FI79548C - Foerfarande foer identifiering av microorganismer medelst infraroed analys av utvecklad koldioxid. - Google Patents

Description

1 79548

Menetelmä mikro-organismien identifioimiseksi kehittyneen hiilidioksidin infrapuna-analyysillä

Keksintö koskee menetelmää mikro-organismien iden-5 tifioimiseksi. Erityisesti keksinnön kohteena on tuntemattomien mikro-organismien identifiointi vertaamalla tuntemattomalla mikro-organismilla useita eri kasvualustoja käyttäen saatua hiilidioksidin muodostusprofiilia tunnettujen mikro-organismien samoilla kasvualustoilla saatuun 10 hiilidioksidin muodostusprofiiliin.

Tavanomaisissa menetelmissä organismien identifioimiseksi käytetään tavallisesti viljelytekniikkaa. Yleisesti tällaisessa menetelmässä siirrostetaan näyte sopivaan kasvualustaan ja näytteessä olevia mikro-organismeja kas-15 vatetaan sellaisen konsentraation saavuttamiseksi, joka riittää mikro-organismien siirtämiseen kiinteälle agar-alustalle. Mikro-organismi otetaan sitten talteen suhteellisen puhtaana konsentroituna näytteenä. Mikro-organismi identifioidaan tutkimalla mikroskoopilla sen muodostamien 20 pesäkkeiden morfologiaa ja gram-reaktiota. Viljelytekniikka on aikaavievää ja usein saatu tulos ei ole täysin lopullinen. On olemassa tarve pystyä identifioimaan mikro-organismi nopeammin ja varmemmin.

Tuntemattomien mikro-organismien identifioimiseen 25 käytetty menetelmä vertaamalla niiden kasvuprofiilia useilla eri kasvualustoilla standardimikro-organismien kasvuprofiiliin on tunnettu. Kliinisten näytteiden bakteerien identifioimiseen käytetty kaupallinen systeemi on saatavissa firmasta BBL Microbiology Systems division of 30 Becton, Dickinson and Company kauppanimellä SCEPT0RR . Tätä systeemiä käytettäessä tuntematonta näytettä inkuboidaan koelevyllä olevissa erillisissä syvennyksissä useissa eri kasvualustoissa. Metabolinen aktiivisuus, kuten hiilihydraattien hapetus tai aminohappojen deaminointi tai dekarb-35 oksylointi aiheuttaa värinmuutoksia niissä syvennyksissä.

2 79548 joissa mikro-organismi käyttää hyväkseen syvennyksen kasvualustaa. Identifiointi suoritetaan vertaamalla tuntemattoman mikro-organismin metabolisen aktiivisuuden profiilia erilaisten tunnettujen mikro-organismien profiiliin.

5 Toinen systeemi mikro-organismien identifioimisek si, jossa käytetään hyväksi hiili-14:llä merkittyjen substraattien metaboliaa radioaktiivisella hiilellä merkityn hiilidioksidin tuottamiseksi, on esitetty US-patenttijulkaisuissa nro 3 946 496 ja 4 057 470 (Schrot). Tässä mene-10 telmässä 14C02 kootaan ja määritetään radioaktiivisuuden laskentalaitteella radiorespirometristen profiilien rakentamiseksi. Näiden patenttien menetelmä vaatii kalliita radioaktiivisella aineella merkittyjä substraatteja ja radioaktiivisuuden laskentalaitteen. Lisäksi on välttämätön-15 tä laskea jokaisesta substraatista kehittyvä 14C02 riittävän pitkän ajanjakson aikana havainnon varmistamiseksi ja kehittymisnopeuden mittaamiseksi.

C.H. Threlkeld (J. of Food Science, 47, 1225 (1982)) on kuvannut C02:n havaitsemisen infrapunasäteilyn 20 avulla kaupallisten elintarvikkeiden päällä olevasta kaasusta elintarvikkeiden mikrobikontaminaation määrittämiseksi. Tämä menetelmä koskee pelkästään toteamista eikä lainkaan identifioimista.

