FI78707C

FI78707C - Nya glykosider och glykokonjugater och foerfarande foer deras framstaellning.

Info

Publication number: FI78707C
Application number: FI832254A
Authority: FI
Inventors: Hans Goeran Magnusson; Jan Erland Dahmen; Torbjoern Frejd; Ghazi Noori
Original assignee: Carbohydrates Int Ab
Priority date: 1982-06-23
Filing date: 1983-06-20
Publication date: 1989-09-11
Also published as: DE3380025D1; EP0098252B1; FI78707B; EP0098252A2; DK284283A; JPS5925399A; FI832254L; EP0098252A3; US4675392A; SE8203925D0; DK284283D0; FI832254A0; ATE43847T1

Description

, 78707

Uusia glykosideja ja glykokonjugaatteja ja menetelmä niiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia 0-glvkosideja ja gly-5 kokonjugaatteja sekä menetelmää niiden valmistamisek si .

Glykokonjugaattien rooliin biologisten reseptorien vuorovaikutuksissa kohdistunut arvostus on viime aikoina suunnannut paljon kiinnostusta näiden yhdisteiden 10 kemiaan ja molekyylibiologiaan. Valtava joukko biologisia havaintoja on esitetty viimeaikaisessa kirjallisuudessa, ja useita erinomaisia katsauksia on ilmestynyt (1). Veriryhmäantigeenit ovat klassisia esimerkkejä hiilihyd-raattireseptoreista (2). Muutaman viime vuoden aikana 15 on osoitettu, että näitä reseptoreja on läsnä kaikkialla, ja uudet tutkimukset sisältävät nyt sellaisia toisistaan poikkeavia alueita kuten lektiinit (3) ja vastaa-aineet (4); solupintareseptorit bakteereilla (5), viruksilla (6), mykoplasmalla (la) ja alkueläimillä (la); bakteeri-20 myrkyt (7); hormonireseptorit (8); solukasvun säätely ja kasvaimien synty (9); siittiö-munasolu -vuorovaikutus ja hedelmöitys (10); tunnistusilmiöt kasveissa (11), lääkkeiden ohjaaminen kohteeseen (12).

Glykokonjugaattien kemiallinen synteesi ja muun-25 taminen on johtanut esimerkiksi keinotekoisiin immuno- geeneihin hiilihydraattispesifisten vasta-aineiden valmistusta varten (2), keinotekoisiin glykolipideihin, joita voidaan liittää liposomeihin (13), ja funktionaa-lisoituja glykosideja on käytetty kiinteiden faasien 30 valmistamiseksi affiniteettikromatografiaa varten (14).

Kaikissa näissä tapauksissa tarvitaan stereospesifisiä menetelmiä, jotka tekevät mahdolliseksi valmistaa puhtaita oCr tai /!> -glykosideja, jotka sisältävät välihaara-glykoneja, jotka voidaan myöhemmässä vaiheessa yhdistää 35 kovalenttisesti kantajamolekyyliin tai -hiukkaseen, edul- 2 73707 lisesti fysiologisissa olosuhteissa. Lisäksi yksinkertaisen aglykonin (esim. metyylin tai etyylin) sisältäviä glykosideja tarvitaan agglutinaatiosysteemien/ kuten 4 . 5 erytrosyytti-vasta-aine 3a erytrosyytti-bakteeri 5 -vuorovaikutusten, spesifisyystutkimuksiin.

Oligosakkaridien välihaaraglykosideja voidaan valmistaa kahta tietä, jotka ovat pääosiltaan erilaisia. Kokonaissynteesi, jossa käytetään lähtöaineina suojattuja monosakkarideja, johtaa tavallisesti anomeerises-10 ti puhtaisiin yhdisteisiin, mutta reaktiosarjän kokonais saanto on alhainen. Toinen aloittamistapa on välihaaran liittäminen (glykosidisynteesillä) valmiin oligosakkaridin (joka saadaan biologisesta materiaalista tai synteettisesti) pelkistyvään päähän. Jälkimmäinen mene-15 telmä on edullinen silloin, kun oligosakkaridia voidaan saada suurina määrinä halvasta lähtöaineesta (esim. polysakkaridien osittaisella hydrolyysillä). Voi kuitenkin olla vaikeata erottaa <<- ja /4-glykosidit toisistaan, erityisesti käytettäessä pitkiä välihaaroja ja/tai 20 korkeampia oligosakkarideja.

Koko glykosidisynteesikysymyksestä ovat Bochkov ja Zaikov (15) esittäneet katsauksen mitä suositelta-vimmalla tavalla, kun taas menetelmiä välihaaraglyko-sidien valmistamiseksi on siellä tällä kemiallisessa 25 kirjallisuudessa (16).

Joitakin yleisiä tunnusmerkkejä voidaan määritellä välihaaraglykosidien valmistukselle ja niiden liittämiselle kantajamolekyyleihin (tai -hiukkasiin): i) Tulisi olla mahdollista yhdistää välihaara ja 30 hiilihydraattiosa (glykosidisynteesillä) stereospesi- fisellä tavalla, niin että voidaan saada puhtaita o<r tai A -glykosideja.

ii) Välihaaran tulisi sopia yhteen tavallisten reagenssien ja reaktio-olosuhteiden kanssa, joita käyte- 35 tään hiilihydraattien synteesissä ja muuntamisessa.

3 78707 iii) Tulisi olla mahdollista vaihdella välihaaran pituutta, hydrofobisuutta ja pääteryhmän funktionaali-suutta.

iv) Tulisi olla mahdollista aktivoida välihaaran 5 pääteryhmä fysiologisissa olosuhteissa jatkossa tapahtuvaa proteiineihin tai muihin vastaanottaviin aineisiin liittämistä varten.

v) Välihaaran tulisi liittyä kovalenttisesti ja selektiivisesti kantaja-aineeseen.

10 vi) Kantaja-aineen (esim. proteiinin) pintavarauk- sen ja konformaation ei tulisi muuttua voimakkaasti liittyvän hiilihydraattiosan vaikutuksesta.

Ylenpalttisesta määrästä menetelmiä, joita kuvataan kirjallisuudessa (16), voidaan löytää joitakin yksittäis-15 tapauksia, jotka täyttävät suurimman osan edellä mainituista tunnusmerkeistä. On kuitenkin yhä olemassa sellaisten yleismenetelmien tarve, jotka sallivat välihaaran joustavan valitsemisen, ilman että on välttämätöntä toteuttaa uusia glykosidisynteesi jokaista muunnelmaa varten.

20 Kirjallisuudessa on esiintynyt muutamia selostuk sia välihaaraglykosidien aseteittaisesta rakentamisesta (17), jossa on käytetty esimerkiksi tavanomaista allyyli-suojausryhmää alkuperäisenä aglykonina. W-halogeenialkyy-liglykosideja ei ole käytetty tähän tarkoitukseen (vaikka 25 (2-bromietyyli)-^-D-glukopyranosidin (3) synteesistä ja sen liittämisestä edelleen tiettyihin aromaattisiin amii- 18 neihin on kerrottu ).

Esillä oleva keksintö koskee O-glykosideja, joiden kaava on 30 (sokeri)n-0-(CH2)2-S-R-R', jossa n on kokonaisluku 1-10, R on alkyyli, jossa on enintään 25 hiiliatomia tai aryyli ja R' on H, CHO, CH(OR")2» 35 jossa R" on C^-alkyyli; N02, NH2, OH, SH, COOH, COOCH3, COOCH2CH3, CONHNH2, CON3 tai kantaja.

4 78707

Keksintö koskee myös bi-dentaatti-O-glykosideja, joiden kaava on /“(sokeri)n-0-(CH2) 2~S-72R, 5 jossa n on kokonaisluku 1-10 ja R on alkyyli, jossa on enintään 25 hiiliatomia, tai aryyli.

Lisäksi keksintö koskee menetelmää O-glykosidien valmistamiseksi, joiden kaava on 10 (sokeri)-O-(CH2)2-S-R-R', mukaisen O-glykosidin valmistamiseksi, jossa kaavassa n on kokonaisluku 1-10, R on alkyyli, jossa on enintään 25 hii-15 liatomia tai aryyli ja R' on H, CHO, CH(OR")2, jossa R" on C1_4-alkyyli; N02, NH2, OH, SH, COOH, COOCH3, COOCH2CH3, CONHNH2 tai CON3· Menetelmälle on tunnusomaista, että ha-logeenialkyyli-O-glykosidi, jonka kaava on 20 (sokeri)n-0-(CH2)2-Hal, jossa Hai on kloori, bromi tai jodi ja n on kokonaisluku 1-10, saatetaan reagoimaan tiolin kanssa, jonka kaava on 25 HS-R-R, jossa R ja R' tarkoittavat samaa kuin edellä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä valmistetaan ensin kyseessä olevan, biologisesti aktiivisen oligosakka-30 ridin anomeerisesti puhdas (J-halogeenialkyyliglykosidi (seuraavassa tekstissä puhutaan tavallisesti 2-bromietyy-liglykosideista) ja sen jälkeen bromi korvataan soveltuvalla tavalla funktionalisoidulla tiolilla, joka tekee mahdollisesti liittämisen lopuksi kantaja-aineeseen. Sen 35 lisäksi bromiatomi voidaan helposti korvata vedyllä (tai 5 78707 tritiumilla) käyttäen tavanomaisia hydrogenointiolosuhtei-ta, jolloin syntyy alkyyliglykosideja, joita voidaan käyttää inhibiittoreina agglutinaatioreaktioita arvioitaessa.

2-bromietyyliryhmä näyttää soveltuvan useimpiin tavanomai-5 siin reaktioihin, joita käytetään synteettisessä hiilihyd-raattikemiassa, mahdollistaen siten oligosakkaridien 2-bro-mietyyliglykosidien monimutkaiset monivaiheiset valmistukset (ks. jäljempänä).

Vaikka tässä selotuksessa puhutaan enimmäkseen 2-10 bromietyyliryhmästä valmistettavien glykosidien osana, tulisi huomata, että vastaavat kloori- ja jodijohdannaiset ovat yhtä käyttökelpoisia. Kloori- ja jodimuunnelmat toimivat siis hyvin samalla tavalla kuin vastaavat bromijoh-dannaiset, ja keksintö koskee kaikkia kolmea halogenidia.

15 Lähtöaineet valmistetaan saattamalla aktivoitu so keri, joka on sokerin 1-asyylijohdannainen, sokerin 1,2-ortoasyyliesterijohdannainen, sokerin 1-bromijohdannainen, 20 sokerin 1,2-oksatsoliinijohdannainen, sokerin l-asyyli-2-deoksi-2-ftalimidijohdannainen tai sokerin l-bromi-2-deoksi-2-ftalimidijohdannainen, reagoimaan alkoholin kanssa, jonka kaava on Hai-(C^)2~OH, 25 jossa Hai on kloori, bromi tai jodi, jolloin muodostuu O-glykosidi, ja ottamalla talteen muodostunut glykosidi.

Mainitun menetelmän edullinen toteutusmuoto käsittää glykosidin muodostamisen 1,2-sokeriasetaatti-, -orto-esteri-, oksatsoliini- tai -l-asyyli-2-ftalimidijohdan-30 naisesta Lewis-hapon ollessa läsnä. Toinen toteutusmuoto käsittää glykosidin muodostamisen glykosyylibromidista raskasmetallisuolan avulla, mahdollisesti suojaamalla 2-hydroksyyliryhmä. Reaktio voidaan tehdä orgaanisessa liuot-timessa, esimerkiksi metyleenikloridissa.

35 Valmistetun glykosidin liittämiseksi välihaaraan suoritetaan nukleofiilisella additiolla käyttäen välihaa- 6 78707 rayhdistettä, jonka 2-asemassa on nukleofiilinen rikkiä sisältävä funktionaalinen ryhmä. Näin saatu yhdiste voidaan sitten liittää kovalenttisesti toisen funktionaalisen ryhmänsä kautta kantaja-aineeseen.

5 Mainittu menetelmä on erityisen käyttökelpoinen silloin, kun muodostuu 06- ja />-2-bromiglykosidin seos, josta isomeerit voidaan helposti erottaa ja haluttu isomeeri ottaa talteen.

Joitakin keksinnön periaatteen sovellutuksia esi-10 tetään kaavoin liitteenä olevassa kuvassa 1.

Edellä esitetyissä kaavoissa sokeriosa on edullisesti jokin jäljempänä tässä selitysosassa mainituista aldooseista. Lisäksi edellä esitetyssä kaavassa R':n on tarkoituksenmukaista olla karboksyylihappojohdannainen, 15 edullisesti esteri. R' voi myös olla edullisesti sulfhyd-ryyliryhmä, vety, aminoryhmä tai nitroryhmä. Kahdessa viimeksi mainitussa tapauksessa on myös edullista, että R on aryyli.

Keksinnön mukaisessa O-glykosidissa sokeri on edul-20 lisesti jokin aldooseista D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-; D-glukoosi, 2-deoksi-2-ftalimidoglukoosi, 2-asetamido- 2-deoksi-D-galaktoosi, 2-atsido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-atsido-2-deoksi-D-galaktoosi, D-glukuronihappo, D-galak-; 25 turonihappo, 2-deoksi-2-ftalimidoglukoosi ja 2-deoksi-2- ftalimidogalaktoosi. Erityisesti aldoosi on galaktoosi ja n on edullisesti kokonaisluku 1-4. Toisessa edullisessa ilmenemismuodossa keksinnön mukaisen O-glykosidin sokeri-osa sisältää sekä galaktoosia että 2-asetamido-2-deoksi-30 D-glukoosia tai 2-asetamido-2-deoksi-D-galaktoosia, jossa tapauksessa n on edullisesti kokonaisluku 2-5.

Esimerkkejä neoglykolipideistä, jotka soveltuvat käytettäviksi hydrofobisina päällysmateriaaleina ovat: 7 78707 D-Galpl^4-D-GlcNAc/?OCH2CH2S- (ΟΗ2> ^CI^, L-Fuco61-2-D-Gal^OCH2CH2S- (CH2) ^Cl^, D-Galoll-^ 4-D-Gal4-D-G1c/*OCH2CH2S“ (CHj) D-GaloU-—^ 4-D-Gal/Sl-^4-D-GlcNAc^OCH2CH2S- (CH2) jCH^ 5 D-GlctCi^si6-D-Glcal-^4-D-Glcal-4-D-Glc^OCH2CH2S-(CH2) .^3, ja D-Gal.il-*>4GlcNac/30CH2CH2S- (CH2> ^3, joissa 1 on korkeintaan 24, esimerkiksi 7 tai 17.

R^: n tarkoittaessa kantajaa kyseisillä glykokonjugaa-10 teillä voi olla kaava D-Gal«ll-4-D-Gal/30CH2CH2-S-CH2CH2C0NH-R" ' , jossa R'" on proteiinin, polysakkaridin, muoviaineen tai epäorgaanisen aineen tähde. Soveltuvia R"1:n muodostavista aineista voidaan mainita naudan seerumialbumiini (BSA), 15 Fissurella-suvun kotilon hemosyaniini (KLH = key hole limpet haemocyanine), aminoidut sefaroosit, silikagee-lit, jne.

Erityisen edullisia glykokonjugaatteja ovat: D-Gal/U-*4-D-GlcNAc/50CH2CH2SCH2CH2C0NH-R" ' , 20 L-Fuco61-2-D-GalpOCH2CH2SCH2CH2CONH-R" 1 , D-GalcU^* 4-D-Gal/3l^4-D-Glc/?OCH2CH2-S-CH2CH2CONHR" ', D-GalaU-^-D-Gal/*!^» 4-D-GlcNAc/30CH2CH2-S-CH2CH2C0N-R" 1 , D—GlccU--*· 6-D-Glcal-^4-D-Glcal-4-D-Glc^OCH2CH2-S-CH2CH2-CONH-R"' 25 ja D-Gal/3l·^ 4G1cNAc/50CH2CH2-S-CH2CH2C0NH-R" ' , jossa R"' on proteiinin, polysakkaridin, muoviaineen tai epäorgaanisen aineen tähde.

Edellä mainitut glykokonjugaatit valmistetaan so-30 pivasti antamalla glykosidin, jolla on yleiskaava (sokeri)n~0-(CH2)2-S-R-R', 35 jossa R' tarkoittaa samaa kuin edellä paitsi kantajaa, 8 78707 reagoida soveltuvan kantaja-aineen kanssa, joka on jokin edellä mainituista.

Edellä mainittuja bi-dentaatti-O-glykosideja voidaan valmistaa antamalla glykosidin, jolla on yleiskaava 5 (sokeri) -O-(CH-)--Hai n ί λ reagoida ditiolin kanssa, jolla on yleiskaava 10 HS-(CH-) -SH, i m jossa m on kokonaisluku 2-20.

Sokeriyksikköjen lukumäärää esitetyissä O-glykosi-deissa voidaan lisätä muuttamalla glykosidit korkeammiksi 15 glykosideiksi. Tämä saadaan aikaan antamalla aktivoidun sokerin reagoida glykosidin kanssa, jolla on kaava (sokeri)n_x-0-(CH2)m-Hal, 20 jossa x on kokonaisluku l-(n-l), ja ottamalla talteen syntynyt korkeampi glykosidi. Tätä menetelmää voidaan edullisesti käyttää 2-bromietyyliglykosidien, joilla on kaava L-Fuoyi-»2-D-Gal/?OCH2CH2Br, 25 D-Galoars 4-D-Gal/)l-^4-D-Glc/POCH2CH2Br tai D-GalOU-M-D-Gal^l-^* 4-D-GlcNPhtH /3o-CH2CH2Br, valmistamiseksi.

Edellä kuvatuissa menetelmissä on joskus toivottavaa suojata jotkut sokerireagenssien ryhmät ei-toivottu-30 jen sivureaktioiden estämiseksi. Tämä on alalla tavanomaista, ja sellaista reaktiivisten ryhmien suojausta koskevia yskityiskohtia löytyy lähdeviittauksista 41 ja 42.

Mitä tulee tämän keksinnön mukaisesti valmistettaviin glykosideihin, on huomattava, että keksintö koskee 35 o(- ja ^»-konfiguraatiota sekä niiden seoksia.

9 78707 2-bromietyyliqlykosidien valmistus ja karakterisointi

Yhdisteet voidaan valmistaa tavanomaisin glykosi-disynteesimenetielmin (vrt. viite 15) käyttäen lähtöainei-5 na asetyloituja tai bentsyloituja 1-bromisokereita. Yksinkertaisten sokerien (monosakkaridien ja muutamien di-sakkaridien) ollessa kysymyksessä suora glykosidin muodostus per-O-asetyloidusta sokerista 2-bromietanolilla käyttäen booritrifluoridieteraattia metyleenikloridissa 10 osoittautuu olevan erittäin edullinen menetelmä, jossa tavallisesti on mahdollista eristää puhdas 1,2-trans-glykosidi kiteisenä suoraan reaktioseoksesta (ks. esimerkit ja taulukko 1). Tätä BF^-eteraatin käyttöä 2,2,2-trikloorietyyliglykosidien synteesissä (19) on äskeittäin 15 kuvattu. Samaa Lewis-happoa on käytetty anomerointitar-koituksiin (20) sekä erilaisten tioglykosidien valmistamiseksi (21) .

Koska korkeampien oligosakkaridien anomeeristen parien erottaminen on vaikeata, on tässä tapauksessa ta-20 vallisesti tarkoituksenmukaista käyttää stereoselektii-visempiä glykosidisynteesimenetelmiä (15) kuin edellä mainittu BF^-eteraattimenetelmä. On esimerkiksi kyetty syntetisoimaan 1,2-trans-2-bromietyyliglykosideja käyttäen hopeatrifluorimetaanisulfonaattimenetelmää (22) ja 25 1,2-cis-glykosideja Lemieux'n keksimän menetelmän (24), jossa käytetään kvaternaarista ammoniumbromidia, muunnelmalla (23) saannon ja stereoselektiivisyyden ollessa kaikissa tapauksissa hyvä (vrt. taulukko 1). Lisäksi 2-bro-mietyyli(3,4,6-tri-0-asetyyli-2-asetamido-2-deoksi- β-D-30 glukopyranosidi) (8) valmistettiin oksatsoliinimenetel-mällä (25) (taulukko 1). Liitteenä oleva kuva 2 esittää yhteenvetoa eri menetelmistä.

10 78707

Taulukko 1. Tuotetiedot ja saannot 2-brordetyyliglykosldlen valmistuksessa

Tuote Mene-_ Saapto Sp (°C) /¾^4 (°) tel^äf _____ 1 . ^ A 46 114-116 -5,2 (c 1,4,

AcO^^^O^Br CDCty ”fc — D ibc <2α> siirappi +30,5 (c 1,4,

O^Br c CHC1J

3CT 12<*+2±) J

04 c 4c0——.q “ 4cO'A-^^-^O^/N0r a 42 119-120 -10^9 jc lf2' .OAc 0° f 4cO~L^M a 58 118-119 +44,7 (c 0,6, Ö^Br CDC13) ΔεΟ-τ£00Μβ

AcO~t<^0 142-143 -21,4 4cO-i^r^L-o^er (c 0,8, CDCl,) OAc -5 6 A'°^\-°v „ * es 144-145 -47,9 (c 1,7, ~ 4c0-l--^^+—O^/ ör CDCl-,) 04 c 3 ,0^Ör : H3C"7 O'/ Z ^27^--^-04 c A 53c ,7&) siirappi -24,7 (c 2,2, Λ«ΓΛ° ,c 0X3-3) i6 (7a) siirappi -22,4 (c 0,8, 4CO-Ä ^ 1 4coA—7^Λ-0^βΓ c 39 174-175 -6,6 (c, 1,1, NHAc cdci3) >04 c 4c0 T^--o 9 AcO-^~<r^--0*y^Br Λ 50c 111-114 +21,4 (c 1,0, ο=Λ=ο chci3)

O

04c T >04c ^04c 9* Λ 55c 224-225 +9,3 (c 1,0, — 04c 4cO-WA-0^Sf CHClo) 0^=0 3 11 78707

Taulukko 1 jatkoa

Tuote Menetelmä5 Saanto (%) Sp (°C) (°) A 80° siirappi -11,0 (c 0,7, /o “3> °*S° OACqac il AcO^'^^'0'^'Sr E 8C siirappi +127 (c 1,0, n3 CHC13) L&ic0 « a 55 “““ u'9^;,'3' „ AC OAc f .04c A 6?C amorfinen +5,8 (c 2,4, ^d-0 cdci3) OAc QAc T \OAc

AcoS^£\ 11 °Ac O _ B 77c 174-177 -75,2 (c 2,0, L0^3.3) Λ<;0^^ν^'0ν/Λ'βΓ a Ks. esimerkkejä. Eristetty antamalla reaktiosedksen kiteytyä itsestään ci *

Eristetty krcmatografisesti käyttäen adsorbenttina silikageeliä.

i2 78707 2-bromietyyliglykosidien fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet sekä niiden yksinkertainen valmistus tekevät nämä yhdisteet houkutteleviksi välituotteiksi neo-glykokonjugaattien valmistukseen. Monosakkaridiglyko-5 sidit kiteytyvät erittäin hyvin, mikä tekee anomeerisesti puhtaiden yhdisteiden valmistamisen yksinkertaiseksi; näiden glykosidien kemiallista reaktiivisuutta käsitellään jäljempänä tässä selostuksessa.

13

Eri 2-bromietyyliglykosidien C-NMR-spektreissä 10 esiintyy vain lievää vaihtelua bromietyyliryhmän hiili- signaalien kemiallisessa siirtymässä (vrt. taulukko 2). ^H-NMR-spektrit (taulukko 3) ovat toisaalta joskus vaikeasti tulkittavissa, koska bromietyyliryhmän monimutkainen spin-asetelma voi peittää joitakin sokerin rengaspro-15 tonisignaaleja. Liitteenä oleva kuva 3 esittää tyypil listä spektriä (bromietyyliryhmäosaa) yhdessä tietokonesimuloinnin kanssa. Tässä erikoistapauksessa sokerin ren-gasprotonit eivät aiheuttaneet häiriöitä.

13 13 78707

Taulukko 2. C-NMR:n kemialliset siirtymät per-O-asetyloi- _duille 2-branietvYliqlykosideille. Numerointi 3 o ¥γ-Λ£:*.ο

Kemiallinen siirtymäa V—

Nr C1 c2 c3 c4 CS C6 C7C C8c Cl1 C2' C3’ C4' C5' C6' CH3_CO am tyyli) 5 1 102.0 71.3b 71.2 70.2 67.4 61.7 69.0 30.4 21,321,1 170,8 170,7 21.1 21,0 170,6 170,0 3 101.5 73J. 2^4 71^5 70^2 62.3 68.8 30.3 21,1 21 ,2 171,1 170,7 21.0 21,0 169,8 169,8 4 98.2 69.9 69.5 69.4 66.5 62.969.030.1 21,3 21,2 171,1 170,5 21.2 21,1 170,3 170,2 5 101.4 73.1 72.4 71.5 70.4 167.6 69.9 30.3 21,2 21,1 170,6169,9 21.0 53,5 169,8 1Λ 6 100.7 71.0 70,4 68.7 62,0 69.230.0 20,8 20,8 170,0 169,8 *-U 20,8 169,5 7a 96.4 711 68.1 67,9 64,8 15.9 68.4 30.2 20,9 20,7 170,6 170,6 20,7 170,0 78 101.3 71.2 70.1 69.3 68.7 16.1 69.530.1 20,7 20,7 170,6 170,2 20.6 169,6 8 100.7 54.5 72.2 71.7 69.0 62.2 69.5 30.4 23,3 20,7 170,9 170,7 20.7 20,6 170,6 169,4 9 98.354.4 72.0 70.6 68.9 61.969.829.8 20,8 20,6 170,7170,1 15 20,5 169,4 9b 98.0 54.7 72.7 75.4 66.5 62.0 69.7 29.8 101.0 71.0 70.9 70.6 69.0 60.6 20,8 20,6 170,4 170,3 20.5 20,5 170,1 170,0 169,7 169,0 10 98.7 51.2 71.0 66.7 67.9 61.4 69.8 29.9 20,7 20.7 170.4 170.3 ~ --- 20,5 169 Je jl 98.4 57.3 67.2 67.6 68.1 61.768.9 29.5 20,71 20,67 170,4 170,0 20,63 169,8 20 il 101.1 72.8 71.4 76.2 70.7 61.9 69.8 29.8 100.8 72.6 71.0 69.1 66.6 60.8 20.8 20*8 170,4 170,4

20.8 20j8 170,3 170 I

20.6 20,6 170,0 169 7 20.6 169,0 ---- 11 101.9 73.1 70,1 74.2 68.7 63.3 69.0 30.2 100,9 72.0 70.1 68.5 66.9 61.3 20,9 20,8 170,6170,4 20.8 20,8 170,2 170,2 20.6 20,6 170,2 169<5 20.6 169,4 14 101.3 72.5 68.5 76.9 67.8 60.569.530.0 99.372.068.467.367.161.9 20,9 20,7 170,6170,5 20.7 20,7 170,4 170,4 20.6 20,6 170,1 169.8 20.6 169 <2 a) ppm, CDCL·, sisäinen TMS. b) alleviivatut arvot voivat vaihtaa paikkaa.

27 c) identtifioitu INEPT-tekniikalla .

i4 78707

Taulukko 3. Hi-NMRjn kemialliset siirtymät3 ja ]<oplausvakiot __ c - per-O-asetvloiduille 2-branietyyliqlykqpyrano sideille,

N:Oh* H2 H3 H4 H5ax H5eq H6 H6' O-CHj-CH, CHj-CHjBr CH^-CO

5 — \ 4,55a 5,24 5,03 5,41 3,75-3,87 4,10---4,25 3,87-4,20 3,43-3,53 2,16 2,09 (J1 2 7.8) (Jj 2 10.5) (J^ ^ 3,5) (J^ j 1,0) (m ) (---m---) (---m---) (-—m—-) 2,06 1,99 3 4,58 5,03 5,23 5.09 3.66-3,78 4,10---4,34 3,78-4,20 3,42-3,51 2,10 2,08 (J,^2 7,8) (J2 2 9.5) (Jj 4 9,5) (J^ ^ 9,5) ( m ) (---01—) (---m-—) (---ro—) 2,03 2,02 10 * 4,88 5,20-------------------5,40 4,09-4.19 4,10---4,34 3,83-4,50 3,53 2,16 2,11 (J, 2 V* (-----------------------------) (-- n --) (---ro---) (— m —) (t, J 5,8) 2,06 2,00 5 4,63 5,04 5,29 5,22 4,06 3,77(C00CH3) 3,75-4,27 3.43-3,50 2,06 2,02 (J) 2 7,6) (J2 3 9,5) (J3 4 9,5 (J^ 5 9,4) (— n —) (— n —) 2,02 6 4,56 5,03-4,90 5.17 5.03-4.90 4,15 3,39 3,75-4,15 3,47 2,08 2,06 15 (J1,26>7) (J2,38v3> (J3.4 8·3) (J4,5«*510:J4.5eq8'5=J5.*,5eq,2*0) <" « “> U.J 6,0)2,05 7a 5,14 5,05-------------------5.43 4.26 1,12 3,81 3,84 3.50 2,17 2,10 <J , 0) (-------------m------------) (J 6.4) <J -12,0) (t, J 5.8) 2.00 5’6 “ c.f. Fig 3 ' 78 4,49 5,17-5,26 5.02 5.17-5.26 3.73-3.88 1,20 3,73-4,32 3,43-3,50 2,17 2,07 (J, j 7,9) (J2>3 10,5) (J3 4 3.5) (— m —) (J5 6 6.4) t.98 S 4,77 3,78-3,93 5.32 5.07 3,66-3.78 4.08---4.31 3.78-4.19 3.48 2,08 2,02 Γ U) 2 8f°) U2,3 ,0i0) (J3,4 ,0-0><J4 5 10·°) (“ “ “) (---»---) m --) (t, J 6,0) 2,01 1,96 ' 9 5,43 4,35 5.82 5.19 3.80----------4.40 3,70-4,20 3.30-3,40 2,13 2,04 <j|>2 8,4) U2 3 10.7) (J3 4 9.6) (Ji i 9.6) (---------m---------) (---n---) (---ro---) 1.88 25 — 5,37 At57 5-83 5‘50 V°----------------4.25 3 f 76 3,34 2,21 2,02 * (J, 28,8) (32 j 11,5) O3 ^ 3.4) (----------m--—-------—) ( m ) ( a ) 1,87 IL 5,07 3.68 5.39 5.48 4,37 4,12 4,09 3,88-4,.05 3,55 2,15 2,06 <jj>2 3,7) <J2>3 11,2) (J3 4 3.4) (J4J <1) (J5 6 -6) (---n---) (---ro---) (t, J 6.0) 2,06 15 78707 N: o Hl 1,2 H3 m' H2' H3' H4’ CH2Br CHjCo .12 4,54 5,21 4,92 4,49 5(12 4.96 5.35 3.44 2,15 2,J3 (J1>2 8.0) (J2 3 9.5) (J3 A 8,0)(J1I(2, 8.0) 10.5) Oj,,,. 3,5) Oa.>5, I.OHt, J 6.0) 2»“ *j°2 _13 4,49 5,10 4,89 4.42 5.25 5.01 5.36 3.47 2.17 2.15 ’ 2 11 2 08 ^ 0,^2 (J2,3 (Jj 4 3,0)(J,t 2> 7.9) (Jj, 3, 10.5) 3,5) O^.j, 1.0) (t, J 6.0) 2|q^ j*04 1 *99 14 4,54 5,22 4,83 5.01 5.39 5.21 5.57 3.49 2,15 2,12 * ’ ' 2 11 2 09 (J,2 8,0) (J2>3 11.0) (J34 3,0)(J1t(2, 3.0) (J2.j3, 11.0) (J3.4, 3.0) O^.j, 1.0)(e. J 5.0) *06 2|0„ 9b 5,42 5,77 4.55 5.13 4,97 5.34 10 (J1,2 8i5 03>Α 7,9)0,.>2, 7.9) 02.>3, 7.7) 03,4, 3,3) (J4.>5, <1.0) a) ppn, CDCly sisäinen TMS. b) todettu väli. c) numerointi d) monimutkainen asetelma, "multipletti", taulukossa 2 16 78 707 Täydellisten välihaaraglykosidien valmistus 2-bromietyyliglykosideista voidaan muodostaa hyvin monenlaisia yhdisteitä, jotka soveltuvat liitettäviksi proteiineihin ja muihin makromolekyylisiin yksikköihin.

