FI80258C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara merkaptoalkanoylfoereningar. - Google Patents

Description

1 80258

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten merkaptoalkano-yyliyhdisteiden valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu menetelmään terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava

R, O R, O

( Il I II

rx -s-ch2 -ch-c-nh-ch- ( ch2 )n -c-r4 I

10 mukaanlukien sen farmaseuttisesti hyväksyttävissä oleva suola, jossa kaavassa Rx on vety; R2 on bentsyyli; 15 R3 on vety tai bentsyyli; R4 on hydroksi, alempi alkoksi tai -NH2; ja n on kokonaisluku välillä 1-9.

Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet merkapto-alkanoyyliyhdisteet ovat käyttökelpoisia analgeettisina 20 aineina, enkefalinaasin inhibiittoreina.

Käytetty termi "alempi alkyyli" tarkoittaa suora-ketjuisia tai haarautuneita hiilivetyryhmiä, joissa on enintään 7 hiiltä, esimerkiksi metyyliä, etyyliä, propyy-liä, isopropyyliä, isobutyyliä, butyyliä, tert.-butyyliä, 25 pentyyliä, isopentyyliä jne. Edullisissa alemmissa alkyy-liryhmissä on enintään 4 hiiliatomia, ja näistä ovat metyyli ja etyyli suositeltavimmat. Vastaavasti termi "alempi alkoksi” tarkoittaa tällaisia ryhmiä kiinnittyneenä happeen.

30 Greenberg et ai. osoittavat (US-patenttijulkaisu 4 401 677), että erilaiset merkaptoalkanoyyli-a-aminohapot ovat käyttökelpoisia analgeettisia aineita niiden enkefa-linaasia ehkäisevän tehon vuoksi.

2 80258

Ondetti et ai. osoittavat (US-patenttijulkaisu 4 053 651), että erilaiset merkaptoalkanoyyli- ja asyyli-merkaptoalkanoyyli-a-aminohapot ovat käyttökelpoisia verenpainetta alentavia aineita niiden angiotensiiniä muut-5 tavan entsyymin inhibiitiotehon johdosta.

Roques et ai. osoittavat (Nature, Voi. 288, marraskuu 1980, ss., 286 - 288), että tiorfaani, [(D,L)-3-mer-kapto-2-bentsyylipropanoyyli]glysiini, on enkefalinaasin inhibiittori in vitro nanomolaarisessa konsentraatiossa 10 ja in vivo sen jälkeen, kun sitä on annettu joko intrake-rebroventrikulaarisen tai systeemisen antotavan mukaan.

Roques et ai. osoittavat (EP-patenttihakemus 38 758), että useilla a-aminohappojohdannaisilla, mukaanluettuina merkaptoalkanoyyli- ja asyylimerkaptoalkanoyyli-15 johdannaiset, on enkefalinaasia ehkäisevää aktiviteettia.

Mumford et ai. osoittavat (Biochemical and Biophysical Research Comm., Voi. 109, n:o 4, 1982, ss. 1303 -1309), että useilla substituoiduilla N-karboksimetyylidi-peptideillä, mukaanluettuina ne, joissa on p-alaniinipää-20 teryhmä, on enkefalinaasia ehkäisevää tehoa.

Berger et ai. esittävät (EP-patenttihakemus 54 862) enkefalinaasia ehkäiseviä peptidejä, joilla on kaava 25 R, R.

i i9

Rx-HC-N-X-CO-NH-CH-(CH2 )y-C0-R6 k jossa R2 on karboksyyli- tai fosfonihappo tai esteri ja Y 30 on 0 tai kokonaisluku välillä 1-3.

Cushman et ai. esittävät (Biochemistry, Voi. 16, n:o 25, 1977, ss. 5484 - 5491) useita karboksialkanoyyli-ja merkaptoalkanoyyliaminohappoja verisuonia supistavaa ainetta muuttavan entsyymin ehkäisyaineina. Esitettyjen 35 yhdisteiden joukossa on yhdiste, jolla on kaava 3 8 Q <_ 5 8 o

(I

hs-(ch2 )2-c-nh-(ch2 )2-cooh

Sundeen et ai. esittävät (US-patenttijulkaisut 5 4 235 885 ja 4 297 275) nisäkkäiden kollagenaasin inhi- biittoreita, joita ovat mm. merkaptoalkanoyyli- ja asyyli-merkaptoalkanoyyliyhdisteet, joilla on kaava (H,C),-CH-CH, 0 R, 0 32 I 2 II i3 tl 10 -s-ch2 -CH —C-NH-(CH2 )m -ch-c-r4 jossa m on 0 tai kokonaisluku välillä 1 - 9, R3 tarkoittaa vetyä ja R4 tarkoittaa hydroksia ja aminoa.

Sundeen et ai. esittävät (US-patenttijulkaisu 15 4 327 111) nisäkkäiden kollagenaasin inhibiittoreita, ja näitä ovat mm. merkaptoalkanoyyli- ja asyylimerkaptoalka-noyyliyhdisteet, joilla on kaava

R, 0 O

i3 II il 20 R2 -s-ch2 -CH-C-NH- (CH2 )n -C-R4 jossa R4 on vety, alkyyli tai aryyli, n on kokonaisluku välillä 1 - 20 ja R3 on alkyyli, jossa on 3 - 8 hiiltä, sykloalkyyli, jossa on 3 - 7 hiiltä, aryyli tai aryylial-25 kyyli.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että asyloidaan yhdiste, jolla on kaava

R, O

r n

30 H2N-CH-(CH2 )n-C-R4 II

hapolla tai sen kemiallisella ekvivalentilla, jolla on kaava 0 R, 0

Il I li

35 R5-C-S-CH -CH-C-OH III

4 80258

Jossa R5 on alempi alkyyli, minkä jälkeen hydrolysoidaan täten muodostunut tuote kaavan I mukaisten yhdisteiden saamiseksi.

Tämä asylointireaktio voidaan suorittaa kytkentä-5 aineen, kuten disykloheksyylikarbodi-imidin tai sen tapaisen läsnäollessa, tai kaavan III mukainen happo voidaan aktivoida muodostamalla sen seka-anhydridi, symmetrinen anhydridi, happohalogenidi, aktiivinen esteri tai käyttämällä Woodward'in reagenssi K:ta, n-etoksikarbonyyli-2-10 etoksi-1,2-dihydrokinoliinia tai sen tapaista. Asylointi-menetelmien katsaus on esitetty teoksessa Methoden der organischen Chemie (Hoyben-Weyl), Voi. XV, osa II (1974), sivulta 1 alkaen. Edullisesti käytetään kaavan III mukaista happohalogenidia, erityisesti happokloridia.

15 Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R4 on NH2 , voidaan valmistaa käyttämällä kaavan II mukaista aminoyh-distettä, jossa amidiryhmä on läsnä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaavan II mukaista välituotetta karboksyyli-happoesterinä, so. R4 on alempi alkoksi, ja sen jälkeen 20 kun asylointireaktio on tapahtunut täydellisesti, käsitellään asyylimerkaptoalkanoyyliaminohappoa ammoniakin meta-noliliuoksen kanssa.

Kaavan II mukaiset amino-välituotteet ovat alalla tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa tunnetuista a-ami-25 nohapoista peräkkäisten homogenaatioiden avulla noudattaen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Ondetti et ai. (Journal of Medicinal Chemistry, 1975, Voi. 18, n:o 7, ss. 761-763).

Kaavan III mukaisia asyylimerkaptokarboksyylihappo-30 välituotteita valmistetaan menetelmien mukaan, joita on selostettu useissa patentti- ja kirjallisuusviitteissä, kuten esimerkiksi seuraavissa:

Ondetti et ai., US-patenttijulkaisut 4 053 651 ja 4 105 776; sekä 35 Sundeen, US-patenttijulkaisut 4 235 885 ja 4 327 111.

Il - Q n r o 5 u u *. sj ö

Edullisia kaavan 1 mukaisia yhdisteitä ovat ne, joissa n on välillä 3-6.

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet sisältävät yksi tai kaksi asymmetristä keskusta, so. kaksi keskusta, kun R3 on 5 joku muu kuin vety. Kaavan I mukaiset yhdisteet esiintyvät siis stereomeerisissä muodoissa tai niiden raseemisissa seoksissa. Kaikkia näitä muotoja voidaan käyttää hyväksi tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä. Edellä kuvatut synteesit voivat käyttää hyväksi lähtöyhdisteitä raseemi-10 sen seoksen tai yksityisen isomeerin muodossa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R4 on hydroksi, muodostavat emäksisiä suoloja useiden epäorgaanisten tai orgaanisten emästen kanssa. Kaavan I mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ovat käyttökelpoisia 15 tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä. Tällaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat alkalimetallisuo-lat, kuten natrium- tai kaliumsuolat, maa-alkalimetalli-suolat, kuten kalsium- tai magnesiumsuolat ja suolat, jotka on johdettu aminohapoista, kuten arginiinistä, lysii-20 nistä jne. Suoloja valmistetaan saattamalla yhdisteen hap-pomuoto, so. R4 on hydroksi, reagoimaan ekvivalentin kanssa emästä lisäämällä toivottu emäsioni väliaineeseen, jossa suola saostuu tai vesipitoiseen väliaineeseen, ja suorittamalla sen jälkeen kylmäkuivaus.

25 Kaavan I mukaiset yhdisteet, jotka sisältävät amii- niryhmän, muodostavat lisäksi happo-additiosuoloja useiden epäorgaanisten ja orgaanisten happojen kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat esimerkiksi hydrohalo-genidit, esim. hydrokloridi, hydrobromidi jne., sulfaatti, 30 fosfaatti, nitraatti, aryylisulfonaatit, esim. kamferisul-fonaatti, bentseenisulfonaatti, tolueenisulfonaatti jne., sitraatti, askorbaatti, maleaatti, fumaraatti, pamoaatti, asetaatti, tartraatti, salisylaatti ja niiden tapaiset. Usein on sopivaa eristää yhdiste muodostamalla happosuola 35 ja seostamalla väliaineessa, johon se on liukenematon.

