FI80051C - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt vaerdefulla substituerade dipeptider. - Google Patents

Description

i 80051

Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokasta substituoitua dipeptidia - Förfarande för framställning av farmakologiskt värdefulla substituerade dipeptider Tämän keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokasta substituoitua dipeptidia, jonka kaava on *6

Rl - HC - NH - X - CONH - CH - (CH2)y - R9 (I) R2 jossa

Rl on fenyyli-(Ci-C4>-alkyyli, naftyyli-(Ci~C4)-alkyyli, (C1-C4)-alkyylifenyyli-(Ci-C4)-alkyyli tai fenyyli-(Ci-C4)-alkyylitio-(Ci-C4)-alkyyli, R2 on karboksyyli, -COO(Ci~C4)-alkyyli tai -COO(Ci~C4)-alkyyli- fenyyli, R4 R4 1 1 X on -CH- tai -N- R4 on tienyyli-(Ci~C4)-alkyyli, fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli, jossa fenyyli voi olla substituoitu halogeenilla tai fenyy-lillä, naftyyli-(Ci~C4)-alkyyli tai (C1-C4)-alkyyli, Y on 1 tai 2,

Rg on vety, (C1-C4)-alkyyli tai fenyyli-(Ci-C4)-alkyyli,

Rg on karboksyyli, -COO(Ci~C4)-alkyyli, -COO(Ci-C4)-alkyyli-fenyyli, /R20 -CON ; jossa toinen ryhmistä \ r21 r20 r21 on vety ja toinen fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli, tai yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat kiinnittyneet, R20 ja R21 muodostavat 5-7 jäsenisen tyydyttyneen renkaan, joka sisältää happea renkaan heteroatomina.

2 80051

Luonnossa esiintyvän opiaattireseptorin agonistin, joka tunnetaan nimellä "enkefaliini" ja jonka uskotaan olevan kahden peptidin, so. H-tyr-gly-gly-phe-met-OH (metioniini-enkefaliini) ja H-tyr-gly-gly-phe-len-OH (leusiini-enkefaliini), joista kummastakin käytetään jäljempänä geneeristä nimeä "enkefaliini”, on ilmoitettu aiheuttavan syvän analgesian rotilla, kun niitä injisoidaan rottien aivokammioihin (Beluzzic et ai nature 260, 625 (1976)).

Enkefaliinin, jota luonnossa muodostuu lämminveristen eläinten kehossa, tiedetään inaktivoituvan enkefalinaaisen, joista myös luonnossa muodostuu näissä kehoissa nimellä tunnetun entsyymi-ryhmän vaikutuksesta. Sen vuoksi on mielenkiintoista etsiä yhdisteitä, jotka pystyvät estämään enkefalinaaisen edellämainitun inaktivoivan vaikutuksen tai lieventämään sitä.

Tyypillisiä tällaisia uusia yhdisteitä ovat seuraavat: N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(3-tienyyli)alanyyli-L-alaniini, Sp. 192,5 - 193°C; N-(D,L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(2-naftyyli)alanyyli-L-alaniini Sp. 149 - 155°C; N-(L-l-etoksikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)-L-3-(2'-tienyyli)-alanyyli-L-alaniini, tai sen maleaatti, Sp. 124 - 124,5°C (100 - 110°C); N-(D-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-(4-fluorifenyyli)-ala-nyyli-L-alaniini, Sp. 147 - 152°C; N-(D-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(3-tienyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 163 - 164°C; N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(1-naftyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 155 - 156°C; N-(l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(3-tienyyli)-alanyyli-L-alaniini ja sen monoetanolaatti, Sp. 163 - 164°C;

II

3 80051 N-(L-(1-karboksi-2-bentsyylitio)etyyli)-fenyylialanyyli-(L)-alaniini ja sen seskvihydraatti, Sp. 153 - 154°C; N-(L-l-karboksi-2-fenetyyli)-L-fenyylialanyyli-Y-aminovoihappo, Sp. 209 - 211°C (179 - 181°C); N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-A-ala-niini, Sp. 189 - 191°C tai hemihydraatti, Sp. 176 - 190°C; N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-D,L-3-(1-naftyyli)-alanyyli-L-alaniinif Sp. 186 - 194°C.

/ (D)-N-( l-etoksikarbonyyli-3-f enyylipropyyli )-f enyylialanyyl i-/3-alaniini (Sp. 101 - 103°C) tai sen maleaattisuola,

Sp. 94 - 97°C

(D)-N-(1-karboksi-3-fenyylipropyyli)-fenyylialanyylϊ-β-alaniini, Sp. 183 - 185°C (190 - 192°C).

N-L-(l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(2-naftyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 149 - 155°C.

N-[(L)-l-karboksi-2-(1-naftyyli)etyyli]-(L)-(4-fenyyli-2-amino-butyroyyli)-^-alaniini, Sp. 206 - 207°C.

N-(L)-(1-karboks i-2-fenyylietyyli)-(L)-homofenyylialanyyl!-^-alaniini, Sp. 200 - 201°C.

N-(L)-(1-etoks ikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)-(D)-fenyyliala-nyyli-/3-alaniini, Sp. 103 - 105°C.

N-(L)-(1-karboksi-2-fenyylietyyli)-(L)-fenyylialanyyli-β-alaniini-2-fenetyyliamidi, Sp. 204 - 205°C.

N-(L)-(1-bentsyylioksikarbonyyli-2-fenyylietyyli)-(L)-fenyylialanyyl i-/S-alaniini-bentsyyl ies teri.

N-(L)-(1-bentsyylioksikarbonyyli-2-fenyylietyyli)-(L)-fenyyli-alanyli-^-alaniini-(2-metyyli-3-trifluorometyyli)-anilidi,

Sp. 114 - 116°C.

N-[(D,L)-1-karboksi-2-fenyylietyyli]-L-leusyyli-(L)-fenyyli-alaniini tai sen hemihydraatti, Sp. 178 - 180°C.

N- [ (L)-1-karboks i-2-f enyyl ietyyl i ] - (L) -leusyyli-/3-alaniini-trifluoriasetaatti, Sp. 70 - 72°C.

* 80051 N-(L)-(l-karboksi-2-fenyylietyyli)-(U-fenyylialanyyli-A-alaniini-(2-metyyli-3-trifluorimetyyli)-anilidi, Sp. 191 - 192°C. N-(L)-(l-bentsyylioksikarbonyyli-2-fenyylietyyli)-(L)-fenyyli-alanyyli-/3-alanyyli-morf oliini-amidi, N-1 (L) -l-karboksi-2-f enyylietyyli ] - (L) -f enyyl ialanyyli-/3-alanyyli-morfoliini-amidi, Sp. 127 - 129°C.

N-(L-l-etoksikarbonyylietyyli )-L-2-tienyylialanyyliglysiini, N-(L-l-etoksikarbonyylietyyli)-L-2-tienyylialanyyli-L-alaniini, N-(L-1-etoksikarbonyylietyyli )-L-3-tienyylialanyyli-L-alaniini, N-(L-l-etoksikarbonyylietyyli)-L-3-tienyylialanyyliglysiini, N-(L-l-karboksietyyli)-L-2-tienyylialanyyli-L-alaniini, N-(L-l-tert.-butoksikarbonyylietyyli)-L-2-tienyylialanyyli-L-alaniini , [(R)-1-bentsyylioksikarbonyyli-2-fenyylietyyli]-(R)-fenyyli-alanyyli-/3-alanyyli-2,2-dimetyyli propionyyl ioks imetyy lies ter i, N-(l-karboksi-2(1-naf tyylietyyli ) )-(R)-fenyyli-alanyyli-/3-alaniini, Sp. 183 - 187°C, N-(S) -(l-karboksi-2-fenyylietyyli )-(S)-parafenyylialanyyli-/3-alaniini, N- (L-l-karboksi-2-parametyyli-fenyylietyyii)-L-f enyyl ialanyyl i-/3-alaniini, Sp. 222 - 224°C, N-t (S )-l-karboksyyli-2-fenyylietyyli]-(S)-alanyyli-(R,S )-<X-fenyylimetyyli-/3-alaniini, Sp. 235 - 247°C, ja N-[ (S)-1-karboksi-2-fenyylietyyli]- (S)-leusyyli-(S)-ιΛ-fenyylimetyyli-/3-alaniinihydrokloridi, Sp. 185 - 190°C ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Olemme havainneet, että kaavan I mukaiset yhdisteet ovat hyödyllisiä enkefalinaasin inhiboinnissa, kuten on kuvattu jäljempänä esitettyihin in vivo ja in vitro testeihin viitaten. Edellä annettujen yhdisteiden lisäksi tyypillisiä tällaisia yhdisteitä ovat esim. seuraavat.

