NO871035L - Konjugerte proteiner av bis-indolalkaloider, bis-indolalkaloider, samt fremgangsmaate til fremstilling og anvendelse derav. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører konjugerte proteiner av bis-indolalkaloider, samt fremstilling og anvendelse derav. Oppfinnelsen vedrører også bis-indolalkaloider som er særlig nyttige ved fremstilling av de konjugerte proteiner.

Såkalte immunotoksiner er konjugerte proteiner hvor et spesielt bærerprotein, som vanligvis, men ikke nødvendigvis, er et antistoff, er utstyrt med en toksisk bestanddel, såsom et vegetabilsk eller mikrobebasert proteintoksin, et antineoplastisk legemiddel eller et radioaktivt middel (Hofstaetter, Gronski og Seiler, "Immuntoxines - Theoretical and Practical Aspects", Behring Inst. Mitt. nr. 74, 1984, p. 113-121).

Som angitt i ovennevnte publikasjon er det generelle immunotoksinprinsipp allerede kjent, men oppfinneriske for-bedringer av denne grunnleggende idé er foreslått når det gjelder bærer, toksisk segment og bindingen mellom disse to.

Forskjellige immunotoksiner er anvendbare, særlig ved behandling av kreftsykdommer, men også ved andre behandlinger som nødvendiggjør nedbrytning av en viss cellepopulasjon uten om mulig å skade andre celler. Bærersegmentet må således være et protein som er i stand til å feste seg spesifikt til slike overflatestrukturer hos en dyrecelle som er karakteristisk for en målcelle, dvs. cellene i en cellepopulasjon som skal ødelegges. Et slikt protein er særlig et antistoffmolekyl fremstilt mot den ovennevnte type av overflatestrukturer. Antistoffet kan i prin-sippet fremstilles ved kjente fremgangsmåter ved immunisering av et dyr med et renset antigen, hvorved ovennevnte type overflate-struktur således funksjonerer som antigenet.

Fortrinnsvis kan imidlertid ovennevnte type antistoff fremstilles ved å benytte konvensjonell hybridteknikk. Denne teknikk som f.eks. er beskrevet i "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", utgiver J.G.R. Murrell, forlegger CRC Press. Inc., Boca Raton, Florida, 1982, gjør fremstilling av antistoffer mulig, også mot urensede overflatestrukturer av mål-celler (f.eks. p. 151-168 i denne publikasjon). Det er også kjent at istedenfor et helt antistoffmolekyl er det mulig å anvende slike fragmenter av dette som inenholder molekylsegmentet som bindes til et antigen, såsom proteolytisk fremstillbare fragmenter Fab og (Fab)2. Istedenfor et antistoff kan bæreren også være et annet protein som har evne til å binde seg selektivt til målcellene. I britisk patentsøknad 2.116.979 beskrives konjugerte proteiner av transferrin eller ceruloplasmin med antisvulst-midler, hvorved disse konjugerte proteiner er anvendbare ved behandling av kreftsykdommer idet transferrinreseptorer er tallrike i kreftceller.

Målcellene kan være kreftceller, men som påpekt i artikkelen ("Ex-vivo treatment of donor bone marrow with anti-T-cell immunotoxines for prevention of graft-versus-host disease", Filipovich et al, The Lancet, 3. mars 1984, p. 469-471, er også et immunotoksin rettet mot et normalt cellesystem også anvendbart når behandlingen av en sykdom (eller i dette spesielle tilfelle: prevensjon) krever selektiv nedbrytning av vedkommende cellepopulasjon.

Fra GB-patentskrift 2.137.210 er det kjent konjugerte immunglobuliner av vinca-alkaloider hvor imidlertid et vinca-eller bis-indolalkaloid er bundet til et immunglobulin, med en esterbinding i stillingen til indolinenheten, heretter betegnetR2. Dette er nettopp det område hvor bis-indolalkaloider med forskjellige egenskaper avviker fra hverandre, og dette område kan antas å ha stor viktighet når det gjelder et molekyls medisinske aktivitet. Fremgangsmåten til fremstilling av konjugerte forbindelser, som er beskrevet i nevnte GB-patentsøknad 2.137.210 må således anses for å være ugunstig, idet et stort proteinsegment hindrer et alkaloids medisinske aktivitet sterisk.