6 80258

Emäkset muodostavat myös kvaternäärisiä ammoniumsuoloja kvaternisoivien aineiden kanssa, jotka ovat hyväksyttävissä farmaseuttiseen käyttöön. Näitä ovat esim. alemmat al-kyylihalogenidit, kuten metyylikloridi, metyylibromidi, 5 etyylikloridi jne., alemmat alkyylisulfaatit, kuten metyy-lisulfaatti, etyylisulfaatit jne., monosykliset aryyli-(alempi alkyyli)-halogenidit ja sulfaatit, kuten bentsyy-likloridi, bentsyylisulfaatti jne. Tämä toteutetaan saattamalla emäs reagoimaan alkyylihalogenidin, -sulfaatin tai 10 niiden tapaisten kanssa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat nisäkkäälle annettuna käyttökelpoisia analgeettisia aineita niiden enkefa-linaasia inhiboivan aktiviteetin vuoksi. Rajoittamatta tämän keksinnön suojapiiriä mihinkään erityiseen teoriaan 15 tai toimintamekanismiin, on otaksuttu, että endogeeniset opiaatti-pentapeptidit, [Met5]-enkefallini (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) ja [Leu5]-enkefallini (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) ovat hermoärsykkeiden siirtäjiä, joita esiintyy keskushermostossa kipua välittävinä (Hughes et ai., Nature, Voi. 258, 20 joulukuu 1975, ss. 577 - 579), ja että nämä endogeeniset opioidi-peptidit inaktivoituvat funktionaalisesti niiden Gly3-Phe3-peptidisidosten katketessa spesifisen peptidaa-sin, enkefalinaasin, vaikutuksesta, jota otaksutaan olevan aivoissa erityisesti hermopäätteiden luona, missä en-25 kefaliineja vapautuu (Malfroy et ai., Nature, Voi. 276, marraskuu 1978, ss. 523 - 526).

Tämän enkefalinaasin spesifiset inhibiittorit parantavat eristetyistä aivoleikkeistä vapautuneen endogee-nisen enkefaliinin talteenottoa (Patey et ai., Science, 30 Voi. 212, kesäkuu 1981, ss. 1153 -1155) ja aiheuttavat hiirissä analgesiaa, mikä on reversoitu opiaatti-antagonistin, naloksonin avulla (Roques et ai., edellä). Anal-gesian lisäksi voi olla seurauksena muita farmaseuttisia vaikutuksia, kuten yskää ehkäiseviä, tai ripulia ehkäise-35 viä vaikutuksia, kehon luonnollisten opiaattien vaikutuk-

II

7 80258 sen pitkittymisestä, joita opiaatteja vapautuu ääreis-samoin kuin keskushermostoon liittyvistä kohdista.

Niinpä antamalla ainekoostumusta, joka sisältää yhtä tai useampaa kaavan I mukaista yhdistettä tai niiden 5 farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa, kipu lievittyy hoidettavassa nisäkkäässä. Yksinkertainen annos tai edullisesti kahteen tai neljään osaan jaettu päivittäinen annos, mikä tarkoittaa noin 0,1 - noin 100 mg yhdistettä kiloa kohti päivässä, tuottaa toivotun analgeettisen vaikutuk-10 sen. Ainekoostumusta annetaan edullisesti oraalisesti, mutta parenteraalisia antotapoja, kuten subkutaanista antoa voidaan myös käyttää.

Erityisesti on todettu, että kaavan I mukaiset yhdisteet samalla, kun niillä on potentiaalista enkefalinaa-15 siä ehkäisevää tehoa, ovat paljon vähemmän aktiivisia an-giotensiiniä konvertoivaa entsyymiä inhiboivina aineina kuin vastaavat α-aminohappoyhdisteet, joita ovat selostaneet edellä mainitut Odetti et ai. ja Greenberg et ai.. Niinpä kaavan I mukaisten yhdisteiden antaminen tuottaa 20 selektiivisen analgeettisen vaikutuksen, mikä ei ole mahdollista aikaisemmin tunnetuilla a-aminohappoyhdisteillä.

Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää enke-falinaasia ehkäisevinä aineina kivun lievittämiseen muodostamalla niistä koostumuksia, kuten tabletteja, kapse-25 leita tai eliksiirejä yhdisteen oraalista antamista varten tai steriilejä liuoksia tai suspensioita parenteraalista antamista varten. Noin 10 - 500 mg kaavan I mukaista yhdistettä tai yhdisteiden seosta tai niiden fysiologisesti hyväksyttävää suolaa yhdistetään fysiologisesti hyväksyt-30 tävän liuottimen, kantaja-aineen, eksipientin, sideaineen, säilöntäaineen, stabilisoivan aineen, makuaineen jne. kanssa yksikköannosmuotoon, kuten hyväksytty farmaseuttinen käytäntö edellyttää. Aktiivisen aineen määrä näissä koostumuksissa tai valmisteissa on sellainen, että saadaan 35 sopiva annostus ilmoitetuissa rajoissa.

8 80258

Tyypillisiä lisäaineita, joita voidaan sisällyttää tabletteihin, kapseleihin ja niiden tapaisiin, ovat sideaine, kuten traganttikumi, arabikumi, maissitärkkelys tai gelatiini; eksipientti, kuten dikalsium£osfaatti; hajoa-5 mistä edistävä aine, kuten maissitärkkelys, perunatärkkelys, algiinihappo ja niiden tapaiset; voiteluaine, kuten magnesiumstearaatti; makeutusaine, kuten sakkaroosi, laktoosi tai sakkariini; maustamisaine, kuten piparminttu, gaulteria öljy tai kirsikkaöljy. Jos annosyksikkö on kap-10 seli, voi se sisältää edellä mainitun tyyppisten aineiden lisäksi nestemäistä kantaja-ainetta, kuten rasvaöljyä. Erilaisia muita aineita voi olla läsnä pinnoitteina tai muulla tavoin muuttamassa annosyksikön fysikaalista muotoa. Tabletit voivat olla päällystettyjä esimerkiksi sel-15 lakalla, sokerilla tai molemmilla.

Siirappi tai eliksiiri voi sisältää aktiivista yhdistettä, sakkaroosia makeutusaineena, metyyli- ja propyy-liparabeenejä säilöntäaineina, väriainetta ja maustetta, kuten kirsikan tai appelsiinin makuaineita.

20 Steriilejä koostumuksia injektioita varten voidaan muodostaa tavanomaisen farmaseuttisen käytännön mukaan liuottamalla tai suspendoimalla aktiivinen aine liuotti-meen, kuten veteen, luonnossa esiintyvään kasviöljyyn, kuten seesamöljyyn, kookospähkinäöljyyn, maapähkinäöljyyn, 25 puuvillansiemenöljyyn jne. tai synteettistä rasvaa olevaan kantaja-aineeseen, kuten etyylioleaattiin, tai niiden tapaisiin. Puskuriaineita, säilöntäaineita, hapetuksen es-toaineita ja niiden tapaisia voidaan tarvittaessa sisällyttää koostumukseen.

30 Farmakologiset koetulokset

Seuraavat farmakologiset koetulokset kuvaavat EP-patenttijulkaisun 21 766 mukaisen yhdisteen (26 198) enke-falinaasia angiotensiiniä konvertoivaa entsyymiä ACE:tä inhiboivaa vaikutusta. Yhdisteellä on isobutyyliryhmä R2-35 asemassa.

il 9 80258

On myös tutkittu aikaisemmin tunnettua tiorfaania (26 385), jolla on samanlainen hiilirunko kuin yhdisteellä 26 198, mutta jossa on bentsyyli R2-asemassa substituent-tina. Tämä antaa suuremman aktiivisuuden, mikä johtunee 5 R2-asemassa isobutyylin sijasta olevasta bentsyylistä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat tiorfaania vielä parempia, toisin sanoen niillä on suurempi enkefalinaasia ehkäisevä spesifisyys.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat täten erityisen 10 edullisia enkefalinaasi-inhibiittoreita yhdisteeseen 26 198 verrattuna, johtuen R2-asemassa olevasta bentsyyli-substituentista. Sitäpaitsi yhdisteillä on vähemmän ACE:tä ehkäisevää vaikutusta, eli niillä on suurempi spesifiteet-ti sekä yhdisteeseen 26 198 että tiorfääniin nähden.

15 Tunnetut yhdisteet 26 198 (Sundeen) CH3 ^CH3

^CH

l

CH, O O

I II II

hs-ch2 -ch—c-nh-ch2 -c-oh 20 26 385 (Rogues' tiorfaani)

CH, 0 O

i 2 il a hs-ch2 -ch—c-nh-ch2 -c-oh

Kaavan I mukaiset 25 yhdisteet

CH, 0 O

I II II

hs-ch2 -ch—c-nh-ch2 -(ch2 )n -C-OH

n:o_n 28 603 1 30 28 718 2 28 821 3 28 946 4 29 072 5 29 032 6 35 29 222 9 10 80258

Kokeen suoritus

Vaikka enkefalinaasiaktiivisuutta ensin havaittiin sivukudoksissa, munuaisista peräisin olevaa "neutraali endopeptidaasi"-entsyymiä on jonkin aikaa pidetty hyvin 5 samanlaisena, ellei peräti identtisenä. Tavanomaisissa enkefalinaasimäärityksissä käytetään yleensä runsaammin esiintyvää munuais-entsyymiä; B. Malfroy ja J.C. Schwartz, J. Biol. Chem., Voi. 259, n:o 23, 1984, ss. 14365 - 14370; 10 J. Almenoff ja M. Orlowski, J. Neurochem., Voi. 42, 1984, ss. 151 - 157; I. S. Fulcher, R. Matsas, A. J. Turner ja A. J. Kenny, Biochem. J., Voi. 203, n:o 2, 1982, ss. 519 - 522, ja B. Malfroy, P.R. Schofield, W. J. Kuang, P. H. Seeburg, 15 A. J. Mason ja W. J. Henzel, Biochem. Biophys. Res. Com-mun., Voi. 144, n:o 1, 1987, ss. 59 - 66.

Neutraalin endopeptidaasin aktiivisuus in vitro määritetään käyttämällä fluorometrista määritysmenetelmää. Määritys perustuu fluoresoivan dansyloidun tripeptidin, 20 Dns-Gly-Phe-Arg, hajoamiseen, jolloin muodostuu Dns-Gly. Viimeksi mainittu uutetaan happameksi tehdystä seoksesta etyyliasetaatilla ja se on voimakkaasti fluoresoiva.

Määrityksen käytettävä inkubaatioliuos sisältää Dns-Gly-Phe-Arg (0,5 mM) tris(hydroksimetyyli)-aminometaa-25 ni-HCl-puskuria (pH 7,5; 50 mM), entsyymipreparaattia 0,05 %:ssa Triton X-100 ja vettä tai inhibiittoria laimennettuna lopputilavuuteen 0,25 ml. Entsyymipreparaatti puhdistetaan rotan munuaisista Almenoff'in et ai. julkaisussa Biochemistry, Voi. 22, (1983), ss. 590 - 599 kuvaaman me-30 netelmän mukaisesti. Inhibiittori esi-inkuboidaan 10 minuuttia entsyymipreparaatin ja puskurin läsnäollessa ennen kuin reaktio aloitetaan lisäämällä substraattia. In-kubaatio suoritetaan 37°C:ssa 30 minuutin ajan ja reaktio lopetetaan lisäämällä 0,25 ml 1-n HC1 ja uuttamalla Dns-35 Gly-tuote 1,5 ml:aan etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiuut-

II

11 80258 teen suhteellinen fluoresoiva voimakkuus (RFI) määritetään käyttäen Ferrand-spektrometriä heräte- ja emissiovalon aallonpituuden ollessa 342 ja 508 nm, korjattuna nolla-ajan kontrollin RFI:llä ja verrattuna määrityksiin, joissa 5 ei ole inhibiittoria.