Il 5 80051 N-(1-karboksi-l-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-L-alanyyli-1/2 isopropanoli, Sp. 164 - 164,5°C, N-(D-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-L-alaniini, Sp. 214 - 215°C, N-(L-l-etoksikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-L-alaniini tai sen maleaatti, Sp. 128 - 130°C (115 - 120°C), N-(1-karboks i-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyliglys i ini-hemihydraatti, Sp. 140 - 145°C, N-(1-karboksi-l-metyyli)-L-fenyylialanyyliglysiini ja sen hydraatti, Sp. 125 - 132°C.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa usealla, seuraavassa kuvatulla menetelmällä.

a) pelkistetään kaavan A mukainen yhdiste C=N kaksoissidok-sessa r1-C = N- X- CONH - CH - (CH 2)y " «9 R2 (A) jossa mahdolliset reaktiiviset ryhmät on sopivalla tavalla suojattu, minkä jälkeen mahdolliset suojaryhmät tarvittaessa poistetaan niin, että saadaan kaavan I mukainen dipeptidi.

Haluttaessa voidaan näin saatu kaavan I mukainen yhdiste muuntaen toiseksi kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi, esim. sopivalla tavalla muuntamalla ryhmät R2 ja R9.

Tämä menetelmä voidaan suorittaa pelkistämällä Schiff-emäs sitä mukaa kun sitä muodostuu reaktioseoksessa ketonihaposta tai -esteristä ja aminohaposta tai -esteristä seuraavan kokonais-reaktion mukaisesti: 6 80051 ?«

H2N - X - CONHCH(CH2)y - Rg + R;l - C = 0 D

*2

C

R1-C=N-X- CONHCH(CH2)y - Rg E

*2

Edellisessä pelkistävässä kondensaatioreaktiossa X on parhaiten r4 -CH-.

Ketohapon tai -esterin primäärisen amiinin C välinen reaktio voidaan esimerkiksi suorittaa liuoksessa käyttämällä liuottimena esimerkiksi vettä tai metanolia oleellisesti neutraaleissa olosuhteissa, kun mukana on sopivaa pelkistintä, esim. natrium-syanoboorihydridiä.

Vaihtoehtoisesti voidaan Schiff-emäs, joka saadaan ketohapon tai -esterin C ja aminohapon tai -esterin D reaktiosta pelkistää katalyyttisesti vedyn läsnäollessa 1-4 ilmakehän paineessa; sopivia katalyyttejä ovat esim. Raney-nikkeli ja palladium/hiili, esim. 10 % Pd/hiili.

Ryhmä Rg on tavallisesti suojattu karboksyyliryhmä, esim. bentsyylioksikarbonyyli tai alempi alkoksikarbonyyli, esim. t-butyylioksikarbonyyli. Tällaisissa tapauksissa suojaryhmä voidaan pelkistää kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi, jossa R9 on karboksyyli, käyttämällä tavanomaisia hydrolyysi- tai hydrogenolyysimenetelmiä, esim. hydrolysoimalla emäksisissä olosuhteissa, esim. saattamalla reagoimaan natriumhydroksidin kanssa sopivassa liuottimessa.

7 80051

Kun Rg on karboksyyli, se voidaan muuntaa tavanomaisilla / r20 menetelmillä ryhmäksi -CON tai alkoksiryhmäksi. Esim.

^ r21 kaavan I mukainen yhdiste voidaan saattaa reagoimaan tionyyli-kloridin kanssa tai oksalyylikloridin kanssa ja muuntaa ryhmä Rg aktivoiduksi esteriryhmäksi, minkä jälkeen saatetaan reagoimaan aminin HNR20R21 ta* alkoholin kanssa niin saadaan halutut yhdisteet.

Yhdisteet C voidaan valmistaa seuraavalla reaktiosarjalla (esimerkkien yhdisteet, joissa X on R* i -CH-).

r4 r6 P - NH - CH - C02H + H2NCH(CH2)y - R9 -

F G

— ~ ψ r4 r4 r6 H2N - CHCONHCH2(CH2)yRg P - NH - CH - CONHCH(CH2)yRg

C H

Edellisessä reaktiosarjassa aminohapon F aminoryhmä voidaan suojata esim. millä tahansa tavanomaisella aminoryhmän suoja-ryhmällä P, esim. bentsyylioksikarbonyylillä tai t-butyylioksi-karbonyylillä.

Aminohappo F voidaan kondensoida aminoesteri-johdoksen G kanssa, esim. käyttämällä kondensointiainetta kuten disyklo-heksyylikarbodi-imidiä (DCC) tai difenyylifosforyyliatsidia. Kondensaatioreaktiossa voidaan käyttää aktivointiainetta, esim. 1-hydrodibentsolia. Saatuun dipeptidiin H kiinnittynyt 8 80051 aminosuojaryhmä P poistetaan sen jälkeen tavanomaisella käsittelyllä, esim. käsittelemällä hapolla tai hydraamalla, esim. käyttämällä vetyä metallikatalyytin läsnäollessa.

b) Kytketään yhdiste A' aminohapon B' kanssa ?*

H-HNCH(CH2)y - Rg + - CH - NH - X - COOH

«2 (A') (B') joissa kaikki reaktiiviset ryhmät ovat sopivalla tavalla suojattu, minkä jälkeen poistetaan nämä mahdolliset suojaryhmät, jolloin saadaan dipeptidi, jonka kaava on R4 Rc I 4 Γ

Rl· - CH - NH - CH - CONHCH(CH2 )yRg R2 ja sen jälkeen haluttaessa muunnetaan näin saatu kaavan I mukainen yhdiste toiseksi kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi.

r4

Valmistettaessa yhdisteitä, joissa X on -CH- ja R2 on jokin muu kuin 0=P - ORin, yhdiste B' voidaan valmistaa kondensoi- i R11 maila pelkistäväksi sopivasti substituoitu aminohappo ketohapon tai -esterin kanssa seuraavan reaktiokaavion mukaisesti

Rd R4

1 I

Rl-C=0 + H2NCH - C02H ----- Rl - CHNHCH - C02H Bj_ R2 r2

II

9 80051

Yhdiste B' valmistetaan kuitenkin parhaiten kondensoimalla pelkistävästi sopivasti substituoitu ketohappo aminohappo-esterin kanssa seuraavan reaktion mukaisesti: r4

R4 - C = O + Rl - CHNH2 -> RiCHNHCHC02H

COOH R2 R2 Nämä kondensoinnit voidaan suorittaa olosuhteissa, jotka on kuvattu edellä menetelmässä a) yhdisteiden D ja C välisessä reaktiossa. Saatu yhdiste B' kytketään sen jälkeen aminohapon A' kanssa, jossa R9 on esim. alkoksikarbonyyli tai dialkyyli-aminokarbonyyli tai muu ei-reagoiva ryhmä edellä esitetyssä ryhmän Rg määritelmässä.

Tie b) sopii sellaisille yhdisteille, joissa R2 on 0=P - OR10.

R11 Lähtöaineena käytetty tällaisten yhdisteiden välituote B' on esimerkiksi yhdiste ?4

Rl - CH - NH - CH - C02H

0=P-0Riq D' *11 jossa Rio on alkyyli tai bentsyyli. Yhdiste D' voidaan valmistaa esim. saattamalla amiini

Rl - CH - NH2 0=P-ORio P_!_ »u reagoimaan kaavan 0=C - C02H mukaisen substituoidun palorypäle-hapon kanssa Schiff-emäkseksi, joka pelkistetään, parhaiten 10 80051 natriumsyanoboorihydridillä yhdisteeksi D'. Yhdiste A', joka saatetaan reagoimaan tässä nimenomaisessa menetelmässä yhdisteen D' kanssa, on esim. sopivasti substituoitu aminohappo (so. Rg on COOMe), esim. käyttämällä kondensointiainetta, esim. DCC:tä.

Valitsemalla sopivalla tavalla suojaryhmät ryhmissä R9 ja R^q voidaan saadusta yhdisteestä poistaa suojaryhmä selektiivisesti ryhmässä Rg tavanomaisilla menetelmillä, jolloin pääteasemassa sijaitseva karboksyyliryhmä, jossa Rg on karboksyyli, jolloin ryhmä R^q jää haluttaessa paikalleen; haluttaessa voidaan kuitenkin hydrolysoida aikalisissä olosuhteissa sekä yhdiste Rg että -OR10 hydroksiryhmäksi.

