FI83659B

FI83659B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara o-glykosidfoereningar och mellanprodukter.

Info

Publication number: FI83659B
Application number: FI863703A
Authority: FI
Inventors: Hans Goeran Magnusson; Torbjoern Frejd
Original assignee: Symbicom Ab
Priority date: 1985-01-14
Filing date: 1986-09-12
Publication date: 1991-04-30
Also published as: IE58778B1; DE3663029D1; FI863703A; EP0208749B1; WO1986004065A1; JP2510176B2; NO166865C; AU588854B2; AU5351586A; FI83659C; CN86100178A; CA1316170C; CN1022687C; NO166865B; IL77602A; NO863645L; NO863645D0; US4868289A; JPS62502258A; IE860077L

Description

1 83659

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten O-glykosidiyh-disteiden valmistamiseksi ja välituotteita

Keksintö koskee uusien O-glykosidiyhdisteiden val-5 niistämiseksi, joiden kaava on I2

(Sokeri) - O - CH0 - C - R0 I

n 2 | 3 R1 10 jossa n on kokonaisluku 1-10 ja sokeri on valittu ryhmästä D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi, D-riboosi, D-arabinoosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoosi, D-glukuro-15 nihappo, D-galakturonihappo, D-mannuronihappo, 2-deoksi- 2 - f taal i - i inido-D-g] ukoosi, 2-deoksi-2-ftaali-imido-D-ga-laktoosi ja sialihappo sekä näiden johdannaiset, jolloin, kun n>l, sokeriyksiköt voivat olla samoja tai erilaisia, ja 20 R3 on H, ja

Ri ja R2, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat ryhmää, jonka kaava on

25 - CH_ - S - R„ - R_ II

2 II 4 5 <°>p jossa m ja p tarkoittavat toisistaan riippumatta lukua 0 tai 1 m+p on 0, 1 tai 2, 30 R4 on tyydyttynyt tai tyydyttymätön, haarautunut tai haarautumaton 1-25 hiiliatomia sisältävä alkyyliket-ju, aryyli tai steroidiryhmä, ja R5 on H, CHO, N02/ NH2, OH, SH, COOH, C00R6, jossa R6 on C^-alkyyli tai kantaja, C0NHNH2, C0N3, CH(OR6)2, 35 jossa R6 tarkoittaa samaa kuin edellä, tai kantaja, tai R2 ja R3 muodostavat yhdessä ryhmän =CH2, ja 2 83659

Rx on yllä määritellyn kaavan II mukainen ryhmä, jossa R4, R5, m ja p tarkoittavat samaa kuin edellä.

Tämä keksintö koskee uusia glykosideja. Kaavan I 5 mukaiset glykosidit ovat käyttökelpoisia mm. synteettisinä biologisina reseptoreina.

Keksintö koskee myös kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistuksessa välituotteina käyttökelpoisia O-glyko-sideja, joiden kaava on 10 R9 I 2 (Sokeri) - 0 - CH„ - C - R0 (I')

Π Z I O

Ri 15 jossa n on kokonaisluku 1-10 ja Sokeri on valittu ryhmästä D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi, D-riboosi, D-arabinoosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoosi, D-glukuro-nihappo, D-galakturonihappo, D-mannuronihappo, 2-deoksi-20 2-ftaali-imido-D-glukoosi, 2-deoksi-2-ftaali-imido-D-ga- laktoosi ja sialihappo sekä näiden johdannaiset, jolloin, kun n>l, sokeriyksiköt voivat olla samoja tai erilaisia, ja R3 on H ja R3 ja R2, jotka voivat olla samoja erilaisia, tarkoittavat ryhmää CH2X, jossa X on poistuva ryhmä, 25 tai R2 ja R3 muodostavat yhdessä ryhmän =CH2 ja Rx on CH2X.

Luonnon glykokonjugaatit koostuvat hiilihydraatti-osasta, joka on useimmissa tapauksissa liittynyt lipidiin tai proteiiniin (vrt. Hakomori (1981) ja Sharon & Lis 30 (1981)). Useimmissa glykolipideissä sokeri on liittynyt joko rasva-aminoalkoholiin sfingosiini tai glyseroliin, jotka puolestaan ovat muuntuneet rasvahappojohdannaisiksi. Näiden kahden glykolipidityypin yleiset kaavat on esitetty alla.

35 l: 3 83659

O

Luonnon glykolipidit

Sokeri—o glykosf ingolipidi

OH

6 glykoglyserolipidi

Sokeri—

Glykoproteiineissa sokeriosa on kiinnittynyt suo-10 raan johonkin proteiinin aminohappoon. Glykolipidit ja glykoproteiinit ovat imettäväisten solujen plasmamembraa-nin olennaisia osia. Jotkut näistä glykokonjugaateista toimivat mm. erilaisten biologisten kokonaisuuksien spesifisinä reseptoreina. Glykokonjugaatin hiilihydraattiosa 15 on esillä plasmamembraanin ulkopinnassa ja sillä voi siten ilmetä antigeeniominaisuuksia. Tähän perustuvat erilaiset veriryhmäjärjestelmät (vrt. Lemieux (1978)). Vastikään on osoitettu, että yllä olevan tyyppiset kalvohii-lihydraatit ovat tärkeitä reseptoreina proteiineille 20 (vrt. Sharon & Lis (1972) ja Kabat (1980)), kuten lektii-neille, vasta-aineille ja hormooneille, ja mikro-organismien solujen pintaan kiinnittymiselle (vrt. Beachey (1981) ).

Keinotekoisia glykokonjugaatteja (niin kutsuttuja 25 neo-glykokonjugaatteja) on valmistettu sekä neo-glykoli-pidejä (vrt. Slama & Rando (1980) ja Dahmen et ai. (Car-bohydr. Res., 127, 1984)) että neo-glykoproteiineja (vrt. Lemieux et ai. (1975) ja Dahmen et ai. (Carbohydr. Res., 129, 1984)). Vielä ei kuitenkaan ole valmistettu neo-gly-30 kolipidejä, joiden molekyylit muistuttaisivat läheisesti luonnon yhdistettä. Tiedetään (vrt. Israelachvili et ai.

(1980)), että lipidien hydrofobisen osan kemiallinen rakenne määrää, minkä tyyppisiä agregaatteja voi muodostua (misellejä, liposomeja jne.) ja myöskin, minkälainen vai-35 kutus lipidillä on, kun se sisältyy esim. johonkin solun kalvoon. Ottaen huomioon hiilihydraattikompleksien suuren 4 83659 reseptorispesifisyyden ja biologisen tärkeyden, on ilmeistä, että todellakin tarvittaisiin molekyylirakenteeltaan tarkoin määrättyjä, helposti vamistettavia glykokon-jugaatteja hoito-, ennakkotorjunta- ja taudinmääritys-5 käyttöön samoin kuin käytettäviksi biokemiallisessa tutkimuksessa .

Edellä esitetyissä kaavoissa I ja 1' liittää hii-lihydraattiosa "(Sokeri)n" on liittynyt muuhun osaan molekyyliä a- tai β-sidoksen välityksellä yhden sokeriyksi-10 kön 1-hiiliatomiin (anomeeriseen hiileen). Hiilihydraat-tiyksikkö, johon muu osa molekyyliä on sitoutunut, on tavallisesti päätehiilihydraattiyksikkö, joka on haarautu-mattoman tai haarautuneen pentoosi- tai heksoosiyksikkö-ketjun pelkistävässä päässä.

15 Tässä yhteydessä tarkoitetaan termillä "sekä näi den johdannaiset" viitaten sokeri-yksiköihin, että joissakin tai kaikissa hiilihydrattiosan vapaissa hydroksi-ryhmissä on johdoksena sellainen ryhmä tai ne on korvattu sellaisilla ryhmillä kuin alkyyli (kuten esimerkiksi me-20 tyyli, etyyli tai propyyli), amino, fluori tai muu ryhmä. Tällaisissa ryhmissä voi taas olla substituentteina erilaisia funktionaalisia ryhmiä. Sokerirenkaan hydroksiryh-missä voi olla johdoksena asyyli, kuten esimerkiksi ase-tyyli tai bentsyyli, C^-alempialkyyli (erityisesti me-25 tyyli tai etyyli) tai tetrahydropyranyyli tai yhtä hyvin suuri määrä muita ryhmiä. Tällaiset johdosryhmät kykenevät muuttamaan hiilihydraattiosan ominaisuuksia (esim. hydrofiilisyyttä, hydrofobisuutta, polaarisuutta, ulkonaista muotoa jne.).

30 Jäljempänä käytetyllä termillä "poistuva ryhmä" tarkoitetaan mitä tahansa ryhmää, joka lohkeaa helposti pois, kun hiiliatomiin, johon se on kiinnittynyt, kohdistuu nukleofiilinen hyökkäys. Tyypillisiä esimerkkejä poistuvista ryhmistä ovat halogeenit, kuten kloori, bromi 35 ja jodi, erityisesti bromi, p-tolueenisulfonyyli, mesyyli samoin kuin esteriryhmät, kuten alempialkyyliesteriryh-

II

5 83659 mät, esim. metyylikarbonyloksi, etyylikarbonyloksi, pro-pyylikarbonyloksi jne. ja aryyliesteriryhmät, kuten esimerkiksi fenyylikarbonyloksi, jolloin fenyyliryhmässä voi myös olla substituentteja.

5 Termillä "kantaja" R5:n merkityksenä tarkoitetaan mitä tahansa orgaanista tai epäorgaanista polymeeristä tai makromolekyylirakennetta, johon kaavan I mukaisen 0-glykosiyhdisteen aglykoniosa on kiinnittynyt. Esimerkkejä tällaisista kantaja-aineista ovat proteiinijäännökset, 10 polysakkaridit, muovipolymeerit ja epäorgaaniset aineet.

Proteiinijäännökset ovat mieluimmin sitoutuneet proteiineissa olevien nukleofiilisten ryhmien, esim. sellaisten ryhmien kuin amino-, hydroksi- ja merkaptoryhmien avulla. Itse proteiinit voivat olla mitä tahansa suuresta määräs-15 tä proteiineja, erityisesti biologisesti sopivia proteiineja, kuten esimerkiksi globuliineja, albumiineja, kuten naudan seerumin albumiini, fibriinejä, polylysiini, "avaimen reikä"-sitoutujia (limpet) -hemosyaniini (KLH) jne. Polysakkaridit, joihin O-glykosiyhdisteet ovat kiin-20 nittyneet, voivat olla mitä tahansa suuresta määrästä polysakkarideja. Kaavan I mukaisen yhdisteen aglykoniosa voi olla sitoutunut tavallisten polysakkaridien, kuten esimerkiksi selluloosan, tärkkelyksen tai glykogeenin, hydroksiryhmien, aminosakkaridien, kuten esimerkiksi ki-25 tosaanin tai aminoidun sefaroosin, aminoryhmien ja tio-modifioitujen polysakkaridien merkaptoryhmien avulla. Esimerkkejä muoveista, joihin kaavan I mukaisten yhdisteiden aglykoniosa voi olla kiinnittynyt, ovat aminoitu lateksi, tioloitu, aminoitu tai hydroksyloitu polystyree-30 ni ja polyvinyylialkoholi. Kyseiset muovit voivat olla esim. helmien tai kalvon muodossa. Esimerkkejä epäorgaanisesta aineesta, johon kaavan I mukaisten yhdisteiden aglykoniosa voi olla kiinnittynyt, ovat piidioksidimate-riaalit, kuten esimerkiksi silikageeli, tseoliitti, pii-35 maa tai erilaisten lasi- tai silikageelityyppien pinta, kuten esimerkiksi tioloitu tai aminoitu lasi, jolloin si- 6 83659 likageeli tai lasi voi olla esim. helmien muodossa. Vielä eräs esimerkki epäorgaanisesta aineesta on alumiinioksidi .

Esimerkkejä R4:n tarkoittamista tyydytetyistä tai 5 tyydyttämättömistä, haarautuneista tai haarautumattomista 1-25 hiiliatomia sisältävistä alkyyliketjuista ovat mety-leeni, dimetyleeni, tetrametyleeni, oktametyleeni, heksa-dekametyleeni, oktadekametyleeni ja oktadek-9-enyleeni, mieluimmin haarautumattomat tyydytetyt alkyyliketjut, ku-10 ten esimerkiksi oktametyleeni, heksadekametyleeni ja oktadekametyleeni, kun R5 on H. Parhaina pidettyjä ryhmistä -R4-R,,, kun R,, on muu kuin H, ovat (CH2)2-COOR6 ja (CH2) 10-COOR6, joissa R6 on yllä määritellyn mukainen. Esimerkki ryhmästä -R4-R5, jossa R4 on aryyli, on fenyyliryh-15 mä, jossa on substituenttina mikä tahansa yllä määritellyistä ryhmistä R5 ja missä tahansa käytettävissä olevassa asemassa.

Termi "steroidiryhmä" voi tarkoittaa mitä tahansa yleisesti esiintyvää biologista steroidiryhmää, kuten 20 esimerkiksi niitä steroidityyppejä, jotka itse tai joiden johdannaiset esiintyvät biologisissa kalvoissa. Esimerkkejä sellaisista steroidiyksiköistä ovat kolesteroli ja lanosteroli.

Esimerkkejä C^-alkyylistä ovat metyyli, etyyli, 25 propyyli, i-propyyli, n-butyyli, i-butyyli ja tert. bu-tyyli.

Sellaisista kaavan I mukaisista yhdisteistä, joissa R3 on H, ovat ne, joissa R: ja R2 ovat identtisiä, mielenkiintoisia koska ne on helpompi valmistaa kuin sellai-30 set, joissa R3 ja R2 eivät ole identtisiä. Kuitenkin yhdisteillä, joissa R: ja R2 ovat erilaiset, on suurempi kapasiteetti, sillä niissä on laajempi toimintospektri yhdistyneenä yhdessä ainoassa yhdisteessä, minkä johdosta nämä yhdisteet kykenevät toimimaan useammilla tavoilla, 35 esim. biologisessa järjestelmässä.

Eräs hyvänä pidetty sellaisten yhdisteiden luokka, li 7 83659 joissa I*! ja R2 ovat identtisiä, ovat yhdisteet, joissa Rj ja R2 ovat kaavan II mukainen ryhmä, jossa m ja p ovat yllä määritellyn mukaisia. R4 on haarautumaton, 2-17 hiiliatomia sisältävä alkyyliketju ja R5 on CH3, COOCH3 tai 5 kantaja-aine. Esimerkkejä haarautumattomista, 2-17 hiili-atomia sisältävistä alkyyliketjuista ovat dimetyleeni, heptametyleeni, dekametyleeni, pentadekametyleeni ja hep-tadekametyleeni. Erityisen hyvänä pidetyssä yhdisteiden alaluokassa m+p on 0 tai 2.

10 Kaavan 1' mukaisista yhdisteistä, joissa R3 ja R2 ovat identtisiä, ovat erityisen hyvinä pidettyjä ne, joissa Rx ja R2 ovat CH2X, jossa X on halogeeni, alkyyli-karbonyloksi, aryylikarbonyloksi, alkyylisulfonyloksi tai aryylisulfonyloksi. Alkyyliosat ovat mieluimmin C^-al-15 kyyli, ja aryyliosa on mieluimmin mahdollisesti substi- tuoitu fenyyliryhmä, erityisen mielellään tolyyli. Hyvänä pidetty halogeeni on Br.

Yhdisteistä, joissa R2 ja R3 yhdessä muodostavat =CH2, ovat eräs erityisen hyvänä pidetty yhdisteryhmä ne, 20 joissa Rx on CH2X, jossa X on halogeeni, alkyylikarbonyl-oksi, aryylikarbonyloksi, alkyylisulfonyloksi tai aryylisulfonyloksi. X on mieluimmin Br.

Alla on lueteltu esimerkkejä tärkeistä hiilihyd-raattiryhmistä (Sokeri)n. Luettelossa on eri sakkaridiyk-25 siköt kirjoitettu alalla yleisesti käytetyn pikakirjoi-tuksen mukaisesti, jossa kustakin sakkaridiyksikköjen (lyhenteinä annettujen) välisestä sidoksesta on ilmoitettu, minkä kummassakin sakkaridiyksikössä olevien hiili-atomien välillä sidos sijaitsee ja onko sidos a- vai β-30 konfiguraatiossa. Merkintä "NAc" tai "NPhth" tarkoittaa, että kyseisessä sakkaridiyksikössä on asetyyliamino- tai ftaali-imidoryhmä, vastaavasti, asemassa 2. Symboli "A" tarkoittaa vastaavaa happoa. Siten "GlcA" on glukuroni-happo. Merkintä "3Me" tarkoittaa, että asemassa 3 normaa-35 listi oleva hydroksyyliryhmä on on korvattu metyyliryh-mällä. Vastaavasti viittaa "3CH2OH" hydroksiryhmään.

8 83659

Vaikka sakkaridiyksiköt voivat olla läsnä sekä furanosidi-että pyranosidirauodossa, pidetään pyranosidiyksikköjä yleensä parempina.

Esimerkkejä hiilihydraattiryhmistä ovat: 5 Gal

Glc Man Fuc Xyl 10 Rib

Ara G IcN Ac GaIN Ac G le A 15 GalA Man A G IcN Phth GalN Phth NeuNAc 20 Manal-\3Man

Manal-^Man Manal^SMan Man61-*4GlcNAc GalB1-*4GlcNAc 25 GlcN Ac3l“4Man GlcNAc31-2Man GalBI^öGlcN Ac Fuca1-*6GlcNAc Mana1-*6GlcN Ac 30 GalSWMan

Fucal-*3GlcNAc

Fuca1_>2Gal

Fuca1-3Gal l! 9 83659

Fucal-*6Gal GalBl-3G!cN Ac GalB1-"2Gal Gal61*6Gal 5 GalBl-3Gal GaIN Acal-3Gal GlcNAc81-3Gal GalB1-4Glc Galal-4Gal 10 GalNAc21"3Gal

GalNAca1-3GalNAc

GalNAcSl-AGal

Gal51"*3GalNAc

Galal-3Gal 15 GIcal-SGIcaWGIcal-4Glc GlcaWGIc GIc21~*4Glc NeuN Aca2-3Gal NeuNAca2-6Gal 20 NeuNAca2"3GalNAc NeuN Aca2-6GlcN Ac NeuN Aca2"*SNeuN Ac GlcSWGIcBWGIc Glcal'MGIcal'^GIc 25 Manel^iManal^GlMan

GalB1-3GaiNAc3l-40alBl-4Glc GalNAcBl-AGalBI-^GalNAcBl^GalBl^Glc GaIN AcSl'*3Gala1-*4GalBl'*4Glc CalNAcSl-3Galal-3GalBl-4Glc 30 Gaiai-4GlcNAcSl-3GalBl-*4Glc ; GalBl-3GlcNAc31^3GalB1-3GalBl-4Glc

Gaiei-4GlcNAc31-3GalSl-4GlcNAcSl-3Gaiei-4Glc

GalB1-4GlcNAcSl',2Mana"3v ^ManB1-4GlcNAcSGIcNAc 35 GalB1**4GlcN Ac31'*2Mana1'*6' 10 83659

Gal5WGIcNAcBl\^ 3GalB1-4GlcN Ac51-3GalBl-*4Glc

GalB1-4GlcN'AcSl'·'^

GalBl"*3Gal51-*4Glc 5 G a IS1 -*3 G a I β 1 —3 G a 131 ~"4G I c GlcNAc51-3Gal GalBl-4Glc3Me Gaiol->4Gal3Me GalBl-4Glc3CH2OH 10 Galal-4Gal3CH?OH Galal-4Gal51-4Glc Galal->4GalBl-4G!cN Ac G!cal-6Glcal-4G1c

Esimerkkejä tärkeistä aglykoniryhmistä ovat: 15 ch2-ch-[ch,s-(ch0)15)-ch3]0 CH-CH-[CH?S-(CH2)3-CH^CH-(CH^)7-CH3],, CH1-CH-[CH1-S-(CH?),-COOCH3]<, CH9-CH-[CH2-S-(CHn)10-COOCH3]7 CH2-CH-[CH?-S-(CH2)g-NH2]2 20 ch2-ch-[ch7-so-(ch2)15-ch3]7 CH2-CH-[CH2-SO-(CH2)8-CH^CH-(CH^)7-CH3]0 CH2-CH-[CH2-SO-(CH2)2-COOCH3]2 CH2-CH-[CH2-SO-(CH2)10-COOCH3]2 CH2-CH-[CH2-SO-(CH2)6-NH2]2 25 -CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)7 -CH2-CH(CH2-SO0-(CH0l8-CH^CH-(CH2)7-CH3)2 -CH2-CH(CH2-SOt-(CH9)7-COOCH3)2 -CH2-CH(CH2(SO2-(CH2)10-COOCH3)7 -CH2-CH(CH^-SO^-(CH2)6-NH2)2 30 -CH2-C( = CH2)-CH0*S-(CH0)15-CH3 -CH0-C(=CH2)-CH1-S-(CH2)^-COOCH3 -CH2-C(=CHo)-CH^-S-(CH2)10-COOCH3 -CH0-C(=CH2)-CH2-S-(CH?)6-NH2 -CH,-C(=CH0)-CH0-N-((CH0)15-CH3)^ 35 -CH0-C(=CH2)-CH?-O-Cholesteryl l! 11 83659 ch2-ch-[ch2-s-(ch2)10-cooch3]ch2-s-(ch2)7ch3 ch2-ch-[ch2-so2-(ch2)10-cooch3]ch2-s-(ch2)7-ch3 ch2-ch-[ch2-so2-(ch2)10-cooch3]ch2-so2-(ch2)7-ch3 -CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 -ch2-ch(ch2-so2-(ch2)2-cooh)2

Tarkoitus on, että kukin ja jokainen yllä mainituista hiilihydraattiryhmistä voidaan yhdistää kunkin ja jokaisen yllä mainitun aglykoniryhmän kanssa ja että luettelointi 10 tulisi ymmärtää käytännölliseksi tavaksi esittää kukin ja jokainen näin saaduista glykosidiyhdisteistä.

