FI78731B - Foerfarande foer framstaellning av polyeterantibiotika x-14889 a, b, c och d. - Google Patents

Description

78731

Menetelmä polyeetteriantibioottien x-14889 A, B, C ja D valmistamiseksi

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä an-5 tibioottien X-14889 A, B, C ja D valmistamiseksi, jolloin antibiooteilla X-14889 A, B ja C on kaava .. If Me Et % - "''rWrWX*· I O OH OH =

R2 OH

l^OH

R, R5 15 jossa (yhdisteelle X-14889 A) Rx on metyyli, H2 on metyyli, Rj on vety, R4 on metyyli ja R5 on vety ja (yhdisteelle X-14889 B) Rx on metyyli, R2 on metyyli, R3 on vety, R4 on metyyli ja Rj on C02H ja (yhdisteelle X-14889 C) Rx on vety, R2 on metyyli, R3 on vety, R4 on metyyli ja R5 20 on C02H, ja antibiootilla X-14889 D on kaava

He Me ?ie S ^ |T“Et 11 " OH ° Me o_£ ^Me ja antibioottien X-14889 A, C ja D farmaseuttisesti hyväk-30 syttävien suolojen valmistamiseksi.

Esillä olevalle keksinnölle on tunnusomaista, että kantaa Streptomyces X-14889, NRRL 15517 viljellään vesipitoisessa hiilihydraattiliuoksessa, joka sisältää typpiravinnetta, aerobisissa submeresiolosuhteissa, ja sen jäl-35 keen eristetään antibiootit X-14889 A, B, C ja D mainitusta liuoksesta ja haluttaessa antibiootit A, C ja D muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäviksi happoadditiosuoloik-si.

2 78731

Kaavojen I ja II mukaisia yhdisteitä tuottava organismi on uusi laji, jolla on annettu laboratorionimi Streptomyces sp. X-14889. Viljelmä elävästä organismista, jolle on annettu laboratoriotunnus X-14889, on talletettu 5 11.07.1983 laitokseen U.S. Department of Agriculture,

Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratories, Peoria, 111. ja liitetty sen mikro-organismi-kokoelmaan talletustunnuksella NRKL 15517. Viljelmä muistuttaa lähinnä lajia Streptomyces sparsogenes.

10 Streptomyces X-14889:n tyypillisellä kannalla on seuraavat ominaisuudet:

Mikroskooppiset ja kemialliset ominaisuudet X-14889:n kasvusto kasvaa koostumukseltaan erilaisissa agar-väliaineissa muodostaen useille aerobisille 15 actinomykeeteille ominaisen kasvumuodon. Pöhjahuovasto tunkeutuu agariin ja jää fragmentoitumatta kun taas osa ilmassa olevasta kasvustomassasta erottuu itiöketjuiksi. Ketjut ovat spiraaleita, jotka voivat olla avoimista tiukasti kiertyneisiin, ja ne sisältävät yli 10 itiötä ketjussa. Itiöt ovat 20 okamaisia ja niiden keskimääräiset dimensiot ovat 0,65 x 0,91^um.

Kokosoluhydrolysaattien kromatografinen analyysi osoitti LL-diaminopimeliinihapon läsnäolon, mikä edellä lueteltujen ominaisuuksien lisäksi on perusteluna sille, 25 että kanta X-14889 voidaan katsoa kuuluvaksi sukuun Streptomyces.

Makroskooppiset ominaisuudet

Yhteenveto erilaisilla agar-väliaineilla kasvaneiden kasvustojen ominaisuuksista on esitetty seuraavassa tau-30 lukossa 1. Tiedot merkittiin muistiin 14 vuorokautta kestäneen inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa.

3 78731

Taulukko 1

Kasvun määrä Ilmassa olevan Alushuovas- ja itiönmuo- massan väri ton väri 5 Kasvualusta dostusaste_MJ_(1)

Hiiva - Runsas kasvu; Nahanruskea Nahanruskea mallasuute vahamainen uiko- (4 pg) (4 pg) (ISP-2) näkö; ei itiöitä 10 Kauraryyni- Runsas kasvu; hyvä Tuhkanvärinen Harmaa (g) agar itiönmuodostus (5 fe) sekoittu- (ISO-3) neena kul lanruskeaan (3 gc) 15

Epäorgaanisia Runsas kasvu; Tammenruskea Vaalean- suoloja - ei itiöitä (4 pi) ruskea agar (4 ng) (ISP-4) 20

Glyseroli - Heikko kasvu; Vaaleanharmaa Vaalean- asparagiini- ei itiöitä (c) harmaa agar (c) (ISP-5) 25 (1) värikoodi on sama kuin on esitetty julkaisussa The Color

Harmony Manual, 4. painos, Container Corporation of America, 1958.