Keksinnön pääasiallisena tarkoituksena on siten 25 saada aikaan nopea menetelmä mikro-organismien identifioimiseksi. Toisena päämääränä on saada aikaan keino organismien nopeaksi identifioimiseksi ilman radioaktiivisesti merkittyjä substraatteja. Lisäksi keksinnön päämääränä on saada aikaan sellainen mikro-organismien identifiointisys-30 teemi, joka ei reaktiotulosten luokittelemiseksi ole riippuvainen kemiallisista indikaattoreista tai muista lisätyistä, tulosta osoittavista reagensseista. Edelleen keksinnön päämääränä on saada aikaan menetelmä, joka voidaan sovittaa automaattisessa määrityslaitteessa käytettäväksi, 35 jolloin vältetään sellaiset reaktiotulosten tulkintavaih- 3 79548 telut, joita reaktiotuloksen silmämääräisessä havaitsemisessa esiintyy.

Keksinnön kohteena on menetelmä mikro-organismien identifioimiseksi näytteessä, kuten veressä, virtsassa, 5 selkäydinnesteessä, vedessä ym. Keksinnössä tuntemattoman mikro-organismin näyte siirrostetaan useihin eri subs-traatteihin. Substraatit sisältävät useita erilaisia hiilen lähteitä, kuten hiilihydraatteja ja aminohappoja, sekä myös muita mikro-organismien kasvuun tarvittavia kompo-10 nentteja. Jokainen näistä substraateista saattaa metaboli-soitua tietyn spesifisen mikro-organismin vaikutuksesta. Siirrostettuja substraatteja inkuboidaan etukäteen määrätyn ajan, joka on riittävä hiililähteen metabolisen hajoamisen aikaansaamiseksi ja hiilidioksidin tuottamiseksi. 15 Näytteessä olevan mikro-organismin kustakin hiililähteestä metabolisesti hajottamalla aikaansaama hiilidioksidi määritetään infrapuna-analyysillä. Hiilidioksidin havaitsemista pidetään positiivisena osoituksena hiililähteen metaboliasta. Vastaavasti, kun tuntematon organismi ei tuota 20 infrapuna-analyysillä havaittavia määriä hiilidioksidia, sitä pidetään osoituksena spesifisen hiililähteen negatiivisesta metaboliasta. Tuntemattoman organismin profiili saadaan huomioimalla positiiviset ja negatiiviset metabo-liatulokset useilla eri hiililähteillä. Näin saatua pro-25 fiilia verrataan tunnetuilla mikro-organismeilla saatuun profiiliin. Tuntematon mikro-organismi identifioidaan, kun todetaan sen profiilin vastaavan jonkin tunnetun mikro-organismin profiilia.

On ymmärrettävä, että tunnetuille mikro-organis-30 meille tällä menetelmällä saadut profiilit voivat olla erilaisia kuin muilla menetelmillä samalle organismille saadut profiilit. Muut menetelmät käyttävät näytteessä olevaa happoemäs-indikaattoria osoittamaan positiivista tulosta värinmuutoksen avulla. Näissä menetelmissä fermen-35 tointireaktiot todetaan positiivisiksi niissä tuotetun 4 79548 hapon ja seurauksena olevan pH-arvon alenemisen avulla, kun sensijaan dekarboksylolntireaktion merkkinä on pH-ar-von kohoaminen. Näiden tai samankaltaisten metabolisten reaktioiden seurauksena voi muodostua tai olla muodostu-5 matta hiilidioksidia.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa laitteessa, joka sisältää astian lukuisia erilaisia ja erillisiä hiililähteitä varten, välineen kunkin astian siirrostamiseksi tuntemattoman mikro-organismin näytteel-10 lä, keinon saattaa siirrostetut astiat olosuhteisiin, jotka johtavat normaalin metabolisen prosessin tapahtumiseen, ja infrapuna-analysointivälineen hiililähteiden metabolis-min seurauksena tuotetun hiilidioksidikaasun analysointiin sen seikan määräämiseksi, esiintyykö kussakin spesifisessä 15 kasvuväliaineessa metabolismia.

Piirustuksissa kuvio 1 esittää keksinnön periaatteiden mukaista laitteistoa, kuviossa 2 nähdään hiilidioksidin absorptiospektri 20 ja absorptiovyö alueella 2300-2400 cm-1, kuvioissa 3, 4 ja 5 nähdään hiilidioksidin infra-puna-absorptiospektrit polymetyylipenteeni-, boorisili-kaattilasi- ja natronkalkkilasiastioiden kannalta mielenkiintoisella alueella, 25 kuvioissa 6 ja 7 on eri tasoilla hiilidioksidia si sältävien polymetyleenipenteenimuovi- ja boorisilikaatti-lasiastioiden infrapunakartoitus, kuvioissa 8 ja 9 nähdään mikro-organismien metabolian tuottama hiilidioksidi eri kasvualustoilla, 30 kuvioissa 10 ja 11 nähdään mikro-organismien meta bolian positiivinen ja negatiivinen hiilidioksidin tuotto eri hiililähteistä.

