FI80905C - Dna och den omfattande vector. - Google Patents

Description

1 80905 DNA ja sitä sisältävä vektori 5 Keksinnön tausta: Tämä keksintö koskee DNA:ta, joka koodaa signaaliami-nohapposekvenssin, mikä saa aikaan tuotteiden erittymisen soluista ja sellaisen järjestyksen sisältävää DNA:ta.

Tässä signaaliaminohapposekvenssi tarkoittaa aminohap-10 pojärjestystä, joka toimii niin, että soluissa muodostu neet tuotteet voidaan eristää soluista. Yleisesti tuotteet tuotetaan soluissa ja akkumuloidaan niihin. Toisaalta niiden tuotteiden, joilla on signaaliaminohapposekvenssi, sanotaan erittyvän soluista sitä mukaan kuin niitä . . 15 muodostuu soluissa. Siis solujen tuotteet voidaan menes- ; ; tyksellä eristää soluista, jos käytetään signaaliaminohap- posekvenssiä.

Tuotteiden eristämisellä soluista voisi olla seuraavat edut: Ensiksi jos solujen tuotteet voidaan siirtää so- 20 luista, tulee mahdolliseksi erottaa helposti epäpuhtaudet tuotteista ja vähentää tuotteiden puhdistus- ja eristysme-netelmiin tarvittavaa työtä. Lisäksi solujen tuotteet voidaan eristää puhtaina ilman, että mukana on solukalvon sisältämiä myrkyllisiä aineita, joten tuotteilla on käyttöä 25 laajalla alueella ilman käyttörajoitusta. Toiseksi vaik-. kakin solujen tuotteet ovat sellaisia, että niiden oma liiallinen muodostuminen inhiboisi niiden tuottamista soluissa, ne vapautetaan takaisinkytkentäinhibiitiosta, kun ne siirretään biosynteettisestä systeemistä, niin että nii-30 den liiallinen tuotanto tulee mahdolliseksi. Kolmanneksi ne solujen tuotteet, jotka ovat vahingollisia solujen kasvulle, voidaan siirtää soluista, joten niiden tuottamista voidaan jatkaa samalla kun solut säilytetään hyödyllisinä.

Tunnetaan monia signaaliaminohapposekvenssejä ja vas-35 taavia DNA-emäsjärjestyksiä. Niitä ovat esimerkiksi signaaliaminohapposekvenssi penisillinaasille Bacillus licheniformiksessa (Nucleic Acid Research Voi. 9, No. 11, 2 80905 2577 (1981)) ja signaaliaminohapposekvenssi α-amylaasilie Bacillus amyloliquefaciensessä (Gene, 15, 43 (1981)).

Esillä olevat keksijät ovat suorittaneet Bacillus sub-tiliksen, tunnettu hyvin korkeasta a-amylaasituottavuudes-5 taan, a-amylaasigeenin kloonauksen, analysoineet kloonatun geenin ja löytäneet uuden signaaliaminohapposekvenssin, joka eroaa amylaasin tunnetusta signaaliaminohapposekvens-sistä ja vastaavasta DNA-emäsjärjestyksestä. Tuloksena he ovat keksineet uuden signaaliaminohapposekvenssin ja DNA-10 emäsjärjestyksen, jotka eroavat tähän asti tunnetuista.

Kun solujen tuote eristetään käyttäen tämän keksinnön mukaista DNA:ta isäntävektorisysteemissä, missä isäntä on Bacillus subtilis, jolla on korkea α-amylaasituottavuus, tällä keksinnön mukaisella systeemillä on parempi stabii-15 lisuus ja eritystuottavuus verrattuna systeemiin, jossa käytetään eri organismia tai eri signaaliaminohapposekvens-siä.

20 Tämän keksinnön päämääränä on tuottaa uuden signaali aminohapposekvenssin koodaava uusi'DNA-emäsjärjestys, jolloin signaalisekvenssi on

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys

Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe ^ Ala Gly Phe Leu Leu Leu Phe

Tyr Leu Vai Leu Ala Gly Pro

Ala Ala Ala Ser Ala Glu Thr

Ala Asn Lys Ser Asn Glu, 30 mainittu DNA-emäsjärjestys on seuraava:

ATG TTT GCA AAA CGA TTC AAA

ACC TCT TTA CTG CCG TTA TTC

GCT GGA TTT TTA TTG CTG TTT

TAT TTG GTT CTG GCA GGA CCG

55 GCG GCT GCG AGT GCT GAA ACG

GCG AAC AAA TCG AAT GAG.

