FI83784C - Radioaktiva steroider och deras mellanprodukter, foerfarande foer framstaellning av dessa och deras laemplighet foer paovisande av glukokortikoidreceptorer och bestaemmande av antalet bindningsstaellen. - Google Patents

Description

1 83784

Radioaktiivisia steroideja, niiden välituotteita, menetelmä niiden valmistamiseksi sekä niiden soveltaminen glukokortikoidireseptorien osoittamiseen ja sitoutumiskohtien lukumäärän määrittämiseen.

5 Tämä keksintö koskee uusia radioaktiivisia steroideja menetelmää niiden valmistamiseksi, niiden välituotteita sekä niiden soveltamista glukokortikoidireseptorien osoittamiseen ja sitoutumiskohtien lukumäärän mää-10 rittämiseen.

Erityisesti sen kohteena ovat tritiumilla leimatut radioaktiiviset steroidit, joiden yleinen kaava on (I): rVs_/Ri 15 X Π 'C^C-CH,

fXT

<Ä3 1 20 Dossa H esittää tritiumia, R ja R^ ovat erilaisia tai samanlaisia ja esittävät vetyä, 1-6 hiiliatomia käsittävää alkyylirvhmää tai 1-10 hiiliatomia käsittävää asyyliryhmää.

R:n ja R^:n esittämistä ryhmistä voidaan mainita: 25 (a) metyyli-, etyyli-, propyyli-, isopropyyli-, butyyli-, sek-butyyli-, tert-butyyli, pentyyli-, isopentyyli-, sek-pentyyli-, tert-pentyyli-, neopentyyli-, heksyyli-, isoheksyyli-, sek-heksyyli-, tert-heksyyliryhmät; (b) formyyli-, asetyyli-, propionyyli-, butyryyli-, iso-30 butyryyli-, valeryyli-, kapryyli-, bentsoyyli-, kaprylyy-li-, metoksikarbonyyli- tai etoksikarbonyyliryhmät; : ·. Yleisen kaavan (I) mukaisista yhdisteistä mainitaan etenkin : 11/3,17 /.1-dihydroksi-6-metyyli-^H^-l7 (1-propy-nyyli) androsta-1,4,6-trien-3-oni.

2 83784

Keksinnön kohteena on myös menetelmä yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava (I).

Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että yleisen kaavan (II) mukainen yhdiste: vt/ 10 jossa R merkitsee samaa kuin edellä ja R2 esittää 1-6 hiiliatomia käsittävää alkoksiryhmää, 2-12 hiiliatomia käsittävää asyylioksiryhmää tai R2 esittää syklistä 15 sekundäärisen amiinin tähdettä, tämä yhdiste saatetaan reagoimaan metyloivan, halogeeniä sisältävän aineen kanssa, jolloin saadaan yleisen kaavan (III) mukainen yhdiste: 20 κογχΐ_γ·° r: (III) :- · cx2 ·;*: 25 jossa X esittää halogeeniä; yhdiste pelkistetään antamalla tritiumin reagoida katalysaattorin läsnäollessa; syntyneen yleisen kaavan (IV) mukaisen yhdisteen 3-ase-massa oleva ketoniryhmä estetään happamassa ympäristös-30 sä: 35 C1H3 , * li 3 83784 O-alkyloivan aineen avulla, jonka kaava on H-CiOR^)^, jossa R^ esittää 1-6 hiiliatomia käsittävää alkyyliryh-mää, jolloin saadaan yleisen kaavan (V) mukainen yhdiste: CD H, 10 jossa R ja R^ merkitsevät samaa kuin edellä; jälkimmäinen saatetaan reagoimaan propynyloivan aineen kanssa; dehydro-genoiva aine saatetaan reagoimaan yleisen kaavan (VI) mukaisen yhdisteen kanssa: RVs—/” c=c"ch3 (VI) 20 R3° C\ jolloin saadaan yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste, : jossa R^ esittää vetyatomia, joka haluttaessa, jos R ei . ole vetyatomi, eetteröidään tai esteröidään 17o(-asemassa ·: 25 olevasta hydroksyyliryhmästään; ja jos R esittää vetyato- mia, eetteröidään tai esteröidään selektiivisesti jompikumpi hydroksyyliryhmä 11,-3- tai Πfi -asemasta tai eetteröidään tai esteröidään molemmat hydroksyyliryhmät 11/3-ja 17 /^-asemissa.

