FI83432B - Foerfarande och anordning foer detektering av biologiskt aktiva aemnen. - Google Patents

Description

i 83432

Menetelmä ja laitteisto biologisesti aktiivisten ainesten havaitsemiseksi Tämä keksintö koskee yleisesti ilmaistuna menetel-5 mää ja laitteistoa biologisen aktiivisuuden havaitsemiseksi. Tarkemmin ilmaistuna tämä keksintö koskee menetelmää materiaalien, joissa epäillään esiintyvän mikro-organismeja tai vastaavia, analysoimiseksi nopeasti tekemällä säiliön kaasutilasta otetulla näytteellä IR-analyysi säiliön 10 ulkopuolella sijaitsevassa näytekammiossa.

Kun esimerkiksi bakteereja kasvatetaan soveltuvassa hiililähdettä, kuten glukoosia, sisältävässä alustassa, pilkkoutuu hiililähde muodostaen C02:a bakteerien kasvun ja metabolian aikana. Olisi toivottavaa saada aikaan nopea, 15 herkkä menetelmä kasvualustan yläpuolelle kehittyvän kaa- suatmosfäärin analysoimiseksi, jotta saataisiin määritetyksi biologisen aktiivisuuden läsnä- tai poissaolo.

Monilla aloilla on tärkeä pystyä määrittämään, ovatko aineet biologisesti aktiivisten ainesten, kuten 20 bakteerien ja vastaavien, kontaminoimia vai ei. Esimerkkejä tällaisista aloista ovat lääketiede, elintarviketeollisuus, lääketeollisuus, kosmetiikkateollisuus ja kansanterveystyö.

Tavanomaisena käytäntönä on pitkään ollut sijoittaa - 25 materiaalinäyte, josta biologisesti aktiivisten ainesten läsnäolo on määrä tutkia, petrimaljassa olevalle puoli-kiinteälle ravintoalustalle ja tehdä silmämääräisiä havaintoja tuloksena mahdollisesti olevasta mikrobikasvusta. Toisessa samankaltaisessa menettelyssä siirrostetaan ste-30 riili pullo, jossa on nestemäistä ravintoalustaa, tutkittavalla materiaalilla ja tehdään jälleen havaintoja kasvusta silmämääräisesti. Tällaiset menetelmät eivät ole ainoastaan hitaita ja työläitä, vaan koska ne ovat riippuvaisia yksilöllisten tarkkailijoiden subjektiivisesta 35 arvostelusta, ei saatava tulos ole yhtenäisellä tavalla luotettava.

2 83432

Bakteerien havaitsemiseksi on kehitetty myös menetelmiä, joissa inkuboidaan tutkittavaa materiaalinäy-tettä suljetussa säiliössä, jossa on radioisotoopilla leimattua kasvualustaa, ja tutkitaan sitten säiliössä alustan 5 yläpuolella olevaa kaasukehää sen määrittämiseksi, muodostuuko radioaktiivisia kaasuja vai ei. Tämän tyyppistä järjestelmää kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 676 679 ja 3 935 073. Tällaiset järjestelmät ovat nopeita ja luotettavia, mutta ne kärsivät lukuisista haitoista, joiden syy-10 nä on pääasiallisesti radioaktiivisten aineiden käyttö. Radioisotooppileimatut aineet ovat kalliita ja vaativat erityiskäsittelyä varastoinnin, käytön ja hävittämisen aikana. Lisäksi, vaikka tällaisten järjestelmien käytön yhteydessä esiintyvät radioaktiivisuusmäärät ovat hyvin 15 pieniä, voi mahdollisia käyttäjiä estää henkilökohtainen radioaktiivisuuden pelko.

On kuvattu järjestelmiä, jotka eivät millään tavalla vaadi radioaktiivisuuden käyttöä. US-patenttijulkaisussa 4 182 656 kuvataan menetelmää biologisesti aktiivisten 20 ainesten havaitsemiseksi, joka perustuu stabiilin hiili-13:n suhteen rikastettujen alustojen käyttöön. Vaikka tämä menetelmä poistaa mahdollisen tarpeen käyttää radioiso-tooppeja havaitsemisjärjestelmässä, on hiili-13:n suhteen rikastettuja ravinteita vähemmän saatavana ja ne ovat huo-25 mattavasti kalliimpia kuin vastaavat radionuklidileimatut yhdisteet. Koska 13C02:n molekulaariset ominaisuudet ovat hyvin samanlaiset kuin 12C02:n, joka on hiilidioksidin voimakkaasti vallitseva isotooppimuoto, ja koska 13C muodostaa enemmän kuin 1 % ympäristön koko hiilimäärästä, tulee pi-30 tää erityistä huolta siitä, että 13C02 havaitaan ensisijaisesti samalla kun ympäristön hiilidioksidi jätetään huomiotta. Massaspektrometriä käytetään yleisesti tehtäessä havaintoja stabiilien isotooppien esiintymissuhteiden muutoksista, ja sitä käytettiin myös edellä mainittua patent-35 tia kehitettäessä. Massaspektrometria vaatii suhteellisen il 3 83432 monimutkaisen suurvakuumilaitteiston eikä ole siten soveltuva keino käytettäväksi tyypillisessä mikrobiologisessa laboratoriossa.

US-patenttijulkaisussa 4 073 691 kuvataan ei-radio-5 metristä keinoa biologisesti aktiivisten aineiden havaitsemiseksi tekemällä havaintoja mahdollisesta muutoksesta suljetussa pullojärjestelmässä olevan nestemäisen kasvualustan yläpuolisen kaasun luonteessa. Muutokset kaasun luonteessa määritetään mittaamalla suhde valitun tuotekaa-10 sun ja inertin referenssikaasun, jota myös on läsnä mittauksissa, välillä, ennen kuin pullo on saatettu alttiiksi bakteerien kasvua aikaan saaville olosuhteille ja sen jälkeen. Inertin referenssikaasun käyttäminen suhdemittaus-tarkoituksiin vaatii sen, että havaitsemisjärjestelmä rea-15 goi sekä metabolian seurauksena vapautuvaan C02:een että inerttiin referenssikaasuun, mikä tekee tällaiseen mittaukseen tarvittavasta laitteistosta monimutkaisen. Inerttikaasun pitoisuuden tällaisessa järjestelmässä käytettävässä viljelykaasussa tulee olla tunnettu ja toistet-20 tavissa viljelykaasuerästä toiseen, mikä edelleen monimut kaistaa havaitsemisjärjestelmää.

Radioisotooppien tai stabiilien isotooppien käyttöä tai inerttien referenssiaineiden käyttöä on yleensä pidetty välttämättömänä, jotta saataisiin aikaan metabolian 25 tuottamien pienten kaasumäärien havaitseminen. Bakteerien aineenvaihdunnan tuottamista erilaisista kaasuista on hiilidioksidi se kaasu, jota erilaiset bakteeriheimot, hiivat ja muut alkukantaiset organismit yleisimmin tuottavat. Siten on olemassa tarve kehittää laitejärjestelmä, jolla 30 voidaan mitata metabolisesti syntynyt hiilidioksidi bakteerien ja vastaavien havaitsemiseksi ja joka järjestelmä ei vaadi ravinteiden isotooppirikastusta tai -leimausta eikä ole riippuvainen inertin referenssikaasun lisäämisestä viljelypulloon.

35 Tämän keksinnön päämääränä on siten saada aikaan nopea menetelmä biologisesti aktiivisten ainesten läsnä- 4 83432 tai poissaolon havaitsemiseksi.

Keksinnön toisena päämääränä on saada aikaan menetelmä biologisesti aktiivisten ainesten läsnä- tai poissaolon havaitsemiseksi, jossa menetelmässä käytetään suh-5 teellisen halpoja materiaaleja sekä suhteellisen yksinkertaista laitteistoa.

Keksinnön päämääränä on lisäksi saada aikaan inst-rumentaalimenetelmä biologisesti aktiivisten ainesten läsnä- tai poissaolon havaitsemiseksi, joka ei ole riippu-10 vainen subjektiivisesta tulkinnasta.

Keksinnön päämääränä on myös saada aikaan laitejärjestelmä biologisen aktiivisuuden läsnä- tai poissaolon havaitsemiseksi, jossa vältetään isotooppirikastettujen tai -leimattujen ravinteiden käyttö tai pitoisuussuhde-15 mittauksessa referenssinä käytettävän inertin aineen lisäys .

Keksinnön päämääränä on vielä lisäksi saada aikaan laitejärjestelmä, jossa käytetään IR-analyysiä biologisesti aktiivisten ainesten havaitsemiseen ja jossa saadaan 20 aikaan paras mahdollinen havaitsemisherkkyys sovittamalla yhteen valmistettujen viljelmäsäiliöiden kaasutilan hiili-dioksidisisältö ja laitteeseen testaus-, kalibrointi- ja puhdistustarkoituksessa syötetyn ulkopuolisen viljelykaa-sun kanssa.

25 Nämä ja muut keksinnön päämäärät saavutetaan biolo gisesti aktiivisten ainesten havaitsemiseen tarkoitetulla menetelmällä, joka sisältää seuraavat vaiheet:

Hankitaan suljettavissa oleva steriili säiliö, josta tässä yhteydessä käytetään tavallisesti nimitystä "pul-30 lo" ja joka sisältää steriiliä, ei-isotooppista viljely-alustaa. Alusta sisältää tunnetun pitoisuuden liuennutta hiilidioksidia. Alustan yläpuolella oleva kaasu sisältää sellaisen määrän hiilidioksidia, joka on tasapainossa vil-jelyalustan kanssa. Säiliön kaasutilassa vallitseva hiili-35 dioksidipitoisuus ja hiilidioksidipitoisuus pullotetussa li 5 83432 kaasussa, jota käytetään laitetestauksessa, ovat suurin piirtein yhtä suuret tietyssä alustan pH-arvossa ja halutussa inkubointilämpötilassa. Pullotettua kaasua, jota käytetään erilaisiin laitetestaustarkoituksiin, kutsutaan 5 tässä yhteydessä "viljelykaasuksi".

Materiaalinäyte, jonka biologinen aktiivisuus on määrä tutkia, laitetaan säiliöön ja säiliö suljetaan. Sitten säiliö saatetaan olosuhteisiin, jotka ovat suotuisat normaalien aineenvaihduntaprosessien tapahtumiselle, 10 niin pitkäksi aikaa, että saadaan aikaan kaasumaisen hiilidioksidin muodostuminen alustassa olevien erilaisten hiililähteiden pilkkoutuessa, jos sisään laitetussa näytteessä on läsnä bakteereja.

Pullon ylätilassa oleva kaasu imetään sitten pul-15 losta ja kierrätetään IR-detektiojärjestelmän näytekammion . läpi säiliön kaasutilan hiilidioksidipitoisuuden määrittämiseksi. Mahdollinen merkittävä kohoaminen säiliön yläti-lakaasun hiilidioksidipitoisuudessa pullotetun viljelykaa-sun hiilidioksidipitoisuuteen nähden on osoituksena biolo-20 gisesta aktiivisuudesta. Sovellutusaluetta mitenkään rajoittamatta soveltuu keksinnön mukainen menetelmä erityisesti lääketieteellisesti tärkeiden bakteerien havaitsemiseen.

Jos tutkittava näyte tuottaa metabolista tausta-25 aktiivisuutta, kuten tuoreen kokoveren metabolia-aktiivi suutta, voidaan viljelykaasun C02-pitoisuus sovittaa yhtä suureksi pullon kaasutilan pitoisuuden kanssa, joka saavutetaan halutussa inkubointilämpötilassa sen jälkeen, kun verinäyte tai muu materiaali on lisätty. Bakteerien, hii-30 vojen tai vastaavien läsnäolo näytteessä havaitaan sitten pullon kaasutilan C02-pitoisuuden kohoamisena tähän normaalipitoisuuteen nähden, joka on yhtä suuri kuin viljelykaasun C02-pitoisuus.