Det som er beskrevet ifølge den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte til konjugering av bis-indolalkaloider til et protein på en måte som de fragmenter som har størst effekt på et alkaloidmolekyls aktivitet blir værende frie.

Bis-indolalkaloider, hvorav noen er vegetabilsk baserte naturlige molekyler og noen syntetisk fremstilt av disse, har vist seg å være såkalte cytostatika som er egnet for medisinsk nedbrytning av kreftceller.

Slike bis-indolalkaloider eller deres syntetiske derivater kan angis med følgende generelle formel:

catarantinenhet

En forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at formelen (I) for den konjugerte forbindelse er

hvor Ar er en benzo- eller arylalkylkarboksylsyregruppe som inneholder en proteingruppe.

Fortrinnsvis er i formelen (I) den generelle formel (II) for indolakaloider:

hvor A er en lavere C^-C^-alkylengruppe og B er en lavere C^-C^-alkylen- eller alkylenylgruppe som kan være substituert med en hydroksygruppe og/eller en lavere alkylgruppe, og

Ar er en gruppe med formelen

hvor n er 0-5, idet alkylenkjeden kan være substituert, og T er en proteingruppe, såsom glukoprotein, immunglukoprotein eller enzym.

Det er åpenbart at det for tiden ikke er noen kommersielt tilgjengelig, ømfintlig og spesifikk sekvensanalytisk metode i klinisk bruk for forbindelser av ovennevnte type, vinkristin, vinblastin og vindesin. En vesentlig forskjell sammenliknet med tidligere publiserte immunanalytiske metoder (Ria, Irma, Elisa etc.) for disse forbindelser er den høye spesifisitet for anti-stoffene som dannes på basis av den ifølge oppfinnelsen utviklede metode. Dette skyldes det faktum at fremgangsmåten til fremstilling av konjugerte proteiner, som er beskrevet her, lar en del, for tiden forstått som den terapeutisk aktive del av bis-indolalkaloid, og følgelig aktiv for fremgangsmåter som ana-lysemetoden er basert på.

Den tilgjengelige høye spesifisitet er nyttig ved analysen, f.eks. på en måte hvor mulige metabolske produkter i medisiner eller biprodukter i produksjonen ikke forstyrrer forsøket.

Bis-indolalkaloider består av vindolin- og katarantinen-heter, hvor indoldelen i en katarantinenhet gjør det mulig å kon-jugere en proteingruppe til en aromatisk seks-leddet ring ved anvendelse av en elektrofil, aromatisk substitusjonsreaksjon. Proteingruppen omfatter generelt protein, glykoprotein, f.eks. enzym, albumin, humant eller animalt serumsalbumin, særlig immunglobulin eller liknende. Som følge av at reaksjonene innen proteinkjemien foregår i vandig løsning vil det være hensikts-messig å benytte diazokopling med et diazoniumsalt hvortil et protein ved dannelsen av et endelig immunogen kan bindes kovalent som et reaksjonstrinn som utføres enten før eller etter diazokoplingen.

Vindolin- og katarantinenhetene i forbindelsene ifølge oppfinnelsen inneholder begge en aromatisk seks-leddet ring for diazokopling. I vindolindelen er den mest aktive del av ringen ikke fri for dette formål som følge av at det er nettopp der katarantinenheten er bundet med en kovalent binding. Dessuten be-finner i vindolin det nest mest reaktive karbonatom i ringen seg når det gjelder diazokopling i et sterisk hindret område. I den aromatiske seks-leddete ring i katarantinenheten er der i prin-sippet 4 karbonatomer tilgjengelige for diazokopling. Ved å ut-føre koplingen ifølge diazokoplingprinsippet for aromatiske aminer, med andre ord ved å la et indolnitrogenatom aktivisere en aromatisk ring, er det ganske berettiget å vente at koplingen skal finne sted i p-stilling i forhold til nevnte nitrogenatom. Idet dette er det mest reaktive sted i ringen når det gjelder kopling, og dessuten er dette sterisk en av de best tilgjengelige stillinger i ringen. Det er således mulig å oppnå et nokså homogent reaksjonsprodukt:

En vanskelighet i reaksjonen er diazoniumionets tilbøyelig-het til å reagere med vannmolekyler. Dersom diazokoplingen er langsom, som følge av ugunstige reaksjonsbetingelser vil sist-nevnte sidereaksjon, fenoldannelse, bli hovedreaksjonen. Således kan også en foreliggende fenolforbindelse diazokoples, hvorved det i tillegg til en ønsket diazoforbindelse dannes en foru-rensningsforbindelse ved nevnte sidereaksjon.