Keksinnön käytäntöön soveltamiseen sopiva laitteisto on esitetty kuviossa 1 numerolla 11. Laitteistossa 11 35 mikro-organismin metabolian tuottama C02 tai sen puuttu- s 79548 minen havaitaan johtamalla infrapunasäde astian seinän lävitse ja havaitsemalla metabolian astiassa tuottaman kaasun infrapuna-absorptio. Astia voi olla pullo tai mikä tahansa muu yksiosainen tai useampiosainen astia.

5 Analysoitava näyte, kuten potilaasta otettu veri-, virtsa- tms näyte tai eri lähteistä otetun organismin viljelmä (vedestä, elintarvikkeista, potilaista ym) pannaan steriiliin astiaan 13 yhdessä sopivan kasvuväliaineen kanssa, joka mikro-organismin metabolian vaikutuksesta 10 tuottaa C02:ta. Näytettä inkuboidaan sitten astiassa. Sopivin väliajoin astia siirretään infrapunamittausvälinee-seen, joka käsittää infrapunalähteen 15 ja infrapunailmai-simen 17. Astian yläosan infrapuna-absorptio todetaan ja sen näyttöön voidaan käyttää mittaria 19, johon saattaa 15 sisältyä apukeino, joka samanaikaisesti antaa valosignaali-ilmaisun 21 ja tietokonetulostuksen 23.

Astia 13 sijaitsee alustalla 25, joka voi olla geometriselta muodoltaan lineaarinen, kaareva tai kiemurte-leva ja jonka avulla astia 13 helposti siirretään infrapu-20 nalähteen ja infrapunailmaisimen välillä. Toinen viljely-astia 13 A on esitetty haamukuvana odottamassa siirtämistä infrapunalähteellä 15 ja infrapunailmaisimella 17 suoritettavaan mittaukseen. Moottorin 27 avulla siirretään alustaa 25. Moottorin 27, infrapunalähteen 15 ja mittari-25 näytön 19 oikeaan sarjassa tapahtuvaan toimintaan käytetään sarjasäädintä 29. Joissakin tapauksissa saattaa olla tarpeellista käyttää laitetta lieriönmuotoisen astian pyörittämiseksi akselinsa ympäri infrapunalähteen aktivoinnin aikana epätasaisen sivuseinämäpaksuuden kompensoimiseksi 30 ja astian sijoittamiseksi infrapunasäteen keskilinjalle.

Astiat 13 ja 13 A voivat olla lasiastioita, kuten pulloja, jotka on varustettu tiiviillä kumisulkimilla ja kapseloitu alumiinikapseleilla, tai ne voivat olla erillisiä, toisissaan kiinni olevia peräkkäisiä muovista valet-35 tuja syvennyksiä sisältäviä mittalaatikoita. Haluttaessa 6 79548 voidaan käyttää myös muita materiaaleja ja muotoja, jotka sopivat halutun kaasuanalyysin suorittamiseen. Astioiden kokonaisvetoisuus on noin 1-200 ml, edullisesti noin 30-150 ml, josta viljelyalusta ja kokeiltava näyte vie noin 5 2-100 ml:n tilan. Veren tai virtsan tai muun näytteen ti lavuus voi olla esimerkiksi 0,1-10 ml.

Astiassa täytyy olla "ikkuna", joka sallii vähintään noin 1 %:n transmittanssin vyön leveydestä, joka sopii kasvualustan metabolian tuottaman kaasun havaitsemi-10 seen. Hiilidioksidilla on vahva infrapuna-absorptiovyö kohdassa 2349 cm-1, joka nähdään kuviossa 2 ilman vesihöyryn interferenssiä. Tätä absorptiovyötä käytettäessä astian läpinäkyvän ikkunan on siten päästettävä lävitse aaltolukujen noin 2300 cm-1 ja noin 2400 cm*1 välillä ole-15 vaa säteilyä. Hiilidioksidilla on myös alhaisfrekvenssinen absorptiovyö kohdassa 670 cm-1, jota voidaan käyttää sovellettaessa keksintöä käytäntöön.