Keksintö sisältää myös laitteiston kuvatun menetel-35 män toteuttamiseksi. Laitteistoon kuuluu säiliö, johon 6 83432 voidaan laittaa materiaalinäyte, jonka biologinen aktiivisuus on määrä analysoida, sekä kasvualusta, joka sisältää erilaisia hiililähteitä, joilla on kyky pitää yllä normaaleja aineenvaihduntaprosesseja, joiden eräänä tuloksena on 5 hiilidioksidin tuotanto. Laitteisto sisältää myös välineen näytteen ottamiseksi mainitun säiliön kaasutilasta. Samoin siinä on väline hiilidioksidipitoisuuden mittaamiseksi kaasusta IR-analyysillä. Näytteenottoväline ja mittausväline ovat yhteydessä toisiinsa pneumaattisen jär-10 jestelmän avulla. Laitteistossa on pumppu ylätilakaasun kierrättämiseksi säiliöstä C02:n havaitsemisjärjestelmän kautta takaisin säiliöön. Laitteistossa on myös välineet kaasunkäsittelyjärjestelmän huuhtomiseksi pullotetulla kaasulla mahdollisten näytekaasujätteiden poistamiseksi 15 kierrätys- ja mittausjärjestelmistä ja välineet kaasunkäs-ittelyjärjestelmän testaamiseksi, jotta saadaan varmistetuksi kierrätyspumpun asianmukainen toiminta, viljelykaa-susyötön oikea paine, säiliökaasun näytteenottovälineen asianmukainen pneumaattinen johtokyky, IR-detektiojärjes-20 telmän asianmukainen toiminta ja viljelykaasun asianmukainen C02-pitoisuus.

Laitteessa on edullisesti välineet, joilla voidaan nopeasti ja peräkkäin analysoida useita tutkittavia säiliöitä, joista kukin sisältää oman materiaalinäytteensä, 25 jonka biologinen aktiivisuus on määrä tutkia. Eräässä edullisessa laitteistotyypissä säiliöt pidetään lujasti paikallaan suorakulmion muotoon järjestettyinä tarkoitukseen suunnitellun lautasen avulla. Laitteistossa on väline kaasunäytteenottovälineen siirtämiseksi säiliöriviä pitkin 30 yhdessä suunnassa. Lisäksi laitteistossa on väline lautasen siirtämiseksi suunnassa, joka on kohtisuorassa ensimmäistä mainittua siirtosuuntaa vastaan, niin että kaasu-näytteenottovälineellä saavutetaan jokainen lautasen pystyrivi. Kaasuanalyysi tehdään peräkkäin tietyn pystyrivin 35 kaikille pulloille, minkä jälkeen lautasta siirretään li 7 83432 niin, että seuraava pystyrivi tulee analysoitavaksi.

Laitekontrolli ja tulosten käsittely tehdään mikroprosessoriin perustuvalla systeemillä, jossa ohjelma on talletettu lukumuistiin (ROM) ja tulokset talletetaan lu-5 kukirjoitusmuistiin (RAM). Operaattorinitäntä saadaan aikaan tavanomaisella tietokonepäätteellä, joka on liitetty järjestelmään käyttämällä RS-232-sarjaliikennekäytän-töä. Samanlaista RS-232C-porttia käytetään kommunikointiin ulkopuolisen tietojenkäsittelyjärjestelmän kanssa.

10 Laitteiston ohjelmisto antaa käyttäjälle mahdolli suuden asettaa laitteen toimintaparametrit, asettaa ha-vaintokriteerit, joille positiiviset tulokset perustuvat, rekisteröidä näytesäiliöt systeemiin, saada tutkittavien näytteiden tuloshistoria, saada luettelo uusista positii-15 visista tuloksista, testata näytesäiliöt manuaalisesti au tomaattisesta toimintaohjelmasta riippumatta sekä tehdä systeemin päivittäinen käyttöhuolto.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle, laitteistolle ja kasvualustalle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk-20 sissa mainitaan.

Kuvio 1 esittää laitteistoa, jota käytettiin tämän keksinnön toteuttamiseen.

Kuvio 2 on kaaviokuva esitetyn laitteiston pääkom-ponenteista.

. 25 Kuvio 3 on kaaviokuva esitetyssä laitteistossa käy tetystä pneumaattisesta järjestelmästä.

Kuvio 4 on ajoituskaavio, joka kuvaa pneumaattisen järjestelmän esihuuhtelusykliä.

Kuvio 5 on ajoituskaavio, joka kuvaa pneumaattisen 30 järjestelmän säiliön testausosasykliä.

Kuvio 6 on yksinkertaistettu juoksukaavio laitteiston sähköjärjestelmästä.

Kuvioissa 7-12 kiinteällä viivalla piirretty käyrä kuvaa 9 tai 10 siirrostetun näytteen keskiarvoa ja katko-35 viivalla piirretty käyrä 40 siirrostamattoman vertailu- 8 83432 näytteen keskiarvoa.

Kuvio 7 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detektio-kokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille Neisseria meningitidis aerobisesti.

5 Kuvio 8 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detektio- kokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille Streptococcus pneumoniae aerobisesti.

Kuvio 9 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detektio-kokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille 10 Haemophilus influenzae aerobisesti.

Kuvio 10 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detek-tiokokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille Streptococcus pneumonia anaerobisesti.

Kuvio 11 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detek-15 tlokokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille

Bacteroides fragilis anaerobisesti.

Kuvio 12 on käyrä, joka kuvaa tuloksia IR-detektio-kokeesta, joka tehtiin vaativalle mikro-organismille Bacteroides vulgatus.

20 Kuvioissa 13-26 umpinaisten ympyröiden kautta piir retty käyrä esittää keksinnön mukaisella IR-menetelmällä detektoitujen 8 siirrostetun näytteen keskiarvoa; umpinaisten kolmioiden kautta piirretty käyrä kaupallisilla radiometrisillä detektiomenetelmillä havaittujen 8 siir-25 rostetun näytteen keskiarvoa; avoimien ympyröiden ja avoimien kolmioiden kautta piirretyt käyrät esittävät IR-menetelmällä ja vastaavasti radiometrisillä menetelmillä detektoitujen 8 siirrostamattoman vertailuverinäytteen keskiarvoa, havaitsemisraja osoitetaan nuolella (-*).

30 Kuvio 13 on käyrästö, joka esittää kineettisen de- tektiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektiojärjestelmän reagointia tavanomaisen radiometrisen detektio-järjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Escherichia coli, inkubointiajan funktiona.

35 Kuvio 14 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek- li 9 83432 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektiojärjestelmän reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojär-jestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Klebsiella pneumoniae, inkubointiajan funktiona.

5 Kuvio 15 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek- tiokokeen tuloksia, jossa verrataan IR-detektiojärjestel-män reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjes-telmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Pseudomonas aeruginosa, inkubointiajan funktiona.

10 Kuvio 16 on käyrästö, joka esittää kineettisen de- tektiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Staphylococcus aureus, inkubointiajan funktiona.

15 Kuvio 17 on käyrästö, joka esittää kineettisen de- tektiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektointijärjes-telmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Staphylococcus epidermidis, inkubointiajan funktiona.

20 Kuvio 18 on käyrästö, joka esittää kineettisen de- tektiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Streptococcus faecalis, inkubointiajan funktiona.

25 Kuvio 19 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek- tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Streptococcus pneumonia, inkubointiajan funktiona.

30 Kuvio 20 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek- tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Haemophilus influezae, inkubointiajan funktiona.

35 Kuvio 21 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek- tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin 10 83432 reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Candida albicans, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 22 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek-5 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin aerobisesti tutkitun mikro-organismin Neisseria meningitidis, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 23 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek-10 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektointijärjestelmän reagointiin anaerobisesti tutkitun mikro-organismin Clostridium novyii, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 24 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek-15 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektointijärjestelmän reagointiin anaerobisesti tutkitun mikro-organismin Clostridium perfringens, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 25 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek-20 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin tuloksia tavanomaisen radiometrisen detektiojärjestelmän reagointiin anaerobisesti tutkitun mikro-organismin Bac-teroides fragilis, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 26 on käyrästö, joka kuvaa kineettisen detek-25 tiokokeen tuloksia, ja jossa verrataan IR-detektoinnin reagointia tavanomaisen radiometrisen detektiojär jestelmän reagointiin anaerobisesti tutkitun mikro-organismin Bac-teroides vulgatus, inkubointiajan funktiona.

Kuvio 27 on pylväsdiagrammi, joka kuvaa detektioon 30 kuluneiden aikojen erotusta kahden samanlaisiksi säädetyn säiliön välillä, jotka tutkittiin kineettisesti IR-detek-tion vertaamiseksi tavanomaiseen radiometriseen detektioon. Tulokset annetaan kokeessa kuluneiden aikojen erotuksina kahden järjestelmän välillä.

. 35 Kuvio 28 on käyrä, joka kuvaa anaerobisen mikro- organismin Bacteroides fragilis, kasvun antamaa IR-reak- 11 83432 tiota steriilin vertailunäytteen antamaan reaktioon verrattuna, kun käytetty laitteiston viljelykaasu ei sisällä hiilidioksidia.

Kuvio 29 on käyrä, joka kuvaa anaerobisen mikro-5 organismin Bacteroides fragilis, kasvun antamaa IR-reak-tiota steriilin vertailunäytteen antamaan reaktioon verrattuna, kun käytetty laitteiston viljelykaasu sisältää 2 % hiilidioksidia.

Kuvio 30 on käyrä, joka kuvaa anaerobisen mikro-10 organismin Bacteroides fragilis, kasvun antamaa IR-reak-tiota verrattuna steriilin vertailunäytteen antamaan reaktioon, kun laitteistossa käytetty viljelykaasu sisältää 5 % hiilidioksidia.

Kuvio 31 on käyrä, joka kuvaa anaerobisen mikro-15 organismin Bacteroides fragilis, kasvun antamaa IR-reak-tiota verrattuna steriilin vertailunäytteen antamaan reaktioon, kun laitteistossa käytetty viljelykaasu sisältää 10 % hiilidioksidia.

Kuvio 32 on käyrä, joka esittää hiilidioksidin va-20 pautumista bikarbonaatilla täydennetystä anaerobisesta alustasta suolahappolisäyksen funktiona.

Kuvio 33 on käyrä, joka kuvaa IR-detektion reaktiota mikro-organismin Bacteroides fragilis, inkubointiajan funktiona, kun käytettiin bikarbonaatilla täydennettyä 25 kasvualustaa ja täydentämätöntä alustaa.

Kuviossa 1 esitetään yleisesti detektiolaitteisto, joka toteuttaa keksinnön periaatteita ja suuntaviivoja. Säiliöt 1, joista biologinen aktiivisuus on määrä määrittää, ovat järjestettyinä suorakaiteen muotoisille lauta-30 sille 2, jotka on sijoitettu paikalleen tutkimuspöydälle. Läpinäkyvä saranoitu pölysuoja 3 suojaa säiliötä tutkimuksen aikana ulkopuoliselta kontaminoitumiselta ja toimii käyttäjälle työskentelypintana. Analyysi- eli testauspää 4, joka sijaitsee käyttäjän avattavissa olevan kannen 5 35 takana, liikkuu lautasen y-akselin suunnassa ja mittaa kukin peräkkäisen säiliön kaasutilan hiilidioksidipitoi- i2 83432 suuden. Kun kukin pystyrivin säiliö on mitattu, lautanen siirtyy testauspään alla siten, että seuraava pystyrivi säiliöitä tulee tutkittavaksi. Laitteisto on mikroprosessoriin perustuva, ja kaikki toiminnan ohjaus ja yhteydet 5 käyttäjään tapahtuvat CRT-päätteen kautta. Koetulokset ja muu käyttäjää kiinnostava tieto ovat saatavissa myös erillisellä kirjoittimella (ei kuviossa).

Laitteisto on erityisen käyttökelpoinen, kun halutaan varhaisessa vaiheessa todeta useimpien lääketie-10 teellisesti merkittävien bakteereiden yleinen läsnäolo sellaisissa materiaaleissa kuin veri, virtsa, selkäydinneste, nivelvoideneste, vesinäytteet ja vastaavat. Tällaisten bakteerien läsnäolo on helppo havaita mittaamalla vapautuvan C02:n määrä, kun analysoitava materiaali sijoi-15 tetaan kasvualustaan, joka sisältää yhtä tai useampaa hii-lilähdettä, joka pilkkoutuu muodostaen C02:a, ja alustaa ja siinä olevaa näytettä inkuboidaan sen jälkeen. Alustan päältä otetun kaasunäytteen C02-pitoisuus, joka on merkittävästi suurempi kuin valitun viljelykaasun C02-pitoisuus, 20 on osoitus mikro-organismien läsnäolosta alkuperäisessä materiaalinäytteessä.

