FI80703C

FI80703C - BIS-INDOLALKALOIDERS PROTEIN CONJUGAT, DERAS FRAMSTAELLNING OCH ANVAENDNING.

Info

Publication number: FI80703C
Application number: FI852785A
Authority: FI
Inventors: Aarre Huhtikangas; Seppo Lapinjoki
Original assignee: Huhtamaeki Oy Laeaeketehdas Le
Priority date: 1985-07-16
Filing date: 1985-07-16
Publication date: 1990-07-10
Also published as: FI852785A0; FI852785L; FI80703B; JPS63500308A

Description

1 807031 80703

Bis-indolialkaloidien proteiinikonjugaatit, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö - Bis-indolalkaloiders proteinkonjugat, deras framställning och användingProtein conjugates of bis-indole alkaloids, their preparation and use - Bis-indole alkaloids protein conjugates, deram framställning och använding

Keksinnön kohteena on bis-indolialkaloidien konjugaatit, niiden valmistus sekä käyttö immunometrisissä määritysmenetelmissä .The invention relates to conjugates of bis-indole alkaloids, their preparation and their use in immunometric assay methods.

Tietyt bis-indolialkaloidit, joista osa on kasveista saatavia luonnonmolekyylejä, osa näistä synteettisesti johdettuja, ovat osoittautuneet syöpäsolujen lääkinnälliseen tuhoamiseen soveltuviksi ns. sytostaateiksi. Tällaisten aineiden pitoi-suusmääritykset ovat sekä niiden kehittelytyön, että erityisesti hoidon optimoinnin kannalta tärkeitä. Herkät analyyttiset menetelmä ovat hyödyksi myös kyseisten yhdisteiden tuotantoprosessien yhteydessä.Certain bis-indole alkaloids, some of which are natural molecules derived from plants, some of which are synthetically derived, have been shown to be suitable for the medical destruction of cancer cells. cytostatics. Concentrations of such substances are important both for their development work and, in particular, for the optimization of treatment. Sensitive analytical methods are also useful in the production processes of these compounds.

Tällaisia bis-indolialkaloideja tai niden synteettisiä johdannaisia voidaan kuvata seuraavalla yleiskaavalla; katarantiiniyksikkö jfy-S V ··'' —f— Il I J ·’ vindoluniyksikkö * (— / R1 K* C0R4 2 80703 D R^ R2 R3 R4Such bis-indole alkaloids or synthetic derivatives thereof can be described by the following general formula; catharanthine unit jfy-S V ·· '' —f— Il I J · 'vindolun unit * (- / R1 K * C0R4 2 80703 D R ^ R2 R3 R4

OHOH

\ / 1 vinblastiini C -CH3 -OCOCH3 -OH -OCH3 I Et CHo / * 2 vinkristiini -CHO -OCOCH3 -OH -OCH3 3 vindesiini -"- -CH3 -OH -OH -NH2 4 vintsolidiini -"- -CH3 -OCOCH3 | j ° Y"n 0 ch2ch2ci\ / 1 vinblastine C -CH3 -OCOCH3 -OH -OCH3 I Et CHo / * 2 vincristine -CHO -OCOCH3 -OH -OCH3 3 vindesine - "- -CH3 -OH -OH -NH2 4 vincolidine -" - -CH3 -OCOCH3 | j ° Y "n 0 ch2ch2ci

Keksinnön mukaiselle yhdisteelle on tunnusomaista se, että konjugaatin kaava (I) onThe compound of the invention is characterized in that the conjugate of formula (I) is

Ar-N=N-bisindolialkaloidi (I) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on r-- C'1 - 3 R1 S* C0R4 3 80703 jossa kaavassa OH CH2CH3 CH2CH3 D on - C - CH2 - tai - C = CH-,Ar-N = N-bisindole alkaloid (I) wherein the general formula (II) of the indole alkaloids is r-- C'1 - 3 R1 S * COR4 3 80703 wherein OH CH2CH3 CH2CH3 D is - C - CH2 - or - C = CH-,

Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -OCOCH3 tai -OH, R3 on -OH, R4 on -OCH3, —NH2 tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -0-C-N-CH2CH2ClR 1 is -CH 3 or -CHO, R 2 is -OCOCH 3 or -OH, R 3 is -OH, R 4 is -OCH 3, -NH 2 or R 3 and R 4 together form a chain -O-C-N-CH 2 CH 2 Cl