3 80905

Suositeltavimpien sovellutusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus : Tässä esityksessä käytettävät kemialliset symbolit ovat seuraaville yhdisteille: 5 Met metioniini

Phe fenyylialaniini

Ala alaniini

Lys lysiini

Arg arginiini 10 Thr treoniini

Ser seriini

Leu leusiini

Pro proliini

Gly glysiini 15 Tyr tyrosiini

Vai väliini

Glu glutamiinihappo

Asn asparagiini A adeniini 20 T tyrniini : G guaniini C sytosiini Tässä keksinnössä erilaisia aminohappoja koodaava DNA-emäsjärjestys kuvataan alla.

25 Alla luetellut emäkset sisältävät modifioituja emäksiä kuten metyloituja emäksiä.

Met ATG

Phe TTT, TTC

Ala GCT, GCC, GCA, GCG

30 Lys AAA, AAG

Arg AGA, AGG, CGT, CGC, CGA, CGG

Thr ACT, ACC, ACA, ACG

Ser TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC

Leu TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG

35 Pro CCT, CCC, CCA, CCG

Gly GGT, GGC, GGA, GGG

Tyr TAT, TAC

« 80905

Vai GTT, GTC, GTA, GTG

Glu GAA, GAG

Asn AAT, AAC

Yllä lueteltuja aminohappoja koodaavat erilaiset DNA-5 emäsjärjestykset voidaan sopivasti valita käytettäviksi tässä keksinnössä.

DNA, joka koostuu DNA-emäsjärjestyksestä tai DNA, joka sisältää tämän keksinnön mukaisen signaaliaminohapposek-venssin koodaavan järjestyksen, voidaan tehdä kemialliselle) la synteesillä tai uuttaa määrättyjen kantojen kromosomaa-lisesta DNA:sta.

Kromosomaalisesta DNA:sta DNA:n uuttamismenetelmässä käytettävät kannat sisältävät esimerkiksi Bacillus subti-liksen, jolla on korkea ot-amylaasituottavuus. Tässä mai-15 nittu korkean amylaasituottavuuden omaava Bacillus subti-lis sisältää ne kannat, joita on parannettu erilaisin menetelmin jo pitkään, kuten Bacillus subtilis NA 64 -kanta (IA 412), joka on valmistettu liittämällä Bacillus natton α-amylaasia kontrolloiva geeni Bacillus subtilis 6l60 20 -kantaan, joka on saatu Bacillus subtilis 168 -kannasta, ja sillä on erikoinen ominaisuus erittää runsaasti a-amylaasia soluista. NA 64 -kanta (IA 412) on jo laajalti tunnettu ja voidaan saada helposti. Esimerkiksi se on jo saatavissa Bacillus Genetic Stock Centeristä (Ohion val-25 tion yliopisto). NA 64 -kanta (IA 412) on talletettu Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technologyssa tallennusnumerolla FERM BP-423· Tämän keksinnön mukaisen signaaliaminohapposekvenssin koodaavan DNA-emäsjärjestyksen sisältävien fragmenttien 30 valmistusta kuvaa seuraava esimerkki.

Valmistusesimerkki: a-amylaasigeeni valmistettiin seuraavasti: 35 Kromosomaalinen DNA valmistettiin Bacillus subtilis NA 64 -kannasta (IA 412) (FERM BP-423), joka tuottaa a-amylaasia, eksosellulaarista entsyymiä, käyttämällä Saito-Miura -me- 5 80905 netelmää (H. Saito et-ai., Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)).

Temperate faagi pii (D.H. Dean et ai., J. Virol, 20, 509 (1976)) valmistettiin seuraavasti: pll-osaset saatiin 5 indusoimalla temperate faagin pii lysogeeninen kanta käsittelemällä mitomysiini C:llä (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd:n tuote).

pii puhdistettiin kesiumkloriditasapainotiheysgradi-enttisentrifugointimenetelmällä (missä kesiumkloridiliuos 10 asetettiin ennen sentrifugointia tiheyteen 1,51 g/cm^).

DNA valmistettiin puhdistetuista pll-osasista SDS-fenoli-etanoli -saostusmenetelmällä.

