JPS63500308A

JPS63500308A - Protein conjugates of bis-indole alkaloids, bis-indole alkaloids, their preparation and applications

Info

Publication number: JPS63500308A
Application number: JP50385486A
Authority: JP
Inventors: ハフティカンガス、アーレ; ラピニョキ、セポ; ニエミ、ヤルモ
Original assignee: ハフタマキ・オイ
Priority date: 1985-07-16
Filing date: 1986-07-04
Publication date: 1988-02-04
Also published as: FI80703C; FI80703B; FI852785L; FI852785A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】ビスインドールアルカロイドの蛋白質コンジュゲート、ビスインドールアルカロイド、それらの製法および適用この発明は、ビスインドールアルカロイドの蛋白質コンジュゲート並びにそれらの製法お上び適用に関する。この発明はまた上記蛋白質コンジュゲートの製造時に特に有用なビスインドールアルカロイドに関する。[Detailed description of the invention] Protein conjugates of bisindole alkaloids, bisindole alkaloids The present invention relates to the production of bisindole alkaloids, their preparation and applications. This invention relates to quality conjugates and their preparation and application. This invention also applies to the above Concerning bisindole alkaloids that are particularly useful in the production of protein conjugates. Ru.

いわゆる免疫毒素は、必ずしも抗体とは限らないが一般的には抗体である特異的担体蛋白質が毒素成分、例えば植物性または微生物に基づく蛋白質毒素、抗腫傷薬または放射性薬剤と組合わされたものであるコンジュゲートである［ホフスタエツター、グロンスキおよびザイラー、「イムノトキシンズーセオレテイカル・アンド・プラクティカル・アスペクツ」、ベージング・インスト・ミツト（Ｉ　ｎｓｔ、　Ｍｉｔｔ、）第７４巻（１９８４）１１３−１２１］。So-called immunotoxins are specific molecules that are generally, but not necessarily, antibodies. The carrier protein contains toxin components, e.g. plant- or microbial-based protein toxins, antitumor Conjugates that are combined with drugs or radiopharmaceuticals [Hofstad Etzter, Gronski and Seiler, “Immunotoxin Theoretical Research” and Practical Aspects”, Basing Instruments (I) Nst, Mitt, Vol. 74 (1984) 113-121].

上記文献に示されるように、一般的な免疫毒素原理は既に知られているが、担体、毒素セグメントおよびこれら２つを互いに結びつける方法に関してこの基本的着想に発明上の改善が提案されている。As shown in the above literature, the general immunotoxin principle is already known, but the carrier , this basic principle regarding toxin segments and how to link these two together. Inventive improvements are proposed to the idea.

様々な免疫毒素は、特に癌疾患の処置に有用であるが、また可能ならば他の細胞を傷つけずにある種の細胞の集団を破壊することを必要とする他の処置においても有用である。すなわち、担体セグメントは、標的細胞の特性を有する動物細胞すなわち破壊されるべき細胞集団の細胞の表面構造にそれ自身特異的に結合することのできる蛋白質でなければならない。このような蛋白質は特に前記タイプの表面構造に対して産生された抗体分子である。前記抗体は、原則として動物を精製抗原で免疫化することによる公知方法で製造され得、前記のタイプの表面構造はその場合の抗原として作用する。Various immunotoxins are particularly useful in the treatment of cancer diseases, but may also be useful in treating other cell types. In other procedures that require destroying certain populations of cells without damaging the is also useful. That is, the carrier segment is an animal cell that has the properties of the target cell. i.e. binds itself specifically to the cell surface structures of the cell population to be destroyed. It must be a protein that can be used. Such proteins are particularly of the type mentioned above. Antibody molecules raised against surface structures. In principle, the above-mentioned antibodies are A surface structure of the type mentioned above can be prepared in a known manner by immunization with a synthetic antigen. acts as the antigen in that case.