OO

Ar tarkoittaa ryhmää jonka kaava on jfiS- T-NH-CO- (CH2) n^Y^/ jossa n on 0 - 5, joka alkyleeniketju voi olla substituoitu ja T tarkoittaa proteiiniryhmää kuten glukoproteiinia, immuno-glukoproteiinia tai entsyymiä.Ar represents a group of the formula jSS-T-NH-CO- (CH2) n ^ Y ^ / wherein n is 0 to 5, which alkylene chain may be substituted and T represents a protein group such as a glycoprotein, an immunoglucoprotein or an enzyme.

Nykyisin kliinisessä käytössä oleville yllämainitun tyyppisille yhdisteille, vinkristiinille, vinblastiinille ja vindesiinille ei tiettävästi ole kaupallisesti saatavissa herkkää ja spesifistä sarja-analyyttistä menetelmää. Keskeisenä erona aikaisemmin julkaistuihin, näiden yhdisteiden immunoanalyyttisiin menetelmiin (Ria, Irma, Elisa ym) nähden on nyt kehitetyn menetelmän pohjalta tuotettujen vastaaineiden suuri spesifisyys. Tämä perustuu siihen, että tässä kuvattava proteiinikonjugaatin valmistusmenetelmä jättää kohteena oleva bis-indolialkaloidin toisen, nykykäsityksen mukaan juuri terapeuttisesti aktiivisen osan vapaaksi ja näin analyysimenetelmän pohjana olevissa vuorovaikutusprosessissa toimintakykyiseksi.For compounds of the above type, vincristine, vinblastine and vindesine, currently in clinical use, a sensitive and specific serial analytical method is not known to be commercially available. A key difference from previously published immunoanalytical methods for these compounds (Ria, Irma, Elisa, etc.) is the high specificity of the antibodies produced on the basis of the method now developed. This is based on the fact that the method of preparing the protein conjugate described here leaves the second, currently understood, therapeutically active part of the subject bis-indole alkaloid free and thus functional in the interaction process underlying the method of analysis.

Saavutettavasta suuresta spesifisyydestä on analyysissä hyötyä esimerkiksi siten, etteivät mahdolliset lääkkeiden aineenvaihduntatuotteet tai tuotannossa sivutuotteet häiritse määritystä.The high specificity achieved is useful in the analysis, for example, so that any drug metabolites or by-products in production do not interfere with the assay.

. 80703 4. 80703 4

Bis-indolialkaloidit muodostuvat vindoliini- ja katarantiini-yksiköistä, joista katarantiiniyksikön indolinen osa antaa mahdollisuuden proteiiniryhmän liittämiseen ko. aromaattiseen kuusirenkaaseen käyttämällä elektrofiilistä aromaattista substituutioreaktiota. Proteiiniryhmällä tarkoitetaan yleisesti proteiinia, glykoproteiinia, esim. entsyymiä, albumiinia, ihmis- tai eläinseerumialbumiinia, immunoglo-buliinia tai vastaavaa. Koska proteiinikemian reaktiot tapahtuvat vesiliuoksessa, tulee tässä tarkoituksenmukaiseksi käyttää diatsokytkentää sellaisella diatsoniumsuolalla, johon proteiini lopullisen immunogeenin muodostuksessa voidaan kovalenttisesti liittää joko diatsokytkentää edeltävänä tai sen jälkeen suoritettavana reaktiovaiheena.Bis-indole alkaloids consist of vindoline and catharanthine units, of which the indole part of the catharanthine unit allows the attachment of a protein group. to an aromatic spruce ring using an electrophilic aromatic substitution reaction. By protein group is generally meant a protein, a glycoprotein, e.g. an enzyme, albumin, human or animal serum albumin, immunoglobulin or the like. Because protein chemistry reactions occur in aqueous solution, it is appropriate herein to use diazoconversion with a diazonium salt to which the protein can be covalently attached in the formation of the final immunogen as either a pre- or post-diazoconversion reaction step.