Kuviossa 2 esitetään kaavamaisesti laitteiston pääosat. Analysoitava materiaalinäyte, kuten veri, virtsa tai vastaava, sijoitetaan steriiliin viljelysäiliöön 1, joka 25 on varustettu itsesulkeutuvalla kumiseptumi11a ja alumii-nikapselilla. Säiliössä on soveltuvaa kasvualustaa 2, joka on puskuroitu siten, että se pysyy halutussa pH-arvossa ja alustan yläpuolella olevaan kaasutilaan 3 saadaan haluttu C02-pitoisuus. Sitten säiliötä inkuboidaan olosuhteissa, 30 jotka ovat suotuisat biologiselle aktiivisuudelle. Sopivin väliajoin neulalaitteen 4 kaksi onttoa, ruostumattomasta teräksestä valmistettua, teräväkärkistä neulaa 5 ja 6 painetaan kohdalla olevan pullon septumin läpi. Pneumaattinen järjestelmä 10, jossa on pumppu 11, kierrättää säiliön 35 ylätilakaasua neulan 5, submikronisuodattimen 7, IR-C02-

II

i3 83432 analysaattorin 13 mittauskammion 12, submikronisuodattimen 8 ja neulan 6 kautta takaisin pulloon. Tuloksena oleva C02-lukema muutetaan digitaaliseksi ja rekisteröidään tieto-jenkäsittely/säätöjärjestelmään 14. Tulokset esitetään 5 tietojenkäsittely/säätöjärjestelmään liitetyn CRT-päätteen 15 tai kirjoittimen 16 avulla.

Kunkin mittauksen jälkeen neulalaite vedetään pois säiliöstä, ja ulkopuolisesta lähteestä 17 tulevaa aerobista tai anaerobista viljelykaasua käytetään poistamaan neulo lalaitteesta, pneumaattisesta järjestelmästä ja IR-näyte- kammiosta 12 mittausjärjestelmään mittauksen seurauksena jäänyt ylätilakaasu. Neulan kuumennin 9 siirretään sitten neulojen 5 ja 6 ympärille ja neulat kuumennetaan sellaiseen lämpötilaan, joka suuresti vähentää sitä mahdolli-15 suutta, että neuloihin tai neuloille mahdollisesti jääneet elävät organismit pääsevät seuraaviin säiliöihin ja aiheuttavat ristikontaminoitumista. Useiden säiliöiden testaaminen automaattisesti saadaan aikaan käyttämällä lautasta 18, joka on valmistettu siten, että siihen voidaan 20 asettaa useita säiliöitä suorakulmion muotoon järjestet tyinä. Laitteistossa on liikuttamis- ja tuntoelimet, jotka siirtävät lautasta laitteiston tutkimuspöydän y-akselin suunnassa. Osat 4-9 muodostavat testauspääkokoonpanon 19, joka sisältää tuntoja liikuttamiselimet, jotka siirtävät 25 kokoonpanoa kokonaisuudessaan tutkimuspöydän x-akselin suunnassa.

Koska C02-pitoisuuden steriilin pullon kaasutilassa inkubointilämpötilassa määrää kemiallinen tasapaino, joka asettuu alustan formuloinnin ja säiliön täytön aikana val-30 mistuksen yhteydessä, ja koska ulkopuolisen viljelykaasun C02-pitoisuus valitaan siten, että se on suurin piirtein yhtä suuri kuin steriilin säiliön kaasutilassa vallitseva C02:n tasapainopitoisuus, voidaan korjaus kaasutilan C02-pitoisuuden suhteen tehdä vähentämällä viljelykaasulle 35 mitattu arvo. Steriiliä materiaalia sisältävien, inkuboi- i4 83432 tujen ja mitattujen säiliöiden korjatut C02-lukemat ovat siten hyvin lähellä nollaa, kun taas säiliöille, joissa esiintyy biologista aktiivisuutta, saadaan korjattuja lukemia, jotka ovat tilastollisesti merkitsevän määrän nol-5 laa suurempia korjatuille lukemayksiköille, jotka kalibroidaan siten, että ne muistuttavat lukemia, jotka saadaan radiometrisellä BACTEC-laitteella, jota myy Johnston Laboratories Division on Becton Dickinson and Company, Coc-keysville, Maryland, on annettu nimitys "kasvuarvoyksik-10 kö", josta käytetään lyhennettä "GV".

Laitteiston pneumaattisen järjestelmän yksityiskohdat esitetään kaavamaisesti kuviossa 3. Ulkopuolisesta painesäädellystä lähteestä tuleva viljelykaasu, jota käytetään aerobista alustaa sisältävien säiliöiden mittaami-15 seen, suodatetaan hiukkassuodattimella F3 ja syötetään sitten järjestelmän muihin osiin sähkökäyttöisen solenoi-dlventtiilin V3 kautta. Anaerobisia viljelmiä sisältävien säiliöiden tutkimiseen käytettävä anaerobinen viljelykaasu syötetään samalla tavalla ja suodatetaan suodattimena F4 20 ja sen virtausta säädellään solenoidiventtiilillä V4.

Pneumaattiset vastukset Rl ja R2 saavat aikaan virtauksesta riippuvat paineen alenemiset pneumaattisen piirin kummassakin haarassa. Paineantureita PT1 ja PT2 käytetään mittaamaan toimintapaineet pneumaattisen piirin kummas-25 sakin haarassa. Toimintasyklin eri vaiheissa saatavia lukemia käytetään varmistamaan laitteiston asianmukainen toiminta ja saamaan aikaan riittävä vikojen havaitseminen sen varalta, että tapahtuu vuotoja, tukkeutumisia tai pumpun rikkoutumisia. Solenoidiventtiilit VI ja V2 eristävät 30 kaasutilanäytteenottopiirin järjestelmän muista osista. Kalvopumppu P kierrättää ylätilakaasua näytteenottopiiris-sä mittauksen aikana ja saa aikaan järjestelmän huuhtomi-sen ja toimintatestauksen vaatimat paine-erot.

Mitattaessa säiliöstä ylätilakaasun C02-pitoisuus 35 neulat Nl ja N2 lävistävät viljelmäsäiliön CC elastomeeri- li is 83432 tulpan. Ylätilakaasu vedetään neulan N1 kautta steriloin-tl/plsarasuodattimen F1 läpi ja sitten ei-dispersiivisen IR-analysaattorin mittauskennon SC läpi pumpun P avulla. Ylätilakaasu palautetaan säiliöön NH ja sen tarkoitus on 5 auttaa estämään seuraavien viljelysäiliöiden kontaminoituminen, joka aiheutuu epästeriileistä vieraista aineista, joita kerääntyy näytteenottoneuloihin tai -neuloille positiivisten viljelmien kaasunäytteistä, mittausjärjestelmän toimintatestauksen aikana tai neulalaitteiston joutuessa 10 ympäristön ilman vaikutukselle alttiiksi laitteiston ollessa käyttämättömänä. Pneumaattinen järjestelmä yhdessä ei-dispersiivisen IR-hiilidioksidianalysaattorin kanssa muodostaa laitteiston mittausjärjestelmän. Soveltuva ei-dispersiivinen IR-analysaattori on Series V C02 IR Analyzer 15 (Sensors, Inc., Saline M148176). Soveltuvien solenoidi-venttiilien toimittaja oli ITT General Controls (Glendale, CA 91201). Mainittuihin painemittauksiin soveltuvia paine-antureita on saatavissa MicroSwitch Division of the Honeywell Corporationista (Freeport, IL 61032). Pneumaattiseen 20 järjestelmään soveltuva kalvopumppu koostuu pumppupäästä Model N05 (KNF Neuberger, Inc., Princeton, NJ 08540), joka on liitetty moottoriin P/N DB31D-12 (Eastern Air Devices, Dover, NH 03820). Vaikka tässä kuvattu mittausjärjestelmän osien valinta ja asennus sopii tämän keksinnön toteuttami-25 seen, voidaan muitakin osia ja asennuksia käyttää, kuten alan asiantuntijoille on selvää.

Tässä esitetyllä menetelmällä tehtävä järjestetyn näytesäiliöryhmän biologisen aktiivisuuden tutkiminen, toimintatestaus ja neulojen kuumennus mukaan luettuina, 30 muodostaa laitteiston yhden testaussyklin, jonka suorittaa mittausjärjestelmä ja jota ohjaa tietojenkäsittelyjärjestelmä. Kokonainen testaussykli koostuu esihuuhteluosasyk-listä, joka tehdään kullekin tutkittavalle säiliöryhmälle, ja säiliöiden testaus -osasyklistä, joka tehdään erikseen 35 ryhmän kullekin säiliölle. Koska laitteiston testaussyklin is 83432 yksityiskohdat riippuvat suuresti mittausjärjestelmän komponenttien valinnasta ja laitteiston ohjausohjelmiston rakenteesta, on seuraava testaussyklin toiminnan kuvaus esimerkkinä niistä erilaisista laitetoiminnoista, joita 5 tarvitaan toteutettaessa menetelmä käyttämällä keksinnön mukaisen laitteiston prototyyppiversiota.

Erilaisia pneumaattisen järjestelmän ja IR-analy-saattorin toimintatestejä tehdään testaussyklin aikana tietoj enkäsittelyj ärj estelmän/ohj ausj ärj estelmän ohj aukio sessa. Se, että halutaan kyetä testaamaan kaikki mittausjärjestelmän tärkeät komponentit, on suurelta osin syynä siihen, että käytetään suhteellisen monimutkaista pneumaattista järjestelmää kaasunäytteenottopiirin komponenttien lisäksi (Nl, Fl, SC, F2, N2 kuviossa 3).

15 Esihuuhteluosasykli on helpoimmin ymmärrettävissä kuviossa 4 esitetyn ajoituskaavion ja kuvion 3 pneumaattisen järjestelmän kaavion avulla. Testaussyklin alussa esihuuhteluosasykli alkaa sillä, että testauspää ja siihen liittyvä neulalaite nostetaan ylös, ja ne joutuvat siten 20 ympäröivän huoneilman vaikutuksen alaisiksi. Kaikki sole-noidiventtiilit ovat suljettuina. Oletetaan, että on määrä tutkia aerobisia säiliöitä, joten viljelykaasua syötetään tarvittaessa V3:n kautta. Pumppu P käynnistetään hetkeksi, niin että IR-analysaattorin näytekammio SC täyttyy huone-- 25 ilmalla, jota virtaa neulojen Nl ja N2 kautta. Myös neulojen kuumennin NH laitetaan päälle tässä vaiheessa kuumentimen esilämmittämiseksi jäljempänä tehtäviä testejä varten ja paljaina oleville neuloille kertyneistä materiaaleista aiheutuvan järjestelmän biologisen kontaminoitumi-30 sen estämiseksi. Analysaattorin annetaan stabiloitua vähän aikaa; neulojen kuumennin pidetään neulalaitteen ympärillä tämän aikaa.

Stabiloitumisjakson lopussa otetaan analysaattorin antama lukema ja verrataan sitä tietojenkäsittelyjärjes-35 telmään talletettuun huoneilman C02-pitoisuuden ylä- ja i7 83432 alarajoihin. Normaali lukema sallii testauksen jatkumisen; epänormaali arvo keskeyttää testauksen ja antaa käyttäjälle kehotuksen tarkistaa IR-analysaattorin nollasäätö. Tässä vaiheessa avataan venttiili V3 lyhyeksi aikaa, otetaan 5 paineantureiden PT1 ja PT2 lukemat ja verrataan niitä talletettuihin parametreihin sen varmistamiseksi, että vilje-lykaasua tulee asianmukaisella syöttöpaineella, samoin kuin paineantureiden asianmukaisen toiminnan tarkistamiseksi . Paineantureiden antamien lukemien erotusta ver- 10 rataan talletettuun vakioon, ja laite antaa kehotuksen huoltaa paineanturit, jos muistissa oleva arvo ylitetään. PTlzn lukemaa verrataan sitten toiseen vakiopariin, jotka ovat lukeman ylä- ja alarajat, ja laite antaa varoituksen liian suuresta tai pienestä viljelykaasun paineesta, ellei 15 lukema osu rajojen sisään. Testaus keskeytyy kummassakin tapauksessa.