Määrityksiä suoritetaan eri konsentraatioilla ja vertaillaan käyttämällä matemaattista mallia lCS0:n määrittämiseksi. IC50 on testattavan yhdisteen sellainen kon-sentraatio, joka inhiboi entsyymiä 50 % risesti.

10 ACE:n inhibiitio in vitro määritetään spektrofoto- metrisesti määrittämällä kvantitatiivisesti synteettisestä hippuryylihistidyylileusiinisubstraatista vapautuva hip-purihappo kanin keuhkoista peräisin olevalla ACErlla, kuten Cushman ja Cheung ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet 15 (D. W. Cushman ja H. S. Cheung, Biochem., Pharmacol., Voi.

20, 1971, ss. 1637 - 1648).

Tulokset IC50 (nM) 20 Neutraali endo- Angiotensiiniä muuttava peptidaasi entsyymi (ACE)

Yhdiste munuaisista (NEP) kanin keuhkoista 26 198 280 1 200 25 26 358 7,4 1 500 28 603 8,9 32 000 28 718 6,0 5 000 28 821 22 240 000 28 946 59 61 000 30 29 072 26 260 000 29 032 20 180 000 29 222 76 39 000 12 80258

Kuten tuloksista ilmenee, yhdiste 26 385 on lähes 40 kertaa tehokkaampi inhiboimaan NEP:iä kuin yhdiste 26 198. Tämä johtuu ilmeisesti R2-asemassa yhdisteen 26 198 isobutyyliryhmän sijasta olevasta bentsyyliryhmäs-5 tä. Valitettavasti tuloksista ilmenee myös, että yhdisteellä 26 385 on huomattava ACE:tä inhiboiva vaikutus. Sen sijaan keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdisteellä 28 603, jossa on bentsyyliryhmä ja yksi ylimääräinen me-tyyliryhmä (koska tässä tapauksessa n ? 0) oli yhdistee-10 seen 26 385 verrattavissa oleva NEP-inhibiitiokyky, mutta se oli huomattavasti selektiivisempi, sillä yhdiste 28 603 oli 20 kertaa vähemmän tehokas inhiboimaan ACE:tä. Muilla tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä saadut tulokset valaisevat edelleen tätä selektiivisyyttä.

15 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat siis paljon tehokkaampia NEP:n inhibiittoreita kuin aikaisemmin tunnetut Sundeen'in yhdisteet. Sitäpaitsi tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden suurempi selektiivi-syys aikaisemmin tunnettuihin Roques'in bentsyyliä sisäl-20 täviin yhdisteisiin verrattuna mahdollistaa tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden käytön NEP-inhibiittoreina kivun lievittämiseksi ehkäisemättä merkittävästi ACE:tä, joka on fysiologisesti tärkeä entsyymi.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

25 Kaikki lämpötilat on annettu Celsius-asteina.

Il π 80258

Esimerkki 1 (+^)-3-/72- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli7~ amino7propionihappo a) (_+) - 3-/72-7(asetyylitio)metyyliJ^-l-okso-3-fenyyli- 5 propyyli^amino7propionihapon etyyliesteri

Liuosta, joka sisältää (_+)-2-/lasetyylitio) metyyli/- 3-fenyylipropionihappoa (0,95 g, 4,0 millimoolia) etyylieet-terissä (8 ml) käsitellään kuivausputkea käyttäen oksalyyli-kloridin (0,37 ml, 4,2 millimoolia) kanssa, jonka jälkeen 10 lisätään varovaisesti katalyyttinen määrä dimetyyliformamidia (3 tippaa). Seosta hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen se väkevöidään tyhjössä. Tetrahydro-furaania (5 ml) lisätään jäännökseen ja poistetaan tyhjössä kaiken jäljellä olevan oksalyylikloridin karkottamiseksi.

15 Jäännöstä, 2-faasista (keltainen ja vihreä) nestettä käsitellään metyleenikloridilla (5 ml) ja liukoinen osa dekantoidaan tiputussuppiloon. Tämä liuos lisätään tipottain typpiatmos-fäärin alaisena kylmään (jää/metanoli) seokseen, jossa on /9-alaniinin etyyliesterin hydrokloridia (0,61 g, 4,0 milli-20 moolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (1,46 ml, 8,38 millimoolia) metyleenikloridissa (10 ml), 10 minuutin kuluessa.

3 tuntia kestäneen hämmentämisen jälkeen suodatetaan muodostunut liete ja väkevöidään. Jäännöstä käsitellään etyyliasetaatin (50 ml) kanssa ja suodatetaan uudelleen ja suodos 25 pestään 10-%:sella kaliumbisulfaattiliuoksella, vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella, ja 50-%:sella ruokasuolaliuoksella (30 ml kutakin), sen jälkeen kuivataan Na2SO^:n avulla ja väkevöidään tyhjössä. Jäännöksenä saatu viskoosinen keltainen öljy (1,20 g) puhdistetaan käyttäen 30 pylvästä, jossa on 80 g piihappogeeliä (230-400 mesh'iä), ja eluoimalla heksaani/asetoni 7:2-seoksella. Fraktiot, jotka sisältävät toivotun tuotteen (TLC=ohutkerroskromato-grafia), yhdistetään ja väkevöidään, jolloin saadaan 1,04 g ( + )-3-/75-7( asetyylitio)metyyli/-l-okso-3-fenyylipropyyli7 35 aminq7propionihapon etyyliesteriä kirkkaana miltei värittömänä öljynä.

14 80258 b) (+) -3-Γ£ΐ- (merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyy-Ii7-amino7propionihappo

Liuos, joka sisältää osasta (a) saatua tuotetta (1,02 g, 3,02 millimoolia) metanolissa (6 ml), jäähdytetään (jää/metano-5 li) ja siihen lisätään typpiatmosfäärin alaisena 1-n natrium-hydroksidia (6,35 ml) 15 minuutin kuluessa. Seosta hämmennetään 3 tuntia samalla kun se pidetään huoneen lämpötilassa (TLC osoittaa epätäydellisen reaktion) ja tämän jälkeen lisätään lisää 1-n natriumhydroksidia (3,0 ml) yhtenä annoksena.

10 Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty vielä 3 tuntia huoneen lämpötilassa, väkevöidään seos noin puoleen tilavuuteen tyhjössä ja jäännös jaetaan veden (50 ml) ja etyyliasetaatin (30 ml) kesken. Vesikerros pestään etyyliasetaatilla (30 ml), pH säädetään arvoon noin 2 väkevällä kloorivetyhapolla ja uu-15 tetaan uudestaan etyyliasetaatilla (3 x 20 ml). Orgaaniset kerrokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuola-liuoksella (30 ml kumpaakin), kuivataan (Na2S04) ja väkevöidään tyhjössä, jolloin saadaan 0,71 g (O-S-ZV^-imerkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli.7-a.minqypropionihappoa valkoisena 20 kiinteänä aineena; sp. 76-82°. TLC (piihappogeeli, tolueeni/ etikkahappo; (4:1).

R^*0,37, vähäinen täplä arvolla 0,07.

Analyysi, lasketut arvot kaavalle C^2H-j7N<3^S: C 58,40; H 6,41; N 5,24? S 11,99 25 Saadut arvot: C 58,17; H 6,34; N 5,15; S 11,85 Esimerkki 2 (+)-4-/Z2-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7-aminoV voihappo 30 a) 4-aminovoihapon metyyliesterin hydrokloridi

Kylmään (-10°) suspensioon, joka sisältää 4-aminovoi-happoa (4,12 g, 40 millimoolia) metanolissa (50 ml), lisätään typpikaasun alaisena tipottain samalla mekaanisesti hämmentäen tionyylikloridia (5,86 ml, 80,0 millimoolia) sellai-35 sella nopeudella, että reaktiolämpötila pysyy välillä -5° --10°. Seosta hämmennetään yön yli lämmittämällä huoneen lämpötilaan, ja sen jälkeen väkevöidään tyhjössä. Harmahtava kiteinen jäännös jauhetaan hienoksi etyylieetterissä (kahdes-

II

15 80258 ti) ja kuivataan tyhjössä, jolloin saadaan 6,25 g 4-aminovoi-hapon metyyliesterin hydrokloridia miltei valkoisena kiinteänä aineena; sp. 118,5 - 122° (pehmenee 90°:ssa).

b) (_+) -4/£>-/"(asetyylitio) metyyli7~l-okso-3-fenyyli-5 propyyli7amino7voihapon metyyliesteri

Oksalyylikloridia (0,37 ml, 4,2 millimoolia) lisätään typpikaasun alaisena liuokseen, joka sisältää (^)-2-^(asetyy-litio)metyyli7~3-fenyylipropionihappoa (0,95 g, 4,0 millimoolia) etyylieetterissä (8 ml). Tätä seosta käsitellään valo rovaisesti katalyyttisellä määrällä dimetyyliformamidia (3 tippaa) ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tyhjössä suoritetun väkevöinnin jälkeen jäännöstä käsitellään tetrahydrofuraanin (10 ml) kanssa ja väke-vöidään uudelleen ylimääräisen oksalyylikloridin poistamisek-15 si. Saatua jäännöstä käsitellään metyleenikloridin (5 ml) kanssa ja liukoinen osa siirretään tiputussuppiloon. Tämä liuos lisätään typpiatmosfäärin alaisena tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°), hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 4-aminovoihapon metyyliesterin hydrokloridia 20 (0,68 g, 4,4 millimoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (1,6 ml, 9,0 millimoolia) metyleenikloridissa (10 ml). Kol-. - men tunnin ajan kylmässä suoritetun hämmentämisen jälkeen keltainen liuos väkevöidään tyhjössä. Jäännöstä käsitellään etyyliasetaatin (60 ml) kanssa, suodatetaan di-isopropyyli-25 etyyliamiinihydrokloridin poistamiseksi ja pestään peräkkäisesti 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä, 50-%:sesti kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla, ja 50-%:sella ruoka-suolaliuoksella (30 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuivataan (Na2SO^) ja väkevöidään, jolloin saadaan vaaleanruskeata 30 kiinteätä ainetta (1,34 g). Tämä kiinteä aine adsorboidaan pieneen määrään piihappogeeliä (230-400 mesh'iä), kuivataan ja lisätään pylvääseen, joka käsittää 80 g tätä samaa pii-' happogeeliä. Eluointi heksaani/asetoni 5:2-seoksella antaa 1,09 g (_+)-4-/*/2-/(asetyylitio)metyyli7-l-okso-3-fenyyli-35 propyyli^amino7voihapon metyyliesteriä valkoisena kiinteänä aineena; sp. 81-82°.