Esimerkkejä parhaina pidetyistä kaavan I mukaisista glykosidiyhdisteistä ovat:

GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 15 Gal0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)7

GalO-CH2-CH(CH2-SOo-(CH9)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH?)7-CH3 GalO-CH2-CH(CH2-SO^-CH2-CH3)2 OalO-CH2-C( = CH2)-CHL,-S-(CH2)2-COOCH3 GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 20 gico-ch2-ch(ch2-s-(ch2)15-ch3)2 gico-ch2-ch(ch2-so2-(ch2)15-ch3)2 GIcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7-CH3 GIc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GIcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 25 GlcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3

ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

ManO-Cl-L-CH (CH--SO-- (CH-)in-COOCH~) -CH~-SO--(CH0)7-CH., M.n0-CH2-CH(CHj-S0|-CH2:CH3)2 30 War>0-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-C00CH3

ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3

Fuco-ch2-ch(ch2-s-(ch0)15-ch3)2

Fuco-ch2-ch(ch2-so2-(ch2)15-ch3)2

FucO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)*CH2-SO2-(CH2)7-CH3 35 fuc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 i2 83659

FucO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 FucO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 XylO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Xyl0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3), 5 XylO-CH2-CH(CH2-SO,-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2*(CH2)7-CH3 XylO-CH2-CH(CH2-SO^-CH2-CH3)^

XylO-CH2-C( = CH2)-CH^-S-(CH^)7-COOCH3 XylO-CHo-C( = CH2)-CH2-S-(CHo)10-COOCH3 RibO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 10 Rib0-CH?-CH(CH2-S02-(CH9)15-CH3)2

RibO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7-CH3 RibO-CH2-CH(CH2-SO2-CH2-CH3)0 RibO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 RibO-CH2-C( = CH2)-CH?-S-(CH2)10-COOCH3 15 AraO-CH^-CH(CH2-S-(CH2)]5-CH3)2

AraO-CH2-CH(CH2-SO0-(CH2)15-CH3)2

AraO-CH7-CH(CH2-SO7-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH7)7-CH3 Ara0-CH2-CH(CH?-S02-CH2-CH3)2 AraO-CH^-C( = CH^)-CHT-S-(CH2)2*COOCH3 20 AraO-CH2-Cl = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GlcNAcO-CH0-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3), GIcNAcO-CHt-CH(CH2-502-(CH2)15-CH3)2 GIcNAcO-CH9-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH?)7-CH3 GIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 25 GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 - GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2'S*(CH2)10-COOCH3

GalNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GalNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH?)7-CH3 30 GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

GalNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 gicAO-ch^-ch(ch2-s-(ch2)15-ch3)2 gicao-ch7-ch(ch2-so2-(ch2)15-ch3)2

Ii i3 83659 GIcAO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH7-SO2-(CH2)7-CH3 GIcA0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GIcAO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GIcAO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH,))10-COOCH3 5 GalAO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalAO-CH2-CH(CH0-SO2-(CH7)15-CH3)2

GalAO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO9-(CH7)7-CH3 GalA0-CH2-CH(CH7-S02-CH2-CH3)2 GalAO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 10 GalAO-CH2-C(=CH2)-CH7-S-(CH7)10-COOCH3 ManAO-CH2-CH(CH2-S*(CH2)15-CH3)2 ManA0-CH?-CH(CH2-S02-(CH7)15-CH3)7

ManAO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH*)10-COOCH3)-CH2-SO9-(CH,)7-CH3 ManA0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 15 ManAO-CH7-Cl = CH9)-CH2-S-(CH7)2-COOCH3 ManAO-CH7-C( = CH,)-CH2-S-(CH7)10-COOCH3

Gic\'PhthO-CH2-CH(CH7-S-(CH7)15-CH3)7

GlcNPhthO-CH7-CH(CH2-SO7-(CH0)15-CH3)2

Glc.NPhthO-CH2-CH(CH7-SO2-(CH7)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH7)7-CH3 20 GlcNPhthO-CH7-CH(CH2-SO2-CH0-CH3)2

GlcNPhthO-CH2-C(sCH2)-CH2-S-*(CH2)2-COOCH3 GlcNPhthO-CH7-C(=CH7)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalNPhthO-CH7-CH(CH2-S-(CH7)15-CH3)2 GalNPhth0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 25 GalNPhthO-CH7-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7-CH3 GalNPhth0-CH2*CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GalNPhthO-CH7-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalNPhthO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH7)10-COOCH3 NeuNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 30 NeuNAc0-CH2*CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 . : NeuNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7-CH3

NeuNAc0-CH7-CH(CH2*S02-CH2-CH3)2 NeuNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)7-COOCH3 NeuNAcO-CH7-C(=CH2)-CH2-S-('CH2)10-COOCH3 35 Mana1-3ManO-CH7-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 i4 83659

Mana1-3Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH.,)15-CH3)2

Manal-3ManO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH ) - CHj 2 7

Manal-3Man0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 5 Mana1~3ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Mana1-3ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH0)1()-COOCH3 Manal-2ManO-CH2-CH(CH7-S-(CH,)15-CH3)9 ManB1-2ManO-CH2-CH(CH2-S02-(CH0)l5-CH3)2 ManaWManO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH ) -10 ch3 2 7

Manel-2Man0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Mana1-2ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)^-COOCH3 Mana1-2ManO-CH2-C(=CH2)*CH2-S-(CH2)*0'COOCH3 Mana1-*6ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH7)15-CH3)2 15 Mana1-6ManO-CH--CH (CH--SO--(CH-). c-CH-),

Manal-6ManO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH9)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH ) - CH3 ‘ 2 '

Mana1-*6ManO-CH^-CH CCH2-S02-CH2*CH3),

Mana1-6Man 0-CH2-C( = CH2)-CH.,-S-(CH2).,-COOCH3 20 ManaV-6Man 0-CH2-C (= CH2)-CHj-S - (CH,,) 10*COOCH3

ManBl-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH?)15-CH3)2

Man6l-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

ManBl-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH,)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)7-ch3 25 ManBWGIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

ManBl-4GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 ManÖl-4GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalBl-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalB1-4GIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2) -CH3)2 30 GalB1^4GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)1Q-C00CH3)-CH2-S02- (ch2i7-ch3

Gal5l-4GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH )

GalB1-4GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2:)2-COOCH3

Gai3l^4GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 li i5 83659

GlcNAcei-4ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH?)15-CH3)2

GlcNAcBl-4Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 G!cNAcS1-4ManO-CH2-CH(CHo-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)7-ch3 5 GlcNAcSl-*4Man0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

GlcNAcS1-4ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH0)2-COOCH3 GlcNAcg1-4ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH~)10-COOCH3 GlcNAcBl-2ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GlcNAcB1-2Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 10 GlcNAcei-2ManO-CHo-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(ch2)?-ch3

GlcNAc5l-*2ManO-CH0-CH(CH2-SO2-CH2-CH3)2 GlcNAc31-2ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GlcNAcSl-*2ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 15 Gal51-*6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3), GalSl-6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH0)15-CH3)2 Gal51^6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)7-ch3

GalBl-6GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 20 GalBl-6GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalBl-6GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOC'H3 Fuca1-6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Fucal-6GlcNAc0-CH2-CHCCH2-S02-(CH2)15-CH3)2 Fucci1-*6GIcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-25 (CH2)7-CH3

Fucb1-6GIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Fucal-6GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Fucal-6GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Manal-6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 30 Manel-6GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

Manal-6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)7-ch3

Manel-6GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

Manol-6GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 16 83659

Manal-*6GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3

GaiBl-2ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH0)15-CH3)2

GalBl-*2Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH,)15-CH3)2

GalB1-*2ManO-CH2-CH(CH,-SO2-(CHo)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH,)7-5 CH3

GalB1-2Man0-CH2-CH(CH2*S02-CH2-CH3)2 GalB1-2ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH,)2-COOCH3 GalBl-2ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CHo)10-COOCH3 Fucal-*3GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 10 Fuca1-3GIcNAcO-CH0-CH(CH2-SO2-(CH9)15-CH3)2

Fuca1-3GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH31-CH2-SO2- (ch2)7-ch3

Fuca1-3GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Fuca1-3GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 15 Fuca1~3GlcNAcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COCCH3 Fuca1-2GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH^)15-CH3)^ Fucal-2Gal0-CH7-CH(CH^-S07-(CH^)15-CH3)2

Fuca1-2GalO-CH^-CH(CH2-SO2-(CH^)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7- CH3 20 Fuca1-2Gal0-CH2-CH(CH^-S07-CH2-CH3)2

Fuca1-2GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Fucal-2GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 . Fuca1-*3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)^

Fuca1-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)l5-CH3)2 25 Fucal-*3GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH?)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7- CH3

Fucal-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Fuca1-*3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Fuca1-3GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 30 Fucal-6GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)?

Fuca1-6Gal0-CH2-CH(CH2-S02*(CH2)15-CH3)2

Fuca1-6GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH7)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7- ch3

Fuca1-6Gal0-CH7-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 i! i7 83659

Fuca1-6GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Fuca1-»6GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Gal61-3GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Gal6WGIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH,,)15-CH3)2 5 GalB1-3GlcNAcO-CH0-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)7-ch3

GalSl-3GlcNAc0-CH,-CH(CH,-S02-CH2-CH3)2 Gal61-3GlcNAcO-CH0-C(=CH2)-CH2-S-(CH?)?-COOCH3 GalSl-3GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 10 GalBl-*2GalO-CH0-CH(CH2-S-(CH0)15-CH3)2

GalBl-*2Gal0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GalBl-2GalO-CH2-CH(CH2-SO2'(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7- CH3

GalSl-2Ga!0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 15 Gal51-‘2GalO-CH0-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)?-COOCH3

Gal£l-2Ga!O-CH7-C( = CH9)-CH2-S-(CH^)10-COOCH3 Gal5l-6GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH9)15-CH3)2 Gal61-*6GalO-CH2-CH(CH2-S09-(CH9)15-CH3)9

Gal61-*6GalO-CH2-CH(CH9-SO9-(CH9)10-COOCH3)-CH9-SO2-(CH2)7-20 CH3

GalS1^6Gal0*CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)9 GalSl-*6GalO-CH9-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalSl-6GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalBl-3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)9 25 GalBl-3Gal0-CH9-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GalBl-3GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3l-CH2-SO2-(CH2)7- ch3

GalSl^3Gal0-CH9-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

Gal3l-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)9-COOCH3 30 GalBl-3GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3

GalNAcal-*3GalO-CH~-CH (CH--S - (CH-), j-’CH-)- l 2 2 15 3 2

GalNAccl-*3Gai0-CH9-CH(CH2-S02-(CH9)15-CH3)2

GalNAcal-3GalO-CH*-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)?-ch3 is 83659

GalNAcal-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GalNAca1-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalNAcal-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GlcNAcSl-3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 5 GlcNAc&l-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GlcNAc51-3GalO*CH2-CH(CH2-SO2-(CHo)10-COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)?-ch3

GlcNAc61-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GlcNAcB1-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 10 GlcNAc6l-3GalO-CH9-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalBl-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalBl~4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GalBl-4GlcO-CH2-CH(CH7-SO2-(CH9)10-COOCH3)-CH2-SO2-(CH2)7- ch3 15 GalBl-4GlcO-CH0-CH(CH^-SO2-CH2-CH3)^

Gal61-4GlcO-CH2-C( = CH?)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Galpl-4G!cO-CH?-C( = CHo)-CH2-S-(CHo)10-COOCH3 Galal-4GalO-CH?-CH(CH2-S-(CH0)15-CH3)2 Galal-*4Gal0-CH7-CH(CH2-S02-(CHT)15-CH3)2 20 Galal-4GalO-CH,,-CH(CH2-SO2-(CH,,)10-COOCH3)-CH2-SO2'(CH2)7- ch3

Galal-4Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Galol-*4GalO- CH2-C (=CH2) -CH2*S- (CH2)2*COOCH3 Galal-4GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 25 GalNAc51-3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalNAc0l-3GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)15-CH3)2 GalNAc3l-3GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2' (ch2)7-ch3

GalNAc21-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 30 GalNAc31-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalNAc31-*3GalO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalNAcal-3GalNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalNAcal-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 GalNAcal-3GalNAcO-CH^-CH(CHo-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-35 (CH^)7-CH3

Ii i9 83 659

GalNAcal-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH,-CH3)2 GalNAcol-3GalNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalNAcal-3GalNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CHo)10-COOCH3 GalNAc5WGalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3f2 5 GalNAc61-4GalO-CH2-CH(CH2-S02-(CH9)15-CH3)2

GalNAcei-4GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)l0>COOCH3)-CH2-SO2- (ch2)?-ch3

GalNAcSWGal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GalNAcBl-4GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 10 GalNAc8l-4GalO-CHo-C(=CH2)-CHo-S-(CH,,)10-COOCH3 GalB1-3GalNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalBl-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 GalB1-3GalNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-(ch^)7-ch3 15 Gal6l-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2

GalS1-3GalNAcO-CH0-C(=CH^)-CH2-S-(CH?)9-COOCH3 Gal5l-3GalNAcO-CH9-C( = CH2)-CH2-S-(CH^)10-COOCH3 Gale1-3GalO-CH,-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3f2 Gala1-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-(CH7)15-CH3)2 20 Galtt1-3GalO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH“)10-COOCH3)-CH2-SO7-(CH2)7-CH3

Galal-3Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)9 Galal-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)?-COOCH3 Gala1-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)~0-COOCH3 25 Glca1-6GlcaWGIca1-*4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Glcel-6Glce1-4Glcal-*4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 Glce1-6Glcol-4Glco1-4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)lo-COOCH3)-CH2-so2-(ch2)7-ch3

Glca1-6Glca1-4Glca1^4Glc0-CH,)-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 30 Glcal.-6Glcal-4Glco1-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Glca1-6Glca1-4G!ca1-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Glca1-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Glca1-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

Glcal-4GlcO-CH7-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO?-(CH9)7- 35 CH3 ' “ 27 20 83659

GlcaWGIcO-CH2-CH(CH2-SO.,-CH2-CH ) GIc«WGIcO-CH2-CC=CH2)-CH2-S-(CH J)/-COOCH, GI«l-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH ) COOCH,

Glc61-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH^)15-CH ) 5 GlcSl-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH^)15-eH2)

Glcä1-4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)^.co3oc2H ,.CH so CH3 j l 1 2 7

GlcS1-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-CH9-CH ) GlcSl-*4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2'S-*(CH2) -COOCHL 10 GlcSl-4GlcO-CH2-C(*CH2)-CH2-S-(CH2) COOCH,

NeuNAco2-3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2) -CH ) 3

NeuNAca2-3GalO-CH2-CH(CH2-SO^-(CH^) .QH )

NeuNAca2-3Gal0-CH2-CH(CH2-S0;-(CH2)1^C00CHO-CH,-S0 - (CH2)7-CH3 4 2 2 15 NeuNAcs2-3Cal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH )

NeuN Acs2^3GalO-CH2'C( = CH2) - CH2-S - (CH2)7-COOCH3 NeuNAca2'3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)“ -COOCH. Neu.NIAca2-*6GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH,) -CH ) 3

NeuNAca2-6Gal0-CH2*CH(CH,-S07-(CH2) 20 NeuNAca2-6Gai0-CH2-CH(CH2-S02-(CH7)^.C00C2H.)-CH,-S0 - (CH2)7-CH3 * 4 2 2

NeuNAca2-6Gal0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3) NeuNAca2-6GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH0)2-COOCH3 NeuNAca2-6GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 25 NeuNActi2-3GalNAcO-CH2-CH(CH2'S-(CH2)1 -CH ) NeuNAca2-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)1 -CH ) NeuNAcB2-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)Jg-C00CH3)-CH2-S02-(ch2)7-ch3

NeuNAca2-3GalNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH )

30 NeuNAca2-3GalNAcO-CH2-C(=CH23-CH2-S-(CH9) -COOCH

NeuNAco2-3GalNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3

NeuN Acct2-6GlcN AcO-CH--CH (CH-j-S - (CH_) -CH 1 4 — 2 15 3 2

NeuNAco2^6GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH:)) -CH ) 2 15 3 2 2i 83659

NeuNAca2-6GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH0) -C00CH3)-CH2-S0 -(ch2)7-ch3 “ 2

NeuNAca2-6GlcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH ) NeuNAca2->6GlcNAcO-CH^-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 5 NeuNAco2-*6GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 NeuNAco2-,8NeuNAcO-CH~-CH(CH0-S-(CH-),_-CH~)- 2 2 2 15 3J2

NeuNAca2-8NeuNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3),

NeuNAca2-8NeuNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH^)10-COOCH3)-CH2-SO - (ch2)7-ch3 " 2 10 NeuNAca2-8NeuNAc0-CH^-CH(CH2-S09-CH,7-CH3)?

NeuNAca2-8NeuNAcO-CH2-C(=CH2)*CH2-S-(CH2)2-COOCH3

NeuNAco2-»8NeuNAcO-CHo‘C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10*COOCH3 GIc51-4GIcS1-4GIcO-CH0-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GIc31-4GIc«1-4GIcO-Ch‘-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 15 GIc21-4G1cS1-4GIcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)*CH2-SO^- (ch2)7-ch3

GlcSil;4Glc31-4GlcO-CH0-CH(CH2-SO^-CH2-CH3)0 ΟΙοδ1-401οδ1·»4ΰΙεΟ-ΟΗΊ-0(=01Η2)-ΟΗ2-$-(θΗ2)2-ΟΟΟΟΗ3 ' GIcS1-4GIcS1-4GIcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 20 Glcsl-4Glcal-4GlcO'CH2-CH(CH2-S-tCH2)15-CH3)2 Glcal-4Gtcal-4GlcO'CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 G 1031-4010=1--40100-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)1Q-COOCH3)-CH2*S07-(ch2)7-ch3 GIc=1-4GIco1-*4G1cO-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 25 Glcal-4Glcal-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Glcal-4Glcal-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Man=l-3(Manol-6)ManO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Manol-3(Manal-6)ManO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 Man = l-3(Manal-6)Man0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2) q-COOCH3)-CH7- 30 SO~- (CH-,)-,-CH_ J 2 2 It 3

Man = l-3(Manol-6)WanO-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 Man=l-3(Mana1-6)ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Man = l-3(Man = l-6)ManO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GalBl-3GalNAc31-*4Gal61-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH-) ..-CH,), • * IJ o z 22 83659

Gal61-3GalNAcBl-4GalBl-4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

Gal61-3GalNAcB1-»4Gal&l-4GlcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)- ch2-so2-(ch2)7-ch3

Gal51~3GalNAcSWGalBl-4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 5 GalSl-3GalNAcBl-4GalBl-4G!cO-CH2-C( = CH2)-CH2*S-(CH2)2-COOCH GalB1-3GalNAcS1-4GalBl-4GlcO-CH2-C(=CH2]-CH2-S-(CH2)10-COOCH GalNAcS1-'4GalB1-*3GalNAcSl-,’4GalBl'»4GlcO-CH2-CH(CH?-S-(CH ) CH3)2 ~ 15

GalNAcSl->4GalB1-»3GalNAcBl"’,4GalBl->4GlcO-CH2-CH(CH2-SO -(CH ) -10 ch3), 2 15

GalNAc&l-*4GalBl-3GalNAcBWGal&WGIc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH ) -cooch3)-ch?-so2-(ch1)7-ch3

GalNAcBl-‘4GalBl-‘3GalNAcBl->4GalBl-*4GlcO-CH2-CH(CH2-S07-CH -CH )? GalNAcBWGalBI-^GalNAcBWGalBI-MGIcO-CH^C^CH^-CH -S-15 (CH7)?-COOCH3 G a IN A c β 1 -4 G a I β 1-3 G a IN A c β 1 4 G a I β 1 -*·4 GI c O - C H 7 - C (= C Η Ί) - C H ^ - S - (ch^)10-cooch3

GaINAcB1-*3Gaia1-»4GalBl-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH^)15-CH ) GalNAcB1-'3Gale1-4GalBl-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)1g-CH ) 20 GalNAcBl-3GalcrWGaiBWG!cO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH7)10-COOCH )- ch2-so2-(ch2)7-ch3

