FI80703B - Bis-indolalkaloiders proteinkonjugat, deras framstaellning och anvaendning. - Google Patents

Description

1 80703

Bis-indolialkaloidien proteiinikonjugaatit, niiden valmistusmenetelmä ja käyttö - Bis-indolalkaloiders proteinkonjugat, deras framställning och använding

Keksinnön kohteena on bis-indolialkaloidien konjugaatit, niiden valmistus sekä käyttö immunometrisissä määritysmenetelmissä .

Tietyt bis-indolialkaloidit, joista osa on kasveista saatavia luonnonmolekyylejä, osa näistä synteettisesti johdettuja, ovat osoittautuneet syöpäsolujen lääkinnälliseen tuhoamiseen soveltuviksi ns. sytostaateiksi. Tällaisten aineiden pitoi-suusmääritykset ovat sekä niiden kehittelytyön, että erityisesti hoidon optimoinnin kannalta tärkeitä. Herkät analyyttiset menetelmä ovat hyödyksi myös kyseisten yhdisteiden tuotantoprosessien yhteydessä.

Tällaisia bis-indolialkaloideja tai niden synteettisiä johdannaisia voidaan kuvata seuraavalla yleiskaavalla; katarantiiniyksikkö jfy-S V ··'' —f— Il I J ·’ vindoluniyksikkö * (— / R1 K* C0R4 2 80703 D R^ R2 R3 R4

OH

\ / 1 vinblastiini C -CH3 -OCOCH3 -OH -OCH3 I Et CHo / * 2 vinkristiini -CHO -OCOCH3 -OH -OCH3 3 vindesiini -"- -CH3 -OH -OH -NH2 4 vintsolidiini -"- -CH3 -OCOCH3 | j ° Y"n 0 ch2ch2ci

Keksinnön mukaiselle yhdisteelle on tunnusomaista se, että konjugaatin kaava (I) on

Ar-N=N-bisindolialkaloidi (I) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on r-- :': 3 R1 S* C0R4 3 80703 jossa kaavassa OH CH2CH3 CH2CH3 D on - C - CH2 - tai - C = CH-,

Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -OCOCH3 tai -OH, R3 on -OH, R4 on -OCH3, —NH2 tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -0-C-N-CH2CH2Cl

O

Ar tarkoittaa ryhmää jonka kaava on jfiS- T-NH-CO- (CH2) n^Y^/ jossa n on 0 - 5, joka alkyleeniketju voi olla substituoitu ja T tarkoittaa proteiiniryhmää kuten glukoproteiinia, immuno-glukoproteiinia tai entsyymiä.

Nykyisin kliinisessä käytössä oleville yllämainitun tyyppisille yhdisteille, vinkristiinille, vinblastiinille ja vindesiinille ei tiettävästi ole kaupallisesti saatavissa herkkää ja spesifistä sarja-analyyttistä menetelmää. Keskeisenä erona aikaisemmin julkaistuihin, näiden yhdisteiden immunoanalyyttisiin menetelmiin (Ria, Irma, Elisa ym) nähden on nyt kehitetyn menetelmän pohjalta tuotettujen vastaaineiden suuri spesifisyys. Tämä perustuu siihen, että tässä kuvattava proteiinikonjugaatin valmistusmenetelmä jättää kohteena oleva bis-indolialkaloidin toisen, nykykäsityksen mukaan juuri terapeuttisesti aktiivisen osan vapaaksi ja näin analyysimenetelmän pohjana olevissa vuorovaikutusprosessissa toimintakykyiseksi.

Saavutettavasta suuresta spesifisyydestä on analyysissä hyötyä esimerkiksi siten, etteivät mahdolliset lääkkeiden aineenvaihduntatuotteet tai tuotannossa sivutuotteet häiritse määritystä.

. 80703 4

Bis-indolialkaloidit muodostuvat vindoliini- ja katarantiini-yksiköistä, joista katarantiiniyksikön indolinen osa antaa mahdollisuuden proteiiniryhmän liittämiseen ko. aromaattiseen kuusirenkaaseen käyttämällä elektrofiilistä aromaattista substituutioreaktiota. Proteiiniryhmällä tarkoitetaan yleisesti proteiinia, glykoproteiinia, esim. entsyymiä, albumiinia, ihmis- tai eläinseerumialbumiinia, immunoglo-buliinia tai vastaavaa. Koska proteiinikemian reaktiot tapahtuvat vesiliuoksessa, tulee tässä tarkoituksenmukaiseksi käyttää diatsokytkentää sellaisella diatsoniumsuolalla, johon proteiini lopullisen immunogeenin muodostuksessa voidaan kovalenttisesti liittää joko diatsokytkentää edeltävänä tai sen jälkeen suoritettavana reaktiovaiheena.