しかしながら、最も好ましくは前記タイプの抗体は常用の２１イブリドーマ技術を適用することにより製造され得る。この技術は例えば「モノクローナル・ハイブリドーマ・アンテイボディーズ；テクエックス・アンド・アプリケーションズ」（ムレル編集、シー・アール・シー・プレス社発行、ポカ・シートン、フロリダ、１９８２年）に記載されているが、この技術により標的細胞の非精製表面構造に対しても抗体産生が可能となる（例、同書第１５１〜１６Ｂ頁）。また、抗体分子全体の代わりに、例えば蛋白質の加水分解により製造できるフラグメントＦａｂおよび（Ｆａｂ）ｔのように抗原に結合する分子セグメントを有するフラグメントを用いることができることも知られている。抗体の代わりに、担体はまた標的細胞にそれ自体を選択的に結合する特性を有する他の蛋白質でもあり得る。特許出願ＧＢ２１１’６９７９では、抗腫瘍剤とトランスフェリンまたはセルロブラスミンのコンジュゲートが記載されているが、このコンジュゲートは、トランスフェリン受容体が癌細胞に豊富にあるため癌疾患の処置に有用である。Most preferably, however, antibodies of said type are used in conventional 21 ibridoma technology. can be manufactured by applying This technology can be used, for example, as a monoclonal Brideoma Antibodies; Techex and Applications ” (edited by Murrell, published by CRC Press, Poka Seton, Flori (Da, 1982), this technique allows for the generation of unpurified surface structures on target cells. It is also possible to produce antibodies against biological structures (eg, pages 151-16B of the same book). Also, anti Fragments that can be produced, for example, by hydrolysis of proteins, instead of whole body molecules Fragments with antigen-binding molecular segments such as Fab and (Fab)t It is also known that components can be used. Instead of antibodies, carriers It can also be any other protein that has the property of binding itself selectively to target cells. . In patent application GB211'6979, an anti-tumor agent and transferrin or cell A conjugate of lobrasmin has been described, but this conjugate Transferrin receptors are abundant in cancer cells, making them useful in treating cancer diseases.

標的細胞は癌細胞であり得るが、「抗宿主移植片疾患の予防を目的とする抗Ｔ細胞免疫毒素によるドナー骨髄の生体外処置」という論文（フィリボピッチ等、ザ・ランセット、１９８４年３月３日、第４６９〜４７１頁）で指摘されているように、病気（または特別の例として避妊）の処置を行なう上で問題になっている細胞集団の選択的破壊が必要な場合なら常に、正常細胞系に対する免疫毒素は有用なものである。Target cells can be cancer cells, but "anti-T cells for the prevention of anti-host graft disease" In vitro treatment of donor bone marrow with cell immunotoxins” (Filibopich et al., ・The Lancet, March 3, 1984, pp. 469-471) sea urchins, which are problematic in the treatment of disease (or, in particular, contraception) Immunotoxins directed against normal cell lines are used whenever selective destruction of a cell population is required. It is useful.

特許出願ＧＢ２１３７２１０は、ビンカアルカロイドの免疫グロブリンコンジュゲートを開示しているが、この場合ビンカまたはビスインドールアルカロイドは、ビンドリン単位のポイント（以後Ｒ。Patent application GB2137210 describes immunoglobulin conjugates of vinca alkaloids. gate, but in this case the vinca or bisindole alkaloid is , points in vindoline units (hereinafter referred to as R).

とする）におけるエステル結合により蛋白質、この場合は免疫グロブリンと結合している。ここが、正に様々な特性を有するビスインドールアルカロイド間の相違をもたらす領域であり、この領域は分子の医薬活性における大きな重要性を有するものと予測され得る。conjugated to a protein, in this case an immunoglobulin, through an ester bond in are doing. This is precisely the phase difference between bisindole alkaloids with various properties. This region is of great importance in the pharmaceutical activity of molecules. It can be predicted that

すなわち、特許出願ＧＢ２１３７２１０に記載されたコンジュゲーション方法の場合、大きなサイズの蛋白質セグメントがアルカロイドの医薬活性を立体的に妨げるため望ましくないものと考えなければならない。That is, the conjugation method described in patent application GB2137210 In some cases, large protein segments sterically hinder the pharmaceutical activity of alkaloids. must be considered undesirable in order to increase

この発明は、アルカロイド分子の活性に最大の効果を与えるフラグメントを遊離させた状態でビスインドールアルカロイドを蛋白質にコンジュゲートする方法に関するものである。This invention releases fragments that have the greatest effect on the activity of alkaloid molecules. A method for conjugating bisindole alkaloids to proteins in a state where It is related to

ビスインドールアルカロイド類には、植物起源の天然分子もあり、そこから合成されたものもあるが、これらは癌細胞の医療的破壊に適したいわゆる細胞増殖抑制剤であることが判った。Bisindole alkaloids include natural molecules of plant origin that can be synthesized from them. These are so-called cell proliferation inhibitors suitable for the medical destruction of cancer cells. It turned out to be a drug.