GalNAcB1-*3Gala1-*4GalBl-'4GlcO-CH^-CH (CH2-S02*CH2-CH3)9 GalNAcei-*3Gala1->4GalBl->4GlcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-CCH2)2”cOOCH GalNAcS1-*3Gala1-*4GalBWGIcO-CH,-C(=CH,)-CH,-S-(CH.,) «-COOCH 25 GalNAcB1-3Gala1-3GalBl-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)l5-CH ) GalNAc51-*3Gala1-3GalBl-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2) -CH ) GalNAcfi1-3Gala1-3GalBl-4GlcO*CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH )-ch2-so2-(ch2)7-ch3 3

GalNAcei-*3Gala1-3GalBl->4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)0 30 GalNAcB1-'3Galal-3GalBl-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2) ~COOCH GalNAcBl'*3Ga!a1-*3Gaiei-'4GlcO-CH2-C(::CH2)-CH2'S-(CH ) -COOCH GalB1-'4GlcNAcB1-3GalBl-*4GlcO-CH2'CH(CH2-S-(CH2)1 -CH ) 3

GalB1-4GlcNAcB1-3GalBWGIc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)l5-CH2 ) GalS1-4GlcNAcB1^3GalBl-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2) -COOCH )-35 CH2-S02-(CH2)7-CH3 10 3 23 83059

GalBl-*4GlcNAcSl-3Gal6l-4ClcO-CH,-CH(CH7-SO,-CH,-CH3), GalB1-4GlcNAcBl-*3GalBl-*4GlcO-CH^-C (=CH^") -CH^-S -1 CH^)0*-COOCH3 GalBl^4GlcNAc£l-3Gal5l-4GlcO-CH!J-C(=CH~)-CH”-S-(CH0)10-COOCH3 Gal51-3GlcNAcBl-*3Gal51-3GalB1-4GlcO-CH,”cH(CH0-S-(CH,,)15-CH3)2 5 Gal61-3GlcNAc3l-3GalS1-3GalB1-*4GlcO-CH,,-CH(CH7-S07-(CH2)15-CH3)^ GalBl-3GlcNAcSl-3GalSl-3GalBl-4GlcO-CH^-CH(CH7-SO7-(CHo)10- cooch3)-ch^-so2-(ch,)7-ch3

GalBl-3GlcNAcBl-3Gal6l-3GalBl'4GlcO-CH2-CH(CH,-SO,-CH,-CH3),

GalB1-3GlcNAc3l-3GalB1-3GalBl-4GlcO-CH2*C(=CH2)-CH2-S-~(CH2)2· 10 cooch3

GalBl-3GlcNAc5l^3GalBl-3Ga151-*4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10- cooch3

GalB1^4GlcNAc51-3GalBH4GlcNAcS1-3GalS1-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-

Cch2) 15-CH3^ 2 15 Gal51-4GlcNAc»1-3CalBl-4GlcNAcB1-3GalB1'*4GlcO-CH2-'CH(CH2-SO,- (ch2)15-ch3)2

GalS1-4G!cNAci1-3Ga!5l^4GlcNAc31^3GaiB1-4GlcO-CH2-CH(CH2-SO-)- (ch^)10-cooch3)-ch0-so0-(ch2)7-ch3

Gal51-4GlcNAcSl-3GalB1-4Glc.NAcS1-3GalB1-4GlcO-CH2-CH(CH2-SO,,-20 CH2-CH3)2

GalS1-4GlcNAc3l-3GalSl-4GlcNAcS1-’3GalB1-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2- s-(ch^)?-cooch3

GalS1-4GlcNAc3l-3GalBl^4GlcNAcS1^3GalB1-*4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2- s-(ch2)1q-cooch3 25 CalB1-4ClcNAcSl-2Mana-*3-^ ^^ManBWGIcNAcSGIcNAcO-CH2-CH- (ch2-s-(ch2)15-ch3)2

GalS1“4GlcNAcBl-2Mana1 -*6 Gal31 -4GlcN Ac3l ~*2\1ana-3— 30 ^^ManB1-4GlcNAc5GlcNAcO-CH2-CH- (CH2-S02-(CH,)15-CH3)2

CalS1-4GlcNAc51-»2Manel-6' 24 83659 G ai 51-•AG IcNAcBl-ZMana-S^^^ ^^Man5l-4GlcNAcBGIcNAcO-CH2-CH- /(ch2-so2-(ch2)10-cooch3)-ch2- S0t"(ch2)7-ch3 5 UalB i-‘4(jlcNAc&l^iMana l-b

GaiB1-4GlcN AcSl^ZMana^-^^^ ^^Man6WGIcNAc6GlcNAcO-CH2-CH-/ (ch2-so2-ch2-ch3)2 G a 151-4G IcN Ac 3 1 -2Ma n a 1 -*6 10 GalBl-4GlcNAcBl~2ManeK3<^^ ^^ManSl-4GlcNAc5GlcNAcO-CH2-C-y' (=ch2)-ch0-s-(ch2)2-cooch3 G a 151-4GI c N A c S1-2M a η a 1 -6 ^

Gal21-4Glc\Ac3l-2Manc-3«^^ 15 ^^Man.ftl-4GlcNAc5GlcNAcO-CH2-C- / (=ch2)-ch0-s-(ch?)10-cooch3

GalS1-4GlcNAc51'*2Manal-'6

GalBWCIcNAcSI--------- "*^GalSWGIcNAcS1-3GalBl-4GlcO- 20 ch9-ch(ch2-s-(ch2)15-ch3)2

GalS1-4GlcN AcSl " '

GalSWGIcNAcBl-----_ fGalBl-4GlcNAcBl-3GalBl-4GlcO-CH2- ^^^^c:h(ch2-so2-(ch2)15-ch3)2 25 GalBWGIcNAcSl^"^^

GalSl-4GlcNAc61------ ^Gal3l-4GlcNAcSl^3Gal31-4GlcO-CH0- ^^ch(ch2-so2-(ch2)10-cooch3)-ch2- S02-(CH2)7-CH3 30 Gal51-4GlcNAcSl^^ li 25 83659 --------------------- *3Gal31-4GIcNAc31-3GalBl-4GlcO-CH.,- ^---*** ch(ch^-so0-ch7-ch3)0 G a I β 1 - 4 G1 c N A c β 1 5 GalBl-4GlcNAcB1-------- ^GalBWGIcNAcBl^GalBWGIcO-CH.,- ^ 9 c(=ch2)-ch1-s-(ch,,)0-cooch3

GalB1-*4GlcN Ac3l—

GaIBWGIcNAcBl_______ 10 ?CalB1-4GlcNAcSl-*3CalBl-4ClcO-CH.,- ^— c(=ch2)-ch2-s-(ch2)10-cooch3

Gal8l-*4GlcNAc3l"^

Gal3l-3Gal51-4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)l5-CH3),, Gal6WGal6WGIc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH.,)15-CH3)2 15 Gal51-3Gal51-4GlcO-CH2-CH(CH^-SO7-(CH2)10-COOCH3)-CH1-SO?- (ch2)?-ch3

Gal31-*3Gal31-4Glc0-CH2-CH(CH2'S02-CH2-CH3)2 GalBl-3GalB1-*4GlcO-CH2-C(=CH-,)-CH,-S-(CH2)2-COOCH3 GalBl-3GalB1-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 20 GalB1-3GalB1-3GalBl-*4GlcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)l5-CH3)2

GalB1-3GalBl-3GalBl-*4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2

GalB1-3GalBl-*3GalB1-*4GlcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10*COOCH3)-CH2- so2-(ch2)7-ch3

GalB1-3GalB1^3GalBl-*4GlcO-CH2-CH(CH7-S02-CH2-CH3)2 25 GalBl-3GalB1-3GalB1-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 GalBl-3GalB1-3GalBWGIcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GlcNAcSl-3GalO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GlcNAc31-3GalO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 GlcNAc31-3GaiO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH,,)l0-COOCH3)-CH2-SO2-30 (CH2)7-CH3

GlcNAcS1-3Gal0-CH^-CH(CH2-S02*CH2-CH3)2

GlcNAcS1-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S*(CH^)2-COOCH3 26 83659

GlcNAcBl-3GalO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 GaieWGIc(3Me)0-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalBl-4Glc(3Me)0-CH2-CH(CH2-S02-(CH7)15-CH3)2 Gal&WGIc(3Me)O-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2-SO2-5 (CH2)?-CH3

Gaiei-4Glc(3Me)0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GalSl-4Glc(3Me)0-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-C00CH3 GalB1-4Glc(3Me)O-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH0)10-COOCH3 Galal-4Gal(3Me)0-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 10 Galal-4Gal(3Me)O-CH2-CH(CH9-SO2-(CH0)15-CH3)2

Galc*l-4Gal(3Me)O-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)10-COOCH3)-CH2*SO2- (ch2)7-ch3

GaleWGal(3Me)0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 GalBl-4Gal(3Me)0-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2)2-C00CH3 15 Galel-4Gal(3Me)0-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Gal61-4Glc(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 Gal31-4Glcf.3CH20H)0-CH,-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3), Gal61-4Glc(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)1^C00CH3)-CH2-S02-(ch2)7-ch3 20 Gal61-‘4Glc(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)

Gal61-4Glc(3CH20H)0-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-C00CH3 Gal31-4Glc(3CH2OH)O-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Galal-4Gal(3CH2OH)0-CH2-CH(CH9-S-(CH2)15-CH ) Galal-*4Gal(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 25 Galal-4Gal(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S02-(CH2) -COOCH3)-CH--SO--(ch2)7-ch3 2

Galal-4Gal(3CH20H)0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH ) Galal-4Gal(3CH20H)0-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH23) 2-COOCH Galol-t4Gal(3CH?OH)0-CH~-C(=CH7)-CH~-S- (Cl-L) -COOCH . 30 Ca1a,-4CälM-402,cO-CH2-C2H(CH2-S2-(CH22)15-CH32,10 3

Galal-4Gal0WGIcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH2)15-CH2 )

Galal^4Gal61MGIc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH ) -C00C2H.)-CH,-S0,- (ch2)7-ch3 J 2 2

Galol-4GalBl-*4GlcO-CH,-CH(CH,-SO,-CH.,-CH 1 *· * *· 2 3'2 27 83 659

Gala1-MGal61-MGIcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)2-COOCH3 Gala1-4Gal61-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 Galal-4Gal61-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S-(CH2)15-CH3)2 GalaWGalBWGIcNAc0-CH2-CH(CH2-S02-(CH.,)15-CH3)2 5 Gala1-*4GalBl-*4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH‘)10-COOCH3)-CH2-so2-(ch2)7-ch3

Gaia1-4GalB1-4GlcNAcO-CH2-CH(CH2-S07-CH0-CH3)2 Gala1-4Gal61-»4GlcNAcO-CH7-C(=CH2)-CH2-S-CCH0)2-COOCH3 Gala1-4GalSl-4GlcNAcO-CH2-C(=CH2)-CH2-S-(CH2)10-COOCH3 10 Glcal-*6Glcal-4GlcO-CHT-CH(CH2-S-(CH7)15-CH3)? Clcel-6Glcal-4GlcO-CH2-CH(CH2-S02-(CH2)15-CH3)2 Glcal-6Glca1-4GlcO-CH2-CH(CH2-SO2-(CH7)10-COOCH3)-CH0-SO?-(ch2)7-ch3

Glcal-6Glca1-4Glc0-CH2-CH(CH2-S02-CH2-CH3)2 15 Glcal-6Glcal-4GlcO-CH2-C( = CH2)-CH2-S-(CH2),-CCOCH3 Glcal-6Glcal-4GlcO-CH2-C(=CH2)-CH?-S-(CH2)‘0-COOCH3

Luetelluissa yhdisteissä voi kysymyksessä olevan hiilihydraattiosan ja kysymyksessä olevan aglykoniosan väli-20 nen sidos olla jokooC- tai p-konfiguraatiossa.

Eräässä erilaisessa mielenkiintoisten kaavan I mukaisten yhdisteiden luokassa ja R3 ovat H ja R2 on -S02~R4-R5, jossa R4 ja R,. ovat yllä määritellyn mukaisia. Näilllä yhdisteillä on rakenne, jossa dimetyleeniryhmä yh-25 distää glykosidisen hapen ja sulfoniryhmän. Esimerkkeinä tällaisten yhdisteiden hiilihydraattiosuudesta voidaan mainita yllä luetteloidut hiilihydraattiosat.

Yhdisteet, joiden aglykoniosa päättyy amino-, hyd-roksi- tai merkaptoryhmään, ovat myös mielenkiintoisia.

30 Tällaisiin yhdisteisiin sisältyvät yhdisteet, joissa R3 on H ja R1 ja R2 ovat kaavan II mukaisia ryhmiä, samoin kuin yhdisteet, joissa R2 ja R3 yhdessä muodostavat =CH2 ja R^ on kaavan II mukainen ryhmä. Tällaisten yhdisteiden mahdollisuuksiin kuuluu kyetä reagoimaan kaavan 1' mukais-35 ten yhdisteiden kanssa, joissa R3 on H ja R^ ja R2 ovat 28 8 3 659 toisistaan riippumatta ryhmä -CH2X, jossa X on poistuva ryhmä, tai varsinkin kaavan 1' mukaisten yhdisteiden kanssa, joissa R2 ja R3 yhdessä muodostavat =CH2 ja R3 on ryhmä -CH2X, jossa X on poistuva ryhmä. Yhdistämällä yh-5 disteitä, joissa on vapaa amino-, hydroksi- tai merkapto-ryhmä, yhdisteiden kanssa, joissa on poistuva ryhmä X, voidaan saada bis- tai trisglykosideja, jolloin sama suhteellisen pieni molekyyli sisältää 2 tai 3 hiilihydraat-tiosaa. Hiilihydraattiyksiköt voivat olla identtisiä, tai 10 ne voivat olla erilaisia, jolloin on mahdollista saada yhdisteitä, joilla on monenlaisia spesifisyyksiä.

Kaavan I mukaisia O-glykosidiyhdisteitä voidaan valmistaa siten, että a) kun R3 on H ja R: ja R2 tarkoittavat yllä mää-15 ritellyn kaavan II mukaista ryhmää, O-glykosidi, jonka kaava on CH0X I 2

(Sokeri) - 0 - CH_ - CH VI

n 2 I

20 CH2X

jossa sokeri ja n tarkoittavat samaa kuin edellä ja X on poistuva ryhmä, saatetaan reagoimaan tiolin kanssa, jonka kaava on ; 25

HS - R„ - R_ VII

4 5 jossa R4 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja haluttaessa tuote saatetaan reagoimaan hapettimen kanssa; tai 30 b) kun R2 ja R3 yhdessä muodostavat ryhmän =CH2 ja R3 on yllä määritellyn kaavan II mukainen ryhmä, jossa m, p, R4 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, O-glykosidi, jonka kaava on 35 CH0 H 2

(Sokeri) - 0 - CH2 - C - CH2 - X VIII

li 29 8 3 659 jossa sokeri, X ja n tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan yllä määritellyn kaavan VII mukaisen tiolin kanssa, ja haluttaessa tuote saatetaan reagoimaan hapettimen kanssa.

5 Menetelmävaihtoehto a) voidaan suorittaa vedessä tai aproottisessa tai proottisessa, poolisessa tai poo-littomassa orgaanisessa liuottimessa, kuten esimerkiksi etyyliasetaatissa, metyleenikloridissa, eetterissä ja di-metyylisulfoksidissa. Reaktiolämpötila ei ole kriittinen, 10 ja reaktio voidaan suorittaa lämpötiloissa, jotka ovat väliltä -30°C - +150°C, yleensä väliltä 0°C - 50°C, kuten esimerkiksi huoneen lämpötilassa. Reaktioaika voi olla 0,1 - 200 tuntia, yleensä 10 - 72 tuntia, kuten esimerkiksi 24 - 48 tuntia. Reaktio suoritetaan yleensä käyt-15 täen hiukan enemmän kuin 2 ekvivalenttia kaavan VII mukaista tiolia yhtä ekvivalenttia kohti kaavan VI mukaista O-glykosidia. Yleensä on tarpeen lisätä reaktioseokseen emästä, vaikka emäs ei saisi olla liian vahva. Esimerkkejä käyttökelpoisista emäksistä ovat cesiumkarbonaatti, 20 kaliumkarbonaatti, natriumkarbonaatti, natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi samoin kuin pyridiini ja substituoidut pyridiinit. Emäs pitäisi mieluimmin lisätä tiolin jälkeen, jotta vältettäisiin eliminaatioreaktioiden tapahtuminen kaavan VI mukaisessa O-glykosidissa. Kaavan VI mu-25 kaisen O-glykosidin hiilihydraattiosassa voidaan käyttää sinänsä tunnettuja suojaryhmiä. Tuoteyhdiste voidaan puhdistaa ja siitä voidaan poistaa suojaus sinänsä tunnetulla tavalla.

Saatujen tioyhdisteiden hapettaminen voi tapahtua 30 kahdenasteisesti, nimittäin joko liittämällä yksi happi atomi kuhunkin rikkiatomiin, jolloin saadaan sulfoksidit, tai liittämällä kaksi happiatomia kuhunkin atomiin, jolloin saadaan vastaavat sulfonit. Jotta hapetettaisiin ainoastaan sulfoksidiyhdisteiden, käytetään kahta ekviva- 3o 8 3 659 lenttia hapettavia aineita. Hapetettaessa sulfoneiksi käytetään neljää ekvivalenttia tai enemmän hapettavaa ainetta. Esimerkkejä sopivista hapettavista aineista ovat perhapot, esim. mklooriperbentsoehappo; peroksidit, esim.

5 tert.butyylihydroperoksidi; amino-oksidit, happikaasu tai sellaiset epäorgaaniset hapettavat aineet kuin kaliumpermanganaatti, kromitrioksidi jne. Hapetusreaktio voidaan suorittaa samassa väliaineessa kuin sitä edeltävä tioeet-terinmuodostusreaktio ja puhdistamatta bis-tioyhdistettä 10 tai poistamatta siitä suojausta. Reaktio suoritetaan lämpötilassa, joka on väliltä -78°C - +100°C, yleensä väliltä 0°C - 50°C, kuten esimerkiksi huoneen lämpötilassa.

Menetelmävaihtoehdossa b) reaktio tiolin kanssa voidaan suorittaa samoissa olosuhteissa kuin jotka on ku-15 vattu vastaavaa tioeetterin muodostusvaihetta varten menetelmässä a), vaikka nyt kysymyksessä olevassa menetelmässä emäs voidaan lisätä ennen tiolia. Hapetusreaktio voidaan suorittaa käyttäen samoja hapettavia aineita kuin jotka on kuvattu menetelmässä a) ja samoissa olosuhteis-20 sa, sillä erotuksella, että valmistettaessa sulfoksidi käytetään vain yhtä ekvivalenttia hapettavaa ainetta ja valmistettaessa sulfoneita käytetään kahta tai useampia ekvivalentteja hapettavia aineita. Tuotteet voidaan puhdistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

. 25 Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää syn teettisinä reseptoreina suurelle määrälle biologisia kokonaisuuksia. Luonnon reseptoreiden reseptorispesifinen yksikkö on yleensä hiilihydraattiyksikkö, vaikka osia "välikevarresta", johon hiilihydraattiyksikkö on kiinnit-30 tynyt, voi myös olla muodostamassa osaa reseptorista tarjoamalla spesifisen ympäristön ja/tai ulkoisen kolmiulotteisen muodon reseptoriyksikölle. Yleensä valitaan kaavan I mukaisiin yhdisteisiin hiilihydraattiosa sen mukaan, minkä tyyppiselle kokonaisuudelle (esim. mikro-organis- il si 83659 mille, virukselle, veren proteiinille, vasta-aineelle jne.) reseptori halutaan. Kaavan I mukaisen yhdisteen ag-lykoniosa määrää yleensä fysikaalisen tavan, jolla reseptoria käytetään. Siten aglykoniosa voi toimia lipidinä 5 (jossa on joko yksi tai kaksi lipofiilistä "häntää"), mikä tekee mahdolliseksi yhdisteiden sijoittamisen biologiseen kalvoon tai misellin välityksellä. Johtuen aglykoni-osuuden sen osan rakenteesta, joka on lähellä hiilihyd-raattiyksikköä, kykenevät kaavan I mukaiset yhdisteet 10 jäljittelemään luonnon reseptoreita. Tämä rakenteen samankaltaisuus käy selvästi ilmi verrattaessa alla esitettyä synteettisten glykolipidien rakennetta aikaisemmin esitettyyn luonnon glykolipidien rakenteeseen.

Lisäetu kaavan I mukaisilla yhdisteillä, joissa 15 R3 = H, R3 = -CH2-S(0)ia(0)p-R4R5, jossa R4 = alkyyliketju ja R5 = COOH, ja R2 = -CH2-S(0)m(0)p-R4R5, jossa R4 = alkyyliketju ja R5 = CH3 tai COOH, on, että nämä yhdisteet ovat vesiliukoisia ollen samanaikaisesti luonnon glykolipidien "jäljitelmiä". Tämä on uusi fysikaalinen ominaisuus yh-20 disteillä, jotka käyttäytyvät samankaltaisella tavalla kuin luonnon glykolipidit reseptoriaktilvisuuden osalta esim. viruksia kohtaan (kts. tuonnempana).

Allyylitioyhdisteillä on etu, että niitä voidaan helposti hydrata (vrt. A.S. Birch ja K.A.M. Walker, Tet-: 25 rahedron Lett. (1967) s. 1935). Tätä voidaan soveltaa tämän keksinnön mukaisiin allyylitioglykosideihin merkitsemällä ne radioaktiivisuudella katalyyttisen tritium-käsittelyn avulla.