Tarkastelun kohteena olevissa vindoliini- ja katarantiini-yksiköissä on kummassakin aromaattinen kuusirengas diatsokytkentää varten. Vindoliiniosassa renkaan aktiivisin kohta ei ole vapaana tätä varten, koska katarantiiniyksikkö on kiinnittynyt juuri siihen kovalenttisella sidoksella. Lisäksi vindoliinissa ko. renkaan toiseksi reaktiivisin hiiliatomi on diatsokytkentää ajatellen steerisesti ahtaalla alueella. Katarantiiniyksikön aromaattisessa kuusirenkaassa on periaatteessa 4 hiiliatomia käytettävissä diatsokytkentää varten. Suorittamalla kytkentää aromaattisten amiinien diatsokytkennän periaatteella, ts. siten, että indolinen typpiatomi saa aktivoida aromaattisen renkaan, voidaan perustellusti odottaa kytkeytymisen tapahtuvan ko. typpiatomiin nähden p-asemaan, joka on renkaan reaktiivisin kohta kytkentää ajatellen, ja kysymyksessä on lisäksi vielä eräs renkaan steerisesti parhaiten käytettävissä olevista asemista. Täten on mahdollista saavuttaa melko yhtenäinen reaktiotuote: 5 80703The vindoline and catharanthine units under consideration each have an aromatic spruce ring for diazo coupling. In the vindoline moiety, the most active site of the ring is not free for this purpose because the catharanthine moiety is attached to it precisely by a covalent bond. In addition, in vindoline, the second most reactive carbon atom of the ring is in a sterically narrow region for diazo coupling. The aromatic spruce ring of the catharanthine unit has in principle 4 carbon atoms available for diazo coupling. By performing the coupling on the principle of diazo coupling of aromatic amines, i.e. in such a way that the indole nitrogen atom is allowed to activate the aromatic ring, it can be reasonably expected that the coupling will take place. to the p-position relative to the nitrogen atom, which is the most reactive point on the ring for coupling, and is also one of the sterically best available positions on the ring. Thus, it is possible to obtain a fairly uniform reaction product: 5 80703

R RR R

ΐ I Iΐ I I

NH NH NHNH NH NH

(^)) + ArNp —> (j^) —> [Qj + H © H N=N-Ar N=N-Ar(^)) + ArNp -> (j ^) -> [Qj + H © H N = N-Ar N = N-Ar

Vaikeutena reaktiossa on diatsoniuin-ionin pyrkimys reagoida vesimolekyylien kanssa. Jos diatsokytkeytyminen on epäedullisten reaktio-olosuhteiden vuoksi hidasta tulee viimeksimainitusta sivureaktiosta, fenolimuodostuksesta, pääreaktio. Tällöin myös ko. fenolinen yhdiste voi diatsokytkeytyä, jolloin halutun diatsoyhdisteen lisäksi syntyy kyseisen sivureaktion tuottamaa kontaminaatioyhdistettä.A difficulty in the reaction is the tendency of the diazonine ion to react with water molecules. If diazo coupling is slow due to unfavorable reaction conditions, the latter side reaction, phenol formation, becomes the main reaction. In this case, the the phenolic compound may be diazo-coupled to form, in addition to the desired diazo compound, the contamination compound produced by that side reaction.

Sivureaktiot voidaan tehokkaimmin välttää säätämällä reaktio-liuoksen happamuusaste (pH) mahdollisimman tarkoin kyseisen synteesireaktion optimiarvoa vastaavaksi.Side reactions can be most effectively avoided by adjusting the acidity (pH) of the reaction solution as closely as possible to the optimum value of the synthetic reaction in question.

Reaktio-olosuhteet, joissa edellä esitetty alkaloidirakenne diatsokytkeytyy mahdollisimman nopeasti ja samalla sivureaktioiden osuus pysyy mahdollisimman pienenä, edellyttävät reaktioliuoksen happamuuden säätöä. Liuos ei myöskään saa olla niin emäksinen, että diatsonium-ionin pitoisuus laskee liikaa, mutta liuos ei myöskään saa olla niin hapan, että protonoitumattoman amiinin (katarantiiniyksikön indolinen osa) pitoisuus jää liian pieneksi. Esillä olevassa diatsokytkentä-reaktiossa on reaktioliuoksen pH-arvo säädettävä alueelle pH 6,60 - pH 6,90 riittävän yhtenäisen ja spesifisesti bis-indolialkaloideja erikseen mittaavan ELlSA-määritys-menetelmän tarpeisiin sopivan immunogeenin muodostamiseksi.The reaction conditions in which the alkaloid structure described above is diazo-coupled as quickly as possible while keeping the proportion of side reactions as small as possible require adjustment of the acidity of the reaction solution. The solution must also not be so basic as to reduce the concentration of diazonium ion too much, but the solution must also not be so acidic that the content of the non-protonated amine (indole part of the catharanthine unit) remains too low. In the present diazo coupling reaction, the pH of the reaction solution must be adjusted to a range of pH 6.60 to pH 6.90 to form a sufficiently uniform immunogen suitable for the ELISA assay method that specifically measures bis-indole alkaloids.