Kromosomaalinen DNA Bacillus subtilis NA 64 -kannasta ja yllä mainitulla tavalla saatu pll-DNA pilkottiin 15 restriktioentsyymillä Bam HI (Takara Shuzo Co., Ltd:n tuote) ja myöhemmin liitettiin T4-ligaasilla (BRL:n tuote), mistä spesifisesti muutetut faagipartikkelit, jotka säilyttivät α-amylaasigeenin, saatiin käyttämällä Kawamura et ai:in menetelmää (Gene, 5> 87 (1979)) tai Nomura et 20 al:in menetelmää (Agric. Biol. Chem. jo, 2637 (1979)). Saaduista α-amylaasigeenin säilyttäneistä spesifisesti muutetuista faagipartikkeleista valmistettiin edelleen a-amylaasigeenin säilyttänyt pll-DNA käyttämällä SDS-fenoli-etanoli -saostusmenetelmää.

: : 25 Myöhemmin tämä pll-DNA muokattiin osittain restriktio entsyymillä Sau 3A (Takara Shuzo Co., Ltd:n tuote). Tuote liitettiin restriktioentsyymi Bam HI:llä pilkottuun plas-midi pUB 110 -fragmenttiin käyttämällä T4-ligaasia, jotta saatiin hybridiplasmidiseos.

* ·. 30 Bacillus subtilis transformoitiin käyttämällä tätä seosta protoplastitransformaatiomenetelmän mukaan (S.

Chang ja S.N. Cohen, M. G. G., 168, 111 (1979)). Transformoiduista kannoista valittiin kannat, joilla oli sekä kanamysiiniresistenssi (10 yg/ml) että a-amylaasiaktiivi-35 suus. Näistä valikoiduista kannoista valmistettiin puh-dasviljelmä kanamysiiniä sisältävällä kasvualustalla (10 yg/ml) ja sen jälkeen plasmidit, jotka säilyivät viljel- 6 80905 lyissä soluissa, erotettiin käyttämällä tavanomaista kir-kas-lysaattimenetelmää. Saadut plasmidit pilkottiin restriktioentsyymillä Eco Rl (Boehringerin tuote) ja Xba I (BRL:n tuote), ja pilkotut tuotteet erotettiin 0,8 J5:sella 5 agaroosigeelielektroforeesilla ja DNA-osanen vyöhykkeellä noin 1,4 kep:a uutettiin geelistä hydroksiapatiittimene-telmän mukaan (H.F. Tabak ja R.A. Flavell, Nucleib Acids Research, 5, 2321 (1978)). Tämä osanen pilkottiin edelleen restriktioentsyymillä Alu I (Takara Shuzo Co. Ltd:n 10 tuote) ja pilkottu tuote eroteltiin 5 5S:sella polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla erottamaan osanen vyöhykkeellä noin 0,45 kep:a DNA:n uuttamiseksi uutepuskurilla (0,1 M Tris-Hcl (pH 8,0), 0,5 M ammoniumasetaatti ja 10 mM EDTA), jotta saatiin DNA-osanen, joka sisälsi tässä keksinnössä 15 tarkoitetun signaaliaminohapposekvenssin koodaavan DNA:n.

Jotta varmistettiin, että tämä DNA-osanen koodasi täs-sä keksinnössä tarkoitetun signaaliaminohapposekvenssin, osanen analysoitiin käyttämällä Maxam-Gilbertin menetel-I- mää (Method in Enzymology, voi. 65, 499). Täten varmis- 20 tettu DNA-emäsjärjestys oli seuraava:

ATG TTT GCA AAA CGA TTC AAA

ACC TCT TTA CTG CCG TTA TTC

GCT GGA TTT TTA TTG CTG TTT

TAT TTG GTT CTG GCA GGA CCG

V; 25 GCG GCT GCG AGT GCT GAA ACG

GCG AAC AAA TCG AAT GAG

• *

Sovellutusesimerkki: * *

Valmistusesimerkissä saatu DNA-osanen ja Hind III * -liittäjä (Takara Shuzo Co. Ltd:n tuote) liitettiin T4-li- 30 gaasilla käyttämällä tavanomaista menetelmää, pilkottiin myöhemmin restriktioentsyymillä Hind III (Takara Shuzo Co. Ltd: n tuote) ja sen jälkeen eroteltiin 5 %'· sella polyak-ryyliamidigeelielektroforeesilla mainitun Hind III -liit-täjään liitetyn osasen uuttamiseksi myöhemmin geelistä.