30 35 32 8 3 659

Synteettisiä glykolipidejä < S Bis-tioglykol ipidi

Sokeri 5 ? \ ' Bis-sulfoksidiglykolipidi

Sokeri o o o

Sokeri Allyylitioglykol ipidi Käyttämällä molekyylissä sulfoksidi- tai sulfoni-ryhmiä on mahdollista "hienosäätää" aglykoniosan hydro-fiilisiä/hydrofobisia ja poolisia/poolittomia ominaisuuk-20 siä, mikä voi olla tärkeää esim. yritettäessä jäljitellä luonnon reseptoreita, joissa osa aglykoniosuudesta myös määrittää reseptoria, kuten esimerkiksi sekundaarisessa läpitunkeutumisreseptorissa eräillä viruksilla.

Aglykoniosa voi myös olla "välikevarsi", joka on 25 kiinnittynyt yllä esitetyn tyyppiseen kantaja-aineeseen; tai aglykoniosa voi olla reaktiokykyisen pääteryhmän omaava yksikkö, mikä mahdollistaa minkä tahansa spesifisen reseptorin sijoittamisen esim. jonkinlaiseen kantaja-rakenteeseen. Reaktiokykyisen pääteryhmän aktivointi oli-30 si mahdollista suorittaa joko ennen reseptorin kiinnittymistä aineeseen, jota varten se on suunniteltu, tai yhtä hyvin kiinnittymisen jälkeen. Eräs tämän keksinnön keskeinen asia on mahdollisuus sijoittaa haluttuun rakenteeseen helposti reseptoreita, jotka ovat spesifisiä suu-35 relle määrälle biologisia aineita. Keksintö avaa lukuisia i; 33 83659 mahdollisuuksia. Kaavan I mukaiset yhdisteet voivat muodostaa osan sellaisista tuotteista tai ne voidaan sisällyttää sellaisiin tuotteisiin kuin farmaseuttiset valmisteet, jotka on tarkoitettu bakteeri- tai virustautien 5 hoitoon tai ennakkotorjuntaan (esim. ruiskutettavat aineet, jotka sisältävät misellejä, liposomeja tai mikroskooppisia pallosia, siirrännäiset, tabletit, pastillit tai purtavat tabletit suunsisäistä ennakkotorjuntakäyttöä varten jne.); diagnostiikan välineet esimerkiksi RIA- ja 10 ELISA-menetelmiä varten, diagnostiset mittauspuikot, agg-lutinaatiotarvikepakkaukset, immunologiset testikortit tai verikoekortit (liittämällä kaavan I mukaiset yhdisteet sopiviin kantaja-aineisiin, kuten esimerkiksi muo-veihin); desinfiointivälineet, kuten esimerkiksi nesteet 15 (esim. leikkaushaavojen puhdistukseen) tai silkkipaperit, jotka sisältävät määrätyille biologisille vaikuttajille spesifisiä reseptoreita (esim. sellaisille viruksille kuin vilustumis-, herpes- ja muille viruksille, bakteereille, jotka aiheuttavat erilaisia tartuntatauteja, 20 jne.).

Virus- tai bakteeritartuntatautien hoidon tai ennakkotorj unnan osalta liittyy eräs tärkeä käyttömahdollisuus epiteelisoluihin ja eri tartuntojen sisääntulokoh-tiin. Esimerkkejä tällaisista sisääntulokohdista ovat 25 silmän, nenän, suuontelon, kurkun, hengitystien, ruoansulatuskanavan, virtsatien ja sukupuolielinten limakalvot. Hoito tai ennakkotorjunta voidaan toteuttaa käyttämällä kaavan I mukaisia yhdisteitä suoraan limakalvoille farmaseuttisesti hyväksyttävässä muodossa, kuten esimerkiksi .30 suspensiona, aerosolina, voiteena tai liuoksena. Limakal- . . voilla aktiiviset yhdisteet sitoutuvat bakteereihin tai erityisesti viruksiin vähentäen siten kysymyksessä olevien organismien tartuntakykyä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan kuitenkin 35 myös käyttää koko elimistöön vaikuttavina aineina, jotka 34 83 6 59 annetaan ruiskeena laskimoon, lihakseen, vatsaontelon sisään tai ihon alle. Tähän käyttöön soveltuva valmiste voi olla joko kiinteässä muodossa olevien yhdisteiden tai yhdisteiden, jotka on liitetty erilaisiin yllä kuvattuihin 5 kantaja-aineisiin, liuos, emulsio tai suspensio. Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan myös antaa nenä- tai suusuih-keiden muodossa.

Muita kaavan I mukaisten yhdisteiden käyttömuotoja ovat virtsatien, suoliston jne. huuhtominen.

10 Vielä eräs mielenkiintoinen kaavan I mukaisten yh disteiden käyttö on rokotteina. Jos hiilihydraattiosa on tyyppiä, joka esiintyy bakteereissa ja/tai viruksissa, voivat sellaiset kaavan I mukaiset yhdisteet toimia antigeeneinä, jotka panevat alulle vasta-aineiden muodostumi-15 sen isäntäeläimessä, esim. ihmisessä. Kykyä saada aikaan vastaaineiden muodostumista voidaan kuitenkin myös hyödyntää in vitro monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen soluviljelmissä.

Koska reseptorispesifinen sitoutuminen siittiöiden 20 ja munasolujen välillä perustuu myös hiilihydraatteihin, .. . voidaan myös pitää mahdollisena kaavan I mukaisten yhdis teiden käyttöä hedelmöitystä ehkäisevänä aineena, joka on sisällytetty esim. emättimensisäiseen välineeseen, kuten sieneen tai tamponiin.

25 Farmaseuttinen valmiste voi olla tablettien, kap seleiden, pastillien, siirappien, ruiskutettavien liuosten, ruiskutettavien emulsioiden, siirrännäisten tai peräpuikkojen muodossa. Kantaja-aine voi olla mikä tahansa alalla yleisesti käytetyistä kantaja-aineista. Kiinteissä 30 valmisteissa voidaan käyttää tavanomaisia kiinteitä kantaja-aineita, jotka eivät ole myrkyllisiä, esim. farmaseuttista laatua olevaa mannitolia, laktoosia, tärkkelystä, magnesiumstearaattia, natriumsakkariinia, talkkia, selluloosaa, glukoosia, sakkaroosia, magnesiumkarbonaat-35 tia tai vastaavaa. Nestemäiset lääkkeinä annettavat vai- li 35 83 659 misteet voidaan esim. valmistaa liuottamalla, dispergoi-malla jne. aktiivinen yhdiste ja mahdollinen farmaseuttinen apuaine kantaja-aineeseen, kuten esimerkiksi veteen, suolaveteen, dekstroosin vesiliuokseen, glysero-5 liin, etanoliin jne., jotta saataisiin liuos tai suspensio. Haluttaessa voi annettava farmaseuttinen valmiste myös sisältää pieniä määriä lisäaineita, jotka eivät ole myrkyllisiä, kuten esimerkiksi kostutus- tai emulgointi-aineita, pH-puskureita jne., esim. natriumasetaattia, 10 sorbitaanimonolauraattia, trietanoliamiinia jne. Aktiivinen yhdiste voidaan myös kaavata peräpuikoiksi käyttäen kantaja-aineena esim. polyalkyleeniglykoleja, kuten esimerkiksi propyleeniglykolia. Tällaisten annostusmuotojen varsinainen valmistus on alan asiantuntijoille tuttua tai 15 selvää, vrt. esim. Remingtons Pharmaceutical Sciences,

Mack Pub-lishing Company, Easton, Pennysylvania, 15. painos, 1975.

Valmistettaessa laskimoruiskeita liuotetaan yhdiste (mahdollisesti sidottuna kantaja-aineeseen) vesiväli-20 aineeseen, joka on puskuroitu haluttuun pHrhon ja jonka isotoonisuus on säädetty.

Koska kaavan I mukaiset yhdisteet ovat hyödyllisiä käytettyinä limakalvoilla, voidaan yhdisteet myös antaa aerosolimuodossa.

25 Aerosolina annettaessa aktiivinen yhdiste annetaan mieluimmin hienoksi jauhettuna yhdessä pinta-aktiivisen aineen ja ponneaineen kanssa.

Annostukset, joina kaavan I mukaiset yhdisteet annetaan, voivat vaihdella suuresti määräytyen aiotun käy-30 tön perusteella, sen mukaan, onko kysymys ennakkotorjun-nasta, mukaan luettuna desinfiointi, vai hoidosta, vastustettavan infektiotyypin, potilaan iän ja tilan jne. perusteella, mutta sen oletetaan olevan milligrammatasoa. Rotavirustartunnan (ripulin) ollessa kysymyksessä on päi-35 väännöksen, joka on 1 mg reseptoria ihmisyksilöä kohden, 36 83659 laskettu agglutinoivan/inaktivoivan kaikki yhden päivän aikana tuotetut virukset, edellyttäen, että reseptori on kaksiarvoinen ja että käytetään vain yhtä bivalenttista reseptoria yhtä virushiukkasta kohden. Käytännössä tarvi-5 taan luonnollisesti paljon suurempi annostus varmistamaan kaikkien läsnä olevien virushiukkasten tehokas sitoutuminen. Päinvastoin kuin useimpien nykyään käytettävien lääkkeiden kohdalla, ei annostustaso välttämättä ole niin tärkeä, koska kaavan I mukaisten yhdisteiden myrkkyvaiku-10 tusten oletetaan olevan häviävän pieniä, koska itse asiassa ainakin luonnon reseptorit ovat aineita, joita on läsnä suuria määriä ihmisen tai eläimen elimistössä. Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Valmistus 1 15 3-bromi-2-bromimetyylipropan-l-oli (DIBol) 3-bromi-2-bromimetyylipropaanihappoa (15,3 g; 62 mmoolia) (vrt. A.F. Ferris, J. Org. Chem., 20 (1955), s, 780) liuotettiin kuivaan dikloorimetaaniin (400 ml) ja jäähdytettiin (0°C). Reaktioseos pidettiin typpikaasun 20 alla. Lisättiin tipoittain liuos, jossa oli diboraania tetrahydrofuraanissa (190 ml; 190 mmoolia; 1 M BH3;n liuos THF:ssä) sekoittaen. Yhden tunnin kuluttua poistettiin jäähdytyshaude ja seos jätettiin yön ajaksi huoneen lämpötilaan. Lisättiin kloorivetyhappoa (210 ml; IM), : 25 orgaaninen faasi erotettiin ja vesifaasia uutettiin di-kloorimetaanilla (3 x 50 ml). Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin (Na2S04) ja konsentroitiin. Suorittamalla jäännökselle pikakromatografointi saatiin puhdasta DIBol (13,8 g; 96 %). K.p. noin 45°C (0,1 mm Hg); n” 1,5439; 30 IR-spektri: vmax=3340 cm1 1H-NMR (CDC13, Me4Si) δ(ppm) = 3,79 (d, 2 H, J = 6,0

Hz, CH2-0), 3,59 (d, 4 H, J = 5,7 Hz, CH2Br), 2,27 (heptetti, 1 H, J = 6 Hz, CH(CH2)3; 13C-NMR (CDC13, Me4Si); 6(ppm)= 62,4 (CH2OH), 44,4 (CH), 35 32,8 (CH2Br); 11 37 83659

Analyysi laskettuna yhdisteelle C.HoBr_0: C 20,7 H 3,48 4 o Δ

Saatu: C 21,0 H 3,73

Esimerkki 1 DIB-glykosidien valmistus 5 (a) Booritrifluoridieetteraattia (0,7 ml) lisättiin tipoittain, sekoittaen liuokseen, jossa oli täysin asety-loitua sokeria (1 mmooli) ja DIBol (232 mg; 1 mmooli) dikloo-rimetaanissa (3 ml) huoneen lämpötilassa. 2-4 tunnin kuluttua seos pestiin vedellä ja natriumvetykarbonaattiliuoksella, 10 kuivattiin (Na2S04) ja konsentroitiin. Jäännös kromatogra-foitiin (Si02, etyyliasetaatti: heksaani), jolloin saatiin DIB-glykosidi puhtaana (katso taulukkoa 1). Valmistettiin seuraavat yhdisteet: 3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-15 ji-D-glukopyranosidi (DIB-1). 1 ,2,3,4,6-penta-0-asetyyli-/3 -D- O O " glukopyranoosista. Saanto: 54 %. C^J^ = -5° (c = 0,6 CDCl^:ssa) .

NMR-spektri (CDcf.,. TMS): a (ppm) -- 5,22 (t, 1 H. J, ,=J, =9 7

Hi, H-3), 5,1 (t, 1 H, J4 5=9,4 Hz. H-4), 4,99 (t. 1 H. H-2)[ 4,51 : (d' 1 H' J1,2=7'9 Hz' H*1}' 4t27' 4>15 (ABq lisäkytkennällä, ku- ^in 1 H' JAB=12'6 Hz' J5,6=4’° Hz' h‘6'6'), 3,71 (m, 1 H, H-5), :·. 2,34 (m, 1 H, CW(CH2)3).

Analyysi: 25 Laskettu yhdisteelle ci8H26Br2°10: C 28'5 H 4,66

Saatu: C 38,4 H 4,69 3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-β-D-galaktopyranosidi (DIP-2). 1,2,3,4,6-penta-0-asetyyli-f?-D-galaktopyranoosista. Saanto: 50 %. /cCJ^ = +1° 30 (c =0,7 CDC13:ssa).

NMR-spektri (CDCl-j, TMS): δ (ppm) = 5.40 (d, 1 H, j3 4=3.2 Hz, H-4), 5,19 (dd, 1 H, ->2,3=10'4 Hz' H'2)' 5,03 (dd, 1 H, H-3). 4,47 ; (d, 1 H, J.j 2=2r8 Hz, H-1), 4,19, 4,13 (ABq lisäkytkennällä ku-35 kin 1 H, -)^^^1^2 Hz, Hz, H-6,6 ), 3,92 (t, 1 H, J4 5=0'4 Hz' H-5), 2'35 (septetti,1 H, J=5,8 Hz, CH(CH2)3).

i j 38 83659

Metyyli(3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyli-2,3,4-tri-0-asetyyli-/?-D-glukopyranosidi) uronaatti (DIB-3) .

Metyyli (1 ,2,3, 4-tetra-0-asetyy li-jb-D-glukopyranoosi) uronaa-tista. Saanto: 26 %. = +3° (c = 1,1 CDCl^ssa).

5 NMR-spektri (CDCLj. TMS): δ (ppm) = 5,33-5,16 (m, 2 H, H-3,4), 5,01 (m, 1 H, H-2), 4,55 (d, 1 H, J1 ,=7,6 Hz, H-1), 4,04 (d, 1 H, J4 5=9,4 Hz, H-5), 3,77 (s, 3 H, OCH-j), 2,34 (septetti,1 H, J=6,1 Hz. CW(CH0)3).

10 3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyli-3,4,6-tri-0-asetyyli-2-deoksi-2-ftaali-imido-f^-D-glukopyranosidi (DIB-4).

1,3,4,6-tetra-0-asetyyli-2-deoksi-2-f taal i-imido-oC/ fl-D-glukopyranoosista (**./ p-suhde 1/1). Saanto: 52 %.

/otj23 = +20° (c = 1,0 CDCl3:ssa).

15 NMR- spektri (CDCLj, TMS): δ (ppm) = 5,82 (t, 1 H, J3 4=10,1 Hz, H-3), 5,36 (d, 1 H, J12=8,3 Hz, H-1), 5.17 (t, 1 H, J4'5=10,1 Hz.

H-4), 4,32 (dd, 1 H, J^3=10,4Hz, H-2), 4,33, 4,19 (ABq lisäkyt-kennällä, kukin i £ JAB=12,2 Hz, J5 6=5,0 Hz, J ,..=2,2 Hz, .. . H-6,6'), 3,89 (m, 1 H, H-5), 2,24 (m, 1 H, J=5,8 Hz, CW(CH2)3).

• 20 3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyii-2,3,4-tri-0-asetyyli- r(_-D-ksylopyranosidi (DIB-5). 1 ,2,3,4-tetra-0-asetyyli-°^/ [i -D-ksylopyranoosista (°C/β -suhde 1/1). Saanto 50 %.

/(öcj23 = _25° (c = 0,9 CDC13;ssa>· 25 NMR-spektri (CDCI3, TMS): δ (ppm) = 5,18 (t, 1 H, J2 3=->3 4=S,3

Hz, H-3), 4,98-4,89 (m, 2 H, H-2,4), 4,49 (d, 1 H, jj ,=6,7 Hz, H-1), 4,14, 3,39 (ABq lisäkytkennällä, JABS11,5 Hz, J4 5=5,0 Hz* J4,5,=9<0 Hz' ^-5,5’), 2,34 septetti j=5,6 Hz, CH(CH2)3).

3-bromi-2-bromiraetyyliprop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-30 (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- P-D-galaktopyranosyyli)-β-D-glukopyranosidi (DIB-6). 1,2,3,6-tetra-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- ^ -D-galaktopyranosyyli) — f3—D— glukopyranoosista. Saanto: 60 %. [°Cj^ = -6° (c = 0,7 CDCl^:ssa).

Il 39 83659 NMR-spektri (CDCI3, TMS): 6 (ppm) = 5..35 (d, 1 H, J3. *2,9 Hz, H-4), 5,20 (t. 1 H, J2 3=9r0 Hz, H-2), 5,11 (dd, 1 H,'jr .=7,9 Hz, J2.f3 =10,l Hz, H-2’*), 4,95 (dd, 1 H, H-3’), 4,89 (t, 1 H, J3 4= 9;0 Hz, H-3), 4,50, 4,47 (kaksi d,kukdn1 H, J=7,9 Hz, H-1,1’), 2*23 5 fceptetti, 1 H, J=5,8 Hz, CH(CH2)3).

Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C3qH4 2^2^1 8: ^ 4,98

Saatu: C 42,4 H 4,92 10 3-bromi-2-bromimetyyliprop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4- 0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-c?C-D-galaktopyranosyyli) - p> -D-galaktopyranosidi (DIB-7). 1,2,3,6-tetra-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-oC-D-galaktopyranosyyli)-oc-D-galaktopyranoosista. Saanto: 43 %. D - +68,6° 1b (c = 1,5 CDCl^ssa).

NMR- spektri (CDCI3, TMS): δ (ppm) = 5,58 (dd, 1 H, J^. ^.-1,0 Hz, H-4’), 5,39 (dd, 1 H, J2· 3.=10,8 Hz, H-2’), 5,20 (dd, 1 H, J3> 4<=3,6 Hz, H-3’), 5,17 (dd, ί H, .)^3=10,8 Hz, H-2), 5,01 (d, 1 .. . H,'jv 2=3,2 Hz, Η-Π, 4,82 (dd, 1 H, J3 ^=2,9 Hz, H-3), 4,47 (d, 20 1 H, jj 2=7,6 Hz, H-1), 2,37 feeptettL,! H, J=5,8 Hz, CHiCH^).

' (b) Asetobromilaktoosia (3,15 g; 4,51 mmoolia) ja : hopeatrifluorimetaanisulfonaattia (1,93 g; 7,5 mmoolia) kui vattiin kaksiosastoisessa reaktioastiassa, kuten ovat kuvan-25 neet Nashed & Andersson (1982). Lisättiin DIBol (1,25 g; 5,39 mmoolia) dikloorimetaanissa (10 ml) ja tetrametyyli-ureaa (1,3 g; 11,3 mmoolia) dikloorimetaanissa (10 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin yön ajan. Reaktioastia suojattiin valolta alumiinikalvon avulla. Kun asetobromilaktoosi oli 30 kulunut loppuun, reaktioseos suodatettiin seliitin läpi, konsentroitiin ja kromatografoitiin, jolloin saatiin DIB-/3-laktosidi (DIB-6, 2,7 g; 73 %) ; katso yltä ja taulukkoa 1.

Käyttäen samaa menetelmää kuin yllä, mutta 2,3,6-tri-O-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-<£*D-galakto-35 pyranosyyli)-°C-D-galaktopyranosyylibromidia (2,65 g, 4o 83659 3,80 mmoolia) (vrt. Dahmen et al., Carbohydr. Res., 116 (1983)) ja asetyloimalla raaka reaktioseos, saatiin eristettyä DIB-7 (1,88 g, 39 %) ja vastaava oC-glykosidi (0,24 g, 7 %).