Sitten venttiili V3 suljetaan viljelykaasun säästämiseksi, samalla kun neulojen kuumennus jatkuu niin pitkään, että neulojen sisälämpötila saavuttaa halutun arvon. 20 Sitten neulojen kuumennus lopetetaan, kuumennuslaitteen poisto aloitetaan, pumppu P käynnistetään ja venttiilit VI, V2 ja V3 avataan, jolloin viljelykaasu pääsee virtaamaan pneumaattisen järjestelmän läpi ja IR-näytekammio SC ja pumppu P1 täyttyvät viljelykaasulla. Kaasun annetaan 25 kiertää useita sekunteja sen varmistamiseksi, että järjestelmä on huuhdottu ja täytetty viljelykaasulla. Sitten otetaan paineantureiden PT1 ja PT2 lukemat ja niiden erotusta verrataan aiemmin talletettuun rajaan pumpun asianmukaisen toiminnan varmistamiseksi. Normaalirajoissa oleva 30 erotus sallii testauksen jatkumisen; epänormaali erotus keskeyttää testauksen ja saa aikaan kehotuksen tarkistaa pumppu ja liitosputkisto. Sitten pysäytetään pumppu P, minkä jälkeen venttiilit VI, V2 ja V3 suljetaan.

IR-analysaattorin annetaan stabiloitua jonkin ai-35 kaa. Sitten luetaan IR-analysaattorin lukema, vähennetään is 8 3 432 muistissa oleva huoneilman antama lukema ja verrataan tulosta valitulle viljelykaasulle annettuihin normaalirajoihin. Rajojen sisäpuolella oleva normaali tulos sallii testauksen jatkumisen; epänormaali tulos keskeyttää tes-5 tauksen ja antaa kehotuksen tarkistaa, onko viljelykaasun C02-pitoisuus joko liian suuri tai pieni ja toimiiko mittausjärjestelmä. Viljelykaasun C02-pitoisuus talletetaan myös tietojenkäsittelyjärjestelmän muistiin, ja sitä käytetään korjattaessa mitatut pullojen ylätilakaasun pitoi-10 suuslukemat tämän menetelmän mukaisesti.

Sitten käynnistetään pumppu P ja avataan venttiilit VI ja V3 V2:n ollessa kiinni, jolloin viljelykaasu virtaa neulojen N1 ja N2 kautta ulos. Sitten otetaan anturin PT2 lukema ja verrataan sitä muistissa oleviin ylä- ja alara-15 joihin sen varmistamiseksi, ettei viljelykaasun paine ole liian suuri eikä liian pieni. Epänormaalit lukemat keskeyttävät testauksen ja antavat käskyn tarkistaa ulkoisen kaasulähteen paine, oli se sitten liian suuri tai pieni. Sitten pumppu pysäytetään, mikä katkaisee yhteyden järjes-20 telmän kahden haaran välillä, ja venttiili V2 avataan. Venttiilien VI, V2 ja V3 ollessa nyt auki viljelykaasu virtaa pneumaattisen järjestelmän kummankin haaran kautta ja ulos neuloista N1 ja N2. Paineantureiden PT1 ja PT2 lukemat otetaan jälleen ja niitä verrataan erikseen muis-25 tissa oleviin arvoihin sen varmistamiseksi, että paineen alenema, jonka kumpikin neula ja suodatin aiheuttaa on hyväksyttävissä rajoissa. Väärä tulos keskeyttää testauksen ja antaa kehotuksen tarkistaa neulat suodattimien tukkeutumien suhteen (suuri paine) tai tarkistaa letkuliitok-30 set (pieni paine). Sitten venttiilit VI, V2 ja V3 suljetaan ja esihuuhteluosasykli päättyy.

Säiliöntutkimusosasykli seuraa esihuuhteluosasykliä ja se toistetaan kullekin tutkittavalle säiliölle. Laitteiston ajoitus testausosasyklin aikana esitetään kuviossa ·· 35 5, jossa viitataan pneumaattiseen järjestelmään, joka esi- i9 83432 tetään kuviossa 3. Tämän osasyklin alussa kaikki venttiilit ovat suljettuina ja neulojen kuumennin poissa päältä. Mittausjärjestelmä, johon kuuluvat neulat N1 ja N2, näyte-kammio SC ja niitä yhdistävät putket, sisältää pelkkää 5 viljelykaasua esihuuhtelun seurauksena. Lautasta ja tes-tauspäätä liikutetaan siten, että ensimmäinen tutkittava säiliö tulee testauspään alle, kuten aiemmin esitettiin kuviossa 2. Pullon oikea asema määritetään erilaisten optisten antureiden (ei kuviossa), jotka ovat tietojenkä-10 sittelyjärjestelmän ohjauksessa, avulla. Asianmukaisen asennon olemassaolo x- ja y-akselin suunnassa on testaus-syklin nollahetki. Ennalta valittua viljelykaasulähdettä käytetään joko aerobiseen tai anaerobiseen testaukseen, ja sitä verrataan koodinumerolla varustettuun säiliölautaseen 15 sen varmistamiseksi, että on valittu oikea viljelykaasu. Yhteensopivuus johtaa testauksen jatkumiseen, kun taas epäsopivuus keskeyttää kokeen ja johtaa varoitukseen väärän viljelykaasun valinnasta.

Venttiili V3 avataan, jolloin viljelykaasua pääsee 20 järjestelmään, anturit PT1 ja PT2 luetaan ja lasketaan niiden erotus. Erotus, joka ylittää muistissa olevan rajan, johtaa kehotukseen huoltaa paineanturit, kun taas PTl:n lukema, joka on annettujen ylä- ja alarajojen ulkopuolella, johtaa kehotukseen tarkistaa, onko viljelykaasun 25 paine liian suuri tai liian pieni. Sitten venttiili V3 suljetaan. Sen jälkeen testauspää painetaan alas, jolloin neulat N1 ja N2 tunkeutuvat säiliön elastomeeritulpan läpi ja avaavat tien säiliön kaasutilaan. Sitten käynnistetään pumppu P, jolloin ylätilakaasua siirtyy pneumaattisen jär-30 jestelmän näytteenottohaaraan.

Ylätilakaasukierron suljettu luonne aiheuttaa sen, että ylätilakaasu laimenee viljelykaasulla suhteessa, joka on riippuvainen säiliön kaasutilan ja näytteenottohaaran tilavuuksien suhteesta, mikä puolestaan saa aikaan sen, 35 että mitattu C02-pitoisuus on erilainen kuin kaasutilan 2o 83432 C02-pitoisuus ennen näytteenottoa. Tämä väistämätön laimentuminen tulee tehdä mahdollisimman pieneksi tämän testausmenetelmän tehokkuuden säilyttämiseksi. Ihannetapauksessa näytteenottohaaran tilavuus on hyvin pieni verrat-5 tuna säiliön kaasutilavuuteen, minkä seurauksena on yläti-lakaasun merkityksetön laimentuminen sen kiertäessä näytteenottohaaran läpi. Käytännön syistä saavutettavissa oleva pienin laimentuminen on noin 50 %, arvo, joka saavutetaan vain minimoimalla huolellisesti liitosputkien pituu-10 det pneumaattisessa järjestelmässä, valitsemalla kuolleelta tilavuudeltaan mahdollisimman pienet solenoidiventtii-lit ja muilla sen kaltaisilla toimilla. Mittauksen vaatiman korjauksen minimoinnin kannalta ja sen kannalta, että testin herkkyys biologisen aktiivisuuden aiheuttamalla 15 kaasutilan C02-pitoisuuden nousulla, saadaan mahdollisimman hyväksi, on tämän keksinnön eräänä tärkeänä näkökohtana se, että ulkoisen viljelykaasun C02-pitoisuus on säädettävissä suurin piirtein yhtä suureksi kuin steriilin pullon kaasutilan C02-pitoisuus inkubointilämpötilassa ennen tut-20 kittavan näytteen lisäämistä. Tämä on tärkeää tässä esitetyn menetelmän käytännön toteutuksen kannalta.

Valitun viljelykaasun hiilidioksidipitoisuus säädetään suurin piirtein yhtä suureksi kuin suljetun pullon kaasutilassa ennen näytteen lisäystä ja inkubointia val-25 litseva hiilidioksidipitoisuus. Yleensä anaerobinen vilje-lykaasu sisältää noin 1 - 10 % hiilidioksidia ja noin 0 - 10 % vetyä lopun ollessa typpeä. Aerobinen viljelykaa-su sisältää yleensä noin 1-10 % hiilidioksidia loppuosan ollessa ilmaa. Steriilin pullon kaasutilassa vallitseva 30 C02-pitoisuus riippuu olosuhteista, joissa kasvualusta lisätään, ja kasvualustan koostumuksesta ja määrästä. Eräässä keksinnön edullisessa muodossa on ylätilakaasun C02-pi-toisuus 60 ml:n pullossa, jossa on 30 ml anaerobista kasvualustaa, noin 3-5 %. Kaikki tässä ilmoitetut prosentti-35 osuudet ovat tilavuusprosenttiosuuksia, ellei erityisesti 2i 83432 toisin mainita. Samanlaisessa pullossa, jossa on 30 ml aerobista kasvualustaa, on kaasutilassa vallitseva C02-pi-toisuus noin 2-3 %.

Neulojen kuumennin laitetaan päälle ja pumppua käy-5 tetään niin pitkään, että viljelykaasun ja ylätilakaasun täydellinen sekoittuminen näytteenottohaarassa ja viljel-mäpullossa varmistuu. Sitten pumppu suljetaan ja IR-analy-saattorin annetaan stabiloitua, samalla kun testauspää nostetaan ylös, jolloin neulat poistuvat viljelysäiliöstä. 10 Sitten luetaan IR-analysaattorin antama tulos, käsitellään se tietojenkäsittelyjärjestelmällä ja talletetaan muistiin. Sitten suljetaan venttiilit VI, V2 ja V3 ylätilakaa-sunäytteen huuhtomiseksi pois näytehaarasta. Venttiilit VI, V2 ja V3 suljetaan, samalla kun ennalta päälle kytket-15 ty neulojen kuumennuslaite viedään neulojen ympärille ja pumppu käynnistetään, huoneilman kierrättämiseksi näyte-haaran läpi. Sitten pumppu sammutetaan lyhyeksi ajaksi ja annetaan neulojen kuumennuksen jatkua neuloissa tai neuloilla mahdollisesti olevan biologisesti aktiivisen aineen 20 poistumisen edistämiseksi.

Vähän ennen neulojen kuumennuksen lopettamista pumppu käynnistetään jälleen, minkä jälkeen avataan VI ja V2. Sitten luetaan paineanturi PT2 ja arvoa verrataan talletettuihin rajoihin asianmukaisen viljelykaasun paineen 25 varmistamiseksi. Mittaus jatkuu lukeman ollessa normaali; asetettujen rajojen ylä- tai alapuolella oleva epänormaali arvo saa aikaan mittauksen keskeytymisen ja kehoituksen tarkistaa, onko viljelykaasun paine liian suuri tai pieni. Sitten avataan venttiili V2 VI:n ja V3:n ollessa edelleen 30 avoinna ja pumpun jatkaessa käyntiään. Viljelykaasun annetaan virrata ulos neulojen N1 ja N2 kautta. Anturit PT1 ja PT2 luetaan jälleen ja paineiden erotusta verrataan talletettuun arvoon. Talletettua vakioarvoa pienempi tulos saa aikaan mittauksen keskeytymisen ja kehoituksen tarkistaa 35 pumppu ja siihen liitetyt putket. PTl:n ja PT2:n painelu- 22 83 432 kemat tarkistetaan ja arvoja verrataan ennalta talletettuihin lukemiin sen varmistamiseksi, että putkiliitokset ovat pitäviä ja että neuloissa ja suodattimissa ei ole tukkeumia. Epänormaali arvo saa aikaan mittauksen kes-5 keytymisen ja kehotuksen tarkistaa putkiliitokset alhaisen paineen ollessa kyseessä tai sen, esiintyykö tukkeumia jomman kumman anturin rekisteröidessä liian suuren paineen.

Sitten avataan V2 ja suljetaan pumppu, jolloin vil-10 jelykaasu virtaa pneumaattisen järjestelmän kumpaankin haaraan. PT1 ja PT2 luetaan jälleen, ja niiden lukemia verrataan talletettuihin arvoihin sen varmistamiseksi, että paineen alenema kummassakin neulassa ja siihen liittyvässä suodattimessa on hyväksyttävissä rajoissa. Epänor-15 maalit tulokset saavat aikaan säiliöiden tutkimisen keskeytymisen ja kehotuksen tarkistaa kaikki putkiliitokset paineen ollessa alhainen tai tarkistaa, onko neuloissa ja suodattimissa tukkeumia, paineen ollessa suuri. Kaikki venttiilit suljetaan sitten ja näytteensiirtäjä käynniste-20 tään siirtämään testauspää ja/tai lautanen sopivaan kohtaan järjestyksessä seuraavan säiliön tutkimiseksi, minkä jälkeen säiliöntestausosasykli alkaa uudelleen.