35 Viitattaessa tähän DNA-osaseen käytetään kirjainta A.

Toisaalta pBR 322 pilkottiin riittävästi restriktio-entsyymlllä Eco Rl ja edelleen pilkottiin endonuklcaasi11a 7 80905

Bal 31 (BRL:n tuote) noin 30 sekuntia ja tuote saostettiin myöhemmin etanolilla DNA:n konsentroimiseksi ja puhdistamiseksi ja pilkottiin jälleen riittävästi restriktioent-syymillä Bst N-l (New England Bio Labs:n tuote): 5 Saatu tuote eroteltiin myöhemmin 1,2 %:sella agaroosi- geelielektroforeesilla, ja sen jälkeen erotettiin DNA l,4:stä l,5:een kepin läheisyydessä ja uutettiin geelistä käyttämällä hydroksiapatiittimenetelmää. Uutettaessa saatu lopputuote tehtiin kaksisäikeiseksi E.coli-DNA-poly-10 meraasi Iillä (Klenow-fragmentti) (BRLin tuote) ja dNTPillä (Yamasa Shoyn Co., Ltdin tuote). Tuote liitettiin myöhemmin Hind III -liittäjällä edellä mainitulla tavalla ja pilkottiin Hind Ulilla. Tämä osanen erotettiin sitten l,2:sen agaroosigeelielektroforeesin avulla ja DNA .. 15 uutettiin. Viitattaessa tähän DNA-osaseen käytetään kir- j ainta B.

pUB 110 pilkottiin restriktioentsyymillä Bam HI, käsiteltiin E.coli-DNA-polymeraasi Iillä (Klenow-fragmentti) samalla tavalla, liitettiin Hind III -liittäjällä ja pil-20 kottiin Hind Ulilla, ja saatu tuote eroteltiin myöhemmin 0,8:sella-agaroosigeelielektroforeesilla edellä mainitulla tavalla DNAin uuttamiseksi. Viitattaessa tähän DNA-osaseen käytetään kirjainta C.

Näitä kolmea osasta A, B ja C sekoitettiin lähes yhtä -···. 25 suuressa määrässä, ja seos vietiin Bacillus subtiliksen protoplastiin tavanomaisella menetelmällä. Regeneraation _* · jälkeen tätä kasvatettiin 20 ug/ml ampisilliiniä ja 10 ug/ml kanamysiiniä sisältävällä kasvualustalla, josta saatiin mainitulla kasvualustalla kasvamaan kykenevä muunnos. 30 Tästä Bacillus subtiliksesta valmistettiin puhdasviljelmä ja immunologisesti varmistettiin, että ampisilliiniä hajottavaa entsyymiä oli mukana kasvualustassa.

Bacillus subtiliksen viljelyssä edellä valmistus- ja sovellutusesimerkeissä käytettiin jrnodifioitua L-lihalientä 35 (joka sisälsi 1 gin Bacto tryptonea'8' (Difcon tuote), 0,5 g hiivauutetta (Difcon tuote), 1,0 g NaClia ja 0,2 g glukoosia 100 mlissa; pH 7,0) pllin valmistuksessa, kun taas L-

8 8090S

lihalientä (modifioitu L-lihaliemi, joka sisälsi 0,5 g NaCl:a) käytettiin muissa tapauksissa.

Entsyymireaktioihin, elektroforeeseihin ja DNA:n uut-toon tässä käytetyillä puskuriliuoksilla oli kaikilla 5 asiaan liittyvissä käsikirjoissa, erityyppisessä kirjallisuudessa ja opaskirjoissa kuvatut tunnetut koostumukset.

Claims (7)

1. 9 80905
2. 1. DNA, tunnettu siitä, että se sisältää kodonit signaaliaminohapposekvenssille: Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys
3. 5 Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala G ly Phe Leu Leu Leu Phe Tyr Leu Vai Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tunnettu siitä, että signaaliaminohapposekvenssin koodaava DNA-emäsjärjestys on ATG TTT GCA AAA CGA TTC AAA ACC TCT TTA CTG CCG TTA TTC
5. 15 GCT GGA TTT TTA TTG CTG TTT TAT TTG GTT CTG GCA GGA CCG GCG GCT GCG AGT GCT GAA ACG GCG AAC AAA TCG AAT GAG.
6. 3. Vektori, joka sisältää DNA:ta, tunnettu siitä, 20 että DNA sisältää kodonit signaaliaminohapposekvenssille: Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly Phe Leu Leu Leu Phe Tyr Leu Vai Leu Ala Gly Pro
7. 25 Ala Ala Ala Ser Ala Glu Thr Ala Asn Lys Ser Asn Glu. 10 80905