Tarkastelun kohteena olevissa vindoliini- ja katarantiini-yksiköissä on kummassakin aromaattinen kuusirengas diatsokytkentää varten. Vindoliiniosassa renkaan aktiivisin kohta ei ole vapaana tätä varten, koska katarantiiniyksikkö on kiinnittynyt juuri siihen kovalenttisella sidoksella. Lisäksi vindoliinissa ko. renkaan toiseksi reaktiivisin hiiliatomi on diatsokytkentää ajatellen steerisesti ahtaalla alueella. Katarantiiniyksikön aromaattisessa kuusirenkaassa on periaatteessa 4 hiiliatomia käytettävissä diatsokytkentää varten. Suorittamalla kytkentää aromaattisten amiinien diatsokytkennän periaatteella, ts. siten, että indolinen typpiatomi saa aktivoida aromaattisen renkaan, voidaan perustellusti odottaa kytkeytymisen tapahtuvan ko. typpiatomiin nähden p-asemaan, joka on renkaan reaktiivisin kohta kytkentää ajatellen, ja kysymyksessä on lisäksi vielä eräs renkaan steerisesti parhaiten käytettävissä olevista asemista. Täten on mahdollista saavuttaa melko yhtenäinen reaktiotuote: 5 80703

R R

ΐ I I

NH NH NH

(^)) + ArNp —> (j^) —> [Qj + H © H N=N-Ar N=N-Ar

Vaikeutena reaktiossa on diatsoniuin-ionin pyrkimys reagoida vesimolekyylien kanssa. Jos diatsokytkeytyminen on epäedullisten reaktio-olosuhteiden vuoksi hidasta tulee viimeksimainitusta sivureaktiosta, fenolimuodostuksesta, pääreaktio. Tällöin myös ko. fenolinen yhdiste voi diatsokytkeytyä, jolloin halutun diatsoyhdisteen lisäksi syntyy kyseisen sivureaktion tuottamaa kontaminaatioyhdistettä.

Sivureaktiot voidaan tehokkaimmin välttää säätämällä reaktio-liuoksen happamuusaste (pH) mahdollisimman tarkoin kyseisen synteesireaktion optimiarvoa vastaavaksi.

Reaktio-olosuhteet, joissa edellä esitetty alkaloidirakenne diatsokytkeytyy mahdollisimman nopeasti ja samalla sivureaktioiden osuus pysyy mahdollisimman pienenä, edellyttävät reaktioliuoksen happamuuden säätöä. Liuos ei myöskään saa olla niin emäksinen, että diatsonium-ionin pitoisuus laskee liikaa, mutta liuos ei myöskään saa olla niin hapan, että protonoitumattoman amiinin (katarantiiniyksikön indolinen osa) pitoisuus jää liian pieneksi. Esillä olevassa diatsokytkentä-reaktiossa on reaktioliuoksen pH-arvo säädettävä alueelle pH 6,60 - pH 6,90 riittävän yhtenäisen ja spesifisesti bis-indolialkaloideja erikseen mittaavan ELlSA-määritys-menetelmän tarpeisiin sopivan immunogeenin muodostamiseksi.

Vasta-aineen valmistus tapahtuu tunnetulla tavalla esim.: 6 80703 L. Hudson & F.C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford 1976, ja R.H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn (toim.), Monoclonal Antibodies and Functional Cell Lines, Plenum, New York 1984.

Vasta-ainetta voidaan tuottaa koe-eläimen immunojärjestelmän avulla immunisoimalla eläin ylläesitettyä konjugaattia immu-nogeeninä käyttäen ja keräämällä vasta-aine verenkierrosta. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa ns. monoklonaalisiä vasta-aineita joko in vivo- tai in vitro-periaatteella eristämällä koe-eläimen elimistöstä vasta-ainetta tuottavia soluja joko jälkeen tai ennen immunisointikäsittelyä sekä kehittämällä edelleen tuotantosolukkoja. Vasta-aine voidaan tarvittaessa puhdistaa tavanomaisia tarkoitukseen soveltuvia menetelmiä käyttäen.