5 Kirjallisuuden (16) perusteella on kuitenkin ilmeistä, että kahdella eri funktionaalisella ryhmällä voidaan hallita käytännöllisesti katsoen kaikki tapaukset, joissa glykosidi liitetään kovalenttisesti kantajamolekyyliin. Niinpä me päätimme käyttää terminaalisen amino- (para-10 substituoidun aniliinin muodossa) ja karboksyyliryhmän sisältäviä johdannaisia liittämiseen (amidisidoksella) kantajan karboksyyli- ja aminoryhmiin, vastaavasti. Lisäksi tiedetään esiintyvän ei-kovalenttista sitoutumista (ns. hydrofobista sitoutumista) esimerkiksi pitkien ali-15 faattisten ketjujen ja lipideistä muodostuneiden solu- membraanien välillä. Tämän tyyppiset välihaarat tekevät mahdolliseksi päällystää biologisia membraaneja määrätyillä oligosakkarideilla.

Taulukossa 4 esitetään välihaaraglykosidimalleja 20 (ks. valmistusta esimerkeistä). Siinä esitetyt tiolit ovat kaikki kaupallisesti saatavia yhdisteitä. Alifaattisia tioliestereitä, joissa ketjun pituus on toinen, voidaan valmistaa tavanomaisin synteesimenetelmin (28) käyttäen <*>-hydroksiestereitä (saatavissa helposti alisyklisistä 25 ketoneista Baeyer-Villiger-reaktiolla ja sitä seuraaval- la alkoholyysillä (29)),mikä tekee mahdolliseksi välihaa-ran pituuden suuren vaihtelun. Rasva-alkyyliketjun pituuden ja haaroittuneisuuden vaihtelu voi johtaa synteettisiin glykolipideihin, jotka kiinnittyvät solumembraanei-30 hin tai muodostavat liposomeja ja muita aggregaatteja monilla eri tavoilla.

Primaariset alkyylibromidit ovat tunnettuja alky-lointiaineita, ja tiolit (erityisesti tiolaatit) ovat hyväksi tunnettuja nukleofiileja. On myös mahdollista 35 toteuttaa reaktio käyttäen suojattuja sokereita, kuten per-O-asetaatteja, sillä se antaa joustavuutta lopulliseen i7 78707 puhdistukseen käytettävien kromatografisten menetelmien valintaa. "Vedettömässä" menetelmässä (G taulukossa 4) deasetylointi ennen reaktiotuotteiden eristämistä ja puhdistamista johtaa hyviin haluttujen tuotteiden saantoi-5 hin.

"Vesimenetelmä" (F taulukossa 4) on selektiivinen ja antaa haluttuja sulfideja korkealla saannolla ilman deasetyloitumista tai muita ei-toivottuja sivureaktioita. Taulukossa 4 esitetään eräitä välihaaraglykosideja, 10 joista suojaus on helposti poistettavissa ja/tai jotka on helppo kemiallisesti aktivoida, joka tekee ne sopiviksi liitettäviksi kantajamolekyyleihin.

18 78707

Taulukko 4. Tuotteiden saannot reaktiossa:

«** '^rtK

Tuote Menetelmäa Saanto (%)^ f^OAc ~ Ac0^^^°'^r'S^COOMe F 73 OAcrt<l (sCo tl Aco\~^?^\--o-~y^s~^y-NH2 f 71

QAc T yOAC

— acoA--^!l~o^s^ΛΛΛ F 70 OAc O Ac l<OAc ΑοθΛ--τΆ (jA c ' 12 td*0 AC°^~^A^^0'^r'S~y^’C00Me OAc ti

AcO

OAc OAc 1/OAc Αΰθ\^/^Λ uAc λ S5 U!?‘

a coA---?^V-o-^*s-VWWW\A

OAc 19 78707

Taulukko 4 jatkoa

Tuote Menetelmä5 Saanto (%)b O Ac fc - 21 ΑοθΛ^<^0^ε-{^-Ν02 G 62

OH

— ^ G 99

HO

23 G 97 3)

Menetelmä F: Faasinsiirtokatalyysi; bentseeni/H20/CS2C03 tai NaOH/(CqH17)3NCH3Br

Menetelmä G:DMF/NaH tai CS2CO.J. Ks. yksityiskohtia esimerkeistä.

y. \

Puhdas yhdiste kromatografisesti eristämällä.

2» 78707 Täydellisten neoglykokonjuqaattien valmistus Tämä keksintö tekee mahdolliseksi valmistaa neoglykokonjugaatteja, joiden hiilihydraattiosa on sekä regio- että stereospesifisesti tarkkaan karakterisoitu.

5 Lisäksi samoja 2-bromietyyliglykosidivälituotteita käyttä mällä on mahdollista valmistaa oligosakkaridiglykosi-deja, jotka soveltuvat hyvin erryrosyytien ja vasta-aineiden, jotka on muodostettu edellä mainittuja neoglykokonjugaatte ja vastaan, välisten agglutinaatioreaktioiden 10 inhibition tutkimiseen. Näiden inhibiittoreiden valmis tusta kuvataan jäljempänä.

Paljon kekseliäisyyttä on käytetty ongelmaan, joka koskee välihaaraglykosidien liittämistä makromolekyylei-hin puolifysiologisissa olosuhteissa (16, 30). Me olem-15 me soveltaneet hyväksi tunnettuja reaktio-olosuhteita kahden malliyhdisteen liittämiseen proteiineihin (ks. kuva 4). Yksinkertainen välihaaragalaktosidi 24 liitettiin naudan seerumialbumiiniin (BSA) Inraanin (31) ja Lemieux'n (30) avustajiensa kanssa kehittämällä menetel-20 mällä kiinnittymisasteen (hapteenimolekyylien lukumää rä BSA-molekyyliä kohden) tutkimiseksi. Tämä tehtiin tunnetulla fenoli/rikkihappo-menetelmällä (32), mutta myös epätavallisemmalla menetelmällä. Tässä työssä käytettävä välihaara sisältää rikkiatomin, joka tekee mahdol-25 liseksi määrittää kovalenttisesti sitoutuneen glykosidin määrän määrittämällä differentiaalisella alkuaineanalyysillä (polttoanalyysillä) proteiiniin lisätyn rikin määrä. Molemmat menetelmät osoittavat, että kuhunkin prote-iinimolekyyliin oli kiinnittynyt 35 galaktoösiyksikköä.

30 Korkein mahdollinen kiinnittymisaste on 57 (pääteamino- ryhmien lukumäärä lysiinitähteissä).

"Aniliini”-välihaaraa käytettiin digalaktosidin 23 liittämiseksi tiofosgeenimenetelmällä (33) proteiineihin BSA ja Fissurella-suvun kotilon hemosyaniini (KLH).

35 Liittymisaste määritettiin antronimenetelmällä (34), joka osoitti 37 ja 435 hapteenimolekyylin kiinnittyneen 21 78707 yhteen proteiinimolekyyliin. Näin tuotettuja neoglyko-proteiineja käytettiin antigeeneinä monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi digalaktoosirakennetta vastaan. Tämän työn yksityiskohdista kerrotaan toisaalla.

5 Neoglykoproteiinien valmistuksen lisäksi tämän keksinnön mukaiset välihaaraglykosidit soveltuvat hyvin liitettäviksi hiukkasiin (esim. lasiin, lateksiin, sili-kageeliin ja ristisidospolysakkarideihin), joita voitaisiin käyttää affiniteettikromatografialla suoritettavaan 10 lektiinin kaltaisten aineiden sekä muiden molekyylien, joilla on hiilihydraattispesifisyyttä, puhdistukseen. Lisäksi pitäisi pienillä sedimentoitumattomilla hiukkasilla kovalenttisesti sitoutuneiden oligosakkaridien kanssa olla käyttöä stabiileina ja tarkkaan määrättyinä 15 erytrosyyttien korvaajina agglutinaatiotutkimuksissa vas ta-aineilla ja bakteereilla.

Yksinkertaisten, agglutinaatioinhibiittoreiksi soveltuvien glykosidien valmistus_

Hiilihydraattispesifisten agglutinaatioreaktioiden 20 arviointi suoritetaan käyttäen tarkoin määrättyjä inhi- biittoreita, jotka kykenevät enemmän tai vähemmän spesifisesti estämään agglutinaatiosaostuman muodostumisen tai jopa sen muodostuttua liuottamaan sen. Tavallisesti käytetyt inhibiittorit ovat joko vapaita mono- tai oligo-25 sakkarideja tai yksinkertaisia (esim. metyyli- ja etyyli-) glykosideja. Viimeksi mainituilla on lisäetuna tarkkaa määritelty anomeerinen konfiguraatio.

Tämän keksinnön mukaiset 2-bromietyyliglykosidit tekevät mahdolliseksi valmistaa etyyliglykosideja (yk-30 sinkertaisella hydrogenolyysireaktiolla) samoista väli tuotteista, joita käytettiin täydellisten välihaara-glykosidien valmistamiseen. Näin vältetään muussa tapauksessa välttämätön koko synteesityömäärän kaksinkertaistuminen. Radioaktiivisesti merkittyjä glykosideja voidaan 35 valmistaa yksinkertaisesti korvaamalla vetykaasu triti umilla.

22 78707 Välihaaran synteesissä käytettyjen funktionalisoi-tujen tiolien korvaaminen ditioleilla tekee mahdolliseksi valmistaa kaksihampaisia inhibiittoriglykosideja, ja tri-, tetra- jne. tiolien pitäisi antaa vastaavin mene-5 telmin kolme-, neljä- jne. hampaisia inhibiittoreita.

Ditiolin ketjun pituuden vaihtelu tekee mahdolliseksi valmistaa sarjan inhibiittoreita,joissa sokeritähteiden välistä etäisyyttä voidaan vaihdella lähes mielin määrin. Hyvin pitkiä yhdistäviä ketjuja sisältävien inhibiitto-10 reiden valmistamiseksi on mahdollista muuttaa 2-bromi- etyyliglykosidin ja ditiolin välistä suhdetta niin, että reaktiossa muodostuu pääasiassa välituotetta, tiolipäät-teistä välihaaraglykosidia (ks. esimerkkejä). Tavanomaista disulfidin muodostusta hapettamalla (35) voidaan 15 sitten käyttää kaksihampaisen inhibiittoriyhdisteen muo dostamiseksi. Eri tyyppisiä inhibiittoriglykosideja, jotka on valmistettu 2-bromietyyliglykosideista, esitetään kuvassa 5.

2-bromietyyliryhmä tavanomaisessa synteettisessä 20 hiilihydraattikemiassa_

Kuten edellä on osoitettu 2-bromietyyliglykosidit ovat hyvin monikäyttöisiä yhdisteitä, joita voidaan käyttää monenlaisten biologisesti kiinnostavien hiilihydraatti johdannaisten valmistukseen. 2-bromietyyliryhmä sovel-25 tuu myös useimpiin hiilihydraattikemiassa käytettäviin synteesireaktioihin. Esimerkin vuoksi me sisällytämme tähän veriryhmä H:n suhteen spesifisen disakkaridin 2-bromi-etyyli-^-glykosidimuodon (39) kokonaissynteesin ja sen edelleen liittämisen BSA:iin (44). Ka-kki nämä reaktiot 30 voidaan toteuttaa ilman ei-toivottua bromietyyliaglyko- nin aiheuttamaa häiriötä. Bentsyyli- ja bentsylideeni-ryhmien hydrogenolyyttinen lohkaisu ansaitsee kuitenkin joitakin lisäselityksiä: valmistettaessa etyyliglykosi-deja (kuva 5) bromiatomi lohkaistiin vedyllä emäksisissä 35 olosuhteissa, kun sen sijaan kuvassa 6 esitetty hydroge- 23 78707 nolyysireaktio tehtiin etikkahapossa; happamat olosuhteet jättävät selvästikin 2-bromietyyliryhmän koskemattomaksi.

2-bromietyyliglykosidin 40 annettiin reagoida metyyli-3-merkaptopropionaatin kanssa (vrt. taulukko 4 5 ja esimerkit), jolloin saatiin välihaaraglykosidi 41.

Tämä yhdiste liitettiin lopuksi (hydratsidin 43 kautta) naudan seerumialbumiiniin, jolloin saatiin valmis puolisynteettinen antigeeni 44.

Keksintöä valaistaan tarkemmin yksittäisillä esi-10 merkeillä, jotka eivät ole luonteeltaan rajoittavia.

Näissä esimerkeissä sulamispisteet määritettiin kalibroidulla Koflerin kuumennuspenkillä tai Reichertin sulamis-pistemikroskoopilla. Optiset kääntökyvyt reskisteröi-tiin Perkin Elmer 241 -polarimetrillä. NMR-spektrit 15 ajettiin Varian XL-200 spektrometrillä. Liuotin poistet tiin pyöröhaihdutinta käyttäen, jota seurasi haihdutus alle 0,1 torrin alipaineessa, joka saatiin aikaan öljy-pumpulla.

Esimerkit 1-14 20 2-bromietyyliglykosidien valmistus (vrt. kuva 2 ja taulukko 1)_

Reaktioita seurattiin ohutkerroskromatografiän (TLC) avulla käyttäen sokerien per-O-asetaattien ja glyko-sidien selektiiviseen visualisointiin soveltuvaa tekniik-25 kaa (19). 2-bromietyyliglykosidien (1-14) saannot, sula mispisteet ja optiset kääntökyvyt esitetään taulukossa 1 13 1 ja C- ja H-NMR-spektrit taulukoissa 2 ja 3, tässä järjestyksessä .

Menetelmä A (vrt. viite 19) 30 Sokeri-per-O-asetaatti (5 mmol) ja 2-bromietano- li (6 mmol) liuotettiin vedettömään metyleenikloridiin (10 ml) ja jäähdytettiin (jäähaude). Lisättiin vähitellen (n. 15 min) booritrifluoridieteraattia (25 mmol). Jäähaude poistettiin 1 h:n kuluttua, ja reaktiota jatket-35 tiin huoneen lämpötilassa, kunnes lähtöaine oli kulunut 24 78707 loppuun (TLC; 2-20 h).

Glykosideja, joilla on 1,2-trans-konfiguraatio, muodostuu ensin. Reaktiojakson lopussa muodostuu tavallisesti pieni määrä 1,2-cis-glykosidia, luultavasti ano-5 merisaatioreaktiolla (20). Lisäksi pitkä reaktioaika johtaa tavallisesti deastyloituneiden yhdisteiden muodostumiseen vähäisinä määrinä. Näiden sivutuotteiden muodostuminen voidaan minimoida seuraamalla reaktiota tarkasti.

10 Reaktioseos kaadettiin jääveteen (10 ml), ja kerrokset erotettiin. Vesikerros uutettiin metyleeniklo-ridilla (5 ml), ja yhdistetyt metyleenikloridiliuokset pestiin (vesi, natriumbikarbonaatti1iuos, vesi) ja kuivattiin (natriumsulfaatti). Suodatus ja haihdutus antoi-15 vat tulokseksi siirapin, joka liuotettiin lämpimään eetteriin tai etyyliasetaattiin. Lisättäessä petroli-eetteriä tai iso-oktaania saatiin kiteinen (mikäli mahdollista; ks. taulukko 1) per-0-asetyloitu 2-bromietyy-liglykosidi. Saanto taulukossa 1. Emäliuoksen prepara-20 tiivinen kromatografia nosti saantoa huomattavasti.

Menetelmä B

2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-ei.-D-galaktopyranosyyli) -Jb -D- galaktopyranosidi) (14)__ 25 Liuos, jossa oli bromivetyä etikkahapossa (45 %, 30 ml), lisättiin pisaroittain (n. 25 min) 0°C:ssa liuokseen, jossa oli l,2,3,6-tetra-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-^-D-galaktopyranosyyli) -oirD-galaktopy-ranoosia (20,0 g, 29,5 mmol) etikkahappo-etikkahappo-30 anhydridi-seoksessa (2:1; 20 ml). Reaktioseos pidet tiin 0°C:ssa 4 h ja sen jälkeen huoneen lämpötilassa 1,5 h ja laimennettiin lopuksi metyleenikloridilla (400 ml) ja kaadettiin jääkylmään kyllästettyyn natriumbikarbo-naattiliuokseen (400 m3.) . Vesikerros uutettiin metyleeni-35 kloridilla (50 ml), ja yhdistetyt uuttoliuokset pestiin 25 78707 toisella erällä bikarbonaattiliuosta (300 ml) ja kuivattiin (natriumsulfaatti). Suodatus ja haihdutus antoivat tulokseksi 1-bromi-2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tet-ra-0-asetyy 1 i-«^rD-galaktopyranosyy 1 i) -eA-D-galaktopyranoo-5 siä (20,8 g; TLC:n perusteella puhdasta) kiteisenä mas sana. Uudelleenkiteyttämällä etyyliasetaattieetteri-seok-sesta saatiin analyysinäyte; sp. 97-99°; ~ +219° (c = 0,8; CHCl3);

1H-NMR (CDC13; TMS) ^6,73 (d, 1H, ^ 2=4 Hz; Hl), 5,55 10 (dd, 1H, J=1,5 Hz, J=3 Hz, H4 ') , 5,36 (dd, 1H, J2 , 3,=H

Hz, J3, 4,=3 Hz; H3'), 5,29 (dd, 1H, J2 3=11 Hz, J3 4=2,5 Hz; H3), 5,25 (dd, 1H, J1, 2,=3,5 Hz* 32' 3'= 11 Hz; H2') 5,10 (dd, 1H, J1 2=4 Hz,J2 3 = 11 Hz, H2), 5,01 (d, 1H, Jlf 2,=3,5 Hz; Hl'), 4,49*(dt, 1H, J4, 5,=1,5 15 Hz, JCI ,,=7 Hz, H5'), 4,40-4,05 (6H), 2,15, 2,13, 2,12,

j f O

2,12, 2,09, 2,03, 2,00 (s, 3H kukin, CH3C0) pp.

13C-NMR (CDC13, TMS)£ 170,4, 170,3, 170,2, 170,1, 169,9, 169,7 (CO), 99,1 (Cl'), 88,7 (Cl), 76,3, 72,7, 69,9, 68,0, 67,7, 67,6, 67,3, 67,2 (CHOAc), 61,5, 60,7 (C6, 20 C6'), 20,9, 20,7, 20,6 (C3-C0) ppm.

Vedettömään metyleenikloridiin (100 ml) liuotettu epäpuhdas asetyylibromisokeri (20,5 g, 29,3 mmol) lisättiin pisaroittain (n. 20 min) typpeä suojakaasuna käyttäen kylmään (-78°) liuokseen, jossa oli hopeatrifluo-25 rimetaanisulfonaattia (puhdistamaton teknillinen aine; 10,3 g, 40 mmol), 2,4,6-trimetyylipyridiiniä (3,6 g, 30 mmol) ja 2-bromietanolia (17,5 g, 140 mmol) metylee-nikloridissa (250 ml). Reaktioseosta sekoitettiin pimeässä 23 h, jona aikana se lämpeni huoneen lämpötilaan.

30 Muodostunut kellertävänvalkoinen saostuma erotettiin, ja tuloksena ollut väritön liuos pestiin peräkkäin IM suolahapolla, vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaatti-liuoksella ja vedellä. Kuivaus (natriumsulfaatti), suodatus ja haihdutus antoivat tulokseksi jäännöksen, joka 35 kiteytyi itsestään. Uudelleenkiteyttämällä etyyliasetaa- 26 78707 tista, haihduttamalla sen jälkeen emäliuos ja uudelleen- kiteyttämällä metanolista saatiin yhteensä 16,6 g (77 %) otsikon mukaista yhdistettä 14. Sulamispiste ja optinen 13 1 kääntökyky esitetään taulukossa 1 ja C- ja H-NMR-5 spektritiedot taulukoissa 2 ja 3, tässä järjestyksessä.

Menetelmä C

2-bromietyyli(3,4,6-tri-0-asetyyli-2-asetamido-2- deoksi-y^ -D-glukopyranosidi (8)____

Per-O-asetyloitu glukoosioksatsoliini (37) 10 (ks. kuva 2; 4,62 g, 14,0 mmol), 2-bromietanoli (8,49 g, 67,9 mmol) ja p-tolueenisulfonihappo (81 mg) liuotettiin tolueenin ja nitrometaanin seokseen (1:1; 80 ml). Liuosta kuumennettiin (110°) noin 10 min, ja sitten se jäähdytettiin. TLC-analyysi (Si02* tolueeni-eetteri-metanoli-15 seos 7:7:1) osoitti, että kaikki oksatsoliinilähtöaine oli kulunut. Lisättiin pyridiiniä (20 pisaraa), ja reak-tioseos haihdutettiin kuiviin. Jäännöksen preparatiivinen kromatografia antoi tulokseksi otsikon mukaisen yhdisteen (8). Saanto, sulamispiste ja optinen kääntökyky esi-

13 1H

20 tetään taulukossa 1 ja C- ja -NMR-spektritiedot taulukoissa 2 ja 3, tässä järjestyksessä.

Menetelmä D

2-bromietyyli (2,3,4,6-tetra-0-bentsyyli-«£-D- galaktopyranosldi) (2)_ 25 Trimetyylisilyylibromidia (7,96 g, 6,78 ml, 52 mmol) lisättiin ruiskulla typpeä suojakaasuna käyttäen ja valolta suojassa seokseen, jossa oli 2,3,4,6-tetra-0-bentsyy-li-D-galaktopyranoosia (28 g, 52 mmol), 2-bromietano-lia (4,46 ml, 40,0 mmol), koboltti(II)-bromidia (11,4 g, 30 52 mmol), tetraetyyliammoniumbroraidia (10,9 g, 52 mmol) ja molekyyliseuloja (4 A, 41 g) 138 mlissa metyleeniklo-ridia. (Koboltti(II)bromidia oli kuivattu 180°:ssa 5x10 ^ mmHg:n paineessa yön yli.) Reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa, ja sitten se suodatettiin.

35 Suodos pestiin 100 ml:11a metyleenikloridia. Suodos haih- 27 78707 dutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 25,8 g epäpuhdasta tuotetta, joka käsiteltiin kromatografisesti (Si02, iso-oktaanin ja etyyliasetaatin seos 3:2). Jae 1 sisälsi puhdasta otsikon mukaista yhdistettä (6,0 g), ja 5 jae 2 oli anomeerien seos , 10,0 g). Glykosidien

saanto yhteensä 16 g (48 %). (Tämä menetelmä on lievästi muunnettu menetelmästä, jonka ovat esittäneet koto et ai (23). = +30,5° (c = 1,4, CHCl-j) . 1H-NMR

(CDC13, TMS):£7,30 (m, 20H, Ph), 4,97-4,42 (m, 9H), 10 4,0-3,8 (m, 6H) , 3,52 (t, 4H, muun muassa CH2Br) .

13C-NMR (CDC13, TMS): 103,3 (d, Cl, JC_H=168 Hz), 84.2, 81,6, 80,2, 75,0 (C2-C5), 80,0, 78,7, 78,6, 78,5, 74.2, 73,5 (C6, bentsyyli-CH2 ja aglykonin 0-CH2), 35,5 (CH2Br).

15 Menetelmä E

2-bromietyyli(3,4,6-tri-0-asetyyli-2-atsido-2- deoksi-^-D-galaktopyranosidi) (11)_

Bentseenin (30 ml) ja nitrometaanin (30 ml) seoksesta tislattiin pois 30 ml liuotinseosta. Jäljelle jää-20 neen liuotinseoksen lämpötila säädettiin 60°:ksi, jonka jälkeen lisättiin 2-bromietanolia (0,355 ml, 5,00 mmol) ja sen jälkeen elohopea(II)syanidia (1,26 g, 5,00 mmol) ja l-kloori-3,4,6-tri-0-asetyyli-2-atsido-2-deoksi-y^ - 38 D-galaktopyranoosia (1,74 g, 4,98 mmol) muutamaan mil-25 lilitraan bentseeniä liuotettuna. Reaktioseosta sekoitet tiin 60°:ssa 3 vrk, sen jälkeen lisättiin 100 ml mety-leenikloridia ja ortaaninen liuos pestiin vedellä (3 x 25 ml). Sen jälkeen kun liuos oli kuivattu (Na2S0^) ja liuotin poistettu alipaineessa, jäännös (1,90 g) kä-30 siteltiin kromatografisesti (Si02, iso-oktaanin ja etyy liasetaatin seos 2:1), jolloin saatiin l-kloori-3,4,6-tri-0-asetyyli-2-atsido-2-deoksi-o£-D-galaktopyranoosia (350 mg) ja toinen jae (340 mg), joka sisälsi molempia yhdisteen 11 anomeereja. Tämä jae käsiteltiin kromatogra-35 gisesti (Si02, 1,1,2-triklooritrifluorietaanin ja eetterin 28 78707 seos 55:15), jolloin saatiin puhdasta otsikon mukaista yhdistettä 11 (165 mg, 8 %) siirappina. Optinen kääntö- 13 1 kyky esitetään taulukossa 1 ja C- 3a H-NMR-spektri-tiedot taulukoissa 2 ja 3, tässä järjestyksessä.

5 Esimerkkit 15-23 Täydellisten välihaaraglykosidien valmistus (vrt. taulukko 4)_

Yhdisteet 15, 16, 17, 18 ja 19 valmistettiin menetelmällä F ja yhdisteet 20, 21, 22 ja 23 menetel-10 mällä G; ks. jäljempänä.

Menetelmä F

2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-?^ -D-galaktopyranosidi) (15) 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-^ -D-15 galaktopyranosidi (1) (1,76 g, 3,90 mmol), metyyli-3- merkaptopropionaatti (1,0 ml, 9,2 mmol), metyylitriok-tyyliammoniumkloridi (n. 10 mg) ja natriumhydroksidi (0,36 g, 9,0 mmol) liuotettiin bentseeniin (5 ml) ja veteen (5 ml). Reaktioseosta sekoitettiin voimakkaasti 20 huoneen lämpötilassa. Reaktio oli puolivälissä noin 40 mi nuutin kuluttua (TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1), mutta tämän jälkeen se hidastui huomattavasti. Reaktiota jatkettiin yön yli, jonka tuloksena lähtöaine kului lähes kokonaan. Tulisi panna merkille, 25 että deasyloitumista ei esiintynyt näissä reaktio-olosuh teissa. Vesikerros uutettiin bentseenillä, ja yhdistetyt bentseeniliuokset pestiin kerran vedellä. Kuivaamalla, haihduttamalla ja käsittelemällä kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:1) saatiin otsikon 30 mukaista yhdistettä 15 siirappina, joka kiteytyi hitaas ti. Saanto 1,41 g (73 %). Uudelleenkiteyttämällä absoluuttisesta etanolista saatiin analyysinäyte: sp. 81-82°; = -10,5° (c = 1,0, CDC13); 1H-NMR (CDCI-j, TMS)£ 5,42 (d, 1H, J3 4=3,5 Hz, H4), 5,24 (dd, 1H, 35 2=7,8 Hz, J2 3=10,5 Hz, H2), 5,05 (dd, 1H, H3), 4,54 (d, 1H, Hl), 3,65-4,26 (m, 5H, H5, 0-CH2-CH2), 3,72 29 78707 (s, 3H, CH3), 2,59-2,88 (m, 6H, S-CH2, CH2-C0), 2,17, 2.09, 2,06, 2,00 (s, 3H kukin, CH^CO) ppm.

13C-NMR (CDC13, TMS172,2, 170,4, 170,2, 170,1, 169,5 (CO), 101,3 (Cl), 70,9, 70,8, 69,6, 68,7, 67,0 (C2-C5, 5 0-CH2), 61,3 (C6), 51,8 (0CH3), 34,7, 31,5, 27,4 (CH2-S, CH2C0), 20,8, 20,7, 20,6 (CH3CO) ppm.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli(2,3,6-tri- O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-Jt-D- galaktopyranosyyli)-/^-D-galaktopyranosidi) (18)_ 10 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6- tetra-0-asetyyli-*(-D-galaktopyranosyyli) -/0 -D-galaktopy-ranosidi) (14) (251 mg, 0,338 mmol), metyyli-3-merkapto-propionaatti (38 ^ug, 0,35 mmol), metyylitrioktyyliammo-niumkloridi (noin 10 mg) ja cesiumkarbonaatti (114 mg, 15 0,35 mmol) liuotettiin bentseeniin (0,5 ml) ja veteen (0,5 ml). Reaktioseosta sekoitettiin (magneetti) yön yli, ja se analysoitiin TLC:llä (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 4:1, reaktiosta tapahtunut 2/3). Lisättiin metyyli-3-merkaptopropionaattia (n. 20 ^ul), ja reaktio-20 seosta sekoitettiin 24 h (TLC:n mukaan reaktio oli lopus sa) . Kerrokset erotettiin, vesikerros uutettiin kahdesti metyleenikloridilla, ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (natriumsulfaatti), jolloin saatiin vihreän-keltainen liuos. Haihdutus antoi tulokseksi siirapin, 25 joka käsiteltiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä (18) siirappina. Saanto 11 mg (80 %).

= +70,0° (c = 0,6, CHC13); 1H-NMR (CDCl3, TMS) ^ 7,25, 6,63(ABg, 4H, JAB=8,6 Hz, aromaattinen H), 5,39 30 (d, 1H, J3 4=3,5 Hz, H4), 5,22 (dd, 1H, J1 2=7,9 Hz, J2 3=10,4 Hz, H2), 5,01(dd, 1H, H3), 4,45(d, 1H, Hl), 2,92(t, 1H, J=6,8 Hz, S-CH2), 2,15, 2,08, 2,05, 2,00 (s, 3H kukin, CH3C0)ppm.

13C-NMR(CDC13, TMS)£ 170,4, 170,3, 170,2, 169,5(C0), 35 146,4, 134,5, 122,0, 115,6(atomaattinen C), 101,5(d), 70.9, 70,6, 68,8, 67,7, 67,0(C2-C5, 0-CH2), 61,2(C6), 30 7 8 7 0 7 35,7(S-CH2), 20,9, 20,7, 20,0 (CH,-CO)ppm.

2-(p-nitrofenyylitio)etyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-^-D-galaktopyranosidia (21) (90 mg, 0,18 mmol) hydrogenoitiin yön yli (4 atm H2, Pd/C 10 %, 90 mg) 5 75 ml:ssa metanolia, jolloin saatiin samanlaisen kromato grafisen käsittelyn jälkeen kuin edellä otsikon mukaista yhdistettä (16) saannon ollessa 58 %.

2-(oktyylitio)etyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-^- D-galaktopyranosid) (17)_ 10 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3-D- galaktopyranosidi) (1) 82,0 g, 4,4 mmol), oktaanitioli (0,7 g, 4,8 mmol), metyylitrioktyyliammoniumkloridi (20 mg) ja natriumhydroksidi (0,3 g, 7,5 mmol) liuotettiin bent-seeniin (9 ml) ja veteen (8 ml). Reaktioseosta sekoitet-15 tiin voimakkaasti 3 h (TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso- oktaanin seos 3:1), ja reaktiotuote eristettiin samalla tavalla kuin edellä yhdisteen 15 yhteydessä. Kromatografinen käsittely (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1) antoi tulokseksi otsikon mukaisen yhdisteen 20 (17) värittömänä öljynä. Saanto 1,6 g (70 %). ^ = “8,6° (c = 1,2, CHC13); 1H-NMR (CDCl3, TMS)«P 5,40(dd, 1H, J4 5=1,0 Hz, H4), 5,23 (dd, 1H, J2 3=10,5 Hz, H2), 5,03(dd, 1H, J3_4=3,5 Hz, H3), 4,53(d, 1H, 2=8,0 Hz,

Hl), 2,71, 2,53 (t, 2H kukin, J=7,0 Hz, S-CH2), 2,16, 25 2,08, 2,06, 1,99 (s, 3H kukin, CH3C0), 0,88 (t, 3H, J=7,0 Hz, CH3-CH2)ppm.

13C-NMR (CDC13, TMS)«P 170,4, 170,2 170,1, 169,4 (CO), 101,4(Cl), 70,9, 70,7, 68,7, 67,0(C2-C5), 69,8(CH2"0), 61,3 (C6), 32,6, 31,8, 31,4, 29,8, 29,2, 28,8, 22,7 (CH2), 30 20,8, 20,7, 20,6(CH3C0), 14,1(CH3-CH2)ppm.