Mittausjärjestelmän, lautasen liikkumisen ja tes-tauspään liikkumisen ja toiminnan ohjaus tapahtuu tieto-25 jenkäsittely/ohjausjärjestelmällä yhdessä tarvittavan elektroniikan kanssa, kuten kuviossa 6 esitetään kaavamaisesti. Päävirta vakioidaan suodattimena 1 kotimaisten ja ulkomaisten radiotaajuusero-ohjeiden mukaiseksi. Suodatettu 120 V:n vaihtovirta syötetään päävirtalähteeseen 2, 30 vaihtovirtaohjauspiiriin 3 ja neulojen kuumentimen voiman lähteeseen 4. Suodatettua 120 V:n vaihtovirtaa käytetään myös virtalähteenä CRT-päätteelle ja kirjoittimelle. Tietojenkäsittely /ohjausjärjestelmästä 5 tulevat logiikkatason signaalit ohjaavat mittausjärjestelmään 6 liittyvien 35 vaihtovirtaa tarvitsevien moottoreiden, solenoidiventtii-

II

23 83432 lien ja vastaavien toimintaa, lautasen liikutuslaitetta 7 ja testauspäätä 2 vaihtovirtaohjauspiirissä olevien puoli-johdekytkimien kautta.

Neulojen kuumentimen voimanlähde antaa tasavirtaa, 5 jotta estettäisiin viive neulojen kuumennustehossa kuumen-nusosien vastuksen kasvaessa niiden vanhetessa. Kuumentimen päälle- ja poiskytkemiskäskyt antaa ohjausjärjestelmä, joka myös seuraa kuumentimen voimanlähteen antamaa vika-signaalia kuumentimen asianmukaisen toiminnan varmista-10 miseksi. Ohjausjärjestelmä ohjaa myös solenoidiventtiilejä ja näytteenottopumpun käyntiä sekä hyväksyy paineantureilta ja IR-analysaattorilta tulevat analogiset lukemat edellä kuvatulla tavalla. Kaikki analogiasignaalit käsitellään monikanavaisella analogiadigitaalimuuntimella en-15 nen signaalien käsittelyä. Lautasen liikkeitä ohjaavat optiset tuntoelimet, jotka määrittävät lautasen sijainnin ja varmistavat lautasen koodin sen takaamiseksi, että valittu aerobinen tai anaerobinen kaasu on oikeaa tutkittavaksi otetulle lautaselle. Pullon tulpan säteilytykseen 20 käytettävä UV-lamppu on myös tietokoneen ohjauksessa ja se on päällä vain pullojen testauksen aikana asianmukaisen suojakannen ollessa suljettuna käyttäjän suojaamiseksi turhalta UV-säteilyltä.

IR-analysaattorista tulevat käsittelemättömät tu-25 lokset, jotka ovat verrannollisia IR-transmittanssiin C02-absorbanssin alueella syötetään tietojenkäsittelyjärjes-telmä/ohjaimeen analogisessa muodossa, muutetaan digitaalisiksi ja linearisoidaan sitten hiilidioksidipitoisuutta kuvaaviksi järjestelmän ohjelmistossa olevan taulukon 30 avulla. Sitten linearisoidut tulokset skaalataan siten, että saadaan käyttäjän tarkasteltavaksi järkevä numeroar-voalue, joka ulottuu 0:sta 200 - 300:aan mielivaltaiseen yksikköön, joille on annettu nimitys kasvuarvoyksikkö (GV). Skaalattujen tulosten suurin mahdollinen arvo riip-35 puu siitä, käytetäänkö aerobista vai anaerobista viljely- 24 83 432 kaasua, ja siitä millaisen osuuden IR-analysaattorin dynaamisesta alueesta viljelykaasussa oleva C02 käyttää. Siten korkein mahdollinen kasvuero on pienempi tutkittaessa anaerobisia viljelmiä, koska C02-pitoisuus on suurempi 5 anaerobisessa viljelykaasussa.

Käyttöjärjestelmän koko ohjelmisto on talletettuna lukumuistiin (ROM), kun taas järjestelmän nopea työmuisti ja tulosten talletus ovat poimintamuistissa (RAM). Järjestelmä toimii jaksottaisen ohjauksen alaisena, johon liit-10 tyy reaaliaikakello näytteenoton ja mittaamisen ajoituksen valvomiseksi. Ratkaisevat tiedot ja järjestelmämuistin sisältö säilytetään ja reaaliaikakellon toimintaa pidetään yllä virtakatkosten sattuessa ainakin yhden viikon ajan nikkelikadmiunvarapariston avulla. Laitteistossa on virta-15 katkos/uudelleenkytkemispiiri laitteiston asianmukaisen poiskytkemisen takaamiseksi virtakatkosten sattuessa. Ratkaisevat järjestelmän ja tietokoneen vakiot säilytetään virtakatkoksen havaitsemisen jälkeen, ja niitä käytetään järjestelmän uudelleenkäynnistykseen päävirran palatessa. 20 Käyttäjän kaikki kommunikointi laitteiston kanssa tapahtuu ulkopuolisen CRT-päätteen avulla valikkojen (menu driven screen presentations) kautta. Laitteistossa on erilliset valikot näytön valintaa, toimintaparametrien asetusta, positiivisen tuloksen havaitsemiskriteerien va-25 lintaa, näytesäiliöiden järjestelmälle tallentamista, aiemmin mitattujen kasvuarvojen avulla ilmaistun aerobisen ja anaerobisen pullon muodostaman parin tuloshistorian saamista, edellisen lukukerran jälkeen positiivisiksi havaittujen viljelmien raportoimista, viljelmäsäiliölautasen 30 käsivaraisen testauksen suorittamista ja päivittäisen laitteiston ylläpidon suorittamista varten.

Sen takaamiseksi, että laitteisto täyttää kliinisen käytön asettamat toimintavaatimukset, käyttöohjelmistossa on myös itsetestausmahdollisuudet, joihin kuuluvat auto-35 maattiset itsetestausrutiinit ROM- ja RAM-muistien, kes-

II

25 8 3 432 kustietokoneen (CPU), syöttöjännitteiden ja varapariston tilan tarkistamiseksi. Nämä rutiinit toteutetaan laitteiston ollessa vapaana säiliöiden testauksen välillä. Toimin-tatarkistukset tehdään myös optisille tuntoelimille, moot-5 toreille, neulojen kuumentimen voimanlähteelle/neulojen kuumentimelle ja mittausjärjestelmälle. Osana käyttäjän tekemää päivittäistä tarkistusohjelmaa tehdään myös yksityiskohtaiset toimintatarkistukset ohjaimen, mittausjärjestelmän, virtalähteiden, optisten tuntoelinten ja eri-10 laisten moottoreiden suhteen. Edellä mainituilla käyttäjän suorittamilla tarkistusmenettelyillä saadaan aikaan vikojen eristäminen laitteiston osalaitetasolle.

Kasvualustat, joita käytetään edellä kuvatun laitteiston yhteydessä keksinnön mukaisen menetelmän toteutta-15 miseksi, formuloidaan soveltuviksi aerobisten, fakultatii- visten ja anaerobisten mikro-organismien kasvatusta ja havaitsemista varten. On selvää, että happea tarvitaan ehdottomasti aerobisten mikro-organismien kasvatukseen ja että hapen määrä tulee saada mahdollisimman pieneksi halu-20 ttaessa kasvattaa ehdottomia anaerobeja. Jos mielenkiinnon kohteena ovat valoa vaativat tai sitä sietämättömät mikro-organismit, tulisi antaa valoa tai vastaavasti poistaa se.

Tyypilliset kasvualustat sisältävät yleensä vettä, hiililähdettä ja typpilähdettä. Hiililähde voi olla hiili-25 hydraatti, aminohappo, mono- tai dikarboksyylihappo tai niiden suola, polyhydroksialkoholi, hydroksihappo, hiili-dioksidi/bikarbonaatti tai muu metaboloitavissa oleva hiili- tai hiilidioksidiyhdiste. Jotkut mikro-organismit assimiloivat hiilidioksidia kasvun aikana. Jotkut näistä 30 mikro-organismeista vaativat suhteellisen korkeita alustan hiilidioksidipitoisuuksia, koska näiden mikro-organismien affiniteetti hiilidioksidiin on alhainen. Hiililähde sisältää tavallisesti vähintään yhtä sokeria, kuten glukoosia, sakkaroosia, fruktoosia, ksyloosia, maltoosia, lak-.35 toosia, jne. Myös aminohapot, kuten lysiini, glysiini, 26 8 3 432 alaniini, tyrosiini, treoniini, histidiini, leusiini, jne. muodostavat osan kasvualustan hiililähteestä. Typpilähde voi olla nitraatti, nitriitti, ammoniakki, urea tai mikä tahansa muu assimiloituva orgaaninen tai epäorgaaninen 5 typpilähde. Aminohappo tai niiden seos voi toimia sekä hiili- että typpilähteenä. Typpeä tulisi olla riittävästi läsnä solujen kasvun ja replikoitumisen takaamiseksi.

Kasvualustaan voidaan lisätä erilaisia kalsium-, kalium- ja magnesiumsuoloja, kloridit, sulfaatit, fosfaa-10 tit, tms. mukaan luettuina. Koska tällaiset materiaalit ovat tavanomaisia mikrobiologisissa kasvualustoissa, ovat materiaalien valinta sekä niiden keskinäiset suhteet alalla hyvin tunnettuja.

Niin kutsuttuihin hivenalkuaineisiin, joita on läs-15 nä hyvin pieniä määriä, kuuluvat tavallisesti mangaani, rauta, sinkki, koboltti ja mahdollisesti muita alkuaineita.

Esimerkkejä tunnetuista kasvualustoista, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä, ovat peptonilie-20 mi, trypsiinipilkottu soijaliemi, ravinneliemi, tioglyko-laattiliemi ja aivo-sydäninfuusioliemi. Trypsiinipilkot-tuun soijaliemeen perustuvien alustojen (alustoja 6B ja 7C aerobista ja vastaavasti anaerobista viljelyä varten myy Johnston Laboratories, BB1 Microbiology Systems Division 25 of BD, Towson, MD 21204) on havaittu toimivan hyvin.

On hyvin tunnettua, etteivät useimmat biologisesti aktiiviset lajit voi toimia voimakkaasti happamissa tai emäksisissä ympäristöissä. Samaten, jotta keksinnön mukainen menetelmä ja laitteisto havaitsisivat tehokkaasti mik-30 ro-organismien metabolian seurauksena syntyvän hiilidioksidin, joka ilmenee viljelysäiliön kaasutilassa vallitsevan C02-pitoisuuden nousuna, on edullista, että alusta puskuroidaan tiettyyn pH-arvoon ja seurataan sitä huolellisesti sen varmistamiseksi, että asianmukainen hiilidiok-.35 sidi-bikarbonaattitasapaino muodostuu kasvualustaan ja 27 8 3 432 säilyy siinä ennen alustan siirrostamista tutkittavilla näytteillä. Optimiarvoa suuremmat pH-arvot johtavat heikkoon C02:n vapautumiseen nestemäisestä alustasta, kun taas optimia alemmat alustan pH-arvot aiheuttavat liian suuren 5 ylätilakaasun C02-pitoisuuden, joka peittää metabolisesti tuotetun hiilidioksidin. Soveltuvia puskureita, kuten kalium- tai ammoniumfosfaatteja, natriumsitraattia tai vastaavia, voidaan käyttää pH-säätöön, kun taas erilaisia karbonaatti- ja bikarbonaattisuoloja, samoin kuin täytetyn 10 viljelypullon valmistuksen aikana kaasutilaan lisättyä kaasumaista hiilidioksidia voidaan käyttää havaitsemisen kannalta edullisimmin kemiallisen tasapainon muodostumisen aikaansaamiseksi. Koska monet bakteerilajit, etenkin anaerobeihin kuuluvat, vaativat merkittävää liuenneen hii-15 lidioksidin pitoisuutta kasvualustassa kasvaakseen optimaalisesti, edistää edellä mainittu huomion kiinnittäminen sekä pH:n säätöön että hiilidioksiditasapainon asettumiseen synergistisesti sekä kasvua että havaitsemista.