Analyysi perustuu edellä esitetyn vasta-aineen ja analysoitavan bis-indolialkaloidin väliseen sitoutumisreaktioon. Sitoutuvan analysaatin määrä todetaan kilpailevan sitoutuvan merkkiaineen avulla. Merkkiaineena voi toimia radioaktiivisella isotoopilla merkattu vastaava kaupallinen yhdiste tai mitattavissa olevaan entsyymin konjugoitu vastaava yhdiste. Radioaktiivisuus ja entsyymiaktiivisuus ovat mitattavissa tavanomaisin, ko. tarkoituksiin markkoitavin laittein. Periaatetta on kuvattu julkaisussa Voller et ai. Bull. Wild. Hlth. Org. (1979) 53, 55 - 56.

Menetelmän toimivuus on käytännössä testattu kaikilta osin vinkristiinin suhteen sekä radioisotooppia että entsyymiä merkkiaineena käyttäen. Radioimmunometrinen menetelmä (RIA) toimii tritioitua merkkiainetta käyttäen pitoisuusalueella 0,1 - 50 ng, on erittäin spesifinen kohdeaineella ja täyttää vastaavien menetelmien toistettavuudelle yleisesti hyväksytyt kriteerit. Menetelmä on todettu käyttökelpoiseksi plasman 7 80703 vinkristiinipitoisuuden määrityksissä. Entsyymi-immunoana-lyyttinen menetelmä (EIA) vastaa muilta ominaisuuksiltaan edellistä, mutta on sitä herkempi (mittausalue n. 10 - 500 pg) ja soveltuu plasman lisäksi myös kokoveren ja veren solu-materiaalin vinkristi inimäärityksi in.

RIA-analyysisarjan toteuttaminen kesää n. 2 vrk, jonka kuluessa yksi henkilö voi suorittaa n. 200 analyysiä. Vastaavasti EIA-sarjan kesto on n. 8 tuntia sisältäen n. 500 näytettä. Molempien määritysten nopeutta ja kapasiteettiä voidaan parantaa merkittävästi, jos niistä kehitetään ns. analyysikitti, jossa lopulliset laboratoriotyövaiheet on minimoitu ja olosuhteet tarkkaan optimoitu.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä sitä rajoittamatta.

Esimerkki 1

Bis-indolialkaloidin albumiinikonjugaatin valmistus 50 mg DL-p-aminofenyylialaniinia liuotetaan 5 ml vettä. Tähän liuokseen lisätään 50 mg naudan seerumin albumiinia ja 50 mg l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli) karbodi-imidiä (EDO) ja seosta inkuboidaan yön yli huoneenlämmössä.

Reaktiotuote erotetaan reagensseista dialysoimalla (ultrasuo-datus) +4°C:ssa vettä vastaan. Liuoksen pH säädetään l,5:ksi suolahapolla jäähauteessa. 100 mg NaN02:a liuotetaan 1 ml vettä ja lisätään tipoittain suolahappoliuokseen, johon edelleen lisätään 50 mg ammoniumamidosulfonaattia liuotettuna 1 mlsaan vettä. 15 mg bis-indolialkaloidia (vinkristiiniä) liuotetaan minimivolyymiin (1-2 ml) boraattipuskuria, pH 6 (0,1 M Na-boraattiliuos, jonka pH säädetty 1 M HCltlla). Näin saatuun liuokseen lisätään 1,8 ml edellä valmistettua 8 80703 hapanta liuosta ja seoksen annetaan olla huoneenlämmössä ravistelijassa yön yli. Lopputuote erotetaan reagensseista dialysoimalla vettä vastaan (geelisuodatus Spehadex 6 - 25 M). Dialysaatti kylmäkuivataan immunisaatioissa käytettäväksi.

Lopullisen konjugaatin muodostuminen voidaan todeta analysoimalla tuoteliuosta spektrofotometrisesti bis-indolialka-loidien kromofooreihin sopivalla aallonpituudella. Tyypillinen saanto on n. 70 %.

Esimerkissä bis-indolialkaloidina on käytetty vinkristiiniä mutta menetelmä voidaan toteuttaa muillakin selityksessä mainituilla alkaloideilla, kuten vinbalstiinilla, vindesii-nilla tai vintsolidiinilla.