Vasta-aineen valmistus tapahtuu tunnetulla tavalla esim.: 6 80703 L. Hudson & F.C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford 1976, ja R.H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn (toim.), Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines, Plenum, New York 1984.The antibody is prepared in a known manner, e.g., 6 80703 L. Hudson & F.C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford 1976, and R.H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn (ed.), Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines, Plenum, New York 1984.

Vasta-ainetta voidaan tuottaa koe-eläimen immunojärjestelmän avulla immunisoimalla eläin ylläesitettyä konjugaattia immu-nogeeninä käyttäen ja keräämällä vasta-aine verenkierrosta. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa ns. monoklonaalisiä vasta-aineita joko in vivo- tai in vitro-periaatteella eristämällä koe-eläimen elimistöstä vasta-ainetta tuottavia soluja joko jälkeen tai ennen immunisointikäsittelyä sekä kehittämällä edelleen tuotantosolukkoja. Vasta-aine voidaan tarvittaessa puhdistaa tavanomaisia tarkoitukseen soveltuvia menetelmiä käyttäen.The antibody can be produced by the immune system of the test animal by immunizing the animal using the above conjugate as an immunogen and collecting the antibody from the circulation. Alternatively, a so-called monoclonal antibodies, either in vivo or in vitro, by isolating antibody-producing cells from the body of the experimental animal either after or before the immunization treatment and by further developing production cells. If necessary, the antibody can be purified using conventional methods suitable for the purpose.

Analyysi perustuu edellä esitetyn vasta-aineen ja analysoitavan bis-indolialkaloidin väliseen sitoutumisreaktioon. Sitoutuvan analysaatin määrä todetaan kilpailevan sitoutuvan merkkiaineen avulla. Merkkiaineena voi toimia radioaktiivisella isotoopilla merkattu vastaava kaupallinen yhdiste tai mitattavissa olevaan entsyymin konjugoitu vastaava yhdiste. Radioaktiivisuus ja entsyymiaktiivisuus ovat mitattavissa tavanomaisin, ko. tarkoituksiin markkoitavin laittein. Periaatetta on kuvattu julkaisussa Voller et ai. Bull. Wild. Hlth. Org. (1979) 53, 55 - 56.The analysis is based on the binding reaction between the above antibody and the bis-indole alkaloid to be analyzed. The amount of analyte to be bound is determined to compete with the binding tracer. The label may be a radiolabeled corresponding commercial compound or a corresponding compound conjugated to a measurable enzyme. Radioactivity and enzyme activity are measurable by conventional means, e.g. equipment to be marked for these purposes. The principle is described in Voller et al. Bull. Wild. Hlth. Org. (1979) 53, 55-56.

Menetelmän toimivuus on käytännössä testattu kaikilta osin vinkristiinin suhteen sekä radioisotooppia että entsyymiä merkkiaineena käyttäen. Radioimmunometrinen menetelmä (RIA) toimii tritioitua merkkiainetta käyttäen pitoisuusalueella 0,1 - 50 ng, on erittäin spesifinen kohdeaineella ja täyttää vastaavien menetelmien toistettavuudelle yleisesti hyväksytyt kriteerit. Menetelmä on todettu käyttökelpoiseksi plasman 7 80703 vinkristiinipitoisuuden määrityksissä. Entsyymi-immunoana-lyyttinen menetelmä (EIA) vastaa muilta ominaisuuksiltaan edellistä, mutta on sitä herkempi (mittausalue n. 10 - 500 pg) ja soveltuu plasman lisäksi myös kokoveren ja veren solu-materiaalin vinkristi inimäärityksi in.The functionality of the method has been tested in virtually all respects for vincristine using both a radioisotope and an enzyme as a marker. The radioimmunometric method (RIA) works with a tritiated tracer in a concentration range of 0.1 to 50 ng, is highly specific for the target substance and meets generally accepted criteria for the reproducibility of similar methods. The method has been found to be useful in the determination of plasma 7 80703 vincristine levels. The enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) has similar properties to the previous one, but is more sensitive (measuring range approx. 10 to 500 pg) and is suitable not only for plasma but also for whole blood and blood cell material assay in humans.