5 (c) DIB-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/¾-D-glukopyranosidi (562 mg; 1 mmooli) voidaan deasetyloida, kuten on kuvattu esimerkissä 2, jolloin saadaan DIB-β-D-glukopyranosidi, joka muutetaan DIB-4,6-bentsylideeni- β-D-glukopyranosidiksi käsittelemällä dimetoksitolueenilla happamissa olosuhteissa. 10 Käsittelemällä bentsyylikloridilla ja natriumhydridillä dimetyyliformamidissa saadaan DIB-2,3-di-0-bentsyyli-4,6-bentsylideeni- β-D-glukopyranosidi, joka puolestaan pelkistetään natriumsyanoboorihydridillä eetterissä (vrt. Nashed & Andersson (1982), jolloin saadaan 2,3,6-tri-0-bentsyyli-/3 -D-1b glukopyranosidi. Reaktiosta asetobromigalaktoosin ja hopea-trifluorimetaanisulfonaatin (AgTf) kanssa, suoritettuna pääosiltaan samoin kuin kohdassa (b) yllä, saadaan odotettu DIB-laktosidi, jota hydrataan, jotta bentsyyliryhmät lohkeai-.. . sivat pois. Asetyloimalla normaalilla tavalla ja sen jälkeen 20 kromatografoimalla saadaan puhdasta DIB-laktosidiä (DIB-6), joka on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 25 Rc %J—o J\fi y H «;

II

4i 83659

Yhdiste nro *1 R2 ^3 ^4 ^5 ^6 5 DIB-1 DAca H OAc OAc H CH2OAc DIB-2 OAc H OAc H OAc CH2OAc

Dl 3-3 OAc H OAc OAc H COOCH3 DIB-4 NPhthb H OAc OAc H CH2OAc

Dl 3-5 OAc H OAc OAc H H

10 DIB-6 OAc H OAc GalAcSC H CH2OAc DIB-7 OAc H OAc H GalAcad CH^OAc a) Ac = asetyyli; b) Phth = ftaloyyli; c) GalAc/3 = 15 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- fb -D-galaktopyranosyyli; d) GalAcct = 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-°c-D-galaktopyranosyyli.

Esimerkki 2

Bis-sulfidiglykosidien valmistus Täysin asetyloitua DIB-glykosidia (0,38 mmoolia), 20 alkyylitiolia (1 mmooli), cesiumkarbonaattia (338 mg; : 1 mmooli) ja dimetyyliformamidia (2 ml) sekoitettiin huoneen ; ' lämpötilassa typpikaasun alla 24-48 tunnin ajan. Reaktiota seurattiin ohutkerroskromatografiän (TLC) avulla (Si02, • etyyliasetaatti: heksaani). Lisättiin dikloorimetaania 25 (40 ml) ja seos pestiin vedellä (2x5 ml), kuivattiin (Na2SO^) ja konsentroitiin. Pylväskromatografiän avulla (Si02, etyyliasetaatti: heksaani) saatiin puhdas, täysin asetyloitu glykosidi (katso taulukkoa 2).

Asetyloitu glykosidi (0,2 mmoolia) liuotettiin dikloo-30 rimetaaniin (15 ml) ja lisättiin natriummetoksidin metanoli-liuosta (10 ml; valmistettu liuottamalla n. 1 mg natriumia metanoliin). Reaktiota seurattiin ohutkerroskromatografiän avulla (kloroformi:metanoli:vesi, 65:35:10). Joissakin tapauksissa muodostui reaktion loppupuolella saostuma. Lisät-35 tiin tippa etikkahappoa ja reaktioseos konsentroitiin, 42 83659 suspendoitiin veteen (10 ml) ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin kvantitatiivinen saanto suojaamatonta glykolipidiä, jossa oli epäpuhtautena pieniä määriä natriumasetaattia (noin 1 paino/paino-%).

5 Valmistettiin seuraavat yhdisteet: 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiomet- yyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-(3-D-glukopyranosidi (RSC16-1) . DIB-1:stä ja heksadekaanitiolista. Saanto: 70 %. - 1,6° (c = 1,1 CDCl^:ssa).

10 NMR-spektri (CDC1.J, TMS): 6 (ppm) = 5,20 (t, 1 H, J, 3=9,3 Hz, H-3), 5,06 (t, 1 H, J3 4=J4 5=9,5 Hz, H-4), 4,98 (dd, V H, H-2), 4,48 (d, 1 H, J ,=7,9 Hz/ H-l), 4,26, 4,11 (ABq lisäkytken- nällä, kukin 1 H, J^g = 12,4 Hz, g=4,8 Hz, g>=2,5 Hz, H-6,6'), 2.6-2,4 (m, 8 H, CH^S).

1 5 Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C5qH92O10S2: C 65,5 H 10,1

Saatu: C 65,7 H 10,2 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-20 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-j3-D-galaktopyranosidi (RSC16-2).

DIB-2:sta ja heksadekaanitiolista. Saanto 79 %.

: = +1° (c = 1,6 CDCl3:ssa).

NMR-spektri (CDCNj, TMS): δ (ppm) = 5,37 (dd, 1 H, J4 5=0,8 Hz, H-4). 5.17 (dd. 1 H, J2(3=10,3 Hz, H-2), 4,99 (dd, 1 h', J3 4=3,4 25 Hz, H -3), 4;44 (d, 1 H, 2=7,8 Hz, H-l), 2,7-2,4 (m, 8 H, ch2-s).

Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C5qH92°ioS2: C H 10,1

Saatu: C 65,3 H 10,2

II

43 83659

Metyyli (3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,4-tri-O-asetyyli-Jb-D-glukopyranosyyli)uronaatti (RSC16-3). DIB-3:sta ja heksadekaanitiolista. Saanto 68 %. /Sc7^3 = 1,7° (c = 0,9 CDCl3:ssa).

^ NMR-spektri (CDC^, TMS): δ (ppm) = 5,25 (t, 1 H, 4=9,0 Hz, H-3), 5,20 (t, 1 H, J4 5=9,4 Hz, H-4), 5,01 (dd, 1 H, J2'3=9,0 Hz, H-2), 4,54 (d, 1 H, j/2=7'6 Hz' Η'υ' 4/03 (d' 1 H' H*5)' 3,76 (s' 3 H, 0-CH3), 2,60-2,45'(m, 8 H, CH2-S).

10 Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C49Hgo°ioS2: c 64,7 H 10,2

Saatu: C 64,9 H 10,2 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-3,4,6-15 tri-0-asetyyli-2-deoksi-2-ftaali-imido-β-D-glukopyranosidi (RSC16-4). DIB-4:stä ja heksadekaanitiolista. Saanto: 81 %.

= +11,6° (c = 1,1 CDCl3:ssa).

NMR-spektri (CDC^TMS): 6 (ppm) = 5,80 (dd, 1 H, J, ,=10,7 Hz, H-3), 5,32 (d, 1 H, J1>2=8,5 Hz, H-1), 5,16 (t, 1 H, J ' =J ,=9,2 20 Hz, H-4), 2,5-2,2 (m, 8 H, CH?-S). 3,4 4,5

Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C55H93NO-| qS2 : C H 9/33 N 1,39

Saatu: C 67,0 H 9,52 N 1,39 25 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,4- tri-0-asetyyli-Ä-D-ksylopyranosidi (RSC16-5). DIB-5:stä / 2 3 o ja heksadekaanitiolista. Saanto: 61 %. = -17,6 (c = 1,1 CDC13:ssa).

NMR-spektri (CDCI3.TMS): J (ppm) = 5,15 (t, 1 H. J, ,=J, ,=8,5 i0 Ηζ· Η·3)· ^98-4,85 (m, 2 H, H-2.4). 4,45 (d, 1 H, J,' =6,7Hz, H-1), 4,10, 3,34 (ABq lisäky tkennällä, kukin ] h/ J =1”> 0

Hz. -^45=5,0 Hz, J4 5·=8;8 Hz, H-5,5’), 2,7-2,4 (m, 8 H, CH,-S)AB Analyysi: ' 4

Laskettu yhdisteelle C47H88^8S2: ^ 66,8 H 10,5 35 Saatu: C 66,7 H 10,6 44 83659 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,6-tri-O-asetyyli-4-O-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-β-D-galakto-pyranosyyli)-β-D-glukopyranosidi (RSC16-6). DIB-6:sta ja heksadekaanitiolista· Saanto 88 %.

5 /öc7^3 = -4,1° (c = 0,8 CDCl3:ssa).

NMR-spektri (CDCLj.TMS): δ (ppm) = 5,34 (d, 1 H, H-4*), 5,19 (t, 1 H' J2,3=9;0 Hz' H'2)' 5/10 (dd' 1 H' J2‘ 3 =10/4 Hz' H-2‘), 4,95 (dd. 1 H, J3· <4·=3,. 6 Hz, H-3’), 4,89 (dd, 1 H, J3 4=7,9 Hz, H-3), 4,47 4,46 (kaksid, kukin! H, J=7,6 Hz ja 7,9 Hz, H-1,1’), 2,6-2,45 10 (m, 8 H, S-CH.,).

Analyysi :

Laskettu yhdisteelle C26H108°18S2: c 61,8 H 9,03

Saatu: C 62,0 H 9,32 15 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,6- tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4 ,6-tetra-0-asetyyli-c^-D-galakto-pyranosyyli)- β-D-galaktopyranosidi (RSC16-7). DIB-7:stä ja heksadekaanitiolista. Saanto 51 %. = + 52° (c = 0,6 CDCl3:ssa).

20 NMR-spektri (CDCI^.TMS): 6 (ppm) = 5,57 (dd, 1 H, ^.=0,8 Hz, H-4’), 5,38 (dd, 1 H, 3·=Π,0 Hz, H-2’), 5,18 (dd. Γη, J3- 4- = 3,7 Hz, H-3'), 5; 16 (dd/1 H, J23=11.0 Hz, H-2), 4,99 (d, 1 H, Jv ,.=3,3 Hz, H-T), 4,79 (dd, 1 H, J3 4 =2,8 Hz, H-3), 4,44 (d, 1 H.J, ,=7,7 Hz, H-1), 2,7-2,45 (m, 8 H, S-CH2).

25 Analyysi:

Laskettu yhdisteelle C62H108°18S2: C 61,8 H 9,03

Saatu: C 60,7 H 9,00 3-oktadekyylitio-2-oktadekyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,6-30 tri-O-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-j? -D-galakto-pyranosyyli)-A -D-glukopyranosidi (RSC18-1). DIB-6:sta ja

t 2 3 O

oktadekaanitiolista. Saanto: 67 %. /oC7D = “3,4 (c = 0,8 CDC13:ssa).

NMR-spektri (CDCl3, TMS): käytännöllisesti katsoen identtinen 35 RSC1b-6:n ja RSC8-1:n spektrien kanssa.

li 45 83659 3-oktyylitio-2-oktyylitiometyyliprop-1-yyli-2,3,6-tri-O-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-β-D-galaktopyranos-yyli) - /2>-D-glukopyranosidi (RSC8-1). DIB-6:sta ja oktaani-tiolista. Saanto: 73 %. /5c7^3 = -4,9° (c = 0,8 CDCl,:ssa).

5 NMR-spektri (CDCl^/ TMS): käytännöllisesti katsoen identti nen RSC16-6:n ja RSC18-1:n spektrien kanssa.

3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli- β-D-glukopyranosidi (RSC16-8). RSC16-1:stä. G<7q3 = -7° 10 (c = 0,9 liuottimessa CMD(CDC13/CD30D/D20, 65:35:10).

NMR- spektri (CMD,TMS, 50°): δ (ppm) = 4,29 (d. 1 H, J] 2=7;6 Hz, H-1), 2,70 (d, 4 H, J=6,4 Hz, CH - (C^-S )2), 2,53 Ct,' 4 H, J=7f3 Hz, S-CH^-CH2).

15 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli- jS-D- galaktopyranosidi (RSC16-9). RSC16-2:sta. = “3°

(c = 0,5 CMD:ssä). „ D

NMR-spektri (CMD, TMS, 20 ): δ (ppm) = 4,24 (virtuaalinen kytkentä, J1,2=7'6 Hz' H_1)' 2'71 (d' 4 H' J=6I7 Hz' CH-(CH2-S)2), 2,53 (t, :*·' 4 H, J=7,2 Hz, S-C^-CH^.

20 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli- /3-D-ksylopyranosidi (RSC16-12). RSC16-5:stä. /oc7q^ = -6° (c = 0,5 CMD:ssä).

NMR-spektri (CMD, TMS, 50»): i (ppm) =4,25 (d, 1 H, j-7,1 Hr, - 25 H-1). 2,69 (d, 4 H, J=6,4 Hr, CH-(CH -S),). 2,53 (t. 4 H.'j=7,5

Hz, S-CH9-CH2).

3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-4-0-D-galaktopyranosyyli- P~D-glukopyranosidi (RSC16-13).

30 RSC16-6:sta. ~ “3,5° (c = 1,6 CMD:ssä).

I NMR-spektri (CMD, TMS, 40°): δ (ppm) = 4,31 (d, 2 H, J=7,8 Hz, H-1,Γ), 2,71 (d, 4 H, J=6,6 Hz, CH-CH2-5), 2,53 (t, 4 H, J=7;3 y Hz, s-ch2-ch2).

46 83659 3-heksadekyylitio-2-heksadekyylitiometyyliprop-1-yyli-4-0-oC-D-galaktopyranosyyli-|3-D-galaktopyranosidi (RSC16-14) .

RSC16-7: stä. = +28° (c = 0,6 CMD:ssä).

NMR- spektri (CMD, TMS. 50°): δ (ppm) = 5,01 (d, 1 H, J . ,.=2,5 5 Hz, H-1'), 4,27 (d, 1 H, J1>2=7r2 Hz, H-l), 2,72 (d, 4 H, J=6,3 Hz, CH-(CH2-S)2), 2.53 (t, 4 H, J=7,4 Hz, S-CW?-CH2).

3-(1O-metoksikarbonyylidekyylitio)-2-(oktyylitiometyyli)-prop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-asetyyli-4-0(2,3,4,6-tetra-10 0-asetyyli-/ä -D-galaktopyranosyyli)-p -D-glukopyranosidi (RSC10EC8). DIB-6 (291 mg, 0,34 mmoolia) liuotettiin kuivaan dimetyyliformamidiin (1 ml). Lisättiin oktyylitiolia (50 mg, 0,34 mmoolia) dimetyyliformamidissa (1 ml) ja sen jälkeen cesiumkarbonaattia (112 mg, 0,34 mmoolia). Sen jälkeen kun 15 oli sekoitettu 70 tunnin ajan 20°:ssa, lisättiin vettä (15 ml) ja seosta uutettiin dikloorimetaanilla (2 x 10 ml). Uute kuivattiin (Na2SO^) ja konsentroitiin lisäten useita kertoja tolueenia jäljelle jääneen dimetyyliformamidin poistamiseksi. Jäännös kromatografoitiin (Si02» heptaani/etyyli-20 asetaatti 2:1), jolloin saatiin seuraava: RSC8-1 (76 mg; 22 %), 2-bromimetyyli-3-oktyylitioprop-1-yyli-2,3,6-tri-0-·. a se tyy li-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- (¾ -D-galaktopyranos yyli) - £ -D-glukopyranosidi (72 mg; 24 %), jonka /oc_7D = “7° (c = 0,6, CHCl^), ja lähtöainetta DIB-6 (34 mg).

25 Yllä olevaa 2-bromimetyyliyhdistettä (57 mg, 0,062 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (1,5 ml) ja lisättiin metyyli-11-merkaptoundekanoaattia (22 mg, 0,093 mmoolia) ja cesiumkarbonaattia (30 mg) huoneen lämpötilassa. Seosta sekoitettiin 15 tunnin ajan, käsiteltiin dikloorimetaanilla 30 ja vedellä ja orgaaninen faasi kuivattiin (Na2SC>4) ja konsentroitiin. Jäännös kromatografoitiin (Si02/ heksaani: etyyliasetaatti), jolloin saatiin RSC10EC8 (59 mg), jonka ^ oli "4° (c = 1'8, cdc13) · NMR-spektri (CDCI-j, Me4Si): δ (ppm) * 5,37 (dd, 1H, J3,5*1,0 Hz, - : 35 H-4'), 5,22 (t. 1H, J2 3=9,3 Hz, H-2), 5,13 (dd, 1H, .*10,5 Hz, H-2'), 4,97 (dd, 1H, J3.4.=3,3 Hz, H-3’), 4,91 (dd, 1H, J3 4=7,7 Hz, H-3), 4,50, 4.48 {<aksid, kukin 1H, J1 2=7;8 Hz, J1 2=7,8 Hz, H-1,1'). 3,69 (s, 3H, OMe), 0.91 (t, 3H, J=6,6 Hz, -CH2-CW3).

I! v 83659

Taulukko 2 K .s-R* K sf.-0 s ~ Κ^__ξζ 10 Ry —— h ?}; 1b Yhdiste nro R1 R 2 R 3 R 4 R 5 R6

Ra = Rb CCh2) 5CH3 RSC16-1 OAca H OAc OAc H CH-OAc - · 20 2 RSC16*2 OAc H OAc H OAc CH2OAc RSC16-3 OAc H OAc OAc H COOCH3 RSC16-4 NPhthb H OAc OAc H CH^OAc

RSC16-5 OAc H OAc OAc H H

25 RSC16-6 OAc H OAc GalAcöC H CH2OAc RSC16-7 OAc H OAc H GalAcad CH2OAc

R5C16-3 OH H OH OH H CH2OH

RSC16-9 OH H OH H OH CH2OH

RSC16-10 OH H OH OH H COOH

30 RSC16-11 NHAc H OH OH H CH2OH

RS C16-12 OH H OH OH H H

RSC16·^ OH H OH GalOHB" H CH2OH

RSC16'14 0H H OH H GalOHaf CH-,ΟΗ 48 83659

Taulukko 2, jatkoa Yhdiste nro R ^ R 3 R 2 R 4 R g R g 5 ______

Ra = Rb = (CH2)17-CH3 RSC18-1 OAc H OAc GalAcS H CH2OAc

RSC18-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

Ra = Rb = (CH2)7-CH3 10 RSC8-1 OAc H OAc GalAcS H CH2OAc

RSC8-2 OH H OH GalOHS H CH0OH

Ra = Rb = (CH2)10-COOCH3 RSC10E-1 OAc H OAc GalAcS H .CH^OAc

RSC10E-2 OH H OH GalOH5 H CH^OH

15 R = (CH0)10-COOCH3,

Rb = (Ch“)7-CH3 RSC10ECS OAc H OAc GalAcS H CH2OAc a) Ac = asetyyli; b) phth = ftaloyyli; c) GalAc|£ = ; 20 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3-D-galaktopyranosyyli; d) GalAcOC = : ' 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- °c -galaktopyranosyyli; e) GalOHj* = • ji-D-galaktopyranosyyli; f) GalOHoC = oC-D-galaktopyranosyyli.

Esimerkki 3

Bis-sulfoksidi- ja bis-sulfoniglykosidien valmistus 25 a) Täysin asetyloitua bis-sulfidiglykosidiä (0,5 mmoolia) liuotettiin etyyliasetaattiin (20 ml) ja jäähdytettiin (-25°). Lisättiin m-klooriperbentsoehappoa (2 mmoolia) ja seosta sekoitettiin, kunnes lähtöaine oli kulunut loppuun (30-60 min; tarkistettu ohutkerroskromato-30 grafian (TLC) avulla). Muodostunut bis-sulfoni (katso taulukkoa 4) puhdistettiin käyttäen pientä alumiinioksidipyl-västä ja eristettiin sitten kromatografiän avulla. Deasety-lointi suoritettiin kuten esimerkissä 2. Käyttäen samaa menetelmää kuin yllä, mutta 1 mmoolia m-klooriperbentsoehap-35 poa, saadaan eritettyä vastaava bis-sulfoksidi (katso taulukkoa 3). Voidaan valmistaa seuraavat yhdisteet: (i « 83659 3-heksadekyylisulfoksi-2-heksadekyylisulfoksimetyyliprop-1-yyli-2,3,4,6-tetra-asetyyli-β-D-glukopyranosidi (RS0C161). RSC166:sta. Saanto 38 %. = "11° (c 1, CDC13). IR Y 1755, 1050 cm"1.

5 NMR-spektri (CDC13, Me4Si): 6 (ppm) = vastaa täysin diastereomeerien seosta, kuten sulfoksideilta on odotettavissa. Selvästi erottuvia signaaleja olivat: 1,26 (bs, 56H, CH2), 0,88 (t, 3H, J 6,3 Hz, CH3).

Analyysi: 10 Laskettu yhdisteelle C5qH92012S2 C 63,3 H 9,77

Saatu: C 62,9 H 9,86 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-prop-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-β-D-glukopyranosidi 15 (RS02C16-1). RSC16-1 : stä. Saanto: 80 %. ~ “5,6° (c = 0,7 CDC13:ssa).

NMR- spektri (CDCLj.TMS): 6 (ppm) = 5,21 (t, 1 H, J2 3=9,5 Hz, H-3), 5,05 (t, 1 H, J3 4=J4 5=10;0 Hz, H-4), 4,97 (dd, l' H, H-2), 4,54 (d, 1 H, J.j 2=8.1 Hz, H-1), 4,27 , 4f13 (ABq lisäkytken-^ nällä, kukin 1 H, J^g=12,5 Hz, g=4,9 Hz, J^· g.=2,4 Hz, H- 6,6 ), 3,70 (m, 1 H, H-5).

3-heksadekyylisulfonyy1i-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-prop-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3 -D-galaktopyranosidi 25 (RS02C16-2). RSC16-2:sta.

NMR- spektri (CDCI^.TMS): δ (ppm) = 5,39 (dd, 1 H, J4 ^=1,0 Hz, H-4), 5,15 (dd, 1 H, J23=10r5 Hz, H-2), 5,01 (dd, 1 h' J3 4=3r4 Hz, H-3), 4,50 (d, 1 H, j'=7,7 Hz, H-1).