30 Yllä mainituissa yleisen kaavan (II) mukaisissa symboleissa R2, joka merkitsee syklistä sekundääristä amiinitähdettä, tarkoittaa esimerkiksi pyrrolidino-, morfolino- tai piperidinoryhmää.

Keksinnön parhaissa toteuttamistavoissa menetel-.V 35 mälle ovat luonteenomaisia seuraavat kohdat: 4 83784 - halogeeniä sisältävä metyloiva aine on hiilitetra-bromidi ja reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä dioksaanissa pyridiinin läsnäollessa huoneen lämpötilassa ja sitten reaktioseoksen kiehumislämpötilassa pysty- 5 jäähdyttejän alla; - katalysaattori, jonka läsnäollessa tritiumin annetaan reagoida, on palladiumhydroksidi ja reaktio suoritetaan dioksaanissa trietyyliamiinin läsnäollessa; - O-alkyloiva aine, joka kohdistuu yleisen kaavan (IV) 10 mukaisen yhdisteen ketoniryhmään 3-asemassa, on etyylior-toformaatti ja reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä happamassa ympäristössä; - propynyloiva aine, joka saatetaan reagoimaan yleisen kaavan (V) mukaisen yhdisteen kanssa, on magnesiumpro- 15 pyn-l-yylibromidi ja reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä tetrahydrofuraanissa; - dehydrogenoiva aine, joka saatetaan reagoimaan yleisen kaavan (VI) mukaisen yhdisteen kanssa, on dikloorisyano-kinoni ja reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä aro- 20 maattisessa tai klooratussa liuottimessa kuten bentsee-nissä tai metyleenikloridissä.

Yleisen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden eette-röinti ja/tai esteröinti voidaan suorittaa tavanomaisilla -·· menetelmillä.

25 Eetteröinti voidaan suorittaa esimerkiksi eetteröi- vällä aineella kuten alkyyli- tai aryylihalogenidilla tai dialkyylisulfaatilla.

Esteröinti voidaan suorittaa esimerkiksi esteröi-vällä aineella kuten hapon funktionaalisella johdannai-30 sella kuten happokloridilla tai anhydridillä.

Keksinnön menetelmän toteuttamistavoille on kuvaavaa, että kun halogeeniä sisältävä metyloiva aine on reagoinut kaavan (II) mukaisen yhdisteen kanssa, tapahtuu kondensointi mainitun aineen ja steroidin välillä huo-35 neen lämpötilassa ja sen jälkeen lämmön vaikutuksesta li 5 83784 in situ muodostuneen molekyylin dehalohydraatio.

Keksinnön kohteena on myös yleisen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden soveltaminen ja etenkin 11$ ,17/3 -dihydroksi-6-metyyli-^H2~17o( -(1-propynyyli)-androsta-5 1,4,6-trien-3-onin glukokortikoidireseptorien olemassa olon todistamiseen ja glukokortikoidireseptorien sitou-tumispaikkojen lukumäärän määrittämiseen ihmis- ja eläin-kudoksissa .

Keksinnön kohteena ovat myös keinot, joilla todis- 10 tetaan glukokortikoidireseptorien olemassaolo ja sitoutumiskohtien lukumäärä glukokortikoideille, jotka sisältävät yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä ja etenkin 11 /3, 17$ -dihydroksi-6-metyyli- ^-17 0( - (1-propynyyli) -androsta-1,4,6-trien-3-onia.