2-(oktyylitio)etyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli—«έ-D-galaktopyranosyyli)- /^-D-galaktopyranosidi) (19)___

Yhdiste 14 (484 mg, 0,65 mmol), oktaanitioli (110 mg, 35 0,75 mmol, 130 ^ul), metyylitrioktyyliammoniumkloridi 31 78707 (n. 10 mg) ja cesiumkarbonaatti (24 mg, 0,75 mmol) liuotettiin bentseeniin (1 ml) ja veteen (1 ml). Reaktioseos käsiteltiin samalla tavalla kuin yhdisteen 17 yhteydessä. Kromatografinen käsittely antoi tulokseksi otsikon mu-5 kaista yhdistettä (19) (250 mg) ja lähtöaineyhdistettä (14) (160 mg). Saanto (kuluneen yhdisteen 14 perusteella laskettuna) 71 %; = +65,3° (c = 1,4, CHCl-j); CHC13); 1H-NMR(CDC13, TMS)<£ 5,57(dd, 1H, J4, 5,= 1 Hz? H4', 5,39(dd, 1H, J2, 3,*11 Hz, J3, 4<=3,5 Hz; H3 '), 10 5,20 (dd, 1H, , 2,=3,5 Hz? H2 ' ) ' 5,19 (dd, 1H, J2 3 = 11 Hz; J3 2=7,5 Hz; H2), 5,01(d, 1H, ^, 2,=3,5 Hz? Hl'), 4,81 (dd, 1H, J3 4=3 Hz; H3), 4,51(d, 1H, Jx 2 = 7,5 Hz;

Hl), 2,73, 2,53(t, 2H kukin, J=7 Hz; CH2~S), 2,13, 2,11, 2.08, 2,07, 2,04, l,99(s, 3H kukin? CH3~C0) ppm.

15 13C-NMR(CDC13, TMS)^ 170,7, 170,6, 170,5, 170,4, 170,1, 169.8, 169,1(C0), 101,2(Cl), 99,4(C1'), 77,1, 72,7, 71,9, 68,6, 68,6, 67,8, 67,4, 67,1(C2-C5, C2'-C5’), 69,6-(0-CH2-CH2-S), 62,0, 60,5(C6, C6'), 32,6, 31,8, 31,3, 29.8, 29,2, 28,8, 22,7(aglykoni-CH2), 21,0, 20,8, 20 20,7(CH3-C0), 14,l(CH3-CH2)ppm.

Menenetelmä G

2-(oktadekyylitio)etyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-oC-D-galaktopyranosyyli) - /9-P-galaktopyranosidi) (20)__ 25 Yhdiste 14 (743 mg, 1 mmol), oktadekyylitioli (315 mg, 1,1 mmol) ja cesiumkarbonaatti (391 mg, 1,2 mmol) lisättiin vedettömään dimetyyliformamidiin (8 ml) huoneen lämpötilassa typpeä suojakaasuna käyttäen. Reaktiota seurattiin TLCtllä. 24 tunnin kuluttua reaktioseos uutet-30 tiin vedellä ja eetterillä. Eetterikerros kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Jäännös käsiteltiin kromato-grafisesti (etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:1), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä (20) (300 mg) ja lähtöaineyhdistettä (14) (400 mg). Saanto (kulunee- Λ 35 seen yhdisteen 14 määrään perustuen) 69 %; OVo = +54-7 78707 (c = 0/5/ CHCl^); ^H-NMR (CDCl^/ TMS): pääosa spektristä (1/9-5/6 ppm) oli käytännöllisesti katsoen identtinen yhdisteen 19 spektrin kanssa.

13C-NMR(CDC13, TMS)^ 170,6/ 170,5, 170,4, 170,4, 170,1, 5 169,7, 169,1(CO), 101,2(C1), 99,4(01'), 77,1, 72,6, 71,9, 68,5, 68,5, 67,8, 67,3, 67,0 (C2-C5, C2’-C5'), 69,5(0-CH2-CH2-S), 62,0, 60,4(06, 06'), 32,6, 31,9, 31,3, 29,8, 29,6, 29,5, 29,3, 29,2, 28,8, 22,6(aglyko-ni-CH2), 20,9, 20,7, 20,7, 20,6, 20,6 (CH.J-C0), 14,Ι-ΙΟ (CH3-CH2) ppm.

2-(p-nitrofenyylitio)etyyli(2,3,4,6-tetra-0-ase- tyyli-^ -D-galaktopyranosidi) (21)_ p-nitrotiofenoli (50 mg, 0,32 mmol) lisättiin huoneen lämpötilassa samalla sekoittaen suspensioon, 15 jossa oli natriumhydridiä (öljytön; 11 mg, 46 mmol) dimetyylifirmamidissa (3 ml). 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra- 0-asetyyli-/^-D-galaktopyranosidi) (1) (110 mg, 0,24 mmol) dimetyyliformamidissa (3 ml) lisättiin 10 minuutin aikana tiofenoliliuokseen, ja reaktioseosta sekoitettiin 20 vielä 75 min (TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:1). Reaktioseos kaadettiin jääkylmään veteen (20 ml) ja eetteriin (40 ml). Vesikerros uutettiin vielä eetterillä (40 ml), ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin kylmällä vedellä (20 ml) ja kuivattiin (natriumsulfaatti). 25 Haihdutus ja kromatografinen käsittely (Si02» etyyliase taatin ja iso-oktaanin seos 1:1) antoivat tulokseksi otsikon mukaista yhdistettä vaaleankeltaisena öljynä.

Saanto 80 mg (62 %) . = -15,2° (c =1,1, CDC13) ; 1H-NMR (CDC13, TMS)*F 8,14, 7,35(ABq, 4H, JAB=9,2 Hz, 30 aromaattinen H), 5,40 (dd, 1H, J4 5=1,0 Hz, H4), 5,22(dd, : 1H, J2 3=10,5 Hz, H2), 5,01(dd, 1H, J3 4 = 3,4 Hz, H3), *: 4,52 (d, 1H, Jx 2=7,8 Hz, Hl), 3,25(t, J=6,5 Hz, S-CH2), 2,17, 2,05, 2,04, 1,99 (S, 3H kukin, CH3C0) ppm.

13C-NMR (CDC13, TMS)^ 170,4, 170,2, 170,1, 169,4(C0), 35 146,6, 145,3, 126,5, 124,1(aromaattinen C), 101,4(C1), 70,8, 68,5, 66,9(C2-C5), 67,9(CH2-0), 61,2(C6), 31,8-(S-CH2), 20,8, 20,7, 20,6(CH3C0) ppm.

33 78707 2-(p-aminofenyylitio)etyyli(4-0-(ft -D-galaktopyra- nosyyli)-/fr-D-galaktopyranosidi) (22)__ p-aminotiofenoli (205 mg, 1,64 mmol) liuotettiin dimetyyliformamidiin (4 ml). Lisättiin natriumhydridiä 5 (70 mg, 2,9 mmol), ja seosta sekoitettiin huoneen lämpö tilassa typpeä suojakaasuna käyttäen 20 min. Lisättiin 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra- 0-asetyyli-/^ -D-galaktopyranosyyli)-/b -D-galaktopyrano-sidia 14 (640 mg, 0,86 mmol) dimetyyliformamidissa (7 ml), 10 ja reaktioseosta sekoitettiin typpeä suojakaasuna käyt täen 2 h (TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:1), ja sitten se kaadettiin kylmään veteen (40 ml). Vesiliuos uutettiin eetterillä (4 x 20 ml), ja yhdistetyt eetteriliuokset pestiin vedellä (10 ml) ja kuivattiin 15 (natriumsulfaatti). Haihdutettaessa saatiin jäännös, joka sisälsi joukon osaksi deasyloituneita yhdisteitä. Vesi-liuoksen haihdutus antoi tulokseksi lisää osittain de-asyloitunutta ainetta. Yhdistetyt jäännökset deasyloi-tiin (natriummetoksidi/metanoli), ja tuote (haihdutuk-20 sen jälkeen) suodatettiin pylvään läpi (Si02, etyyliase- taattimetanoli-seos 2:3), jolloin saatiin kiteinen jäännös (neulamaisia kiteitä). Saanto 425 mg (99 %). Uudelleenko teyttämällä metanolista saatiin analyysinäyte: sp. 104-106°; fö*3 = -0,8° (c = 1,1, H20);

25 1H-NMR (DMS0-D6 plus D20, 50°C, TMS)«£ 7,13, 6,58 (d, 2H

kukin, J=8,5 Hz, aromaattinen H), 4,28(d, 1H, J=7,0 Hz,

Hl1), 4,28 (d, 1H, J=7,5 Hz, Hl), 2,90(t, 2H, J=7,0 Hz, CH2~S) ppm.

13C-NMR(DMS0-D6 plus D20)^ 149,2, 136,6, 124,7, 119,7 30 (atomaattinen C), 107,0, 105,5 (Cl, Cl'), 79,7, 77,8, 76,9, 75,9, 75,5, 74,2, 73,9, 71,4, 70,7 (C2-C5, C2'-C5\ CH20), 63,8, 63,1 (C6, C6'), 37,6 (CH2-S) ppm.

2-(p-aminofenyylitio)etyyli(4-0-(^-D-galaktopyra- nosyyli) -^-D-galaktopyranosidi) (23)_ 35 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6- tetra-0-asetyyli-J.-D-galaktopyranosyyli) -D-galaktopyra- 34 78707 nosidi (14) (170 mg, 0,23 mmol) käsiteltiin kuten edellä (yhdiste 22). Deasyloitumisreaktion jälkeen saatu raaka-tuote suodatettiin pylvään läpi (Si02, etyyliasetaatti-metanoli-seos 2:3), jolloin saatiin otsikon mukaista 5 yhdistettä (23) amorfisena kiinteänä aineena. Saanto 110 mg (97 %). Kromatografisella käsittelyllä (Si02, kloro-formi-metanoli-vesi-seos 65:35:10; alempi faasi) saatiin analyysinäyte: ~ +70,6° (c = 0,58, f^O) ; *H-NMR (DMS0-D6 plus D2,'0, 50°J^7,13, 6,56(d, 2H kukin, 10 J=8,4 Hz, aromaattinen H), 4,83(d, 1H, J=3,3 Hz, Hl'), 4,14(d, 1H, J=7,6 Hz, Hl), 2,89(t, 2H, J=7,5 Hz, CH2~S) ppm.

13C-NMR(DMS0-D6 plus D20)J 149,1, 136,5, 124,8, 119,7 (aromaattinen C), 105,7(Cl), 102,9(Cl'), 79,8, 77,7, 15 75,1, 73,6, 73,5, 71,9, 71,7, 71,4, 70,8 (C2-C5, C2'-C5', CH20), 63,3, 62,8(C6, C6'), 37,6(CH2Br) ppm.

Esimerkit 24-27 Täydellisten neoglykokonjugaattien valmistus (vrt. kuva 4) 20 Välihaaraglykosidit 24 ja 25, joissa on terminaa linen esteri- ja aminoryhmä, tässä järjestyksessä, liitettiin proteiiniin hyväksi tunnetuin menettelytavoin 30,31,33.

2- (2-metoksikarbonyylietyylitio) etyyli (/jl· -D- 25 galaktopyranosidi (24)_ 2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli (2,3,4,6-tetra-0-asetyyl i-^- D-galaktopyranosidi (15) (1,00 g, 2,32 mmol) liuotettiin 25 ml:aan vedetöntä metanolia ja lisättiin liuokseen, jossa oli natriummetoksidia metano-30 lissa ja joka oli valmistettu natriumista (n. 0,05 g) ja metanolista (10 ml). Sekoittamista jatkettiin 4 h, jonka jälkeen reaktioseos neutraloitiin Duolite-H+:11a (pestiin vedellä ja kuivattiin). Suodatuksen ja liuottimen haihduttamisen jälkeen saatiin kvantitatiivisella 35 saannolla otsikon mukaista yhdistettä (590 mg), joka 35 78707 TLC:n (Si0o, kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10) * 1 ja NMR:n mukaan oli puhdasta. H-NMR (D20, TM£> ulkopuolisena standardina): £ 4,44 (d, 1H, Hi, 2=7»62 Hz), 4,08 (m, 1H, 0CH2-CH2), 3,72 (s, 3H, 0CH3), 3,52 (dd, lH, 5 H2), 2,92-2,70 (m, 6H, CH2S, CH2C0).

^C-NMR (D20, TMS ulkopuolisena standardina): £ 178,2 (CO), 105,8 (C-l), 78,1, 75,6, 73,6, 71,5 (C2-C5), 71,7 (C-6), 63,8 (aglykonin 0-CH2), 55,2 (0CH3), 37,1, 33,7, 29,3 (aglykonin -CH2).

10 2-(2-hydratsiinikarbonyylietyylitio)etyyli (y> -D- galaktopyranosidi) (25)_ 2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli (/>-D-galaktopyranosidi (24) (500 mg) liuotettiin etanoliin (99,5 %, 2,5 ml), ja liuokseen lisättiin hydratsiini-15 hydraattia (85 %; 1 ml). Reaktioseos jätettiin huoneen lämpötilaan yön ajaksi (TLC: Si02, kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10; alempi faasi). Haihdutuksen jälkeen saatiin otsikon mukaista yhdistettä (25) siirappina (TLC:n ja ^H-NMR:n perusteella puhdasta) saannon ollessa 20 kvantitatiivinen. Uudelleenkiteyttämällä etanolista saatiin puhdas yhdiste: sp. 178-179°; = -2,2° (c = 0,5, H20); ^H-NMR (D20 TMS ulkopuolisena standardina)^ 4,43 (d, 1H, Hl, ^ 2 = 7,7 Hz)» 4,07 (m, lH, 0-CH2-CH2), 3,92-3,60 (m, 7H), 3,50 (dd, lH, H2, J2 3=11,6 Hz),

25 2,90, 2,86 (t, 2H kukin, -CH,S, J=7 Hz), 2,54 (t,2H

13 Z

CH2C0). C-NMR (D20, TMS ulkopuolisena standardina),£ 176,1(C=0), 105,6(C-l), 77,9, 75,4, 73,4, 71,6, 71,3 (C-2-C-6), 63,7(0-CH2-CH2), 36,5, 33,5 29,9 (CH2S), CH2C0).

30 BSA-konjugaatti 26

Monosakkaridi 25 liitettiin BSA:iin käyttäen asyyliatsidimenetelmää, joka on esitetty veriryhmä H-di-sakkaridi-BSA-konjugaatin (44) valmistuksen yhteydessä. Yhteen mooliin BSA:a liittyi 36 mol hapteenia, mikä mää-35 ritettiin sekä differentiaalisella alkuainerikin analyysil- 36 78707 lä että fenoli-rikkihappo-menetelmällä (32).

KLH-konjugaattl 27

Disakkaridi 23 liitettiin KLH:iin käyttäen lähdeviitteessä 33b kuvattua menettelytapaa (tiofosgeenimene- 5 telmä). Yhteen mooliin KLH:a liittyi 490 mol hapteenia, 32 mikä määritettiin fenoli-rikkihappo-menetelmällä

Esimerkit 28-33

Agglutinaatioinhibittoreiden valmistus (vrt. kuva 5)

Etyyliglykosidit valmistettiin vastaavista 2-bro-10 mietyyliglykosideista katkaisemalla hiili-bromi-sidos hydrogenolyyttisesti. Kaksihampaiset glykosidi-inhibiit-torit valmistettiin alkyloimalla ditioleja samanlaisella menetelmällä kuin se, jota käytettiin täydellisten väli-haaraglykosidien valmistamiseksi (menetelmä F, ks. edellä). 15 Etyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3 -D-galaktopyra- nosidi) (28)_ 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-^3 -D-galaktopyranosidi) (1) (98 mg, 0,22 mmol) liuotettiin me-tanoliin 5 ml) ja kaliumhydroksidin vesiliuokseen (0,3M, 20 5 ml), ja sitä hydrogenoitiin (Pd/C 10%, 47 mg) normaa lisen ilmanpaineessa 3 h. Reaktioseos (pH 6) suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin jäännös, joka TLC:n (Si02, kloroformi-metanolivesi-seos 65:35:10; alempi faasi perusteella oli puhdasta. Jäännös asetyloi-25 tiin (etikkahappoanhydridi/pyridiini 1:1; 60°; 1,5 h), ja reaktioseos jäähdytettiin, suodatettiin ja haihdutettiin useaan kertaan tolueenin ja etanolin kanssa ja lopuksi kuivattiin (0,1 torr). Kiteyttämällä eetterin ja iso-oktaanin seoksesta saatiin otsikon mukaista yhdis-30 tettä (28). Saanto 55 mg (68 %) . Sp. 92-93°; = -31,0° (c = 1,2, bentseeni); ~ “14,4° (c = 1,2, CDCl^) ^Tcirjallisuusarvot (39): sp. 88°; ~ “29,8° (c = 10, bentseeni)^; 1H-NMR (CDCl-j, TMS) S 5,40 (dd, 1H, J4 5 = 1,0 Hz, J4 3 = 3,5 Hz, H4) , 5,22 (dd, 1H, J2 3*=10,5 35 Hz, 2=B,0 Hz, H2), 5,02 (dd, 1H, H3), 4,48 (d, 1H, 37 7 8 7 0 7

Hl), 4,16 (m, 2H, H6), 3,93 (oct, 1H, J =10,0 Hz, gem J„. =7,0 Hz, 0CH_CH^) , 3,89 (dd, 1H, J,- c=4 Hz, H5) , 3,60 (oct, 1H, 0CH2CH3), 2,17, 2,07, 2,06, 1,99 (s, 3H kukin, CH3C0), 1,22 (t, 3H, 0CH2CH3).

5 13C-NMR (CDC13, TMS)^ 170,4, 170,3, 170,2, 169,4 (CO), 101,1 (Cl), 71,0, 70,6, 68,9, 67,1(C2-C5), 65,7 (CH2CH3), 61,3(C6), 20,8, 20,7, 20,7, 20,6(CH3C0), 15,1(CH2CH3).

Etyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyylinei-D-galaktopyranosyyli) -/$ -D-galaktopyra- 10 nosidi) (29)_ 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-e^-D-galaktopyranosyyli) -/^-D-galakto-pyranosidi (14) (740 mg, 1 mmol) liuotettiin metano-liin (14 ml) kuumentaen samalla. Lisättiin natriummetok-15 sidia metanolissa (0,1M, 2 ml), ja reaktioseosta sekoitet tiin huoneen lämpötilassa 2 h. Lisättiin natriumhydroksi-dia (87 mg, 2,2 mmol) vedessä (2 ml) sekä katalyyttiä (10 % Pd/C, 120 mg), ja reaktioseosta hydrogenoitiin normaalissa ilmanpaineessa 15 h. Suodattamalla (Celite) 20 ja haihduttamalla (alle 0,1 torr) saatiin väritön amorfi nen jäännös, joka suspentoitiin etikkahapon ja pyridiinin seokseen (1:1, 10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin (75°, 3 h), seos jäähdytettiin ja kaadettiin eetteriin (50 ml). Eetteriliuos pestiin (vesi, kyllästetty natriumbikarbo-25 naattiliuos, vesi), kuivattiin (natriumsulfaatti) ja haihdutettiin (alle 0,1 torr), jolloin saatiin kiteisenä jäännöksenä yhdistettä 29, joka TLC:n (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:1) perusteella oli puhdasta. Saanto 650 mg (98 %). Uudelleenkiteyttämällä metanoli-30 vesi-seoksesta saatiin analyysinäyte (neulamaisia kiteitä) : sp. 133-135°; = +81,4° (c = 0,9, CHC13); XH-NMR (CDC13, TMS)£ 5,57 (d, 1H, H4·), 5,39(dd, 1H, J3, 4,=3,2 Hz, H3'), 5,20(dd, 1H, J2, 3,=11,0 Hz, H2'), 5,18(dd, 1H, J2 3=10,8 Hz, H2), 5,01(d, 1H, ^ , 2,=3,5 Hz' 35 Hl1), 4,82 (dd, 1H, J3 4=2,6 Hz, H3), 4,48(d, lH," 2=7,9

Hz, Hl), 4,06 (d, 1H, H4), 3,92, 3,59 (dq, lH kukin, J=9,7 38 78707 ja 7,1 Hz, CH3-CH2-0), 2,13, 2,11, 2,08, 2,075, 2,06, 2,04, 1,99(S, 3H kukin, CHj-CO), l,22(t, 3H, J=7,l Hz, CH3“CH2“0) ppm.

X3C-NMR (CDC13, TMS)^ 170,7, 170,6, 170,5, 170,4, 5 170,1, 169,7, 169,1 (CHj-CO), 100,9(C1), 99,4 (Cl'), 77,2, 72,8, 71,9, 68,8, 68,6, 67,9, 67,4, 67,1(C2-C5, C2'-C5'), 65,4(CH2-CH3), 62,1, 60,5(C6,C61), 21,0, 20,8, 20,7, 20,6(CH3-C0), 15,1(CH2-CH3) ppm.

Bis-galaktopyranosidi 30 ja galaktopyranosiditioli 31 10 2-bromietyyli (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/^-D-galak- topyranosidi) (1) (915 mg, 2,0 mmol) ja heksaani-1,6-ditioli (150 mg, 1,0 mmol, 153 ui) liuotettiin bentsee-niin (3 ml), ja kaliumhydroksidin vesiliuos (112 mg, 2 mmol, 3 ml) sekä metyylitrioktyyliammoniumkloridi (n. 10 15 mg) lisättiin liuokseen. Reaktioseosta sekoitettiin typ peä suojakaasuna käyttäen 24 h, ja kerrokset erotettiin. Vesikerros uutettiin metyleenikloridilla, ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin vedellä. Kuivaus ja haihdutus antoivat tulokseksi jäännökseen, joka käsiteltiin 20 kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:1), jolloin saatiin otsikon mukaisia yhdisteitä 30 ja 31.

Yhdiste 30: Saanto 190 mg (21 %); viskoosi siirappi; = -10,3° (c = 1,4, CDC13); 25 1H-NMR (CDC13, TMS)^ 5,40(d, 2H, H4), 5,22(dd, 2H, J2 3 = 10,5 Hz, H2), 5,03(dd, 2H, J3 4=3,5 Hz, H3), 4,51(d, 2H, Jx 2=8,0 Hz, Hl), 2,70, 2,53 (t, 4H kukin, J=7,0, S-CH2)I 2,16, 2,09, 2,06, 1,99(s, 6H kukin, CHjCO) ppm. 13C-NMR(CDC13, TMS)<5 170,7, 170,7, 170,6, 169,9(C0), 30 101,8(C1), 71,3, 71,1, 69,1, 67,4(C2-C5), 70,2(C2-0=, 61,7(C6), 32,9, 31,8, 30,0, 28,8(CH2), 21,3, 21,1, 21,0(CH3C0) ppm.

Yhdiste 31: Saanto 280 mg (27 %); viskoosi öljy; = -8,9° (c = 1,3, CDd3); 35 1H-NMR (CDC13, TMS)$ 5,41(d, 1H, H4), 5,24(dd, lH, J2,3=10»5 Hz, H2), 5,04 (dd, lH, J3 4=3,5 Hz, H3), 39 78707 4,53(d, 1H, 3λ 2=8,0 Hz, Hl), 2,72 (t, 2H, J=7,0 Hz, S-CH2), 2,50 - 2,60(m, 4H, S-CH2), 2,16, 2,08, 2,06, 1,99 (s, 3H kukin, CH3C0) ppm.

13C-NMR (CDC13, TMS)«$ 170,8, 170,7, 170,6, 169,9 (CO), 5 101,9(C1), 71,4, 71,2, 69,2, 67,5(C2-C5), 70,3(CH2~0), 61,7(C6), 34,3, 33,0, 31,9, 30,1, 28,7, 28,4, 25,0(CH2), 21,3, 21,2, 21,1(CH3C0) ppm.

Bis-digalktopyranosidi 32 ja digalaktopyranosidi- tioli 33_____ 10 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6- tetra-O-asetyyli-06-D-galaktopyranosyyli)-D-galaktopy-ranosidi) (14) (1486 mg, 2,0 mmol) käsiteltiin kuten edellä (yhdisteet 30 ja 31). Kromatografisella käsittelyllä (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 4:1) 15 saatiin otsikon mukaisia yhdisteitä 32 ja 33 sekä lähtö- aineyhdistettä 14 (457 mg, 31 %).

Yhdiste 32: Saanto 312 mg (21 %); viskoosi siirappi; = +62,2° (c = 0,9, CHCl^) ; 1H-NMR (CDCl-j, TMS)$ 5,56(d, 2H, J3, 4,=3,0 Hz, H4'), 5,39(dd, 2H, 20 J2, 3,=11,0 Hz, H2') , 5,20 (dd, 2H, J2 3 = H,0 Hz, H2), 5,18(dd, 2H, H3'), 5,00(d, 2H, ^, 2,=4,0 Hz, Hl'), 4,81(dd, 2H, J3 4=10,5 Hz, H3), 4,50(d, 2H, 2=8,0

Hz, Hl), 2,53, 2,72(t, 4H kukin, J=7,0 Hz, S-CH2), 2,13, 2,10, 2,07, 2,06, 2,04, l,98(s, CH3-C0) ppm.

25 13C-NMR(CDC13, TMS)£ 170,7, 170,6, 170,5, 170,4, 170,1, 169,8, 169,1 (CH3C0), 101,2(Cl), 99,4(Cl'), 77,1, 72,7, 72,0, 68,6, 68,6, 67,9, 67,4, 67,1 (C2-C5, C2'-C5'), 69,5(0-CH2), 62,0, 60,5(C6, C6'), 32,6, 31,4, 29,8, 29,2, 28,8 (CH2), 29,4(C5 nonaaniditioliosan C5), 21,0, 20,8, 30 20,7,20,6 (CH3C0) ppm.

Yhdiste 33: Saanto 335 mg (20 %; viskoosi siirappi; = +60,3° ( c = 1,9, CHC13); 1H-NMR (CDC13, TMS )^ 5,58(d, 1H, J3, 4,=3,0 Hz, H4·), 5,40(dd, 1H, J2, 3,=11,0 Hz, H2'), 5,21(dd, 1H, H3'), 35 51,19 (dd, 1H, J2^3 = 11,0 Hz, H2), 5,01 (d, 1H, 2,=4,0 40 78707

Hz, Hl'), 4,82(dd, 1H, J3 4=3,0 Hz, H3), 4,52(d, lH,

Jx 2=8,0 Hz, Hl), 2,74, 2,55, 2,52(t, 2H kukin, J=7 Hz, CH2-S), 2,14, 2,11, 2,08, 2,07, 2,04, l,99(s, CH3C0) ppm. 13C-NMR (CDC13, TMS)S 170,7, 170,5, 170,4, 170,3, 5 170,1, 169,8, 169,1(CH3-C0), 101,2<C1), 99,4(C1'), 77,1, 72.7, 71,9, 68,6, 68,6, 67,8, 67,4, 67,1 (C2-C5, 02^05^, 69,5(0-CH2), 62,0, 60,5(C6, C6'), 34,0, 32,6, 31,3, 29,8, 29,4, 29,2, 29,0, 28,8, 28,3, 24,6(CH2), 20,9, 20,8, 20.7, 20,6{CH3-C0) ppm.

10 Esimerkit 34-44 2-bromietyyliryhmä tavanomaisessa synteettisessä hiillhydraattikemiassa_ 2

Veiryhmä H:n suhteen spesifinen disakkaridi on syntetisoitu 2-bromietyyliglykosidin muodossa, mikä on 15 osoituksena 2-bromietyyliryhmän soveltuvuudesta kemial lisiin synteesireaktioihin.

2-bromietyyli(4,6-O-bentsylideeni-/0 -D-galakto- pyranosidi) (35)_ 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-/3 -D-20 galaktopyranosidi (1) (39,0 g, 76 mmol) liuotettiin meta- noliin (100 ml) ja lisättiin huoneen lämpötilassa olevaan liuokseen, jossa oli natriumia (0,2 g) metanolissa (500 ml). Deasyloituminen meni loppuun muutamassa minuutissa (TLC: Si02, etyyliasetaatti-etikkahappo-vesi-seos 2:1:1). Reak-25 tioseos neutraloitiin ioninvaihtohartsilla (Duolite-H+, pesty metanolilla), hartsi suodatettiin pois, ja suodos haihdutettiin (alle 40°), jolloin saatiin ylykosidia 34 (18 g, epästabiili siirappi). Tämä käytettiin välittömästi seuraavassa vaiheessa.

40 30 Kuiva sinkki(Il)kloridi (14,4 g, 106 mmol) liuo tettiin tetrahydrofuraaniin (80 ml), ja bentsaldehydiä (11,2 ml, 106 mmol; juuri tislattu ja pidetty typen alla pimeässä) lisättiin liuokseen. Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 min, ja siihen lisättiin tetrahydro-35 furaaniin (90 ml) liuotettuna 2-bromietyyli-(/*-D-galak- topyranosidi) 34 (18 g, raakatuote; ks. edellä). Reaktio- 4i 78707 seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa valolta suojattuna yön yli. Haihdutettaessa saatiin jäännös, joka liuotettiin metyleenikloridiin (200 ml) ja pestiin vedellä (2 x 100 ml). Kuivaus (natriumsulfaatti) ja haihdutus 5 antoivat tuloseksi raaktuotteen, joka liuotettiin meta- noliin (55 ml) samalla kuumentaen. Kuuma liuos laimennettiin eetterillä (200 ml) ja jäähdytettiin, jolloin kiteytyi otsikon mukaista yhdistettä (35) (12,5 g). Emäliuos haihdutettiin ja käsiteltiin kromatografisesti (Si02, 10 etyyliasetaatti-metanoli-seos 85:15), jolloin saatiin lisää yhdistettä 35 (1,8 g). Saanto 13,5 g (49 %).

Sp. 138-139°, = -29,9° (c = 1,2, CDCl3) .

1H-NMR(CDC13, TMS)$ 7,4 (m) 7,5 (m) (5H, aromaattinen), 5,56 (s, 1H, bentsylideeni), 4,35(d, 1H, H-l, 2=7,1 15 Hz), 4,32(dd, H-6B, JgA gB=12,7 Hz, Jg 6B=1,5 Hz), 4,27(t, 0-CH2CH2), 4,21(m, 2H, H-3, H-4), 4,08(dd, 1H, H-6A, J5 gA=l,8 Hz), 3,88(m, 0CH2CH2), 3,79(m, H-2), 3,51-3,58(m, 2H, CH2Br), 3,47(m, 1H, 5-H).

13C-NMR(CDC13, TMS)£ 129,3, 128,3, 126,5(aromaattinen), 20 103,1, 101,5(01, bentsylideeni), 75,3, 72,6, 71,6, 66,9(C-5-C-2), 69,5, 69,2(06, 0-CH2CH2), 30,4 (CH2Br).

2-bromietyyli(3-0-bentsoyyli-4,6-0-bentsylideeni- A-D-galaktopyranosidi) (36)_ 2-bromietyyli(4,6-0-bentsylideeni-/>-D-galaktopy-. 25 ranosidi) (35) (10,0 g, 26,7 mmol) liuotettiin metyleeni kloridiin (50 ml) ja pyridiiniin (20 ml) ja jäähdytettiin -30°:een. Lisättiin pisaroittaan liuos, jossa oli bentso-yylikloridia (5,2 g, 37 mmol) metyleenikloridissa (60 ml), ja reaktioseoksen lämpötilan annettiin kohota 0°:een 30 1 h:n aikana (TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1). Reaktioseos pestiin kylmällä vedellä, ja vesi-kerros uutettiin useaan kertaan metyleenikloridillä. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset kuivattiin (Na2S0^) ja haihdutettiin kahdesti tolueenin kanssa. Jäännös käsitel-35 tiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso- oktaanin seos 2:1), ja kiteytettiin isopropanolista. Emä- 42 78707 liuos käsiteltiin uudelleen kroraatografisesti ja kiteytettiin. Kiteisen aineen (36) kokonaissaanto oli 7,6 g (59 %). Sp. 141°; = +100° (c =0,78, CHCl-j) ; 1H-NMR(CDC13, TMS)£ 8,13, 8,10, 7,43-7,35 (in, 10H, 5 aromaattinen), 5,53(s, 1H, bentsylideeni), 5,17(dd, 1H, H~3, J2 3=10,2 Hz), 4,51(d, H-l, 2=7,7 Hz), 4,50(bd, H-4), 4,36(dd, H-6B), 4,29(m, 0CH2CH2), 4,24(dd, H-2, J2 3=10,2 Hz), 4,10(dd, 1H, H-6A, JgA gB=l2,7 Hz, J5 6=1,8 Hz), 3,88(m, 1H, 0CH2CH2), 3,47(m, H-5), 3,55(m, 10 CH2Br).