そのようなビスインドールアルカロイド類またはそれらの合成誘導体は、下記一般式により説明され得る。Such bisindole alkaloids or their synthetic derivatives are as follows: It can be explained by the general formula.

カタランチン単位２ビンクリスチン　−”−−Ｃ）１０　−０ＣＯＣＨ３−ＯＨ−０ＣＨ３３ビンデシン　−”−−ＣＨ３−ＯＨ−０Ｈ−ＮＨ。catharanthine unit 2 bottles Cristine -”--C) 10 -0 COCH3-OH-0CH33 bottles Decyne-”--CH3-OH-0H-NH.

この発明の化合物は、コンジュゲートの式（１）が、Ａｒ−Ｎ＝Ｎ−ビスインドールアルカロイド　（１）（式中、Ａｒは蛋白質基を含む安息香酸またはアリールアルキルカルボン酸基である）であることを特徴とする。The compound of this invention is characterized in that the formula (1) of the conjugate is Ar-N=N-bisindo alkaloid (1) (wherein, Ar is benzoic acid or aryl alkaloid containing a protein group) (alkylcarboxylic acid group) It is characterized by

好ましくは式（１）において、インドールアルカロイドの一般式（ｎ）は、（式中、Ａは低級Ｃ８Ｃｓアルキレン基を表わし、Ｂはヒドロキシ基および／または低級アルキル基により置換され得る低級Ｃ，−Ｃ５アルキレンまたはアルキレニル基を表わす）であり、そしてＡｒは式（式中、。は０〜５であり、アルキレン鎖は置換され得、Ｔは蛋白質基、例えば糖蛋白質、免疫糖蛋白質または酵素を表わす）を有する基を表わす。Preferably, in formula (1), the general formula (n) of the indole alkaloid is: (In the formula, A represents a lower C8Cs alkylene group, B represents a hydroxy group and/or or lower C,-C5 alkylene or alkylene which may be substituted with a lower alkyl group ), and Ar is of the formula (wherein . is 0-5, the alkylene chain may be substituted, and T is a protein group, e.g. glycoprotein, immunoglycoprotein or enzyme).

明らかに、現在臨床使用において上記タイプの化合物、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビンデシンに対する工業的に利用可能で感度がよく特異的な配列分析方法は存在しない。これらの化合物に関して既に公表された免疫分析方法（ラジオイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ等）と比較した場合の本質的な相違は、この新たに開発された方法に基づいて生産された抗体の特異性が高いことである。このことは、この明細書に記載された蛋白質コンジュゲートの製造方法の場合、ビスインドールアルカロイドの治療活性部分として現在理解されている一部分を遊離させているため、この部分が分析方法の基礎である相互作用プロセスにおいて活性を示すという事実に基づくものである。Apparently, compounds of the above type, vincristine, vinbu, are currently in clinical use. Industrially available, sensitive and specific sequences for rustin and vindesine No analytical method exists. Previously published immunoassay methods for these compounds ( Radioimmunoassay, immunoradiometric assay, enzyme linked The essential difference is that this newly developed The specificity of the antibodies produced based on the developed method is high. This thing is , in the case of the method for producing protein conjugates described in this specification, bisindo liberates what is currently understood to be the therapeutically active moiety of the alkaloids. Therefore, this part shows activity in the interaction process that is the basis of the analytical method. This is based on the fact that

高い特異性が得られるということは、例えば医薬中にあり得る代謝産物または製造時の副産物がアッセイを妨げないというような点で、分析において有用なことである。High specificity means that, for example, the metabolic products or products that may be present in the drug are Useful for analysis in that manufacturing by-products do not interfere with the assay It is.