80258 16 c) (_+) -4-/72- (merkap tome tyyli) -l-okso-3-fenyyli-propyyli7-aminq7voihappo

Osasta (b) saatua tuotetta (0,6 g, 1,8 millimoolia) otetaan metanoliin (5 ml) ja jäähdytetään jäähauteessa typ-5 pikaasun alaisena. Tähän liuokseen lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa 1-n natriumhydroksidia (5,4 ml, 3 ekvivalenttia) . Seosta hämmennetään 3 tuntia kylmässä ja sen jälkeen se väkevöidään noin puoleen tilavuuteen tyhjössä. Jäännös laimennetaan vedellä (40 ml), pestään kloroformil-10 la (2 x 15 ml) ja hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä kloorivetyhapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Nämä uutokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella (15 ml kutakin), kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan, jolloin 15 saadaan 0,48 g (_+)-4-/"£2-(merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyy-lipropyyli/amino/voihappoa valkoisena kiinteänä aineena; sp. 94,5 - 101°. TLC (piihappogeeli, bentseeni/etikkahap-po; 4:1) = 0,41.

Analyysi: 20 Lasketut arvot kaavalle C^H^gNO^S: C 59,76; H 6,81; N 4,98; S 11,40

Saadut arvot: C 59,81; H 6,81; N 4,96; S 11,37.

Esimerkki 3 25 (S)-3-/72-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7 aminq7-bentseenivoihappo (isomeeri A) a) (S) -4-fenyyli-3-/'/(fenyylimetoksi)karbonyyli7ami-no^voihapon metyyliesteri (S)-/*3-diatso-2-okso-l-(fenyylimetyyli)propyyli/kar- 30 bamiinihapon fenyylimetyyliesteriä valmistetaan noudattamalla menetelmää, jonka ovat selostaneet Penke et ai. (Helv.

Chim Acta, Voi. 53, s. 1057-1061, 1970), käyttäen isobutyyli-klooriformiaattia etyyliesterissä seka-anhydridin muodostamiseksi.

35 Hopeabentsoaattia (1,0 g, 4,7 millimoolia) sekoite taan trietyyliamiinin (10 ml) kanssa ja sen jälkeen suodatetaan. Määräosa suodosta (noin 0,5 ml) lisätään liuokseen, joka sisältää diatsoyhdistettä (2,0 g, 6,2 millimoolia) li ,, onocp

17 v V L·. sJ O

metanolissa (20 ml). Tällöin tapahtuu kaasun kehittymistä ja seos muuttuu tummaksi. Sen jälkeen kun kupliminen lakkaa (noin 10 minuutin kuluttua), käsitellään seosta lisämäärän kanssa hopeabentsoaattiliuosta (noin 0,5 ml) ja häm-5 mennetään 30 minuuttia. Seosta käsitellään sen jälkeen aktiivisella hiilellä, suodatetaan ja haihdutetaan tyhjössä tummaksi, tervamaiseksi jäännökseksi. Kromatografia Florisil-pylvään läpi (eluenttina etyylieetteri) tuottaa 1,5 g (S) -4-fenyyli-3-/’/1[fenyylimetoksi) karbonyyljj7aminq7voihapon 10 metyyliesteriä vaaleankeltaisena kiinteänä aineena.

b) (S)-3-amino-4-fenyylivoihapon metyyliesterin p-tolueenisulfonihapposuola

Liuosta, joka sisältää (S)-4-fenyyli-3-/Y"(f enyyli-metoksi)-karbonyyli7amino7voihapon metyyliesteriä (1,64 g, 15 5,0 millimoolia) ja p-tolueenisulfonihappomonohydraattia (0,95 g, 1,0 ekvivalenttia) 95-%:sessa etanolissa (30 ml), käsitellään argon-kaasun alaisena 100 mg:n kanssa 10-%:sta palladium/hiilikatalysaattoria. Seosta hämmennetään vetykaa-sun ylipaineen alaisena 1,5 tuntia, sen jälkeen suodatetaan 20 ja haihdutetaan, jolloin saadaan harmahtava jäännös. Uudel-leenkiteytys asetonitriilistä (suodatus kuumana) antaa 1,44 g (S)-3-amino-4-fenyylivoihapon metyyliesterin p-tolueenisul-fonihapposuolaa neulamaisina valkoisina kiteinä; sp. 168,5 -T: 170,5°; + 7/0° <c = 1,05, metanoli) .

V; 25 c) (s) -3-/'/2-/‘(asetyylitio) metyyli/-l-okso-3-fenyyli- propyyli*7amino<7bentseenivoihapon metyyliesteri (isomeeri A)

Oksalyylikloridia (1,1 ekvivalenttia) lisätään argon-kaasun alaisena liuokseen, joka sisältää (_+)-2-/’(asetyyli-tio)metyyli7-3-fenyylipropionihappoa (0,92 g, 3,9 millimoolia) 30 etyylieetterissä (30 ml). Tätä liuosta käsitellään varovaisesti dimetyyliformamidin (2 tippaa) kanssa ja hämmennetään 45 minuuttia. Seos väkevöidään tyhjössä ja jäännös otetaan * metyleenikloridiin (5 ml). Tämä liuos lisätään argonkaasun alaisena tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (jää/metanoli) 35 liuokseen, joka sisältää (S)-3-amino-4-fenyylivoihapon metyyliesterin p-tolueenisulfonihapposuolaa (1,41 g, 3,84 millimoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (1,35 ml, 7,75 millimoolia) metyleenikloridissa (20 ml). Seosta hämmennetään 18 80258 3 tuntia lämmittäen huoneen lämpötilaan ja sen jälkeen vä-kevöidään. Jäännös jaetaan 50-%:sesti kyllästetyn natriumbikarbonaatin (100 ml) ja etyyliasetaatin (3 x 30 ml) kesken. Orgaaniset kerrokset yhdistetään, pestään vedellä, 5 10-%:sella kaliumbisulfaatilla ja väkevällä ruokasuolaliuok- sella (50 ml kutakin), kuivataan (^250^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,57 g hitaasti kiteytyvää keltaista öljyä. Tämä öljy lisätään pylvääseen, jonka muodostaa 160 g pii-happogeeliä (230-400 mesh'iä) (adsorboituna etukäteen pie-10 neen määrään samaa geeliä) ja eluoidaan 26-%:sella etyyli-asetaatti/petroolieetteriliuoksella. Ne fraktiot, jotka sisältävät vain nopeasti liikkuvaa isomeeriä, yhdistetään ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,072 g (S)-3-/72-/*(ase-tyylitio)metyyli7-l-okso-3-fenyyli-propyyli7aminq7bentsee-15 nivoihapon metyyliesteriä (isomeeri A) valkoisena kiteisenä aineena; sp. 87-88,5°;\cQ - 77,5° (c=:0,96, klo roformi) .

d) (S) -3-/2.2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipro-PyyliJ-amino^bentseenivoihappo (isomeeri A) 20 Liuokseen, joka sisältää osasta (c) saatua tuotetta (0,35 g, 0,85 millimoolia) metanolissa (2 ml) lisätään ar-gonkaasun alaisena tipottain 10 minuutin kuluessa 1-n nat-riumhydroksidia (1,87 ml, 2,2 ekvivalenttia). Kahden tunnin kuluttua lisätään lisää 1-n natriumhydroksidia (0,7 ml) 25 ja seosta käsitellään riittävän metanolimäärän kanssa sakan liuottamiseksi. 7 tuntia kestäneen hämmennyksen jälkeen : huoneen lämpötilassa metanoli haihdutetaan pois tyhjössä.

Jäännös laimennetaan vedellä ja käsitellään 2-n natriumhyd-roksidilla kiinteiden aineiden liuottamiseksi ja sen jälkeen 30 uutetaan etyyliasetaatilla (2 x 30 ml) ja heksaanilla (30 ml). Vesikerros hapotetaan pH-arvoon noin 1,0 väkevällä kloorive-tyhapolla ja uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 20 ml). Nämä : orgaaniset faasit yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä :· ruokasuolaliuoksella (30 ml kutakin), kuivataan (Na2SO^)

35 ja haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan 0,23 g (S)-3-^7~2-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7-aminq7bentseeni-voihappoa (isomeeri A) valkoisena kiinteänä aineena; sp. 149 - 151,5°; + 40,3° (c = 1,0, metanoli). TLC

(piihappogeeli, 7:1 bentseeni/etikkahappo) = 0,40.

Il 19 80258

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle C20H23N<93S: C 67,20; H 6,49; N 3,92; S 8,97 Saadut arvot: C 66,86; H 6,45; N 3,93; S 8,71 5 Esimerkki 4 (S)-3-/Z2-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyy-liyamino/’-bentseenivoihappo (isomeeri B) a) (S) -3-/72-/~(asetyylitio) metyyli7-l-okso-3-fe-nyylipropyyli7aminq7bentseenivoihapon metyyliesteri (iso- 10 meeri B)

Noudattaen esimerkin 3 (c) menettelytapaa yhdistetään ne fraktiot, jotka sisältävät hitaampaa isomeeriä, ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,67 g (S) -3-/",/2-/"(ase- tyyli tio) metyyli7-l-okso-3-f enyylipropyyli7amino_7bent-15 seenivoihapon metyyliesteriä (isomeeri B) valkoisena kiinteä nä aineena; sp. 93,5 - 95°;/θί7^ + 55,4° (c = 1,C0, kloroformi) .

b) (S) -3-^2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipro-pyyli7-amina/bentseenivoihappo (isomeeri B) 20 Argonkaasun alaisena olevaan hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää osasta (a) saatua tuotetta (0,35 g, 0,85 milli-moolia) metanolissa (3 ml), lisätään tipottain 15 minuutin kuluessa liuos, joka sisältää natriumhydroksidia (0,102 g, 3 ekvivalenttia) 20-%:sessa metanolin vesiliuoksessa (1,5 ml). 25 Kuuden tunnin hämmentämisen jälkeen huoneen lämpötilassa reaktio on vielä epätäydellinen (TLC) , jonka vuoksi reaktio-seokseen lisätään lisämäärä natriumhydroksidia (0,85 ml 1-n natriumhydroksidin vesiliuosta) ja seosta säilytetään yön yli kylmässä (jääkaappi). Seuraavana päivänä metanoli 30 poistetaan tyhjössä ja jäännös jaetaan veden (40 ml) ja etyyliasetaatin (2 x 25 ml) kesken. Vesikerros hapotetaan väkevällä suolahapolla pH-arvoon noin 1,0, ja sen jälkeen uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 20 ml) . Nämä uutokset : . yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuok- 35 sella (30 ml kumpaakin), kuivataan (Ν3250^) ja haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan 0,30 g (S)-3-/*/*2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli7amino7bentseenivoihappoa (isomeeri B) valkoisena kiinteänä aineena; sp. 148 - 150°; f\oö7q6 -28,9° (c = 1,07, metanoli). TLC (piihappogeeli, 40 7:1 bentseeni/etikkahappo) = 0,34.

2° 80258

Analyysi :

Lasketut arvot kaavalle C20H23NO3S: C 67,20; H 6,49; N 3,92; S 8,97

Saadut arvot: C 66,95; H 6,53; N 3,82; S 8,82.