2-bromietyy1i(3-O-bentsoyyli-4,6-0-bentsy1ideeni- 2-0- (2,3,6-tri-0-bentsyyli-#£-L-fukopyranosyyli) - ft -D-galaktopyranosidi) (37)_ l-bromi-2,3,4-tri-O-bentsyyli-oC-L-fukopyranoosin 15 raetyleenikloridiliuos, joka valmistettiin l-0-(p-nitro- bentsoyyli)-2,3,4-tri-0-bentsyyli-/^ -L-fukopyranoosista (4,00 g, 6,86 mmol) bromivetyä käyttäen metyleeniklori-dissa (kokonaismäärä 30 ml), lisättiin seokseen, jossa oli 2-bromietyyli(3-0-bentsoyyli-4,6-0-bentsylideeni-/J -20 D-galaktopyranosidia) (36) (4,00 g, 8,35 mmol), tetra- etyyliammoniumbromidia (1,8 g, 8,5 mmol) ja molekyyli-seuloja (4 A, 5 g) 20 ml:ssa metyleenikloridia, huoneen lämpötilassa kuivaa typpeä suojakaasuna käyttäen. Reaktion etenemistä seurattiin TLC:llä (tolueeni-etyyliasetaatti-25 seos 5:1). Lisättiin kaksi lisäerää fukosyylibromidia (2,00 g:sta, 3,46 mmol:sta, esiastetta) 2 ja 5 vrk:n kuluttua, vastaavasti. 1,0-(p-nitrobentsoyyli)-2,3,4-0-bentsyyli-^-L-fukopyranoosia käytettiin yhteensä 8,00 g (13,7 mmol). 8 vrk:n kuluttua yhdiste 31 oli kulunut lähes 30 kokonaan. Reaktioseos suodatettiin Celite:n läpi, joka pestiin metyleenikloridilla (2 x 25 ml). Suodos pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 50 ml) ja vedellä (50 ml). Kuivauksen (Na2S04) ja liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännös käsiteltiin kromatografisesti 35 (Si02, tolueeni-etyyliasetaatti -seos 5:1), jolloin saa- 43 7 8 7 0 7 tiin 3,0 g (40 %) puhdasta otsikon mukaista yhdistettä (37) vaahtona, joka uudelleenkiteytettiin iso-oktaani-etyyliasetaatti-seoksesta; sp. 172°. ~ +26° (c = 0,72, CHC13).

5 1H-NMR (CDC13, TMS)^ 8,06-6,98(m, 25H, aromaattinen), 5,50(s, bentsylideeni), 5,46(d, H-l', , 2,=3,0 Hz), 5,40(dd, H-3, J2 3=9,7 Hz, J3 4=3,8 Hz), 4,95(d, 1H, bentsyyli), 4,77(d, 1H, bentsyyli), 4,68(d, H-l, 2=7,7 Hz), 4,56(H-4), 4,56(H-5'), 4,47(H-2), 4,34(m, 0CH2CH2), 10 4,32 (s, bentsylideeni), 4,10 (bd, 1H, H-6A, J,_ ,=13,6 OAf Ob

Hz), 4,02(dd, 1H, H-31), 3,94(dd, 1H, H-2·), 3,73(m, 0CH2CH2), 3,68(bs, 1H, H-4'), 3,59(bs, 1H, H-5), 3,49(m, 2H, CH2Br), 1,14(d, 3H, H-6#, J5, 6,=6,6 Hz).

2-bromietyyli(4,6-0-bentsylideeni-2-0-(2,3,4-tri-15 0-bentsyyli-o(-*L-fukopyranosyyli) -/^-D-galaktopyra- nosidi) (37)_

Valmistettiin natriummetoksidin metanoliuos 250 ml:sta metanolia ja natriumista (0,1 g, 4 mmol). Lisättiin yhdiste 37 (4,00 g, 4,46 mmol) 25 mlsssa metanolia, ja reak-20 tioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 4 vrk. TLC

(tolueeni-etyyliasetaatti-seos 5:1) osoitti yhdisteen 37 konvertoituneen täydellisesti. Reaktioseos neutraloitiin metanolilla pestyllä Duolite-H+:11a ja suodatettiin liuotin poistettiin, jolloin saatiin 3,45 g epäpuhdasta yh-25 distettä 33, joka käsiteltiin kromatografisesti (Si02, tolueeni-etyyliasetaatti-seos 5:1). Näin saatiin vaahtona 2,40 g (68 %) yhdisettä 38. £i/33 = -49° (c = 0,78, CHC13) . 1H-NMR (CDC13, TMS)S 7,54-7,22 (m, 20H, aromaattinen), 5,55(s, 1H, bentsylideeni), 5,30(d, 1H, H-l', J1( 2,=3,2 30 Hz), 4,97(d, 1H, bentsyyli), 4,64(d, bentsyyli), 4,45(d, H-l, J= 8 Hz), 4,32(H-5'), 4,03(H-2’), l,13(d, 3H, H-6*, J-, ^,=6,4 Hz).

JH-NMR (CDC13, TMS)<? 101,8, 101,4 (C-l ja bentsylideeni -C), 99,1(C-l1), 30,l(CH2Br), 16,7(C-6·)- 35 44 78707 2-bromietyyli(3,4,6-tri-0-asetyyli-2-0-(2,3,4-tri-O-asetyyli-^-L-fukopyranosyyli)-fr -D-galaktO- pyranosidi) (40)___

Liuosta, jossa oli yhdistettä 38 (0,50 g, 0,63 5 mmol) 20 ml:ssa etikkahappoa, hydrogenoitiin normaalissa ilmanpaineessa yön yli käyttäen 10 % palladiumia hiilellä sisältävää katalyyttiä (0,50 g). Reaktioseos suodatettiin, ja liuotin poistettiin haihduttaen useita kertoja tolueenin kanssa, jolloin saatiin 0,27 g (100 %) 2-bromi-10 etyyli(2-0 WrL-fukopyranosyyli)-fr -D-galaktopyranosi- dia) (39), joka TLC:n (Si02» kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10) perusteella oli puhdasta. Tämä tuote asetyloitiin 5 ml:11a pyridiiniä ja 2,5 ml:11a etikka-happohydridiä huoneen lämpötilassa yön yli. Haihdutta- 15 maila useaan kertaan tolueenin kanssa ja kuivaamalla -2 sen jälkeen 10 mm Hg:n paineessa saatiin 230 mg (53 %) puhdasta 2-bromietyyli(3,4,6-tri-0-asetyyli-2-0-(2,3,4-tri-O-asetyyli-eirL-fukopyranosyyli) -fr -D-galaktopyranosi-dia) (40) (TLC: Si02, iso-oktaani-etyyliasetaatti -seos 20 1:2). = -77° (c = 0,95, CHC13) .

1H-NMR (CDC13, TMS)<? 5,43 (d, 1H, H-l' , J1, 2*=3'7 Hz> ' 5,34(dd, H-31), 5,3(bs, H-4, H-4·), 5,04(dd[ 1H, H-3, J3 4=3,4 Hz), 4,99(dd, lH, H-2’, J2, 3,=10,9 Hz), 4,74(q, lH* H-51, J5, 6,=6,7 Hz), 4,55(d, 1h! H-l, J1 2=7,9 Hz), . 25 4,30(dt, 0-CH2CH2), 4,1 (H-6), 4,00 (dd, H-2,fJ2 3= 10 Hz), 3,90(m, 0CH2 CH2 ja H-5), 3,52 (m, 2H, CHjBr), 1,15 (d, 3H, H-6')/ 2,15, 2,14, 2,05, 2,00, 1,99, 1,99, 1,98(18H, OAc).

2- (2-metoksikarbonyylietyylitio) etyyli (2-0- (o£*L- 30 fukopyranosyyli)-fr -D-galaktopyranosidi (42)_

Perusteellisemmin puhdistamatta yhdiste 40 (230 mg, 0,335 mmol) liuotettiin 0,7 ml:aan bentseeniä. Tähän liuokseen lisättiin metyyli-3-merkaptopropionaattia (94 mg, 0,787 mmol), vettä (0,5 ml), cesiumkarbonaattia (257 mg, 35 0,787 mmol) ja metyylitrioktyyliammoniumkloridia (n. 5 mg), ja syntynyttä seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 h.

45 7 8707 TLC-levyllä (Si02, iso-oktaani-etyyliasetaatti-seos 1:2) esiintyi uusi, päätuotetta polaarisempi täplä, mutta huomattava määrä lähtöainetta oli yhä jäljellä. Lisättiin vielä 2 ekvivalenttia cesiumkarbonaattia ja tioliesteriä, 5 ja sekoittamista jatkettiin 7 vrk. Tässä vaiheessa lähtö ainetta oli yhä jäljellä, mutta koska deasyloitumistuot-teita alkoi esiintyä, reaktioseos laimennettiin 50 ml:11a bentseeniä, orgaaninen kerros erotettiin, pestiin vedellä ja kuivattiin (Na2S04). Liuottimen poistamisen jälkeen 10 raakatuote käsiteltiin kromatografisesti (Si02, iso-ok- taani-etyyliasetaatti-seos 1:1), jolloin saatiin 150 mg (62 %) yhdistettä 41 siirappina.

Valmistettiin natriummetoksidin metanoliuos 50 ml:sta kuivaa metanolia ja 10 mg:sta natriumia. Tähän liuokseen 15 lisättiin yhdiste 41 (150 mg, 0,207 mmol), ja seosta se koitettiin huoneen lämpötilassa 4 h. TLC-levyllä (kloroformi -metanoli-vesi-seos 65:35:10) esiintyi tämän ajan kuluttua yksi ainoa täplä. Neutraloitiin Duolite-H+:11a (pesty metanolilla ja kuivattu huolellisesti). Suodatta-20 maila ja haihduttamalla liuotin saatiin 76 mg (78 %) otsi kon mukaista yhdistettä (42) siirappina, joka käytettiin tarkemmin puhdistamattomana seuraavaan vaiheeseen.

^D° = "75° (c = °'70, H20)· ^H-NMR (D20, TMS ulkopuolisena standardina)£ 5,29(d, 25 1H, H-l·, Jlt 2,=3,6 Hz), 4,54(d, 1H, H-l, 2=7,7 Hz), 4,43(q, 1H, H-5·), 4,l(m, 1H, 0-CH2CH2), 3,75(s, 0CH3), 3,63(dd, H-2), 2,88-2,75(m, 6H, CHjS, CH2-C0), l,23(d, 3H, H-6', J., ,,=6,4 Hz).

13 5 C-NMR (D20, TMS ulkopuolisena standardina)^ 178,1(CO), 30 104,3, 102,0(C-l, C-l’), 78,9, 77,9, 76,6, 74,8, 72,3, 71,8, 71,5, 71,1, 69,7, 63,8, 55,2, 37,1, 33,9, 29,3-(renkaan ja välihaaran hiilet), 18,2(C—6 *).

46 78707

Veriryhmä H-dlsakkaridin konjugaatti BSAin kanssa (44)

Yhdiste 42 (61 mg, 0,13 mmol) liuotettiin 0,25 ml:aan absoluuttista etanolia, ja siihen lisättiin 0,10 ml 85 % 5 hydratsiinihydraattia. 2 vrk:n kuluttua liuotin ja yli määrä hydratsiinihydraattia haihdutettiin, jolloin saatiin kvantitatiivisella saannolla hydratsidia 43 (TLC: kloroformi -metanoli-vesi-seos 65:35:10) hydratsidi 43 (20 mg, 0,043 mmol) liuotettiin DMF:iin (1 ml), ja liuos jäähdy-10 tettiin -25°:een. Lisättiin kloorivedyn 4,2N dioksaani- liuosta (60 ^ul) ja sen jälkeen t-butyylinitriittiä (29 mg, 0,08 mmol) 80 ^ul:ssa DMF:a. 30 minuutin kuluttua lisättiin sulfamiinihappoa (80 ui), ja sekoittamista jatkettiin 15 min. Asyyliatsidiliuos lisättiin suoraan 0°-iseen 15 liuokseen, jossa oli naudan seerumialbumiinia (BSA) (58 mg) liuotettuna vesiliuokseen (2 ml), joka oli 0,08M Na2B^0^:n suhteen ja 0,35M KHCO^sn suhteen. Liuoksen pH säädettiin asyyliatsidin lisäyksen aikana arvoon 9,05 - 9,30 natriumhydroksidin IN vesiliuoksella ja IN HCl:lla.

20 Sen jälkeen kun reaktioseosta oli pidetty +4°:ssa 20 h, se dialysoitiin vettä vastaan ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin aikaan antigeeniä (33 mg) valkoisena jauheena. Fenoli-rikkihappo-menetelmällä (32) määritetty liittymisaste oli 8 mol hapteenia yhtä moolia kohden BSA:a.

25 Esimerkit 9b ja 45-47

Valmistettiin neljä uutta yhdistettä ja karakterisoitiin ne: yhdiste 9b (taulukot 1, 2 ja 3), 45, 46 ja 47 (ks. jäljempänä). Nämä neljä yhdistettä valmistettiin taulukossa 1 ja kokeellisessa osassa esitetyn mene-30 telmän A mukaisesti käyttäen soveltuvaa £*>-bromialkyyli- alkoholia. Yhdisteiden 4 5-47 tuotetiedot ja saannot esi-1 13 1 tetään taulukossa 5 ja C- ja H-NMR-spektritiedot taulukoissa 6 ja 7.

47 78707

Taulukko 5. Tuotetiedot ja saannot CD-bromialkyyliglyko- sidien valmistuksessa (vrt. menetelmä A)_ m , Lähtöaine Saanto Sp. (°C) rst 5ä°te alkcholi (%)a ._ 5 3-brcmiproparoli 53 68-70 +7,7(c 1,0; CHC13) / 0A‘ £3; D-Gal 10 pOk'o'N-'Ng^ 3-brcmipro- 90 67-68 +0,4 (c 1,1; fxj** panoli CHC1-) ^ L· 15 Α£ϊ D-Glc r°k 0ΛΛΑΑΑΑβν- 11-bromiunde- 35 siirappi +15,6 (c 1,0;

. P4-—T kanoli CHC1J

?n 3

Qy'SO

D-GlcKPhtp a) Eristetty kranatografisesti adsorbenttina silikageeli.

4β 7 8 707 Jäljempänä esitettävät esimerkit 48-50 ovat täydellisiä selostuksia sellaisten glykokonjugaattien valmistuksesta, joiden hiilihydraattiosalla on todistettu biologinen merkitys. Nämä Esimerkit tulisi lukea itsenäisinä, 5 riippumattomina toisistaan ja edellä olevasta selostuk sesta.

49 78707 i n I ®l i $ 1 i ! ^

? ό B

y « ί i ® ^ s S ^ s \ o o o o 4 I it lit .

31 1 1 . £ +J « g 3 3 iar η ffi ή qj s*h ! 8 Si a I ali * j S ; !l 3 2 Γ3 i Ϊ 2 £fi g§ g " j Jj | ί II IIa ? ΐ J ä 3-J ΐ S 18-238¾ q e; λ +j χ: ω -h

cTy hi in hi in S

A s 1

/ i®M

so 78707

Mene telinä

Äe?,04e 4ci>AC

O. HO^Br; BF*-Et,0 Y^°\ .

AcO^fä^OAc CH2CIz 4c0'^“'3ac'0''^ 4 fOAc JOAe

AcO^a—· o _, ΑεΟ—^^-Ο

AcO^~~ir\ -~ AcO-^-"·^""^—0-^"®Γ A

o=f"yoo*c °X>° ac6»c Ae\&\ 4c0^3teA HO^Br; Ag0S02CF3 Ae0^fä\ 0^4c CH*ct* ·’ kollidiini 9^0Ac JOAe JOAe ΑβΟ-γ£^0 HO^Br ; H3CCeH4S03H AeO-i>C^0 ACO^TA CgHgCH, ·, CHsNOe AcCh^^O^*'

CffS HOSBrj CoBt2 o rr*\m ssasiSsSL· 'M/*1 icUi% na(cw» tc\^%

Aco^j^-ci bentseeni; CH3NO 2 Ae<>*p\j~Br *

Kuva 2. Esimerkkejä 2-brcmietyyliglykosidisynteeseista.

51 78707 50c H : 3.50 ppm 5.8 Hz * HaHa

V 3 81 PP" JAC= 5 8 HI

Hc: 3.99 ppm JBC: -12.0 Hz Hg Hg jkJvirl

_jMUMm_R

_julLL__Luu_J—

1-1-1-1-1-1-1-Y

i.l B.M

Kuva 3. 2-branietyyli (2,3,4-txi-0-asetyyli-<^rL-fukopyranosidin 7: 2-branietyyliosa) ''"H-NMR-spekti. Ylhäällä: Alkuperäinen spektri; 26 keskellä: simuloitu spektri , piikin leveys 1,2 Hz; alhaalla simuloitu spektri, piikin leveys 0,1 Hz 52 7 8 7 0 7 SOd

H? yOH

15 MtONq Μ·ΟΗ Γ^Ό HgN-NHg ηοΛ^-o^^coom. EtOH-vesi-24 seos

0 ,Jf -BuNOg /DMF

H{^r^°·^ ^C0NH-NH2 HC/dloksW — z,h2nso5

Vo fiL Vo H°A^?pi-0N/'sA-C0W3 s-Vc o- (as*) 26 ί 1¾ ,3¾

H<^dir^~0^S^y~NH‘ 2>KLH~CI

£3 4J

Kuva 4. Mallireaktioita välihaaraglykosldlen liittämiseksi ρϊο-’ teiineihin. Lisäesimerkki kuvassa 6.

53 78707

nHz/Pd/C AcQ

, °h-/h,o Ut'o 21 Ac, o/ pyri- diini 28 — -¾¾ \po „ 29

Ac<? <OAc , HS'V^SH VA--n am _ - Äcc>W^o^s'VV^s^r'öT^TOAc (CeH,7 )3 NCH3Br *CUCfAc u 'θ--νλ

NaOH/tf20/bentseeni 5? -Aco w« *te·»

AcO-A^?^A— o-»/'s‘VA--sh 3i hapetus

Acj>c

AcC^^^oy'S'^^S-S~JW'S'\,o-^^^OAC

Acer 0Ac ,., ws-vw\rs« Ac wTl — -- ? X»Ac 4- « ^C6Bl7^3NCH3Br V"d-0 — :: ^eoH/H20/bentsee- 4co-A-^?^>L-0v^s'V\/W^sA_o-vSii--^o-4c ni c 'o—«Λ

Acer λ T OAc ~ ^T°Ac

Acer OAc

Kuva 5. Agglutinaatioinhibiittoriglykosidien valmistus 2-brani-etyyliglykosideista.

54 78707 SO f HQ sCxHPh I **«<Wa PhCHO V^-

MtOH ZnCL/THF «oA-^L- BtCI

34 0H °^Br pyridilni 35 v-r-of fjr V° *"M* K·®.

^C-o 522- ΒιοΛ-^Λ- O^Sr ΒζοΛ~-^Λ-ο^/ r chzciz ; molekyyli- j _μ·ονο seuloja 5 μ·οη i* feeT^0®" βηο .3? jS_. oVer O^^Br H3C-7^.o-7 ^ H9/Pd/C, HO Ac M,C-T^.0^ eJ%»°e" ***** o /pyridiini hs^coomj 2S £3: R ·Η ±0: Ρ·Αο Ο — Λ'·0«·; «·Λβ

-R’ 42: ft'·ΟΜ·; R«R

H3C~T"οη 15' *'· n«nh2 ; r-h

44: R’*BSA ; R*H

Kuva 6. 2-brcmietyyliryhniä synteettisessä hiilihydraattikemiassa, esimerkkinä veriryhmä H: n suhteen spesifisen glykosidin kokonaissynteesi.

55 7S707

Esimerkki 48 2-bromietyyliglykosideja. Veriryhmä P -antigeenin trisakkaridiosan välihaara-, lipidi- ja etyyliglykosi- dien synteesi. Neoglykoproteiinien valmistus._ 5 Yhteenveto esimerkistä

Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin vastaavan 2-bromietyyliglykosidin 58 kautta korvaamalla bromidi-ioni metyyli-3-merkaptopropionaatilla, oktadekyylitiolil-la ja vedyllä, vastaavasti. Hopeatriflaatin edistämä 2-bromietyyli(2,3,6-tri-O-bentsyyli-yS -D-glukopyranosi-din (53) glykosylointi 2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-*C-D-galaktopyranosyyli) —4-D-galaktopyra-nosyylibromidilla (48) antoi tulokseksi yhdisteen 58. Vastaava tetradeuteroitu yhdiste (73) valmistettiin pääasias-15 sa samaa tietä. Välihaaraglykosidi (63) liitettiin nau dan seerumialbumiiniin ja Fissurella-suvun kotilon hemo-syaniiniin, jolloin saatiin vastaavia neoglykoproteiineja.

Johdanto ]ς

On esitetty, että triheksosyyliseramidi (44) (P -45 20 antigeeni ) ja globotetraosyyliseramidi (46) (P-antigee- 45 m ) toimivat patogeenisen E. coli -bakteerin reseptoreina ihmisen virtsaelimissä. Me kerroimme hiljattain näiden seramidien Galotl—>4Gal-yksikön (jota pidetään reseptorin tärkeänä osana) parannetusta synteesitä (47) sekä 25 joukosta johdannaisia (48-50), jotka ovat arvokkaita reseptori-ilmiön biologisessa arvioinnissa.

Pk-antigeenin trisakkaridin (GaldU— >4Gal/£ 1—>4Glc) yksinkertaisia glykosideja (Me ja p-r^CgH^) on valmistettu (51) soveltuvalla tavalla suojattujen laktoosi- ja 30 galaktoosijohdannaisten kautta. Me kerromme nyt vaihtoehtoisesta tiestä, joka lähtee asetyylibromisokerista 48 ja 2-bromietyyliglukosidista 53 johtane yleiseen 2-bromi- k etyyliglykosidesiasteeseen (58), jota käytettiin P -antigeenin välihaara-, lipidi- ja etyyliglykosidien valmis-35 tamiseen.

56 787G7

Nimenomaan hiilihydraattien deuteroituja johdannaisia voidaan käyttää massa- ja ^H-NMR-spektrien tulkitsemisten yksinkertaistamiseen ja merkittyinä yhdisteinä tutkittaessa esimerkiksi neoglykolipidien dynaamisia omi- 2 5 naisuuksia solumembraaneissa H-NMR-tekniikalla. Olemme valmistaneet yhdisteen 58 tetradeuteroidun analogin (73) yhdisteistä 70 ja 53 käyttäen samaa tietä kuin valmistettaessa yhdistettä 58 (ks. jäljempänä).

57 M« 78 707 η„" i>OAc --— W-'-'O OR" -¾

48 0r 0R

♦ 56 E-Br, I·-*"·»». *'”-Ac 57 *-»f. *·-*“-«, »"·-*« 0R„ 58 *»'.

Λ'0-τ^λ 59 *'»'· *·»· *"*,n· »"·'** RO-X-r&.o^S'B' 60 *“' “· .........

62 K-S'VCOOH*. *'-*"-r"-At 63 K-S'VCOOMi, Ε*»Β"-Β"·-Η 64 MS'WWWW , Ι·.*··.*·'·.Αί

Cfi *** ’* "Ac 65 Ε-5ΛΛΛΛΛΛΛΛΛ , Ε·-Β"-Β*"-Η

50 I-H. «·“-««, 66 »..»...«....AC

67 *-*. »·.»-.*···.«

r. *·* -*n, * -H go R-S-VCOHH-ASA, ’-M

->4 B-Bt, B’B'-CHrb

r _ 69 E-S'VCOHH-KLH, *'-«"-K"'-H

DO B-B«, E'-H, B"-Be ♦

AcO ” ifÄ"OR*

ter A

AcO-L^X OR OJ2—0/?’

°C °ldS^0Ac <°R

Ac0o£\ 71 -«». «·- »0^ZroJ

Br 72 e-η. E'-At 70 73 E-R'-At Ρ*^ΟΛβ O—T*'*—o Y /OAe 0—X JDBn 52 Ae0-^C-0 Βι q^/^Bt 61

Kuvio 7 58 78 707

Tulokset ja johtopäätökset 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-0-aSetyyli-/* -D-gluko-pyranosidia (49) käsiteltiin natriummetoksidin metanoli-liuoksella, ja deosyloitu tuote lisättiin välittömästi 5 Ν,Ν-dimetyyliformamidiin liuotettuna sinkki(Il)kloridin 52 ja bentsaldehydin seokseen , jolloin saatiin 75 % yhdistettä 50. Käsittelemällä bentsyylibromidilla faasinsiirto-katalyysin olosuhteissa saatiin kiteisiä yhdisteitä 51 ja 52 saannon ollessa 80 % ja 20 *, tässä järjestyksessä.

10 Käsittelemällä (53) yhdiste 51 natriumboorihydridillä saatiin 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-bentsyyli-/3-D-gluko-pyranosidia) (53) 59 %:n saannolla. Käsittelemällä yhdiste 50 bentsoyylikloridilla pyridiinissä saatiin yhdistettä 54 86 %:n saannolla. Bentsylideeniryhmän pelkistys 15 edellä esitetyllä tavalla (53) antoi tuloseksi 2-bromi etyyli (2,3-di-0-bentsoyyli-6-0-bentsyyli-/£ -D-glukopyrano-sidia (55) 65 %:n saannolla.

Osittain suojattuja 2-bromietyyliglykosideja 53 ja 55 käytettiin aglykoneina hopeatriflaatin edistämissä 20 glykosylaatioissa 2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra- O-asetyyli-edrD-galaktopyranosyyli) -e^-D-galaktopyranosyy-libromidilla (49) (48). Käytettäessä yhdistettä 53 muodostui ^-glykosidia 56 (ja pieni määrä <?<,-glykosidia; ks. jäljempänä) 55 %:n saannolla, kun taas yhdistettä 55 25 käytettäessä muodostui ot1 ja y^-glykosidin seos (61 ja 59) , jossa suhde oli noin 3:1. Katalyyttlsesti hydrogenoimal-la 48,50, yhdiste 59 saatiin yhdistettä 60 100 %:n saannolla, ja käsittelemällä se natriummetoksidin metanoli-liuoksella ja lopuksi asetyloimalla uudelleen saatiin yh-30 diste 58.

Uudelleenkiteytetyn yhdisteen 56 katalyyttinen hydrogenointi etikkahapossa antoi tulokseksi kvantitatiivisella saannolla yhdistettä 57 (emäksisissä olosuhteissa bentsyyliryhmät jäävät koskemattomiksi, kun taas 35 happamien olosuhteiden käyttö mahdollistaa sellaisten suo- jausryhmien poistamisen ilman mitään vaikutusta 2-bromi- 59 7 8 707 etyyliaglykoniin (50). Asetyloitaessa saatiin 69 %:n saannolla 2-bromietyyliglykosidia 58, joka keskeinen valmistettaessa loppuja yhdisteitä (62-69). Tetradeuteroitu yhdiste 73 valmistettiin samalla menetelmällä yhdisteistä 5 70 ja 53 yhdisteiden 71 ja 72 kautta.

Yhdisteessä 58 olevan bromidi-ionin nukleofiilinen korvaaminen käyttäen metyyli-3-merkaptopropionaattia (54) tai oktadekyylitiolia cesiumkarbonaattia sisältävässä Ν,Ν-dimetyyliformamidissa antoi tulokseksi välihaaragly-10 kosidia 62 ja neoglykolipidiä 64 saannon ollessa kummas sakin tapauksessa 87 %. Deasetyloimalla yhdisteet 62 ja 64 saatiin yhdisteitä 63 ja 65 97 %:n ja 88 %:n saannolla. Glykosidi 63 liitettiin naudan seerumialbumiiniin ja Fissurella-suvun hemosyaniiniin käyttäen Inmanin ja 15 Lemieux'n menetelmän (55,56,48/ muunnelmaa (43), jossa Ν,Ν-dimetyyliformamidin tilalla liuottimena oli dimetyy-lisulfoksidi, jolloin saatiin neoglykoproteiineja 68 ja 69, vastaavasti. Katalyyttisesti hydrogenoimalla yhdiste 58 emäksisissä olosuhteissa (48) ja sen jälkeen asetyloi-20 maila saatiin yhdistettä 66 62 %:n sannolla. Deasetyloi malla yhdiste 66 saatiin kvantitatiivisella saannolla yhdistettä 67. Epäpuhtaan yhdisteen 58 käyttö viimeksi mainitussa reaktiosarjassa antoi tulokseksi pienen määrän (alle 5 %) ft-glykosidia (TLC ja ^H-NMR), jota oli muo- 25 dostunut yhdisteen 53 reagoidessa yhdisteen 48 kanssa.

57

Yhdisteen 67 rakenne varmistettiin sokeri- ja metyloin-tianalyysillä (58) .

Kokeellinen osa

Yleismenetelmät olivat sellaisia kuin on selostet-30 tu (50). Tetrametyylisilaania (Me^Si) tai natrium-3- (trimetyylisilyyli)propionaatti-d^:ä (TSP) käytettiin referenssiaineina NMR-spektrejä ajettaessa.

2-bromietyyli (4,6-0-bentsylideeni-/5 -D-glukopyra- nosidi (50)_ 35 Liuos, jossa oli 2-bromietyyli(2,3,4,6-tetra-0- asetyyli-y£ -D-glukopyranosidia (49) (49, 30 g, 66 mmol) 60 78707 lämpimässä metanolissa (300 ml), jäähdytettiin nopeasti, ja sitä käsiteltiin huoneen lämpötilassa natriummetoksi-din metanoliliuoksella (0,1 M, 30 ml) 3 h. Reaktiota seurattiin TLC:n (Si02/ kloroformi-metanoli-vesi-seos 5 65:35:10, alempi faasi). Reaktioseos suodatettiin pyl vään (5x4 cm) läpi, joka sisälsi Duölite 026 (H+)-hartsia, ja liuotin poistettiin. Jäännös (18,6 g) lisättiin pisaroittain (10 Min) N,N-dimetyyliformamidiin (20 ml) liuotettuna ja samalla sekoittaen sinkkikloridin 10 (44 g, 103 mmol) ja bentsaldehydin (48 g, 471 mmol) seok seen. 21 h:n kuluttua lisättiin eetteriä (500 ml) ja jää-vettä (300 ml), ja vesikerros uutettiin eetterillä (2 x 100 ml). Eetteriuuttoliuos pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (2 x 100 ml) ja vedellä (50 ml). Kiteyty-15 misen estämiseksi lisättiin dikloorimetaania. Liuos kuivat tiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin, jolloin saatiin kiteistä yhdistettä 50 (18,1 g, 73%). Kiteyttämällä uudelleen etanolista saatiin ainetta, jolla oli sp. 157-159° ja = -43° (c * 2, CHC13).

20 NMR-tiedot: ^H (CDCl3+D20, Me4Si)$ 7,56-7,34 (5 H), 5,52 (s, 1 H, OjCH-Ph), 4,43 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,32 (dd, 1H, J 11 ja 5 Hz), 4,14 (td, 1 H, J 6 ja li Hz), 3,97-3,34 (8 H). 13C (CDC13 Me4Si) 136,9, 129,3, 128,3 (2 C), 126,3 (2 C), 103,3, 101,9 (C-l), 80,4, 74,4, 25 73,0, 69,9 (CHj), 68,5 (CH2), 66,4, 30,1 (CH2-Br).

Alkuaineanalyysi:

Laskettu G^gH^OgBr:lie: C 48,01; H 5,10 Todettu: C 48,18; H 5,04.

2-bromietyyli(2,3-di-0-bentsyyli)-4,6-0-bentsyli-30 deeni-yfr-D-glukopyranosidi) (51)______

Seosta, jossa oli yhdistettä 50 (4,4 g, 11,7 mmol), bentsyylibromidia (20 ml, 77 mmol), tetrabutyyliammonium-vetysulfaattia (0,5 g) ja natriurahydroksidin vesiliuosta (10 %, 44 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 17 h, 35 seos laimennettiin tolueenilla, pestiin vedellä, kuivat- 61 78707 tiin (Na2S04) ja väkevöitiin. Kromatografinen käsittely (Si02, tolueeni, sitten tolueeni-etyyliasetaatti-seos 19:1 ja lopuksi etyyliasetaatti) pylväässä (5 x 18 cm) antoi tuloseksi yhdisteitä 51 (5,2 g, 80 %) ja 52 (0,9 g, 5 20 %) . 1

Yhdisteen 51 sp. oli 97-98° (etanolista), = -30° (c = 2, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me4Si)<p 7,55 -6,88 (15 H), 5,58 (s, 1 H, 02CH-Ph), 4,98, 4,77 (ABq, 2 H, JAB 11 Hz, CH2Ph), 4,92, 4,81 (ABq, 2 H, JÄfi 11,5 10 Hz, CH2Ph), 4,56 (d, 1 H, J 7,5 Hz, H-l), 4,35 (dd, 1 H, J 10,5 ja 5 Hz) 4,22 (dt, 1 H, J 11 ja 5,5 Hz, CHj-CHj-Br) , 4,01-3,63 (4 H), 3,59-3,35 (4 H), 3,52 (bt, J 6Hz, C^Br) . 13C (CDC13, Me4Si) 138,4, 138,2, 137,2, 129,0, 128,32 (2 C), 128,28 (2 C), 128,23 (4 C), 128,01 (2 C), 127,7, 15 127,6, 126,0 (2 C), 104,1, 101,1 (C-l), 81,9, 81,3, 80,7, 75,4 (CH2), 75,1 (CH2), 70,0 (CH2), 68,7 (CH2), 66,1, 30,0 (CH2Br).