Sidereaksjoner kan mest effektivt unngås ved regulering av surheten (pH) i reaksjonsløsningen, slik at den stemmer så nøy-aktig som mulig overens med den optimale verdi for den spesielle reaksjon.

Reaksjonsbetingelser hvor ovennevnte alkaloidstruktur diazokoples så hurtig som mulig samtidig som det blir så få sidereaksjoner som mulig krever regulering av reaksjonsløsningens surhet. Løsningen må heller ikke være så alkalisk at diazonium-ionkonsentrasjonen faller for mye, men heller ikke bør løsningen være så sur at konsentrasjonen av ikke-protonisert amin (indoldelen i katarantinenheten) blir værende for lav. I den foreliggende diazokoplingsreaksjon må pH-verdien i reaksjonsløsningen reguleres i området fra pH 6,60 til pH 6,90 for å danne et immunogen som er tilstrekkelig homogent og i stand til å måle spesifikt og separat bis-indolalkaloider for å tilfredstille kravene i ELISA-forsøksprosessen.

Fremstilling av et antistoff utføres på i og for seg kjent måte, f.eks.: L. Hudson&F.C. Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1976 og R.H. Kennett, K.B. Bechtol & T.J. McKearn (utgiver), Monoclonal Antibodies and Practical Cell Lines, Plenum, New York, 1984.

Antistoff kan fremstilles ved hjelp av et forsøksdyr immun-system ved å immunisere dyret med den ovenfor beskrevne konjugerte forbindelse som immunogen og ved å oppsamle antistoffet fra blodsirkulasjonen. Alternativt er det mulig å fremstille såkalte monoklonale antistoffer enten in vivo eller in vitro prinsippielt ved å isolere antistoffdannende celler fra systemet hos et dyr enten etter eller før immuniseringsbehandlingen og ved videre utvikling av produksjonscellesystemer. Antistoffet kan om nødvendig renses ved konvensjonelle og egnede metoder.

Analysen er basert på en bindingsreaksjon mellom nevnte antistoff og et bis-indolalkaloid som skal analyseres. Mengden bindingsanalysemedium bestemmes ved hjelp av en konkurrerende bindingstracer. Traceren kan være en tilsvarende kommersiell forbindelse merket med en radioaktiv isotop eller en tilsvarende forbindelse som er konjugert med et målbart enzym. Radioaktivitet og enzymatisk aktivitet kan måles med konvensjonelt utstyr som er markedsført for disse formål. Dette prinsipp er beskrevet i en publikasjon av Voller et al., Bull. Wild. Hlth. Org., Vol. 53, 1979, p. 55-56.

At denne metode funksjonerer er praktisk testet i alle hen-seender for vinkristin ved å anvende både radioisotop og enzym som tracer. En radioimmunometrisk metode (RIA) funksjonerer med en tritionert tracer i konsentrasjonsområdet 0,1-50 ng, er meget spesifikk for et målmateriale og tilfredsstiller de kriterier som generelt godtas når det gjelder reproduserbarhet for tilsvarende metoder. Metoden har vist seg å kunne anvendes ved bestemmelse av vinkristinkonsentrasjonen i plasma. En enzym-immunoanalytisk metode (EIA) tilsvarer den ovennevnte når det gjelder andre karakteristika, men er mer ømfintlig (målområde 10-500 pg) og i tillegg til plasma er den også egnet for vinkristinbestemmelser i helblod og cellemateriale i blod.

Utførelsen av RIA-analysesekvens tar ca. 2 dager, og i løpet av dette tidsrom kan en person utføre ca. 200 analyser. Varigheten av en EIA-sekvens er ca. 8 timer, omfattende ca. 500 prøver. Hastigheten og kapasiteten til begge metoder kan bedres vesentlig dersom de utføres i laboratorieutstyr hvor de av-sluttende laboratpriearbeidsfaser minimaliseres og betingelsene optimaliseres nøyaktig.