Fysiologiset ominaisuudet

Viljelmä X-14989 voi kasvaa käyttäen ravintonaan 30 glukoosia, galaktoosia, fruktoosia, arabinoosia, ramnoosia, mannitolia, ruokosokeria ja raffinoosia. Kasvua ei ole ksyloosissa, inositolissa tai selluloosassa ja kasvu on heikko tai epävarma salisiinissa. Streptomysiini estää kasvun. Melamiinin muodostuminen ISP-7 -kasvualustalla, 35 H2S:n muodostuminen ISP-6 -kasvualustalla ja nitraatin pelkistyminen ISP-8 -kasvualustalla ovat negatiiviset. Gelatiini 4 78731 ja kaseiini hydrolysoituvat mutta tärkkelys ei hydrolysoidu. NaCl -sieto on vähäinen (alle 2 %).

Taksonomiset päätelmät

Edellä viljelmälle X-14889 lueteltujen fenotyyppisten 5 ominaisuuksien perusteella tämä viljelmä voidaan lukea kuuluvaksi Streptomyces-lajien ryhmään, jotka lajit muistuttavat merkittävästi tutkittavaa kantaa niiden fenotyyppisten tietojen mukaan, joita näistä lajeista on esitetty kirjallisuudessa, so.

Buchanan, R.E. ja N.E. Gibbons. 1974. Bergey's Manual 10 of Determinative Bacteriology, 8. painos. Williams and Wilkins Co., Baltimore.

Shirling, E.B. ja D. Gottlieb. 1968. Cooperative description of type cultures of Streptomyces. II. Species descriptions from first study. Int. J. Syst. Bacteriol.

15 18: 69-189.

Shirling, E.B. ja D. Gottlieb. 1968. Cooperative description of type cultures of Streptomyces. III. Additional species descriptions from first and second studies. Int. J. Syst. Bacteriol. 18: 279-392.

20 Shirling, E.B. ja D. Gottlieb. 1969. Cooperative description of type strains of Streptomyces. IV. Species descriptions from the second, third and fourth studies.

Int. J. Syst. Bacteriol. 19: 391-512.

Shirling, E.B. ja D. Gottlieb. 1972. Cooperative 25 description of type strains of Streptomyces. V. Additional descriptions. Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 265-394.

Nämä lajit ovat S. albaduncus, S. canus, S. cuspidospo-rus, S. olivoviridis, S. craterifer, S. saraceticus ja S. sparsogenes. S. albaduncus eroaa kannasta X-14889 ksy-30 loosin, inositolin ja ruokosokerin käyttämisen suhteen; S. canus käyttää ksyloosia ja inositolia; S. cuspidosporus kasvaa ksyloosissa, inositolissa ja salisiinissa; S. olivoviridis on negatiivinen raffinoosin ja ruokosokerin suhteen ja positiivinen ksyloosin suhteen; S. craterifer käyttää 35 ksyloosia ja ruokosokerin ja raffinoosin käyttö on epävarmaa; S. saraceticus käyttää ksyloosia mutta ramnoosin käyttö on 5 78731 epävarmaa. S. sparsogenes on ehkä laji, joka lähinnä muistuttaa kantaa X-14889. Kumpikaan organismeista ei muodosta hyvin itiöitä tietyillä kasvualustoilla ja sokerien käyttäminen on samanlainen lukuunottamatta ksyloosia, jota S. sparso-5 genes käyttää, ja galaktoosia, jonka suhteen tämä laji on negatiivinen. Muihin eroihin kuuluu se seikka, että yksittäiset itiöt S. sparsogenes -lajin itiöketjuissa ovat epäselviä, mikä viittaa itiötupen olemassaoloon ja itiömassan hygroskooppiseen luonteeseen. Yhteenvetona on todettava, että vaikkakin 10 X-14889 muistuttaa useita muita Streptomyces-suvun lajeja, ainutlaatuisten antibioottien tuottaminen ja lukuisat fysiologiset ja morfologiset ominaisuudet erottavat sen kaikista muista lajeista, joihin sitä on verrattu.

Tässä kuvattu laji Streptomyces X-14889 käsittää kaik-15 ki Streptomyces-kannat, jotka tuottavat kaavojen I ja II

mukaisia yhdisteitä ja joita ei voida varmasti erottaa mikro-organismista numero X-14889 ja sen alaviljelmistä mukaanluettuina mutantit ja variantit. Kaavojen I ja II mukaiset yhdisteet on identifioitu tässä ja kun tämä identifiointi 20 tunnetaan, on helppoa erottaa kaavojen I ja II mukaisia yhdisteitä tuottavat kannat muista kannoista.

Streptomyces sp. X-14889 tuottaa sopivissa olosuh-: teissä kasvatettuna kaavojen I ja II mukaisia yhdisteitä.