Alkuaineanalyysi:

Laskettu c2gH330gBr:lie: C 62,70; H 5,63 20 Todettu: C 62,94; H 5,62.

Yhdisteen 52 sp. oli 16,5-162,5° (etanoli-etyy-liasetaatti-seoksesta) , ~ "21° (c = 1*5, CHC13) .

NMR-tiedot: XH (CDCl3, Me4Si)£ 7,52-7,18 (10 H), 5,57 (S, 1 H, 02CH-Ph), 4,86 (s, 2 H, CH2-=h), 4,42 (d, 1 H, 25 J 8 Hz, H-l), 4,38 (dd, 1 H, J 10 ja 4,5 Hz), 4,02-3,51 (8 H), 3,31 (bt, 1 H, J 7,5 Hz).

13c (CDC13, Me4Si)«y 138,3, 137,1, 129,0, 128,3 (2 C) , 128,2 (2 C), 127,8 (2 C), 127,6, 126,0 (2 C), 101,5 ja 99,1 (C-l ja CH-Ph), 81,7, 80,5, 77,4, 74,3 (CH2), 30 68,5 (CH2), 68,2, 66,8 (CH2), 66,4.

Alkuaineanalyysi:

Laskettu C22H24°6: lie: C 68,73; H 6,29 Todettu: C 68,58; H 6,33.

35 62 78707 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-bentsyyli-/Ä -D-glukopy- ranosidi) (53)_

Seosta, jossa oli yhdistettä 51 (29,5 g, 53 mmol), natriumsyaaniboorihydridiä (9 g, 143 mmol), molekyyliseu-5 loja (3 A, 30 g) ja tetrahydrofuraania (175 ml), sekoitet tiin, samalla kun siihen lisättiin pisaroittain kloori-vedyllä kyllästettyä eetteriä (225 ml) (53). Lisättiin lisää syaaniboorihydridiä (1 g) ja eetteriliuosta (25 ml). TLC (Si02, tolueeni-etyyliasetaatti-seos 19:1) osoitti 10 yhdisteen 51 kuluneen loppuun. Lisättiin tolueenia (500 ml), ja seos pestiin jäävedellä (250 ml) ja kylmällä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (250 ml) kuivattiin (Na2S0) ja väkevöitiin, jolloin saatiin puoleksi kiteinen jäännös (32 g). Kromatografinen käsittely (Si02, etyyliasetaatin 15 ja iso-oktaanin seos 1:2) pylväässä (10 x 18 cm) antoi tuloseksi yhdistettä 53 (17,5 g, 59 %). Kiteyttämällä uudelleen tolueenin ja iso-oktaanin seoksesta saatiin analyysinäyte, sp. 63-64°, * -18° (c * 1,0, CHCl^).

NMR-tiedot: ΧΗ (CDC13, Me4Si)£ 7,45-7,27 (15 H), 5,03, 20 4,72 (ABq, 2 H, JftB 10,5 Hz, CH3-Ph), 4,95, 4,72 (ABq, 2 H, JAB 11,5 Hz, CH2-Ph), 4,60, 4,57 (ABq, 2 H, JftB 12,0 Hz, CH2~Ph), 4,47 (d, luonnollinen koplaus17, 1 H, 2 75 Hz, H-l), 4,23 (dt, 1 H, J 11 ja 5,5 Hz, CH2-CH2-Br), 3,95-3,39 (10 H). 13C (CDC13, Me4Si)S 138,5, 138,3, 25 137,8, 128,6 (2 C), 128,4 (2 C) , 128,36 (2 C), 128,3 (2 C), 128,0 (2 C), 127,9, 127,7 (2 C), 127,68 (2 C), 103,8 (C-l), 83,8, 81,5, 75,3 (CH2), 74,8 (CH2), 74,2, 73,6 (CH2), 71,2, 70,0 (CH2>, 69,7 (CH2), 30,3 (CH2Br). Alkuaineanalyysi: 30 Laskettu C2gH330gBr:lle: C 62,48; H 5,97

Todettu: C 62,64; H 5,97.

2-bromietyyli(2,3-di-0-bentsoyyli-4,6-0-bentsli- deeni-y^-D-glukopyranosidi) (54)_

Lisättiin pisaroittain (7 min) samalla sekoittaen 35 bentsoyylikloridia (20 ml, 240 mmol) jäähdytettyyn (0°) liuokseen, jossa oli yhdistettä 50 (17 g, 45,3 mmol) pyri- 63 78707 diinissä (85 ml). Tunnin kuluttua lisättiin jäävettä (125 ml), ja seos uutettiin eetteri-dikloorimetaani-seoksella (2:1, 750 ml). Orgaaninen kerros pestiin natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (100 ml) ja kyllästetyl-5 lä NaCl-liuoksella (100 ml), kuivattiin (Na2S04) ja haih dutettiin, jolloin saatiin yhdistettä 54 (27,7 g, 82 %). Kiteyttämällä uudelleentolueeni-etanoli-seoksesta saatiin analyysinäyte, sp. 176-178°, (UJ= -0,1° (c = 1,1, CHC13). NMR-tiedot: ΧΗ (CDC13, Me^i)^ 8,06-7,94 (4 H), 10 7,60-7,20 (11 H), 5,80 (t, 1H, J 9 Hz, H-3), 5,55 (s, 1H, CH-Ph), 5,50 (dd, 1 H, J 9 ja 8 Hz, H-2), 4,88 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,44 (dd, 1 H, J 10 ja 5 Hz, H-5), 4,16 (dt, 1 H, J 11 ja 6 Hz, CH2CH2Br), 4,04-3,65 (4 H), 3,39 (t, 2 H, J 6 Hz, CH2Br). l5C (CDCl3, Me4Si)<J 165,6, 15 165,2, 136,7, 133,2, 133,1, 129,8 (4 C), 129,4, 129,3, 129,1, 128,3 (4 C), 128,2 (2 C), 126,1 (2 C), 101,8 ja 101,5 (C-l ja CH-Ph), 78,7, 72,2, 72,0, 69,8 (CH2), 68,6 (CH2), 66,7, 29,5 (CH2Br).

Alkuaineanalyysi: 20 Laskettu c29H270gBr:lie: C 59,70; H 4,66

Todettu: C 60,08; H 4,80.

2-bromietyyli(2,3-di-0-bentsoyyli-6-0-bentsyyli-/£ - D-glukopyranosidl) (55)______

Seos, jossa oli yhdistettä 54 (26,1 g, 45 mmol), 25 natriumsyaaniboorihydridiä (7 g, 110 mmol), molekyyli- seuloja (4 A, 20 g) ja tetrahydrofuraania (150 ml) käsiteltiin jokseenkin samalla tavalla kuin yhdistettä 53 valmistettaessa, jolloin saatiin yhdistettä 55 (17,1 g, 65 %). Kiteyttämällä uudelleen iso-oktaani-tolueeni-30 seoksesta saatiin analyysinäyte, sp. 78-80°, ~ +53° (c = 1,0, CHC13). NMR-tiedot: XH'(CDCl3, Me4Si)^ 8,04 -7,92 (4 H), 7,57-7,27 (11 H), 5,52-5,37 (2 H), 4,76 (d, luonnollinen koplaus17, 1 H, 2 8 Hz, H-l), 4,65, 4,61 (ABq, 2 H, JftB 12 Hz, CH2~=h), 4,14 (dt, 1 H, J H 35 ja 6 Hz, CH2-CH2-Br), 4,02-3,62 (5 H), 3,40 (bt, 2 H, J = 7, Hz, CH2Br). 13C (CDCl3, Me4Si)S 167,1, 165,3, 64 78707 137.6, 133,4, 133,1, 129,9 (2 C), 129,7 (2 C) , 129,4, 128,9, 128,5 (2 C), 128,4 (2 C), 128,3 (2 C), 127,9, 127,7 (2 C), 101,1 (C-l), 76,5, 74,9, 73,7 (CHj), 71,3, 70.6, 69,7 (CH2), 69,5 (CH2), 29,65 (CH2Br).

5 Alkuaineanalyysi:

Laskettu C2gH2g0gBr:lie: C 59,49; H 4,99 Todettu: C 59,19; H 5,11.

2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-bentsyyli-4-0-^2,3,6-tri-O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-^t-D-10 galaktopyranosyyli)-ft -D-galaktopyranosyyli7·" J* -D-glukopyranosidl) (56)_

Liuos, jossa oli yhdistettä 48 (49) (21 g, 30 mmol) dikloorimetaanissa (70 ml), lisättiin pisaroittain (45 min) samalla sekoittaen liuokseen (-78°, N2), jossa oli yhdis-15 tettä 53 (14 g, 25 mmol), hopeatrifluorimetaanisulfonaat- tia (9 g, 35 mmol) ja tetrametyyliureaa (4,6 g, 39,6 mmol) dikloorimetaanissa (130 ml). 5 tunnin kuluttua seos suodatettiin huoneen lämpötilassa Celite:n läpi, laimennettiin dikloorimetaanilla ja pestiin 1 M suolahapolla ja 20 natriumbikarbonaatin vesiliuoksella ja lopuksi kuivattiin (Na2S0^) ja haihdutettiin. Jäännös (35 g) käsiteltiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatti-iso-öktaani-gradientti 1:1 - 3:2), jolloin saatiin yhdisteitä 48 (2 g) ja 56 (16,5 g). Epäpuhdasta yhdistettä 56 sisältä-25 neen jakeen uusi kromatografinen käsittely tuotti tulok seksi lisää ainetta (1,3 g). Yhdisteen 56 kokonaissaanto oli 17,8 g (70 % yhdisteen 53 reagoineesta määrästä laskettuna). Kiteyttämällä uudelleen abs, etanolista saatiin analyysinäyte, sp. 155-158°, = +58° (c = 1,2, 30 CHC13). NMR-tiedot: ^ (CDClg, Me4Si)£ 7,42-7,20 (15 H), 5,58 (dd, 1 H, J 3 ja < 1 Hz, H-4"), 5,30 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,17 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,11 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2’), 5,03 (d, 1 H, J 11,5 Hz, CH2Ph), 4,94 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,94 (d, 1 H, 35 J 11 Hz, CH2Ph), 4,83 (d, 1 H, J 11,5 Hz, CH2Ph), 4,74 , 78707 (d, 1 H, J 12 Hz, CH2Ph), 4,69 (d, 1 H, J 11 Hz, CH2Ph), 4,67 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,58 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-31), 4,50 (d, 1 H, J 12 Hz, CH2Ph), 4,43 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,59-4,41 (3 H, mm. H-l ja PhCH2), 4,30-4,04 5 (4 H), 3,98-3,36 (12 H), 2,12, 2,07, 2,05, 1,98, 1,95, 1,93 (3 s, kukin 3 H MeCO) . l3C (CDCl-j, Me^i)^ 170,7, 170,6, 170,4, 170,13, 170,1, 169,5, 168,9, 139,3, 138,31, 137,9, 128,5, 128,4, 128,24, 128,16, 127,93, 127,86, 127,64, 127,58, 127,0, 126,9, 103,6 (d, J = 158 Hz, 10 C-l), 100,6 (d, J = 156 Hz, C-l'), 99,8 (d, J = 172 Hz,

Cl") 82,6 81,5, 77,5 (2 C), 75,0 (CH2), 74,9 (CH2), 74,6, 73.6 (CH2), 73,0, 71,7, 69,7 (CH2), 69,3 68,5, 67,8, 67.7 (CH2), 67,3, 67,0, 61,3 (CH2), 60,2 (CH2), 30,2 (CH2Br), 21,0, 20,73, 20,66, 20,5 (MeCO).

15 Alkuaineanalyysi:

Laskettu C55H67023Br:lle: C 56,16; H 5,74 Todettu: C 55,90; H 5,72.

2-bromietyyli(4-0-/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,- 6-tetra-O-asetyyli-^C-D-galaktopyranosyyli) -D- 20 galaktopyranosyy1i7-Λ-D-glukopyranos idl) (57)_

Hydrogenoimalla katalyyttisesti (normaali ilmanpaine, 10 % Pd/C, 0,2 g) yhdistettä 56 (1,05 g, 0,89 mm) etikkahapossa (50 ml) 2 h, suodattamalla ja poistamalla liuotin saatiin yhdistettä 57 (0,81 g, 100 %). Kiteyttä-25 mällä uudelleen metanolista saatiin analyysinäyte, sp.

178-180°, * +77° (c = 1,0, CHC13).

NMR-tiedot: 1H (CDCl3, Me4Si)£ 5,59 (bd, 1 H, J = 3 Hz, H-4"), 5,38 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,24 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 5,22 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, 30 H-2"), 4,97 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,81 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-3'), 4,67 (d, J 8 Hz, Hl'), 4,44 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,57-4,34 (3 H, mm. H-l), 4,30-3,37 (15 H), 2,15, 2,11 (2 s, kukin 6 h; MeCO), 2,08, 2,05, 2,00 (3 s, kukin 3 H, MeCO). 13C (CDCl3, Me4Si) 170,6, 35 170,5 (2 C), 170,4, 170,1, 169,9, 169,1, 102,6, 101,8 (C-l ja C-l'), 99,6 (C-l"), 80,7, 77,1, 74,5, 74,2, 66 78707 73,2, 72,6 (2 C), 69,8, 68,5, 68,3, 67,7, 67,3, 67,2, 62,4, 60,7, 60,4, 30,0 (CHjBr), 20,8, 20,6. Alkuaineanalyys i s

Laskettu :lie: C 45,09; H 5,45 5 Todettu: C 45,22; H 5,22.

2-bromietyyli (2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/"2,3,6-tri-O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-*l-D-galaktopyranosyyli) -/> -D-galaktopyranosyyli7~/^ - D-glukopyranosidi) (58)___ 10 (a) Liuosta, jossa oli yhdistettä 57 (6,65 g, 7,3 mmol) etikkahappoanhydridi-pyridiini-seoksessa (1:1, 132 ml), pidettiin huoneen lämpötilassa 15 h, ja sitten se haihdutettiin tolueenin kanssa. Kiteyttämällä jäännös abs. etanolista saatiin yhdistettä 58 (5,22 g, 69 %), 15 jonka sp. oli 179-181° ja = +45° (c = 1,6, CHC13).

NMR-tiedot: ΧΗ (CDC13, Me4Si)£ 5,59 (bdd, 1 H, J - 3 ja <1 Hz, H-4"), 5,40 (dd, 1 H, J 11 ja 3 HZ, H-3"), 5,22 (t, 1 H, 9 Hz, H-3), 5,18 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,11 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,99 20 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,92 (dd, 1 H, J 9,5 ja 8 Hz, H-2), 4,74 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3*)» 4,56 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,53 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,59-4,39 (5 H), 4,23-4,05 (5 H), 4,02 (bd, 1 H, J ~ 2,5 Hz, H-4»), 3,903,73 (3 H), 3,65 (q, 1 H, J 9,5 ja 2 Hz, H-5), 25 3,46 (bt, 2 H, J^ 6 Hz, CHjBr), 2,14, 2,13, 2,09, 2,07, 2,07, 2,06, 2,05, 1,99 (8 s, kukin 3 H, MeCO).

13C (CDC13, Me4Si)£ 170,7, 170,44 (3 C), 170,39, 170,1, 169,8, 169,6, 169,5, 168,8, 101,1 (d, J 165 Hz, C-l'), 100.7 (d, J 165 Hz, C-l), 99,6 (d, J 172 Hz, C-l"), 30 76,9 (C-4 *), 76,4 (C-4), 72,9 (C-3), 72,8 (C-3»), 72.7 (C-5), 71,8 (C-5»), 71,5 (C-2), 69,8 (0-CH2-CH2), 69,0 (C-2»), 68,8 (C-2"), 67,9 (C-4"), 67,14 (C-3"), 67.07 (C-5"), 62,1 (C-6), 61,3 (C-6'), 60,3 (C-6"), 20,9, 20,86, 20,8, 20,7, 20,6, 20,5.

35 67 78707

Alkuaineanalyysi:

Laskettu £40^55^26^: lie: C 46,56; H 5,37 Todettu: C 46,79; H 5,39.

(b) Hydrogenoimalla katalyyttisesti (normaali il-5 manpaine, 10 % Pd/C, 53 mg) yhdistettä 59 (218 mg, 0,18 mmol) etikkahapossa (12 ml) 1,5 h, suodattamalla ja poistamalla liuotin saatiin kvantitatiivisella saannolla 2-bromietyyli(2,3-di-0-bentsoyyli-4-0-^5,3,6-tri-0-ase-tyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-J-D-galaktopyrano-10 syyli)-^ -D-galaktopyranosyyli,/-^ -D-glukopyranosidia (60). Kiteyttämällä uudelleen metanolista saatiin ana-lyysinäyte, sp. 218-220°, = -69° (c = 0,7, CHC13) .

NMR-tiedot: ΧΗ (CDC13, Me4Si)£ 8,10-7,92 (4 H), 7,60- 7,28 (6 H), 5,72 (t, 1 H, J 9,5 Hz, H-3), 5,59 (bd, 15 1 H, 3 Hz, H-4") , 5,35 (dd, 1 H, J 9,5 ja 8 Hz, H-2), 5,29 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,12 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,98 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 4,87 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,80 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,66 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3'), 4,66 20 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,45 (bt, J 6,5 Hz, H-5”), 4,28-3,79 (8 H), 3,75-3,49 (3 H), 3,48-3,31 (3 H), 3,39 (t, 2 H, J 6,5 Hz, CH2Br), 2,12, 2,07, 2,044, 2,04, 2,01, 1,93, 1,91 (7 s, kukin 3 H, MeCO).

Alkuaineanalyysi: 25 Laskettu :lie: C 51,76; H 5,16

Todettu: C 51,93; H 5,14.

Deasyloimalla natriummetoksidin metanoliliuoksel-la (0,02 M, 20 ml) 24 h, neutraloimalla Duolite C-26 (H ) -hartsilla ja haihduttamalla saatiin jäännös, jota 30 asetyloitiin (etikkahappoanhydridipyridiini-seos 1:1, 50 ml) huoneen lämpötilassa 22 h. Haihduttamalla toluee-nin kanssa saatiin jäännös, joka käsiteltiin kromatogra-fisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1) pylväässä (1 x 14 cm), jolloin saatiin yhdistettä 58 35 (80 mg, 43 % laskettuna yhdisteen 59 pohjalta). Kiteyttä- 68 78707 mällä uudelleen abs. etanolista saatiin puhdasta yhdistettä 58, joka karakterisoitiin sulamispisteen, optisen kääntökyvyn ja ^H-NMR-tietojen avulla.

2-bromietyyli(2,3-di-0-bentsoyyli-6-0-bentsyyli-5 4-0-^5,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0- asetyyli-β¢-D-galaktopyranosyyli) -«l- ja -D-galaktopyranosyyli7~A-D-glukopyranosldi) (61 ja 59) Liuos, jossa oli yhdistettä 48 (49) (2,7 g, 4 mmol) dikloorimetaanissa (10 ml), lisättiin -78°:ssa liuokseen, 10 jossa oli yhdistettä 55 (5,85 g, 10 mmol), hopeatrifluo- rimetaanisulfonaattia (3,08 g, 12 mmol) ja tetrametyy-liureaa (14,0 g, 12 mmol) dikloorimetaanissa (15 ml).

Seos käsiteltiin kuten yhdisteen 56 valmistuksen yhteydessä. Kromatografinen käsittely (Si02, etyyliasetaatin 15 ja iso-oktaanin seos 2:1) antoi tuloseksi yhdistettä 61 (1,59 g, 34 %) ja hitaammin liikkuneen jakeen, joka sisälsi yhdistettä 59 (0,52 g, 11 %). Kiteyttämällä uudelleen yhdiste 59 abs. etanolista saatiin analyysinäyte.

Yhdiste 61 oli amorfista, = -122° (c = 1,3, 20 CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDCl3, Me4Si)£ 7,98-7,84 (4 H), 7,58-7,30 (10 H), 5,73 (t, 1 H, J 9 Hz, H-3), 5,51 (bd, 1 H, 2,5 Hz, HM"), 5,40-5,25 (3 H), 5,19 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,16 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5

Hz, H-2'), 5,02 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,90 25 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,79 (d, 1 H, J<~ 8 Hz, H-l), 4,74, 4,62 (ABq, 2 H, JftB 12,5 Hz, CH2-Ph), 4,50-3,72 (13 H), 3,43 (bt, 2 H, J 7 Hz, CH-Br), 2,12, 2,11, 2,04, ^ 1 'k 2.02, 1,97, 1,96,1,75 (7 s, kukin 3 H, MeCO), C (CDC13, Me4Si)$ 170,5, 170,4, 170,2, 170,15, 170,1, 169,9, 30 169,5, 165,6, 165,2, 137,8, 133,4, 133,1, 129,7 (2 C), 129,6 (2 C), 129,2, 129,0, 128,5 (4 C), 128,2 (2 C),

127.8, 127,6 (2 C), 100,8 (d, J 164 Hz, C-l), 99,5 (d, J

172 Hz, C-l"), 97,0 (d, J 175 Hz, C-l'), 78,1, 74,9, 74.8, 74,1, 73,3 (CH2), 71,8, 69,5 (CH2), 69,2, 68,8, 35 68,7 (CH2), 68,3, 67,7, 67,3, 66,8, 66,3, 62,3 (CH2), 60,3 (CH2), 29,6 (CH2Br), 20,9, 20,7, 20,67, 20,6 (3 C), 20.2.

69 78707

Yhdisteen 59 sp. oli 189-192° ja = -65° (c = 0,5, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me4Si)$ 8,07-7,91 (4 H), 7,58-7,25 (11 H), 5,65 (t, 1 H, J 9,5 Hz, H-3), 5,58 (bd, 1 H, J 3 Hz, H-4"), 5,41 (dd, 1 H, J 9,5 ja 8 5 Hz, H-2), 5,24 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,06 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,04 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,85 (d, J 3,5 Hz, H-l"), 4,78, 4,56 (ABq, 2 H, JftB, 2 H, JftB 12 Hz, CH2-Ph), 4,73 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 4,52 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 10 4,49 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,41 (bt, 1 H, J 7 Hz, H-5"), 4,30-4,00 (5 H), 3,96-3,54 (6 H), 3,50-3,30, (3 H), 3,41 (bt, 2 H, J 7 Hz, CH2Br), 2,11, 2,07, 2,04, 2.02, 1,97, 1,93, 1,88 (7 s, kukin 3H, MeCO). 13C (CDC13, Me4Si)£ 170,7, 170,6, 170,5, 170,1, 170,0, 169,4, 15 168,6, 165,3, 164,9, 137,8, 133,1, 132,7, 129,8-127,9, 101.2, 100,7 (2 d, J 161 ja 160 Hz, C-l ja C-l'), 99,4 (d, J 172 Hz, C-l"), 77,2, 77,17, 76,0, 75,0, 73,8, 73,1, 72,9, 71,7, 71,6, 69,5, 68,8, 68,7, 67,8, 67,3, 66,9, 60,8, 60,3, 29,6 (CHjBr), 21,0-20,5.

20 Alkuaineanalyysi:

Laskettu c33Hg3023Br:lie C 54,86; H 5,27 Todettu: C 54,84; H 5,28.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli^,3,6-tri-0-asetyy11-4-0-/¾,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-25 tetra-O-asetyyli-JrD-galaktopyranosyyli)-/* -D- galaktopyranosyylj7-,/fr-D-qlukopyranosldi) (62)

Seosta, jossa oli yhdistettä 58 (3,09 g, 3 mmol), metyyli-3-merkaptopropionaattia (54) (0,72 g, 6 mmol), cesiumkarbonaattia (1,2 g, 3,7 mmol) ja N,N-dimetyyliform-30 amidia (15 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1,5 h, ja sitten se uutettiin dikloorimetaanilla (100 ml) ja vedellä (25 ml). Orgaaninen kerros pestiin vedellä (20 ml), kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Kromatografinen käsittely (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1) 35 antoi tulokseksi yhdistettä 62 (2,81 g, 87 %) amorfisena 70 7 8 7 0 7 kiinteänä aineena, “ -36° (c = 1,1, CHCl^)· NMR-tiedot: 1H (CDCl3, Me4Si)S 5,59 (dd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4”), 5,40 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,21 (t, 1 H, J 9 Hz, H-3), 5,18 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, 5 H-2"9, 5,11 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 499 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,90 (dd, 1 H, J 9,5 ja 8 Hz, H-2), 4,73 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,53 (d, 2 H, J 8

Hz, H-l ja H-l'), 3,71 (s, 3 H, MeO), 2,81 ja 2,62 (2 bt, kukin 2 H, J- 7 Hz, S-CH2“CH2C0) , 2,71 (t, 2 H, 10 J 7 Hz, CH2-S), 2,14, 2,13, 2,09, 2,08, (4 s, kukin 3H), 2,07 (s, 6 H), 2,06, 2,06, 2,05, 1,99 (4 s, kukin 3 H).

13c (CDC13, Me4Si)«£ 172,1, 170,5, 170,3 (3 C) , 170,2, 169,9, 169,5, 169,4, 169,3, 168,7, 100,9, 100,4 (2 d, J 164 Hz, C-l ja C-l'), 99,4 (d, J 174 Hz, C-l"), 76,8, 15 76,2, 72,8, 72,6, 72,4, 71,6, 71,4, 69,5 (CH2), 68,8, 68,6, 67,7, 66,9, 66,88, 62,0 (CH2), 61,2 (CH2), 60,1 (CH2), 51,6 (MeO), 34,5 (CH2), 31,2 (CH2), 27,1 (CH2), 20,8, 20,7, 20,6, 20,54 (2 C), 20,5 (2 C), 20,47, 20,4, 20,3.

20 2- (2-metoksikarbonyylietyylitio) etyyli^l-O-^-O- (A-D-galaktopyranosyyli} -/V-D-galaktopyranosyy-D-glukopyranosidi) (63)

Liuosta, jossa oli yhdistettä 62 (1,07 g, 1,0 mmol) natriummetoksidin metanoliliuoksessa (0,003 M, 40 ml), 25 pidettiin huoneen lämpötilassa 42 h. Reaktiota seurat tiin TLC:n (Si02, kloroformi-metanolivesi-seos 65:35:10, alempi faasi) avulla. Kiteinen yhdiste 63 erotettiin suodattamalla, pestiin metanolilla ja kuivattiin, jolloin saatiin puhdasta yhdistettä 63 (412 mg). Suodos neutra-30 loitiin duolite C-26 (N+)-hartsilla ja liuotin poistet tiin. Jäännös kiteytettiin metanolista, jolloin saatiin lisää yhdistettä 63 (182 mg) neulamaisina kiteinä (yhdisteen 63 kokonaissaanto 594 mg, 97 %), sp. 115-118°, = +54° (c = 0,8, vesi). NMR-tiedot: H (DMS0-dg, 35 50°, D20 lisätty, Me4Si)S 4,82 4,29, 4,26 (3 d, kukin 1 H, 7i 78707 J 3,5, 7 ja 8 Hz, H-l", H-l, H-l'), 3,62 (s, 3 H, MeO), 13C (D20, TSP)£ 178,0, 106,0, 104,8 (2 d, J 163 ja 160 Hz, C-l, C-l'), 103,0 (d, J 170 Hz, C-l"), 81,3, 80,1, 78,2, 77,6, 77,1, 75,6, 74,9, 73,6, 73,5, 71,8, 71,7 5 (CH2), 71,66, 71,3, 63,2 (CH2>, 63,1 (CH2), 62,8 (CH2>, 55,0 (MeO), 36,9 (CH2), 33,5 (CH2), 29,2 (CH2). Alkuaineanalyysi:

Laskettu C^H^O^gS: lie: C 44,30; H 6,50 Todettu: C 43,41; H 6,71.

10 2-(oktadekyylitio)etyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4- 0-^2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-ei-D-galaktopyranosyyli) -A -D-galaktopyra- nosyylj7~A -D-qlukopyranosidi) (641_

Seosta, jossa oli yhdistettä 58 (650 mg, 0,63 mmol), 15 oktadekyylitiolia (360 mg, 1,26 mmol), cesiumkarbonaat- tia (250 mg, 0,77 mmol) ja N,N-dimetyyliformamidia (3 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 78 h. Reaktiota seurattiin TLC:n (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:1) avulla. Seos laimennettiin dikloorimetaanilla (50 ml), 20 pestiin vedellä (2 x 25 ml), kuivattiin (Na2S0^) ja haih dutettiin. Käsittelemällä kromatografisesti (Si02, tolu-eeni ja tolueeni-etyyliasetaatti-seos 1:1) pylväässä (5 x 18 cm) saatiin amorfista yhdistettä 64 (677 mg, 87 %), = +33° (c = 1,0, CHClg).

25 NMR-tiedot: 3H (CDCI3, Me^i)^ 5,59 (dd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4"), 5,40 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz. H-3"). 5,22 (t, J - 9 Hz, H-3), 5,18 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,11 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,99 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,90 (dd, 1 H, J 9,5 ja 8 Hz, H-2), 4,73 (dd, 30 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,52 (d. 2 H. J 8 Hz, H-l ia H-l'), 4,58-4,39 (5 H, mm. H-l ia H-l'), 4-25-3,48 (10 Hl, 2-68 2,51 (2 t, kukin 2 H, J 7 Hz CH?-S-CH2), 2,13, 2,12, 2,08, 2,08, 2,07, 2,07, 2,06, 2,054, 2,049, 1,99 (10 s, kukin 3 H, MeCO), 1,65-1,02 (32 H), 0,88 35 (t, 3 H, J 6,5 Hz, CH3-CH2), 13C (CDClg, Me4Si)$ 170,7, 72 78707 170.5 (3 C), 170,1, 169,7, 169,6, 169,5, 168,9, 101,1, 100.6 (2 d, J 164 ja 162 Hz, C-l, C-l'), 99,6 (d, J 175 Hz, C-l"), 76,9, 76,5, 73,1, 72,8, 72,6, 71,8, 71,6, 69,8 (CH2), 68,9, 68,8, 67,9, 67,1, 67,0, 62,2 (CH2), 5 61,3 (CH2), 60,3 (CH2), 32,06-22,7 (CH2>, 21,0-20,5 (CH3C0), 14,1 (ch3).

2-(oktadekyylitio)etyyli(4-0- ^4-0- (,4-D-galaktopy-ranosyyli) “A" D-galaktopyranosyyli7-/£ -glukopyra- nosidi) (65)___ 10 Liuosta, jossa oli yhdistettä 64 (1,0 g, 0,81 mmol) natriummetoksidin metanoliuoksessa (0,003 M, 100 ml), pidettiin huoneen lämpötilassa 24 h, ja sitten se neutraloitiin Duolite C-26 (H+) -hartsilla. Liuotin poistettiin, ja jäännös liuotettiin veteen (300 ml) ja kylmä-15 kuivattiin, jolloin saatiin yhdistettä 65 (580 mg, 88 %), - +42° (c = 0,7, dimetyylisulfoksidi).

NMR-tiedot: ΧΗ (DCSO-dg, 50°, D20 lisätty, Me4Si)£ 4,8p (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,27, 4,24 (2 d, kukin 1 H, J 7 ja 8 Hz, H-l ja H-l'), 2,67, 2,52 (2 t, kukin 2 H, 20 J 7,5 Hz, CH2-S-CH2), 0,86 (t, 3 H, J 6,5 Hz, Me).

13C (CDC13-CD30D 1:5)<£ 105,2, 104,1 (2 d, J 162 Hz, C-l, c-l·), 102,6 (d, J 172 Hz, C-l"), 81,1, 80,0, 76.3 (3 C), 74,6 (2 C), 72,9, 72,5, 71,1, 70,9, 70,4, 70.3 (CH2), 62,7 (CH2), 62,0 (CH2), 61,3 (CH2), 33,2-29,7 25 (CH2), 23,5 (CH2), 14,4 (CH3>.