Tulisi ottaa huomioon, että kaikki mikro-organismit 20 eivät metaboloi kasvualustassa olevia hiilihydraatti- ja/tai aminohapposubstraatteja siten, että syntyisi riittäviä määriä hiilidioksidia havaittaviksi tällä menetelmällä. Tilanne on tällainen erityisesti tiettyjen anaerobisten mikro-organismien, etenkin Bacteroides-sukuun kuu-25 luvien, kuten B. fragilisin, ollessa kyseessä. Pääosa tällaisista mikro-organismeista tuottaa kuitenkin huomattavia määriä erilaisia haihtuvia ja haihtumattomia orgaanisia happoja alustan pilkkoutumistuotteina.

Tällä menetelmällä saadaan aikaan näiden mikro-• 30 organismien havaitseminen detektoimalla kasvualustan pH:n aleneminen, joka tapahtuu hapon tuotannon seurauksena, mitattuna epäsuorasti säiliön kaasutilan C02-pitoisuuden kasvun avulla, joka tapahtuu hiilihappo-bikarbonaattitasa-painon muuttuessa, mikä väistämättömästi liittyy pH:n 35 muuttumiseen. Tällainen epäsuora metabolian havaitseminen 28 83432 tekee mahdolliseksi hyvin monenlaisten mikro-organismien kasvun ja metaboliamallien havaitsemisen kaasutilaan meta-bolisesti muodostuvan hiilidioksidin kautta. Alustan perusmerkitys menetelmälle ja laitteistolle on siten lähtöi-5 sin huolellisesti valitusta bikarbonaattipitoisuudesta, joka sekä edistää bikarbonaattia ravinnokseen vaativien organismien kasvua että tekee mahdolliseksi happoa tuottavien organismien, jotka tuottavat vähän tai ei ollenkaan metabolista hiilidioksidia, havaitsemisen. Yhdessä minkä 10 tahansa soveltuvan puskurisysteemin kanssa tämä lisätty bikarbonaatti kohottaa hiilidioksidipitoisuutta kaasuti-lassa ja vaatii vastaavaa viljelykaasun hiilidioksidipitoisuuden nostamista. Näiden pitoisuuksien kasvaessa meta-bolisesti tuotetun hiilidioksidin havaitsemisherkkyys ale-15 nee.

Herkkyyden alenemiseen vaikuttaa kaksi syytä. Alustan C02/bikarbonaattipitoisuuden ollessa korkeahko on viljelykaasun hiilidioksidipitoisuuden ja kaasutilassa alussa vallitsevan hiilidioksidipitoisuuden välisellä erotuksella 20 taipumus saada korkeahko absoluuttinen arvo. Eroa viljely-kaasun ja ylätilakaasun välillä voi korkeimmillaan olla jopa 20 % hiilidioksidia. Käytettäessä hiilidioksidiana-lysaattoria näiden korkeahkojen pitoisuuksien vallitessa tulee sillä olla suurempi mittausalue ja tällöin on taipu-25 mus esiintyä virheitä hiilidioksidipitoisuuden suuremman absoluuttisen virheen takia. Halutulle organismiryhmälle on kasvualustan optimaalinen bikarbonaattipitoisuus siten pienin mahdollinen pitoisuus, joka soveltuvalla tavalla edistää organismien kasvua ja saa aikaan happoa tuottavien 30 organismien havaitsemisen. Kun nämä valinnat tehdään tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon yhteydessä kuvatulla tavalla, voidaan kaikki veriviljelmistä tavallisesti löytyvät patogeeniset bakteerit havaita nopeasti, eikä detek-tointiin kuluva aika kasva suuresti niilläkään bakteereil-35 la, jotka voitaisiin havaita kasvualustan sisältäessä paljon vähemmän tai ei ollenkaan bikarbonaattia.

li 29 83 432

Yleisesti ilmaistuna alusta, joka on soveltuva antamaan assimiloituvaa hiilidioksidia samoin kuin riittävästi hiilidioksidia happoa tuottavien organismien havaitsemiseksi, sisältää vaikuttavan määrän hiilidioksidin esi-5 astetta, josta voi muodostua hiilidioksidia materiaali-näytteessä olevan mikro-organismin metabolian seurauksena. Esiaste aktivoituu hapon muodostumisen seurauksena happoa tuottavien organismien metabolian aikana. Esiastetta on läsnä alustassa sellainen määrä, joka vastaa bikarbonaat-10 tiekvivalenttipitoisuutta noin 0,5 - 20,0 mmol/1, edul lisesti noin 1,0 - 10,0 mmol/1. Soveltuviin esiasteisiin kuuluvat natriumbikarbonaatti, liuennut hiilidioksidi, natriumkarbonaatti ja muut bikarbonaattisuolat.

Testausprosessin alkaessa kasvualusta siirrostetaan 15 tutkittavalla materiaalinäytteellä pitäen alustan pH sa malla arvossa noin 6,5 - 8,0, edullisesti noin 7,2 -7,5. Kaasutilassa vallitseva C02-pitoisuus on noin 2,0 - 3,0 % aerobisen alustan ollessa kyseessä ja noin 3,0 - 5,0 anaerobisen alustan ollessa kyseessä ja se on altis kemialli-: 20 sen tasapainon, tilavuuden ja lämpötilan muutoksille, ku ten edellä kuvattiin. Käytettävä näytemäärä voi vaihdella laajasti, mutta sen tulisi edullisesti olla noin 1,0 - 20,0 % kasvualustan tilavuudesta. Lyhyen viiveen jälkeen kasvualustassa mahdollisesti esiintyvät mikro-organismit 25 kasvavat ja replikoituvat, mitä seuraa lisääntymisnopeuden aleneminen. C02:n vapautumisnopeus vaihtelee lisäksi sellaisten tekijöiden kuin ravinnekoostumuksen, pH:n, lämpötilan, inokulaatin osuuden ja läsnäolevien mikro-organismien tyypin mukaan.

30 Bakteerien enemmistön tehokkaan metabolian kannalta tulisi näytteen sisältävän alustan lämpötila pitää noin 35 - 37 °C:na. Joillakin mikro-organismeilla optimikasvu tapahtuu lämpötilassa 20 °C tai viileämmässä, kun taas Jotkut saattavat kasvaa parhaiten 45 eC:ssa tai lämpimämmäs-35 sä. Tämän keksinnön yhteydessä voidaan käyttää mitä tahansa kuhunkin tilanteeseen parhaiten soveltuvaa lämpötilaa 3o 83432 sillä edellytyksellä, että kiinnitetään huomiota halutussa lämpötilassa pidettävien säiliöiden kaasutilassa vallitsevaan C02-pitoisuuteen ja säädetään käytettävän viljely-kaasun C02-pitoisuus niin lähelle kaasutilan C02-pitoisuut-5 ta kuin käytännössä on mahdollista. Vaikka tyydyttävä mikro-organismien kasvu on tavallisesti saavutettavissa sekoittamatta säiliöissä olevaa siirrostettua viljelmää, tehdään kasvatus edullisesti käyttämällä aktiivista ravistusta, sekoitusta tai vastaavaa, joka on kyllin tehokas 10 takaamaan C02:n asianmukaisen vapautumisen alustasta.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa ulkopuolinen sekoitus saadaan aikaan pyöröravistimella, joka muodostaa vorteksin nestemäiseen alustaan.

Käsitelläksemme nyt tarkemmin kuviossa 1 esitetyn 15 laitteiston avulla toteutetun menetelmän käytännön puolta on viljelysäiliöiden 1 kokonaistilavuus edullisesti 30 -150 ml, josta kasvualustan ja tutkittavan näytteen osuus on 2 - 100 ml. Veren, virtsan tai muun näytteen tilavuus voi olla esimerkiksi 0,1 - 10,0 ml. Eräässä edullisessa 20 suoritusmuodossa viljelysäiliöiden ylivuototilavuus on noin 60 ml, ja niihin laitetaan 30 ml kasvualustaa ja mahdollisesti 3-5 ml näytettä. Kaasutilan osuus on siten noin 50 % säiliön kokonaistilavuudesta. On edullista, että säiliön kaasutilan osuus on noin 30 - 60 % säiliön koko-25 naistilavuudesta. On jossain määrin tärkeämpää, että säi liön kaasutilavuuden ja mittausjärjestelmän tilavuuden suhde pidetään mahdollisimman suurena edellä esitettyjen näkökohtien valossa järjestelmän havaitsemisherkkyyden säilyttämiseksi.

30 Jotta saataisiin määritetyksi tässä esitetyn lait teiston ja menetelmän käyttökelpoisuus biologisen aktiivisuuden esiintymisen havaitsemiseksi simuloiduissa verivil-jelmissä analysoimalla viljelysäiliön ylätilakaasu, valmistettiin tutkimustarkoituksiin prototyyppilaite, jolla 35 on kuviossa 1 esitetyn laitteiston oleelliset piirteet. Käytetty pneumaattinen järjestelmä oli suurin piirtein li 3i 83432 kuviossa 12 esitetyn kaltainen. C02:n havaitsemiseen käytettiin kaupallista IR-analysaattoria (Model AR500R Infrared Gas Analyzer, Anarad, Inc., Santa Barbara, CA 93105), kun taas säiliöiden testaus tehtiin muunnetulla kaupal-5 lisesti saatavissa olevalla laitteella BACTEC Model 225 (Johnston Laboratories). Järjestelmää ohjattiin mikrotietokoneella Cromeco System Three (Cromeco, Inc., Mountain View, CA 94040). Laitteiden toiminta ja testausjärjestys olivat suurin piirtein edellä esitettyjen kaltaiset.

10 Kliinisissä veriviljelmissä havaittavien pienten siirrospitoisuuksien simuloimiseksi ja tilastollisesti merkittävien tulosten saavuttamiseksi siitä huolimatta, preparoitiin simuloitu veriviljelmä -kokeissa käytetyt siirrokset siten, että säiliöön tuli noin 100 pesäkkeitä 15 muodostavaa yksikköä (CFU). Kokeisiin käytetyt organismit otettiin yön yli inkuboiduista agar- tai liemiviljelmistä. Standardointia varten suspentoitiin useita agarmalJalta otettuja pesäkkeitä 5,0 ml:aan tioglykolaattilientä (anae-robit) tai trypsiinipilkottua soijalientä (aerobit) (mo-20 lemmat toimitti BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD 21030) 16 x 125 mm:n kierrekorkkiputkessa ja sameus säädettiin vastaamaan transmittanssia 57 - 63 % Spectro-nic 88-spektrofotometrissä (Bausch and Lomb, Rochester, NY 14625) aallonpituudella 600 nm. Vaihtoehtoisesti sekoi-25 tettiin 0,7 ml sameaa lientä BACTEC-pullosta (Johnston Laboratories) 5,0 ml:aan lientä ja säädettiin sameus kuten edellä. Standardoitu liemi laimennettiin kolmesti suhteessa 1:100 samanlaisella liemellä ja 0,5 ml lopullista laimennosta (noin 100 CFU) lisättiin kuhunkin laitteessa tut-30 kittavaan pulloon. Siirrostasot tarkistettiin laskennalla maljalta.

Kineettisissä kasvukokeissa käytetyn veren toimitti Community Blood and Plasma Service (Baltimore, MD 21231). Tämä veri, josta joskus tässä yhteydessä käytetään nimi-35 tystä "varastoveri", otettiin tilauksesta erityisesti preparoituihin pusseihin, jotka sisälsivät antikoagulanttina 32 8 3 432 natriumpolyanetolisulfonaattia (SPS) loppupitoisuutena 0,05 %. Kineettiset kokeet, joissa käytettiin Neisseria meningitidisiä, tehtiin tuoreella verellä, koska SPS mahdollisesti estää N. meningitidisin kasvua. Kasvututkimuk-5 set, joissa käytettiin muita vaativia mikro-organismeja, tehtiin samoin käyttäen tuoretta kokoverta.

Kaikki seuraavissa esimerkeissä käytetyt kasvualustat toimitti Johnston Laboratories. Kaikki anaerobiset mikro-organismit viljeltiin anaerobisessa alustassa 7C 10 BACTEC, jota huuhdottiin anaerobisella viljelykaasulla kokeen aikana, mutta ei ravisteltu. Tämä kaasu sisälsi 2 % hiilidioksidia ja 5 % vetyä loppuosan ollessa typpeä. Aerobiset mikro-organismit kasvatettiin alustassa 6BM (alusta 6B, johon on lisätty sekoitusmagneetit), jota sekoitet-15 tiin magneettisekoittimellä prototyyppilaitteessa. Aerobi nen viljelykaasu sisälsi 2,5 % hiilidioksidia loppuosan ollessa ilmaa. Inkubointilämpötila säädettiin kaikissa kokeissa 35 - 37 eC:ksi.