Ved terapeutisk anvendelse kan de konjugerte proteiner med formelen (I) ifølge oppfinnelsen som proteingruppe inneholde et protein som bindes spesifikt til overflatestrukturene av en ani-malsk eller human celle, et antistoff som er dannet mot individuelle strukturer eller et antistoff som er monoklonalt og fremstilt ved hybrid teknikk. Som påpekt i beskrivelsesinnledningen kan antistoffet typisk være spesifikt for kreftceller.

Oppfinnelsen vil bli nærmere belyst i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av et konjugert albumin av bis- indolalkaloid

50 mg aminofenylalanin ble løst i 5 ml vann. Til denne løsning ble det tilsatt 50 mg okseserumalbumin og 50 mg 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodeimid (EDC), og blandingen ble ut-viklet over natten ved romtemperatur.

Reaksjonsproduktet ble separert fra reaktanter ved dialyse (ultrafiltrering) ved +4° mot vann. Løsningens pH ble regulert til 1,5 med saltsyre i isbad. 100 mg NaN02ble løst i 1 ml vann og dråpevis tilsatt til saltsyreløsningen, hvortil det ble tilsatt ytterligere 50 mg ammoniumamidsulfonat løst i en 1 ml vann. 15 mg bis-indolalkaloid (vinkristin) ble løst i minst mulig (1-2 ml) boratbuffer med pH 6 (0,1 M Na-boratløsning hvis pH var regulert med IM HC1). Til den således fremstilte løsning ble det tilsatt 1,8 ml av den fremstilte sure løsning, og blandingen ble hensatt over natten ved romtemperatur i et rysteapparat. Sluttproduktet ble separert fra reaktanter ved dialyse mot vann (gel filtrering Sephadex G - 25 M). Dialysatet ble tørket kaldt.

Dannelsen av en endelig konjugert forbindelse kan bestemmes ved å analysere produktløsningens spektrofotometrisk med en bølgelengde som er egnet for kromoforene i bis-indolalkaloider. Et typisk utbytte er ca. 70%.

I dette eksempel var bis-indolalkaloidet vinkristin, men fremgangsmåten kan også utføres med andre alkaloider som er nevnt i beskrivelsen, såsom vinblastin, vindesin eller vinzolidin.

Eksempel 2

Konjugering av bis- indolalkaloid med protein

1 mg aminobenzoat ble løst i 0,5 ml 0,2 M HC1, og til denne løsning ble det dråpevis tilsatt 1 mg natriumnitritt løst i 0,5 ml vann. Den oppnådde løsning ble plassert i isbad i 45 minutter med langsom omrøring av og til. Til denne løsning ble det dråpevis tilsatt 1 mg sulfaminsyre løst i 0,5 ml vann og 3 mg vinkristin løst i minst mulig av en blanding av N,N-dimetylformamid og en boratbuffer (1:1) (boratbuffer: pH 0,1 M Na-borat regulert til området 6,5-7,5 med 0,1 M borsyreløsning).

Den ovenfor fremstilte sure løsning ble dråpevis tilsatt til en vinkristinløsning. Under tilsetningen ble pH overvåket og holdt på ca. 7 ved hjelp av 0,1 M Na-borat (danner gul farge). Reaksjonen fikk foregå i fra 3 til 4 timer i mørket, etterfulgt av tilsetning av 3 mg protein til løsningen (løsningens pH ca. 6). 4 mg 1-ety1-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodeimid løst i minst mulig vann ble tilsatt til en enzymløsning, og reaksjonen fikk foregå over natten ved +4°C. Sluttproduktet ble separert fra reaktanter ved ultrafiltrering ved +4°C mot en egnet buffer (f.eks. en fosfatbufret, fysiologisk saltløsning).

Claims (18)

1. Konjugert proteinforbindelse av bis-indolalkaloider, karakterisert ved at den konjugerte for-bindelses formel (I) er

hvor Ar er en benzo- eller arylalkylkarboksylsyregruppe som inneholder en proteingruppe.