Yhdiste B' voidaan yhdistää aminohappoon A' vakiomenetelmillä, esim. muodostamalla ensin aktivoitu esteriryhmä saattamalla B' reagoimaan aktivointiaineen kuten 1-hydroksibentsotriatsolin kanssa, ja sen jälkeen saattamalla reagoimaan yhdisteen A' kanssa ja käsittelemällä kondensointiaineella kuten l-(3-di-metyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridin kanssa.

c) Yhdisteiden, joissa X on -CH-, eräässä toisessa valmistusmenetelmässä pelkistetään kaavan X mukainen yhdiste C=N kak-soissidoksessa H R4 R6 1 1 10 R1-C-N=C- CONH - CH - (CH2)y - Rg *2 (X) minkä jälkeen haluttaessa poistetaan mahdolliset suojaryhmät ja/tai muodostetaan sen suola. Tämä menetelmä suoritetaan

II

11 80051 tarkoituksenmukaisesti kondensoimalla ketoni, jonka kaava on *4 ?6 0=C - CONR5 - CH - (CH2)y-R9 EJ_ aminohapon tai -esterin kanssa, jonka kaava on

H

i

Rl - C - NH2 FJ_ r2 pelkistimen, esim. natriumsyaniboorihydridin läsnäollessa.

Saadut yhdisteet G', joissa on pääteasemassa sijaitseva karbok-siryhmä (Rg: -COOH), ja parhaiten yhdisteet, joissa R2 on jokin muu kuin 0=P - ORiq, voidaan edelleen käsitellä edellä kuva- R11 tuilla menetelmillä niin, että saadaan toinen kaavan I mukainen yhdiste muuntamalla sopivalla tavalla funktiot R2 ja Rg.

Välituote E', jossa Rg on -COOH, voidaan valmistaa noudattamalla seuraavaa reaktiokaaviota: R'4CH O

S-i

NaOAC /\ R’4 - CHO + CH2C02H -N 0 Jl | Ac20 NHCOCH3 HJ. CH3 h2nch-r9

HoO+ » O Rg

H I

<- R'4CH=C-C-NHCH(CH2)yRg H20 NHCOCH3 12 80 051 jossa R'4 on ryhmä, joka yhdessä metyyliryhmän kanssa, jolla se kiinnittyy saadun yhdisteen E' peptidiketjun, muodostaa ryhmä R4.

N-asetyyliglysiini H' kondensoidaan sopivalla tavalla R4~subs-tituoidun aldehydin kanssa (parhaiten aryyli- tai heteroaryyli-tai heteroalkyy1ialdehydi) etikkahappoanhydridi/natriumase- taatin läsnäollessa, jolloin saadaan substituoitu atslaktoni J', joka vuorostaan saatetaan reagoimaan aminohapon A' kanssa. Näin saadaan substituoitu N-asetyylidehydrodipeptidi, joka vesipitoisen hapon läsnäollessa muunnetaan vastaavaksi R4~subs-tituoiduksi palorypäleaminohapoksi E'.

Vaihtoehtoisesti lähtöyhdiste E' voidaan valmistaa kondensoi-malla R4~substituoitu palorypälehappo aminohappoesterin kanssa dihykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) vaikutuksen avulla, minkä jälkeen hydrolysoidaan alkalisesti saatu esteri seuraavan reaktiokaavion mukaisesti: R4 Re DCC R. Rg I 4 I6 I 4 1b 0=C-C02H + H2NCH(CH2)yR9 -» 0=C-C0NHCH(CH2)yR9

LI Ml N_L

Rg yhdisteessä M' voi olla esimerkiksi karbometoksi.

Hydrolysoimalla esteri N' saadaan vapaa ketohappo r4 r6

O-C - CONHCH(CH2)y C02H (V

kun on kysymys yhdisteistä, joissa R2 on 0=P - OR^q» menetelmä R11 c) voidaan toteuttaa käyttämällä yhdisteitä, joissa on 11 13 80051 jokin muu kuin vety, esim. bentsyyli tai alempialkyyli. Vastaavat yhdisteet, joissa on vety, voidaan helposti saada pelkistämällä Rio* ^un se on bentsyyli, ja kun se on alkyyli, hydrolysoimalla emäksisesti käyttämällä tavanomaisia menetelmiä.

Välituotteilla, joita voidaan käyttää valmistettaessa keksinnön mukaisia yhdisteitä tällä menetelmällä, on kaava R]_ - CH - NH2 0=P-ORio £ jossa Rio ei ole vety,

Rll ja nämä yleensä kondensoidaan yhdisteen E’ kanssa pelkistimen, kuten natriumsyaniboorihydridin läsnäollessa. Mainitut välituotteet voidaan valmistaa esim. saattamalla reagoimaan keskenään R^-substituoitu aldehydi, ammoniakki ja Rn-substituoitu alkoksi- tai bentsyylioksifosfoni- tai fosfiinihappo.

Oheinen keksintö käsittää kaavan I mukaan saatujen yhdisteiden, joissa on yksi tai useampi vapaa happo- tai emäsryhmä, suolat epäorgaanisten tai orgaanisten happojen tai emästen kanssa.

Näitä suoloja ovat esim. alkalimetallisuolat, esim. natrium-ja kaliumsuolat, ja orgaanisten ja epäorgaanisten happojen, esim. suolahapon ja maleiinihapon suola.

Suolat voidaan valmistaa tunnetulla menetelmällä, esim. saattamalla vapaana happona tai vapaana emäksenä oleva tuote reagoimaan vähintään yhden ekvivalentin kanssa sopivaa emästä tai happoa liuottimessa tai reaktiomediumissa, esim. etyyliasetaatissa, johon suola ei liukene tai liuottimessa, joka voidaan poistaa tyhjössä tai pakkaskuivaamalla.

Kun edellä kuvatuissa reaktioissa, joko kun valmistetaan välituotteita tai lopullisia haluttuja keksinnön mukaisia tuot- 14 80051 teitä, muodostuu vettä, esim. kondensaatioreaktioissa, nämä reaktiot voidaan suorittaa tislaamalla atseotrooppisesti yhdessä sopivan korkealle kiehuvan liuottimen, esim. tolueenin tai ksyleenin kanssa tai kun mukana on dehydratointiainetta, esim. molekyyliseula.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistuksen, kun käytetään edellä kuvattuja menetelmiä, monet välituotteet ovat saatavissa kaupallisesti, esim. Chemical Dynamics Corporationista, tai niiden valmistus on kuvattu peptidikirjallisuudessa tai yleisessä kemiallisessa kirjallisuudessa, esim. J.H. Jones Comprehensive Organic Chemistry, Voi. 2, s. 819 - 823 1979; viitteet 2 ja 29 - 31, ja Tetrahedron Letters No. 4, 1978, s 375 - 378.

Edellä määritellyissä yhdisteissä voi olla kiraalisuuskeskuksia asymmetrisissä hiiliatomeissa.

Tässä yhteydessä kuvatuilla menetelmillä valmistetut yhdisteet ovat yleensä diastereomeerisia seoksia yhdisteistä, jotka ovat vastaavasti 'D' ja 1L' ainakin yhdessä mainitussa kiraalisuus-keskuksessa.

Tällaiset diastereomeeriset seokset voidaan erottaa alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Vastaavat yhdisteet voidaan esim. erottaa fysikaalisin keinoin kuten kiteyttämällä tai kormatograafisesti tai muodostamalla diastereomeeriset suolat ja sen jälkeen fraktiokiteyttämällä.

Keksinnön kohteena ovat myös edellä esitettyjen dipeptidiyh-disteiden kaikki stereomeeriset muodot.

Parhaana pidetään niitä yhdisteitä, joilla on samanlainen konfiguraatio kuin luonnossa esiintyvillä L-aminohapoilla. Luonnon aminohapoilla on tavallisesti S-konfiguraatio Cuhn-

II

is 80051

Ingold Prelog-systeemin mukaisesti. Merkittävä poikkeus on luonnonaminohappokysteiini, jolla on R-konfiguraatio.

Yhdisteiden farmakologinen aktiivisuus

Seuraavassa on annettu joidenkin yhdisteiden enkelfalinaasia inhiboida vaikutus mitattuna luettelon jälkeen kuvatulla tavalla. Numeroarvot esittävät niitä koeyhdisteen mooli-pitoisuuksia, jotka alentavat enkelfalinaasientsyymien vaikutusta 50 % (IC50)

Yhdiste IC50 o /=\ (S) .

£ Λ-CH2-NH-CH-CONH-CH2CH2COOH 1,0 x 10“8 ^—j I (S)

COOH

o /=v 'H2° , .

Λ— CH2-CH-NH-CH-C-NH-CH2)3COOH 5,5 x 10-8

' j COOH

(S) 0

/ \ (S) CH 2 O

L Λ-CH2CH2-CH-NHCH-C-NHCH2CH2COOH 2,6 x 10"8 \J I (S)

COOH

ie 80051

Edellä määritellyt dipeptidiyhdisteet inhiboivat enkefalinaa-sien aktiivisuutta. Eräiden näiden yhdisteiden on havaittu olevan hyödyllisiä inhiboitaessa rottien striaatasta saatua enkefalinaasia A. Nämä yhdisteet, kun niitä on käytetty kon-sentraatioalueella 10“^ - 10”® M, ovat in vitro-testeissä pienentäneet edellä mainitun entsyymin aktiivisuutta 50 % tai enemmän.