15 Keksinnön kohteena ovat myös uusina teollisina yh disteinä ja etenkin keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamisessa tarvittavina välituotteina seuraavat yhdisteet: - 11/? -hydroksi-6-dibromimetyleeniandrost-4-en-3,17-dioni, f·. - 11$ -hydroksi-6-metyyli- H-.-androst-4-en-3,17-dioni, ."· 20 ~ 3-etoksi-ll$-hydroksi-6-metyyli- H.j-androsta-3,5-dien- 17-oni, - 3-etoksi-ll/9,17$-dihydroksi-6-metyyli-^H.j-17n/-(1-propynyyli)-androsta-3,5-dieeni.

·;·; Yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä ja eten- "·'· 25 kin 11$ , 17/?-dihydroksi-6-metyyli-^H.j-17 (1-propynyy- li)-androsta-1,4,6-trien-3-oneilla on mahdollista, kuten edellä jo on mainittu, todistaa glukokortikoidireseptorien olemassaolo ja määrittää glukokortikoidien sitoutu- -- miskohtien lukumäärä.

30 On jo tunnettua, että ei-radioaktiivinen 11/3,17/3- dihydroksi-e-metyyli-l?^ -(1-propynyyli)-androsta-1,4,6-trien-3-oni sitoutuu selektiivisesti glukokortikoidi-reseptoreihin (G. Teutsch, R. Deraedt et ai. Steroids, ;Y Voi. 38, N 6, s. 651-665, 1981).

35 Sitä vastoin muut tämäntyyppisissä kokeissa käy tettävät luonnolliset tai synteettiset kortikoidit si- 6 83784 toutuvat muihin steroidireseptoreihin ja etenkin mine-ralokortikoidireseptoreihin.

Sitä paitsi kun tehdään sellaisia kokeita, joissa käytetään ei-radioaktiivistä 11/3,17/¾ -dihydroksi-6-5 metyyli-17o( -(1-propynyyli)androsta-1,4,6-trien-3-onia ja erityisesti kun tutkittavien elinten kudoksissa on samanaikaisesti glukokortikoidireseptoreita ja mineralo-kortikoidireseptoreita, on usein pakko käyttää pitkiä, monimutkaisia menetelmiä.

10 Näin ollen kuten juuri on todettu, yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä ja etenkin radioaktiivisella 11/¾ , ll^-dihydroksi-6-metyyli-3H3-17 cA- (1-propynyyli) -androsta-1,5,6-trien-3-onilla, jotka ovat keksinnön kohteena, on sama selektiivinen reaktiivisuus glukokorti-15 koidireseptorien suhteen kuin ei-radioaktiivisilla analogisilla yhdisteillä.

Yleisen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden radioaktiivisuuden avulla on paljon helpompi todistaa gluko-• '* kortikoidireseptorien olemassaolo elinten kudoksissa, : : 20 kun mineralokortikoidireseptoreita on myös läsnä, sovel- :** tamalla tavanomaisia sitoutumismittausmenetelmiä, joissa käytetään radioaktiivisia yhdisteitä.

Lisäksi esimerkiksi glukokortikoidireseptorien .· · sitoutumiskohtien lukumäärän määrittäminen, joka ei olisi 25 mahdollista ilman radioaktiivista yhdistettä, tulee mahdolliseksi käyttämällä kaavan (I) mukaisia yhdisteitä.

Voidaan myös ottaa huomioon, että kun käytetään in vivo yleisen kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja etenkin Λ 11 //, 17 /3-dihydroksi- JH3-17<=£-(1-propynyyli) androsta-30 1,4,6-trien-3-onia, niiden radioaktiivisuuden perusteella voidaan helposti määrittää tarkkaan syrjäytyminen gluko- >· kortikoidien sitoutumiskohdista.

'I'. Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan siis käyt- tää erityisen mielenkiintoisella tavalla glukokortikoidi-*·/* 35 reseptorien olemassaolon todistamiseen ja sitoutumiskoh- 7 83784 tien lukumäärään määrittämiseen esimerkiksi elinten kudoksissa, joissa on glukokortikoidi- ja mineralo-kortikoidireseptoreita, kuten hippocampuksessa ja muissa aivojen rakenteissa, munuaisissa, paksussasuolessa, 5 aivolisäkkeessä ja muissa perifeerisissä kudoksissa.