2. Konjugert proteinforbindelse i samsvar med krav 1, karakterisert ved at formelen (I) er den generelle formel (II) for indolakaloidene:

hvor A er en lavere C^ -C^ -alkylengruppe og B er en lavere C^-Cj--alkylen- eller alkylenylgruppe som kan være substituert med en hydroksygruppe og/eller en lavere alkylgruppe, og Ar er en gruppe med formelen

hvor n er 0-5, idet alkylenkjeden kan være substituert, og T er en proteingruppe, såsom glukoprotein, immunglukoprotein eller enzym.

3. Konjugert proteinforbindelse i samsvar med krav 1, karakterisert ved at bis-indolens formel (III) er:

hvor OH CH2 CH3 CH2 CH3 D er - C - CH2 - eller - C = C-, Rj er -CH3 eller -CHO, R2 er -OCOCH3 eller -OH, R3 er -OH, R. er -OCH-, -NH„ eller

4 3 2 R3 og R^ danner sammen en kjede

4. Konjugert proteinforbindelse i samsvar med et av de fore-gående krav, karakterisert ved at proteingruppen som inneholder syregruppe er i 5-stillingen i indolringen i en andre alkaloidgruppe.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av en konjugert proteinforbindelse av bis-indolalkaloider hvis formel (I) er Ar-N=N-bisindolalkaloid hvor Ar er en proteingruppeholdig benzo- eller arylalkyl karboksylsyregruppe, karakterisert ved at en bis-indol med formelen (III)

hvor OH CH2 CH3 CH2 CH3 D er - C - CH2 - eller - C = C-, R1 er -CH3 eller -CHO, R2 er -OCOCH3 eller -OH, R3 er -OH, <R>4 er -OCH3 , -NH2 eller R3 og R^ danner sammen en kjede

omsettes med et diazoniumsyrederivat med formelen Ar-N=N<*+V> hvor Ar har den ovenfor angitte betydning, men med den unntakelse at Ar ikke kan inneholde en proteingruppe, idet derved en proteingruppe er bundet til en aromatisk syregruppe.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at bis-indolen omsettes med en diazosyre med formelen (IV)

hvor Ar har den ovenfor angitte betydning, men ikke inneholder en proteingruppe, hvoretter en proteingruppe bindes til den resulterende syre ved hjelp av en elektrofil substitusjonsreaksjon, eller en aromatisk aminosyre

hvor Ar har den ovenfor angitte betydning, diazoteres og omsettes med bis-indol.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5 eller 6, karakterisert ved at den utføres under sure betingelser, fortrinnsvis under svakt sure betingelser, helst i pH-området 6-6,9.

8. Bis-indolalkaloidderivat, karakterisert ved at dets formel (V) er

hvor Ar^ er en benzo- eller arylalkylkarboksylsyregruppe.

9. Anvendelse av et bis-indolalkaloidderivat, hvis formel (V) er

hvor Ar^ er en benzo- eller arylalkylkarboksylsyregruppe, til fremstilling av et konjugert protein av bis-indolalkaloider som angitt i krav 1.

10. Anvendelse av et bis-indolalkaloidderivat, hvis formel (I) er Ar-N=N -bis-indolalkaloid hvor Ar er en proteingruppeholdig benzo- eller arylalkylkarboksylsyregruppe i en immunometrisk forsøksmetode.

11.. Konjugert proteinforbindelse i samsvar med krav 1, karakterisert ved at proteingruppen er et protein som bindes spesifikt til overflatestrukturer av en animal eller human celle.

12. Konjugert forbindelse i samsvar med krav 11, karakterisert ved at proteingruppen er et antistoff dannet mot individuelle overflatestrukturer av en animal eller human celle.

13. Konjugert forbindelse i samsvar med krav 12, karakterisert ved at antistoffet er monoklonalt og fremstilt ved hybrid teknikk.

14. Konjugert forbindelse i samsvar med krav 12 og 13, karakterisert ved at overflatestrukturen som antistoffet dannes mot er typisk eller spesifikk for kreftceller.

15. Konjugert forbindelse i samsvar med krav 11, karakterisert ved at proteingruppen er transferrin.

16. Fremgangsmåte til fremstilling av de i kravene 11-15 angitte konjugerte forbindelser.

17. Anvendelse av de konjugerte forbindelser ifølge kravene 11-15 til behandling av en sykdom.

18. Anvendelse av de i kravene 11-15, angitte konjugerte forbindelser ved behandling av kreft.