Streptomyces-lajia X-14889 sisältävä fermentointiliemi val-25 mistetaan siirtämällä kaavojen I ja II mukaisia yhdisteitä tuottavan organismin itiöitä tai myseeliä sopivaan ravinto-alustaan ja viljelemällä aerobisissa olosuhteissa. Kaavojen I ja II mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi viljely kiinteällä kasvualustalla on mahdollista, mutta suurten määrien 30 tuottamiseksi on edullista toteuttaa viljely nestemäisessä kasvualustassa. Viljelylämpötilaa voidaan vaihdella laajalla alueella, 20-35°C, jossa organismi voi kasvaa, mutta 26-30°C:n lämpötila ja oleellisen neutraali pH ovat suositeltavia. Organismin aerobisessa uppoviljelyssä kaavojen I 35 ja II mukaisten yhdisteiden tuottamiseksi kasvualusta voi sisältää hiililähteenä kaupallisesti saatavaa glyseridiöljyä 6 78731 tai hiilihydraattia kuten glyserolia, glukoosia, maltoosia, laktoosia, dekstriiniä, tärkkelystä, jne. puhtaina tai puhdistamat tornina muotoina ja typpilähteenä orgaanista ainesta kuten soijapapujauhon liukoisia tislaustuotteita, maapähkinä-5 jauhoa, puuvillansiemenjauhoa, lihauutetta, peptonia, kala-jauhoa, hiivauutetta, maissin liotusnestettä jne. ja haluttaessa epäorgaanisia typpilähteitä kuten nitraatteja ja ammoniumsuoloja ja mineraalisuoloja kuten ammoniumsulfaattia, magnesiumsulfaattia ja niiden kaltaisia. Se voi sisältää myös 10 natriumkloridia, kaliumkloridia, kaliumfosfaattia ja niiden kaltaisia ja puskurointiaineita kuten natriumsitraattia, kalsiumkarbonaattia tai fosfaatteja hivenmäärinä raskas-metallisuoloja. Ilmastetuissa uppoviljelymenetelmissä käytetään vaahdonestoainetta kuten nestemäistä parafiinia, rasva-15 happoja tai silikoniyhdisteitä. Kaavojen I ja II mukaisten yhdisteiden tuottamiseksi voidaan käyttää useamman kuin yhdenlaista hiililähdettä, typpilähdettä tai vaahdonestoainetta. Seuraavat esimerkit valaisevat tätä keksintöä.

20 Esimerkki 1

Streptomyces X-14889:n fermentointi ravistuspullossa X-14889-kantaa kasvatetaan ja säilytetään tärkkelys-kaseiini-agar -vinopinnalla, jolla on seuraava koostumus (gramma/litra tislattua vettä): 25 Liukoista tärkkelystä 10,0

Kaseiinia 1,0 K2HP04 0,5

MgSO^ (vedetön) 0,5

Agaria 20,0 30 pH säädetään arvoon 7,4 NaOH:lla ennen autokiavointia.

Vinopinnalle siirrostetaan kantaa X-14889 ja inkuboi-daan 28°C:ssa 10-14 vuorokautta. Möhkäle agaria, joka sisäl-·' tää itiöitä muodostanutta kantaa agar-vinoviljelmästä siir rostetaan sitten 500 ml:n erlenmeyer-pulloon, joka sisältää 35 100 ml steriloitua ymppäyskasvualustaa, jolla on seuraava koostumus (gramma/litra vesijohtovettä): 7 78731 <g>

Soylose 105 10,0

Cerelose® 20,0

CaC03 0,2

CoC13.6H20 0,001 5 Na2S04 1,0 pH arvoon 6,0 ennen sterilointia.

Ympättyä pulloa inkuboidaan 28°C:ssa 72 tuntia kierto-ravistimessa, joka toimii kierrosnopeudella 250 kierrosta minuutissa iskunpituuden ollessa 5,1 cm. 3 ml:n erä (3 % tila-10 vuus/tilavuus) muodostuneesta viljelmästä siirrostetaan sitten 500 ml:n erlenmeyerpulloon, joka sisältää 100 ml steriloitua tuotantokasvualustaa, jolla on sama koostumus kuin ymppäyskasvualustalla. Ympättyä pulloa inkuboidaan 28°C:ssa 6 vuorokautta kiertoravistimessa, joka toimii nopeudella 15 250 min 1 iskunpituuden ollessa 5,1 cm.

Esimerkki 2

Streptomyces X-14889;n fermentointi säiliössä X-14889-kantaa kasvatetaan ja säilytetään tärkkelys-kaseiini-agar -vinopinnalla kuten on kuvattu esimerkissä 1.