Edellä mainituissa testeissä käytetty enkefalinaasi saatiin erottamalla ne nuorten sprague-dowley urosrottien aivoista C. Gorenstein et, al.:n kuvaamalla menetelmällä, Life Sciences, Voi., 25, sivut 2065 - 2070, Pergamon Press (1979).

Tässä menetelmässä erotetaan toisistaan aivojen eri enkefalii-nia hajoittavat entsyymiaktiivisuudet seuraavalla, Gorensteinin ja Synderin kuvaamalla menetelmällä (Life Sciences, Vo., 25, sivut 2065 - 2070, 1979). Nuoren sprague-dawley-rotan aivot (minus cerebellum) homogenisoitiin ensin 30 tilavuudessa 50 mM Tris puskuria, pH 7,4. Saatu homogenaatti sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 50 000 xg-voimalla ja pelletti, joka muodostuu membraanin sitoutuneesta entsyymimateriaalista, suspendoitiin uudelleen Tris puskuriin, pestiin ja sentrifugoitiin edellä kuvatulla tavalla neljä kertaa.

Membraanipelletti liuotettiin inkuboimalla sitä 45 minuuttia 37°C:ssa, kun mukana oli 15 tilavuusosaa (laskettuna aivojen alkuperäispainosta) 50 mM Tris - 1 % TRITON X-100 puskuria, pH 7,4. Liukenematon aines poistettiin sentrifugoimalla 60 minuuttia 100 000 xg-voimalla, minkä jälkeen Tritoniin liukeneva supernatantti ajettiin kerroksiksi 1,5 x 30 cm DEAE Sephacel-pylväässä joka oli tasapainotettu etukäteen 50 mM Tris - 0,1 * Triton-puskurilla, pH 7,4. Pylväs eluoitiin käyttämällä yhden litran lineaarista NaCl-graniittia kosentraatio välillä 0,0 - 0,5 M. Eluantti otettiin talteen 7 ml:n jakeina, joista

II

17 80051 kustakin määritettiin enkefalinaasiaktiivisuus. Näissä olosuhteissa havaitaan enkefalinaasin "A" aktiivisuuden (dipepti-dyyli karboksipeptidaasi) eluoituvan välillä 120 ja 220 ml, jota seuraa aminopeptidaasin aktiivisuus (260 - 400 ml) ja lopuksi enkefalinaasin "B" aktiivisuus (dipeptidyyli amino-peptidaasi) välillä 420 ja 450 ml.

Kokeessa seurattiin enkefalinaasiaktiivisuutta radiometri-sesti. Substraatti oli 3H-met-enkefaliini (50,1 Ci/mmol, NEN) laimennettuna 0,05 M Tris-puskuri, pH 7,4 siten, että reaktio-seoksen lopullinen konsentraatio oli 40 nM. Koko reaktioseok-sen, mukaalukien entsyymi ja substraatti, tilavuus oli 250 ml.

Inkubointi suoritettiin 90 minuutin aikana 37°C:ssa. Reaktion pysäyttämiseksi putket siirrettiin kiehuvaan vesihauteeseen 15 minuutiksi. Reaktioseoksesta otettiin 4 ml:n erä Baker-Flex Silica Gel IB levylle (20 x 20 cm) yhdessä leimaamattomien standardien kanssa (met-enkefaliini, tyrosiini, tyrosyyli-glysiini, tyrosyyli-lysyyli-glysiini) ja komponentit kromato-grafoitiin yhdessä liuotinsysteemissä (isopropanolisetyyli-asetaatti: 5 paino-%/tilavuus etikkahappo, (2:2:1), joka kykenee erottamaan met-enkefaliinin hajoamistuotteistaan. Ajoaika oli yhteensä noin 17 tuntia. TLC-säiliöt kaasutettiin typellä ennen ajon alkua. Ajon jälkeen täplät tehtiin näkyviksi inhydrini-suihkeella. Nämä täplät yhdessä jäljelle jääneiden levyalueiden kanssa erotettiin levystä ja kunkin täplä vastaava radioaktiivisuus määritettiin tuikelaskennan avulla.

Näin määritettiin radioaktiivisuuden määrä täplissä, joissa Tyr, TryGly, TyrGlyGly ja hajoamaton met-enkefaliini vas-• - taavasti sijaitsevat.

Kullekin levylle voidaan kunkin täplän aiheuttama radioaktiivisuus ilmoittaa prosentteina levyn koko radioaktiivisuudesta.

ie 80051

Met-enkefaliinin, kun mukana ei ole entsyymejä, luonnollisen hajoamisen vaikutuksen poistamiseksi ei-entsyyminollan Tyr-, TyrGly-, TyrGlyGly-täplien radioaktiivisuusprosentit vähennetään vastaavista arvoista, jotka on saatu kunkin ajonäyt-teistä käytettäessä entsyymejä; saadut arvot lasketaan yhteen, jolloin saadaan kullekin ajolle nettoprosentit.

Arvot, joilla voidaan verrata eri dipeptidejä, saadaan sijoittamalla kaavaan (A-B)/P kunkin dipeptidityypin nettoprosentti (P), joka on saatu ajossa vastaavan tyypin läsnäollessa ja nettoprosentti (A), joka on saatu koeajossa ilman dipeptidi-tyyppiä. Eri dipeptidityyppien saadut arvot mittaavat eri dipeptidien suhteellista inhiboivaa aktiivisuutta.

Tällaisten yhdisteiden, kun niitä on annettu parenteraalisesti hiirille annosalueella 5 - 100 mg/kg, on myös havaittu iv vitro testeissä tehostavan intraserebraalisesti annetun D-ala-met-enkefaliiniamidin analgeettisia vaikutuksia.

Farmaseuttiset suolat voivat olla missä tahansa alalla tunnetussa muodossa, esim. oraaliseen antamiseen tarkoitettuihin tabletteina, kapseleina tai eliksiireinä tai parenteralliseen antamiseen tarkoitettuina steriileinä liuoksina tai suspensioina.

Annostusmuodot valmistetaan edullisesti käyttämällä aktiivisen dipeptidin lisäksi farmaseuttisesti hyväksyttävää ja yhteensopivaa kantajaa tai apuainetta, sideaineita, säilytysaineita, stabilointiaineita ja aromiaineita.

Annostusmuodot valmistetaan tavallisesti siten, että aktiivisia yhdisteitä on mahdollista antaa annosalueella 5 - 100 mg/kg, jolloin tällaiset annokset annetaan 3-8 tunnin välein.

Il 19 80051

Tyypillisiä hyväksyttäviä farmaseuttisia kantajia, joita voidaan käyttää edellä kuvatuissa formulaatioissa, ovat esimerkiksi: sokerit kuten laktoosi, sakkaroosi, mannitoli ja sorbitoli; tärkkelykset kuten maissitärkkelys, tapiokatärkkelys, selluloosa ja johdokset kuten natriumkarboksimetyyliselluloosa, etyylisel-luloosa ja metyyliselluloosa; kalsiumfosfaatit kuten di-kalsium-fosfaatti ja tri-kalsiumfosfaatti; natriumsulfaatti, kalsiumsulfaatti, polyvinyylipyrrolidoni, polyvinyylialkoholi, steariini-happo; maa-alkalimetallistearaatit kuten magnesiumstearaatti ja kalsiumstearaatti, steariinihappo; kasvisöljyt kuten maapähkinäöljy, puuvillasiemenöljy, seesamöljy ja maissiöljy; kationiset ja anioniset pinta-aktiiviset aineet; etyleeniglykoli-polymee-rit; beta-syklodekstriini; rasva-alkoholit ja hydrolysoidut vilja-ainekset.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä:

Esimerkki 1 L-3-(31 -tienyyli )alanyyli-/3-alaniini-trif luoriasetaattisuolan valmistus a) N-tri-tertiäärinen butyylioksikarbonyyli-L-3-(3'-tienyyli)-alaniini 2,0 g (11,68 mM) L-3-C3'-tienyyli)alaniinia (Chemical Dynamics Inc.) suspendoitiin 1,6 ml:aan trietyyliamiinia. 2,6 g di-tert.-butyylidikarbonaattia liuotettin seokseen, joka sisälsi 22 ml dimetyyliformamidia (DMF) ja 22 ml metanolia (joka oli jo kuivattu molekyyliseulalla).