Esimerkki 1 20 Viittä hitaasti kasvavaa, vaativaa mikro-organismia tutkittiin verellä täydennetyssä alustassa. Siirrostus tehtiin kullekin mikro-organismi/liemi-yhdistelmälle kunkin pullon sisältäessä tuoretta, eri henkilöstä otettua kokoverta. Siirroksen määrä oli 8 - 150 CFU/pullo. Ver-25 tailusäiliöt preparoitiin käyttäen tuoretta kokoverta, mutta ei mikro-organismi-siirrosta. Vertailusäiliötulokset laskettiin yhteen keskiarvojen ja standardipoikkeamien laskemiseksi. Säiliöt tutkittiin siirrostuksen jälkeen ja kerran vuorokaudessa jatkossa. Havaittavuusrajoiksi valit-30 tiin 19 GV aerobisille viljelmille ja 34 GV anaerobisille viljelmille pahimpien mahdollisten veren metabolian aiheuttamien tausta-arvojen määrittämiseksi tehtyjen kokeiden perusteella. Seuraavissa kuvissa olevat virhepylväät vastaavat keskiarvoa, josta on vähennetty ja johon on li-35 sätty kaksi kertaa standardipoikkeama (SD), sekä testi-että vertailutulosten ollessa kyseessä.

Il 33 83 4 32

Kuvio 7 esittää kasvuarvoja määritettynä kokeeseen kuluneen ajan funktiona mikro-organismille Neisseria meningitidis. C02:n vapautumisen seurauksena tapahtuvan de-tektion havaitaan ilmenevän kokeen päivänä 2. Testi- ja 5 vertailutulokset erottuvat toisistaan käytettäessä kokeen loppuajan +/-2SD:tä arvosteluperusteena. Kuviossa 8 esitetään samanlaiset Streptococcus pneumoniaella saadut tulokset. Kohtalainen detektio saavutetaan 24 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen. Haemophilus influenzaella saadut tu-10 lokset ovat kuviossa 9. Vaikka tämä mikroorganismi on heikko hiilidioksidin tuottaja, detektio tapahtuu toisena koepäivänä. Streptococcus pneumoniaella saadut viljelytu-lokset esitetään kuviossa 10. Havaitaan suhteellisen heikko, lyhytaikainen vaste, mutta mikroorganismi on selvästi 15 havaittavissa kokeen toisena päivänä.

Vaativia anaerobisia mikro-organismeja tutkittiin samalla tavalla. Bacteroides fragilisilla saadut tulokset ovat kuviossa 11. Havaitseminen tapahtuu toisena koepäivänä. Bacteroides vulgatusin detektointitulokset osoittavat 20 huomattavaa hajontaa, mutta organismi on havaittavissa päivään 5 mennessä kaikissa tutkituissa näytteissä, kuten kuviosta 12 ilmenee.

Esimerkki 2

Kineettisiä kasvututkimuksia tehtiin joukolle klii-25 nisesti merkittäviä mikro-organismeja mittaamalla keskenään samanlaiset säiliöryhmät prototyyppi-IR-laitteistolla ja muuntamattomalla radiometrisellä laitteella BACTEC Model 225. Kineettisten kokeiden koeparametrit annetaan taulukossa 1. Varastoverta, joka sisälsi 0,05 % SPS, käytet-30 tiin kaikille muille mikro-organismeille paitsi Neisseria meningitidisille, jolle käytettiin juuri otettua verta. Seuraavissa kuvioissa esiintyvät pisteet ovat useista koemittauksista saatuja keskiarvoja piirrettyinä inkubointi-ajan funktiona 37 °C:ssa. Nuolet osoittavat havaittavuus-35 rajoja eri kokeissa. Siirrostamattomalla, verellä täydennetyllä liemellä saadut tulokset esitetään myös useiden 34 83432 mittausten keskiarvoina, mittaukset tehtiin samoin aikavälein kuin mikro-organismeilla siirrostetuille, verellä täydennetyille alustoille. Säiliöille tehtiin mittaus kahden tunnin välein nopeasti kasvavien mikro-organismien 5 ollessa kyseessä ja viiden tunnin välein hitaasti kasvavia mikro-organismeja tutkittaessa.

Taulukko I

IR-detektion käyttökelpoisuustutkimus 10 Kineettisten kasvukokeiden koeparametrit

Parametri Aerobiset_Anaerobiset_

Kasvualusta 6BM

(magneetti-

sekoitus ) 7C

15 Viljelykaasu 2,5 % (X^, loppu- 2 % CX^, 5 % H

osa ilmaa loppuosa N

Testausväli nopeasti nopeasti

kasvavat : 2 h kasvavat: 2 H

vaativat : 3 H hitaasti 20 kasvavat: 5 h

Kokeen kesto: nopeasti nopeasti kasvavat: 18-24 h kasvavat: 18 h vaativat: 36-45 h hitaasti kasvavat: 70 h 25 Havaittavuus- raja, IR 19 34

Havaittavuus- raja, BACTEC 20

Kaikki kokeet:

30 Veri: 5,0 ml varastoverta, 0,05 % SPS

Inkubointi-

lämpötila: 35 - 37 eC

Siirrosta 50-100 CFU/pullo, standardoitu spektrofoto- noin: metrissä; todelliset lukumäärät määritetty 35 laskemalla maljalta

II

35 83432

Rekisteröidyt kineettiset tulokset, joilla verrataan keskenään mikro-organismin Escherichia coli havaitsemista IR-detektiolla ja radiometrisellä detektiolla, esitetään graafisesti kuviossa 13. Detektioon kuluva aika 5 on suurin piirtein sama kummallakin menetelmällä. Kuviossa 14 esitetään samanlaiset tulokset Klebsiella pneu-moniaelle. Myös tässä tapauksessa IR-menetelmän ja tavanomaisen radiometrisen menetelmän detektioajat osoittautuvat suurin piirtein samanlaisiksi. Radiometrisille 10 BACTEC-tuloksille saatu yläosastaan tasainen käyrä edustaa laitteen koko mitta-asteikon täyttävää lukemaa. Pseudomonas aeruginosa havaitaan jonkin verran hitaammin keksinnön mukaisella menetelmällä, ja se antaa sekä voimakkaamman että nopeamman vasteen radiometristä menetelmää 15 käytettäessä, kuten kuviosta 15 ilmenee. Radiometristen tulosten yhteydessä havaittava yläosastaan tasainen käyrä heijastaa laitteen koko mitta-asteikon täyttävää tulosta. Staphylococcus aureusilla saadut vasteet ovat kuviossa 16. Detektio on suurin piirtein samanaikainen kummallakin jär-20 jestelmällä, mutta IR-detektiolla havaitaan voimakkaampi vaste. Samanlainen käyttäytyminen havaitaan Staphylococcus epidermisin ollessa kyseessä, kuten kuviosta 17 ilmenee. Tässä tapauksessa IR-detektio antaa varhaisemman havaitsemisen ja positiivisemman vasteen kuin radiometrinen jär-25 jestelmä. Mikro-organismi Streptococcus faecalista tutkittiin samalla tavalla, ja sille saatiin kuviossa 18 esitetyt tulokset. IR-detektio on nopeampi ja voimakkaampi kuin radiometrinen detektio tämän mikro-organismin ollessa kyseessä. Streptococcus pneumonieaella saatuja tuloksia ver-30 rataan kuviossa 19. Keksinnön mukaisen IR-menetelmän tarjoama etu detektiossa on selvästi ilmenevä. Haemophilus influenzae antoi tutkittaessa kuviossa 20 esitetyt vasteet. Mikro-organismin havaittavuusraja ylitettiin radio-metrisellä menetelmällä hieman voimakkaammin ja nopeammin 35 kuin IR-järjestelmällä. Hiivan Candida albicans detektoin-ti tapahtui hieman nopeammin radiometrisesti tutkittaessa 36 83432 ja saavutettu lukema täytti koko mitta-asteikon. Kumpikin järjestelmä havaitsi tämän mikro-organismin suurin piirtein samalla tavalla, kuten kuviosta 21 ilmenee. Neisseria meningitidis antoi kuviossa 22 esitetyt vasteet vertailu-5 tutkimuksessa. Vaikka kumpikin järjestelmä havaitsi mikro-organismin riittävän hyvin, saatiin BACTEC-menetelmällä aikaan jonkin verran varhaisempi ja positiivisempi detek-tio.

Myös anaerobisesti kasvatettuja organismeja tutkit-10 tiin detektiokinetiikan suhteen. Kumpikin järjestelmä havaitsi mikro-organismin Clostridium novyii yhtä hyvin, kuten kuviosta 23 ilmenee. Samanlaiset tulokset saatiin Clostridium perfringensille, kuten kuviosta 24 käy ilmi. Detektioon kuluva aika on hieman lyhyempi IR-detektoinnis-15 sa. Bacteroides fragilis sai aikaan kuviossa 25 esitetyn vasteen. BACTEC-detektoinnilla saadaan aikaan nopeampi havaitseminen ja voimakkaampi vaste. Tilanne on sama myös Bacteroides vulgatusin ollessa kyseessä, kuten kuviosta 26 käy ilmi.

20 Kineettisten kokeiden tulokset esitetään taulukossa 2. Keskenään samanlaisille maljoille tehtyjen kineettisten kokeiden perusteella IR-detektoinnilla saadaan aikaan suurin piirtein vastaava tutkittavaksi valittujen mahdollisesti patogeenisten mikro-organismien havaitseminen. 25 Kineettisten tulosten analysointi edelleen kullekin mikro-organismille saatujen yksittäisten pullojen tulosten, eikä keskiarvotuloksen, perusteella osoitti, että keksinnön mukaisella IR-menetelmällä saavutetut detektioon kuluneet ajat olivat yhtä hyvät tai paremmat kuin tavanomaisella 30 radiometrisellä BACTEC-menetelmällä saavutetut 72 %:ssa kokeista. Noin 93 %:ssa kokeista detektio tapahtui yhtä testiväliä myöhemmin kuin BACTEC:illa tai tätä nopeammin. Testivälit vaihtelivat mittausten välillä kuluneista kahdesta tunnista (nopeasti kasvavat organismit) viiteen tun-. '.‘35 tiin (hitaasti kasvavat). Kineettiset tulokset ilmoitetaan detektioon kuluneiden testivälien lukumäärän avulla kuviossa 27.

li 37 83432

Taulukko 2 IR- ja BACTEC-detektolnnln vertaaminen erilaisille organismeille - samanlaisiksi tehdyt pulloparit 5 5,0 ml varastoverta - 0,5 % SPS Aerobiset organismit -

alusta 6BM

Detektioon kulunut aika keskimäärin (h)_

Organismi Kokeiden Siirrosta IR Bactec Erotus 10 _lkm_(CFU/pullo)_ E.coli 8 (2 h) 62-71 10 10 0 K.pneumoniae 8 62-74 10 10 0 P.aeruginosa 14 53-67 15 14 -1 S.aureus 15 4-169 12 13 +1 15 S.epidermidis 4 1-57 16 18 +2 S.faecalis 8 75-87 12 12 +1 S.pneumoniae 10 (2 h) 18-58 18 20 +2 H.influenzae 10 -250 20 17 -3 C.albicans 11 4-19 31 33 +2 . . 20 N.meningitidis 8 82 19 19 0

Aerobiset organismit - alusta 7C

C.perfringens 9 (2 h) 25 10 12 +2 C.novyii 8 21 10 10 0 25 B.fragilis 9 (5 h) 90 29 25 -4 B.vulgatus 15 (3 h) 100 33 28 -5

Positiivinen arvo * IR parempi Negatiivinen arvo = BACTEC parempi 30 2Havaittavuusrajat: IR, aerobiset - 19 IR, anaerobiset * 34 BACTEC = 20 (molemmat) 35 38 83432

Esimerkki 3

Jotta osoitettaisiin se etu havaitsemisherkkyydes-sä, joka saavutetaan säätämällä laitteiston viljelykaasun hiilidioksidipitoisuus yhtä suureksi kuin steriilien, si-5 irrostamattornien, halutussa inkubointilämpötilassa pidettyjen säiliöiden kaasutilassa vallitseva C02-pitoisuus, tehtiin joukko kokeita mikro-organismilla Bacteroides fra-gilis alustassa 7C (Johnston Laboratories). Preparoitiin vertailu- ja testisäiliöt, jotka sisälsivät 5,0 ml varas-10 toverta. Testisäiliöihin lisättiin myös noin 100 CFU tutkittavaa mikro-organismia, joka oli preparoitu, laimennettu ja standardoitu laskennan avulla aiemmissa esimerkeissä kuvatulla tavalla. Käytettiin viljelykaasuja, jotka sisälsivät 0, 2, 5 ja 10 % hiilidioksidia, 5 % vetyä ja lop- 15 puosan typpeä. Kuusi pulloparia, joissa kussakin oli näyte- ja vertailunäytepullo, tutkittiin anaerobisesti IR-prototyyppilaitteessa inkuboiden 35 °C:ssa 48 h kussakin tutkittavalle viljelykaasuseokselle tehdyssä kokeessa.