ビスインドールアルカロイドはビンドリンおよびカタランチン単位からなり、カタランチン単位のインドール部分が親電子物質芳香族置換反応を用いることにより問題の芳香族６員環に蛋白質をコンジュゲートする可能性を提供する。蛋白質基は一般に蛋白質、糖蛋白質、例えば酵素、アルブミン、ヒトまたは動物血清アルブミンおよび特に免疫グロブリンなどと関係を有する。蛋白質化学反応は水溶液中で行なわれるため、この場合、ジアゾカップリングの前または後に行なわれる反応段階として最終免疫原の形成用蛋白質が共有結合され得るようなジアゾニウム塩による、ジアゾカップリングを用いるのが適当である。Bisindole alkaloids consist of vindoline and catharanthine units; The indole moiety of the taranthine unit is This provides the possibility of conjugating proteins to the six-membered aromatic ring of interest. protein The groups are generally proteins, glycoproteins, such as enzymes, albumin, human or animal serum proteins. It is related to rubumin and especially immunoglobulin. Protein chemical reactions are soluble in water Since it is carried out in liquid, in this case it can be carried out before or after the diazo coupling. As a step in the reaction, a diazonidine is added to which the protein for the formation of the final immunogen can be covalently attached. It is suitable to use diazo coupling with um salts.

これらのビンドリンおよびカタランチン単位は共にジアゾカップリングに関与し得る芳香族６員環を伴っている。ビンドリン部分において、環の最も活性を示す部分は、正にカタランチン単位が共有結合により結合するところなので遊離状態ではない。さらに、ビンドリンにおいて、前記環の２番目に高い反応を示す炭素原子はジアゾカップリングを考えた場合立体的クランプ領域に存在する。カタランチン単位の芳香族６員環にはジアゾカップリングに用いられ得る４個の炭素原子が原則として存在する。芳香族アミン類のジアゾカップリング原理に基づくカップリングを行なうことにより、すなわち、インドールの窒素原子により芳香族環を活性化させることにより、当然カップリングが前記窒素原子に関してパラ位のところで行なわれるものと予期され、この位置がカップリングを考えた場合環の最も反応性の高い部分であり、そしてさらにこれが立体的に環の最も用いられ得る位置の１っであることになる。すなわち、全く均一の反応生成物を得ることが可能である。Both these vindoline and catharanthine units participate in diazo coupling. The result is an aromatic 6-membered ring. The vindoline moiety shows the most activity of the ring. The part is in a free state because it is exactly where the catharanthine units are bound by covalent bonds. isn't it. Furthermore, in vindoline, the second most reactive carbon in the ring Atoms exist in the steric clamp region when considering diazo coupling. Katara The aromatic six-membered ring of the nitin unit contains four carbon atoms that can be used for diazo coupling. Children exist in principle. A carbon based on the diazo coupling principle of aromatic amines. By coupling, i.e., the nitrogen atom of indole By activating the ring, the coupling naturally occurs at the para position with respect to the nitrogen atom. This position is expected to occur at the ring when coupling is considered. is the most reactive part of the ring, and is also sterically the most used part of the ring. This will be one of the best positions you can get. That is, to obtain completely homogeneous reaction products. is possible.

反応における問題点は、ジアゾニウムイオンが水の分子と反応しやすい点である。好ましくない反応条件が原因でジアゾカップリングが緩慢なものとなる場合、前記副反応すなわちフェノール形成が主反応となる。すなわち、問題のフェノール化合物もまたジアゾカップリングされ得るため、所望のジアゾ化合物に加えて前記副反応により生成された不純化合物が生成される。The problem with the reaction is that diazonium ions easily react with water molecules. . If the diazo coupling is slow due to unfavorable reaction conditions, The side reaction, ie, phenol formation, becomes the main reaction. That is, the phenol in question In addition to the desired diazo compound, diazo compounds can also be diazo coupled. Impure compounds are produced by the side reactions.

たけ正確に一致するように調節することにより副反応を最も効果的に避けることができる。Most effectively avoid side reactions by adjusting for the most precise match. Can be done.

上記アルカロイド構造が可能な限り速くジアゾカップリングされると同時に副反応が可能な限り少なくてすむ反応条件として反応溶液の酸性度を調節する必要がある。また、溶液は、ジアゾニウムイオン濃度が大きく低下するほどアルカリ性であってはならないし、非プロトン化アミン（カタランチン単位のインドール部分）の濃度が低すぎるほど酸性であってもならない。このジアゾカップリング反応において、反応溶液のｐＨ値は、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬｒＳＡ）の必要条件を満たすようにビスインド−ルアルカロイドを特異的および別々に測定できる充分均一な免疫原を製造するために、ｐＨ６，６０− ｐＨ６，９０の範囲内に調節されなければならない。The above alkaloid structure undergoes diazo coupling as quickly as possible and at the same time a side reaction occurs. It is necessary to adjust the acidity of the reaction solution as a reaction condition that requires as little reaction as possible. be. Also, the more alkaline the solution is, the more the diazonium ion concentration decreases. should not be unprotonated amine (indole moiety of catharanthine unit) It should not be so acidic that the concentration of This diazo coupling anti- In the reaction, the pH value of the reaction solution is adjusted using an enzyme-linked immunosorbent assay. Specification of bisindole alkaloids to meet the requirements of ELrSA In order to produce sufficiently homogeneous immunogens that can be measured separately and at pH 6. The pH must be adjusted within the range of 6.90.