RIA-analyysisarjan toteuttaminen kesää n. 2 vrk, jonka kuluessa yksi henkilö voi suorittaa n. 200 analyysiä. Vastaavasti EIA-sarjan kesto on n. 8 tuntia sisältäen n. 500 näytettä. Molempien määritysten nopeutta ja kapasiteettiä voidaan parantaa merkittävästi, jos niistä kehitetään ns. analyysikitti, jossa lopulliset laboratoriotyövaiheet on minimoitu ja olosuhteet tarkkaan optimoitu.Implementation of the RIA analysis series takes about 2 days in the summer, during which one person can perform about 200 analyzes. Correspondingly, the duration of the EIA series is about 8 hours, including about 500 samples. The speed and capacity of both assays can be significantly improved if they are developed into so-called an analysis kit in which the final laboratory work steps are minimized and conditions are carefully optimized.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä sitä rajoittamatta.The following examples illustrate the invention without limiting it.

Esimerkki 1Example 1

Bis-indolialkaloidin albumiinikonjugaatin valmistus 50 mg DL-p-aminofenyylialaniinia liuotetaan 5 ml vettä. Tähän liuokseen lisätään 50 mg naudan seerumin albumiinia ja 50 mg l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidiä (EDO) ja seosta inkuboidaan yön yli huoneenlämmössä.Preparation of bis-indole alkaloid albumin conjugate 50 mg of DL-β-aminophenylalanine are dissolved in 5 ml of water. To this solution are added 50 mg of bovine serum albumin and 50 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDO) and the mixture is incubated overnight at room temperature.

Reaktiotuote erotetaan reagensseista dialysoimalla (ultrasuo-datus) +4°C:ssa vettä vastaan. Liuoksen pH säädetään l,5:ksi suolahapolla jäähauteessa. 100 mg NaN02:a liuotetaan 1 ml vettä ja lisätään tipoittain suolahappoliuokseen, johon edelleen lisätään 50 mg ammoniumamidosulfonaattia liuotettuna 1 mlsaan vettä. 15 mg bis-indolialkaloidia (vinkristiiniä) liuotetaan minimivolyymiin (1-2 ml) boraattipuskuria, pH 6 (0,1 M Na-boraattiliuos, jonka pH säädetty 1 M HCltlla). Näin saatuun liuokseen lisätään 1,8 ml edellä valmistettua 8 80703 hapanta liuosta ja seoksen annetaan olla huoneenlämmössä ravistelijassa yön yli. Lopputuote erotetaan reagensseista dialysoimalla vettä vastaan (geelisuodatus Spehadex 6 - 25 M). Dialysaatti kylmäkuivataan immunisaatioissa käytettäväksi.The reaction product is separated from the reagents by dialysis (ultrafiltration) at + 4 ° C against water. The pH of the solution is adjusted to 1.5 with hydrochloric acid in an ice bath. 100 mg of NaNO2 are dissolved in 1 ml of water and added dropwise to a hydrochloric acid solution, to which is further added 50 mg of ammonium amidosulfonate dissolved in 1 ml of water. 15 mg of bis-indole alkaloid (vincristine) are dissolved in a minimum volume (1-2 ml) of borate buffer, pH 6 (0.1 M Na-borate solution, pH adjusted with 1 M HCl). To the solution thus obtained is added 1.8 ml of the 880703 acidic solution prepared above, and the mixture is allowed to stand at room temperature on a shaker overnight. The final product is separated from the reagents by dialysis against water (gel filtration Spehadex 6-25 M). The dialysate is lyophilized for use in immunizations.

Lopullisen konjugaatin muodostuminen voidaan todeta analysoimalla tuoteliuosta spektrofotometrisesti bis-indolialka-loidien kromofooreihin sopivalla aallonpituudella. Tyypillinen saanto on n. 70 %.The formation of the final conjugate can be detected by spectrophotometric analysis of the product solution at the appropriate wavelength for the chromophores of the bis-indole alkaloids. The typical yield is about 70%.