Tulokset, jotka saatiin hiilidioksidia sisältämät-20 tömälle viljelykaasulle, esitetään kuviossa 28. Koska lukemat rekisteröidään säiliön ylätilakaasun C02-pitoisuu-den ja viljelykaasun vastaavan pitoisuuden erotuksena, havaitaan kaikkien lukemien kohdalla positiivinen siirtymä, joka väistämättä tulee lisätyksi havaittavuusrajaan ja 25 alentaa testiherkkyyttä. Kun viljelykaasun C02-pitoisuus säädetään yhtä suureksi kuin kaasutilassa vallitseva pitoisuus, eivät pohja-arvot ole enää koholla ja saavutetaan paras mahdollinen detektio, kuten kuviossa 29 esitetään. Tulokset, jotka saatiin 5 % C02 sisältävällä seoksella, 30 annetaan kuviossa 30. Alussa esiintyvä suuri negatiivinen siirtymä saattaisi estää nopeasti kasvavien mikro-organismien detektoinnin. Lisäksi vaaditaan noin 15 h:n inkuboin-tia ja siihen liittyvää toistuvaa testausta, jotta kaasu-tilan C02-pitoisuus saavuttaa tasapainon viljelykaasun C02-35 pitoisuuden kanssa. Näyte- ja vertailusäiliöiden kasvu- 39 83 432 arvojen välisen eron pieneneminen on selvästi havaittavissa. Kuviossa 31 esitetään tulokset, jotka saadaan vil-jelykaasun sisältäessä 10 % hiilidioksidia. Alun negatiivinen siirtymä on nyt paljon suurempi ja havaitsemisherk-5 kyys hyvin heikko. Lisäksi vaaditaan noin 36 tunnin inku-bointi ja useita toistuvia mittauksia, jotta ylätilakaa-sun C02-pitoisuus saavuttaisi tasapainon viljelykaasun kanssa.

Tässä esitetyn menetelmän asianmukaisen toiminnan 10 kannalta on edullista, että laitteistossa käytettävän viljelykaasun hiilidioksidipitoisuus säädetään mahdollisimman lähelle steriilien, siirrostamattomien, laitteiston yhteydessä käytettävien säiliöiden kaasutilassa vallitsevaa C02-pitoisuutta. Tässä optimitilanteessa saadaan aikaan paras 15 mahdollinen detektio, ja aika, joka kuluu viljelysäiliön ylätilakaasun asettumiseen tasapainoon laitteiston viljelykaasun kanssa, tulee mahdollisimman lyhyeksi. Pohjalukemat pysyvät stabiileina koko inkubointijakson ajan, mikä tekee mahdolliseksi valita havaittavuusraja, joka on ajas-20 ta riippumaton.

Esimerkki 4

On hyvin tunnettua, että jotkut kliinisesti merkittävät mikro-organismit, etenkin anaerobeihin kuuluvat, tuottavat vain vähän hiilidioksidia metabolian seurauk-25 sena. Pääosa näistä mikro-organismeista tuottaa kuitenkin merkittäviä määriä haihtuvia ja haihtumattomia orgaanisia happoja, jotka erittyvät alustaan pyrkien alentamaan sen pH-arvoa. Siksi tehtiin kokeita sen määrittämiseksi, voitaisiinko käyttää hiilidioksidin ja bikarbonaatin välistä 30 kemiallista tasapainoa hyväksi näiden mikro-organismien havaitsemisessa mittaamalla kasvualustasta alustan pH: n alentumisen aiheuttaman kemiallisen tasapainon muuttumisen seurauksena vapautuva hiilidioksidi. Epäsuoraa C02:n vapautumista tutkittiin ensin alustassa 7C, johon oli lisätty 35 16,6 mmol/1 natriumbikarbonaattia. Testipulloihin, jotka «O 83432 sisälsivät alustaa ja bikarbonaattia, ja vertailupulloi-hin, jotka sisälsivät pelkkää alustaa, lisättiin 0,1 ml:n annoksissa 0,5 M HCl:ää. Yhteen pullopariin lisättiin 0,1 ml happoa, seuraavaan 0,2 ml, jne. Samanlaiset pullo-5 parit preparoitiin pH-mittausta varten. Pullopareille tehtiin C02-mittaus laitteistolla, ja vapautunut C02 esitettiin graafisesti happolisäyksen funktiona kuviossa 32. Kemiallisesti vapautuneen hiilidioksidin havaitseminen on selvästi osoitettavissa vertaamalla testi- ja vertailupul-10 lojen kasvuarvolukemia. pH: n alentuessa ilmenevä vaste kompensoi hyvin C02:n alkupitoisuuden nousun kaasutilassa.

Epäsuora detektointijärjestelmä testattiin sitten sellaisella Bacteroides fragilis-kannalla, josta tiedetään, ettei se tuota merkittäviä hiilidioksidimääriä meta-15 bolian seurauksena. Alustaan 7C (Johnston Laboratories) lisättiin 16,6 mmol/1 bikarbonaattia. Valmistettiin myös samanlaiset vertailupullot, jotka eivät sisältäneet bikarbonaattia. Kuhunkin pulloon lisättiin 5,0 ml edellä kuvattua varastoverta; testipullot siirrostettiin noin 100 20 CFU:lla mikro-organismia. Testin tulokset esitetään ku viossa 33. Bikarbonaatilla täydennetyn alustan yhteydessä havaitaan suuresti parantunut mikro-organismin havaitseminen. Vaikka veren aiheuttamat taustalukemat kohoavat jonkin verran, on lisähiilidioksidin saatavuuden tarjoama etu 25 selvästi havaittavissa.

tl

Claims (19)

4i 83432

1. Menetelmä mikro-organismien läsnäolon havaitsemiseksi analysoitavassa näytemateriaalissa, tunnet- 5. u siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) tutkittava näyte viedään steriiliin astiaan, jossa on viljelyalustaa ja sen yläpuolella oleva kaasuti-la, jolloin viljelyalustassa on hiililähde ja ylätilakaa-sun C02-alkukonsentraatio tunnettu, 10 b) astia inkuboidaan olosuhteissa, jotka edistävät mikro-organismien metaboliaa; c) analyysipäähän viedään viljelykaasu, jonka C02-konsentraatio on suurin piirtein sama kuin ylätilakaasun tunnettu C02-alkukonsentraatio; 15 d) määritetään viljelykaasun C02-konsentraatio ana- lyysipäässä, johon kuuluu tunto- ja liikuttamiselimet, joita käytetään otettaessa näytteitä astian ylätilakaasus-ta; e) pystytetään virtausyhteysreitti ylätilan ja ana- 20 lyysipään väliin; f) sekoitetaan analyysipään viljelykaasu ylätila-kaasulla; g) mitataan analyysipäässä viljelykaasun ja ylätilakaasun seoksen C02-konsentraatio; ja 25 h) verrataan seoksen mitattua C02-konsentraatiota vaiheessa d) määritettyyn viljelykaasun C02-konsentraatioon mikro-organismien läsnäolon havaitsemiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylätilakaasunäytteen kanssa 30 sekoitettavan viljelykaasun C02-konsentraatiotaso ennen mittausvaihetta on alueella noin 1 - 10 %.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelykaasun C02-konsentraa-tiotaso on alueella noin 2 - 5 %.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 42 83432 tunnettu siitä, että analyysipään tuntoelimissä on mittauskammio, ja virtausyhteysreitin pystyttämisvaihe tekee mittauskammiolle mahdolliseksi mitata seoksen C02-konsentraatio.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virtausyhteysreitti huuhdotaan viljelykaasulla ennen vaihetta d).

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelykaasun C02-konsentraa- 10 tiotaso järjestetään alueelle noin 1 - 10 %.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitavana näytteenä käytetään kokoverta.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että analysoidaan useita viljely-astioita peräkkäin.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettävä laitteisto materiaalien analysoimiseksi biologisen aktiivisuuden esiintymisen suhteen IR-absorbanssin 20 avulla, tunnettu siitä, että mainittu laitteisto sisältää: suljetun säiliön, jossa on mikro-organismien kasvualustaa, joka sisältää hiililähdettä, joka voi tuottaa hiilidioksidia materiaalinäytteessä olevan mikro-organismin metabo-: : 25 lian seurauksena, jossa suljetussa säiliössä on kasvualustan yläpuolella kaasutila, jonka täyttää ylätilakaasu, joka sisältää tasa-painopitoisuuden hiilidioksidia, välineet materiaalinäytteen viemiseksi säiliöön, 30 välineet näytteen ja alustan sisältävän säiliön saattamiseksi olosuhteisiin, jotka edistävä näytteessä mahdol lisesti esiintyvien mikro-organismien normaalia metabolis-ta prosessia kohottaen ylätilakaasun hiilidioksidipitoisuuden ylätilakaasussa vallitsevan tasapainopitoisuuden 35 yläpuolelle, II « 83432 välineet ylätilakaasusta koostuvan näytteen poistamiseksi ja viemiseksi näytekammioon, välineet IR-sädesuihkun tuottamiseksi ja IR-detektioväli-neet ylätilakaasun IR-absorbanssin detektoimiseksi näy-5 tekammiossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että suljettu säiliö on varustettu lävistettävissä olevalla tulpalla.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen laitteisto, 10 tunnettu siitä, että välineet ylätilakaasusta koostuvan näytteen poistamiseksi ja näytteen viemiseksi näytekammioon sisältävät ensimmäisen neulan, joka on vir-tausyhteydessä näytekammion sisäänmenoaukkoon, ja toisen neulan, joka on virtausyhteydessä näytekammion ulostulo- 15 aukon kanssa.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että siinä on välineet ensimmäisen neulan ja toisen neulan työntämiseksi lävistettävissä olevan tulpan läpi, jolloin muodostuu silmukka 20 ylätilakaasun kierrättämiseksi.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen laitteisto, tunnettu siitä, että se sisältää pumpun, jolla saadaan aikaan ylätilakaasun kierto.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen laitteisto, : : 25 tunnettu siitä, että se sisältää välineet viljely- kaasun viemiseksi silmukkaan ennen ensimmäisen neulan ja toisen neulan työntämistä lävistettävissä olevaan tulppaan.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen laitteisto, 30 tunnettu siitä, että viljelykaasun hiilidioksidi pitoisuus on suurin piirtein yhtä suuri kuin hiilidioksidin tasapainopitoisuus ylätilakaasussa.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käytettävä mikro-organismien kasvualusta, tunnet- 35. u siitä, että se sisältää bakteerien ravinnemateriaalia 44 8 3 4 3 2 ja riittävän määrän hiilidioksidin esiastetta, jolla on kyky muodostaa hiilidioksidia materiaalinäytteessä olevan mikro-organismin metabolian seurauksena ja jonka aktivoi hapon muodostuminen mainittuun kasvualustaan tuodussa 5 näytteessä olevan mikro-organismin metabolian aikana.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että esiastetta on läsnä sellainen määrä, että kasvualustan bikarbonaattiekvivalenttipitoi-suus on noin 0,5 - 20 mmol/1.

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen kasvualusta, tunnettu siitä, että esiastetta on läsnä sellainen määrä, että kasvualustan bikarbonaattiekvivalenttipitoi-suus on noin 1-10 nunol/1.

19. Patenttivaatimuksen 16, 17 tai 18 mukainen kas-15 vualusta, tunnettu siitä, että esiaste on natriumbikarbonaatti, liuennut hiilidioksidi, natriumkarbonaatti tai muu bikarbonaattisuola. 45 83432