5 Esimerkki 5 (+_) -S-f Cl- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli/- aminq7valeriaanahappo a) 5-aminovaleriaanahapon metyyliesterin hydrokloridi Tionyylikloridia (2,93 ml, 40 millimoolia) lisätään 10 tipottain samalla hämmentäen kylmään suspensioon, joka sisältää 5-aminovaleriaanahappoa (2,34 g, 20 millimoolia) metanolis-sa (25 ml) sellaisella nopeudella, että reaktiolämpötila pysyy välillä -5° - -10°. Sen jälkeen kun tionyylikloridin lisäys on suoritettu, annetaan seoksen lämmetä huoneen lämpötilaan 15 ja sitä hämmennetään yön yli. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan valkoisia kiteitä, jotka jauhetaan hienoksi eetterissä (kahdesti) ja näin saadaan 2,68 g 5-aminovaleriaanahapon metyyliesterin hydrokloridia valkoisena kiinteänä aineena; sp. 132-137° (pehmenee 86°:ssa).

20 b) (jO-5-£22-Z"lasetyylitio)metyyli7-l-okso-3-fenyyli- propyyli/amino^valeriaanahapon metyyliesteri

Oksalyylikloridia (0,45 ml, 5,2 millimoolia) lisätään liuokseen, joka sisältää (_+)-2-/”(asetyylitio) metyyli7-3-fe-nyylipropionihappoa (1,19 g, 5 millimoolia) etyylieetterissä 25 (10 ml). Tätä seosta käsitellään varovaisesti katalyyttisen määrän (3 tippaa) kanssa dimetyyliformamidia ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan öljyä, joka liuotetaan tetrahydrofuraaniin (10 ml) ja haihdutetaan uudelleen tyh-30 jössä. Saatu jäännös liuotetaan metyleenikloridiin (6 ml) ja lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°), hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 5-aminovaleriaanaha-pon etyyliesterin hydrokloridia (0,91 g, 5,4 millimoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (1,96 ml, 11,25 millimoo-35 lia) metyleenikloridissa (11 ml). Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty kylmässä (-5°) 2,5 tuntia, annetaan sen lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään yön yli. Seuraavana päivänä seos väkevöidään tyhjössä ja jäännös otetaan etyyliasetaattiin (60 ml) ja suodatetaan di-iso-40 propyylietyyliamiinihydrokloridin poistamiseksi. Suodos

II

21 80258 pestään peräkkäisesti 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä, 50-%:sesti kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla ja 50-%:sella ruokasuolaliuoksella (3 x 20 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuivataan (Na2S0^) ja haihdutetaan, jolloin saa-5 daan hyvin vaaleankeltaista öljyä (1,49 g). Tämä öljy lisätään pylvääseen, jonka muodostaa 115 g piihappogeeliä (230-400 mesh'iä), ja eluoidaan heksaani/asetoni 5:2-seoksella, jolloin saadaan 1,41 g (_+)-5-//2-/"(asetyylitio) metyyli7-l-okso- 3-fenyylipropyyli/amino/valeriaanihapon metyyliesteriä värit-10 tömänä öljynä.

c) (j^) -5-ΓΟ-- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipro-pyylijaminoyvaleriaanahappo 1-n natriumhydroksidia (12,9 ml, 3,8 ekvivalenttia) lisätään tipoittain 10 minuutin kuluessa jäähdytettyyn liuok-15 seen (jäähaude), joka sisältää osasta (b) saatua tuotetta (1,20 g, 3,41 millimoolia) liuotettuna metanoliin (13 ml), typpiatmosfäärin alaisena. Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään 3 tuntia. Seos haihdutetaan puoleen ti-20 lavuuteen tyhjössä. Jäännös laimennetaan vedellä (40 ml), pestään kloroformilla (2 x 20 ml) ja hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä suolahapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Nämä orgaaniset uutokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä 25 ruokasuolaliuoksella (20 ml kumpaakin), kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan valkoista vahamaista kiinteätä ainetta (0,82 g). Tämä kiinteä aine liuotetaan etyyliasetaattiin, suodatetaan, haihdutetaan ja jäännös jauhetaan hienoksi eetterin kanssa, jolloin saadaan (_+) -30 5-/-/2- (merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7amino7va- leriaanahappoa valkoisena kiinteänä aineena; sp. 78-79°.

TLC (piihappogeeli, bentseeni/etikkahappo 4:1) = 0,30 (vähäinen hännänmuodostus).

Analyysi: 35 Lasketut arvot kaavalle C.cHo-N0oS: 15 21 3 C 60,99; H 7,17; N 4,74; S 10,85

Saadut arvot: C 60,80; H 7,15; N 4,62; S. 10,73.

22 60258

Esimerkki 6 (+)-6-[[2-(merkaptometyyli)-l-okso-l-fenyylipropyyli^-aminojkapron ihappo a) 6-aminokapronihapon metyyliesterin hydrokloridi 5 Tionyylikloridia (2,93 ml, 40 millimoolia) lisätään tipottain samalla hämmentäen kylmään suspensioon, joka sisältää 6-aminokapronihappoa (2,62 g, 20 millimoolia) metanolis-sa (25 ml) sellaisella nopeudella, että reaktiolämpötila pysyy välillä -5° - -10°. Sen jälkeen kun tionyylikloridin lisäys on suoritettu, annetaan seoksen lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään 4 tuntia. Seos haihdutetaan sen jälkeen tyhjössä, jolloin saadaan valkoista kiinteätä ainetta, jota jauhetaan hienoksi eetterissä (kahdesti) ja tällöin saadaan 3,53 g 6-aminokapronihapon metyyliesterin hydroklo-15 ridia valkoisena kiinteänä aineena; sp. 114-118° (pehmenee 109°:n yläpuolella).

b) (+_) -6-/T"2-£(asetyylitio) metyyli7-l-okso-3-f enyy-1 ipropyyli.7amino/kapronihapon metyy 1 iesteri

Oksalyylikloridia (0,45 ml, 5,2 millimoolia) lisätään 20 liuokseen, joka sisältää ( + )-2-/’(asetyylitio)metyyli7-3-fe-nyylipropionihappoa (1,19 g, 5 millimoolia) etyylieetteris-sä (10 ml). Tätä seosta käsitellään varovaisesti katalyyttisen määrän (3 tippaa) kanssa dimetyyliformamidia ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos 25 haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan öljyä, joka liuotetaan tetrahydrofuraaniin (10 ml) ja haihdutetaan uudelleen tyhjössä. Saatu jäännös liuotetaan metyleenikloridiin (6 ml) ja liuos lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°) hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 6-aminokapro-30 nihapon metyyliesterin hydrokloridia (0,98 g, 5,4 millimoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (1,96 ml, 11,25 millimoolia) metyleenikloridissa (11 ml). Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty kylmässä (-5°) 2,5 tuntia, annetaan sen lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään 2 tuntia. Seos -f 35 haihdutetaan tyhjössä ja jäännös otetaan etyyliasetaattiin (60 ml) ja suodatetaan di-isopropyylietyyliamiinihydroklo-ridin poistamiseksi. Suodos pestään peräkkäisesti 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä, 50-%:sesti kyllästetyllä nätit 23 80258 riumbikarbonaatilla ja 50-%:sella ruokasuolaliuoksella (3 x 20 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,64 g (_+)-6-/72~7(asetyy-litio) metyyl j,7-l-okso-3-fenyylipropyyll7aminq7kapronihapon 5 metyyliesteriä vaaleankeltaisena kiinteänä aineena; sp. 50-54° (sintrautuu 39°:n yläpuolella).

c) (jO -6-/Y*2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipro-pyyli/amino7kapronihappo 1-n natriumhydroksidia (12 ml, 3 ekvivalenttia) lisä-10 tään typpiatmosfäärin alaisena tipottain 10 minuutin kuluessa jäähdytettyyn (jääkylpy) liuokseen, joka sisältää osasta (b) saatua tuotetta (1,46 g, 3,99 millimoolia) liuotettuna metanoliin (12 ml). Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja 15 hämmennetään 3 tuntia. Seos haihdutetaan puoleen tilavuuteen tyhjössä. Jäännös laimennetaan vedellä (40 ml), pestään kloroformilla (2 x 20 ml) ja vesiosa hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä suolahapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Nämä uutokset 20 yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella (20 ml kumpaakin), kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan väritöntä öljyä (1,23 g). Tämä öljy lisätään pylvääseen, jonka muodostaa 80 g piihappoa (230-400 mesh'iä) ja eluoidaan 20-%:sella etikkahapon tolueeni-liuoksella, jol-25 loin saadaan väritöntä öljyä (0,99 g). Tämä öljy kromatogra- foidaan uudestaan käyttämällä 75 g piihappoa (230-400 mesh'iä) ja eluoimalla 15-%:sella etikkahapon tolueeni-liuoksella, jolloin saadaan väritöntä öljyä (0,75 g). Tämä aine lisätään sen jälkeen pylvääseen, jonka muodostaa (Silic AR CC-4)-pii-30 happo, ja eluoidaan kloroformilla lisäämällä asteettain etyyliasetaattia (10 %-»40 % etyyliasetaattia), jolloin saadaan valkoista kiinteätä ainetta (0,67 g). Tämä kiinteä aine jauhetaan hienoksi heksaani/eetteri-seoksen kanssa, jolloin saadaan 0,456 g (+j-6-/72-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7-35 amino./kapronihappoa valkoisena kiinteänä aineena; sp. 58-60°. TLC (piihappo, tolueeni/etikkahappo 4:1) = 0,26 (vähäinen hännänmuodostus).

2* SQ258

Analyysi :

Lasketut arvot kaavalle C16H23N03S . 0.18 I^O: C 61,46; H 7,53; N 4,48; S 10,25 Saadut arvot: C 61,46; H 7,47; N 4,40; S 10,14.

5 Esimerkki 7 (_+) -5-/7*2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-f enyylipropyyli7~ aminq/valeriaanahapon metyyliesteri ( + )-5-/Z2-/'(asetyylitio)metyyll7-l-okso-3-fenyylipro-pyylifc7aminq7valeriaanahapon metyyliesteriä (1,93 g, 5,5 mil-10 limoolia) liuotetaan metanoliin (10 ml) ja jäähdytetään jää-kylvyssä typpiatmosfäärin alaisena. 1-n natriumhydroksidia (5,5 ml, 1,0 ekvivalenttia) lisätään tähän liuokseen tipot-tain 10 minuutin kuluessa. Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpöti-15 laan ja hämmennetään tunnin ajan. Seos haihdutetaan puoleen tilavuuteen tyhjössä. Jäännös laimennetaan vedellä (20 ml) ja uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Orgaaniset kerrokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuo-laliuoksella (15 ml kumpaakin), kuivataan (Na2SO^) ja haih-20 dutetaan, jolloin saadaan 1,68 g väritöntä öljyä. Tämä öljy lisätään pylvääseen, jonka muodostaa noin 125 g toiminimen »Merck piihappogeeliä (230-400 mesh'iä), ja eluoidaan hek-saani/asetoni-(5:3)-seoksella, jolloin saadaan 1,34 g (+j -5-//2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-f enyylipropyyli/amino_7-25 valeriaanahapon metyyliesteriä valkoisena kiinteänä aineena; sp. 39-41°. TLC (piihappogeeli, heksaani/asetoni 5:3) = 0,29 (vähäinen hännänmuodostus).