Tietyntyyppisten lasiastioiden ja määrätyntyyppisten muoviastioiden on havaittu olevan käyttökelpoisia kek-20 sintöä sovellettaessa. Käyttökelpoisiksi ovat osoittautuneet varsinkin boorisilikaattilasi- ja natronkalkkilasi-astiat. On myös määritetty, että hiilidioksidin absorption aaltopituudelle sopiva läpinäkyä "ikkuna" voidaan valmistaa polymetyylipenteenimuovista. Myös muita lasi- tai muo-25 vimateriaaleja voidaan käyttää.

On huomattava, että infrapunaspektroskopian asiantuntijat eivät pidä lasia eikä muovia käyttökelpoisena näytettä sisältävän kennon materiaaliksi absorptioalueella 400 cm*1 - 4000 cm*1. Vaikka lasi läpäisee näkyvää valoa, 30 se ei läpäise infrapuna-alueen aaltopituuksia, jotka ovat aivan vähäisen pidempiä kuin hiilidioksidianalyysissä käytetyt. Muovit orgaanisina materiaaleina absorboivat koko tavallisella infrapuna-alueella. On yllättävää, että poly-metyylipenteenillä on läpinäkyvä "ikkuna" aaltoluvulla 35 2349 cm*1 ja lähellä aaltolukua 600 cm*1, joissa transmis- 7 79548 sio on riittävä hiilidioksidin analysoimiseen jommallakummalla edellä olevista absorptiofrekvensseistä.

Haluamatta sitoutua mihinkään teoriaan oletetaan, että hiilidioksidi absorboi infrapunaenergiaa aallonpi-5 tuusalueella, joka vastaa orgaanisten molekyylien kova-lenttista kolmoissidosta. Polymeerimateriaaleissa ei yleensä esiinny kolmoissidoksia. Polymetyylipenteeni on edullinen kovalenttisia kaksoissidoksia sisältävä polymeerimateriaali. Sopiakseen käytettäväksi keksinnön mukaises-10 sa menetelmässä polymeerimateriaalin tulee olla sellaista, että se voidaan steriloida joko tavanomaisesti autoklaavissa tai kaasu- tai säteilysteriloinnilla. Polymetyylipenteeni on tässä suhteessa sopiva, koska se kestää steriliteetin saavuttamiseen tarvittavia lämpötiloja.

15 Mikro-organismilla siirrostettava kasvualusta voi koostua yhdestä ainoasta hiililähteestä ja perusalustasta, joka sisältää suoloja, puskureita, kasvutekijää tai -tekijöitä tms. Vaihtoehtoisesti sellaisissa tapauksissa, joissa alustan puskurointikapasiteetilla ja ioniväkevyydellä 20 ei ole merkitystä ja joissa kasvutekijän edistävää vaikutusta ei tarvita, yksi tai useampi näistä komponenteista voidaan jättää pois alustasta. Esimerkkejä sopivista keksinnön käytäntöön soveltuvista perusalustoista ovat hiili-assimilaatioalusta (Carbon Assimilation Medium, josta käy-25 tetään seuraavassa nimitystä CAM), SCEPTOR gram-negatii-vinen MIC-ID, dehydratoitu viljelyalusta (seuraavassa DCM), E.coli perusalusta 1 ja Ledbetter-alusta. Nämä stan-dardialustat on kuvattu teoksissa Manual of Clinical Microbiology, 3. painos, American Society for Microbiology, 30 1980, toim. E.H. Lennette, E.H. Spaulding ja J.P. Truant;

Experiments in Molecular Genetics, 1968 ja 1972, toim. R.C. Cloroes ja W. Hayes, Blacknell Scientific Publications; ja julkaisussa P.E. Goldenbaum ja G.A. Hall, J. Bacterial. 140 sivu 459.

35 Perusalusta voidaan valmistaa ja siihen voidaan li- β 79548 sätä hiililähteet ennen alustan lisäämistä astiaan tai hlilllähteet voivat olla valmiina astioissa tai panossy-vennyksissä nesteessä, geelissä, jäädytettyinä, eluoita-vissa kiekoissa tai muissa dehydratoidulssa muodoissa, 5 jolloin perusalusta lisätään hiililähteeseen.