DMF/metanoli-liuos lisättiin suspensioon sekoittaen ja sekoittamista jatkettiin ympäröivässä lämpötilassa vielä noin 24 tuntia. Saatu homogeeninen liuos laimennettiin 330 ml:11a 20 8 0 0 51 vettä ja tehtiin sen jälkeen happameksi sitruunahapolla. Saatu liuos uutettiin neljä kertaa 80 ml:11a etyyliasetaattia, uute pestiin vedellä ja sen jälkeen suolaliuoksella ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin 3.2 g otsikkoyhdistettä.

b) N-tri-tertiäärinen butyylioksikarbonyyli-L-3-(31-tienyyli)-alanyyli-^-alaniini-etyyliesteri 3.2 g (11,68 mM) vaiheesta a) saatua otsikkoyhdistettä, 1,8 g /3-alaniinietyyliesterihydrokloridia ja 3,3 g hydroksibentsyyli-triatsolia suspendoitiin ympäröivässä lämpötilassa sekoittaen seokseen, joka sisälsi 20 ml dimetyyliformamidia ja 2,0 ml trietyyliamiinia. Sen jälkeen suspensioon lisättiin 2,5 g N-(Ν,Ν-dimetyyliaminopropyyli)-N'-etyylikarbodi-imidiä ja 2 ml trietyyliamiinia ja saatua seosta sekoitettiin yön yli.

Tämän jälkeen reaktioseokseen lisättiin 300 ml vettä ja uutettiin neljä kertaa 60 ml:11a etyyliasetaattia. Yhdistetyt uutteet pestiin kaksi kertaa 70 ml:lla IN natriumbikarbonaattia, kaksi kertaa 30 ml:11a IN sitruunahappoa, kaksi kertaa 70 ml :11a vettä ja kerran 70 ml:11a suolaliuosta. Saatu uute kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä.

c) N-tri-tertiäärinen butyylioksikarbonyyli-L-3-(3'-tienyyli)-alanyyli-/3-alaniini 4,4 g (11,8 mM) vaiheesta b) saatua ostikkoyhdistettä liuotettiin 30 ml:aan metanolia. Liuokseen lisättiin 30 ml vettä ja sen jälkeen 1,1 g (14,2 mM) natriumhydroksidia 50 % (paino/tilavuus) vesiliuoksena. Reaktioseosta sekoitettiin ympäröivässä lämpötilassa ja tunnin jälkeen tarkistettiin ohutlevykromatografiän (tie) avulla lähtöaineen mukanaolo

II

2i 80 051 käyttämällä silikageeliä ja liikkuvana faasina metanolin, kloroformin ja etikkahapon seosta tilavuussuhteessa 5:95:0,5. Sekoittamista jatkettiin ja reaktiota seurattiin tällä tavoin, kunnes lähtöaineen häviäminen osoitti reaktion tapahtuneen loppuun. Tämän jälkeen reaktioseos väkevöitiin alipaineessa ja jäännökseen sekoitettiin 30 ml vettä; saatu vesiliuos pestiin kaksi kertaa 30 ml:11a metyleenikloridia ja sen jälkeen tehtiin happameksi, jolloin saatiin kumimaista sakkaa. Tämä sakka uutettiin etyyliasetaatilla ja uute kuivattiin magnesiumsulfaatilla, minkä jälkeen etyyliasetaatti haihdutettiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä.

d) L-3-(3 1 -tienyyli)-alanyyli-/3-alaniini-tr if luor iasetaatt i 5,8 g vaiheesta c) saatua otsikkoyhdistettä liuotettiin sekoittaen 15 ml:aan metyleenikloridia. Liuokseen lisättiin 15 ml tr ifluorietikkahappoa ja seosta sekoitettiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktiota seurattiin ohutlevykromato-grafian avulla silikageelillä käyttämällä liikkuvana faasina metyleenikloridin, metanolin ja etikkahapon seosta tilavuus-suhteessa 95:5:0,5. Kun lähtöainetta ei enää ollut tie:n perusteella reaktioseos väkevöitiin kumimaiseksi jäännökseksi, joka liuotettiin bentseeniin. Liuos tislattiin jäännökseksi, liuotettiin uudelleen bentseeniin ja jälleen tislattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä.

e) N-(l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(3-tienyyli)-alanyyli-fl-alaniini L-3-(3-tienyyli)-alanyyli-L-alaniini-trifluoriasetaatin (4,75 g, 13,4 mM) ja 2-okso-4-fenyylivoihapon (11,0 g, 56,1 mM) vesiliuos säädettiin pH-arvoon 6,8 lisäämällä IN natriumhyd-roksidia. Liuokseen lisättiin yhtenä eränä natriumsyanoboori-hydridiä (2,2 g, 34,8 mM) ja saatua reaktioseosta sekoitettiin 22 80051 huoneen lämpötilassa 64 tuntia. Tämän jälkeen säädettiin liuoksen pH arvoon 2,9 lisäämällä IN suolahappo. Liuoksesta eronnut kumimainen tuote pestiin useita kertoja vedellä. Tämä kumimainen tuote liuotettiin 20 ml:aan asetonitriiliä ja liuos laimennettiin 10 ml:lla eetteriä. Jäähdytettäessä erosi kiinteää ainetta, joka otettiin talteen suodattamalla. Emäliuoksia seisotettiin jääkaapissa kaksi päivää, jolloin saostui valkoista kiinteätä ainetta: tämä kiinteä aine erotettiin suodattamalla, pestiin asetonitriilillä ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdisteen N-(L-l) diastereoisomeeriä.

Esimerkit 2-7

Seuraavat yhdisteet ja diastereomeeriset seokset valmistettiin noudattamalla esimerkin 1 mukaista menetelmää ja käyttämällä sopivia lähtöaineita: 2) N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-L-alaniini, Sp. 176 - 179°C.

3) N-(D,L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(2'naftyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 149 - 155°C.

4) N-(L-l-etoksikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)—L—3—(2'-tie-nyyli)alanyyli-L-alaniini-maleaatti, Sp. 124 - 125°C.

5) N(D,L-l-karboksyyli-etyyli)-L-fenyylialanyyli-L-alaniini,

Sp. 125 - 135°C.

6) N-(D-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-(4-fluorifenyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 147 - 152°C.

7) N-(D,L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-fenyyli-alanyyli-glysiini, Sp. 140 - 145°C.

Esimerkki 8 15 g (0,07 moolia) fenyylialaniinimetyyliesteri-hydrokloridia liuotettiin 400 ml:aan metanolia. Tämän jälkeen lisättiin 23 80051 2.4 g (0,105 moolia) natriumfenyylipyruvaattia ja seuraavaksi 15 g jauhemaista 3A molekyyliseulaa (Aldrich Chemical). Lietettä sekoitettiin ympäröivässä lämpötilassa ja samalla lisättiin kuuden tunnin aikana 6,6 g (0,105 moolia) natriumsyano-boorihydridiä 75 mlsssa metanolia. Tämän jälkeen lietettä sekoitettiin kaksi päivää, suodatettiin ja suodos väkevöitiin siirapiksi. Siirappiin lisättiin kolmen tunnin aikana 300 ml 2.5 %:sta suolahappoa ja saadut valkoiset kiteet suodatettiin ja kuivattiin alipaineessa vakiopainoon. Edustava näyte kuivatusta tuotteesta kromatografoitiin silikageeliohutlevyillä käyttämällä liuotinsysteeminä kloroformismetanoli:väkevä suola-happoseosta (tilavuussuhde 50:15:1) diastereoisomeerien suhteen arvioimiseksi. Kromatogrammin perusteella kyseessä oli diastereoisomeerien suurinpiirtein 50/50 seos, joka sisälsi hieman 3-fenyyli-2-hydroksipropionihappoa.

Saanto: 24 g, Sp. 119 - 130°C.

NMR vastaa haluttua tuotetta.

Kiteyttämällä 400 ml:sta etanolia saatiin 14,7 g haluttua yhdistettä (jälleen diastereoisomeerisena seoksena, joka ohut-levykromatografiän (tie) perusteella oli rikastunutta nopeammin liikkuvan isomeerin suhteen), Sp. 135 - 150°C.

200 mg rikastettua diastereomeerista seosta kiteytettiin uudelleen 3 ml:sta metanolia, jolloin saatiin 100 mg kiteitä, jotka olivat lähes puhdasta, nopeammin liikkuvaa isomeeriä (määritettynä tlc:n avulla), Sp. 169 - 172°C.

14.5 g rikastettua diastereoisomeerista seosta kiteytettiin uudelleen 400 ml:sta metanolia, mutta mitään kiteitä ei muodostunut. Liuos väkevöitiin 200 ml:ksi, ympättiin ja annettiin seistä. Muodostui gelatiinimainen sakka, joka tlc:n perusteella oli isomeerien seos, jossa valtaosa oli hitaammin liikkuvaa isomeeriä: saanto 7,0 g. Tätä tuotetta HPL-kromatogra- 24 8 0 0 51 foitiin (high performance liquid chromatography) Waters Prep.