Etyyli-(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/5,3,6-tri-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-o£-D-galaktopyranosyyli) -y^-D-galaktopyranosyyli/-^- D-glukopyranosidi) (66)_______ 30 Liuosta, jossa oli yhdistettä 58 (0,52 g, 0,5 mmol) natriummetoksidin metanoliuoksessa (0,007 M, 40 ml), pidettiin huoneen lämpötilassa 2 h, ja siihen lisättiin natriumhydroksidia (95 mg) vedessä (2 ml). Seosta hydro-genoitiin (normaali ilmanpaine, 10 % Pd/C, 100 mg) 100 min, 35 suodatettiin, neutraloitiin 1 M suolahapolla ja poistet- 73 78 707 tiin liuotin. Jäännöstä asetyloitiin (etikkahappoanhydri-dipyridiini-seos 1:1, 100 ml) huoneen lämpötilassa 17 h, ja sitten se haihdutettiin tolueenin kanssa. Jäännös uutettiin dikloorimetaanilla (100 ml) ja vedellä (25 ml), 5 ja orgaanen kerros kuivattiin (Na2S0^) ja haihdutettiin.

Kromatografinen käsittely (Si02» etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1) pylväässä (5 x 18 cm) antoi tulokseksi amorfista yhdistettä 66 (300 mg, 62 %), = +41° (c = 1,0, CHC13). NMR-tiedot: lH (CDC13, Me4Si)<£ 5,91 10 (d, 1 H, J 3 Hz, H-4"), 5,40 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,21 (t, 1 H, J 9 Hz, H-3), 5,18 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,11 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,99 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,88 (dd, 1 H, J 9 ja 8 Hz, H-2), 4,73 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,56-4,38 15 (5 H, mm. H-l ja H-l'), 4,23-4,03 (4 H), 4,02 (d, 1 H, J 2,5 Hz, H-4'), 3,98-3,70 (3 H), 3,69-3,46 (2 H), 2,14-1,98 (MeCO), 1,19 (t, 3 H, J 7 Hz, C^-C^) .

13C (CDC13, Me4Si)^ 170,4, 170,3 (4 C), 169,9, 169,6, 169,5, 169,4, 168,7, 100,9, 100,1 (2 d, J 160 ja 164 20 Hz, C-l, C-l'), 99,4 (d, J 172 Hz, C-l"), 76,8, 76,3, 73,0, 72,6, 72,3, 71,6 (2 C), 68,8, 68,6, 67,7, 66,9, 66,9, 65,4 (CH2), 62,1 (CH2>' 61'2 <CH2)' 60,1 <CH2) , 20.8, 20,7, 20,54 (3 C), 20,5 (2 C), 20,46, 20,4, 20,3, 14.9.

25 Etyyli (4-0-,^-0- («Λ-D-galaktopyranosyyli) -/*-D- gal aktopyranosyy 11,7-/^-D-glukopyranosidi) (67) Liuosta, jossa oli yhdistettä 66 (440 mg, 0,46 mmol) natriummetoksidin metanoliliuoksessa (0,005 M, 40 ml), pidettiin huoneen lämpötilassa 18 h, sitten se neutraloi-30 tiin Duolite C-26 (H+)-hartsilla ja liuotin poistettiin.

Jäännös liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin yhdistettä 67 (245 mg, 100 %), = +71° (c = 0,5, vesi). NMR-tiedot: ^H (DMSO-dg, 50°, lisätty, Me4Si)S 4,81 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,28, 4,20 (d, 35 kukin 1 H, J 7 ja 8 Hz, H-l ja H-l'), 1,14 (t, 3 H, J 7 74 78707

Hz, CH3-CH2). 13C (D20, TSP)S 106,1, 104,5, 103,2 (C-l, 1', 1"), 81,5, 80,2, 78,3, 77,7, 77,3, 75,8, 75,0, 73,7, 73,6, 72,0, 7p,8, 71,4, 69,1 (CH2), 6,3,3 (CH2), 63,2 (CH^), 62,9 (CH2), 17,1.

5 Sokeri-3 ja metylointianalyysi3** täsmäsivät ole tetun rakenteen kanssa.

Neoglykoproteiini 68 (vrt. viite 43)

Liuoksen, jossa oli yhdistettä 63 (44 mg, 0,07 mmol) ja hydratsiinihydraattia (85 %, 0,25 mmol) etanolissa 10 (2 ml), annettiin seisoa yön yli, haihdutettiin, liuo tettiin jäännös veteen ja kylmäkuivattiin. Syntynyt hyd-ratsidi liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (1 ml), sen jälkeen lisättiin kloorivetyä dioksaani-sa (4 M, 105^,ul) ja t-butyylinitriittiä (18 ^ul, 0,15 mmol) dimetyyli-15 sulfoksidissa (0,1 ml). Seosta sekoitettiin huoneen läm pötilassa 30 min, ja lisättiin sulfamiinihappoa (10 mg, 0,11 mmol) dimetyylisulfoksidissa (0,1 ml). 15 minin kuluttua seos lisättiin pisaroittaan ja samalla sekoittaen liuokseen, josea oli naudan seerumialbumiinia (BSA, 65 20 mg, 1 ^umol) natriumtetraboraatti-kalihmbikarbonaatti- puskuriliuoksessa (2,5 ml, 0,08 M Na2B^0^ ja 0,35 M KHCO^). pH pidettiin välillä 9,0-9,3 lisäämällä natriumhydroksi-diliuosta (IM). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 16 h, dialysoitiin (H20, 72 h) ja kylmäkuivattiin, 25 jolloin saatiin 68. Sitoutumisaste (hapteenimolekyylien lukumäärä proteiinimolekyyliä kohden) oli 14, joka määritettiin fenoli-rikkihappo-menetelmällä (60). Käytettäessä 0,35 mmol yhdistettä 63 ja 1 ^umol BSA:a sitoutumisaste oli 43.

30 Neoglykoproteiini 69 - Noudatettiin edellä esi tettyä menettelytapaa käyttäen yhdistettä 63 (114 mg, 0,18 mmol) ja proteiinina Fissurellasuvun kotilon hemo-syaniinia (KLH, 30 mg, 0,034 y,umol) . Näin saatiin 69, jossa sitoutumisaste oli 480, joka määritettiin samalla 35 tavalla kuin edellä.

75 78707 2,3,6-tri-O-asetyyli-6,6-dideutero-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-6,6-dideutero-el-D-galaktopyrano- syyli) -JL-P-galaktopyranosyyli-l-bromidi (70)_

Valmistettiin 1,2,3,6-tetra-0-asetyyli-6,6-di-5 deutero-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-6,6-dideutero-o£- D-galaktopyranosyyli) -ο^-D-galaktopyranoosista ^valmistettu "digalakturonihaposta" xH-yhdisteen yhteydessä kuvatulla (47) tavalla, paitsi että pelkistysvaiheessa käytettiin natriumboorideuteridia. Sp. 153-155°.

10 = +138° (c = 0,9, CHC13). NMR-tiedot olivat odo- tettuja.y Samalla menetelmällä kuin yhdiste 48 ja käytettiin suoraan seuraavassa vaiheessa.

2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-bentsyyli-4-0-^2,3,6-tri-0-asetyyli-6,6-dideutero-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-15 asetyy] i-6,6-dideutero-o4-D-galaktopyranosyyli) -tb D-galaktopyranosyyli^-/*-D-glukopyranosidi) (71) Valmistettiin yhdisteistä 70 ja 53 yhdisteen 56 yhteydessä kuvatulla tavalla. Yhdisteen 71 sp. oli 155-157°, = +58° (c = 0,7, CHC13) ja NMR-tiedot odotettuja.

20 2-bromietyyli(4—0—^2,3,6-tri-0-asetyyli-6,6-di- deutero-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-6,6-dideute-ro-ei-D-galaktopyranosyyli) -/> -D-galaktopyranosyy- li7-/^-D-glukopyranosidi) (72)_

Valmistettiin yhdisteestä 71 kuten on kuvattu 25 yhdisteen 57 yhteydessä. Yhdisteen 72 sp. oli 177-179°, O Ί = +78° (c = 0,5, CHC13) ja NMR-tiedot odotettuja. 2-bromietyyli(2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-^2,3,6-tri-0-asetyyli-6,6-dideutero-4-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-6,6-dideutero-jC-D-galaktopyranosyyli) -f% -30 D-galaktopyranosyyli7-/fr-D-glukopyranosidi) (73)

Valmistettiin yhdisteestä 72 yhdisteen 58 yhteydessä kuvatulla tavalla. Yhdisteen 73 sp. oli 181-183°, = +44° (c = 0,9, CHC13) ja NMR-tiedot odotettuja.

76 78707

Esimerkki 49 2-bromietyyliglykosideja. Synteesi ihmisen virtsasta löydetyn tetrasakkaridin välihaara-, lipidi-ja etyyliglykosidien pullulaanista; neoglykopro- 5 teiinlen valmistus_

Yhteenveto esimerkistä

Pullulaanin entsymaattinen hydrolyysi ja sitä seurannut asetylointi ja kromatografinen käsittely antoivat tulokseksi «C-D-Glcp- (1—>6) -o^-D-Glcp- (1—>4) -^,-D-10 Glcp-(1—>4)-D-Glcp:ä täydellisesti asetyloituneessa muodossa. Käsittelemällä 2-bromietanolilla ja boori-trifluoridieteraatilla dikloorimetaanissa saatiin vastaava 2-bromietyyliglykosidi, joka muutettiin välihaaragly-kosideiksi metyyli-3-merkaptopropionaatilla ja metyyli-15 11-merkaptoundekanoaatilla, neoglykolipidiksi oktadekaa- nitiolilla ja etyyliglykosidiksi bromi-hiili-sidoksen hydrogenolyysillä. Merkaptopropionaatilla saatu välihaara-glykosidi liitettiin naudan seerumialbumiiniin (BSA) ja Fissurella-suvun kotilon hemosyaniiniin (KLH), jolloin 20 saatiin vastaavia neoglykoproteiineja.

Johdanto

Tetrasakkaridia o£-D-Glcp- (1—>6) -oi-D-Glcp- (1—>4) - -et-D-Glcp-(1—>4)-D-Glc (74) erittyy tavallisesti ihmisen 6 2 virtsassa . Lisääntynyttä eritystä havaitaan potilailla, 25 joilla on tyypin II ja tyypin II glykogenoosi (63),

Duchennen lihasdystrofiassa (64) ja normaalin raskauden aikana (65). Tetrasakkaridin 74 nopea toteaminen voidaan tehdä radioimmunologisella määrityksellä (66) käyttäen vasta-aineita, jotka on muodostettu neoglykoproteiinia 30 vastaan, joka saatiin tetrasakkaridin 74 (eristetty virt sasta (62) pelkistävällä aminoinnilla p-aminofenyylietyyli-amiinia käyttäen ja liittämällä se Sen jälkeen Fissurella-suvun kotilon hemosyaniiniin (KLH) ja naudan seerumi-albumiiniin (BSA).

35 77 78707 vOR RO—-o ΛαΧοΓ^ο βθΛ^\ <*« 5 0-γ\—0 ÄOöTi

Ο'^Τ*^'—O RChOR^-OR

74 Is R = H

10 75 2: R = Ac Kuva 8

Koska pelkistävä aminointi muuttaa tetrasakkari-din 74 pelkistyvän pään glusitolijohdannaiseksi, muodostui kiinnostavaksi valmistaa välihaaraglykosidi, jonka 15 kaikki neljä glukoosiyksikköä olisivat koskemattomia.

Me selostamme nyt tetrasakkaridin 74 valmistusta ja sen muuttamista vastaavan 2-bromietyyliglykosidin 76 kautta erilaisiksi johdannaisiksi (77-85), jotka ovat arvokkaita vasta-aineiden valmistuksessa ja arvioinnissa (kuva 8).

20 Tulokset ja johtopäätökset

Pullulaanin (68) entsymaattinen hydrolyysi (67) Ψ -amylaasi ja pullulanaasi), sitä seurannut raakatuot-teen asetylointi ja käsittely kromatografisesti adosr-benttina silikageeli antoivat tulokseksi yhdistettä 75 25 kokonaissaannon ollessa 12 % (©O- ja /J-anomeerin suhde noin 1:1). Yhdisteen 74 rakenne varmistettiin metylointi-analyysillä (63) ja vertamalla massaspektritietoja autenttisen aineen tietoihin (63). Lisää tukea rakenteelle saatiin yhdisteiden 75-83 NMR-spektreistä (ks. kokeelli-30 nen osa). Tämä vahvisti myös yhdisteen 74 anomeerisen konfiguraation sellaiseksi kuin Hallgren et ai. ovat esittäneet (62).

2-bromietyyliglykosidi ^6 valmistettiin muodostamalla booritrifluoridieteraatin indusoimana yhdisteen 35 75 U,- ja y^-anomeerin seoksesta glykosidi 2-bromieta- nolilla dikloorimetaanissa. Näin saatiin ^-glykosidi? 78 7 8707 οΛ-anomeeria ei reaktioseoksesta voitu todeta. Käsittelemällä yhdistettä 76 metyyli-3-merkaptopropionaatilla, metyyli-ll-merkaptoundekanoaatilla (88), oktadekyylitio-lilla ja vedyllä katalyyttinä Pd/C saatiin välihaaragly-5 kosideja 77 ja 78, neoglykolipidiä 79 ja etyyliglykosi- dia 80, vastaavasti. Deasetyloimalla yhdisteet 77, 78 ja 79 saatiin yhdisteet 81, 82 ja 83. Nämä muutokset ovat analogisia aikaisemmin kuvattujen kanssa (61, 70).

Neoglykoproteiinit 84 ja 85 valmistettiin liittä-10 mällä yhdiste 81 BSA:iin ja KLHiiin. Käytettiin Inma- nin (71) ja Lemieux'n (72) menetelmän muunnelmaa (ks. kokeellinen osa), joSSä Ν,Ν-dimetyyliformamidi korvattiin dimetyylisulfoksidilla, koska yhdiste 81 liukenee huonosti edelliseen liuottimeen. Yhdisteen 81 sitoutumis-15 aste (hapteenimolekyylien lukumäärä proteiinimolekyyliä kohden) BSA:iin oli 20 ja KLH:iin 245.

Pullulaani -+ 1 2 20 76 3; R - Ac, R' = Br mj 9 RO~~77 4: R - Ac, R* *= S^COOMe Ä£>o^\ 78 5: R - Ac, R' - SAAAAVCOOMe

0^ 79 6: R - Ac. R' - SWWWAA

BO-L^i „ 80 _J: R . H, R' - H

25 OR I /OR

81 £: R “ H, R' «= S'VCOOMe *°'θΐΓή /OR 82 R “ H* R1 e S ΛΑΑΑΛ/COOMe 83 19= R * ».

0R 84 11: R - H, R1 - SCONH - RSA

85 12: R - H, R' « S-V CONH -lOH 30

Kuva 9 79 787 07

Kokeellinen osa

Pullulaani valmistettiin kuvatulla tavalla (68) ja puhdistettiin saostamalla kahdesti vedestä lisäämällä isopropanolia (200 g pullulaania, 4 1 vettä ja 13 1 iso-5 propanolia). Pullulanaasia ja /J -amylaasia on myytävänä (Sigma Chemical Company). Optiset kääntökyvyt saatiin käyttäen Perkin-Elmer 241 -polarimetriä. NMR-spektrit ajettiin Varian KL-200 -spektrometrillä referensSiaineena tetrametyylisilaani (TMS) tai natrium-3-(trimetyylisi-10 lyyli)propionaatti-d^ (TSP). NMR-siirtymät perustuvat kaksoisresonanssiin ja INEPT (73)-kokeisiin.

4-0-^*4-0-/*6-0- (otrD-glukopyranosyyli) -«><-D-glukopy-ranosyyli^-^-D-glukopyranosyyli^-D-glukoosi (74) Pullulaani (68) (100 g) liuotettiin veteen (1 1) 15 kuumentaen ja lisättiin liuokseen, jossa oli etikkahappoa (n. 15 ml) ja natriumasetaattia (41 g) vedessä (5 1) liuoksen pH säädettiin arvoon 5, ja lisättiin pullulanaasi ja -amylaasi (200 ja 200000 yksikköä, vastaavasti). Reaktioseosta sekoitettiin 37°:ssa 24 h (TLC: Si02# 20 asetonin, isopropanolin ja 0,1 M maitohapon seos 2:2:1), ja sen jälkeen sitä kuumennettiin 120°:ssa 20 min (autoklaavi). Liuos väkevöitiin (lopputilavuus 1,5 1) ja käsiteltiin Duolite C-26 (H+) -ioninvaihtohartsilla (0,5 1). Hartsi pestiin vedellä, ja yhdistetyt vesiliuokset (n 4 1) 25 ultrasuodatettiin (Millipore PSAC 14205 NMWL 1000), jol loin saatiin väritön liuos. Kylmäkuivauksen jälkeen saatiin yhdistettä 74 (72 g), joka sisälsi epäpuhtautena glukoosia, maltoosia ja maltorioosia. Puhdasta yhdistettä 74 saatiin käsittelemällä (75) (1,0 g) natriumme-30 toksidin metanoliliuoksella (50 ml, noin 1 mg;sta nat riumia) huoneen lämpötilassa seuraten reaktiota samalla TLC:n (Si02, kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10, alempi faasi) avulla. 24 h:n kuluttua reaktioseos neutraloitiin kuivalla Duolite H+-hartsilla, suodatettiin, 35 haihdutettiin ja käsiteltiin kromatografisesti (Waters

Preppak-500/C^gjvesi), jolloin saatiin yhdistettä 74 so 78707 (337 mg, 63 %, puhtausaste yli 99,5 % HPLCrn perusteella). = +165° (c = 0,8, vesi); kirjallisuudessa^ = +179° (c = 1,14, vesi). NMR-tiedot: H (D20, TSP)£ 5,40, 5,38 (2d, kukin 1 H, J 3,8 ja 3,5 Hz, H-l' 5 ja H-l"), 5,26 (d, ~ 0,3 H, J 3,7 Hz, H-l), 4,99 (d, 1 H, J 3,7 Hz, H-l"'), 4,68 (d, - 0,7 H, J 7,9 Hz, H-l). 13C (D20, TSP)£ 102,6, 102,2, 100,8 (C-l', C-l", C-l'"), 98,5, 94,7 (C-l), 79,9, 79,8, 79,6, 78,9, 77,3, 76,7, 76,0, 75,97, 75,8, 74,7, 74,6, 74,4, 74,3, 74,2, 74,1, 10 73,9, 72,7, 72,3, 72,1, 68,6, 63,4, 63,3, 63,2.

Metylointianalyysi (63) vahvisti yhdisteen 74 rakenteen.

1,2,3,6-tetra-0-asetyyl.i-4-0-^2,3,6-tri-0-asetyy-li-4-0-^*2,3,4-tri-Ö-asetyyli-6-0- (2,3,4,6-tetra-15 O-asetyyli-oi-D-glukopyranosyyli) -o<-D-glukopyrano- syyli.7-^.-D-glukopyranosyyli^-ft -D-glukopyranoo- si (75)_

Yhdiste 74 (63,7 g, ks. edellä) liuotettiin etik-kahappoanhydridipyridiini-seokseen (1:2, 450 ml) ja jä-20 tettiin huoneen lämpötilaan 15 h:ksi. Seos haihdutet tiin tolueenin kanssa, ja asetylointitoimenpide toistettiin kahdesti. Jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin ja pestiin kahdesti suolahapolla (1 M) ja kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kuivaus (Na2S0^) ja 25 haihdutus antoivat tulokseksi jäännöksen (112,5 g), joka käsiteltiin kromatografisesti adsorbenttina silikageeli (etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:2), jolloin saatiin Yhdistettä 75 (*<r ja /^-anomeerin seos, 20,0 g, 12 % pullulaanin määrään pohjautuen laskettuna). -75:llä 30 (puhtausaste yli 98 %) oli = 114° (c = 0,2, CHCl^)· NMR-teidot: 1H (CDC13, Me4Si)£ 6,25, 5,75 (2d, kukin^ 0,5 H, J 3,6 ja 8,0 Hz, H-l). 13C (CDCl3, Me4Si)$ 95,8, 95,8, 95,2 (C-l', C-l", C-l"'), 91,2 (C-l), 75,0, 73,5, 73,4, 73,0, 72,8, 72,6, 72,0, 7],7, 71,6, 70,9, 70,7, 35 70,4, 70,1, 69,9, 69,7, 69,4, 69,3, 69,0, 68,4, 67,4, 65,3, 62,8, 62,7, 62,7, 61,8, 20,9-20,3.

81 78707 2-bromietyyli/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/S,3,4-tri-0-asetyyli-6-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli- -D-glukopyranosyyli) -t»£-D-glukopyranosyyl D-glukopyranosyyliy-/^-D-glukopyranosidi/ (76)_ 5 Yhdiste 75 (12,54 g, 9,85 mmol) ja 2-bromietanoli (2,5 g, 1,4 ml, 20 mmol) liuotettiin dikloorimetaaniin (50 ml) lisättiin pisaroittain huoneen lämpötilassa boori-trifluoridieteraattia (7,1 g, 6,3 ml, 50 mmol), ja seosta sekoitettiin kunnes reaktio oli lopussa (48 h, TLC: Si02f 10 etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:1). Seos pestiin (vesi, kyllästetty natriumbikarbonaatti), kuivattiin (Na2S0^) ja haihdutettiin. Jäännös käsiteltiin kromato-grafisesti (S1O2, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin-seos 3:2), jolloin saatiin yhdistettä 76 (4,95 g, 63 % muut-15 tuneeseen yhdisteen 75 määrään pohjautuen) ja reagoimatonta yhdistettä 75 (5,05 g). Yhdisteellä 76 oli = + 109° (c = 1,3, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me^i)*? 5,35, 5,28, 5,18 (3 d, kukin 1 H, J 3,8, 2,8 ja 3,6 Hz, H-l', H-l" ja H-l'"), 4,60 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 3,42-3,49 20 (m, 2 H, CH2-Br). 13C (CDC13, TMS)£ 170,6-169,3 (CO), 100,4 (C-l), 95,9, 95,7, 95,3 (Cl', C-l", C-l"’), 77,3, 75.0, 73,7, 72,7, 72,2, 71,9, 71,8, 70,7, 70,4, 70,1, 69,9, 69,8, 69,7, 69,4, 69,3, 68,9, 68,5, 68,4, 67,4, 63.0, 61,8, 29,9, 21,1-20,6.

25 2-(metoksikarbonyylietyylitio)etyyli/2,3,6-tri-0-asetyyli- 4-0-/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/2,3,4-tri-0-asetyyli-6-0-(2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-oC-D-glukopyranosyyli)-JL-D- glukopyranosyyl i^-dC-D-glukopyranosyyli/-/^ -D-glukopyra- nosidi7 (77)__ 30 Seosta, jossa oli yhdistettä 76 (4,00 g, 3,0 mmol) metyyli-3-merkaptopropionaattia (0,546 g, 0,49 ml, 4,5 mmol), cesiumkarbonaattia (1,17 g, 3,6 mmol) ja N,N-di-metyyliformamidia (25 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa, kunnes yhdiste 76 oli kulunut (7 h, TLC: Si02» 35 etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 4:1), liuotin pois- m 78707 tettiin, ja jäännös käsiteltiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 3:1), jolloin saatiin yhdistettä 77 (3,22 g, 78 %). = +102° (c = 1,0, CHC13). NMR-tiedot: ΧΗ (CDC13, Me4Si)£ 5,36, 5,28, 5 5,19 (3 d, kukin 1 H, J 3,8, 4,1 ja 3,7 Hz, H-l', H-l", H-l'"), 4,57 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 3,71 (s, 3 H,

MeO), 2,81, 2,71, 2,61 (3 t, kukin 2 H, J 6,7 Hz, CH2-S-CH2 jaCH2-C0). 13C (CDC13, Me4Si)«J 10,2 (C-l), 95,8, 95,6, 95,2 (C-l', C-l", C-l'"), 75,1, 73,7, 72,6, 10 72,0, 71,9, 71,7, 70,7, 70,3, 70,0, 69,8, 69,6, 69,3, 69.2, 68,8, 68,4, 67,3, 65,2, 63,0, 62,9, 61,7, 60.3, 51,7, 34,6* 31*3, 27,2, 20,8-20,5.

2-(ll-metoksikarbonyyliundekyylitio)etyyli/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-15 /2,3,4-tri-0-asetyyli-6-0-(2,3,4,6-tetra-0- asetyyli-JtD-glukopyranosyyli) -*C-D-glukopyrano-syy 1 i_/-*L-D-g lukopyranosyy 1-D -glukopyrano- sidQ Οδ)________

Seosta, jossa oli yhdistettä 76 (431 mg, 0,33 mmol) 20 metyyli-ll-merkaptoundekanoaattia (88, 114 mg, 0,49 mmol), cesiumkarbonaattia (128 mg, 0,39 mmol) ja N,N-dimetyyliformamidia (3 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 h. Seos laimennettiin dikloorimetaanilla, pestiin vedellä (neutralointi Duolite H+-hartsilla hel-25 potti faasien erottumista) ja kuivattiin (Na2S04).

Liuotin poistettiin, ja jäännös käsiteltiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 2:1), jolloin saatiin yhdistettä 78 (243 mg, 50 %) . = +91° (c = 4,4, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDdl3, Me4Si)£ 5,36, 30 5,28, 5,19 (3 d, kukin 1 H, J 3,8, 4,1 ja 3,6 Hz, H-l', H-l", H-l'"), 4,57 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 3,67 (s, 3 H, MeO), 2,68, 2,52, 2,31 (3 t, kukin 2 H, J 7 Hz, CH2-S-CH2 jaCH2C0). 13C (CDC13, Me4Si)£ 174,1, 170,4-169,1, 100,1 (C-l), 95,6, 95,5, 95,1 (C-l', C-l", Cl’"), 35 75,0 73,6, 72,5, 71,9, 71,5, 70,5, 70,2, 69,9, 69,7, 69,6, 69,2, 69,1, 69,1, 69,1, 68,7, 68,3, 67,2, 65,1, 83 73707 62,9, 62,8, 61,6, 51,2, 33,9, 32,3, 31,1, 29,5, 29,2, 29.1, 29,0, 29,0, 28,9, 28,6, 24,7, 20,7-20,4.

2- (oktadekyylitiö)etyyli^, 3,6-tri-0-asetyyli-4-0-^*2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-/i2,3,4-tri-0-asetyyli-6-0- (2,3,4,6-5 te.tra-O-asetyyli-eC-D-glukopyranosyyli) -«^-D-glukopyrano- syylX?~^-D-glukopyranosvyliv7->^ -P-glukopyranosidij^ (79)

Seosta, jossa oli yhdistettä 76 (265 mg, 0,2 mmol), oktadekaanitiolia (86 mg, 0,3 mmol), cesiumkarbonaat-tia (79 mg, 0,24 mmol) ja N,N-dimetyyliformamidia (10 ml), 10 sekoitettiin huoneen lämpötilassa, kunnes yhdiste 76 oli kulunut (48 h; TLC: Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 4:1). Liuotin poistettiin, ja jäännös käsiteltiin kromatografisesti (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:1), jolloin saatiin yhdistettä 79 (142 mg, 15 44 %) . ' +93° (c = 0,5, CHC13) . NMR-tiedot: 1H (CDCl3,

Me4Si)£ 5,30, 5,22, 5,12 (3d, kukin 1 H, J 4,0, 4,2 ja 3,7 Hz, H-l', H-l" ja H-l'"), 4,51 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 2,62, 2,46 (2 t, kukin 2 H, J 7,0 Hz, CH2-S-CH2). 13C (CDC13, Me4Si)<T 170,5-169,1 (CO), 100,2 (C-l), 20 95,7, 95,6, 95,2 (C-l', C-l", C-l'"), 75,1, 73,7, 72,6, 72,0, 71,6, 70,6, 703, 70,0, 69,8, 69,7, 69,6, 69,3, 69.2, 68,8, 68,4, 68,3, 67,3, 65,2, 63,0, 62,9, 61,7, 32,4, 31,8, 31,2, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,2, 29,1, 28,7, 22,6, 20,8-20,5, 14,0.

25 Etyyli/4-0-/4-0-^6-0-(,JL-D-glukopyranosyyli) -•t-D-glukopy- ranosyyll7-i.-D-glukopyranosyyll7-/» -D-glukopyranosidi) (80) Yhdiste 76 (122 mg) liuotettiin metanoliin (10 ml),' ja siihen lisättiin natriummetoksidin metanoliuosta (5 ml, 1 mg:sta natriumia). Lisättiin natriumhydroksidiliuos-30 ta (0,1 M, 5 ml), ja reaktioseosta hydrogenoitiin (72 mg

Pd/C; 4 atm) yön yli, ja sitten se neutraloitiin Duolite H+-hartsilla ja suodatettiin. Lisättiin yksi pisara väkevää ammoniumhydroksidia vedessä, ja poistettiin liuotin. Jäännös käsiteltiin kromatografisesti 35 (Si02, kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10, alempi faasi), jolloin saatiin yhdistettä 80 (24 mg, 40 %).

84 78707 (ot]^A = +108° (c = 1,0, vesi). NMR-tiedot: 1H (DjO, TSP)^ 5,40 (d, 2 H, J 3,8 Hz, H-l' ja H-l"), 4,96 (d, 1 H, J 3,7 Hz, H-l'"), 4,49 (d, 1 H, J 8,0 Hz, H-l), 1,23 (t, 3 H, J 7,1 Hz, CHjCH-j), 13C (D20, TSP)^* 104,5 5 (C-l), 102,7, 102,2, 100,8 (C-l', C-l", C-l"'), 79,8, 79,7, 79,0, 77,3, 76,0, 75,8, 75,8, 74,6, 74,5, 74,4, 74.2, 74,1, 73,9, 72,3, 72,2, 69,0, 68,6, 63,5, 63.2, 17,0.

2- (2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli^-O-^-O-^ö-O-10 (dl-D-glukopyranosyyli) -e4-D-glukopyranosyyli7-»/-D-gluko- pyranosyyljj-/^ -D-glukopyranosidi7 (81)_

Yhdiste 77 (3,0 g, 2,2 mmol) liuotettiin metano-liin (25 ml) ja lisättiin liuokseen, jossa oli natriumia (1 mg) metanolissa (75 ml). Reaktioseosta tarkkailtiin 15 TLC:n (kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10, alempi faasi) avulla. Sen jälkeen kun seosta oli pidetty huoneen lämpötilassa 9 h ja 40°:ssa 30 min, liuotin poistettiin, ja jäännös käsiteltiin kromatografisesti (Si02, kloroformi-metanoli-vesi-seos 65:35:10, alempi faasi), jolloin saa-20 tiin yhdistettä 81 (1,50 g, 84 %) . s +113° (c = 0,7, vesi). NMR-tiedot: XH (D20, TSP)£ 5,41 (d, 2 H, J 3,5 Hz, H-l1 ja H-l"), 4,98 (d, 1 H, J 3,6 Hz, H-l'"), 4,53 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 3,75 (s, 3 H, MeO). 13C (D20, TSP)«£ 177,4 (CO), 104,3 (c-l), 102,0, 101,6, 100,2, 25 (c-l', Cl", Cl'"), 79,3, 79,1, 78,3, 76,7, 75,4, 75,2, 75,1, 73,9, 73,8, 73,6, 73,5, 73,3, 71,6, 71,5, 71,1, 68,0, 62,8, 62,7, 62,6, 62,6, 54,5, 36,3, 32,9 28.6.

2-(ll-metoksikarbonyyliundekyylitioJetyyli/^-O-Z^-O-fö-Q- (ol-D-glukopyranosyyli) -oirD-glukopyranosyyli7-«(-D- 30 glukopyranosyylj^-/^ -D-glukopyranosidj? (82)__

Yhdiste 78 (218 mg, 0,148 mmol) deasetyloitiin ja puhdistettiin suurin piirtein samalla tavalla kuin edellä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin yhdistettä 82 (100 mg, 73 %). = +94 (c = 0,8, vesi). NMR-tiedot: 1H (D20, 35 TSP, 70°)£ 5,31 (m, 2 H, H-l' ja H-l"), 4,93 (d, 1 H, J 3,6 Hz, H-l"'), 4,41 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 3,64 (s, 3 H, MeO), 2,76, 2,56 (2 t, 2 H kukin, J 7,0 Hz, CH2-S-CH2). 2,28 (t, 2 H, J 7,3 HZ, CH2"C0).