Käytettäväksi sopivia hillilähteitä ovat esimerkiksi hiilihydraatit, kuten glukoosi, laktoosi, arabinoosi, raffinoosi, sakkaroosi, ramnoosi, trehaloosi ym; hiilihydraatti johdannaiset, kuten salisiini; happamet sokerit; 10 urea; polyolit, kuten glyseroli, mannitoli, inositoli, sorbitoli, adonitoli ym; Krebs-syklin välituotehapot, kuten sitruunahappo; aminohapot, kuten arginiini, glysiini, alaniini, lysiini, ornitiini, treoniini, histidiini, leu-siini ym; alhaismolekyylipainoiset peptidit; puriini- ja 15 pyrimidiiniemäkset; ja alhaismolekyylipainoiset yhdisteet, jotka voivat dekarboksyloitua tuottaen hiilidioksidia, esimerkiksi rasvahapot. Hiililähdettä tulisi olla läsnä riittävä määrä tuottamaan metabolian vaikutuksesta helposti havaittava määrä hiilidioksidia. Kasvualusta sisältää 20 edullisesti noin 2 - noin 10 paino-% hiililähdettä.

Astiassa oleva hiililähdettä sisältävä kasvualusta siirrostetaan pienellä määrällä näytettä, joka sisältää mikro-organismeja. Siirrostus voidaan suorittaa joko käsin tai automaattisesti siirrostetaan joko useampia astioita 25 tai yhden astian sisältämät useat osastot.

Slirrostusvaiheen jälkeen mikro-organismeja inku-boidaan noin 20 - noin 45°C:ssa noin 1-24 tuntia riippuen mikro-organismista ja hiililähteestä, edullisesti inkuboi-daan noin 2 - noin 8 tuntia. Jotkut organismit kasvavat 30 parhaiten 20°C:ssa tai sen alapuolella ja toiset saattavat saavuttaa optimikasvun 45°C:ssa tai sen yläpuolella. Voidaan käyttää mitä tahansa lämpötilaa ja inkubointiaikaa, joka parhaiten sopii ko. olosuhteisiin. Vaikka tyydyttävä kasvu saadaan ilman sekoittamista, niin metabolia suori-35 tetaan edullisesti aktiivisesti ravistaen, sekoittaen tai 9 79548 muulla tavoin liikuttaen alustaa, jotta varmistutaan C02:n vapautumisesta. Eräässä edullisessa toteutusmuodossa liikuttaminen tapahtuu sekoittaen tai ravistaen kiertoliikkeellä siten, että nestemäiseen alustaan muodostuu pyörre.

5 C02:n läsnäolo todetaan infrapuna-analyysillä kas vualustasta kehittyneestä kaasusta. Tähän analyysiin käytetään infrapunasäteilyn absorptiota noin 2360 cm"1 .

C02:n absorptio nähdään kuvion 2 C02-infrapuna-absorptio-spektrissä.

10 Keksintöä sovellettaessa infrapuna-absorptio määri tetään välittömästi siirrostuksen jälkeen ja tietyin väliajoin senjälkeen aina inkubaatioajan loppuun asti. Koko-naisabsorptio kohdassa 2360 cm*1 mitataan. Astioiden aiheuttaman absorption korjauksia tehdään sitten mittaamalla 15 lasiastioiden absorptio kohdassa 2400 cm*1 ja polymetyyli-penteeniastioiden kohdassa 2250 cm*1. Vähentämällä koko-naisabsorptioista astioiden aiheuttamat absorptiot saadaan kehittyneen C02:n korjattu absorptio.

Hiililähteiden hyväksikäytön tai ei-käytön (joka 20 määritetään yläosassa olevassa kaasussa olevan hiilidioksidin läsnäolon tai puuttumisen perusteella) profiilia käytetään näytteen tuntemattoman mikro-organismin profiilin saamiseen. Samalla tavalla valmistetaan useiden tunnettujen mikro-organismien profiilit. Vertaamalla tunte-25 mattoman mikro-organismin profiilia tunnettujen mikro-organismien profiileihin voidaan identifioida tuntematon. On selvää, että tämä vertailu helpottuu, jos ensin erotetaan tuntemattoman organismin ja tunnettujen organismien profiilit ryhmiin tunnettujen standardiluokitusten mukaan, 30 esimerkiksi gramvärjäyksen mukaisesti gram-positiivisiin ja gram-negatiivisiin mikro-organismeihin.