500 Equipment kromatograafilia käyttämällä kahta silikageeli-koloniaa sarjassa. Liuotinsysteeminä oli kloroformi:meta-noli:ammoniumhydroksidi (tilavuussuhde 500:500:10) ja virtausnopeus 0,2 litraa minuutissa. Jakeista 8 ja 9 saatiin 450 mg isomeeriä I (kts. jäljempänä). Jakeesta 10 saatiin 400 mg tuotetta, josta metanolista uudelleen kiteytettäessä saatiin 150 mg isomeeriä I. Jakeista 12 - 15 saatiin 1,2 g puhdasta isomeeriä II (kts. jäljempänä). Jakeesta 11 saatiin isomeerin I ja isomeerin II seosta.

HPLC-käsittely suoritettiin samana tuotteena toisella 3,5 g:n erällä edellisen kappaleen mukaisesti käyttämällä samoja liuo-tinsuhteita ja absorbointiaineita. Jakeesta 4 saatiin 400 mg puhdasta isomeeriä I, jakeesta 5 saatiin 1,0 g tuotetta, josta metanolista uudelleen kiteytettäessä saatiin 550 mg oleellisesti puhdasta isomeeriä I. Jakeesta 6 saatiin 0,4 g isomeerin I ja isomeerin II seosta ja jakeesta 7-10 saatiin 1,6 g puhdasta isomeeriä II.

Isomeeri I, sulamispiste 171 - 173°C.

Massaspektri M+l 328 282 (M-COOH) 268 (M-COOH3) 236 (M-91)

Kaava yv

Po cb2

HC - NH - CH.COOH

COOCH3

II

25 80051

Suodos, joka oli saatu suodattamalla gelatiinimainen sakka, väkevöitiin 50 mlrksi ja siihen lisättiin jäähdyttäen 100 ml asetonitriiliä. Näin saatiin 1,0 g valkoisia kiteitä, sulamispiste 167 - 170°C. Nämä kiteet kiteytettiin uudelleen metanolista, jolloin saatiin 0,7 g valkoisia kiteitä,

Sp. 171 - 173°C.

L-N-[(l-karboksi-2-fenyyli)etyyli1-fenyylialanyyli-fl-alaniini metyyliesteri 1,0 g (3,05 mM) isomeeriä I liuotettiin 20 mlraan dimetyyli-formamidia (DMF). Sen jälkeen lisättiin 520 mg (3,4 mM) 1-hydroksi-bentsotriatsolihydraattia (HOBT H2O) ja tämän jälkeen 472 mg (3,4 mM) /3-alaniinimetyylieetteri-hydrokloridia, 1,3 ml (ekvivalenttia) N-etyylimorfoliinia (NEM) ja 649 mg (3,4 mM) N-(3-dimetyyli-aminopropyyli)-N-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia (EDCL). Saatua liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 48 tuntia ja sen jälkeen se kaadettiin sekoittaen 150 ml:aan jäävettä. Vesiliuos uutettiin kaksi kertaa 150 ml:11a etyylieetteriä. Etyylieetterikerros pestiin kolme kertaa 150 ml:11a, sen jälkeen vedellä, johon oli lisätty muutama pisara suolahappoa, ja lopuksi vedellä. Eetterikerros kuivattiin magnesiumkarbonaatilla, suodatettiin, ja suodos väkevöitiin kumimaiseksi aineeksi; otsikkoyhdistettä saatiin 1,1 g.

L-N-[(l-karboksi-2-fenyyli)-etyyli]-fenyylialanyyli-ft-alaniini

Edellisestä vaiheesta saatu kumimainen aine liuotettiin 20 ml:aan metanolia ja liuokseen lisättiin sekoittaen ja ulkoapäin jäähdyttäen 10 minuutin aikana tipottain 6,6 ml 1-natrium-hydroksidia. Liuoksen annettiin seista yön yli (15 - 20 tuntia) huoneen lämpötilassa. Lisättiin tipottain 5 %:sta suolahappo-liuosta, kunnes liuoksen pH oli laskenut 2,5:een (tämän lisäyksen aikana liuosta sekoitettiin ja sakka kuivattiin alipai- 26 80051 neessa 40°C:ssa vakiopainoon.

Saanto 900 mg, Sp. 218 - 219°C.

Massaspektri M/e 385 (M+l) 367 (M+l-18) 340 (M+l-COOH) 339 (M-45-COOH) 293 (M-91).

Esimerkit 9-15

Seuraavat yhdisteet ja diastereomeeriset seokset valmistettiin noudattamalla esimerkin 8 mukaista menetelmää ja käyttämällä sopivia lähtöaineita.

9) N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-D,L-3-(1-naftyyli)-ala-nyyli-L-alaniini, Sp. 186 - 194°C.

10) N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-3-(1-naftyyli)-ala-nyyli-^-alaniini.

11) N-(L-l-karboksi-2-metyylipropyyli)-D,L-fenyyli)-alanyyli-L-alaniini, Sp. 160 - 172°C.

12) N-(L-l-karboksi-2-(bentsyylitio)-etyyli)-L-fenyylialanyyli-(3-alaniini, Sp. 152 - 154°C.

13) N-(L-l-karboksi-3-fenyylipropyyli)-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-L-alaniini.

14) N-(L-l-karboksi-2-fenyylietyyli)-L-fenyylialanyyli-Y-aminovoihappo, Sp. 209 - 211°C.

15 ) N- (L-l-kar boksi-3-f enyylipropyyli)-L-f enyyl ialanyy li-/*-alaniinihemihydraatti, Sp. 176 - 190°C.

Esimerkki 16 N-(D,L-l-karboksietyyli)-L-fenyylialanyyliglysiini

Liuokseen, joka sisälsi 0,6 g (2,5 mM) L-fenyylialanyyligly-

II

27 80 051 siiniä, 5 ml IN natriumhydroksidia ja 20 ml vettä lisättiin tipottain ja yhden tunnin aikana liuos, jossa oli 0,25 g (2,5 mM) 2-klooripropionihappoa 5 mlsssa IN natriumhydroksidia. Lisäyksen aikana reaktioliuos pidettiin lämpötilavälillä 80 - 90°C ja pH välillä 8-9. Lisäyksen jälkeen seos pidettiin lämmittäen 15 minuuttia 80 - 90°C:ssa ja sen jälkeen haihdutettiin kuiviin alipaineessa ja neutraloitiin 5 %:lla (paino/tilavuus) vesipitoisella suolahapolla. Haihdutettaessa uudelleen kuiviin saatiin harmaata kiinteätä ainetta.

Tämä harmaa aine sekoitettiin eetterin kanssa, minkä jälkeen dekantoitiin; kiinteä aine sekoitettiin kylmän etanolin kanssa. Liukenematon aine erotettiin suodattamalla etanoliliuoksesta. Liuos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin otsikon diastereo-meerien seosta, Sp. 90 - 120°C.

Esimerkki 17 a) Butyylioksikarbonyylihydratsiinin valmistus

Sekoitettu liuokseen, joka sisälsi 0,1 ml hydratsiinihydraattia 15 mlrssa isopropanolia, lisättiin tipottain di-t-butyylikarbo-naatin liuos isopropanolissa (liuos sisälsi 0,45 ml dikarbo-naattia 7 ml:ssa propanolia). Lisäysnopeus oli yksi pisara joka 7. sekunti. Reaktio pysäytettiin sen jälkeen kun t-butyylidi-karbonaatista oli kulunut noin 6/7 osaa.

Emäliuos haihdutettiin ja saatu kiinteä aines kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä liikkuvana faasina kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 97:3.

Kiteyttämällä uudelleen eetteri/petrolieetteristä saatiin kiin teätä ainetta, jonka sulamispiste oli 36,5 - 37°C.

28 80051 b) N-bentsylidiini-N1-t-butyylioksikarbonyylihydratsiini 3,47 g kohdan a) otsikkoyhdistettä liuotettiin sekoittaen 30 ml:aan etanolia ja lisättiin 2,,79 g bentsaldehydiä. Reaktio-seosta kuumennettiin höyryhauteella sekoittaen 10 minuuttia ja sen jälkeen jäähdytettiin jäävesihauteessa.

Saatu reaktioseos suodatettiin. Otsikkoyhdistettä saatiin 3,50 g.

Emäliuos haihdutettiin kiinteäksi aineeksi, josta heksaanipesun ja suodattamisen jälkeen saatiin 1,56 g kiinteätä ainetta.

Nämä molemmat jakeet ohutlevykromatografoitiin silikageelile-vyillä käyttämällä liikkuvana faasina kloroformin ja metanolin seosta tilavuussuhteessa 97:3.