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle: C.,HnoN0oS:

Ib zj j 30 C 62,11; H 7,49; N 4,53; S 10,36; SH 10,69

Saadut arvot: C 61,86; H 7,54; N 4,50; S 10,21; SH 10,62.

Esimerkki 8 (jO -7-//2-/"(asetyylitio)metyyli/-l-okso-3-fenyylipro-pyyliyaminoyenantyylihapon metyyliesteri 35 a) 7-aminoenantyylihapon metyyliesterin hydrokloridi (1:1)

Tionyylikloridia (1,81 ml, 24,8 millimoolia)lisätään tipottain samalla hämmentäen kylmään suspensioon, jossa on 7-aminoenantyylihappoa (1,8 g, 12,4 millimoolia) metanolis-

II

25 8 D 2 5 8 sa (30 ml), sellaisella nopeudella, että reaktiolämpötila pysyy välillä -5° - -10°. Sen jälkeen kun tionyylikloridi-määrä on kokonaan lisätty, annetaan seoksen lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään yli yön. Sen jälkeen seos 5 haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan valkoista kiinteätä ainetta, joka jauhetaan hienoksi eetterissä (kahdesti) ja tällöin saadaan 2,38 g 7-aminoenantyylihapon metyylieste-rin hydrokloridia (1:1) valkoisena kiinteänä aineena; sp. 132-134° (sintrautuu 118°:n yläpuolella).

10 b) (JO-7-/’/2-/’(asetyylitio)metyyliy-l-okso-3-fenyy- 1ipropyy1 iJaminojenantyylihapon metyyliesteri

Oksalyylikloridia (0,67 ml, 7,69 millimoolia) lisätään liuokseen, joka sisältää 3-asetyylitio-2-bentsyylipro-pionihappoa (1,83 g, 7,67 millimoolia) etyylieetterissä 15 (15 ml). Tätä seosta käsitellään varovaisesti katalyyttisen määrän (2 tippaa) kanssa dimetyyliformamidia ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan öljyä, joka liuotetaan tetrahydrofuraaniin (15 ml) ja haihdutetaan uudelleen tyh-20 jössä. Saatu jäännös luotetaan metyleenikloridiin (15 ml) ja lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°), hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 7-aminoenantyyli-·: hapon metyyliesterin hydrokloridia (1:1) (1,50 g, 7,67 mil limoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (2,68 ml, 15,38 mil-25 limoolia) metyleenikloridissa (15 ml). Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty kylmässä (-5°) 2,5 tuntia, annetaan sen : lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään yli yön.

' Seos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös otetaan etyyliasetaat tiin (100 ml) ja suodatetaan di-isopropyylietyyliamiinihyd-30 rokloridin poistamiseksi. Suodos pestään peräkkäisesti 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä, 5-%:sesti kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla, vedellä ja 50-%:sella ruokasuo-laliuoksella (3 x 30 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuiva-taan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,60 g val-35 koista kiinteätä ainetta. Tämä aine kiteytetään uudelleen heksaani/etyyliasetaattiseoksesta, jolloin saadaan 2,48 g (+)-7-/Z2-7"(asetyylitio)metyyli/-l-okso-3-fenyylipropyyli7- amino^enantyylihapon metyyliesteriä valkoisena kiinteänä 26 80258 aineena, sp. 84-85° (sintrautuu 51°:n yläpuolella). TLC (piihappogeeli, etyyliasetaatti/heksaani 2:1) Rf = 0/45. Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle: <2ο_Η,,ηΝ0 .S: 20 29 4 5 C 63,30; H 7,70; N 3,69; S 8,45

Saadut arvot: C 63,01; H 7,57; N 3,51; S 8,40.

Esimerkki 9 (_+) -7-/Y2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyy-1x7amino7enantyylihappo 10 (+) -7-/’/2-if(asetyylitio)metyyli7’-l-okso-3-fenyyli- propyyli^amino7enantyylihapon metyyliesteriä (1,65 g, 4,3 millimoolia) liuotetaan metanoliin (20 ml) lämmittämällä ja sen jälkeen jäähdytetään jäähauteessa typpiatmos-fäärin alaisena. Tähän liuokseen lisätään tipottain 10 15 minuutin kuluessa 1-n natriumhydroksidia (13 ml, noin 3 ekvivalenttia). Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään 3 tuntia. Seos haihdutetaan tyhjössä kaiken metanolin poistamiseksi. Jäännös laimennetaan vedellä 20 (40 ml), pestään kloroformilla (2 x 20 ml) ja vesiosa hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä kloorivetyhapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Nämä uutokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella (20 ml kutakin), kuivataan 25 (Na2SC>4) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,32 g valkoista kiinteätä ainetta. Tämä aine lisätään pylvääseen, jonka muodostaa noin 90 g toiminimen Merck piihappogeeliä (230-400 mesh'iä), ja eluoidaan tolueeni/etikkahappo (7:1)-seoksella, jolloin saadaan 1,14 g valkoista kiinteätä ainetta. Tämä 30 aine lisätään sen jälkeen piihappogeelin (SilicAR CC-4) muodostamaan pylvääseen ja eluoidaan kloroformilla lisäämällä siihen asteettain etyyliasetaattia (10 *—>55 % etyyliasetaattia), jolloin saadaan 1,05 g (+^)(merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli./aminoi7enantyylihappoa valkoi-35 sena kiinteänä aineena; sp. 71-73° (sintrautuu 65°:n yläpuolella). TLC (piihappogeeli, bentseeni/etikkahappo 4:1) = 0,36 (jälkiä arvolla 0,27).

27 80258

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle: C. _H„,.NO^S:

1 / 25 J

C 63,13; H 7,79; N 4,30; S 9,91, SH 10,22

Saadut arvot: C 63,36; H 7,91; N 4,21; S 9,57; SH 9,89.

5 Esimerkki 10 (±)-Ί-Γ&·- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli7amino_7-enantyylihapon metyyliesteri (_+) -7-/T2-Z"(asetyylitio)metyyli7-l-okso-3-fenyylipro- pyyli/amino/enantyylihapon metyyliesteriä (1,43 g, 3,77 mil-10 limoolia) liuotetaan metanoliin (30 ml) lämmittämällä ja sen jälkeen liuos jäähdytetään jääkylvyssä typpiatmosfäärin alaisena. Tähän liuokseen lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa 1-n natriumhydroksidia (3,77 ml, 1,0 ekvivalenttia). Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen 15 annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään tunnin ajan. Seos haihdutetaan tyhjössä kaiken metanolin poistamiseksi. Jäännös laimennetaan vedellä (20 ml) ja uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Nämä orgaaniset kerrokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuok-20 sella (15 ml kumpaakin), kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,26 g valkoista kiinteätä ainetta. Tämä aine liuotetaan 25 ml:aan metanolin ja veden l:l-seosta ja pH säädetään arvoon noin 1,0 väkevällä suolahapolla. Tähän liuokseen lisätään sinkkipölyä (80 mg) ja seosta hämmenne-25 tään huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Jäljellä oleva sinkki erotetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan tyhjössä kaiken metanolin poistamiseksi. Jäännös laimennetaan vedellä (20 ml) ja sen jälkeen uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 25 ml). Nämä orgaaniset kerrokset yhdistetään, pestään 30 5-%:sella natriumbikarbonaatilla, vedellä ja väkevällä ruo-kasuolaliuoksella (2 x 20 ml kutakin), kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,23 g valkoista kiinteätä ainetta. Tämä aine puhdistetaan pikakromatografiän avulla käyttäen 50 g toiminimen Merck piihappogeeliä (230-400 35 mesh'ia) ja eluoimalla etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 980 mg valkoista kiinteätä ainetta. Tämä aine otetaan metanoliin, suodatetaan selluloosamikrosuodattimen läpi ja haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan (+j-1-CC2-(merkapto-metyyli)-l-okso-3-fenyylipropyyli7amino/enantyylihapon me- 28 80258 tyyliesteriä, Sp. 68°-70°. TLC (piihappogeeli, bentseeni/-etikkahappo 4:1) = 0,44.

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle: C.jgl^-yNO^S: 5 C 64,06; H 8,06; N 4,15; S 9,50; SH 9,80

Saadut arvot: C 64,33; H 8,14; N 3,99; S 9,45; SH 9,79.

Esimerkki 11 (j-) -8-ΓΟ·~ (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli7-amino7kapryylihappo 10 a) 8-aminokapryylihapon metyyliesteri-hydrokloridi(1:1)

Tionyylikloridia (2,93 ml, 40 millimoolia) lisätään ti-pottain samalla hämmentäen kylmään suspensioon, joka sisältää 8-arninokapryylihappoa (3,18 g, 20 millimoolia) metanolis-sa (25 ml) sellaisella nopeudella, että reaktiolämpötila 15 pysyy välillä -5 - -10°. Sen jälkeen kun koko tionyyliklo-ridimäärä on lisätty, annetaan seoksen lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään yön yli. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan valkoista kiinteätä ainetta, joka jauhetaan hienoksi eetterissä (kahdesti), jolloin saadaan 20 3,89 g 8-aminokapryylihapon metyyliesterin hydrokloridia (1:1) valkoisena kiinteänä aineena; sp. 130-132°.

b) (_+) -8-/72-Z.(asetyylitio)metyyli/-l-okso-3-fenyy-lipropyyli/amino7kapryylihapon metyyliesteri

Oksalyylikloridia (0,45 ml, 5,2 millimoolia) lisä-25 tään liuokseen, joka sisältää 3-asetyylitio-2-bentsyylipropio-nihappoa (1,19 g, 5 millimoolia) etyylieetterissä (10 ml).