85 7 8 707 13c (D20, TSP, 65°)£ 178,0 (CO), 105,9, 103,6, 103,4, 101,6 (C-l, C-l', Cl", C-1,M), 81,5, 81,4, 79,5, 78,2, 76.6, 76,4, 75,3, 75,0, 74,9, 74,8, 73,2, 72,9, 72,4, 69,5, 64,2, 54,8, 37,2, 35,4, 34,6, 32,9, 32,6, 32,5, 5 32,34, 32,3, 32,2, 31,9, 28,0.

2- (oktadekyylitio) etyyli^J-O-^i-O-^fe-O- ( dk-D-glukopyrano-syyli) -^-D-glukopyranosyyli^-^-D-glukopyranosyyli^-/^-D- glukopyranosidl? (83)__

Yhdiste 79 (120 mg, 0,79 mmol) asetyloitiin suurin 10 piirtein samalla tavalla kuin edellä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin yhdistettä 83 (73 mg, 95 %). Reaktiota seurattiin TLC:n (Si0„, etikkahappometanoli-vesi-seos Λ i 4b 2:1:1) avulla. fa) = +77° (c = 0,6, CHCl^-metanoli-seos 1:1). NMR-tiedot: 3H (D20, TSP)<f 5,35, 5,33 (2 d, 15 kukin 1 H, J 3,9 Hz, H-l' ja H-l"), 4,96 (d, 1 H, J 3,5

Hz, H-l"'), 4,44 (d, 1 H, J 7,9 Hz, H-l), 2,80, 2,58 (2 t, kukin 2 H, J 7,0 Hz, CH2-S-CH2). 13C (CDC13, (CD3)2S0 Me4Si)<f 10,28, 101,7, 100,8, 98,8 (C-l, Cl', Cl", Cl'"), 81,5, 81,4, 80,1, 76,1, 73,3, 73,1, 72,8, 20 72,3, 72,2, 72,1, 72,0, 71,7, 70,2, 70,1, 68,7, 60,8, 31.7, 31,4, 30,8, 29,3, 29,1, 28,8, 28,3, 22,2, 14,0.

Neoglykoproteiini 84 valmistettiin esitetyllä tavalla (61) käyttäen yhdistettä 81 (112 mg, 0,14 mmol) ja naudan seerumialbumiinia (BSA, 65 mg, 1 ^umol). Si-25 toutumisaste (61) oli 8. Käytettäessä 0,07 mmol yhdis tettä 81 ja 0,5 ^umol BSA:a sitoutumisaste oli 20.

Neoglykoproteiini 85 valmistettiin esitetyllä 61 tavalla käyttäen yhdistettä 81 (112 mg, 0,14 mmol) ja Fissurella-suvun kotilon hemosyaniinia (KLH, 30 mg, 30 0,034 mmol, oletettu molekyylipaino 870 000; toimitta jana Schwarts/Mann, Spring Valley, New York). Sitoutumisaste oli 65. Käytettäessä 0,7 mmol yhdistettä 81 ja 0,034 mmol KLH:a sitoutumisaste oli 245.

Metyyli-11-bromiundekanoaatti (86) 35 Seosta, jossa oli 11-bromiundekaanihappoa (kaupal- 86 73707 linen aine, 25,0 g, 94 mmol), Duolite H+-hartsia (10 g), kalsiumkloridia (26,2 g, 94 mmol) ja metanolia (700 ml), sekoitettiin 15 h. Metanoli poistettiin, ja lisättiin dikloorimetaania. Seos pestiin vedellä, kuivattiin 5 (Na2S0^) ja väkevöitiin. Tislattaessa saatiin puhdasta yhdistettä 86 (22,0 g, 84 %), jonka kp. oli 103-104° (2 x 10"2 torr) . 1H-NMR-tiedot: (CDCl-j, Me4Si)£ 3,67 (s, 3 H, MeO), 3,41 (t, 2 H, J 6,8 Hz, Br-CH2), 2,31 (t, 2 H, J 7,3 Hz, CHjCO).

10 Metyyli-ll-tioasetyyliundekanoaatti (87)

Seosta, jossa oli yhdistettä 86 (17,8 g, 64 mmol), tioetikkahappoa (9,7 g, 9,0 ml, 128 mmOl), metyylitriok-tyyliammoniumkloridia (0,5 g), cesiumkarbonaattia (25 g, 77 mmol), dikloorimetaania (95 ml) ja vettä (95 ml), 15 sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 h. Reaktiota seurat tiin TLC:n (S802, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos (1:5). Seos uutettiin dikloorimetaanilla, ja yhdistetyt uuttoliuokset kuivattiin (tfa2S04) ja väkevöitiin. Tislaus antoi tulokseksi puhdasta yhdistettä 87 (15,6 g, 89 %), 20 jonka kp. oli 137-139° (0,1 torr) ja sp. alle 25° (iso- oktaanista). NMR-tiedot; XH <CDC13, Me4Si)^ 3,67 (s, 3 H, MeO), 2,86 (t, 2 H, J 7,1 Hz, S-CH2), 2,32 (s, 3 H, MeCO) 2,30 (t, 2 H, J 7,7 Hz, CH2C0). 13C (CDC13, Me4Si)£ 195,9, 174,1 (CO), 51,3, 34,0, 30,5, 29,4, 25 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 28,9, 28,7, 24,8.

Alkuaineanalyysi:

Laskettu c34H2g03S:Hei C 61,27; H 9,50 Todettu: C 60,80; H 9,79.

Metyyll-ll-merkaptoundekanoaatti (88) 30 yhdiste 87 (15,6 g, 56,9 mmol) lisättiin metano- liin (50 ml) liuotettuna liuokseen, jossa oli kloorivetyä metanolissa (HCl:a johdettiin 600 mitään MeOHta 10 min). Reaktiota seurattiin TLCtn (Si02, etyyliasetaatin ja iso-oktaanin seos 1:5) avulla. 48 h:n kuluttua lisät-35 tiin ylimäärin natriumbikarbonaattia, ja seos laimennet- 87 78707 tiin dikloorimetaanilla (150 ml), suodatettiin ja väke-vöitiin. Tislaus antoi tulokseksi puhdasta yhdistettä 88 (9,0 g, 68 %), jonka kp. oli 93-94° (0,07 torr). NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me4Si)cT 3,68 (s, 3 H, MeO), 5 2,53 (q, 2 H, J ~ 7 Hz, H-S-CH2), 2,31 (t, 2 H, J 7,5

Hz, CH2C0). 13C (CDC13, Me4Si)^ 174,2 (CO), 51,3, 34,0, 33,9, 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 28,9, 28,3, 24,8, 24,5.

Esimerkki 50 2-bromietyyliglykosideja. Veriryhmä P^-antigeenin termi-10 naalisen trisakkaridiosan välihaara-, lipidi- ja etyyli- glykosidien synteesi. Neoglykoproteiinien valmistus_

Yhteenveto esimerkistä

Otsikon mukaiset yhdisteet valmistettiin vastaavan 2-bromietyyliglykosidin 93 kautta korvaamalla bromidi-15 ioni metyyli-3-merkaptopropionaatilla, oktadekyylitiolil- la ja vedyllä, vastaavasti. Hopeatriflaatin edistämä 2-bromietyyli(3,6-di-0-bentsyyli-2-deoksi-2-f-alimido-/^ -D-glukopyranosidin) (90) glykosylointi 2,3,6-tri-0-ase-tyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-»C-D-galaktopyrano-20 syyli)-oC-D-galaktopyranosyylibromidilla (89) antoi tuot teeksi yhdisteen 93. Välihaaraglykosidi 97 liitettiin naudan seerumialbumiiniin ja Fissurella-suvun kotilon hemosyaniiniin, jolloin saatiin vastaavia neoglykopro-teiineja.

25 Johdanto P-veriryhmäsysteemin hiilihydraattien (75) on esitetty olevan uropatogeenisille E. coli-bakteereille spesifisiä reseptoreja. Näiden ja niitä lähellä olevien yhdisteiden synteesiä koskevat tutkimukset ovat johta-30 neet oligosakkaridien «C„-D-Gal-(1—>4)-D-Gal (77), o^-D-gal- (1—>4) -/* -D-gal- (l->4) -/> -D-Glc78, o£-D-Gal-(l->4)--D-Gal-(1—>4) -/»>-D-GlcNAc79 ja fo -D-GalNac- (1—>3) O Λ D-Gal- (1—>4 ) -/*> -D-Gal- (1—>4) -/*> -D-Glc glykosidien val mistukseen.

35 Me selostamme nyt P^-antigeenin terminaalisen trisakkaridiosan valmistusta 2-bromietyyliglykosidin (93) 08 78707 muodossa, joka sitten muutetaan välihaara-, lipidi- ja etyyliglykosideiksi (81) sekä neoglykoproteiineiksi. Synteesi perustuu asetyylibromisokeriin 89, jota saadaan helposti pektiinistä peräkkäisten entsymaattisen 5 hydrolyysin ja boorihydridipelkistyksen avulla (77g).

89 78707 /OBn V^-o Η°-χ±-Ό

AcO-λ—BnO'^-^T^~-o^/r'Br OAc A

K°

AcO-l-^A

0AcBr 89 1 290 0R., \"Ά L£or" R °~orq „ ft'bA—

I /0R OR" X

\£~a yOR1 °<V> ·,'βΛ^-ο-Γ" 91 3 R=Br, R’=Bn, R”*Ac 96 8 R=S^COOMe, R*-R"-Ac

92 4 R=Br, fc’=H, R"=Ac 97 9 R=S'VCOOMe, R'=R"=H

93 5 R=Br, R’=R"=Ac 98 10 R=S'VWV\MAA> R1=R"=Ac

94 6 R=S'V-COOMe, R’=R"=Ac 99 11 R=SWWA\\, R’=R"=H

95 7 R=S^VWVVVVV\r'=r"=Ac 100 12 R=H, R’=Bn, R"=Ac 101 13 R=R’=H, R"=Ac 10214 R=H, R’-R’^Ac

103 15 R=R’=R"=H

104 16 R=S ''VCONH-BSA, R’=R"=H

105 17 R=S^VCONH-KLH, R'=R"=H

Kuva 10 90 78707

Tulokset ja johtopäätökset Täydellinen reaktiosarja esitetään kuvassa 10. Osittain suojattu 2-bromietyyliglykosidi 90 (81d) gly-ko.syloitiin asetyylibromisokerilla 8977<^ käyttäen hopea-5 triflaattia ja metyyliureaa dikloorimetaanissa, jolloin saatiin trisakkaridiglykosidi 91 (41 %). Yhdisteen 91 bentsyylisuojausryhmät poistettiin hydrogenolyysillä etikkahapossa (81), jolloin saatiin yhdiste 92 (92 %). Yhdisteen 92 asetylointi antoi tuotteeksi elintärkeän 10 välituotteen 93 (72 %), jota käytettiin yhdisteiden 94, 95 ja 102 valmistukseen. Käsittelemällä yhdistettä 93 metyyli-3-merkaptopropionaatilla tai oktadekaanitiolil-la Ν,Ν-dimetyyliformamidissa käyttäen cesiumkarbonaattia jouduttimena (81) saatiin välihaaraglykosidia 94 (94 %) 15 ja neoglykolipidiä 95 (91 %), vastaavasti. Yhdisteen 93 hydrogenointi emäksisissä olosuhteissa (81), sitä seurannut N-suojauksien poisto ja uudelleen asetyloiminen antoivat tulokseksi etyyliglykosidin 102 (28 %). Tulisi panna merkille, että hydrogenointi happamissa olosuhteis-25 sa lohkaisee bentsyyliryhmät jättäen samalla 2-bromietyy- liryhmän koskemattomaksi (esim. 91*92), kun sen sijaan emäksiset olosuhteet saavat aikaan hiili-bromi-sidoksen katkeamisen vaikuttamatta bentsyyliryhmiin (esim. 91—>100).

kuva 11 /Hz, Pd/Ci \θΗ- 91 787G7 N-suojauksen poisto yhdisteistä 94 ja 95 ja niiden uudelleenasetylointi antoivat tulokseksi yhdisteet 96 (50 %) ja 98 (52 %), vastaavasti. O-asetyyliryhmien poisto yhdisteistä 96, 98 ja 102 antoi tuloseksi välihaara-5 glykosidin 97 (90 % 9, neoglykolipidin 99 (87 %) ja etyy- liglykosidin 103 (60 %), vastaavasti. Viimeksi mainittu valmistettiin myös yhdisteestä 91 yhdisteiden 100 ja 101 kautta.

Välihaaraglykosidi 97 liitettiin proteiineihin 10 naudan seerumialbumiini (BSA) ja Fissurella-suvun koti- lon hemosyaniini (KLH) suurin piirtein kirjallisuudessa (81d,e,f) esitetyllä tavalla, jolloin saatiin neogly-koproteiinit 104 ja 105. Sitoutumisaste (81a) oli 17 ja 420, vastaavasti.

15 Kokeellinen osa

Yleiset menetelmät olivat esitetyn (81c) kaltaiset. NMR-referenssiaineina käytettiin tetrametyylisilaania (Me4Si) tai natrium-3-(trimetyylisilyyli)-propionaat-ti-d4:a (TSP).

20 2-bromietyyli(3,6-di-0-bentsyyli-2-deoksi-2-ftalimido-4-0- ζ2, 3,6-tri-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-o£-D-galaktopyranosyyli)-ft -D-galaktopyranosyyli^-/^ -D-gluko- pyranosidi) (91)_

Yhdiste 90 (81d) (4,56 g, 7,65 mmol), tetrametyy- 25 liurea (1,74 g, 15 mmol) ja hopeatrifluorimetaanisulfo- naatti (3,5 g, 13,62 mmol) liuotettiin dikloorimetaa-niin (30 ml) ja jäähdytettiin 0°:een. Dikloorimetaa-niin (13 ml) liuotettu yhdiste 89 (8,25 g, 11,8 mmol) lisättiin sekoittaen. Seos suojattiin valolta ja sekoi-30 tettiin 0°:ssa 2 h ja huoneen lämpötilassa 22 h. Kiin teät aineet poistettiin suodattamalla Celite:n läpi ja suodos laimennettiin dikloorimetaanilla, pestiin 1 M suolahapolla ja natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella, kuivattiin (Na2S04) ja väkevöitiin. Jäännös (12 g) käsi-35 teltiin kromatografisesti (Si02 pylväs, 5 x 18 cm, to- 92 78707 lueeni-eetteri 1:2), jolloin saatiin 91 (3,8 g, 41 %). Kiteyttämällä metanolista saatiin ainetta (2,81 g), jonka sp. oli 98 - 101°, +65° (c = 0,7, kloroformi).

NMR-tiedot: ΧΗ (CÖClg, Me^i)^ mm. 7,85*7,60 (bs, 5 4 H), 7,50-7,30 (5 H), 6,94-6,79 (3 H), 5,54 (bd, 1 H, J 3 Hz, H-4”), 5,26 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,17- 5,15 (3 H, H-l, H-2’ ja H-2"), 4,94 (d, 1 H, J 3 Hz, H-l"), 4,90 (d, 1 H, J 12,5 Hz, PhCH2), 4,80 (d, 1 H, J 12 Hz, PhCH2), 4,67 (dd, 1 H, J 10,5 ja 3 Hz, H-3'), 10 4,64 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,52 (d, 1 H, J 12 Hz,

PhCH2), 4,44 (d, 1 H, J 12,5 Hz, PhCÖ2), 3,29 (bt, 2 H, J 6 Hz, CH2Br), 2,10, 2,09, 2,05, 2,02, 2,01, 1,91 ja 1,82 (bs, kukin 3 H, MeCO). 13C (CDCl-j, Me4Si) 170,5, 170,4, 170,3, 170,2, 170,0, 169,3, 168,8, 168,0, 128,5 -15 123,1, 100,5 (d, J 164 Hz), 99,3 (d, J 172 Hz, Cl”), 98.4 (d, J 163 Hz), 78,3, 77,1, 76,9, 74,7, 74,5 (CH2), 73,5 (CH2), 72,7, 71,6, 69,2 (2 C, CH2), 68,2, 67,7, 67,4 (CH2), 67,1, 66,9, 61,2 (CH2), 60,2 (CH2), 55.4 (C-2), 29,9 (CH2Br), 20,9, 20,6 (3 C), 20,5 (2 C), 20 20,3.

Alkuaineanalyysi:

Laskettu C^gHgtjBrNO^;lie: C, 55,31; H, 5,39

Todettu C, 55,22; H, 5,41.

2-bromietyyli(2-deoksi-2-ftalimidO-4-0-/2,3,6-tri-0- 25 asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-^-D-galaktopyra- nosyyli) - A -D-galaktopyranosyyli,?-/* -D-glukopyranosidi)

(92)_L

Yhdistettä 91 (5,0 g, 4,1 mmol) hydrattiin (10 %

Pd/C, 1,0 g, 2 atm) etikkahapossa (50 ml) 17 h ja seos 30 suodatettiin, väkevöitiin ja kuivattiin (öljypumppu), jolloin saatiin yhdistettä 92 (3,9 g, 92 %) värittömänä, amorfisena kiinteänä aineena, jonka oli +49° 1 u (c = 1»5, kloroformi). NMR-tiedot: H (CDCl-j, Me^Si) £ mm.

7,96-7,81 (2 H), 7,80-7,68 (2 H), 5,58 (dd, 1 H, J 3 35 ja 1 Hz, H-4"), 5,39 (d, 1 H, J 8,5 Hz, H-l), 5,34 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,25 (dd, 1 H, J 11 93 78707 ja 8 Hz, H-2'), 5,19 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 4,93 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,79 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5

Hz, H-3'), 4,68 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 3,34 (t, 2 H, J 6 Hz, CH„Br), 2,13 (6 H), 2,10, 2,08, 2,05, 1,97 5 ja 1,86. l3C (CDC13, Me4Si) S 170,6, 170,5 (2C), 170,4, 170.1, 169,8, 169,1, 168,0 (leveä, 2 C), 134,0 (2 C), 131,7 (2 C), 123,3 (2 C), 101,9 (d, J 167 Hz, C-l tai C-l'), 99,8 (d, J 174 Hz, C-l"), 98,4 (d, J- 163 Hz, C-l tai C-l'), 82,2, 77,3, 74,2, 72,7, 72,5, 69,7, 69,6, 10 68,43, 68,38, 67,7, 67,4, 67,2, 62,5 (CH2), 60,8 (CH2), 60,4 (CH2), 55,6 (C-2), 29,9 (CH2Br), 20,9 (2 C), 20,8, 20,6 (3 C), 20,2.

2-bromietyyli-(3,6-di-0-asetyyli-2-deoksi-2-ftalimido-A-0-f2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-oi-15 D-galaktopyranosyyli) -/b -D-galaktopyranosyyli7-^-D- glukopyranosidi) (93)_

Yhdistettä 92 (3,76 g, 3,6 mmol) asetyloitiin (etikkahappoanhydridi-pyridiini 1:1, 50 ml) huoneen lämpötilassa 18 h ja haihdutettiin sitten yhdessä tolueenin 20 kanssa. Kiteyttämällä etanolista saatiin 93 (3,64 g, 90 %), jonka sp. oli 227-229° ja +50° (c=0,8, kloroformi).

NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me^i)^ 7,92-7,81 (2 H), 7,80 - 7,64 (2 H), 5,76 (dd, 1 H, J 10,5 ja 8 Hz, H-3), 5,59 (bdd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4"), 5,44 (d, 1 H, J 8,5 Hz, 25 H-l), 5,38 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,17 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,13 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,98 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,74 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,58 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,64-3,70 (15 H, mm. H-l'), 3,34 (bt, 2 H, J 6 Hz, CH2Br), 2,15, 2,12, 30 2,07 (9 H), 2,06 (6 H), 2,04, 1,96.

13C (CDC13, Me4Si) S 170,7, 170,52, 170,48 (2 C), 170,4, 170.1, 169,7, 169,5, 168,9, 167,9 (leveä, 2 C), 134,2 (2 C), 131,6, 131,5, 123,5 (2 C), 101,0 (d, J 160 Hz, C-l'), 99,6 (d, J 171 Hz, Cl"), 98,1 (d, J 166 Hz, C-l), 35 76,9, 76,8, 72,7, 72,6, 71,6, 71,4, 69,8 (CH2CH2Br), 69,0, 68,8, 67,9, 67,1 (2 C), 62,2 (CH2), 61,1 (CH29, 94 78707 60/2 (CH2), 54,7 (C-2), 29,8 (CH2Br), 21,0, 20,9, 20,8, 20,7 (3 C), 20,6, 20,5, 20,4.

Alkuaineanalyysi:

Laskettu C^gH^gBrMOjg:lie: C, 49,38; H, 5,05 5 Todettu: C, 49,50; H, 5,08.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli(3,6-di-0-asetyy-li-2-deoksi-2-(ftalimido-4-0-£>,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-ei-D-galaktopyranosyyli) -/* -D- galaktopyranosyyll7-/S -D-glukopyranosidi) (94)_ 10 yhdistettä 93 (3,91 g, 3,5 mmol), metyyli-3- merakaptopropionaattia (82) (0,84 g, 7,0 mmol), cesium- karbonaattia (1,30 g, 4,0 mmol) ja N,N-dimetyyliformami-dia (15 ml) sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2,5 h. Reaktion kulkua seurattiin TLC:llä (Si02, etyyliase-15 taatti-iso-oktaani 3:1). Seokseen lisättiin dikloorime- taania (100 ml) ja pestiin vedellä (50 ml). Vesikerros uutettiin dikloorimetaanilla (25 ml) ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin vedellä (20 ml,, kuivattiin (Na2S0^) ja väkevöitiin. Jäännös kiteytettiin metano-20 lista, jolloin saatiin yhdiste 94 (3,80 g, 95 %), jonka sp. oli 151-153° (faasimuutos alkaa 118°:ssa) ja = +52° (c = 0,7, kloroformi). NMR-tiedot: (CDC13, Me4Si) S nim. 7,96-7,74 (4 H), 5,74 (m, 1 H, H-3), 5,58 (dd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4"), 5,42 (d, 1 H, 25 J 8,5 Hz, H-l), 5,38 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-3"), 5,17 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,13 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,98 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l”), 4,74 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3’), 4,59 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l·), 3,67 (s, 3 H, CH3O), 2,70-2,56 (4 H, 30 CH2S), 2,42 (bt, 2 H, J 7 Hz, CH2S), 2,15, 2,12, 2,07 (6 H), 2,064, 2,059, 2,04, 1,96 ja 1,95. 13C (CDCl-j, Me4Si):<f 172,1, 170,7, 170,5 (2 C), 170,4, 170,0, 169,7, 169,5, 168,9, 167,8 (2 C), 134,2 (2 C), 134,15 (2 C), 123,5 (2 C), 101,0 (C-l1 tai C-l), 99,6 (C-l"), 35 98,0 (C-l tai C-l'), 77,0, 76,8, 72,7, 72,6, 71,6, 71,5, 69,5 (0CH2CH2), 69,0, 68,8, 67,9, 67,0, 62,3 (CH2), 95 78707 61,1 (CH2), 60,2 (CH2), 54,8 (C-2), 51,8 (OCH3), 34,5 <CH2), 31,3 (CH2), 27,1 (CH2), 21,0, 20,9, 20,74, 20,69, 20,66, 20,64, 20,6, 20,5, 20,4.

Alkuaineanalyysi: 5 Laskettu C50H63N028S:lle: C, 51,05; H, 5,48

Todettu: C, 51,70; H, 5,41.

2-(oktadekyylitio)etyyli(3,6-di-0-asetyyli-2-deoksi-2-ftalimido-4-0-^2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,5,6-tetra-O-asetyyli-^rD-galaktopyranosyyli)-/3 -D-galaktopyrano- 10 syylj7~/fr -D-glukopyranosidi) (95) _

Yhdistettä 93 (1,68 g, 1,5 mmol), oktadekaanitio-lia (0,81 g, 2,8 mmol), cesiumkarbonaattia (0,50 g, 1,53 mmol) ja N,N-dimetyyliformamidia (11 ml) sekoitettiin huoneen lämpötilassa 7,5 h ja käsiteltiin, kuten edellä 15 esitettiin yhdisteen 94 yhteydessä. Saatu jäännös käsi teltiin kromatografisesti (Si02~pylväs, 5 x 18 cm, etyyli-asetaatti-iso-oktaani 2:1, sitten 4:1 ja lopuksi pelkkä etyyliasetaatti), jolloin saatiin 95 (1,80 g, 91 %). Kiteyttämällä metanolista saatiin analyyttinen näyte, 20 jonka sp. oli 150 - 152° ja +47° (c = 0,6, kloro formi). NMR-tiedot: 1H (CDCl-j, Me4Si) «f 7,93-7,72 (4 H), 5,75 (m, 1 H, H-3) , 5,58 (bd, 1 H, J-3 Hz, 4-4"), 5,42 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l), 5,38 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,16 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-3"), 5,13 (dd, 25 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,98 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,74 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,63-4,34 (4 H, mm. H-l’), 4,58 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,29-3,57 (11 H), 2,55 (t, 2 H, J 7 Hz, CH2S), 2,31 (t, 2 H, J 7 Hz, CH2S), 2,15, 2,12, 2,07 (6 H), 2,064, 2,058, 2,04, 1,96 ja 1,95, 30 1,40-1,15 (bs), 0,88 (t, 3 H, J 6,5 Hz, CH3).

13C (CDC13, Me4Si)£ 170,7, 170,5 (3 C), 170,4, 170,0, 169,7, 169,5, 168,9, 168,2 (leveä, 2 C), 134,2 (2 C), 134,0 (2 C), 123,5 (2 C), 101,0 (d, J 160 Hz, C-l' tai C-l), 99,6 (d, J 173 Hz, C-l"), 98,1 (d, J 160 Hz, C-l 35 tai C-l’), 77,8, 72,7, 72,6, 71,62, 71,56, 69,7 (0CH2CH2), 69,0, 68,8, 67,9, 67,1 (2 C), 62,4 (CH2), 61,1 (CH2), 96 78707 60,2 (CH2), 54,2 (C-2), 32,4-22,7 (CH2), 21,0, 20,9, 20,74, 20,68 (2 C), 20,64, 20,57, 20,51, 20,45, 14,14.

2-(metoksikarbonyylietyylitio)etyyli(2-asetamido-2-deoksi- 3,6-di-0-asetyyli-4-0-^’2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0- (2,3,4,6-5 tetra-O-asetyyli-*4rD-galaktopyranosyyli) -ft -D-galaktopy- ranosyylj/ - Λ-D-glukopyranosidi) (96)_

Yhdiste 94 käsiteltiin samoin kuin yhdiste 96 valmistettaessa yhdiste 98. Epäpuhdas 96, joka muodostui, käsiteltiin kromatografisesti (Si02~pylväs, etyyliasetaat-10 ti-iso-oktaani 4:1 ja pelkkä etyyliasetaatti), jolloin saatiin puhdas 96, jonka oli +33°. NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me4Si)«f mm. 5,86 (d, 1 H, J 9 Hz, NH), 5,58 (dd, 1 H, J 3 ja <1 Hz, H-4"), 5,39 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,19 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,12 15 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 5,11 (t, 1 H, J 8,5 Hz, H-3), 5,00 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,76 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,60-4,38 (5 H, mm. H-l ja H-l'), 3.71 (S, CH30), 2,82 (bt, 2 H, J 7 Hz, SCH2CH2C0), 2.72 (t, 2 H, J 6,5 Hz, 0CH2CH2), 2,62 (bt, 2 H, J 7 Hz, 20 SCH2CH2C0), 2,13, 2,12, 2,11, 2,084, 2,075 (6 H), 2,06, 2.05, 1,99 ja 1,96 (CH3C0). 13C (CDD13, Me4Si)£ 172,5 - 169,1, 101,0 (2 C, C-l ja C-l'), 99,6 (C-l"), 77,0, 76,1, 72,9, 72,6, 71,9, 69,2 (0CH2CH2), 69,0, 68,7, 67,9, 67,1 (2 C), 62,4 (CH2), 61,4 (CH2), 60,4 (CH2), 53,4 (C-2), 25 51,9 (CH30), 34,6 (CH2), 31,5 (CH2), 27,3 (CH2), 23,2 - 20.5.

2-(2-metoksikarbonyylietyylitio)etyyli(2-asetamido-2-deoksi-4-0^4-0-(/-D-galaktopyranosyyli)-/£ -D-galakto- pyranosyyll7-,A -D-glukopyranosidl) (97)__ 30 Yhdiste 96 (350 mg, 0,3 mmol) liuotettiin metano- liin (10 ml) lämmittäen ja jäähdytettiin sitten nopeasti. Lisättiin metanoliin liuotettua natriummetoksi-dia (0,2 M, 0,2 ml) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 18 h, neutraloitiin (Duolite C-26 (H+)-hartsi), 35 suodatettiin ja väkevöitiin. Jäännös liuotettiin metano liin (7 ml) ja lisättiin metanoliin liuotettua hydrat- s7 78707 siinihydraattia (0,1 M, 3 ml). Seosta refluksoitiin 33 h lisäten kaksi lisäannosta reagenssia (2x3 ml) (24 ja 30 h:n kuluttua). Reaktion kulkua seurattiin TLC:lla (Si02, kloroformi-metanoli-vesi 65:35:10, alempi 5 kerros). Liuotin poistettiin ja jäännöstä käsiteltiin etikkahappoanhydridin (2,5 ml), etanolin (12 ml) ja veden (4 ml) seoksella huoneen lämpötilassa 1 h. Etanoli poistettiin ja jäännös jaettiin veden (20 ml) ja dikloorime-taanin (5 ml) välillä. Vesikerros pestiin dikloorimetaa-10 nilla (3x5 ml) ja väkevöitiin. Jäännös käsiteltiin kro- matografisesti (Sephadex G-10 -pylväs, 3x57 cm, vesi), jolloin saatiin yhdiste 97 (157 mg, 75 %), jonka oli +34° (c = 0,7, vesi). NMR-tiedot: f(CD3)2S0+D20, 50°, Me4Si7^» mm. 4,80 (d, 1 H, J 3,5 15 Hz, H-l"), 4,40 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l tai H-l'), 4,28 (d, 1 H, J 7 Hz, H-l tai H-l'), 4,08 (dt, 1 H, J 6 ja 1 Hz), 3,61 (s, CH30), 2,75-2,70 ja 2,61-2,54 (m, kukin 2 H, SCH2CH2C0), 2,64 (t, 2 H, J 7 Hz, 0CH2CH2S), 1,80 (s, 3 H, MeCON). 13C (DjO, TSP) 178,0, 177,3, 20 106,1, 103,8, 103,1, 81,6, 80,1, 78,2, 77,7, 75,3, 75,0, 73,7, 73,6, 72,1 (CH2), 72,0, 71,8, 71,4, 63,3 (CH2), 63,2 (CH2), 62,9 (CH2), 58,0 (C-2), 55,2 (CH30), 37,1 (CH2), 33,8 (CH2), 29,4 (CH2), 23,2.

2-(oktadekyylitio)etyyli(2-asetamido-2-deoksi-3,6-di-0-25 asetyyli-4-0-/2,3,6-tri-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra- O-asetyyli-oC-D-galaktopyranosyyli) -/¾ -D-galaktopyrano- syylj7-/fr-D-glukopyranosidi) (98)__

Yhdiste 95 (1,46 g, 1,1 mmol) liuotettiin meta-nolin (75 ml) ja tetrahydrofuraanin (10 ml) seokseen 30 lämmittäen. Kirkas liuos jäähdytettiin nopeasti n. 40°:een ja lisättiin natriummetoksidin metanoliuos (0,2 M, 5 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 5 h, minkä jälkeen deasetylointi oli edennyt loppuun (TLC; Si02, kloroformi -metanoli-vesi 65:35:10, alempi kerros), neutra-35 loitiin lisäämällä hapanta ioninvaihtohartsia (Duolite 98 78707 C-26), suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin uudelleen kiehuvaan metanoliin (50 ml) ja lisättiin hydratsiinihydraatti (0,5 g, 10 mmol). Refluksointia jatkettiin 17,5 h, minkä jälkeen liuotin haihdutettiin.