Seuraavat esimerkit antavat lisävalaistusta keksinnön eri piirteisiin, jonka suojapiiri määritellään patenttivaatimuksissa. Varsinkin, vaikka metabolinen mielenkiin-35 toinen tuote esimerkeissä on hiilidioksidi, myös muita 10 79548 metabolisesti muodostuneita kaasuja voidaan määrittää sillä edellytyksellä, että yhdisteellä on infrapuna-absorp-tiovyö ja että astian materiaalilla on infrapuna-transmit-tanssi etäisyydellä vähintään noin ± 10 cm-1 kaasumaisen 5 tuotteen aaltoluvusta ja vähintään noin 1 %:n transmissio kiinnostavalla aaltopituusalueella.

Esimerkki 1

Kuvioissa 3-5 nähdään kolmen eri materiaalin infra-puna-transmission suhteelliset määrät. Kuviossa 3 125 ml:n 10 polymetyylipenteenipulloon, jonka sivuseinien paksuus on noin 0,76 mm ja ulkopuolinen läpimitta 47,8 mm, kohdistetaan infrapunasäteily. C02 -absorption alue on merkitty kuvioon 3. Kuten osoitettiin, C02-absorptio vaihtelee trans-mittanssln ollessa noin 2 - noin 7 %. Tämä riittää C02:n 15 määrittämiseen. Kuviossa 4 boorisilikaattilasiseen putkeen, jonka sivuseinien paksuus on 1,35 mm ja ulkopuolinen läpimitta 33,8 mm, kohdistetaan säteily, jonka aaltoluvut ovat mielenkiintoisella alueella. Voidaan nähdä, että boo-risillkaattilasin transmittanssl lnfrapunaisella aaltolu-20 kualueella jonkin verran C02:n absorptioalueen jälkeen on 0. C02:n absorption alueella transmittanssi-% vaihtelee noin 7 %:sta noin 14 %:iin. Kuviossa 5 50 ml:n natronkalk-kilasista valmistettuun pulloon, jonka ulkoläpimitta on noin 43,2 mm, kohdistetaan infrapunasäteily. Jälleen 25 transmittanssi-% on 0 infrapuna-aaltoluvuilla, jotka ovat hieman suurempia kuin C02:n absorption alue. C02:n absorption alueella transmittanssi-% on noin 3 - noin 9. Kaikki tämän esimerkin ja muiden esimerkkien infrapunamittaukset tehtiin Nicolet 5-MX FT-IR spektrofotometrillä. Kuvioiden 30 3-5 mittaukset tehtiin pullojen ollessa avoimia ja täynnä huoneilmaa, ja mittauksia suoritettiin noin 60, joista laskettiin keskiarvo. Näitä mittauksia verrattiin huoneilmalla tehtyihin mittauksiin, joita tehtiin myös 60. Kaikissa tapauksissa hiilidioksidiabsorption kannalta mielen-35 kiintoinen alue on noin 2400-2200 cm"1.

n 79548

Esimerkki 2

Kuvioissa 6 ja 7 on tulokset kokeista, joissa poly-metyylipenteenipullon ja boorisilikaattilasiputken yläosaan pantiin erilaisia määriä hiilidioksidia. Vertailuar-5 vot saatiin pitämällä astioita ensin auki huoneilmaan ja ottamalla 60 lukemaa Nicolet-spektrofotometrillä. Astiat huuhdottiin sitten kaasuilla, jotka sisälsivät noin 2,5, 5,0 ja 10 % hiilidioksidia ja suljettiin välittömästi. Pullolle ja putkelle suoritettiin jälleen mittaukset kun-10 kin huuhtelun jälkeen (60 kertaa) Nicolet-spektrofotometrillä. Tulokset nähdään kuvioissa 6 ja 7, joissa pystyakseli osoittaa tässä tapauksessa infrapuna-absorbanssia x 100. Voidaan havaita selvä korrelaatio alueen 2400-2300 cm'1 infrapuna-absorption ja astioiden hiilidioksidi-kon-15 sentraatioiden välillä.