Myöhemmät kokeet osoittivat, että molemmat jakeet olivat oleellisesti identtisiä tuotteita. Kokonaissaanto oli 5,06 g,

Sp. 190 - 194,5°C.

c) N-bentsyyli-N'-t-butyylioksikarbonyylihydratsiini 1 g kohdan b) otsikkoyhdistettä liuotettiin 30 ml saan tetra-hydrofuraania. Lisättiin 0,23 g 5 %:sta palladium/hiili-kata-lyyttiä ja hydrattiin noin 15 minuuttia. Reaktioseos suodatettiin ja emäliuos haihdutettiin, jolloin otsikkotuotetta saatiin 0,96 g.

d) L-metyyli-2-isosyanato-4-metyylivaleraatti 7 g L-leusiinimetyyliesteriä suspendoitiin 200 ml:aan tolueenia, joka oli ennalta kuivattu kalsiumhydridillä. Suspensiota sekoitettiin ja sen läpi kuplitettiin ylimäärä fosgeenikaasua. Kiin- il 29 80051 teän aineen liukenemisen jälkeen reaktioseoksen lämpötilaa nostettiin refluksointilämpötilaan ja pidettiin siinä puoli tuntia.

Kuumentamisen lopettamisen jälkeen ylimääräinen fosgeeni ja liuokseen liuennut kloorivety-reaktiotuote poistettiin saadusta liuoksesta kuplittamalla sen läpi typpikaasua. Tämän jälkeen liuos haihdutettiin ja saatu nestemäinen tuote tislattiin.

[e(]26 = -25,55°C. (C = 5,7 % tolueenissa) kirjallisuus: -22,4°C. Annalen 1952, 575, 217).

Sp. 71 - 72°C.(45 mm Hg) e) N-t-butyylioksikarbonyyli-oC-atsafenyylialanyyli-L-leusiini-metyyliesteri 1,90 g tuotetta b) lisättiin 2,47 g:aan tuotetta a ja tämän jälkeen reaktioliuokseen lisättiin 1,12 g trietyyliamiinia. Saatua reaktioseosta sekoitettiin 16 tuntia, minkä jälkeen se laimennettiin 200 ml:11a etyyliasetaattia, pestiin kerran sitruunahapon 5 % (paino/tilavuus) vesiliuoksella, tämän jälkeen kerran suolaliuoksella ja lopuksi kerran vedellä.

Liuos kuivattiin natriumsulfaatilla, natriumsulfaatti erotettiin suodattamalla ja liuos väkevöitiin jäännökseksi. Tämä jäännös kromatografoitiin 75 g:lla silikageeliä käyttäen eluointiaineena heksaanin ja kloroformin 7/3 (tilavuus) seosta.

Tavanomaisen käsittelyn jälkeen saatiin 3,72 g otsikon mukaista tuotetta. [o(]26 = -7 i° (c = 3,29 % kloroformissa).

D

f) ol-atsafenyylialanyyli-L-leusiini-metyyliesteri 8,0 ml vedetöntä suolahapon ja etikkahapon (tilavuussuhde 1/80) seosta jäähdytettiin sekoittaen 4°C:een ja siihen lisättiin vaiheen e) tuote. Sekoittamista jatkettiin 4°C:ssa 20 minuuttia, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa. Jäännös ohut- 30 8 0 0 51 levykromatografoitiin silikageelillä käyttämällä eluointlaineena kloroformin ja metnolin seosta (98/2 tilavuus/tilavuus). Jakeet, joilla oli vastaavat rf-arvot, yhdistettiin, jolloin saatiin 0,163 g otsikkotuotetta [o<]26 = +1,9°

Massaspektri M+293 (-HC1) 262 (-m-OCH3) 234 (-m-C02CH3) g) N- (D, L-l-etoks ikarbonyyli-3-fenyyli-propyyli) -<x-atsaf enyyli-alanyyli-L-leusiini-metyyliesteri 0,151 g (0,458 mM) vaiheesta f) saatua otsikkotuotetta liuotettiin 3 ml:aan metanolia ja liuokseen lisättiin sekoittaen 60°C:ssa 83,4 mg etyyli-4-fenyyli-2-oksobutanoaattia. Reaktiota seuraattiin tlc:llä käyttäen silikageelilevyjä ja eluointi-aineena kloroformin ja asetonin seosta (9/1, tilavuus). Reaktion tapahduttua oleellisesti loppuun lisättiin 70 mg natriumsyano-boorihydridiä ja 4 pisaraa etikkahapon 10 %:sta (paino/tilavuus) vesiliuosta.

Reaktiota seurattiin tlc:n avulla käyttäen silikageelilevyjä ja eluointiaineena kloroformin ja metanolin seosta (98/2, tilavuus). Sen jälkeen lisättiin uudelleen 70 mg natriumsyanoboori-hydridiä ja 4 pisaraa edellä mainittua etikkahappoliuosta. Reak-tioliuoksen annettiin seistä 16 tuntia, minkä jälkeen liuotin poistettiin alipaineessa. Jäännökseen lisättiin 40 ml etyyliasetaattia, saatu liuos pestiin 20 ml:lla vesipitoista natrium-kloridia ja sen jälkeen kaksi kertaa 20 ml:11a vettä. Orgaaninen liuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja liuos poistettiin alipaineessa.

Jäännös (0,277 g) kromatografoitiin silikageelillä käyttäen eluointiaineena heksaanin ja kloroformin seosta ((7/3, tilavuus). Vastaavat jakeet yhdistettiin ohutlevyllä tapahtuvan kulkeutumisen perusteella, jolloin saatiin otsikkoyhdistettä.

Il 3i 80051 h) N-(D,L-l-karboksi-3-fenyyli-propyyli)-<*-atsafenyylialanyyli-L-leusiini 0,428 g (0,265 mM) vaiheesta g) saatua otsikkoyhdistettä liuotettiin 10 ml:aan vesipitoista asetonia (asetoni/vesi, 3/1, tilavuus) ja reaktioliuokseen lisättiin sekoittaen 1,06 ml natriumhydroksidin vesiliuosta (sisältää 10,06 mM natriumhyd-roksidia). Reaktiota seurattiin tlc:n avulla käyttäen eluointi-aineena kloroformi/metanoli/ammoniumhydroksidia tilavuussuhteessa 1:1:1. Lisättiin vielä 0,04 ml väkevää natriumhydroksidia (sisälsi 0,4 mM natriumhydroksidia) ja reaktion seuraamista jatkettiin, kunnes reaktio oli oleellisesti tapahtunut loppuun.

Reaktioseokseen lisättiin 10 ml vettä, minkä jälkeen uutettiin kaksi kertaa 30 ml:11a etyyliasetaattia. Uutteet yhdistettiin, kuivattiin ja väkevöitiin jäännökseksi.

Jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttäen eluointiai-neena kloroformi:metanoli:aramoniumhydroksidi-seoksen (2:1:1, tilavuussuhde) alempaa faasia.

Vastaavat jakeet yhdistettiin rf-arvojensa perusteella. Yhdistetyt jakeet kiteytettiin uudelleen dietyylieetteristä. Ensimmäisen uudelleenkiteyttämisen emäliuos väkevöitiin edelleen, jolloin saatiin toinen erä kiteitä. Otsikkoyhdisteen kokonaissaanto oli 43 mg ja Sp. 105 - 111°C.

Esimerkki 18 CH2C6H5 CH2CH(CH3)2

I I

C6H5CH — NH - N - CONHCHCOOH

0=P-0H

c2h5 32 80051

Liuokseen, joka sisälsi o<-atsafenyylialanyyli-L-leusiini-metyyliesteriä (kts. esimerkki 17) ja yhden ekvivalentin (esterin suhteen) bentsaldehydiä vedettömässä metanolissa, annettiin seista 16 tuntia 3A tyyppisen molekyyliseulan päällä. Saatuun liuokseen lisättiin yksi ekvivalentti (esterin suhteen) etyylifosfonihapon etyyliesteriä ja hivenen natriumetoksidia. Reaktioliuoksen annettiin sen jälkeen seistä 6-8 tuntia. Molekyyliseula poistettiin tämän jälkeen suodattamalla ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Väkevöityyn liuokseen lisättiin 2,1 ekvivalenttia (esterin suhteen) natriumhydroksidia IN vesi-liuoksena ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 6 tuntia. Orgaaninen aines uutettiin etyyliasetaatilla ja vesiliuos tehtiin happameksi pH-arvoon 2,5 lisäämällä IN suolahappoa.

Saatu sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdisteen diastereomeerien seosta.