抗体の製造は、既知の方法、例えばハドソンおよびヘイ、「プラクティカル・イムノロジー」（ブラックウェル・サンエンティフィック・パブリケーションズ、オックスフォード、１９７６年）並びにケネット、ベクトールおよびマッヵーン（編集）、「モノクロナール・アンティボディーズ・アンド・プラクティカル・セルラインズ」（ブレナム、ニューヨーク、１９８４年）により行なわれる。Antibodies can be produced using known methods, such as Hudson and Hay, "Practical Instruments." "Munology" (Blackwell Santific Publications, (Oxford, 1976) and Kennett, Bechtol and McCurn. (Eds.), Monoclonal Antibodies and Practical Cell Lines'' (Brenham, New York, 1984).

抗体は、免疫原として上記コンジュゲートにより動物を免疫化する試験動物の免疫系を用い、血液循環から抗体を集めることにより製造することができる。別法として、免疫化処置の後または前に動物の系から抗体産生細胞を分離し増殖させることによりインビボまたはインビトロにおいて所謂モノクロナール抗体を製造することも可能である。必要ならば常用の適当な技術を用いて抗体を精製することができる。Antibodies can be used to test the immune system of test animals by immunizing them with the conjugate described above as an immunogen. It can be produced by collecting antibodies from the blood circulation using an epidemiological system. alternative method As a method, antibody-producing cells are isolated from the animal's system and expanded after or before the immunization procedure. So-called monoclonal antibodies can be produced in vivo or in vitro by It is also possible to do so. If necessary, purify the antibody using appropriate routine techniques. I can do it.

分析は、前記の抗体と分析すべきビスインドールアルカロイド間の結合反応に基づくものである。結合分析質の量は拮抗的結合トレーサーにより測定される。トレーサーは、放射性同位元素で標識された対応する市販の化合物または測定可能な酵素にコンジュゲートした対応する化合物であり得る。放射能および酵素活性の測定は、これらの目的に合った常用の市販されている装置により行なうことができる。この原理はポーラ−等発表、ビスレタン・ワイルド・ヘルス・オーガン（Ｂｕｌｌ、　Ｗｉｌｄ、　Ｈｌｔｈ、　Ｏｒｇ、Ｘｌ　９７９年）５３．５５〜５６に記載されている。The analysis is based on the binding reaction between the above antibody and the bisindole alkaloid to be analyzed. It is something that can be developed. The amount of bound analyte is measured with a competitively bound tracer. to The racer is a corresponding commercially available compound labeled with a radioactive isotope or measurable The corresponding compound may be conjugated to a suitable enzyme. Radioactivity and enzymatic activity Measurements can be carried out using commercially available equipment suitable for these purposes. can. This principle was published by Pauler et al., Bisletan Wild Health Organ. (Bull, Wild, Hlth, Org, Xl 979) 53.55 -56.

この方法の実行可能性は、トレーサーとして放射性同位元素および酵素の両方を用いることによりビンクリスチンについてすべての点で実際に試験された。０．１〜５０ナノグラムの濃度範囲内のトリチオン化トレーサーを用いた放射線免疫検定方法（ＲＩ　Ａ）は標的物質に高い特異性を示し、対応する方法の再現性に関して一般的に認められた基準を満たす。この方法は血漿のビンクリスチン濃度アッセイに適用できることが判明した。酵素免疫分析方法（Ｅ　Ｉ　Ａ）は、他の特徴において前記と一致するが、この方が感度が高く（測定範囲的ｌＯ〜５００ピコグラム）、血漿に加えて、全血および血液中細胞性材料のビンクリスチンアッセイにも適している。The feasibility of this method is due to the use of both radioisotopes and enzymes as tracers. Vincristine was actually tested in all respects by using 0. Radioimmunization with trithionated tracers in the concentration range of 1-50 nanograms The assay method (RIA) shows high specificity for the target substance, and the reproducibility of the corresponding method is meets generally accepted standards for This method is used to determine plasma vincristine concentration. It was found to be applicable to the assay. Enzyme immunoassay method (EIA) is This is the same as the above in terms of characteristics, but it has higher sensitivity (measurement range 1O~50 0 picograms), vincristine in whole blood and cellular material in blood, in addition to plasma. Also suitable for assays.