Esimerkki 3

Kuviossa 8 nähdään infrapuna-absorption suurenemisen ja organismin kasvun välinen korrelaatio.

Kahdessa polymetyylipenteenipullossa oleva 30 ml 20 trypsiini-soijalientä (TBS) steriloitiin autoklaavissa. Toiseen pulloon siirrostettiin ajankohtana 0 noin 0,5 ml yli yön kasvanutta viljelmää. Toiseen pulloon ei siirros-tettu mitään, ja sitä käytettiin vertailuna. Mittauksia suoritettiin kummallakin pullolla 60 kertaa kuviossa 8 25 esitettyinä aikaväleinä. Kuvion 8 tulokset edustavat siirrostetun pullon koetulosta, josta on vähennetty siir-rostamattoman pullon lukemat. Pulloja inkuboitiin 37eC:ssa määritysten välillä. Voidaan nähdä selvä korrelaatio organismin kasvun ja infrapuna-absorption välillä hiilidiok-30 sidin absorptioalueella.

Kuviossa 9 on steriiliä alustaa sisältävällä nat-ronkalkkilasiputkella saatu koetulos ja natronkalkkiput-kessa olevalla alustalla, joka on siirrostettu Clostridium perfringens-organismilla, saatu koetulos. Molempia infra-35 punakoetuloksia verrattiin huoneilmaa sisältävällä natron- 12 79548 lasiputkella saatuun tulokseen. Kalkki määritykset suoritettiin 60 kertaa Nicolet-spektrofotometrillä. C.perfrin-gens-organismia sisältävällä putkella saatiin paljon suurempi hiilidioksidilukema kuin pelkkää viljelyalustaa si-5 sältävällä putkella.

Esimerkki 4

Natronkalkkilasiputket, jotka sisälsivät 30 ml joko CAM tai DCM viljelyalustaa ja valikoituja hiililähteitä, siirrostettiin 5 ml:11a E.coli suspensiota (noin 109 so-10 lua/ml) normaalissa suolaliuoksessa. Infrapuna-absorptio mitattiin ajankohtana 0. Putkia inkuboitiin 37°C:ssa ja infrapuna-absorptio mitattiin 5 tunnin kuluttua. Näiden kokeiden tulokset nähdään kuvioissa 10 ja 11. Mikro-organismin metabolian tuloksena glukoosi-, laktoosi-, manni-15 toll- ja lysiinipitoisista alustoista kehittyi hiilidioksidia, joka havaittiin. Organismi ei metaboloinut sakkaroosia eikä lnositolia.

Keksinnön mukaista menetelmää on edellä kuvattu käytettynä bakteerien määrittämiseen; menetelmää voidaan 20 kuitenkin käyttää laajemmin biologisen aktiivisuuden toteamiseen, kuten soluorganismien, kudosviljelysolujen, hiivojen aktiivisuuden ja entsymaattisten reaktioiden toteamiseen. Tätä menetelmää voidaan myös käyttää mikro-organismin herkkyyden määrittämiseen mikrobivastaisen aineen 25 suhteen silloin, kun organismin tuottama hiilidioksidimäärä kasVaa tai vähenee mikrobivastaisen aineen vaikutuksesta mikro-organismiin. Tässä kuvatun keksinnön erilaiset variaatiot ovat alan asiantuntijalle ilmeisiä. Keksinnön suojapiiriä rajoittavat siten ainoastaan patenttivaatimuk-30 set.

Claims (8)