Esimerkissä bis-indolialkaloidina on käytetty vinkristiiniä mutta menetelmä voidaan toteuttaa muillakin selityksessä mainituilla alkaloideilla, kuten vinbalstiinilla, vindesii-nilla tai vintsolidiinilla.In the example, vincristine has been used as the bis-indole alkaloid, but the process can also be carried out with other alkaloids mentioned in the specification, such as vinbalstin, vindesine or vincolidine.

Esimerkki 2Example 2

Vinkristiinin konjugointi alkaaliseen fosfataasiin 1 mg P-aminobentsoaattia liuotetaan 0,5 ml:aan 0,2 M HC1, johon lisätään tipottain 1 mg natriumnitriittiä liuotettuna 0,5 ml:aan vettä. Saatua seosta pidetään jäähauteessa 45 min ajoittain hiljaa sekoittaen. Tähän seokseen lisätään tipottain 1 mg sulfamiinihappoa liuotettuna 0,5 ml:aan vettä ja 3 mg vinkristiiniä liuotetaan minimivolyymiin N-N-dimetyyli-formamidin ja boraattipuskurin seosta (1 : 1) (boraatti-puskuri: 0,1 M Na-boraatin pH säädetään välille 6,5 - 7,5 0,1 M boorihappoliuoksella)Conjugation of vincristine to alkaline phosphatase 1 mg of β-aminobenzoate is dissolved in 0.5 ml of 0.2 M HCl, to which 1 mg of sodium nitrite dissolved in 0.5 ml of water is added dropwise. The resulting mixture is kept in an ice bath for 45 minutes, stirring gently from time to time. To this mixture is added dropwise 1 mg of sulfamic acid dissolved in 0.5 ml of water and 3 mg of vincristine is dissolved in a minimum volume of a 1: 1 mixture of N, N-dimethylformamide and borate buffer (borate buffer: 0.1 M Na-borate The pH is adjusted to 6 .5 to 7.5 with 0.1 M boric acid solution)

Edellä valmistettu happoliuos lisätään tipottain vinkristiini-liuokseen. Lisäyksen aikana seurataan pH:ta, joka pidetään n. 7:ssä 0,1 M Na-boraatin avulla (muodostuu keltainen väri). Reaktion annetaan edetä 3 - 4 t +4°C:ssa pimeässä, jonka jälkeen liuokseen lisätään 3 mg alkaalista fosfataasia 9 80703 (liuoksen pH n. 6). Minimitilavuuteen vettä liuotettu l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidi (4 mg) lisätään entyymiseokseen ja annetaan reaktio edetä yön yli +4°C:ssa. Lopputuote erotetaan reagensseista ultrasuodatuk-sella +4°C:ssa sopivaa puskuria vastaan (esim. fosfaatti-puskuroitu fysiologinen suolaliuos).The acid solution prepared above is added dropwise to the vincristine solution. During the addition, the pH is monitored, which is maintained at about 7 by means of 0.1 M Na borate (a yellow color forms). The reaction is allowed to proceed for 3-4 hours at + 4 ° C in the dark, after which 3 mg of alkaline phosphatase 9 80703 (pH of the solution of about 6) are added to the solution. 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (4 mg) dissolved in a minimum volume of water is added to the enzyme mixture and the reaction is allowed to proceed overnight at + 4 ° C. The final product is separated from the reagents by ultrafiltration at + 4 ° C against a suitable buffer (e.g. phosphate-buffered saline).

Diatsokytkennän kohdistuminen yhteen ainoaan kohtaan voidaan todeta ajamalla HPLC-analyysi vinkristiinin diatsokytkennän tuotteesta. Tyypillinen saanto tästä vaiheesta on n. 90 %. Ylläesitetyllä menetelmällä voidaan valmistaa myös immuno-geenejä ainakin vinkristiinistä, vinblastiinista ja vinde-siinistä käyttäen esim. albumiinia alkaalisen fosfataasin tilalla.The targeting of the diazo coupling to a single site can be determined by running an HPLC analysis of the diazo coupling product of vincristine. The typical yield from this step is about 90%. By the above method, immunogens can also be prepared from at least vincristine, vinblastine and vindesine using, for example, albumin instead of alkaline phosphatase.