ＲＩＡ分析シーケンスは約２日間行なわれ、その間−人で約２゜Ｏの分析を行なうことができる。他方、ＥＩＡシーケンスは約８時間続けられ、約５００の試料を処理する。これら両方のアッセイの速度および受容力は、最終の実験室作業段階が最小限にされ、条件が正確に最適化されたいわゆる実験室キットが開発され１こ場合に顕著に改善され得る。The RIA analysis sequence is performed for approximately 2 days, during which time - human analysis is carried out at approximately 2°O. I can. On the other hand, the EIA sequence lasted about 8 hours and collected about 500 samples. process. The speed and acceptability of both of these assays will depend on the final laboratory stage. So-called laboratory kits have been developed with minimal space and precisely optimized conditions. In this case, significant improvements can be made.

治療適用において、この発明による式（１）の蛋白質コンジュゲートは、蛋白質基として動物またはヒトの細胞の表面構造に特異結合する蛋白質、個々の構造に対して産生された抗体、またはモノクロナールであり、ハイブリドーマ技術を用いて製造された抗体を含み得る。この明細書の導入部で指摘したように、抗体は癌細胞に特有または特異的であり得る。In therapeutic applications, the protein conjugate of formula (1) according to the invention proteins that specifically bind to surface structures of animal or human cells; Antibodies produced against or monoclonal, using hybridoma technology may include antibodies produced by As pointed out in the introduction to this specification, antibodies are Can be unique or specific to cancer cells.

以下、実施例によりこの発明を説明するが、これらに限定する訳ではない。The present invention will be explained below with reference to Examples, but is not limited thereto.

実施例１ビスインドールアルカロイドのアルブミンコンジュゲートの製造。Example 1 Production of albumin conjugates of bisindole alkaloids.

５０Ｒ９のアミノフェニルアラニンを５Ｈの水に溶かす。この溶液に５０ｘｇのウシ血清アルブミンおよび５０π９の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、ｓ−合物を室温で一夜インキユベートする。Dissolve 50R9 aminophenylalanine in 5H water. Add 50xg to this solution. Bovine serum albumin and 50π9 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropylene) ropyru) carbodiimide (EDC) and incubate the s-compound overnight at room temperature. to

反応生成物を、水に対して＋４℃で透析（限外濾過）することにより試薬から分離する。溶液のｐＨを水浴生塩酸により１．５に調節する。１００次ｇのＮ　ａ　Ｎ　Ｏｔを１祿の水に溶かし、塩酸溶液に滴下し、さらに５０１９のアミドスルホン酸アンモニウムを１ｘＱの水に溶かしたものを滴下する。１５ｍ？のビスインドールアルカロイド（ビンクリスチン）を最小容量（１〜２ｒｒｒＱ）のホウ酸緩衝液、ｐＨ６（０，１モルのホウ酸ナトリウム溶液、ｐＨを１モルのＨＣ＆により調節）に溶かす。こうして得られた溶液に、１　、８　ｍＱの前記で製造された酸性溶液を加え、混合物をシェーカーに入れて室温で一夜放置する。水に対して透析することにより［ゲル濾過セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ２５Ｍ］最終生成物を試薬から分離する。透析物を冷却乾燥する。The reaction products are separated from the reagents by dialysis (ultrafiltration) against water at +4°C. Let go. The pH of the solution is adjusted to 1.5 with water bath raw hydrochloric acid. 100th order g N a Dissolve NOt in 1 yen of water, drop it into hydrochloric acid solution, and then add 5019 amidos Add ammonium sulfonate dissolved in 1×Q water dropwise. 15m? screw Indole alkaloid (vincristine) in a minimum volume (1-2rrrQ) Boric acid buffer, pH 6 (0.1 molar sodium borate solution, pH 1 molar HC & adjust). Add 1,8 mQ of the above-produced solution to the solution thus obtained. Add the prepared acidic solution and leave the mixture in a shaker at room temperature overnight. water By dialyzing against [gel filtration Sephadex] G25M] Separate the final product from the reagents. Cool and dry the dialysate.