Esimerkki 2

Vinkristiinin konjugointi alkaaliseen fosfataasiin 1 mg P-aminobentsoaattia liuotetaan 0,5 ml:aan 0,2 M HC1, johon lisätään tipottain 1 mg natriumnitriittiä liuotettuna 0,5 ml:aan vettä. Saatua seosta pidetään jäähauteessa 45 min ajoittain hiljaa sekoittaen. Tähän seokseen lisätään tipottain 1 mg sulfamiinihappoa liuotettuna 0,5 ml:aan vettä ja 3 mg vinkristiiniä liuotetaan minimivolyymiin N-N-dimetyyli-formamidin ja boraattipuskurin seosta (1 : 1) (boraatti-puskuri: 0,1 M Na-boraatin pH säädetään välille 6,5 - 7,5 0,1 M boorihappoliuoksella)

Edellä valmistettu happoliuos lisätään tipottain vinkristiini-liuokseen. Lisäyksen aikana seurataan pH:ta, joka pidetään n. 7:ssä 0,1 M Na-boraatin avulla (muodostuu keltainen väri). Reaktion annetaan edetä 3 - 4 t +4°C:ssa pimeässä, jonka jälkeen liuokseen lisätään 3 mg alkaalista fosfataasia 9 80703 (liuoksen pH n. 6). Minimitilavuuteen vettä liuotettu l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidi (4 mg) lisätään entyymiseokseen ja annetaan reaktio edetä yön yli +4°C:ssa. Lopputuote erotetaan reagensseista ultrasuodatuk-sella +4°C:ssa sopivaa puskuria vastaan (esim. fosfaatti-puskuroitu fysiologinen suolaliuos).

Diatsokytkennän kohdistuminen yhteen ainoaan kohtaan voidaan todeta ajamalla HPLC-analyysi vinkristiinin diatsokytkennän tuotteesta. Tyypillinen saanto tästä vaiheesta on n. 90 %. Ylläesitetyllä menetelmällä voidaan valmistaa myös immuno-geenejä ainakin vinkristiinistä, vinblastiinista ja vinde-siinistä käyttäen esim. albumiinia alkaalisen fosfataasin tilalla.

Esimerkki 3

Vasta-aineen valmistus

Lyofilisoituja immunogeeneja emulgoitiin Freundsin adjuvant-tiin ja annettiin ruiskeena neljälle uusi-seelantilaiselle albinokanille. VCR-albumiininsuhde immugeeneissa oli: immugeeni 1 = 245:1; immugeeni 2 = 22:1 ja immugeeni 3 = 7,5:1. Kanille 1, 2 ja 3 annettiin immugeenia 1, 2 ja 3 sekä kanille 4 immugeenia 2. Taulukossa 1 on annettu immunisointiaikataulu ja määrät. Viikko viimeisen injektion jälkeen otettiin verinäytteet ja vasta-aineiden tuotanto todettiin mittaamalla [^H]VCR-sitoutuminen seeruminäytteissä kuten on kuvattu teoksessa Lehtola, T.; Huhtikangas, A. ja Virtainen, R.,

Application of radioimmunoassay to the quantitation of hyos-cyamine in plant material. Planta Medica, 1982;45: 237 - 239. Inununogolbuliini G (IgG) puhdistettiin antiseerasta DEAE-sel-luloosan avulla. Hudson, L and Hay, F.C., Practical Immunology, London: Blackwell Scientific Publications, 1976.

10 80703

Taulukko I

Kanien immunisointi vasta-ainetuotantoa varten

Injektion ___Antiqeenimäärä_ ajankohta (viikkoja)_Kani 1_Kani 2_Kani 3_Kani 4 0 0,75 1,00 0,40 0,60 4 0,75 - 5 - 0,80 0,50 0,45 9 0,75 - - - 12 - 0,25 0,25 0,30 13 0,15 - 18 0,30 - 19 - 0,30 0,30 0,20 22 0,15 0,20 0,20 0,10 27 - 0,10 31 - 0,20 - 0,27 32 - 0,50 -

Kuvassa 1 on kuvattu VCR-antiseerumin muodostus immunisoinnin aikana. Kuvan 1 tulosten ja taulukon 1 arvojen vertailu osoittaa, että suuremmat immonogeeniannokset kohottavat vasta-aine-tiitteriä. Kuvassa 1 on esitetty vasta-ainetiitteri kaneissa 1-4 taulukon I mukaisen immunisoinnin aikana. Ilmoitettu see-rumilaimennus vastaa [^H]VCR-merkkiaineen 50 % sitoutumista.