Esimerkki 3Example 3

Vasta-aineen valmistusAntibody preparation

Lyofilisoituja immunogeeneja emulgoitiin Freundsin adjuvant-tiin ja annettiin ruiskeena neljälle uusi-seelantilaiselle albinokanille. VCR-albumiininsuhde immugeeneissa oli: immugeeni 1 = 245:1; immugeeni 2 = 22:1 ja immugeeni 3 = 7,5:1. Kanille 1, 2 ja 3 annettiin immugeenia 1, 2 ja 3 sekä kanille 4 immugeenia 2. Taulukossa 1 on annettu immunisointiaikataulu ja määrät. Viikko viimeisen injektion jälkeen otettiin verinäytteet ja vasta-aineiden tuotanto todettiin mittaamalla [^H]VCR-sitoutuminen seeruminäytteissä kuten on kuvattu teoksessa Lehtola, T.; Huhtikangas, A. ja Virtainen, R.,Lyophilized immunogens were emulsified in Freunds adjuvant and injected into four New Zealand albino rabbits. The VCR-albumin ratio in the immunogens was: immunogen 1 = 245: 1; immunogen 2 = 22: 1 and immunogen 3 = 7.5: 1. Rabbits 1, 2 and 3 were given immunogen 1, 2 and 3 and rabbit 4 immunogen 2. Table 1 shows the immunization schedule and amounts. One week after the last injection, blood samples were taken and antibody production was detected by measuring [3 H] VCR binding in serum samples as described in Lehtola, T .; Huhtikangas, A. and Virtainen, R.,

Application of radioimmunoassay to the quantitation of hyos-cyamine in plant material. Planta Medica, 1982;45: 237 - 239. Inununogolbuliini G (IgG) puhdistettiin antiseerasta DEAE-sel-luloosan avulla. Hudson, L and Hay, F.C., Practical Immunology, London: Blackwell Scientific Publications, 1976.Application of radioimmunoassay to the quantitation of hyos-cyamine in plant material. Planta Medica, 1982; 45: 237-239. Inununogolbulin G (IgG) was purified from antiserum using DEAE-cellulose. Hudson, L and Hay, F.C., Practical Immunology, London: Blackwell Scientific Publications, 1976.

10 8070310 80703

Taulukko ITable I

Kanien immunisointi vasta-ainetuotantoa vartenImmunization of rabbits for antibody production

Injektion ___Antiqeenimäärä_ ajankohta (viikkoja)_Kani 1_Kani 2_Kani 3_Kani 4 0 0,75 1,00 0,40 0,60 4 0,75 - 5 - 0,80 0,50 0,45 9 0,75 - - - 12 - 0,25 0,25 0,30 13 0,15 - 18 0,30 - 19 - 0,30 0,30 0,20 22 0,15 0,20 0,20 0,10 27 - 0,10 31 - 0,20 - 0,27 32 - 0,50 -Time of injection ___ Amount of antigens_ (weeks) _Rabbit 1_Rabbit 2_Rabbit 3_Rabbit 4 0 0.75 1.00 0.40 0.60 4 0.75 - 5 - 0.80 0.50 0.45 9 0.75 - - - 12 - 0 .25 0.25 0.30 13 0.15 - 18 0.30 - 19 - 0.30 0.30 0.20 22 0.15 0.20 0.20 0.10 27 - 0.10 31 - 0 .20 - 0.27 32 - 0.50 -

Kuvassa 1 on kuvattu VCR-antiseerumin muodostus immunisoinnin aikana. Kuvan 1 tulosten ja taulukon 1 arvojen vertailu osoittaa, että suuremmat immonogeeniannokset kohottavat vasta-aine-tiitteriä. Kuvassa 1 on esitetty vasta-ainetiitteri kaneissa 1-4 taulukon I mukaisen immunisoinnin aikana. Ilmoitettu see-rumilaimennus vastaa [^H]VCR-merkkiaineen 50 % sitoutumista.Figure 1 depicts the generation of VCR antiserum during immunization. A comparison of the results in Figure 1 and the values in Table 1 shows that higher doses of immunogen increase the antibody titer. Figure 1 shows the antibody titer in rabbits 1-4 during immunization according to Table I. The reported serum dilution corresponds to 50% binding of the [3 H] VCR marker.