Yleisen kaavan (I) mukaiset yhdisteet eivät meta-boloidu kokeissa käytetyissä olosuhteissa in vitro eivätkä tietyissä kudoksissa sellaisissa inkubaatio-olo-suhteissa, joissa esimerkiksi kortikosteroni tai korti-10 soli metaboloituvat tietyissä kudoksissa.

Käytetyt tekniikat steroidireseptorien olemassaolon todistamiseksi ja sitoutumiskohtien lukumäärän määrittämiseksi ovat yleisesti alalla käytettyjä: - Raynaud J.P., Philibert D. et ai., J. of Steroid Bio-15 chem., 6 (1975), 615-622; - Moguilevski et ai., J. of Steroid Biochem, 12, (1980), s. 309-314.

11 β , 17/’i-dihydroksi-6-metyyli-'^H2-17o^- (1-propy-nyyli)-androsta-1,4,6-trien-3-onilla (yhdiste A) suorite-2Q tut kokeet ovat osoittaneet, että ne täyttävät kaikki tarvittavat vaatimukset glukokortikoidireseptorien olemassaolon todistamiseksi ja sitoutumiskohtien määrittämiseksi. Näin on siis todistettu, että (a) yhdiste A:han ei sitoudu spesifisesti mitään ihmisen 25 eikä eläimen plasman proteiineja, jotka yleensä kohtami- noivat kaikki kudosreseptorivalmisteet; O * v Q — 2.

(b) 0 C:ssa yhdiste A:n assosiaatiovakio (K = 10 M ) rotan kateenkorvan sytosolin kortikosteroidireseptoreihin, joka on määritetty hiili-dekstraanin tapahtuvan adsorption ·.’ 3Q avulla, on noin kaksi kertaa suurempi kuin deksametaso-nilla; (c) yhdiste A: 11a on kohonnut assosiaationopeus (K .= "... e —1 —1 + ·*· 10 M min ) ja alhainen dissosioitumisnopeus kateen- korvan glukokortikoidireseptorien suhteen (t^y2= ^H) ‘ 35 ja hippocampuksen glukokortikoidiresentorien suhteen i 8 83784 (tjy2=24h)· Näissä kahdessa kudoksessa se dissosioi- tuu käyrän mukaisesti, jossa on yksi laskeva suora, 3 3 kun taas H-deksametasoni ja H-kortikosteroni hippo-campuksen sytosolissa dissosioituvat käyrän mukaisesti, 5 jossa on kaksi laskevaa suoraa, mikä on tunnusomaista sitoutumiselle ainakin kahteen kohtaan glukokortikoidi-ja mineralokortikoidien sitoutumispaikoissa; (d) 0°C:ssa ja 15°C:ssa yhdiste A muodostaa kateenkorvan glukokortikoidireseptorien kanssa komplekseja, jotka 10 ovat stabiileita ainakin 24 tuntia.

Näissä olosuhteissa mainitusta yhdiste A:sta ei irtoa tritiumia; se ei metaboloidu eikä sillä ole kuin heikkoa epäspesifistä sitoutumista; (e) kun yhdistettä inkugoidaan 15°C:ssa 24 tuntia, se 15 korvaa täysin ei-radioaktiivisen kortikosteronin ja kortisolin, jotka ovat sitoutuneet glukokortikoidiresepto-reihin. Tästä syystä on mahdollista määrittää glukokorti-koidreseptorien kokonaismäärä eri fysiologisissa olo-• ' suhteissa.