30 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-prop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-^J) -D-galaktopyranosyyli) -/3 -D-glukopyranosidi ··-: (RS02C16-6). RSC16-6:sta. Saanto: 69 %. * “6,7° (c = 0,8 CDCl3:ssa).

so 83659 NMR- spektri (CDC13,TMS): δ (ppm) = 5,35 (dd, 1 H, J4· 5·=1 Hz' H-4’), 5,19 (t, 1 H, J2)3=^/4 Hz- h'2>' 5?11 tdd< 1 H' J2',3'=10'1 Hz, H-2'), 4.96 (dd, 1 H, J3. ^.=3,2 Hz, H-3'), 4,88 (dd, 1 H, J3 4=7i9 Hz- h'3)- 4.50, 4.48 (kaksi d,kukini h, J =J -.=7,6 Hz, 5 H-1 H-T). ' '2 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-prop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-oC-D-galaktopyranosyyli) - (¾ -D-galaktopyranosidi 10 (RS02C16-7). RSC16-7: sta. Saanto: 99 %. = +47,2° (c = 0,6 CDC13:ssa).

NMR- spektri (CDCI^TMS): δ (ppm) = 5;58 (dd, 1 H, J4> 5> = 1 Hz, H-4‘), 5,39 (dd, 1 H, J2.j3. = n Hz, H-2'), 5,21 (dd, 1 H, 4·=3,4 Hz, H-3'), 5,15 (dd, 1 H, J2 3=11 Hz, H-2), 4.97 (d, 1 H, Jr'2.=3,9 15 Hz. H-V), 4,79 (dd, 1 H, J3' 4=2,7 Hz. H-3), 4,51 (d, 1 H, J.' ,=7,8 Hz, H-1).

3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyy1imetyyli-prop-1 -yyli-/S -D-glukopyranosidi (RS02C16-8).

20 RS02C16-1 :stä. = +3,9° (c = 0,9 CMD:ssä).

NMR- spektri (CMD, TMS): δ (ppm) = 4,34 (d, 1 H, 2=7/2 *"*ζ, H-1), 0,89 (t, 6 H, J=6,8 Hz, CH2-CH3), 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-25 prop-1-yyli-/3-D-galaktopyranosidi (RS02C16-9). RS02C16-2:sta.

. 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli- prop-1-yyli-4-0-β-D-galaktopyranosyyli-β -D-glukopyranosidi 30 (RS02C16-3). RS02C16-6:sta. (bcj= -1° (c = 0,5 CMDrssä).

NMR- spektri (TMS): 6 (ppm) = 4,39, 4,31 (d,kukin 1 H, J=7,6 ja 7,8 Hz, H-1,T), 2;71 (d, 4 H, J=6,6 Hz. CH-Ctf2-SC>2), 2.53 (t, 4H, J=7,3 Hz, S00-CH2-CH2).

Ii 51 83659 3-heksadekyylisulfonyyli-2-heksadekyylisulfonyylimetyyli-prop-1-yyli-4-0-oc-D-galaktopyranosyyli-ft-D-galakto-pyranosidi (RSC>2C16-14) .RSC>2C16-7:stä. Zöc_7p3 = +27,4° (c = 0,8 CMDrssä).

5 13C-NMR-spektri (CMD, TMS: δ (ppm) = 4,34, (d, 1 H, J1<2=7,3

Hz, H-1), 0.39 (t, 1 H, J=6,8 Hz, CH2-CH3).

3-(1O-metoksikarbonyylidekyylisulfonyyli)-2-(10-metoksi-karbonyylidekyylisulfonyylimetyyli)prop-1-yyli-2,3,6-tri-1 0 O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- β> -D-galakto-pyranosyyli)- -D-glukopyranosidi (RSC>2C10E-1) ja 3-(1O-metoksikarbonyylidekyylisulfonyyli)-2-oktyylisulfonyy-limetyyliprop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli- />-D-galaktopyranosyyli)- β-D-glukopyrano-15 sidi (RS02C10EC8-1).

DIB-6 (2,6 g, 3 mmoolia) liuotettiin kuivaan dime-... tyylitormamidiin (29 ml) ja lisättiin metyyli-11-merkapto- ' ; undekanoaattia (2 ml) ja sen jälkeen cesiumkarbonaattia (1,5 g). Reaktiota seurattiin ohutkerroskromatografiän 20 avulla. 40 tunnin kuluttua 20°:ssa lisättiin vettä ja seos uutettiin dikloorimetaanilla. Kuivaamalla ja haihduttamalla • _j_ liuottimet saatiin jäännös, joka liuotettiin etyyliasetaat- : : tiin (80 ml) ja lisättiin m-klooriperbentsoehappoa (12,5 mmoolia). 18 tunnin kuluttua seos suodatettiin alumiini-25 oksidipylvään lävitse (70 g) dikloorimetaanin avulla (300 ml). Liuottimet poistettiin ja 10 % jäännöksestä kro-matografoitiin (Si02; heksaani/etyyliasetaatti, 2:3), jol-. . loin saatiin 2-bromimetyyli-3-(10-metoksikarbonyylidekyyli- sulfonyyli)prop-1-yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-30 tetra-0-asetyyli-β-D-galaktopyranosyyli)-β-D-glukopyra- nosidi (1,00 g, 36 %) , jonka Z"°^7D oli “6° (c 0,7, CHC13) , ja sen jälkeen RSO2C10E-1 (1,01 g, 31 %), jonka D oli -7° (c 1,1, CHC13).

NMR-spektri (CDC13, TMS): ^*(ppm) = 4,48, 4,50 (d, 1H 35 kukin, J 7,6 ja 7,8 Hz, H-1, H-1'), 3,66 (s, 3H, OCH3>.

52 8 3 6 5 9

Yllä oleva 2-bromimetyyliyhdiste (820 mg, 0,79 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (20 ml) ja lisättiin oktaani-tiolia (174 mg, 1,19 mmoolia) ja sen jälkeen cesiumkarbo-naattia (240 mg). 20 tunnin kuluttua seoksen annettiin 5 jakaantua dikloorimetaanin (120 ml) ja veden (100 ml) kesken ja vesifaasi uutettiin dikloorimetaanilla (50 ml). Yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin (NagSO^) ja konsentroitiin ja jäännös kromatografoitiin, (Si02, heksaani/ etyyliasetaatti 1:1), jolloin saatiin puhdasta 3-(10-metoksi-10 karbonyylidekyylisulfonyyli)-2-oktyylitiometyyliprop-1- yyli-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0 - (2,3,4, 6-tetra-0-asetyyli-/?>-D-galaktopyranosyyli)- β-D-glukopyranosidia (830 mg, 96 %), jonka /c*7 oli -5° (c 0,9, CHC13) .

NMR-spektri (CDC13, TMS): 6(ppm) = 4,48, 4,46 (m, 1H kukin, 15 H1, H-1')f 3,67 (s, 3H, OCH3), 0,88 (t, 3H, J6, 9 Hz, c h2-ch3) .

: Tämä sulfoni-sulfidi (800 mg, 0,74 mmoolia) liuotet- tiin etyyliasetaattiin (25 ml) ja lisättiin m-klooriper-bentsoehappoa (1,85 mmoolia). 18 tunnin kuluttua seos 20 konsentroitiin ja liuotettiin sitten dikloorimetaaniin ja suodatettiin alumiinioksidipylvään (15 mg) läpi. Haihduttamalla liuottimet saatiin puhdas RSO^CIOECe-l (667 mg, 80 %), jonka Zp*=7d oli -14° (c 0,8, CHCl^) .

NMR-spektri (CDCl^» TMS): S(ppm) = 4,49, 4,47 (d, 1H kukin, 25 J 7,8 ja 7,8 Hz, H-1, H1'), 3,66 (s, 3H, OCH3), 0,87 (t, 3H, J 6,4 Hz, CH2-CH3), 3-(1O-metoksikarbonyylidekyylisulfonyyli)-2-(10-metoksi-karbonyylidekyylisulfonyylimetyyli)prop-1-yyli-4-0-β-D-30 galaktopyranosyyli-β -D-glukopyranosidi (RSC^CI0E-2).

RSO2C10E-1 deasetyloitiin tavanomaisesti (MeOH/MeONa), jolloin saatiin RSO2C10E-2, jonka //V7d oli “3° (c 0,8, CMH) .

53 83659 3-(1O-metoksikarbonyylidekyylisulfonyyli)-2-oktyylisulfonyy-limetyyliprop-1 -yyli-4-0- /S-D-galaktopyranosyyli-p> -D-glukopyranosidi (RSC^CI 0EC8-2) . RSC^CIOECe-l deasetyloi-tiin tavanomaisesti (MeOH/MeONa), jolloin saatiin 5 RSO2~C10EC8-2, jonka D oli -1° (c 0,9, CMH).

3-(1O-karboksidekyylisulfonyyli)-2-(1O-karboksidekyylisul-fonyylimetyyli)-prop-1-yyli-4-0- f? -D-galaktopyranosyyli-D-glukopyranosidi (RSO2CIOA).

10 RSO2CIOE-2 (13 mg, 0,014 mmoolia) lisättiin natrium- hydroksidiliuokseen (0,01M, 10 ml) ja kuumennettiin 100°:ssa 30 minuutin ajan. Seos jäähdytettiin ja lisättiin etikka-happoa (1 tippa). Liuotin poistettiin, jolloin saatiin RSO2C10A, jossa oli epäpuhtautena natriumasetaattia.

15 3-(1O-karboksidekyylisulfonyyli)-2-oktyylisulfonyylimetyyli-.. . prop-1-yyli-4-0-p -D-galaktopyranosyyli-p -D-glukopyranosidi (RSO2CI0AC8). RSO2CI0EC8-2:ta käsiteltiin natriumhydroksidi-liuoksella kuten yllä, jolloin saatiin RSC^CIOACe, jossa 20 oli epäpuhtautena natriumasetaattia.

b) 2-(heksadekyylisulfonyyli)etyyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- Ji -D-glukopyranosidi. 2-bromietyyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-β-D-glukopyranosidiä (Dahmen et ai., Carbohydr. Res., 116 (1983) (540 mg, 1,19 mmoolia), heksa- 25 dekaanitiolia (383 mg, 1,49 mmoolia), cesiumkarbonaattia (292 mg, 0,89 mmoolia) ja dimetyyliformamidia (5 ml) sekoitettiin yön ajan. Lisättiin dikloorimetaania (75 ml) ja vettä (40 ml). Vesifaasia uutettiin dikloorimetaanilla (2 x 25 ml), yhdistetyt orgaaniset faasit kuivattiin 30 (Na2SO^) ja konsentroitiin. Kromatografoimalla (Si02; etyyliasetaattitheksaani) saatiin puhdasta 2-(heksadekyyli-tio)etyyli-2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-fb-D-glukopyranosidia (480 mg, 0,76 mmoolia, 64 %), joka liuotettiin etyyliasetaattiin (12 ml) ja käsiteltiin m-klooriperbentsoehapolla 35 (1,71 mmoolia). 4 tunnin jälkeen poistettiin liuottimet ja 54 83659 jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin ja suodatettiin alumiinioksidin läpi (10 g), jolloin saatiin puhdas sulfoni-lipidi (495 mg, 98 %) . = -8,7° (c = 0,9 CDCl^ssa).

NWR-spektri (CDCI-j, TMS): δ (ppm) = 5,21 (t, 1 H, J34=9,5 Hz, 5 H-3), 5,07 (t, 1 H, J4 5=9,7 Hz, H-4), 5.00 (dd, 1 H, J0'3=9,5 Hz, H-2), 4,57 (d, 1 H, J] .,=8,1 Hz, H-1), 4,28, 4,14 (ABq lisäkytken-nällä, kukin 1 H, JAB = 12r 5 Hz, 0=4,88 Hz, J5 g., =2,44 Hz, H-6,6’), 3,72 (m, 1 H, H-5).

10 2-(heksadekyylisulfonyyli)etyyli-β-D-glukopyranosidi.

Yllä oleva sulfonilipidi (440 mg) liuotettiin dikloorimetaaniin (45 ml) ja lisättiin natriummetoksidin metanoli-liuosta (30 ml; 1 mg:sta Na). 24 tunnin kuluttua (ohut-kerroskromatografia osoitti deasetyloinnin olevan täydelli-15 sen) lisättiin etikkahappoa (1 tippa) ja liuottimet poistettiin, lopuksi <0,1 Torrin paineessa, jolloin saatiin dease-tyloitu materiaali (320 mg, 97 %), jossa oli epäpuhtautena pieni määrä natriumasetaattia. föcjp'3 = -10,5° (c = 1,0 ·'· CMD: ssä) .

;.· 20 NMR-spektri (CMD, TMS): δ (ppm) = 4,36 (d, 1 H, J] 2=7,8 Hz, ! . H-1), 0,89 (t, 3 H, J=6;8 Hz, CH2*CH3).

Taulukko 3

25 K

KJ-0 y-h \ o ; · 30 h 3;

II

55 83659

Yhdiste nro

5 R = (CH2)15CHS

RS0C16-1 OAca H OAc OAc H Ch^OAc RSOC16-2 OAc H OAc H OAc CH2OAc RSOC16-3 OAc H OAc OAc H COOCH3 10 RSOC16-4 NPhthb H OAc OAc H CH2OAc

RSOC16-5 OAc H OAc OAc H H

RSOC16-6 OAc H OAc GalAcSC H CH2OAc RSOC16-7 OAc H OAc H GalAcod CH2OAc

15 RSOC16-8 OH H OH OH H CH2OH

RSOC16-9 OH H OH H OH CH2OH

RSOC16-10 OH H OH OH H COOH

RSOC16-11 NHAc H OH OH H CH2OH

RSOC16-12 OH H OH OH H H

” 20 RSOC16-13 OH H OH GalOHB* H CH2OH

RSOC16-14 OH H OH H GalOHaf CH2OH

R = (ΟΗί)17-ΟΗ3 RSOC18-1 OAc H OAc GalAcB H CH2OAc

RSOC18-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

R = (CH2)7-CH3 RSOC8-1 OAc H OAc GalAcB H CH2OAc

RSOC8-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

R = (CH2)10-COOCH3 . . 3Q RSOC10E-1 OAc H OAc GalAcB H CH.,OAc

RSOCIOE-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

a) Ac = asetyyli; b) Phth = ftaloyyli; c) GalAc/i> = 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3-D-galaktopyranosyyli; d) GalAcoQ= · 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-°^-D-galaktopyranosyyli; e) GalOH β = β -D-galaktopyranosyyli; f) GaloHoC. = °C-D-galak-topyranosyy1i.

56 83659

Taulukko 4 0

Ri r11*‘ yi—o '-Jv-s ** 10 πϊ h s;

Yhdiste 15 nro R1 R 2 R3 R4 R5 R6

Ra = Rb ^CH2)15CH3 RSO^Cl 6-1 OAca H OAc O Ac H CH2OAc RSO.,Cl 6-2 OAc H OAc H OAc CH2OAc 20 RS02C16-3 OAc H OAc OAc H COOCH3 Γ·' RSO^C16-4 NPhthb H OAc OAc H CH^OAc

RS02C16-5 OAc H OAc OAc H H

:V RSO^CI 6-6 OAc H OAc GalAcSc H CH2OAc 25 RSO^C16-7 OAc H OAc H GalAcad CH2OAc

RSO~C16-8 OH H OH OH H CH2OH

RS02C16-9 OH H OH H OH CH2OH

RSO2C16-10 OH H OH OH H COOH

RS02C16-11 NHAc H OH OH H CH2OH

30 RS02C16-12 OH H OH OH H H

RS02C16-13 OH H OH GalOHft" H CH2OH

RSO?C16-14 OH H OH H GalOHaf CH2OH

Ra = Rb = CCH2)17-CH3 35 RS02C18-1 OAc H OAc GalAcS H CH2OAc

RS02C18-2 OH H OH GalOHfi H CH2OH

li 57 83659

Taulukko 4, jatkoa Yhdiste nro R 1 R 2 R 3 R4 R5 R6 5 -:-—---

Ra = Rb = (CH2^7'CH3 RS02C8-1 OAc H OAc GalAcS H ΟΗ,,ΟΑο

RSO,C8-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

Ra = Rb = (ch?)10-cooch3 10 RSO?C10E-1 OAc H OAc GalAcB H CH2OAc

RSO2C10E-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

Ra = Rb = (CH2)1qCOOH

RSO^CIOA OH H OH GalOHB H CH^OH

Ra = (CH2)10COOCH3, 15 Rb = (ch?)?ch3 RSO.,- C10EC8-1 OAc H OAc GalAcS H CH2OAc RSO.,C10-

EC3-2 OH H OH GalOHB H CH2OH

i ‘ 20 Ra = (CH2)1QCOOH, : Rb = (CH2)yCH3 ; RSO2C10-

AC8 OH H OH GalOHB H CH2OH

25 a) Ac = asetyyli; b) Phth = ftaloyyli; c) GalAcp = 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-£ -D-galaktopyranos-yyli; d) GalAcoc = 2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-OC-D-galakto-pyranosyyli; e) GalOH^ = -D-galaktopyranosyyli; f) GalOHoQ = c<L-D-galaktopyranosyyli.

58 83659

Esimerkki 4 2-bromimetyyliallyyliglykosidien käyttö rikki-, typpi- ja happinukleofiilien kanssa_ DIB-glykosidi (1 mmooli) liuotettiin etyyliasetaat-5 tiin (10 ml) ja lisättiin tipoittain diatsabisykloundekaa-nia (DBU; 2 mmoolia). Noin 5 tunnin kuluttua (kiteinen DBU-hydrobromidi oli muodostunut), lisättiin 1 mmooli sopivaa tiolia. Vaihtoehtoisesti voidaan lisätä ekvivalenttinen määrä sopivaa amiinia tai alkoholia. Reaktiota seurattiin ohut-10 kerroskromatografiän avulla, joka osoitti, että allyyli- bromidiglykosidi-välituote oli kulunut loppuun ja oli muodostunut uusi tuote. Kiinteä aine poistettiin ja jäännös kro-matografoitiin, jolloin saatiin puhdas tuote. Deasetylointi suoritettiin kuten esimerkissä 2. Voidaan valmistaa seuraa-15 vat yhdisteet: 2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 2.3.4.6- tetra-0-asetyyli--D-glukopyranosidi (ARSC2E-1). DIB-1:stä.

20 2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-β -D-glukopyranosidi (ARSC2E-2). ARSC2E-1:stä.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-25 2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3 -D-galaktopyranosidi (ARSC2E-3).

DIB-2:sta.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- -D-galaktopyranosidi (ARSC2E-4). ARSC2E-3:sta.

- 30 2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 2.3.6- tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- β-D- galaktopyranosyyli)-β-D-glukopyranosidi (ARSC2E-5). DIB-6:sta. Saanto: 43 %. = “11,5° (c = 0,8 CDCl^sssa).

59 83659 NMR- spektri (CDCLj, TMS): δ (ppm) = 5,35 (dd, 1 H, J . .=0 7

Hz, H-4 ), 5,20 (t, 1 H, 3=9,,3 Hz, H-2), 5,12, 5,07 (bs,kukin 1 H, =CH2), 5,11 (dd, 1 H, 3=9,8 Hz, H-2’), 4,95 (dd, 1H, J3’,4'=3'4 Hz, H-3'), 4,93 (t, 1 H, -<3 4=8,1 Hz, H-3), 4,51, 4,48 (d, 5 kukin! H, ’<!, 2=J1', 2' = 7 ‘8 Hz' H'1'1')' 4,37, 4,17 (ABq, kukin 1H, JAB = 12'0 Hz< 0-CH2-C = ), 3.70 (s, 3 H, OCH3), 3,17, 3,14 (ABq, kukin 1 H, = C-CH2-S).

2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-10 4-0-/3-D-galaktopyranosyyli-/3-D-glykopyranosidi (ARSC2E-6) .

ARSC2E-5:stä.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 2,3,6-tri-0-asetyy li-4-0 - (2,3,4,6-tetra-0-asetyy li- OC.-D-15 galaktopyranosyyli)- ^-D-galaktopyranosidi (ARSC2E-7).

DIB-7:stä. Saanto: 44 %. = +53° (c = 0,8 CDCl^rssa).

NMR-spektri (CDCI3, TMS): δ (ppm) = 5;57 (dd, 1 H, J . 5·=1,2 Hz, H-4’), 5,38 (dd, 1 H, Jj. 3.=11,0 Hz, H-2'), 5,21 (dd,' 1 H, J2 3=10,8 Hz, H-2), 5,20 (dd, l'H, J3. 4-=3,4 Hz, H-3'), 5,16, 5,07 ... 20 (bs,kukin 1 H, =CH2), 5;00 (d, 1 H, Jj·^·--3,7 Hz, H-T), 4,82 (dd, Γ · 1 H, J3 4=2,9 Hz, H-3), 4,51 (d, 1H, -</2=7/6 Hz' H_1)' 4/41' 4/20 :’· (ABq, kokin 1 H, JAB=12.3 Hz, 0-CH2-C=), 3,70 (s, 3 H, OCH3), 3,21, 3,17 (ABq, kukin 1 H, JAB=14,1 Hz, =C-CH2-S).