Claims (8)

11 80703

1 R3 4 jossa kaavassa OH /CH2CH3 CH2CH3 D on - C - CH2 - tai - C = CH-, Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -OCOCH3 tai -OH, R3 on -OH, R4 on -0CH3, -NH2 tai •R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -O-C-N-CH2CH2CI O is 80703 Ar^ tarkoittaa happoryhmää, jonka kaava on NH2-CO-(CH2)n jossa n = 0 - 5, joka alkyleeni ketju voi olla substituoitu, käyttö valmistettaessa patenttivaatimuksen 1 mukaista bisindoli-alkaloidien proteiinikonjugaattia.

8. Bisindolialkaloidijohdoksen, jonka kaava (I) on Ar-N=>N-bisindolialkaloidi (I) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on CO -

1. Bis-indolialkaloidien proteiinikonjugaatti, tunnet-t u siitä, että konjugaatin kaava (I) on Ar-N=N-bisindolialkaloidi (I) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on “Cx5?x ,—.—»

3 R1 R* C0R4 jossa kaavassa OH CH2CH3 /CH2CH3 D on -^c^- CH2 - tai - C - CH-, Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -0C0CH3 tai -OH, R3 on -OH, R4 on -0CH3, -NH2 tai R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -0-C-N-CH2CH2Cl i Ar tarkoittaa ryhmää jonka kaava on /oV T-NH-CO- (CH2 ) n—/ i2 80703 jossa n on 0 - 5/ joka alkyleeniketju voi olla substituoitu ja T tarkoittaa proteiiniryhmää kuten glukoproteiinia, immuno-glukoproteiinia tai entsyymiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen bis-indolialkaloidien proteiinikon jugaatti , tunnettu siitä että proteiiniryhmän sisältävä happoryhmä on toisen alkaloidiryhmän indolirenkaan 5-asemassa.

3. Menetelmä kaavan I mukaisen bisindolialkaloidien proteiinikonjugaatin valmistamiseksi» tunnettu siitä» että bisindoli saatetaan reagoimaan diatsoniumhappo-johdannaisen kanssa» jonka kaava on Ar-NsN<+>, jossa Ar tarkoittaa edellä määriteltyä» kuitenkin niin» että Ar voi olla sisältämättä proteiiniryhmää» jossa tapauksessa proteiiniryhmä liitetään aromaattiseen happoryhmään.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä» tunnettu siitä» että bisindoli saatetaan reagoimaan diatsohapon» jonka kaava IV on -NSN+-AR jossa Ar tarkoittaa samaa kuin edellä» mutta ei sisällä proteiiniryhmää» jonka jälkeen proteiiniryhmä liitetään saatuun happoon elektro£iilisellä substituutioreaktiolla» tai aromaattinen aminohappo, NH2-Ar-COOH jossa Ar on edellä määritelty, diatsotoidaan ja saatetaan reagoimaan bisindolin kanssa. '3 80703

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä suoritetaan happamissa olosuhteissa, edullisesti heikosti happamissa olosuhteissa, edullisimmin pH-alueella 6 - 6,9.

6. Bisindolialkaloidijohdos, tunnettu siitä, että sen kaava (V) on Ar^ - N = N - bisindolialkaloidi (V) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on

3 RI 4 °“4 jossa kaavassa OH CH2CH3 CH2CH3 D on - C - CH2 - tai - C = CH-, Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -OCOCH3 tai -OH, R3 on -OH, R4 on -OCH3, -NH2 tai ( R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -0-C-N-CH2CH2Cl O 14 80703 Ari tarkoittaa happoryhmää, jonka kaava on NH2-CO-(CH2)n jossa n = 0 - 5, joka alkyleeniketju voi olla substituoitu.

7. Bisindolialkaloidijohdoksen, jonka kaava (V) on Ari - N » N - bisindolialkaloidi (V) jossa indolialkaloidien yleiskaava (II) on J—N-\

3 R. COR*

3 R1 *f C0R4 jossa kaavassa OH CH2CH3 /CH2CH3 D on -X- CH2 - tai - C » CH-, Rl on -CH3 tai -CHO, R2 on -OCOCH3 tai -OH, '« 80703 R3 on -OH, R4 on -OCH3, -NH2 tai j R3 ja R4 muodostavat yhdessä ketjun -O-C-N-CH2CH2CI O Ar tarkoittaa happoryhmää, jonka kaava on T-NH-CO-(CH2)n jossa n * 0 - 5, joka alkyleeniketju voi olla substituoitu, ja T tarkoittaa proteiiniryhmää, kuten glukoproteiinia, immunoglukoproteiinia tai entsyymiä, käyttö valmistettaessa vasta-ainetta käytettäväksi immuno-metrisessä määritysmenetelmässä « 80703