20 Seuraava esimerkki valaisee keksintöä.

: Esimerkki 11 ,3,17/? -dihydroksi-6-metyyli — 17- (1-propy- : nyyli) androsta-1,4,6-trien-3-oni

:V Vaihe A

25 11/3 -hydroksi-6-dibromimetyleeniandrost-4-en-3,17- dioni

Valmistetaan reaktioseos, jossa on 3,7 g 3-etoksi-11 λ·ϊ-hydroksiandrosta-3,5-dien-17-onia , 20 ml dioksaania, 1 ml pyridiiniä ja 4 g hiilitetrabromidia, sekoitetaan '·' _ 30 inertissä atmosfäärissä noin 24 tuntia, sakka erotetaan, pestään useassa erässä dioksaanissa, orgaaniset suodok-set yhdistetään ja kuumennetaan pystyjäähdyttäjän alla noin 4 tuntia. Kun liuos on jäähtynyt, lisätään 50 ml · 2N kloorivetyhappoa, sekoitetaan noin kymmenen minuuttia, ‘ 35 uutetaan etyyliasetaatilla, orgaaniset faasit pestään pe-

II

9 83784 räkkäin vedellä ja natriumkloridilla kyllästetyllä vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja halutun yhdisteen annetaan kiteytyä -20°C:ssa. Yhdiste puhdistetaan kiteyttämällä 5 uudestaan etyyliasetaatista, jolloin saadaan 0,6 g haluttua yhdistettä, joka sulaa 256°C:ssa.

UV-spektri (EtOH); maksimi-252 nm; käännepiste -284 nm.

Puhtaus voidaan tarkistaa silikageeliohutkerros-kromatografiällä eluoimalla sykloheksaani/etyyliasetaat-10 tiseoksella (1.1), Rf=0,2.

Yleisen kaavan (II) mukaisista lähtöaineista 11/^ -hydroksi-3-etoksiandrosta-3,5-dien-17-onia on kuvattu JP-patentissa 9577/71.

Muita tätä kaavaa vastaavia yhdisteitä voidaan 15 valmistaa sinänsä tunnetuilla tavoilla.

Vaihe B

11/^ -hydroksi-6-metyyli-^H2-androst-4-en-3,17- dioni Jäähdytetään nestetypessä reaktioseosta, jossa on 20 80 mg edellisessä vaiheessa valmistettua dibromattua yh distettä, 2 ml dioksaania, 20 mg 2 %:sti palladioidulla hiilellä päällystettyä talkkia ja 120^ul trietyyliamiinia.

Pannaan vakuumiin 15,5 ml tritiumia, jonka spesifinen aktiivisuus on 58 Ci/mmol. Reaktioseoksen annetaan 25 lämmetä huoneen lämpötilaan, lämmitetään sitten noin 40°C:een ja sekoitetaan tritiumissa, kunnes adsorptio on täydellinen. Ylimäärä tritiumia otetaan talteen, suoda-. .. tetaan, lisätään 1 ml 2N HCl:a, annetaan seistä huoneen lämpötilassa noin tunnin ajan, uutetaan etyyliasetaatilla, . 30 pestään vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin, jol- loin saadaan 60 mg raakatuotetta, joka käytetään sellaisenaan seuraavassa vaiheessa.

UV-spektri (EtOH); max 240 nm.

Yhdisteen puhtaus voidaan tarkistaa silikageeli-35 ohutkerroskromatografiällä käyttämällä eluanttina syklo- i 1» 83784 heksaani/etyyliasetaatti-seosta (1-1), Rf=0,17.

Vaihe C

S-etoksi-ll/^-hydroksi-ö-metyyli-^H^-androsta- 3,5-dien-17-oni 5 Inertissä atmosfäärissä lisätään sekoittamalla edellisessä kohdassa saatuun tritioituun yhdisteeseen 120^-ul etyyliortoformaattia ja 20^ul 1 % etyyliortofor-maattia asetyylikloridissa, lisätään sitten 400^ul etanolia. Sekoitusta jatketaan huoneen lämpötilassa noin 10 10 minuutin ajan, sitten lisätään 100 ^,ul trietyyliamii- nia, sitten reaktioseos konsentroidaan kuiviin alennetussa paineessa, jolloin saadaan 58 mg haluttua raaka-tuotetta, joka käytetään sellaisenaan seuraavaan vaiheeseen.