25 2-(2-metoksikarbonyylietyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-4-0- °C’-D-galaktopyranosyyli- fi -D-galaktopyranosidi (ARSC2E-8) . ARSC2E-7:stä.

2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-2,3,4-tri-0-30 asetyyli-β -D-ksylopyranosidi (ARSC16-1). DIB-5:stä.

Saanto: 42 %.

NMR-spektri (CDCI3, TMS): δ (ppm) = 5,20-4,88 (m, 3 H, H-3,2,4), 5,09, 5,01 (bs, kukin 1 H, SCH2), 4,51, (d, 1 H, J1 2=6,9 Hz, H-1), 4/37 4,13 (ABq, kukin 1 H, -<AB = 12,4 Hz, C-CHj-O)/4,16-4,08 (m, 1 "" 35 H' H-5), 3,35 (dd, 1 H, J4 5-=8,6 Hz, J5 ^. = 11,8 Hz, H-5'), 3,13 (s, 2 H, =C-CH2-S), 2;35 (t, 2 H, J=7 Hz, CH^CH^S).

«ο 83659 2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- /b-D-ksylo-pyranosidi (ARSC16-2). ARSC16-1:stä.

2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0-5 asetyyli-(¾-D-galaktopyranosidi (ARSC16-3). DIB-2:sta.

2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-^-D-galakto-pyranosidi (ARSC16-4). ARSC16-3:sta.

10 2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-2,3,4,6-tetra-0- asetyyli-β-D-glukopyranosidi (ARSC16-5). DIB-1:stä.

Saanto: 50 %. foCJ^3 = -14,7° (c = 1,4 CDCl^ssa). NMR-spektri (CDC^, TMS): 6 (ppm) = 5,21 (t, 1 H, J2 3=J3 4=9'4 Hz, H-3), 5,10 (t, 1 H, J4 5=9,8 Hz. H-4), 5,097, 5,03 ’(s.kvlkin 1 15 H, =CH2), 5,04 (t, 1 H, H-2), 4,54 (d, 1 H, Jj 2=8,0 Hz. H-1), 4,41, 4,20 (ABq, kukin 1 H, Jab=15,0 Hz. 0-CH2-C=), 4,27, 4,15 (ABq lisä kytkennällä, kukin i h, Jab=12,0 Hz, J5 g=4,6 Hz, **5 6 =“;4 Hz' 3,69 (oktetti,1 H, H-5), 3,15, 3,11 (ABq, kukin 1 H, JAB=13,9 Hz, =C-CH2-S), 2,36 (t, 2 H, J=7 Hz, S-CH2-CH2).

20 2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-p -D-glukopyranosidi (ARSC16-6). ARSC16-5:stä.

2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-2,3,6-tri-0-25 asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3-D-galaktopyranos-yyli) - (3 -D-glukopyranosidi (ARSC16-7). DIB-6:sta.

Saanto: 46 %. = -11,0° (c = 1,4 CDCl^sssa).

NMR-spektri (CDCI3, TMS): 5 (ppm) = 5,34 (dd, 1 H, J . . = 1,0

Hz, H-4'), 5,20 (t, 1 H, J-, 3=9,0 Hz, H-2). 5,11 (dd, 1 h/j'^ .=-30 10,1 Hz, H-2 ), 5,08, 5,02 '(bs, kukin 1 H, =CH2), 4,95 (ddTV^, J3· 4.=3,7 Hz. H-3), 4,93 (t, 1 H, J3 4=8.1 Hz, H-3), 4,-51, 4,48 (d, kukin 1 H, J1(2=Jv>2- = 7;8 H-1,1), 4,38, 4,16 (ABq,kukin 1 H, JAB=12/° Hz' °-CH2-C=), 3,14, 3,10 (ABq, kukin 1 h, J.r=14,3 Hz, = C-CH2-S), 2,37 (t, 1 H, J-7,4 Hz, S-CH2*CH2).

Il 61 83659 2- (heksadekyylitiometyyli) prop-2-en-1 -yyli-4-0-p -D-galaktopyranosyyli-P-D-glukopyranosidi (ARSC16-8).

ARSC16-7:stä.

5 2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-2,3,6-tri-0- asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-°C-D-galaktopy-ranosyyli)- fi> -D-galaktopyranosidi (ARSC16-9). DIB-7:stä. Saanto: 50 %. />c.723 = +56,4° (c = 0,5CDC13: ssa) .

NMR-spektri (CDCLj, TMS): δ (ppm) = 5,57 (dd. 1 H, J . 5< = 1 Hz, 10 H-4'), 5;38 (dd, 1 H, ^. = 11,0 Hz, H-2’), 5,21 (dd, 1 H, J2 3=10,7

Hz, H-2), 5,20 (dd, 1 Η', ^·>4·=3,2 Hz, H-3), 5,12, 5,03 (bs, kukin 1 h, =CH2), 5;00 (d, 1 Hf'jVi2.=3;7 Hz, H-T), 4,82 (dd, 1 H, J3,4=2^7 Hz- H'3)' 4/51 (d' 1 H' Ji ·, = 7·8 Hz- H-1), 4,42, 4,20 (ABq, kukin 1 H. Jab=12,3 Hz, 0-CH2_C = ), 3,17, 3,14 (ABq, kukin 1 15 H' JAB=14’2 Hz' =C-CH2-S). 2.39 (t, 2 H, J=7,3 Hz, S-CH^CH2).

2-(heksadekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli-4-0-oC-D-galaktopyranosyyli-p -D-galaktopyranosidi (ARSC16-0). ARSC16-9:stä.

20 2-(1O-metoksikarbonyylidekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- -D-galaktopyranosyyli)-β-D-glukopyranosidi (ARSC10E-1).

DIB-6: sta. Saanto: 52 %. /0C_723 = -8,9° (c = , CDC13).

NMR-spektri (CDCI-j, TMS): δ (ppm) = 5,35 (dd, 1 H, $=0,7 25 Hz. H-41), 5,20 (t, 1 H, J2,3=9'° Hz' H_2)' V1 (dd' 1 H' J2’ 3,=“ 10,5 Hz, H-2’), 5,08, 5,02 '(bs.kukin 1 H, =CH2), 4,95 (dd, 1 H, J3‘,4,=3/5 Hz' 4'94 1 H' J3 4=8'5 Hz' H-3), 4,50, 4,48 (d, kukin 1 H, 2=J.j. ^z' ^-1,1'), 4,38, 4,16 (ABq,kukin 1 H, JAb=12;0 Hz,'o-CH2-C=), 3,67 (s, 3 H, OCH3). 3.14, 3,10 (ABq, _ .· 30 kukinl H, JAB=14,5 Hz, =C-CH2-S), 2,37 (t, 2 H, J=7,5 Hz, S-CH2-CH2), 2,30 (t, 2 H, J=7,5 Hz, CH2-COO).

2-(1O-metoksikarbonyylidekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 4-0-f*-D-galaktopyranosyyli- P-D-glukopyranosidi (ARSC10E-2). 35 ARSC10-1:stä.

62 83659 2-(1O-metoksikarbonyylidekyylitiometyyli)prop-2-en-1-yyli- 2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-oc-D-galaktopyranosyyli)- £-D-galaktopyranosidi (ARSC10E-3).

DIB-7:stä. Saanto: 51 %. £öc723 = +55° (c = 1,1 CDCl3:ssa).

5 NMR- spektri (CDCLj, TMS): δ (ppm) = 5,57 (dd, 1 H, J4> = 1,2 Hz, H-4'), 5,38 (dd, 1 H, 3'.=11,0 Hz, H-2'), 5,21 (dd,' 1 H, J2,3=10/5 Hz' H‘2)' 5/20 (dd' 1 H' J3’,4,=3'2 Hz' H_3'^ 5,12, 5,03 (bs,kukin 1 H, =CH2), 5,00 (d, 1 H, r=3,7 Hz, H-T), 4,82 (dd, 1 H' J3,4=2/9 Hz' H*3)' 4/51 <d' 1 H, -,=7,8 Hz, H-1), 4,42 4,20 10 (ABq,kukin 1 H, JAB=12,7 Hz, O-CHj-OO, 3,67 (s, 3 H, OCH3), 3,17, 3,14 (ABq, kukin 1 H, JAB=14,2 Hz, =C-CH2-S), 2,39 (t, 2 H, J7/3 Hz, S-CH2CH2), 2,30 (t, 2 H, J=7,8 Hz, CW,COO).

Esimerkki 5 15 Neo-glykokonjugaattien valmistus (a) Glykosideja, joissa oli yksi tai kaksi esteri-pääteryhmää (RSO2C10E-2, RSO2C10EC8-2 ja ARSC2E-3) muutettiin vastaaviksi asyyliatsideksi, oleellisilta osin siten kuin ovat kuvanneet Dahmen et ai. (Carbohydr. Res. 129 20 (1984) neo-glykokonjugaattien valmistuksensa yhteydessä.

Reaktioseos, jossa oli asyyliatsidi metyylisulfoksidissa, lisättiin tipoittain aminoryhmän sisältävään kantaja-aineeseen, joka oli Na2B^O-y“RHC03-puskuriliuoksessa (katso Dahmen et ai.) pH:ssa 9,0-9,3, ja saatua seosta sekoitet-25 tiin yön ajan. Valmistettiin seuraavat konjugaatit: RSC^C 1 0EC8-2 · BSA. RSC>2C 1 0EC8-2 : sta (50 mg, 0,07 mmoolia) ja naudan seerumin albumiinista (BSA, 65 mg). Reaktioseos dialysoitiin (4x51 tislattua vettä) ja jäännös pakaste-kuivattiin, jolloin saatiin neo-glykoproteiini. Sitoutumis-30 aste (sokeriyksikköjen lukumäärä proteiinimolekyyliä kohden) oli 21 määritettynä differentiaalisen rikkipolttoanalyysin avulla.

63 83 659 ARSC2E-3*BSA. ARSC2E-2 deasetyloitiin tavanomaisesti, jolloin saatiin ARSC2E-3 (36 mg, 0,07 mmoolia), joka kytkettiin BSArhan (65 mg) kuten yllä. Pakastekuivaamalla saatiin neo-glykoproteiini, jonka sitoutumisaste oli 18 määritettynä 5 differentiaalisen rikkipolttoanalyysin avulla.

RSC^CI0EC8-2·spermidiini. RSC^CI0EC8-2:sta (94 mg, 0,13 mmoolia) ja spermidiinitrikloridista (12,1 mg, 0,067 mmoolia). Raaka tuote erottui geelinä ja eristettiin suodattamalla 10 reaktioseos ja kromatografoltiin sitten (SiC^, CMH, 65/35/10), jolloin saatiin puhdas konjugaatti.

RSC^C 1 OE-2 · SiC>2 · RSC^C 1 OE-2 : sta (50 mg, 0,054 mmoolia) ja nminoidusta silikageelistä (166 mg, Sperisorb 5 pm, 0,6 I3 mmoolia aminoryhmiä/g; Phase Sep, Deeside Ind. Est.,

Queensferry, Clwyd, UK). Saatu glykokonjugaatti pestiin kaksi kertaa vedellä, metanolilla ja dikloorimetaanilla sentri-fugoiden. Vakuumissa kuivaamalla saatiin 154 mg puhdasta glykokonjugaattia. Sitoutumisaste oli 0,13 mmoolia sokeri-20 hapteenia/g konjugaattia määritettynä rikkipolttoanalyysin avulla.

ARSC2E-3 · SiC>2 deasety loitiin tavanomaisesti, jolloin saatiin ARSC2E-3 (46 mg, 0,09 mmoolia), joka kytkettiin aminoituun 25 silikageeliin (95 mg), käsiteltiin edelleen ja puhdistettiin kuten yllä, jolloin saatiin 88 mg puhdasta glykokonjugaattia. Sitoutumisaste oli 0,19 mmoolia sokerihapteenia/g konjugaattia määritettynä rikkipolttoanalyysin avulla.

(b) ARSC3-SiC>2. Täysin asetyloitua DIB-glykosidiä 30 (DIB-6, 85 mg, 0,1 mmoolia) liuotettiin kuivaan etyyliasetaattiin (1,5 ml) ja lisättiin diatsabisykloundekaania (46 mg, 0,3 mmoolia, 45 μΐ). Seosta sekoitettiin 3 tunnin ajan ja lisättiin tioloitua silikageeliä (114 mg, valmistettu ... 9 käsittelemällä Lichrosorb'ia, Merck, 10 pm, n. 300 m /g, 1 3-trimetoksisilyylipropaani-1-tiolilla; n. 0,9 mmoolia 64 83659 tiolia/g tuotetta). 2 tunnin kuluttua sokeri oli kulunut loppuun (ohutkerroskromatografiän perusteella) ja konju-gaatti pestiin dikloorimetaanilla, vedellä ja metanolilla lasisuodattimessa. Konjugaatti deasetyloitiin käsittelemällä 5 sitä natriummetoksidin metanoliliuoksella (0,02M, 1 ml) yön ajan, pestiin vedellä, metanolilla, dikloorimetaanilla ja eetterillä ja kuivattiin. Sitoutumisaste oli 0,23 mmoolia sokerihapteenia/g konjugaattia määritettynä hiilipolttoana-lyysin avulla. Tämä tarkoittaa, että n. 25 % saatavilla olio leista tioliryhmistä oli reagoinut.

Esimerkki 6

Monihampaisten glykosidien valmistus Täysin asetyloitua DIB-glykosidia (1 mmooli), alkyyli-ditiolia (1 mmooli), cesiumkarbonaattia (1 mmooli) ja dime-15 tyyliformamidia (2 mmoolia) sekoittaa huoneen lämpötilassa typpikaasun alla 24-48 tunnin ajan. Reaktioseosta käsitellään edelleen kuten esimerkissä 3, jolloin saadaan monihampaisten glykosidien seos. Deasetyloimalla kuten esimerkissä 2 saadaan polymeeri, jossa sokeriyksiköt ovat kiinnittyneet alkyy-20 lipolysulfidi-runkoon. Polymeroitumisaste määritetään kroma- tografian avulla käyttäen Sephadexgeeliä.

Taulukko 5

0 ,°OL-R

h s; 65 83659

Yhdiste r,ro R i R 2 R 3 R4 R 5 R 6 5 R = S-(CH2)15CH3

ARSC1S-1 OAc H OAc OAc H H

ARSC16-.2 CAc H OAc OAc H CH2OAc ARSC16-3 OAc H OAc GalAeS H CH^OAc ARSC16-4 OAc H OAc H GalAca CH-,OAc 10 R = s-(ch2)^cooch3 ARSC2E-1 OAc H OAc GalAeS H CH2OAc ARSC2E-2 OAc H OAc H GalAca CH2 OAc

ARSC2E-3 OH H OH H GalAca CH2OH

R = s-(ch2)10cooch3 15 ARSC10E-1 OAc H OAc GalAeS H CH2OAc ARSC10E-2 OAc H OAc H GalAca CH0OAc R = S-(CH2)3-Si02

ARSC3-SiO^ OH H OH GalOHö H CH2OH

20 Esimerkki 7

Nestekiteiden muodostuminen diroetyylisulfoksidissa Bis-sulfidiglykolipidi (RSC16-8, RSC16-9 tai RSC16-12; 5-10 mg) liuotettiin heikosti lämmittäen dimetyyli-sulfoksidiin (1 ml). Kun lämpötila oli laskenut 30-35°C:een, 25 muuttui vielä läpinäkyvä seos puolijähmeäksi. Tutkittaessa seosta polarointimikroskoopin avulla paljastui, että oli muodostunut nestekiteitä, erityisesti nesteeseen sulkeutuneiden ilmakuplien läheisyydessä. Kun seos jätettiin useiden tuntien ajaksi, muodostui stabiilimpia aggregaatteja (luulta-30 vasti kiteitä) saostumana, ja muu osa nestettä muuttui juoksevaksi .

β6 83659

Esimerkki 8

Virusten sitomisen spesifisyyden tutkimus ja suhteel-lisen sitomiskyvyn määrittäminen_ a) Ohutkerroslevymenetelmä 5 Koe, jossa osoitetaan virusten sitoutuminen glykoli- pideihin ja testataan sitoutumisen yksityiskohtaista spesifisyyttä, on ratkaisevan tärkeä (vrt. Hansson et ai., FEBS Lett. 170, 1984, ss. 15-18). Periaate on se, että tutkittavaa virusta levitetään kerrokseksi kromatogrammille, 10 jossa on kohdesoluista tai muista lähteistä peräisin olevia glykolipidejä eroteltuina, ja virusten annetaan olla vuorovaikutuksessa mahdollisten reseptoriaineiden kanssa. Huolellisten pesujen jälkeen paljastetaan sitoutuneet virukset virusvastaisten vasta-aineiden ja vasta-aineiden radioaktii-15 visuudella merkittyjen vasta-aineiden ja sen jälkeen auto-radiografian avulla. Joissakin tapauksissa virushiukkanen merkittiin suoraan ennen sitoutumista. Menetelmä on yksityiskohdiltaan seuraavanlainen:

Kokonaislipidien (korkeintaan 100 ug kullakin kaistal-20 la) tai kokonaisglykolipidien (20-40 pg kullakin kaistalla) tai puhtaiden glykolipidien (0,01-1 pg) seoksia eroteltiin alumiinilevyillä, noin 5x5 cm, jotka oli päällystetty sili-kageeli 60:llä (Merck), käyttäen yleensä kloroformi/metanoli/ vettä (60:35:8, tilavuuden mukaan) liuottimena hapottomilla 25 glykolipideillä ja kloroformi/metanoli/2,5M ammoniakkia hapottomilla glykolipideillä ja kloroformi/metanoli/2,5M ammoniakkia (60:40:9, tilavuuden mukaan) liuottimena happamilla glykolipideillä. Vertailun vuoksi tunnistetaan rinnakkainen levy kemiallisesti suihkuttamalla anisaldehydi-30 liuoksella ja kuumentamalla. Virusten sitoutumista varten upotetaan kuivattu kromatogrammi, jossa aineet ovat eroteltuina, 1 minuutin ajaksi 200 ml:aan dietyylieetteriä, joka sisältää 0,5 % (paino/tilavuus) polyisobutyylimetakrylaattia (Plexigum P28, Rohm GmbH, Darmstadt) ja kuivataan 2 minuutin 35 ajan. Levy suihkutetaan sitten fosfaatilla puskuroidulla 67 83659 fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka pH on 7,3 ja joka sisältää 2 % naudan seerumin albumiinia (BSA) ja 0,1 % NaN^/ (liuos A), ja upotetaan sitten liuokseen A ja asetetaan petrimaljaan 2 tunnin ajaksi. Sen jälkeen kun liuos A 5 on kaadettu pois, lisätään virussuspensio (noin 25 pg/ml ja noin 2 ml levyä kohden, jonka mitat on annettu yllä) kromatogrammille, joka on asetettu vaakasuoraan petrimaljan kostutettuun ilmaan. Kun on inkuboitu 2 tunnin ajan, kaadetaan virussuspensio pois ja levy pestään kuusi kertaa 10 PBS:llä, kulloinkin 1 minuutin ajan. Tyypillisessä vasta-ainetapauksessa monoklonaalista vasta-ainetta 817, joka kohdistuu askites-nesteessä tuotettua Sendai-virusta vastaan, laimennetaan 1:100 liuoksella A, käyttäen noin 2 ml levyä kohti, ja inkuboidaan 2 tunnin ajan. Sen jällkeen kun 15 on pesty viisi kertaa PBS:llä, inkuboidaan noin 2 ml:n kanssa kaniinissa tuotettua hiiren Fab'in vastaista vasta-ainetta 5 125 (4 x 10 cpm/ml I-merkittyä F(ab'>2, the Radiochemical Centre, Amersham) 2 tunnin ajan. Kun on pesty kuusi kertaa PBS:llä, levy kuivataan ja XAR-5-röntgenfilmin (Eastman) 20 annetaan valottua sillä, yleensä 2-3 päivän ajan, käyttäen vahvistusvarjostinta.

Käsittelemällä muovilla saadaan hydrofobinen pinta. Erotellut glykolipidi- tai muut vyöhykkeet saadaan siten olemaan esillä hydrofobisella kiinteällä pinnalla samaan 25 tapaan kuin lipidit ovat esillä biologisessa kalvossa. Tämä tarkoittaa, että testattava aine on tiiviisti ankkuroituneena parafiiniketjuillaan muovipinnassa ja polaariset pääteryhmät ovat esillä ja ympäristön tavoitettavissa. Tämä jäljittelee elävän solun pintakerrosta. Tämä muovikäsittely on erittäin 30 kriittinen spesifisyyden ja toistettavuuden kannalta ja selittää tämän kiinteäfaasimenetelmän edullisuuden verrattuna tavanomaisiin inhibitiomäärityksiin, jotka perustuvat "liuotettuihin" aggregaatteihin tai miselleihin.