ビスインドールアルカロイドの発色団に適した波長で生成物溶液を分光光変針分析することにより最終のコンジュゲートの生成を測定することができる。一般的収率は約７０％である。Spectrophotometrically analyze the product solution at a wavelength appropriate for the chromophore of the bisindole alkaloid. Formation of the final conjugate can be determined by analysis. general Yield is approximately 70%.

この実施例において、ビスインドールアルカロイドはビンクリスチンであったが、この方法は明細書に記載された他のアルカロイド類、例えばビンブラスチン、ビンデシンまたはビンシリジンについても行なうことができる。In this example, the bisindole alkaloid was vincristine; , this method can be used with other alkaloids as described in the specification, such as vinblastine, It can also be done with vindesine or vincilidine.

実施例２ビスインドールアルカロイドと蛋白質のコンジュゲーシヨン。Example 2 Conjugation of bisindole alkaloids and proteins.

１１！９のアミノベンゾエートを０．２モルのＨＣＱＯ，５ｊＩＣに溶かし、ｌｘｇの硝酸ナトリウムを０　、５　ＪＩ（！の水に溶かしたものを滴下する。Dissolve the aminobenzoate of 11!9 in 0.2 mol of HCQO, 5jIC, Drop a solution of xg of sodium nitrate in 0.5 JI (!) of water.

得られた溶液を４５分間水浴中にときどきゆっくりと撹拌しながら保つ。この溶液に０　、５　ｘＱの水にＩＲ９のスルファミン酸を溶かしたものを滴下し、３Ｈのビンクリスチンを最小容量のＮ−Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびホウ酸緩衝液（１：ＩＸホウ酸緩衝液＝１モルホウ酸ナトリウムのｐ）（を０．１モルホウ酸溶液により６．５〜７．５の範囲に調節する）からなる混合物に溶かす。The resulting solution is kept in a water bath for 45 minutes with occasional slow stirring. This melt A solution of 0, 5 x Q sulfamic acid dissolved in IR9 water was added dropwise to the solution, and 3 Vincristine in a minimal amount of N-N-dimethylformamide and boric acid buffer solution (1: IX borate buffer = 1 mol of sodium borate) (0.1 mol of sodium borate) (adjusted to a range of 6.5-7.5 with uric acid solution).

前記で製造された酸溶液をビンクリスチン溶液に滴下する。滴下中、ｐＨをモニターＬ、ｏ、ｔモルのＮａホウ酸塩により約７に保つ（黄色形成）。反応を３〜４時間暗闇で続行させ、次に３１！９の蛋白質を溶液に加える（溶液ｐＨ約６）。最小容量の水に溶かしたｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（４ｘ９）を酵素溶液に加え、反応を＋４℃で一夜続行させる。＋４℃で適当な緩衝液（例、燐酸緩衝生理食塩水溶液）に対する限外濾過により最終生成物を試薬から分離する。The acid solution prepared above is added dropwise to the vincristine solution. Monitor pH during dripping. The temperature is maintained at about 7 with L, o, t mol of Na borate (yellow formation). 3 reactions Continue in the dark for 4 hours, then add 31!9 protein to the solution (solution pH approximately 6) . l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)ka dissolved in a minimum volume of water. Rubodiimide (4x9) is added to the enzyme solution and the reaction is allowed to proceed overnight at +4°C. + Optimal sterilization is achieved by ultrafiltration against a suitable buffer (e.g., phosphate-buffered saline solution) at 4°C. Separate the final product from the reagents.

ビンクリスチンジアゾカップリング生成物に関するＨＰＬＣ（高速流体クロマトグラフィー）分析を行なうことにより、単一の位置だけがジアゾカップリングに関与するという事実を明確にすることができる。この段階からの一般的収率は約９０％である。HPLC (high performance fluid chromatography) for vincristine diazo coupling product By performing a diazo-coupled analysis, only a single position The fact that they are involved can be made clear. Typical yields from this step are approximately It is 90%.

国際調査報告１Ｍ＋１＋１１瞳−＾ρ＠Ｉ−ＣＩＩ□ａｎＮ・ｑ１轡１＝ＴＰＡ／α狛７４international search report 1M+1+11 Pupil-^ρ@I-CII□anN・q1轡1=TPA/αKoma74

Claims

[Claims]

(1) Formula (I) of the conjugate is Ar-N=N-bisindole alkaloid (I) (wherein Ar contains a protein group) benzoic acid or arylalkylcarboxylic acid group) A protein conjugate of bisindole alkaloids, characterized in that To.