15 Yhdisteen puhtaus voidaan tarkistaa silikageeli- ohutkerroskromatografiällä käyttämällä eluanttina syklo-heksaani/etyyliasetaatin seosta (1-1), Rf=0,5.

Vaihe D

3-etoksi-ll·/3,17/3-dihydroksi-6-metyy1i-^H^-17^~ 20 (1-propynyyli) androsta-3,5-dieeni : ‘ Edellisessä vaiheessa saatu yhdiste lisätään se- koittaen inertissä atmosfäärissä 100^,ul:aan tetrahydro-·: furaania, lisätään 2 ml IM magnesium-l-propynyylibromidi- liuosta tetrahydrofuraanissa, reaktioseosta sekoitetaan 25 huoneen lämpötilassa noin puoli tuntia, sitten lisätään 5 ml 10 % ammoniumkloridin vesiliuosta, uutetaan etyyliasetaatilla, uutos pestään vedellä, kuivataan ja konsentroidaan kuiviin. Näin saadaan 60 mg yhdistettä, jonka aktiivisuus on 7 Ci. Yhdistettä käytetään sellaisenaan 30 seuraavaan vaiheeseen.

Yhdisteen puhtaus voidaan tarkistaa silikageeli-,··· ohutkerroskromatografiällä käyttämällä eluanttina syklo- heksaani/etyyliasetaatin seosta (1.1), Rf=0,4.

:.:. Vaihe E

35 llv3 ,17 ,','-dihydroksi-6-metyyli-^H2-17 (1-propy nyyli) androsta-1,4,6-trien-3-oni

II

11 83784

Lisätään edellisessä kohdassa saatuun yhdisteeseen, joka on liuotettu 0,5 mlraan bentseeniä, 15 minuutin aikana sekoittaen inertissä atmosfäärissä liuos, jossa on 90 mg diklooridisyanokinonia. Sekoitusta jatketaan noin 5 puoli tuntia, lisätään sitten 0,5 ml asetonia, lOO^ul natriumbisulfiittia (vesiliuos, jonka d=l,32) ja 1 ml 10 % natriumbikarbonaattiliuosta. Uutetaan sitten etyyliasetaatilla, uutos pestään 10 % natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja korkeapainenestekromatografiän jälkeen 10 silikageelipylväässä käyttämällä eluanttina 5 % klorofor-mi/metanolin seosta vedessä (99/1), saadaan 50,3 mg haluttua yhdistettä, jonka spesifinen aktiivisuus on 37 Ci/-mmol.

Silikageeliohutkerroskromatografiällä käyttämällä 15 eluanttina sykloheksaani/etyyliasetaatin seosta (1-1) saadaan yhdiste, jonka Rf=0,15.

Claims (15)

1. Radioaktiiviset steroidit, joiden yleinen kaava on (I) 5 /0R1 RO X 0liiC=C-CU3 10 3 c h3 jossa 3H on tritium, R ja Rx, jotka voivat olla samoja 15 tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, 1-6 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää tai 1-10 hiiliatomia sisältävää asyy-liryhmää.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen steroidi, tunnettu siitä, että se on 11β,17B-dihydroksi-6- 20 metyyli-3H3-17a-(1-propynyyli)androsta-l,4,6-trien-3- oni.

3. Menetelmä patenttivaatimusten 1 ja 2 mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdiste, jonka yleinen kaava on (II) 25 RO T~f° di) ·Λ -· jossa R tarkoittaa samaa kuin patenttivaatimuksessa 1 ja 35 R2 on 1-6 hiiliatomia sisältävä alkoksiryhmä, 2-12 hiili- i3 83784 atomia sisältävä asyylioksiryhmä, syklinen sekundäärinen amiinitähde, saatetaan reagoimaan halogeenia sisältävän metylointiaineen kanssa yleisen kaavan (lii) mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa R on vetyatomi, 5 RC) . .0 ^ (III) 10 CX2 jossa X on halogeeni, että näin saatu yhdiste pelkiste-15 tään tritiumilla katalysaattorin läsnäollessa yhdisteen saamiseksi, jonka yleinen kaava on (IV) RO n ^ - c3h., 25 että yhdisteen 3-asemassa oleva ketoniryhmä suojataan O-alkyloivan aineen avulla, jonka kaava on H-C(OR3)3, jossa R3 on 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä yhdisteen saamiseksi, jonka yleinen kaava on (V) 30 RO . .0 Y^-f (V) R3° T Λ3 35 i4 83784 joissa kaavoissa R ja R3 merkitsevät samaa kuin edellä, ja että yhdiste (V) saatetaan reagoimaan propynylointiai-neen kanssa yhdisteen saamiseksi, jonka kaava on (VI)