Esimerkki 19 (L,D) CH2C6H5 CH3

I I

* I *

CH3 — CHNHCH — CO — NHCHCOOH

| (L)

0=P-0H

OH

(IL)-l-aminoetyylifosfonihappo (kts. US-patenttijulkaisu 4.016.148) liuotettiin vedettömään metanoliin ja liuokseen lisättiin pisara kerrallaan yhtä suuri moolimäärä tionyyli-kloridia pitäen lisäyksen aikana liuoksen lämpötilan 0°C:ssa. Lisäyksen tapahduttua saadun liuoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja seisotettiin tässä lämpötilassa 6-8 tuntia. Tämän jälkeen poistettiin haihtuvat ainekset alipaineessa huoneen lämpötilassa, jolloin saatiin puhdistamatonta (lL)-l-aminoetyylifosfonidimetyyliesterihydrokloridia.

tl 33 80051

Dimetyyliesteria ja yhtä suuresta moolimäärästä natriumfenyyli-pyruvaattia metanolissa tehtiin liuos ja liuoksen pH säädettiin välille 6,5 - 7 IN natriumhydroksidiliuoksella ja käsiteltiin 50 %:lla mooliylimäärällä natriumsyanoboorihydridiä. Reaktio-seosta sekoitettiin kaksi päivää huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen se kaadetaan veteen. Saadun vesiliuoksen pH säädettiin välille 2 - 3 ja saatu sakka uutettiin etyyliasetaatilla. Uutteet pestiin vedellä ja kuivattiin. Haihduttamalla liuotin saatiin puhdistamatonta monohappoa, jonka kaava on CH2C6H5

CH3 — CH — NHCH — C02H

0=P / \

MeO OMe

Monohappo, ekvivalentti (monohapon suhteen) L-alaniinimetyyli-esterihydrokloridia ja ekvivalentti (monohapon suhteen) N-etyy-limorfoliinia liuotettiin yhdessä dimetyyliformamidiin. Saatu seos jäähdytettiin öin 0°C:een ja liuokseen lisättiin yksi ekvivalentti (monohapon suhteen) N-(3-dimetyyliaminopropyyli)-N*-etyylikarbodi-imidi-hydrokloridia ja yksi ekvivalnetti N-etyylimorfoliinia ja dimetyyliformamidia.

Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilassa, sekoitettiin yön yli. Sen jälkeen se kaadettiin veteen ja saostunut tuote uutettiin etyyliasetaatilla. Uutteet pestiin 0,5 %:lla (paino/tilavuus) suolahapolla ja sen jälkeen natriumbikarbonaatin kyllästetyllä liuoksella, kuivattiin ja haihdutettiin jolloin saatiin yhdistettä, jonka kaava on CH2C6H5 ch3 CH3 — CH — NH — CH — CO — NHCHCOOCH3 o=p-och3 6ch3 34 8 0 0 51 Tämä tuote liuotettiin metanoliin ja saatuun liuokseen lisättiin tipottain 3,1 ekvivalenttia (tuotteen suhteen) natrium-hydroksidia IN liuoksena. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se väkevöitiin alipaineessa, laimennettiin vedellä ja säädettiin pH-arvoon 3 - 4 IN suola-happoliuoksella. Saostuneet tuotteet suodatettiin, pestiin vedellä, kuivattiin, jolloin saatiin otsikkoyhdisteen diastereo-meerinen seos.

Esimerkki 20 N-(L-l-bentsyylioksikarbonyyli-2-fenyylietyyli)-L-fenyyli-alanyyl i-/3-alani ini-bentsyyliester i N-[L-l-(fenyylimetoksi)karbonyyli-2-fenyylietyyli]-L-fenyyli-alaniinia (16 g, 39,7 mmoolia), /3-alaniinibentsyyliesteri-tosylaattia (13,9 g, 39,7 mmoolia), 1-hydroksibentsotriatsoli-hydraattia (6,07 g, 1 ekv.), N-etyylimorfoliinia (14,8 ml, 3 ekv.) ja 250 ml kuivaa DMF sekoitettiin huoneen lämpötilassa. Seokseen lisättiin 1 ekv. (7,58 g) l-(3-dimetyyli-amonopro-pyyli )-3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia. Kirkkaan liuoksen annettiin seista yön yli. Saatu tummankeltainen liuos kaadettiin noin 600 ml:aan kylmää vettä ja uutettiin kolme kertaa 300 ml:lla eetteriä. Eetteriliuos pestiin toistuvasti vedellä, kuivattiin ja väkevöitiin öljyksi, (21 g) NMR vastasi tuotetta. TLC osoitti yhden täplän, R 0,7 (CHC13/CH3OH/AcOH.100:5:0,5).

Il

Claims (4)

35 80051

1. Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokasta substituoitua dipeptidia, jonka kaava on f6 Rl - HC - NH - X - CONH - CH - (CH2)y ~ Rg (I) R2 jossa Rl on fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli, naftyyli-(Ci-C4)-alkyyli, (C1-C4)-alkyylifenyyli-(Ci-C4)-alkyyli tai fenyyli-(Ci~C4)-alkyylitio-(Ci~C4)-alkyyli, R2 on karboksyyli, -COO(Ci-C4)-alkyyli tai -COO(Ci~C4)-alkyyli-fenyyli, «4 j*4 X on -CH- tai -N- R4 on tienyyli-(Ci~C4)-alkyyli, fenyyli-(Ci-C4)-alkyyli, jossa fenyyli voi olla substituoitu halogeenilla tai fenyy-lillä, naftyyli-(Ci-C4)-alkyyli tai (C1-C4)-alkyyli, Y on 1 tai 2, Rg on vety, (C1-C4)-alkyyli tai fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli, Rg on karboksyyli, -COO(Ci~C4)-alkyyli, -COCHC1-C4 )-alkyyli-fenyyli, /*20 -CON ; jossa toinen ryhmistä X r21 r20 r21 on vety ja toinen fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli, tai yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat kiinnittyneet, R20 ja R21 muodostavat 5-7 jäsenisen tyydyttyneen renkaan, joka sisältää happea renkaan heteroatomina, tunnettu siitä, että yhdiste valmistetaan jollakin seuraavista menetelmistä, jolloin esitetyissä kaavoissa Ri, R2» R4, Rg» 1*9, R10» r20» r21 3a Y tarkoittavat samaa kuin kaavassa I, mukaanlukien reaktiivisten ryhmien sopivat suojaryhmät, 36 80051 a) pelkistetään kaavan A mukainen yhdiste C=N kaksoissidok-sessa Rl-C=N-X- CONH - CH - (CH2)y - R9 *2 (A) b) kytketään yhdiste A' aminohapon B' kanssa *6 H-HNCH(CH2)y - R9 + Rx - CH - NH - X - COOH «2 ( A' ) (B* ) c) pelkistetään kaavan X mukainen yhdiste C=N kaksoissidok-sessa H R4 R6 ! I I Rl-C-N=C- CONH - CH - (CH2)y - R9 «2 (X) minkä jälkeen haluttaessa poistetaan mahdolliset suojaryhmat ja/tai muodostetaan sen suola.

2. Patenttivaatimuksen la, b tai c mukainen menetelmä kaavan I yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, jossa yhdisteessä X on -CH- II 37 8 0 0 51 jossa R4 on edellä määritelty, tunnettu siitä, että käytetään lähtöainetta, jossa ryhmä X on tässä vaatimuksessa määritelty.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, jossa yhdisteessä on fenyyli-(Ci~C4)-alkyyli tai naftyyli-(Ci~C4)-alkyyli, R4 on bentsyyli, 1- tai 2-naftyyli-metyyli, (C1-C4)-alkyyli, fenyyli-(C1-C4)-alkyyli, naftyyli-(C1-C4)-alkyyli tai 2- tai 3-tienyylimetyyli, Rg on vety, R9 on karboksyyli tai ^/R20 -CON , jossa toinen ryhmistä NVr21 r20 3a r21 on vety ja toinen on fenyyli-(C]_-C4 )-alkyyli, tai yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat kiinnittyneet, r20 3a r21 muodostavat 5-7 jäsenisen tyydyttyneen renkaan, joka sisältää happea renkaan heteroatomina, tunnettu siitä, että lähtöaineen ryhmät Rj_, R4, Rg ja R9 on määritelty tässä vaatimuksessa ja muut ryhmät edellä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä (S)-N-(l-karboksi- 3-fenyylipropyyli)-(S)-fenyyli-alanyyli-/5-alaniinin tai (S)-N-(karboksi-2-fenyylietyyli)-(S)-fenyylialanyyli-^-ala-niinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käytetään lähtöainetta, jossa Y tarkoittaa samaa kuin patenttivaatimuksessa 1, Rl on bentsyyli tai fenyylietyyli, R2 ja R9 tarkoittavat karboksia, X on -CH- ja R4 ja X tarkoittavat vetyä. CH2 38 80051