Tätä seosta käsitellään varovaisesti katalyyttisen määrän (3 tippaa) kanssa dimetyyliformamidia ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos haihdutetaan 30 tyhjössä, jolloin saadaan öljyä, joka liuotetaan tetrahydro-furaaniin (10 ml) ja haihdutetaan uudelleen tyhjössä. Saatu jäännös liuotetaan metyleenikloridiin (6 ml) ja lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°), hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 8-aminokapryylihapon metyylieste-35 rin hydrokloridia (1:1) (1,06 g, 5,1 millimoolia) ja di-iso- propyylietyyliamiinia (1,96 ml, 11,25 millimoolia) metylee-nikloridissa (11 ml). Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty kylmässä (-5°) 2,5 tuntia, annetaan sen lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään yön yli. Seos haihdutetaan sen jäl-

II

29 80258 keen tyhjössä ja jäännös otetaan etyyliasetaattiin (60 ml) ja suodatetaan di-isopropyylietyyliamiini-hydrokloridin poistamiseksi. Suodos pestään peräkkäisesti 10'%:sella kaliumbi-sulfaatilla, vedellä, 5-%:sesti kyllästetyllä natriumbikar-5 bonaattiliuoksella, vedellä ja 50-%:sella ruokasuolaliuok- sella (3 x 20 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,01 g vaaleankeltaista kiinteätä ainetta. Tämä aine liuotetaan etyyliasetaattiin ja adsorboidaan pieneen määrään toiminimen 10 Merck piihappogeeliä (230-400 mesh'iä). Tämä aine lisätään sen jälkeen pylvääseen, jonka muodostaa noin 125 g samaa piihappoa, ja eluoidaan heksaani/etyyliasetaatti (1:1)-seoksella , jolloin saadaan 1,69 g (j+) -8-/72-/lase-tyylitio)metyyliT-l-okso-S-fenyylipropyyli/aminoJkapryy-15 lihapon metyyliesteriä valkoisena kiinteänä aineena; sp. 44 - 45°.

c) (j^) -8-/72- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipro-pyylijamino/kapryy1ihappo

Osasta (b) saatua metyyliesterituotetta (1,69 g, 20 4,3 millimoolia) liuotetaan metanoliin (13 ml) ja liuos jääh dytetään jäähauteessatyppiatmosfäärin alaisena. Tähän liuokseen lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa 1-n natriumhyd-roksidia (13 ml, noin 3 ekvivalenttia). Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huo-25 neen lämpötilaan ja hämmennetään 4 tuntia. Tätä liuosta huuh-dellaan sen jälkeen argonkaasulla ja sitä säilytetään jääkaapissa yön yli. (Valkoista sakkaa muodostuu sen jälkeen kun liuosta on hämmennetty noin 3,5 tuntia). Lisätään me-tanolia ja liuos haihdutetaan tyhjössä kaiken metanolin 30 poistamiseksi. Jäännös laimennetaan vedellä (40 ml), pestään kloroformilla (2 x 20 ml) ja vesiosa hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä suolahapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 15 ml). Uutokset yhdistetään, pestään vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella 35 (20 ml kumpaakin), kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan, jol loin saadaan 720 mg valkoista kiinteätä ainetta. Alkuperäi-. . nen kloroformikerros uutetaan uudelleen 1-n natriumhydrok- sidilla (2 x 15 ml). Vesiosa hapotetaan, yhdistetään aikaisemmin hapotetun kerroksen kanssa ja uutetaan etyyliasetaa-40 tiliä (2 x 20 ml). Nämä uutokset pestään vedellä ja väkeväl- 80258 3 0 lä ruokasuolaliuoksella, kuivataan ja haihdutetaan, jolloin saadaan vielä 380 mg valkoista kiinteätä ainetta. Nämä kaksi erää kiinteätä ainetta yhdistetään, jolloin saadaan 1,10 g (±)-8-//2- (merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyylij’-5 amino7kapryylihappoa; sp. 81-83° (sintrautuu 68°:n yläpuolella). TLC (piihappogeeli, bentseeni/etikkahappo 4:1)

Rf = 0,42.

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle C1QH„_N0oS: lo & / 3 10 C 64,06; H 8,06; N 4,15; S 9,50; SH 9,80

Saadut arvot: C 63,77; H 7,84; N 4,12; S 9,18; SH 9,66.

Esimerkki 12 (+j -11-//2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyy-li7amino7undekaanihappo 15 a) 11-aminoundekaanihapon metyyliesterin hydroklo- ridi (1:1)

Tionyylikloridia (5,84 ml, 80 millimoolia) lisätään tipottain samalla hämmentäen kylmään suspensioon, jossa on 11-aminoundekaanihappoa (8,05 g, 40 millimoolia) metanolis-20 sa (50 ml) sellaisella nopeudella, että reaktiolämpötila pysyy välillä -5 - -10°. Sen jälkeen kun koko tionyyliklo-ridimäärä on lisätty, annetaan seoksen lämmetä huoneen lämpötilaan. Tällöin muodostuu valkoista sakkaa, joka liuotetaan lisäämällä seokseen vielä 50 ml metanolia. Reaktio-25 seosta hämmennetään huoneen lämpötilassa yön yli. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan valkoista kiinteätä ainetta, joka jauhetaan hienoksi eetterissä (kahdesti) ja tällöin saadaan 7,26 g 11-aminoundekaanihapon metyyliesterin hydrokloridia (1:1); sp. 155-158°.

30 b) (_+) -ll-/~^2-/f(asetyylitio) metyyliy-l-okso-3-fenyy- 1 ipropyy 1 i,7amino./undekaan ihapon me tyy 1 ie s ter i

Oksalyylikloridia (0,54 ml, 6,2 millimoolia) lisätään liuokseen, joka sisältää 3-asetyylitio-2-bentsyylipropioni-happoa (1,43 g, 6 millimoolia) etyylieetterissä (10 ml).

35 Tätä seosta käsitellään varovaisesti katalyyttisen määrän (3 tippaa) kanssa dimetyyliformamidia ja sen jälkeen hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Seos haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan öljyä, joka liuotetaan tetrahyd-rofuraaniin (10 ml) ja haihdutetaan uudelleen tyhjössä. Saa-40 tu jäännös liuotetaan metyleenikloridiin (6 ml) ja liuos il •ji o n n r n 31 OUZOÖ lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa kylmään (-5°), hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 11-aminoundekaanihapon metyyliesterin hydrokloridia (1:1) (1,61 g, 6,4 millimoolia) ja di-isopropyylietyyliamiinia (2,23 ml, 12,8 millimoolia) 5 metyleenikloridissa (11 ml). Sen jälkeen kun seosta on hämmennetty kylmässä (-5°) 2,5 tuntia, annetaan sen lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään yön yli. Sen jälkeen seos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös otetaan etyyliasetaattiin (100 ml) ja suodatetaan di-isopropyylietyyliamiinihydro-10 kloridin poistamiseksi. Suodos pestään peräkkäisesti 10 %:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä, 5-%:sella natriumbikarbonaatilla, vedellä ja 50—%:sella ruokasuolaliuoksella (3 x 30 ml kutakin). Orgaaninen kerros kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,5 g (+)-ll-/"/2-/f(asetyyli-15 t io) mety y 1 iT’-l-ok so- 3-f enyy 1 ipropyy 1 ij amino7 undekaanihapon metyyliesteriä vaaleankeltaisena kiinteänä aineena; sp.

64-66°.

c) (+j-11-/72-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipro-pyy 1 i7aminoJ7undekaan ihappo 20 Kohdasta (b) saatua metyyliesterituotetta (2,5 g, 5,74 millimoolia) liuotetaan metanoliin (25 ml) ja jäähdy-·;· tetään jäähauteessatyppiatmosfäärin alaisena. Tähän liuok- '· seen lisätään tipottain 10 minuutin kuluessa 1-n natrium- ·_·. hydroksidia (23 ml, noin 3 ekvivalenttia). Liuos muuttuu 25 sameaksi sen jälkeen kun siihen on lisätty koko natriumhydrok-sidimäärä. Seosta hämmennetään 0°:ssa 10 minuuttia ja sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmen-netään 3 tuntia. Seos haihdutetaan tyhjössä kaiken metanolin poistamiseksi. Jäännös laimennetaan vedellä (40 ml) ja uute-30 taan kloroformilla (2 x 20 ml). Kloroformikerros uutetaan 1-n natriumhydroksidilla (3 x 20 ml). Kaikki vesiuutokset yhdistetään ja hapotetaan pH-arvoon noin 1,5 väkevällä suolahapolla. Saatu valkoinen suspensio uutetaan etyyliasetaatilla (3 x 40 ml). Nämä uutokset yhdistetään, pestään 35 vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella (40 ml kumpaakin), kuivataan (Na2SC>4) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,09 g vaaleankeltaista kiinteätä ainetta. Tämä aine kiteytetään uudelleen heksaanin, etyyliasetaatin ja eetterin seoksesta, jolloin saadaan epäpuhtaita kiteitä. Tämän vuoksi ai- 32 80258 ne liuotetaan etyyliasetaattiin ja adsorboidaan pieneen määrään piihappogeeliä (SilicAR CC-4) , ja lisätään saman piihapon muodostamaan pylvääseen. Eluointi kloroformilla ja etyyliasetaatin asteettainen lisäys (10 % 40 % etyyli- 5 asetaattia) antaa 1,77 g (_+)-ll-//2-(merkaptometyyli)-l-ok-so-3-fenyylipropyyli7amino7undekaanihappoa valkoisena kiinteänä aineena; sp. 104-105°. TLC (piihappogeeli, bentsee-ni/etikkahappo 4:1) R^ = 0,51.

Analyysi: 10 Lasketut arvot kaavalle: C21H33N03S: C 66 ,45; H 8,76; N 3,69; S 8,45; SH 8,71

Saadut arvot: C 66,12; H 8,75; N 3,65; S 8,45; SH 8,67.

Esimerkki 13 (_+) -5-//2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli_/-15 amino/pentamidi a) 5-/Y~(l ,l-dimetyylietoksi)karbonyyli7aminQ7valeriaa-na-happo

Natriumhydroksidia (1,0 g, 25 millimoolia) lisätään hämmennettyyn liuokseen, joka sisältää 5-aminovaleriaanahap-20 poa (2,93 g, 25 millimoolia) 7,5 ml:ssa t-butanoli:vesi (2:1)-seosta. Lisätään vielä 9 ml t-butanoli:vesi (2:l)-seos-ta liukenemisen aikaansaamiseksi, sen jälkeen lisätään di-t-butyylidikarbonaattia (6,0 g, 27,5 millimoolia) useina annoksina tunnin kuluessa. Lisätään vielä 5 ml t-butanolia ja pak-25 sua valkoista lietettä hämmennetään 3,5 päivää. Reaktioseos laimennetaan vedellä (15 ml) ja uutetaan heksaanilla (3 x 15 ml). Vesikerros hapotetaan kaliumbisulfaatilla (3,5 g 25 ml:ssa vettä). Tuote uutetaan etyyliasetaattiin (1 x 25 ml, 2 x 15 ml), pestään vedellä ja väkevällä ruokasuola-30 liuoksella, kuivataan (Na2SO^), ja haihdutetaan, jolloin saadaan 5,38 g hitaasti kiteytyvää väritöntä öljyä. Jauhaminen hienoksi heksaani-etyylieetterin kanssa antaa 4,29 g 5-/·/”(1,1-dimetyylietoksi)karbonyyli7amino7valeriaa-nahappoa valkoisena kiteisenä aineena; sp. 47-50,5°.