Claims

11 80703

R 3 is wherein OH / CH 2 CH 3 CH 2 CH 3 D is -C - CH 2 - or - C = CH-, R 1 is -CH 3 or -CHO, R 2 is -OCOCH 3 or -OH, R 3 is -OH, R 4 is -OCH 3, - NH 2 or • R 3 and R 4 together form a chain -OCN-CH 2 CH 2 Cl O is 80703 Ar 1 represents an acid group of the formula NH 2 -CO- (CH 2) n where n = 0 to 5, which alkylene chain may be substituted, use in the preparation of claim 1 protein conjugate of bisindole alkaloids according to

A bisindole alkaloid derivative of the formula (I) is an Ar-N => N-bisindole alkaloid (I) wherein the general formula (II) of the indole alkaloids is: <* & oa -

Protein conjugate of bis-indole alkaloids, characterized in that the conjugate of formula (I) is an Ar-N = N-bisindole alkaloid (I) wherein the general formula (II) of the indole alkaloids is

3 R 1 R * COR 4 wherein OH CH 2 CH 3 / CH 2 CH 3 D is CH 2 - or - C - CH-, R 1 is -CH 3 or -CHO, R 2 is -OCOCH 3 or -OH, R 3 is -OH, R 4 is -OCH 3, -NH 2 or R 3 and R 4 together form a chain -O-CN-CH 2 CH 2 Cl i Ar represents a group of the formula / OV T-NH-CO- (CH 2) n - / 12 80703 wherein n is 0 to 5 / which alkylene chain may be substituted and T means a group of proteins such as a glycoprotein, an immunoglucoprotein or an enzyme.

Protein conjugate of bis-indole alkaloids according to Claim 1, characterized in that the acid group containing the protein group is in the 5-position of the indole ring of the second alkaloid group.

3. A process for the preparation of a protein conjugate of bisindole alkaloids of the formula I «characterized in» that the bisindole is reacted with a diazonium acid derivative of the formula Ar-NsN <+>, wherein Ar is as defined above »but» so that Ar may not contain a protein group »in which case the protein group is attached to an aromatic acid group.

Process according to Claim 3, characterized in that the bisindole is reacted with a diazoic acid of the formula IV -NSN + -AR in which Ar has the same meaning as above but without a protein group, after which the protein group is attached to the acid obtained by an electro substitution reaction or an aromatic amino acid , NH 2 -Ar-COOH wherein Ar is as defined above is diazotized and reacted with bisindole. '3 80703

Process according to Claim 3 or 4, characterized in that the process is carried out under acidic conditions, preferably under weakly acidic conditions, most preferably in the pH range from 6 to 6.9.

Bisindole alkaloid derivative, characterized in that its formula (V) is Ar 1 - N = N - bisindole alkaloid (V) wherein the general formula (II) of indole alkaloids is

In which OH is CH 2 CH 3 CH 2 CH 3 D is -C - CH 2 - or -C = CH-, R 1 is -CH 3 or -CHO, R 2 is -OCOCH 3 or -OH, R 3 is -OH, R 4 is -OCH 3 , -NH 2 or (R 3 and R 4 together form a chain -O-CN-CH 2 CH 2 Cl O 14 80703 A 1r represents an acid group of the formula NH 2 -CO- (CH 2) n where n = 0 to 5, which alkylene chain may be substituted.

A bisindole alkaloid derivative of formula (V) is Ari - N »N - bisindole alkaloid (V) wherein the general formula (II) of indole alkaloids is J-N- \

3 R. COR *

3 R 1 is CO 4 wherein OH is CH 2 CH 3 / CH 2 CH 3 D is -X- CH 2 - or -C 1 CH-, R 1 is -CH 3 or -CHO, R 2 is -OCOCH 3 or -OH, "80703 R 3 is -OH, R 4 is - OCH3, -NH2 or j R3 and R4 together form a chain -OCN-CH2CH2ClO Ar represents an acid group of the formula T-NH-CO- (CH2) n wherein n * 0 to 5, which alkylene chain may be substituted, and T represents use of a protein moiety, such as a glycoprotein, an immunoglucoprotein or an enzyme, in the manufacture of an antibody for use in an immunometric assay method «80703