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että halogeeniä sisältävä mety-lointiaine on hiilitetrabromidi ja reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä dioksaanissa pyridiinin läsnäollessa huoneen lämpötilassa ja sitten reaktioseoksen ref- 25 luksointilämpötilassa.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että katalysaattori, jonka läsnäollessa tritium saatetaan reagoimaan, on palladiumhydrok-sidi ja että reaktio suoritetaan dioksaanissa trietyyli- 30 amiinin läsnäollessa.

5 RO OH /,C=C-CH3 Ju. JL\ J <vd 10 3 C H3 ja joka saatetaan reagoimaan dehydrogenointiaineen kanssa kaavan (I) mukaisen yhdisteen saamiseksi, jossa Rx on ve- 15 tyatomi, ja että jos R ei ole vety, 178-asemassa oleva hydroksyyliryhmä haluttaessa eetteröidään tai esteröi-dään, ja että jos R on vetyatomi, jompikumpi tai molemmat 118-, 178-asemassa olevista hydroksyyliryhmistä haluttaessa eetteröidään tai esteröidään.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yleisen kaavan (IV) mukaisen yhdisteen 3-asemassa olevan ketoniryhmän 0-alky-lointiaine on etyyliortoformiaatti ja että reaktio suori- 35 tetaan inertissä atmosfäärissä happamessa väliaineessa. il is 83784

7. Jonkin patenttivaatimuksen 3-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että propynylointiaine, joka saatetaan reagoimaan yleisen kaavan (V) mukaisen yhdisteen kanssa, on magnesium-l-propynyylibromidi ja että 5 reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä tetrahydrofu-raanissa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 3-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dehydrogenointiaine, joka saatetaan reagoimaan yleisen kaavan (VI) mukaisen 10 yhdisteen kanssa, on diklooridisyanokinoni ja että reaktio suoritetaan inertissä atmosfäärissä aromaattisessa tai klooratussa liuottimessa kuten bentseenissä tai mety-leenikloridissä.

9. Patenttivaatimuksessa 1 määriteltyjen yleisen 15 kaavan (I) mukaisten yhdisteiden ja etenkin 118,178-di- hydroksi-6-metyyli-3H3-17a-(1-propynyyli)androsta-l,4,6-trien-3-onin soveltaminen glukokortikoidireseptorien osoittamiseen ja glukokortikoidien sitoutumiskohtien lukumäärän määrittämiseen.

10. Tapa osoittaa glukokortikoidireseptorien ole massaolo ja glukokortikoidien sitoutumiskohtien lukumäärä, tunnettu siitä, että käytetään yleisen kaavan (I) mukaista yhdistettä ja etenkin 118,173-dihydroksi-6-metyyli-3H3-17a-(1-propynyyli)androsta-l,4,6-trien-3-25 onia.

11. Kaavan (I) mukaisten steroidien valmistuksessa käyttökelpoiset välituotteet: - 113-hydroksi-6-dibromimetyleeniandrost-4-en-3,17-dioni, - llS-hydroksi-6-metyyli-3H3-androst-4-en-3,17-dioni, 30 - 3-etoksi-113-hydroksi-6-metyyli-3H3-androsta-3,5-dien- 17-oni, - 3-etoksi-llB, 178-dihydroksi-6-metyyli-3H3-17a-( 1-propynyyli)-androsta-3, 5-dieeni. i6 83 784