35 b) 5-/m ,l-dimetyylietoksi)karbonyyli/aminQ7peri~ tamidi

Isobutyylikloridiformiaattia (1,55 ml, 12 millimoolia) lisätään tetrahydrofuraanissa (5 ml) tipottain noin 5 minuutin kuluessa voimakkaasti hämmennettyyn liuokseen, li 33 80258 joka sisältää 5-/^(1,l-dimetyylietoksi)karbonyyli/aminoyva-leriaanahappoa (2,61 g, 12 millimoolia) ja N-metyylimorfolii-nia (1,32 ml, 12 millimoolia) tetrahydrofuraanissa (15 ml) -15°:ssa samalla kun reaktiolämpötila pysytetään välillä -25° -5 -15°. Reaktioseosta hämmennetään 12 minuuttia, sen jälkeen siihen lisätään tipottain 30 minuutin kuluessa noin -15°:ssa 10 ml ammoniakin metanoliliuosta (kyllästetty 0°:ssa). Reaktioseosta hämmennetään vielä 30 minuuttia kylmässä, sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja hämmennetään 10 yön yli. Sakea valkoinen suspensio laimennetaan vedellä, haihdutetaan tyhjössä orgaanisten liuottimien poistamiseksi ja sen jälkeen uutetaan etyyliasetaatilla (150 ml) . Etyyliase-taattiliuos pestään vedellä, 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuoksella, kuivataan (Na2SO^) 15 ja haihdutetaan, jolloin saadaan 1,54 g valkoista kiinteätä tuotetta; sp. 135-138,5°.

Koska saanto on alhainen, väkevöidään alkuperäinen vesiuutos puoleen tilavuuteen ja uutetaan etyyliasetaatilla (1 x 75 ml, 3 x 25 ml). Etyyliasetaattiliuos pestään vedellä 20 (2 x 10 ml) ja väkevällä ruokasuolaliuoksella (2 x 10 ml), kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,56 g valkoista kiinteätä ainetta, joten kokonaissaannoksi saadaan 2,1 g. Pieni osa kiteytetään uudelleen etyyliasetaatista, jolloin saadaan analyyttisesti puhdas näyte 5-/ZTl,1-dimetyy-25 lietoksi)karbonyyli7amino/pentamidia; sp. 138-140°. c) 5-aminopentamidin hydrokloridi (1:1)

Liuoksen, joka sisältää 5-/£(l,l-dimetyylietoksi)kar-bonyyli7aminq7pentamidia d/77 g, 8,18 millimoolia) 20 ml:ssa 1,3-n kloorivedyn etikkahappoliuosta, annetaan seistä huoneen 30 lämpötilassa 45 minuuttia. Liuotin haihdutetaan alipaineessa ; ja öljymäinen jäännös jauhetaan hienoksi kylmän etyylieette- rin kanssa, jolloin saadaan kovaa hartsia. Noin 2 ml:n suuruisen metanolimäärän lisääminen tekee mahdolliseksi tuotteen jauhamisen hienoksi valkoiseksi jauheeksi, joka kootaan ja 35 tällöin saadaan 1,18 g 5-aminopentamidin hydrokloridia (1:1).

34 80258 d) (+) -5-/72-/'(asetyylitio) metyyli„7-l-okso-3-f enyy-lipropyyliJ^amino7pentamidi

Liuokseen, joka sisältää 3-asetyylitio-2-bentsyylipro-pionihappoa (1,43 g; 6 millimoolia) ja oksalyylikloridia 5 (0,58 ml, 6,6 millimoolia) etyylieetterissä (12 ml), lisätään 1 tippa dimetyyliformamidia. Reaktioseosta hämmennetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen se haihdutetaan tyhjössä. Jäännös otetaan kahdesti tetrahydrofuraaniin (5-10 ml) ja haihdutetaan viimeistenkin oksalyylikloriditähtei-10 den poistamiseksi ja sen jälkeen haihdutetaan tyhjöpumppua käyttäen 10 minuuttia. Tämän happokloridin liuos 7,5 ml:ssa metyleenikloridia lisätään tipottain tunnin kuluessa lämpö-tilavälillä 5-10° liuokseen, joka sisältää 5-aminopentamidin hydrokloridia (1:1) (916 mg, 6 millimoolia) ja di-isopropyy- 15 lietyyliamiinia (2,09 ml, 12 millimoolia) 15 ml:ssa metyleenikloridia. Reaktioseosta hämmennetään tunnin ajan kylmässä, sen jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä hämmennetään 2 tuntia. Liuotin haihdutetaan ja jäännös otetaan etyyliasetaattiin (200 ml), pestään peräkkäisesti ve-20 dellä, 5-%:sella natriumbikarbonaatilla, vedellä, 10-%:sella kaliumbisulfaatilla, vedellä ja väkevällä ruokasuolaliuok-sella (noin 2 x 20 ml kutakin), kuivataan (Na2SO^) ja haihdutetaan tyhjössä, jolloin saadaan 1,44 g valkoista kiinteätä ainetta. Kaksi uudelleen kiteytystä etyyliasetaatti/-25 heksaani-seoksesta antaa 0,86 g (_+)-5-/7~2-/~(asetyylitio) me-tyy1i7~1-ok so-3-fenyy1ipropyy1iJamino/pentamidia.

e) (_+)-5-/^2-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipro- pyyli7amino7pentamidi 1-n natriumhydroksidia (2,53 ml, 1 ekvivalentti) li-30 sätään tipottain 5 minuutin kuluessa liuokseen, joka sisältää (_+)-5-/’/2-_^~(asetyylitio)metyyli/-l-okso-3-fenyylipro-pyyli7aminq7pentamidia (0,85 g, 2,53 millimoolia) 5 ml:ssa metanolia välillä 0-5°. Jäähaude poistetaan ja reaktioseosta hämmennetään 1,5 tuntia. Enin osa metanolista haihdute-35 taan ja jäännös laimennetaan sen jälkeen vedellä (noin 7 ml) il 35 80 258 ja pH säädetään arvoon 7,0 1-n suolahapolla. Erottuva kiinteä aine uutetaan etyyliasetaattiin (10 ml, sen jälkeen 3 x 20 ml). Yhdistetty orgaaninen uutos pestään väkevällä ruokasuolaliuoksella, kuivataan (Na2S04) ja haihdutetaan 5 tyhjössä, jolloin saadaan 0,75 g valkoista kiinteää jäännöstä; sp. 112-122°. Yksi uudelleenkiteytys metanoli/vesi-seoksesta antaa ainetta, jonka sp. on 122,5 - 125°. Kiinteä aine ja emäliuos yhdistetään uudelleen ja väkevöidään ja lisätään sen jälkeen pylvääseen, jonka muodostaa piihap-10 pogeeli (SilicAR CC-4) sullottuna kloroformissa. Pylväs eluoi-daan ensiksi 10-%:sella etyyliasetaatin kloroformiliuoksella, suurentaen aste ttain etyyliasetaatin aikaansaamaa poolisuut-ta ja lopuksi 10-%:sella metanolin etyyliasetaattiliuoksel-la, jolloin saadaan 0,50 g (_+)-5-/7^- (merkaptometyyli) -1-ok-15 so-3-fenyylipropyylij7aminq/pentamidia valkoisena kiinteänä aineena; sp. 127-128,5°. TLC (piihappogeeli; bentseeni/etik-kahappo, 7:3) = 0,25, heikko hännänmuodostus.

Analyysi:

Lasketut arvot kaavalle: C.cH^_N„OnS: ID 72 2 2 20 C 61,19; H 7,53; N 9,51; S 10,89; SH 11,23

Saadut arvot: C 60,88; H 7,64; N 9,28; S 10,83; SH 11,11.

Esimerkki 14 (_+)-5-//5- (merkaptometyyli)-l-okso-3-f enyylipropyy-- Ii^amino7valeriaanahapon natriumsuola 25 (jO-5-//2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-f enyylipropyy- li/amino_7valeriaanahappoa (1 millimooli) liuotetaan veteen (50 ml). Lisätään natriumbikarbonaatin vesiliuosta (0,1-n, 20 ml) ja vesiliuos kuivataan jäädyttämällä. Sen jälkeen se liuotetaan veteen (10 ml) ja lisätään pylvääseen 30 (5 cm x 60 cm), jonka muodostaa "Sephadex^chromatography gel G-10", ja eluoidaan vedellä. Toivottua tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja kuivataan jäädyttämällä, jolloin saadaan (+j-5-/72-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyy-lipropyyli7aminq7valeriaanahapon natriumsuolaa.

36 80258

Esimerkki 15 1000 tablettia, joista jokainen sisältää 100 mg (_+) -5-{[2- (merkaptometyyli) -l-okso-3-fenyylipropyyli/ami-no/valeriaanahappoa valmistetaan seuraavista aineksista: 2 (_+)-5-/7*2- (merkaptometyyli)-1- okso-3-f enyylipropyyli_/amino/va-leriaanahappoa 100 g

Maissitärkkelystä 50 g

Gelatiinia 7,5 g

Avicel'ia (mikrokiteistä selluloosaa) 25 g

Magnesiumstearaattia 2,5 g (+)-5- f[2-(merkaptometyyli)-l-okso-3-fenyylipropyy-liyamino/valeriaanahappo ja maissitärkkelys sekoitetaan gelatiiniin vesiliuoksen kanssa. Seos kuivataan ja jauhetaan 15 hienoksi jauheeksi. Avicel ja sen jälkeen magnesiumstearaatti sekoitetaan rakeiden kanssa. Tämä seos puristetaan sen jälkeen tablettipuristimessa 1000 tabletiksi, joista jokainen sisältää 100 mg aktiivista aineosaa.

Esimerkkien 1-4 ja 6- 13 yhdisteet voidaan formuloida 2o vastaavalla tavalla.

f{

Claims (14)

37 8 0 2 5 8

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava 5 R, O R, O I2 II I3 | R: -S-CH2 -CH C-NH-CH—(CH2 )n -C-R4 I mukaanlukien sen farmaseuttisesti hyväksyttävissä oleva 10 suola, jossa kaavassa Rx on vety; R2 on bentsyyli; R3 on vety tai bentsyyli;

15 R4 on hydroksi, alempi alkoksi tai -NH2; ja n on kokonaisluku välillä 1-9; tunnettu siitä, että asyloidaan yhdiste, jolla on kaava

20 R, O I 3 II H2N-CH-(CH2 )n-C-R4 II hapolla tai sen kemiallisella ekvivalentilla, jolla on kaava 25 O R2 O r5 -I>s-ch2 -tn— C-OH III jossa Rs on alempi alkyyli, minkä jälkeen hydrolysoidaan 30 täten muodostunut tuote kaavan I mukaisten yhdisteiden saamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on kokonaisluku välillä 3-6. 38 8 0 2 5 8

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on yksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on kaksi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on kolme.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on neljä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n 15 on viisi.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on kuusi.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa n on yhdeksän.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R3 on vety.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R3 on bentsyyli.

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, 30 jossa R4 on hydroksi.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R4 on metoksi.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen me- 35 netelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa R4 on -NH2 . tl 39 80258