5 Jäännös asetyloitiin sekoittamalla 22 h pyridiinin ja etikkahappoanhydridin seoksessa (1:1, 50 ml). Jäännös käsiteltiin haihduttamisen jälkeen kromatografisesti (Si02~pylväs, 5x18 cm, etyyliasetaatti-iso-oktaani-gra-dientti 2:1—>4:1—»etyyliasetaatti), jolloin saatiin amor-10 finen yhdiste 98 (0,72 g, 52 %), jonka £*$1^ oli +32° (c = 1,1, CHCI3). NMR-tiedot: 1H (CDC13, Me4Si) S 5,67 (d, 1 H, J 9,5 Hz, NH), 5,58 (bd, 1 H, J 3 Hz, H-4"), 5,39 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,23-5,01 (3 H, H-2', H-2" ja H-3), 4,99 (d, 1 H, J 3,5, H-l"), 15 4,75 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,58-4,37 (5 H, mm. H-l ja H-l'), 4,54 ja 4,49 (2 d, kukin 1 H, J 8 Hz kukin, H-l ja H-l')/ 4,23-3,90 (7 H), 3,85-3,55 (4 H), 2,69 (t, 2 H, J 7 HZ, 0CH2CH2S), 2,51 (t, 2 H, J 7 Hz, SCH2), 2,13, 2,12, 2,11 ja 2,08 (4 s, kukin 3 H, MeCO), 20 2,075 ja 2,05 (2 s, kukin 6 H, MeCO), 1,99 ja 1,97 (2 s, kukin 3 H, MeCO), 1,66-1,20, 0,88 (t, 3 H, J 6,5 Hz, CH3CH2), 13C (CDC13) Me4Si)^* 170,6 (2 C), 170,4 (3 C), 170,2, 170,1, 169,6, 169,0, 101,1 ja 101,0 (d, J kukin 160 Hz, C-l ja C-l'), 99,6 (d, J 172 Hz, C-l"), 76,9, 25 75,9, 72,7, 72,6 (2 C), 71,8, 69,1 (0CH2CH2), 68,9, 67,7, 67,8, 67,1, 67,0, 62,4 (CH2), 61,3 (CH2>, 60,2 (CH2), 53,3 (C—2), 32,5-28,8, 23,3 (CH3C0NH), 22,7 (CH2), 20,9-20,5, 14,1.

2-(oktadekyylitio)etyyli(2-asetamido-2-deoksi-4-0-^4-0-30 (^-D-galaktopyranosyyli)-/¾ -D-galaktopyranosyyli/-/3 -D- glukopyranosidi (99)__

Yhdiste 98 (560 mg, 0,45 mmol) liuotettiin metanoliin (25 ml) ja lisättiin natriummetoksidin metanoli-liuos (0,2 M, 1 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpö-35 tilassa 14,5 h, jolloin syntyi amorfinen sakka. Tämä liuotettiin lisäämällä metanolia (50 ml) ja lämmittämällä 99 78707 seos noin 40°:een. Liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, neutraloitiin Duolite C-26 (H+)-hartsilla, suodatettiin ja väkevöitiin. Jäännös suspentoitiin veteen (100 ml) ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin amorfinen 99 5 (340 mg, 87 %), jonka ^ oli +35° (c = 0,6, dimetyyli- sulfoksidi). NMR-tiedot: ΧΗ /(CD3>2S0+D20, 50°,

Me4Si/£ mm. 4,81 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,40 ja 4,29 (2 d, kukin 1 H, J 7,5 Hz, H-l ja Hl'), 2,60 (t, 2 H, J 7 Hz, CH2S), 2,50 (t, 2 H, J 7 Hz, SCH2), 1,81 (s, 3 H, 10 CH3C0N), 0,86 (t, 3 H, J 6,3 Hz, CH3CH2).

13C (CD3)2S0, Me4Si)£ 168,7, 103,8 (d, J 162 Hz, C-l tai C-l'), 100,7 ja 100,5 (2 d, J~ 162 ja 172 Hz, C-l" ja C-l tai C-l'), 8,2, 77,1, 75,0 (2 C), 72,8, 72,1, 71,0, 70,8, 69,1, 68,7, 68,5, 68,5 (0CH2CH2), 60,3 (2 CH2), 15 59,3 (CH2), 54,5, 31,4-28,1 (CH2), 22,9, 22,1 (CH2), 13,9 (CH3CH2).

Etyyli(2-asetamido-2-deoksi-3,6-di-0-bentsyyli-4-0-^2,3,6-tri-O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-*<r-D-galak-topyranosyyli) -fr -D-galaktopyranosyyli7-/5 -D-glukopyra- 20 nosidi) (100)_

Yhdistettä 91 (310 mg, 0,26 mmol) hydrattiin (10 % Pd/C, 0,3 g, 2,1 atm) natriummetoksidin metanoliliuokses-sa (0,02 M, 33 ml) huoneen lämpötilassa 22 h, suodatettiin ja neutraloitiin Duolite C-26 (H+)-hartsilla. Liuok-25 sen pH säädettiin 7,5:ksi lisäämällä natriumvetykarbonaat- tia ja seos suodatettiin ja väkevöitiin (alle 1 totria). Lisättiin metanolia (25 ml) ja hydratsiinihydraattia (0,8 g, 16 mmol) ja seosta refluksoitiin 3 h. Muutos oli täydellinen TLC:n mukaan (Si02, kloroformi-metanoli-30 vesi 65:35:10, alempi kerros). Liuotin poistettiin ja jäännös asetyloitiin (etikkahappoanhydridi-pyridiini 1:1, 50 ml huoneen lämpötilassa 17 h. Haihduttamalla yhdessä tolueenin kanssa saatiin jäännös, joka käsiteltiin kromatografisesti (Si02~pylväs, etyyliasetaatti-iso-ok-35 taani 3:1 ja lopuksi pelkkä etyyliasetaatti), jolloin 100 7 8 7 0 7 saatiin kiteinen 100 (151 mg, 55 %). Kiteyttämällä uudelleen isopropanoli-iso-oktaani-seoksesta saatiin _ ΛΛ Λ analyyttinen näyte, jonka sp. oli 97-100 ja ^/D +40 (c = 0,6, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDCl3, Me^i),^ 7,42-7,20 5 (10 H), 5,93 (d, 1 H, J 8 Hz, NH), 5,55 (dd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4"), 5,32 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,19 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,14 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 4,99 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,88-4,63 (5 H), 4,58-4,44 (3 H, mm. H-l tai H-l' ja PhCH), 4,54 10 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l tai H-l'), 4,47 (d, 1 H, J 12 Hz,

PhCH), 4,31 (dd, 1 H, J 11 ja 6,5 Hz), 4,23-3,44, 2,13- 1,92 (24 H, MeCO), 1,18 (t, 3 H, J 7 Hz, CH3CH2).

13c (CDC13, Me4Si)£ 170,5 (2 C) , 170,4, 170,3, 170,2, 170,1, 169,6, 169,5, 138,8, 138,0, 128,4-127,3, 100,0 15 (d, J 165 Hz, C-l tai C-l'), 99,7 (d, J 163 Hz, C-l tai C-l'), 99,3 (d, J 172 Hz, C-l”), 77,2, 76,8, 75,9, 74,3, 73,5 (CH2), 73,1 (CH2), 72,4, 71,9, 69,0, 68,8 (CH2), 68,4, 67,7, 67,2, 67,0, 64,2 (CH2), 61,4 (CH2), 60,4 (CH2), 53,1 (C-2), 23,3 (CH3C0NH), 20,9, 20 20,72, 20,69, 20,65 (2 C), 20,6, 20,5, 15,0 (CH3CH2).

Alkuaineanalyysi:

Laskettu C^QHg3N023:lie: C, 57,30; H, 6,25 Todettu: C, 57,12; H, 6,27.

Etyyli(2-asetamido-2-deoksi-4-0-/5,3,6-tri-0-asetyyli-25 (2,3,4,6-tetra-0-asetyyli-e£~D-galaktopyranosyyli) -y9- D-galaktopyranosyyli7-l/ft-D-glukopyranosidi) (101)_ yhdistettä 100 (475 mg, 0,45 mmol) hydrattiin (10 % Pd/C, 200 mg, 1 atm) etikkahapossa (10 ml) 5,5 h huoneen lämpötilassa. Seos suodatettiin ja liuotin pois-30 tettiin, jolloin saatiin kiteinen jäännös. Kiteyttä mällä uudelleen etanolista saatiin yhdiste 101 (291 mg, 74 %), jonka sulamispiste oli 260-262° ja +67° (c = 0,9, CHC13). NMR-tiedot: 1H (CDC13+D20, Me4Si)£ 5,59 (dd, 1 H, J 3 ja 1 Hz, H-4"), 5,37 (dd, 1 H, J 11 35 ja 3 Hz, H-3"), 5,23 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 5,21 101 78707 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 4,96 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,80 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3'), 4,75 (d, 1 H, J 8,5 Hz, H-l), 4,68 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l'), 4,51 (bt, 1 H, J 7 Hz, H-5"), 4,44 (dd, 1 H, J 11 5 ja 8,5 Hz), 4,28-3,40 (13 H), 2,142, 2,139, 2,10, 2,084, 2,080, 2,05, 2,01, 2,00 (8 s, kukin 3 H), 1,21 (t, 3 H, J 7 Hz, CH3CH2). 13C (CDC13, Me4Si)£ 170,6, 170,5 (2 C), 170,4, 170,3, 170,1, 169,9, 169,1, 101,8 (C-l tai C-l'), 100,2 (C-l tai C-l'), 99,8 (C-l"), 81,8, 77,3, 73,9, 10 72,7, 72,6, 71,9, 68,5, 68,4, 67,8, 67,4, 67,3, 65,3 62,5, 61,0, 60,4, 56,6 (C-2), 23,6-20,5, 15,1. Alkuaineanalyysi:

Laskettu C36H53N023:lie: C, 49,82; H, 6,16 Todettu; C, 50,0; H, 6,20.

15 Etyyli(2-asetamido-2-deoksi-3,6-di-0-asetyyli-4-0-^2,3,6- tri-O-asetyyli-4-O- (2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-fC-D-galak-topyranosyyli)-fb -D-galaktopyranosyyli/-/fc -D-glukopyrano- sidi) (102)___

Yhdistettä 93 (0,65 g, 0,58 mmöl) hydrattiin (10 % 20 Pd/C, 0,31 g, 2,1 atm) natriummetoksidin metanoliliuok- sessa (0,02 M, 56 ml) huoneen lämpötilassa 20 h, suodatettiin ja neutraloitiin Duolite C-26 (H+)-hartsilla.

Seos suodatettiin ja väkevöitiin ja jäännös liuotettiin metanolin (20 ml) ja hydratsiinihydraatin (1,7 g, 34 mmol) 25 seokseen, refluksoitiin 23 h ja väkevöitiin. Jäännös asetyloitiin (etikkahappoanhydridi-pyridiini 1:1, 50 ml) huoneen lämpötilassa 18 h. Väkevöimällä yhdessä tolueenin kanssa saatiin jäännös, joka liuotettiin dikloorimetaa-niin (75 ml) ja pestiin vedellä (50 ml). Vesifaasi uutet-30 tiin dikloorimetaanilla (25 ml) ja yhdistetyt orgaaniset uutteet pestiin vedellä (10 ml), kuivattiin (Na2S04) ja väkevöitiin. Jäännös käsiteltiin kromatografisesti (Si02~pylväs, 1,5 x 46 cm, etyyliasetaatti), jolloin saatiin kiteinen 102 (159 mg, 28 %), jonka sp. oli 130 -35 133° ja (d]*2 +41° (c = 0,7, CHCl3) .

102 73707 NMR-tiedot: 1H (CDCl3/ Me4Si)& 5,73 (d, 1 H, J 9,5 Hz, NH), 5,58 (bd, 1 H, J - 3 Hz, H-4"), 5,39 (dd, 1 H, J 11 ja 3 Hz, H-3"), 5,19 (dd, 1 H, J 11 ja 3,5 Hz, H-2"), 5,12 (dd, 1 H, J 11 ja 8 Hz, H-2'), 5,10 (dd, 5 1 H, J 9,5 ja 8 Hz, H-3), 5,00 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,76 (dd, 1 H, J 11 ja 2,5 Hz, H-3'), 4,58-4,37 (5 H, mm. H-l, H-l'), 4,55 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l tai H-l'), 4,46 (d, 1 H, J 7,5 Hz, H-l tai H-l’), 423-3,96 (6 H), 3,95-3,73 (3 H), 3,71-3,45 (2 H), 2,14, 2,11, 2,106, 10 2,084, 2,079, 2,076, 2,06, 2,05, 1,99, 1,97, 1,19 (t, 3 H, J 7 Hz, CH3CH2). 13C (CDCl3, Me4Si)^ 170,6 (2 C), 170,51, 170,46 (2 C), 170,4, 170,3, 170,1, 169,7, 169,1, 101,1 (d, J 164 Hz, C-l tai C-l’), 100,7 (d, J 160 Hz, C-l tai C-l'), 99,6 (d, J 174 Hz, C-l"), 77,0, 76,1, 15 72,8, 72,7, 72,5, 71,9, 69,0, 68,7, 67,9, 67,1 (2 C), 65.0 (CH2), 62,5 (CH2), 60,3 (CH2), 53,4 (C-2), 23,2-20,5, 15.1 (CH3CH2).

Alkuaineanalyysi i

Laskettu C4QH57N02g:lie: C, 50,47; H, 6,04 20 Todettu: C, 50,31; H, 6,02.

Etyyli (2-asetamido-2-deoksi-4-0-^"4-0- («2-D-galaktopyrano-syyli) -/3 -D-galaktopyranosyyli^-^-D-glukopyranosidi (103) a: Yhdiste 102 (58 mg, 0,06 mmol) 0-deasetyloi-tiin natriummetoksidin metanoliliuoksessa (0,036 M, 5,5 ml) 25 huoneen lämpötilassa 21 h. Seos neutraloitiin Duolite C-26 (H+)-hartsilla, suodatettiin ja väkevöitiin. Jäännös liuotettiin veteen ja kylraäkuivattiin, jolloin saatiin 103 (21 mg, 60 %), jonka oli +25° (c = 0,7, vesi). NMR-tiedot: 1H ^(CD3) 2S0+D20, 50°, Me4Si,7 S mm.

30 4,80 (d, 1 H, J 3,5 Hz, H-l"), 4,37 (d, 1 H, J 8 Hz, H-l tai H-l'), 4,29 (d, 1 H, J 7,5 Hz, H-l tai H-l'), 4,07 (bt, 1 H, J 6,5 Hz), 1,81 (s, 3 H, MeCON), 1,08 (t, 3 H, J 7 Hz, CH3CH2). 13c (D20, TSP)g 177,4, 106,1, 103,4, 103,1, 81,6, 80,1, 78,2, 77,7, 75,4, 75,0, 73,7, 35 73,6, 72,0, 71,7, 71,4, 69,1 (CH2), 63,3 (CH2), 63,2 103 78707 (CH,), 62,9 (OH,), 58,1, 25,0, 17,1. b: Yhdiste 13 (15 mg, 0,017 mmol) 0-deasyloitiin ja eristettiin kuten edellä, jolloin saatiin 15 (8,0 mg, 81 %).

Neoglykoproteiinit 104 ja 105 5 Yhdiste 97 (40 mg) käsiteltiin äskettäin ilmesty- een raportin (78c) mukaisesti ja tuote liitettiin naudan seerumialbumiiniin (BSA, 60 mg), jolloin saatiin 104. Sitoutumisaste oli 17. Toinen osa yhdistettä 97 (120 mg) liitettiin Fissurella-suvun kotilon hemosyaniiniin 10 (KLH, 35 mg) käyttäen samaa 78c menetelmää. Sitoutumis aste oli 420.

104 73707

Kirjallisuusviitteet 1 a R. C. Hughes and S.D. J. Pena in "Carbohydrate Metabolism and its Disorders”, PJ. Randle, D.F.Steiner and W. J.Whelan, Eds. Academic Press, 1961, London.

b S.Hakomori, Ann. Rev. Biochem.. 50, 733 (1981).

c J.Montreuil, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37, 157 (1980).

d "Symposia of the Society for Experimental Biology; Symposium XXXII Cell-Cell Recognition" Cambridge University Press, 1978.

e W.J.Lennartz, "The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans", Plenum Press, 1980, New York.

f N.Sharon and H.Lis, Chem. Eng. News, March ^0, 21, (1981).

g D.M.Veir, Immunology Today, August, 45 (1980).

h T.Feizi, TlbS, December, 333 (1981).

2 R.U.Lemieux, Chem. Soc. Rev., 423 (1978).

105 78707 3 N.Sharon and H.Lis, Science, 177, 949 0 972).

4 E.A.Rabat, Methods Enz., 70, 3 (1980).

5 a E.H.Beachey, ^3. Infect. Diseases, 143, 325 (1981). b R.J.Gibbons, Microbiology, 395 (1977).

c T.Vadström and T.J. Trust, "Bacterial surface lectins", to be published.

d J.W.Costerion, G.C.Ceesey and K-J.Cheng, Scientific American, 238, 86 (1978).

e "Bacterial Adherence", E.H.Beachey Ed., Chapman and Hall, London, New York, 1980.

6 a C.W.Ward, P.A.Gleeson and T.A.Dopheide, Biochem. J., 189, 649 (1980).

b M.A.R.Markwell, L.Svennerholm and J.C.Paulson, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5406 (1981).

7 J.Holmgren, Nature, 292, 413 (1981).

8 L.D.Kohn in "Receptors and Recognition" P.Cuatrecasas and M.F.Greaves Eds., Vol. 5, p. 134-212. Chapman and Hall,

London 1978.

9 D.I.Meyer and M.M.Burger in "Cancer-The Outlaw Cell", R.E. LaFond, Ed., Am. Chora. Soc., Washington, D C, 1978.

106 78707 10 a J.M. Bedford, Nature , 29^, 266 0981).

b F.Rosati and R.De Santie, Nature, 263, 762 (1980).

11 a Recent Advances in Phytochemistry, Vol. 15: "Phytochemistry of Cell Recognition and Cell Surface

Interactions", F.A.Loewus and C.A.Ryan, Eds., Plenum Publishing Corp., New York, 1981.

b G.R.Noggle, What*s New in Plant Physiology, 10(2),5 (1979).

12 M.M.Ponpipom, R.L.Bugianesi and T.Y.Shen, Can. -J. Chem., 58, 214 (1980).

13 a J.C.Chabala and T.Y.Shen, Carbohydr. Res., 67, 55 (1978). b J.S.Slama and R.R.Rando, Biochemistry, 19, 4595 (1980).

14 J.H.Pazur, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 39, 404 (1981).

15 A.F.Bochkov and G.E.Zaikov, "Chemistry of the 0-Glycosidic Bond: Formation and Cleavage", Pergamon Press, 1979.

16 a Review: C.P.Stovell and Y.C.Lee, Adv. Carhoh. Chem. Biochem., 37, 225 (1980).

b Review: J.D.Aplin and J.C.Vriston, Jr., CRC Critical Rev. Biochem., May 1981, pp 259-306.

17 a R.T.Lee and Y.C.Lee, Carbohydr. Res., 37, 193 (1974).

b J.C.Jacquinet and H.Faulsen, Tetrahedron Lett., 22, 1387 (1981). c M.A.Bernstein and L.D.Hall, Carbohydr. Res., 78, Cl (1980).

107 78707 18 F.Marquez and A.Mesquida, Anales de Quimica, 70, 833 (1974).

19 C.Magnusson. C.Noori, J.Dahmen, T.Frejd and T.Lave, Acta Chem. Scand., B 35, 213 (1981).

20 B.Lindberg, Acta Chem. Scand., 2^, 426-429 (1948).

21 R.J.Ferrier and R.H.Furneaux, Methods Carbohydr. Chem., 13, 251 (1980).

22 See ref. 15, p. 20.

23 N.Morishima, S.Koto, C.Kusuhara and S.Zen, Chem, Lett., 427 (1981).

24 R.U.Lemieux, K.B.Hendriks, R.V.Stick and K.James, J.Am.

Chem. Soc., 97, 4056 (1975).

25 See ref. 15, p. 48.

26 Varisn XL-200; Based on the Fortran program LAME (LA0C00N vith magnetic equivalence added).

27 Varisn XL-200. See G.A.Morris and R.Freeman, J. Am. Chem. Soc. 101, 760 (1979).

Λ 28 a R.P.Volante, Tetr. lett., 3119 (1981).

b J.H.Chapman and L.N.Owen, J^. Chem. Soc., 579 (1950).

108 78707 29 P.A.S.Smith in "Molecular hcarrangemcnts" part ], p. 577, P.de Mayo, Ed,. Interscience, New York, 1963.

30 R.U.Leroieux, D.R.Bundle and D.A.Baker, J. Am. Chem. Soc..

97, 4076 (1975).

31 J.K.Inman, B.Merchant, L.Claflin and S.E.Tacey, Immunochetnistry, U), 165 (1973).

32 M.Dubois, K.A.Gilles, J.K.Hamilton, P.A.Rebers and F.Smith,

Analyt. Chem., 28, 350 (1956).

33 a C.R.Mc Broom, C.H. Santanen and I .J.Goldstein, Methods Enzyrool., 28, 212 (1972).

b D.F.Smith, D.A.Zopf and V.Ginshurg, ibid., 50, 169 (1978).

34 J.E.Hodge and B.T.Hofreiter, Methods Carboh. Chem., 389 (1962).

35 A.Shöberl and A.Wagner in flouben -Veyl "Methoden der Organischen Chemie”, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1955, Vol. 9, pp. 55.

37 C.Augg and A.Veyriers, Carbohydr. Res., 46, 293 (1976).

38 R.U.Lemieux and R.M.Ratcliffe, Can. J. Chem, 57, 1244 (1979).

39 E.Fisher and F.Armstrong, Ber., 35, 3155 (1902).

40 A.R.Pray, Inorg. Synth., 5, 154 (1957).

41 "Protective Groups in organic Chemistry", J.F.W. McOmie, Ed. Plenum Press, London, 1973.

42 A.H. Haines, Adv. Cabohydr.Chem. Biochem., 39, 13 (1981).

109 78707 43 J. Dahmän, T. Frejd, G. Magnusson, and G. Noori, Carbohydr. Res., submitted.

44 g. Källenius, R. Möllby, S.B. Svensson, J. Winberg, A. Lundblad, S. Svensson, and B. Cedergren, FEMS Lett,, 7 (1980) 297-302.

45 R.R. Race and R. Sanger, Blood Groups in Man, 6th edn., Blackwell, Oxford, 1975; M. Naiki and M. Kato, Vox Sang.. 37 (1979) 30-38.

46 H. Leffler and C. Svanborg-Eden, FEMS Lett., 8 (1980) 127-134.

47 J· Dahmen, T. Frejd, T. Lave, F. Lindh, G. Magnusson, G. Noori, and K. Palsson, Carbohydr. Res., 113 (1983) 219-224.

48 J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, and G. Noori, Carbohydr. Res., 111 (1982) C1-C4; 49 J'· Dahmen, T. Frejd, G. Grönberg, T. Lave, G. Magnusson, and G. Noori, Carbohydr. Res., (1983) UK 2538.

50 Idem, ibid. UK 2562.

51 D.D. Cox, E.K. Metzner, and E.J. Reist, Carbohydr. Res., 63 (1978) 139-147; P.J. Garegg’ and H. Hultberg, ibid., 110 (1982) 261-266.

52 D.M. Hall, Carbohydr. Res., 86 (1980) 158-160.

53 P. Garegg and H. Hultberg, Carbohydr. Res., 93 (1981) C10-C11.

54 B.R. Baker, M.V. Querry, S. Bernstein, S.R. Safir, and Y. Subbarow, J. Or&. Chem., 12 (1947) 167-173.

55 J.K. Inman, B. Merchant, L. Claflin, and S.E. Tacey, Immunochemistry, 10 (1973) 165-174.

56 R.U. Lemieux, D.R. Bundle, and D.A. Baker, _J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 4076-4083.

57 J.S. Sawardeker, J.H. Sloneker, and A. Jeanes, Anal. Chem., 37 (1965) 1602-1604.

58 H. Bjömdal, C.G. Hellerqvist, B. Lindberg, and S. Svens son, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 9 (1970) 610-619.

59 R.U. Lemieux and J.D. Stevens, Can. J. Chem., 43 (1965) 2059-2070.

60 M. Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, and F. Smith,

Anal. Chem., 28 (1956) 350-356.

no 78707 61 J. Dahmen, T. Frejd, G Magnusson, G Noori and A.S. Carlström,

Carbohvdr. Res., submitted.

62 P. Hellgren, G. Hansson, K.G. Henriksson, A. Häger. A. Lundblad and S. Svensson, Europ. J. Clin. Invest., 4 (1974) 429-433.

63 G Lennartson, A. Lundblad, J. Lundsten, S. Svensson and A. Häger,

Eur. J. Biochem., 83 (1978) 325-334.

64 A. Lundblad, S. Svensson. I. Yamashina and M. Ohta, FEBS Lett., 97 (1979) 249-252.

65 P. Hellgren. B.S. Lindberg and A. Lundblad, J^. Biol. Chem., 252 (1977) 1034-1040.

66 D. A. Zopf, R. E. Levinson and A. Lundblad, J♦ Immun♦ Methods, 48 (1982) 109-119.

67 B.V. McCleary, Carbohydr. Res., 85 (1980) 160-163.

68 B.J. Catley, £. General Microbiol., 78 (1973) 33-38.

69 6 Magnusson, G Noori, J. Dahmen, T. Frejd and T. Lave, Acta Chem. Scand., B 35 (1981) 213-216; J. Dahmen, T. Frejd, G Magnusson and G Noori, Carbohydr. Res., 111 (1982) C1-C4; J. Dahmen, T. Frejd. G Magnusson and G. Noori, Carbohydr. Res., 114 (1983) 328-330; J. Dahmen. T. Frejd, G. Grönberg, T. Lave, G Magnusson and G. Noori, Carbohydr. Res., in press (UK 2538).

70 J. Dahmen, T. Frejd, G. Grönberg, T. Lave, G Magnusson and G Noori, Carbohydr. Res., (UK 2562); J Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G Noori and A.S. Carlström, Carbohydr. Res., submitted.

71 J. K. Inman, B. Merchant, L. Claflin and S.E. Tacey, Immunochemistry, 10 (1973) 165-174.

72 R. U. Lemieux, D. R. Bundle and D.A. Baker, J. Am. Chem. Soc., 97 (1975) 4076-4083.

73 See G. A. Morris and R. Freeman, J. Am. Chem. Soc., 101 (1979) 760-763.

111 78707 74 J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G. Noori and A-S. Carlström,

Carbohydr. Res, submitted.

75 R.R. Race and R. Sanger, Blood Groups in Man, 6th edn., Blackwell,

Oxford, 1975; M. Naiki and M. Kato, Vox Sang., 37 (1979) 30-38.

76 G. Källenius, R. Möllby, S.B. Svenson, J. Winberg, A. Lundblad , S. Svensson, and B. Cedergren, FEMS Lett., 7 (1980) 297-302; H. Leffler and C. Svanborg-Edep, ibid. 8 (1980) 127-134.

77 (a) G.O. Aspinall and R.S. Fanshawe, J_. Chem. Soc., (1961) 4215-4225; (b) M.E. Chacon-Fuertes and M. Martin-Lomas, Carbohydr. Res., 43 (1975) 51-56; (c) P.A. Gent, R. Gigg, and A.A.E. Fenglis, £. Chem.

Soc., Perkin Trans. (1976) 1395-1404; (d) D.D. Cox, E.K. Metzner, and E.J. Reist, Carbohydr. Res., 62 (1978) 245-252; (e) P.J. Garegg and H. Hultberg, ibid., 110 (1982) 261-262; (f) M-L. Miiat, P.A. Zollo, and P. Sinay, ibid. 100 (1982) 263-271; (g) J. Dahmen, T. Frejd, T. Lave, F. Lindh, G. Magnusson, G. Noori, and K. Pileson, ibid. 113 (1983) 219-224.

78 (a) D.D. Cox, E.K. Metzner, and E.J. Reist, Carbohydr. Res., 63 (1978) 139-147; (b) P.J. Garegg and H. Hultberg, ibid. 110 (1982) 261-266; (c) J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G. Noori, and A-S. Carlström, ibid., submitted.

79 M.A. Nashed and L. Anderson, Carbohydr. Res., 114 (1983) 43-52.

80 H. Paulsen and A. Bunsch, Carbohydr. Res., 101 (1982), 21-30.

81 (a) j. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, and G. Noori, Carbohydr. Res., lit (1982) C1-C4; (b) J. Dahmen, T. Frejd, G. Grönberg, T. Lave, G. Magnusson, and G. Noori, ibid., (UK 2538); (c) idem., ibid., (UK 2562); (d) J. Dahmen, T. Frejd, G. Magnusson, G. Noori, and A-S. Carlström, Carbohydr. Res., submitted; (e) ref. 5 c; (f) ref. 1.

b.R. Baker, M.V. Querry, S. Bernstein, S.R. Safir, and Y. Subbarow, J. Org. Chem., 12 (1947) 167-173.

Claims

112 78707

1. D-Gal/31-> 4GlcNAc/iOCH2CH2-S-CH2CH2CONH-R" ' , jolloin R"1 on proteiinin, polysakkaridin, muoviaineen tai epäorgaanisen aineen tähde.

1. O-glykosidi, tunnettu siitä, että sen kaava on 5 (sokeri) -O-(CH_)«-S-R-R1, n ι i jossa n on kokonaisluku 1-10, R on alkyyli, jossa on enintään 25 hiiliatomia, tai aryyli ja R’ on H, CHO, CH(0R")2, jossa R" on C^_^-alkyyli; N02, NH2, OH, SH, COOH, COOCH^,

10 COOCH2CH3, CONHNH2, CON3 tai kantaja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen glykosidi, tunnettu siitä, että sokeri on D-glukoosi, D-galaktoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi, L-fukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-deoksi-2-ftalimidoglukoosi, 2-asetamido-2-deoksi-

15 D-galaktoosi, 2-atsido-2-deoksi-D-glukoosi, 2-atsido-2- deoksi-D-galaktoosi, D-glukoronihappo, D-galakturonihappo, 2-deoksi-2-ftalimidoglukoosi tai 2-deoksi-2-ftalimidogalak-toosi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen O-glykosidi, t u n-20 n e t t u siitä, että R on alkyyli ja R' on COOCH3·

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että R on CH2-CH2·

5 D-Gal<*l-> 4-D-Gal£ l-> 4-D-Glc/»OCH2CH2-S-CH2CH2CONHR" ' , D-Galoll-> 4-D-Gaip l-> 4-D-GlcNAc«OCH2CH2-S-CH2CH2CONH-R" ' , D-Glc<*l-* 6-D-Glc*l-> 4-D-Glcetl-> 4-D-Glc0OCH2CH2-S-CH2CH2CONH-R” ' tai

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että R on (CH2^ ' 3ossa 2 on enintään 25 24, ja R' on metyyli.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että se on glykolilipidi, jonka kaava on D-GalÄl-> 4-D-Gal/50CH2CH2S-(CH2)^ CH3, L-Fuc*l-> 2-D-Gal60CH2CH2S-(CH2)^ CH3,

30 D-Gal*l-> 4-D-Gal/*l-> 4-D-Glc.e0CH2CH2S- (CH^ CH3, D-Gal<*l-> 4-D-Gal,el-> 4-D-GlcNAc«OCH2CH2S-(CH^ CH3, D-Glcdl-> 6-D-Glc<*l-> 4-D-Glc.*l-> 4-D-Glcfl0CH2CH2S-(CH^ CH3, tai D-Gal/81-> 4-GlcNAc/30CH2CH2S-(CH2)^ CH3, 35 jolloin 2 on enintään 24, esim. 7 tai 17. 113 78707

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen O-glykosidi, tunnettu siitä, että sen kaava on D-Gal*l-> 4-D-Gal.*OCH2CH2-S-CH2CH2CONH-R" ' , L-Fuc<*l-> 2-D-Gal/^OCH2CH2SCH2CH2CONH-Rn ' ,

8. Bi-dentaatti-O-glykosidi, tunnettu siitä, että sen kaava on 15 /Jsokeri)n-0-(CH2)2~Si72R, jossa n on kokonaisluku 1-10 ja R on alkyyli,jossa on enintään 25 hiiliatomia, tai aryyli.

9. Menetelmä kaavan (sokeri)n-0-(CH2)2-S-R-R', mukaisen O-glykosidin valmistamiseksi, jossa kaavassa n on kokonaisluku 1-10, R on alkyyli, jossa on enintään 25 hii-25 liatomia, tai aryyli ja R' on H, CHO, CH(OR")2, jossa R" on C1_4-alkyyli; N02, NH2, OH, SH, COOH, COOCH3, COOCH2CH3, CONHNH2 tai CONj, tunnettu siitä, että halogeeni-alkyyli-O-glykosidi, jonka kaava on (sokeri) -O-(CH_)--Hai, 30 n 2 2 jossa Hai on kloori, bromi tai jodi ja n on kokonaisluku 1-10, saatetaan reagoimaan tiolin kanssa, jonka kaava on HS-R-R', 35 jossa R ja R' tarkoittavat samaa kuin edellä. 114 78707