13 79548

1. Menetelmä näytteessä olevien mikro-organismien identifioimiseksi, tunnettu siitä, että 5 1) varataan useita astioita, joissa jokaisessa erillisessä astiassa on erilaista mikro-organismien kasvualustaa, joista jokainen kasvualusta sisältää hiililäh-dettä, joka voi metabolisoitua ja tuottaa hiilidioksidia, jolloin hiililähde jokaisessa astiassa on erilainen kuin 10 kaikissa muissa astioissa oleva hiililähde, 2. valmistetaan standardi-hiilidioksidiprofiili määrätylle tunnetulle mikro-organismille seuraavissa vaiheissa : (a) useihin astioihin siirrostetaan tunnetun mikro-15 organismin näyte, (b) astiaa inkuboidaan ajanjakso, joka riittää mainitun kasvualustan metaboliseen hajottamiseen ja sen seurauksena hiilidioksidin tuottamiseen ainakin joistakin kasvualustoista, 20 (c) hiilidioksidin läsnäolo kustakin kasvualustasta kehittyneessä kaasukehässä tai sen puuttuminen todetaan mittaamalla mainitun kaasukehän infrapuna-absorptio johtamalla kaasukehän lävitse infrapunasädekimppu ja havaitsemalla mainitun kaasukehän infrapuna-absorptio, 25 (d) muodostamalla standardi-hiilidioksidiprofiili mainitulle tunnetulle mikro-organismille perustuen niiden kasvualustojen lukuun ja tyyppiin, joilla hiilidioksidin läsnäolo tai puuttuminen määritetään infrapuna-absorptiol-la, 30 3) toistetaan vaiheet (a) - (d) useilla tunnetuilla mikro-organismeilla standardi-hiilidioksidiprofiilien sarjan saamiseksi tunnetuille mikro-organismeille, 4. toistetaan vaiheet (a) - (d) näytteellä, joka sisältää tuntematonta mikro-organismia, tuntemattoman mik-35 ro-organismin hiilidioksidiprofiilin saamiseksi, ja li 79548 5. verrataan tuntemattoman mikro-organismin hiili-dioksidiprofiilia mainittuun sarjaan standardi-hiilidiok-sidiprofiileja mainitun tuntemattoman mikro-organismin identifioimiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että infrapuna-absorptio mitataan lasiastiassa aallonpituuksilla 2360 cm'1 ja 2400 cm*1, ja aallonpituudella 2400 cm~1 saatu absorptio vähennetään aallonpituudella 2360 cm-1 saadusta absorptiosta, jolloin 10 saadaan todellinen mitta hiilidioksidin aiheuttamalle absorptiolle aallonpituudella 2360 cm'1 .

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että infrapuna-absorptio mitataan polymetyylipenteeniastiassa aallonpituudella 2360 cm'1 ja 15 2250 cm'1, ja aallonpituudella 2250 cm'1 saatu absorptio vähennetään aallonpituudella 2360 cm'1 saadusta absorptiosta, jolloin saadaan todellinen mitta hiilidioksidin aiheuttamalle absorptiolle aallonpituudella 2360 cm'1 .

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että infrapuna-absorbanssi mitataan aallonpituudella 670 cm-1 .

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkubointiaika on noin 1-24 tuntia.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkubointiaika on noin 2-8 tuntia. 15 79548

1. Förfarande för identifiering av mikroorganismer i ett prov, kännetecknat därav, att inan 5 1) tillhandahäller ett flertal behällare, varvid de individuella behällarna försetts med olika tillväxtme-dier för mikroorganismer och varje tillväxtmedium innehäl-ler en kolkälla, som kan metaboliseras och avge koldioxid, varvid kolkällan är olik kolkällan i samtliga övriga be-10 hällare; 2. framställer en standardkoldioxidprofil för en speciell känd mikroorganism genom följande steg: a) ett flertal behällare ympas med ett prov av den kända mikroorganismen, 15 b) behällaren inkuberas under en tidsrymd, som räcker för att ästadkomma metabolisk nedbrytning av nämn-da tillväxtmedium, vilket resulterar i produktion av koldioxid i ätminstone nägra av tillväxtmedierna, c) närvaron eller fränvaron av koldioxid i gasat-20 mosfären, vllken utvecklas i vart och ett tillväxtmedium detekteras, genom att mätä den infraröda absorptionen hos nämnda gasatmosfären genom att leda ett infrarött sträl-knippe genom gasatmosfären och detektera den infraröda absorptionen hos nämnda gasatmosfär, 25 d) en standardikoldixidprofil görs för nämnda kända mikroorganism pä basen av antalet och typen tillväxtme-dier, i vilka närvaron eller fränvaron av koldioxid fast-ställs genom infraröda absorption, 3. stegen (a) - (d) upprepas för ett flertal kända 30 mikroorganismer för att erhälla en serie standardkoldi- oxidprofiler för kända mikroorganismer, 4. stegen (a) - (d) upprepas för ett prov, vilket innehäller en okänd mikroorganism, för att erhälla en kol-dioxidprofil för en okänd mikroorganism, och 35 5) den okända mikroorganismens koldioxidprofil jäm-