(2) In formula (I), the indole alkaloid is expressed by the general formula (II), ▲ , chemical formulas, tables, etc.▼(II) (in the formula, A represents a lower C1-C5 alkylene group, B represents a hydroxy group and/or a lower lower C1-C5 alkylene or alkylene which can be substituted by a lower alkyl group ), and Ar is represented by the formula ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ (where n is 0-5, the alkylene chain may be substituted, and T is a protein group, e.g. glycoprotein, immunoglycoprotein or enzyme) A protein conjugate of bisindole alkaloids according to claim 1, Gate.

(3) Formula (III) of bisindole has ▲mathematical formula, chemical formula, table, etc.▼( III) (wherein, D is ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼or▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼, R1 is -CH3 or -CHO, R2 is -OCOCH3 or -OH R3 is -OH, R4 is -OCH3, -NH2 or R3 and R4 together form a chain ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ ) The bisindole according to claim 1 or 2, characterized in that Protein conjugates of alkaloids.

(4) A protein group containing an acid group is present at the 5-position of the indole ring of the second alkaloid group. Bisindoles according to any one of the preceding claims, characterized in that Protein conjugates of alkaloids.

(5) Formula (I) Ar-N=N-bisindole alkaloid (I) (wherein Ar is a protein group-containing benzoic acid or arylalkylcarboxylic acid group) A method for producing a protein conjugate of bisindole alkaloid shown by , formula (III) ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼(III) (in the formula, D is ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼or▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼, R1 is -CH3 or -CHO, R2 is -OCOCH3 or -OH R3 is -OH, R4 is -OCH3, -NH2 or R3 and R4 together form a chain ▲Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ ) The bisindole shown by the formula Ar−N≡N(+) (In the formula, Ar has the same meaning as above, but the protein group is bonded to the aromatic acid group. (If so, Ar cannot contain protein groups) A manufacturing method characterized by reacting with a diazonium acid derivative represented by

(6) Bisindole with formula (IV) -N=N+-AR (In the formula, Ar has the same meaning as above, except that it does not contain a protein group. do) After reacting with the diazo acid shown in , a protein group is generated by an electrophile substitution reaction. or the aromatic amino acid NH2-Ar-COOH (in the formula , Ar has the same meaning as above) Claim 5, characterized by diazotizing and reacting with bisindole. Manufacturing method described in section.

(7) Under acidic conditions, preferably under weakly acidic conditions, most preferably at pH 6 to 6.9. according to claim 5 or 6, characterized in that the method is carried out within the scope of Manufacturing method.

(8) Formula (V) Ar1-N=N-bisindole alkaloid (V) (wherein Ar1 is benzoin (represents an acid or arylalkylcarboxylic acid group) A bisindole alkaloid derivative characterized by:

(9) Protein conjugate of bisindole alkaloid according to claim 1 Formula (V) Ar1-N=N-bisindole alkaloid ( V) (wherein Ar1 represents benzoic acid or an arylalkylcarboxylic acid group ) Application of bisindole alkaloid derivatives shown in

(10) Formula (I) Ar-N=N-bisindo in immunoassay method alkaloid (wherein, Ar is protein group-containing benzoic acid or arylalkyl (represents a carboxylic acid group) Application of bisindole alkaloid derivatives shown in

(11) A protein whose protein group specifically binds to the surface structure of animal or human cells. The protein conjugate according to claim 1, which is a protein conjugate.

(12) Protein groups are produced on individual surface structures of animal or human cells. 12. The conjugate according to claim 11, which is an antibody obtained by

(13) the antibody is monoclonal and produced by hybridoma technology; The conjugate according to claim 12.

(14) The surface structure (against which antibodies are produced) is unique or specific to cancer cells. 14. The conjugate of claims 12 and 13, wherein the conjugate is

(15) The conduit according to claim 11, wherein the protein group is transferrin. ugate.

(16) A method for producing a conjugate according to claims 11 to 15.

(17) The use of the conjugate according to claims 11 to 15 in the treatment of diseases. Application.

(18) Applicability of the conjugate according to claims 11 to 15 in the treatment of cancer for.