68 83659

Toteamisraja vaihtelee ligandin sitoutumishalukkuuden mukaan, mutta on suuruusluokkaa 5-50 ng reseptoria tai suurin piirtein samaa pikomoolisuuruusluokkaa. Jotta resepto-riehdokasta pidettäisiin kielteisenä, ei saisi olla ollen-5 kaan tummentumaa yhden mikrogramman tai sen ylittävällä tasolla. Hyvien sitojien ollessa kysymyksessä saadaan kyllästäviä mustia kaistoja 10 ng:lla. Tämän määrityksen ilmeinen etu on, että seokset tai aineet erotellaan ensin erilliseksi ainelajikkeiksi, jolloin vältetään vaara, että vähäiset 10 komponentit jäisivät piiloon tai että saataisiin valesitomat-tomuutta, joka johtuisi epäpuhtautena olevasta aineesta. Albumiinilla päällystäminen myös tukkii epäspesifisiä hydrofobisia kohtia, jotka muuten voivat aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Lopuksi vielä perusteelliset pesut pois-15 tavat tai irrottavat epäspesifisiä kiinnittymisiä. Sen sijaan tavanomaisissa inhibitiomäärityksissä yleensä inkuboidaan viruksia kohdesolujen kanssa suspensiossa, jossa ei ole tai on läsnä sonikoituja misellejä. Kun on kysymyksessä hemo-lyysimääritys, tutkitaan seos yksinkertaisen fotometrian 20 avulla sentrifugoinnin jälkeen (vrt. Huang, Lipids 18, 1983, ss. 489-492). Albumiinia ei sitten ole läsnä eikä ole vastaavia pesuvaiheita kuin nyt kyseessä olevassa määrityksessä.

b) Virusten sitoutumisen kvantitatiivinen määrittäminen mikrotitraussyvennysten autoradiografiän avulla.

25 Virusten sitoutumisen kvantitatiivista määrittämistä varten omaksuttiin menettelytapa vastaavasta vasta-aineiden sitomisesta kiinteään faasiin mikrotitraussyvennyksiin (Brockhaus et ai., J. Biol. Chem., 256, 1981, ss. 13223-13225). Glykolipidin tai muiden aineiden laimennussarjän 50 yl:ssa 30 metanolia annetaan haihtua mikrotitraussyvennyksessä yön aikana huoneen lämpötilassa. 100 μΐ 2 % BSA:ta PBS:ssä inkuboidaan sitten 2 tunnin ajan, minkä jälkeen syvennys huuhdotaan kerran samalla tilavuudella liuosta. 50 pl suspensiota, jossa on 1,5 ug virusta BSA-PBS:ssä, inkuboidaan 4 tunnin ajan, 35 minkä jälkeen pestään neljä kertaa kulloinkin 100 piillä li 69 83659 BSA-PBS. Sendai-viruksen ollessa kysymyksessä inkuboidaan 50 μΐ askites-nesteessä tuotettua vasta-ainetta 817, laimennettuna 1:100 liuoksella A, 4 tunnin ajan, minkä jälkeen pestään neljä kertaa. Lopuksi inkuboidaan 50 ui kaniinissa 5 tuotettua hiiren Fab'in vasta-ainetta (2,5 x 104 cpm 125I:lla merkittyä F(ab')2, the Radiochemical Centre, Amersham) yli yön 4°C:ssa, minkä jälkeen pestään viisi kertaa 100 pl:lla BSA-PBS. Syvennykset leikataan levystä ja niistä määritetään 125 yksitellen I spektrometrissä.

10 Yllä olevaa menetelmää käytettiin tutkittaessa Sendai- viruksen sitoutumista tämän keksinnön mukaisiin synteettisiin glykolipidianalogeihin. Tutkitut keksinnön mukaiset yhdisteet olivat Glc/3—> OCH2CH (CH2S02 (CH ) 1 5CH3) (yhdiste A) ja Gal^1—MGlc/3—> OCH2CH (CH2S02 (CH.,) 5CH3 ) (yhdiste B) , 15 joita verrattiin kahteen luonnon reseptoriin, nimittäin Galp—^ ceramidiin ja Glcβ—f»· ceramidiin.

Puolikvantitatiivisesti tutkittaessa yhdiste A ja yhdiste B osoittivat kumpikin omaavansa erinomaisen kyvyn sitoa virusta. Kvantitatiivisemmassa tutkimuksessa yhdisteel-20 lä B osoittautui olevan suurin piirtein samanlainen sitomis-kyky kuin luonnon vertailureseptoreilla. Katso myös alla olevaa taulukkoa 6.

Taulukko 6

Sendai-viruksen sitoutuminen luonnon ja synteettisiin 25 glykolipideihin____

Glykolipidi Menetelmä Tulos

Glc30-CH2CH(CH9S(CH2)15CH3)^ TLC (Esim.8a) (♦)

GtcSO-CH0CH(CH9SO,(CH2)15CH3)2 TLC (Esim.8a) 30 Glc30-(CH9)0S02S02(CH2)15CH3 TLC (E3im.8a)

GalBO-ceramidi ΜΓ-syvennysten autorad. * (Esim. 8b)

Glc30-ceramidi MT-syvennysten autorad. * (Esim. 8b) 3^ GIc30-CH2CH(CH2S02(CH2)^3CH3)2 MT-syvennysten autorad. * (Esim. 8b)

Gal31-*4Glc30-CH2CH (CH2S02(CH2) i^CH3) 2 MT-syvennysten autorad. * (Esim. 8b) 70 83659 c) Virusten sitomisen kvantitatiivinen määrittäminen ELISA-menetelmällä Tässä tutkimuksessa käytettiin koko ajan mikrotitraus-laattoja, jotka olivat tyyppiä Cooks M29. Laattojen päällys-5 tys luonnon glykolipideillä, synteettisillä glykolipideillä ja kaniinin anti-Sendai-virus-seerumilla suoritettiin seuraavasti:

Luonnon globotetraosyyli-fi-ceramidi ja galaktosyyli-l^-ceramidi liuotettiin analyysiin kelpaavaan metanoliin 10 seuraaviksi pitoisuuksiksi: 20, 10, 5, 2, 5, 1,5, 0,75, 0,375, 0,185, 0,092 ja 0,046 pg/ml. Synteettinen GalfM ~*4G1c|30-CH2CH(CH2S02(CH2) 15CH3) gic^o-ch2ch(ch2so2(ch2)15ch3)2,

GalfM ^4GlcfM->4Glcpo-CH2CH - (CH2S- (CH2) η 5CH3) 2 ja 15 GlcpO-CH2CH(CH2S(CH2)^3CH2)2 liuotettiin analyysiin kelpaavaan metanoliin seuraaviksi pitoisuuksiksi: 100, 50, 25, 6,25 ja 1,56 pg/ml. Kutakin yllä olevista liuoksista (50 μΐ) lisättiin mikrotitraussyvennykseen ja metanolin annettiin haihtua yön ajan.

20 Kaniinin anti-Sendai-virus-seerumi laimennettiin pitoisuuteen 50 pg proteiinia/ml natriumkarbonaatti/natrium-vetykarbonaattipuskuriliuoksella, siten, että pH:ksi tuli 9,6. Seerumiliuosta (100 μΐ) lisättiin sarjaan mikrotitraussyven-nyk siä ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa yön ajan ja pus-25 kuriliuos poistettiin. Lisättiin liuosta (100 μΐ) , jossa oli BSA:ta (2 %) Tris-HCl (5 mM)-NaCl (0,15M) -liuoksessa (pH 8,5). Laattoja inkuboitiin 37°C:ssa 2 tunnin ajan ja pestiin sitten kaksi kertaa ylimäärällä BSA-liuosta (1 %) Tris-HCl (50 mM)-NaCl:ssa (0,15M), jonka pH oli 8,5.

30 Sendai-virusta laimennettiin proteiinipitoisuuteen 15 pg/ml liuoksella, jossa oli BSA:ta (1 %) Tris-HCl (50mM)-NaCl:ssa (0,15M), pH:ssa 8,5. Virusliuosta (100 μΐ) lisättiin yllä mainittujen mikrotitrauslaattojen kuhunkin päällystettyyn syvennykseen. Laattoja inkuboitiin 37°C:ssa 35 2 tunnin ajan ja pestiin sitten neljä kertaa ylimäärällä il 7i 83659 BSA-liuosta (1 %) Tris-HCl-NaCL:ssa (pitoisuus kuten yllä). Hiiren monoklonaalista Sendai-virusvastaista vasta-ainetta BSA-liuoksessa (100 ful, 1 % BSA, Tris-HCl-NaCl kuten yllä) lisättiin kuhunkin syvennykseen. Laattoja inkuboitiin 5 37°C:ssa 90 minuutin ajan ja pestiin sitten neljä kertaa ylimäärällä BSA-liuosta (1 % BSA Tris-HCl-NaCl:ssä kuten yllä). Piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua kaniinissa tuotettua hiiren vasta-aineen vasta-ainetta (Dakopatts) laimennettiin pitoisuuteen 20 pg/ml BSA-liuoksella (1 % BSA, 10 Tris-HCl-NaCl kuten yllä). Liuosta lisättiin (100 μΐ) yllä oleviin mikrotitraussyvennyksiin ja laattoja inkuboitiin 37°C:ssa 90 minuutin ajan ja pestiin sitten neljä kertaa ylimäärällä BSA-liuosta (1 % BSA, Tris-HCl-NaCl kuten yllä). Ortofenyleenidiamiini (OPD) -liuosta (100 μΐ; 4 mg OPD ja 15 4 μΐ 30 % H2°2 ^ m^-:ssa sitraatti-fosfaattipuskuri- liuosta; pH 5,0) lisättiin kuhunkin syvennykseen ja laattoja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. Rikkihappoa (50 μΐ, 0,5M) lisättiin jokaiseen syvennykseen ja absorptio mitattiin aallonpituudella 492 nm (katso kuvaa 1). 20 d) Virusten sitoutumisen estäminen; ELISA-menetelmä Tämä määritys suoritettiin siten kuin yllä kohdassa (c) on kuvattu, seuraavin poikkeuksin: 1) Käytettiin vain yhtä pitoisuutta (10 ^g/ml) globotetraosyyli-p-ceramidia ja galaktosyyli- β-ceramidia.

25 2) Ennen virussuspension lisäämistä mikrotitraus syvennyksiin viruksia inkuboitiin vaihtelevien määrien kanssa neo-glykoproteiinia /Galj2>1—>4Glcpo-CH2CH (CH2SC>2-(CH2) 7CH.j) CH2S02 (CH2) 1 φΟΟΟΝΗ)η 2Q-BSA. Neo-glykoproteiini liuotettiin Tris-HCl (50 mM)-NaCl:iin (0,15M), pH 8,5, 30 seuraaviksi pitoisuuksiksi: 4,4, 1,1, 0,275, 0,069, 0,017, 0,004 ja 0,001 mg/ml. Sendai-virussuspensiota (4 μΐ) lisättiin kuhunkin neo-glykoproteiiniliuokseen (265 μΐ) siten, että lopullinen viruskonsentraatio oli 45 pg/ml. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 2 tunnin ajan ja saatua virusneo-35 glykoproteiini-suspensiota (50 μΐ) käytettiin yllä kohdassa 72 83659 (c) kuvatun mukaisessa virusmäärityksessä. Tulokset on esitetty kuviossa 2. Globotetraosyyli-(c-ceramidia käytettiin negatiivisena kontrollina, koska aikaisemmin on osoitettu, ettei se kykene sitomaan Sendai-virusta.

5 e) Virusten sitoutumisen estäminen; ohutkerros- levymenetelmä

Sendai-virusta (60 pg) inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan 2 mg:n kanssa

Gal/M -^4G1c|30-CH2CH(CH2-S02-(CH2) 1()COONa) 2, 2 mg:n kanssa 10 Gal/?1 ->4Glc^0-CH2CH(CH2S02 (CH2) 7CH3)CH2S02 (CH2) igCOONa ja 1 mg :n kanssa Gal/M -*4Glcf 0-CH2CH (CH2SC>2 (CH2> ?CH3) CH2S02" (CH2)1qC0NH-BSA, jotka kukin oli liuotettu 2 ml:aan PBS. Seokset levitettiin ohutkerroslevyille, jotka sisälsivät useita luonnon glykolipidejä, jotka ovat tunnettuja toisen 15 vaiheen reseptoreina Sendai-viruksella (katso Karl-Anders Karlsson, Virusvastaisia aineita; DK-patenttihakemus nro 178/75, jätetty tämän patenttihakemuksen prioriteettipäivä-määränä). Levyjä inkuboitiin ja niiden käsittelyä jatkettiin kuten yllä on kuvattu (esim. 8a). Positiivisen estämisenä 20 rekisteröitiin reseptoritäplien tummuuden huomattava heikkeneminen autoradiogrammissa. Tulokset on esitetty alla taulukossa 7.

Neo-glykokonjugaatti Estäminen 25 GalSWGIcSO-CH2CH(CH2SO2(CH2)10COONa)2

GalBl-4Glc5O-CH2CH(CH2SO2(CH2)7CH3)CH2SO2(CH2)10COONa GalB1~4GlcSO-CH2CH(CH2SO2(CH2)7CH3)CH2SO2(CH2)10CONHBSA ♦

Esimerkki 9

Bakteerien sitoutumisen spesifisyyden määritys; 30 ohutkerroslevymenetelmä_

Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti (Hansson et ai., Anal. Biochem. 146, 1985, ss. 158-163). Bakteerit merkittiin ulkonaisesti radioaktiivisuudella käyttäen jodogenia 1 2 5 ja Na I (Hansson et ai. yllä). E. Coli oli kantaa, joka 35 on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla Gal-^Gal-sitomisspesi-fisyyteen keskittyen (Bock et ai. J. Biol. Chem. 260, 1985,

II

73 83659 ss. 8545-8551 ). Propionibacterium freudenreichii1 n on aikaisemmin selostettu sitovan laktosyyliceramidia (Hansson et ai., Glykokonjugaatteja, M.A. Chester, D. Heinegärd, A. Lundblad ja S. Svensson, toimittajat, 1983, ss. 631-632, 5 Rahms in Lund, Lund, Ruotsi). Radioaktiivisuudella merkityt bakteerit levitettiin levyille, jotka sisälsivät alla taulukossa 8 esitetyt neoglykolipidit. Levyjä käsiteltiin ja toteaminen tapahtui kuten on kuvattu yllä olevissa kirjallisuusviitteissä (pääosilta siten kuin virusten sitomisen 10 yhteydessä, esimerkissä 8a kuvatulla tavalla). Tulokset on esitetty alla taulukossa 8.

Taulukko 8

Bakteerien sitoutuminen synteettisiin glykolipideihin 15 Glykolipidi Bakteeri Sitoutuminen

Gal6l-4Glc50-CH2CH(CH2*S-(CH^)^CH2)2 Propionibacterium (*) f reudenreichii

GalB1-4Glc60-CH2CHlCH-S-(CH2)17CH3)2 " (-) 20 GalftWGIcS0-CH2CH(CH2-S02-(CH2)15CH3)2

Galal-4GalBO-CH2CH(CH2-S-(CH0)15CH3)2 f. coli

Gala1-4GalB0*CH2CH(CH2-S02-(CH2)15CH3)2 74 83659

Kirjallisuusviitteet S. Hakomori, Ann. Rev. Biochem., 50, 11981), s. 733.

5 N. Sharon ja H. Lis, Chem. Eng. News, (March 30, 1981), s. 21. R.U. Lemieux, Chem. Soc. Rev., (1978), s. 423.

N. Sharon ja H. Lis, Science, 177, (1972),s. 949.

10 E.A. Kabat, Methods Enz., 70, ( 1972),s.3.

E.H. Beachey, J. Infect. Diseases, 143, (1981), s.325.

15 J.S. Slama ja R.R. Rando, Biochemistry, 19, (1980), s. 4595.

J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G. Noori, ja A.-S. Cariström, Carbohydr. Res., 127, (1984), s. 27.

20 R.U. Lemieux, D.R. Bundle, ja D.A. Baker, J. Am. Chem. Soc, 97, (1975},s. 4076.

J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G. Nloori, ja A.*S. Cariström, Carbohydr. Res., 129, (1984), s. 63.

25 J.N. Israelachvili, S. Marcelja, ja R.G. Horn, Quarterly Reviews of Biophysics, 13, (1980), s.121.

J. Dahmen, T. Frejd, G. Grönberg, T. Lave, G. Magnusson, 30 G. Noori, Carbohydr. Res., 116, (1983), s . 303.

M.A. Nashed ja L. Anderson, J. Am. Chem. 5oc., 104, (1982), s.7282.

II

Claims

75 83659

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten 0-glykosidiyhdisteiden valmistamiseksi, joiden kaava on 5 ,R= (Sokeri )n - 0 - CH2 - Cj - R3 I Ri 10 jossa n on kokonaisluku 1-10 ja sokeri on valittu ryhmästä D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloos i, D-riboosi, D-arabinoosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoosi, D-glukuroni-happo, D-galakturonihappo, D-mannuronihappo, 2-deoksi-2-15 ftaali-imido-D-glukoosi, 2-deoksi-2-ftaali-imido-D-galak-toosi ja sialihappo sekä näiden johdannaiset, jolloin, kun n>l, sokeriyksiköt voivat olla samoja tai erilaisia, ja R3 on H, ja

20 Rx ja R2, jotka voivat olla samoja tai erilaisia, tarkoittavat ryhmää, jonka kaava on - CH, - S - R, - Rs II Z II 4 5 25 (0)p jossa m ja p tarkoittavat toisistaan riippumatta lukua 0 tai 1 m+p on 0, 1 tai 2, R4 on tyydyttynyt tai tyydyttymätön, haarautunut 30 tai haarautumaton 1-25 hiiliatomia sisältävä alkyyliket-ju, aryyli tai steroidiryhmä, ja R5 on H, CHO, N02, NH2, OH, SH, COOH, C00R6, jossa R6 on C^-alkyyli tai kantaja, C0NHNH2, C0N3, CH(OR6)2, jossa R6 tarkoittaa samaa kuin edellä, tai kantaja, tai 35 R2 ja R3 muodostavat yhdessä ryhmän =CH2, ja 76 83659 Rx on yllä määritellyn kaavan II mukainen ryhmä, jossa R4, R5, m ja p tarkoittavat samaa kuin edellä, tunnettu siitä, että 5 a) kun R3 on H ja Rx ja R2 tarkoittavat yllä määri tellyn kaavan II mukaista ryhmää, O-glykosidi, jonka kaava on CH,X 10 (Sokeri )n - 0 - CH2 - CH VI CH2X jossa sokeri ja n tarkoittavat samaa kuin edellä ja X on poistuva ryhmä, saatetaan reagoimaan tiolin kanssa, jonka 15 kaava on HS - R4 - Rs VII jossa R4 ja Rrj tarkoittavat samaa kuin edellä, ja halut-20 taessa tuote saatetaan reagoimaan hapettimen kanssa; tai b) kun R2 ja R3 yhdessä muodostavat ryhmän =CH2 ja Rx on yllä määritellyn kaavan II mukainen ryhmä, jossa m, p, R4 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, O-glykosidi, jonka kaava on

25 CH2 (Sokeri )n - 0 - CH2 - C - CH2 - X VII jossa sokeri, X ja n tarkoittavat samaa kuin edellä, saa-30 tetaan reagoimaan yllä määritellyn kaavan VII mukaisen tiolin kanssa, ja haluttaessa tuote saatetaan reagoimaan hapettimen kanssa. li 77 83 659

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa Rx ja R2 ovat identtisiä, kun R3 on H.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 ja R2 tarkoittavat kaavan II mukaista ryhmää, R4 on haarautumaton 2-17 hiiliatomia sisältävä alkyyliketju ja R5 on CH3, COOCH3 tai kantaja.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa m+p on 0 tai 2.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R2 ja R3 yhdessä muodostavat ryhmän 15 =CH2 ja Rx on kaavan II mukainen ryhmä, jossa R4 on haarautumaton 2-17 hiiliatomia sisältävä alkyyliketju, R5 on CH3, COOCH3 tai kantaja ja m+p on 0 tai 2.

6. 0-glykosidi, jonka kaava on

20 R, i 1 (Sokeri )n - 0 - CH2 - C - R3 (I') Ri jossa n on kokonaisluku 1-10 ja Sokeri on valittu ryhmäs- 25 tä D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi, D- riboosi, D-arabinoosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoosi, D-glukuroni-happo, D-galakturonihappo, D-mannuronihappo, 2-deoksi-2-ftaali-imido-D-glukoosi, 2-deoksi-2-ftaali-imido-D-galak- 30 toosi ja sialihappo sekä näiden johdannaiset, jolloin, kun n>l, sokeriyksiköt voivat olla samoja tai erilaisia, ja R3 on H ja R3 ja R2, jotka voivat olla samoja erilaisia, tarkoittavat ryhmää CH2X, jossa X on poistuva ryhmä, tai R2 ja R3 muodostavat yhdessä ryhmän =CH2 ja Rj on CH2X.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen O-glykosidi, 78 83659 tunnettu siitä, että Rx ja R2 tarkoittavat ryhmää CH2X, jossa X on halogeeni, alkyylikarbonyloksi, aryyli-karbonyloksi, alkyylisulfonyloksi tai aryylisulfonyloksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen O-glykosidi, 5 tunnettu siitä, että X on Br.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että R2 ja R3 yhdessä muodostavat ryhmän =CH2 ja Rx on CH2X, jossa X on halogeeni, alkyylikarbonyloksi, aryylikarbonyloksi, alkyylisulfonyloksi tai 10 aryylisulfonyloksi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että X on Br. Il 79 83659