20 Möhkäle agaria, joka sisältää itiöitä muodostanutta viljelmää, agarvinoviljelmästä siirretään sitten 6 litran erlenmeyerpulloon, joka sisältää 2 litraa kasvualustaa, jolla on seuraava koostumus (gramma/litra vesijohtovettä):

Soylose® 10,0 25 Cerelose® 20,0

CaC03 0,2

CoC12.6H20 0,001

Na2S04 1,0 pH arvoon 6,0 ennen sterilointia autoklaavissa 45 30 minuutin ajan.

Ympättyä pulloa inkuboidaan 28°C:ssa 5 vuorokautta kiertoravistimessa, joka toimii nopeudella 250 min ^ iskunpituuden ollessa 5,1 cm. 4 litraa muodostuneesta viljelmästä käytetään sitten ymppinä aloitettaessa fermentointi 380 lit-35 ran fermenttorissa, joka sisältää 228 litraa (60 gallonaa) kasvualustaa, jolla on seuraava koostumus (gramma/litra vesijohtovettä) : s 78731

Soylose 105 10,0

Cerelose® 20,0

CaC03 0,2

CoCl0.6H00 1,0 5 Sag 4130 vaahdonestoainettaw0,1 (Union Carbide) pH arvoon 6,0 ennen kuin steriloidaan 45 minuuttia 1.03 barin höyryllä.

Ympättyä kasvualustaa ilmastetaan paineilmalla nopeu- 3 10 della 0,085 m minuutissa ja sekoitetaan sekoittimilla nopeudella 280 min \ Fermentointi suoritetaan 28°C:ssa 72 tunnin ajan. 76 litralla muodostunutta viljelmää ympätään sitten 1900 litran fermenttori, joka sisältää 1368 litraa kasvualustaa, jolla on seuraava koostumus (gramma/litra vesi-15 johtovettä):

Soylose 105^ 10,0

Cerelose^ 20,0

CaC03 0,2

CoC12.6H20 0,001 20 Na2S04 1,0

Sag 4130 vaahdonestoaine^ 0,1 (Union Carbide) pH arvoon 6,0 ennen kuin steriloidaan 45 minuuttia 1.03 barin höyryllä.

25 Ympättyä fermenttoria ilmastetaan sitten paineilmalla 3 nopeudella 0,566 m minuutissa ja sekoitetaan sekoittimilla nopeudella 280 kierrosta minuutissa. Fermentointi suoritetaan 28°C:ssa 139 tunnin ajan.

Esimerkki 3 30 Antibiootin X-14889A eristäminen Streptomyces-kannan X-14889 säiliöfermentoinnista

Koko viljelylientä (1368 litraa), joka oli saatu fer-mentoitaessa 139 tuntia Streptomyces-organismin lajia X-14889, uutettiin kahdesti yhtä suurilla tilavuuksilla etyy-35 liasetaattia talteenotto-pH:ssa (7,1). Liuotinkerros erotettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa öljyksi, öljy 9 78731 liuotettiin n-heksaaniin ja uutettiin kahdesti yhtä suurilla tilavuuksilla asetonitriiliä. Uuttoheksaanifaasi väkevöitiin alennetussa paineessa öljyksi (70 g), liuotettiin 1,5 litraan metyleenikloridia ja pestiin perättäin 0,5 litralla 1N HCl, 5 vettä, kyllästettyä natriumkarbonaattia ja vettä. Liuotin-kerros kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin alennetussa paineessa. Tämä väkevöite kromatografoitiin metyleeni-kloridilietteellä täytetyllä 800 g:n silikageelipylväällä (Davison grade 62). Pylväs eluoitiin 4 litralla metyleeni-10 kloridia, sen jälkeen 4 litralla dietyylieetteri/heksaania (9:1). Otettiin talteen fraktioita, joista kukin oli 40 ml, ja fraktiot n:o 60-120 yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa öljyksi (6 g). öljy liuotettiin minimimäärään metyleenikloridia ja kromatografoitiin metyleenikloridi-15 lietteellä täytetyllä 300 g:n silikageelipylväällä (Davison grade 62). Pylväs eluoitiin 2 litralla metyleenikloridia ja sitten gradientilla välillä 4 litraa dietyylieetteri - n-hek-saani - asetoni - ammoniumhydroksidi (7:3:1:0,02) ja 4 litralla dietyylieetteri/asetonia (9:1). Otettiin talteen frak-20 tioita, joista kukin oli 25 ml. Fraktiot n:o 54-64 yhdistettiin, liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin ja pestiin perättäin 1 N HCl:11a, vedellä, kyllästetyllä natriumkarbonaatilla ja vedellä ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuotin poistettiin 25 alennetussa paineessa ja jäännös kiteytettiin n-heksaanista, jolloin saatiin antibiootti X-14889A.

Sp. 149-150°C, ZH/q5 = +29,3° (cl MeOH:ssa), +16,7° (cl CHCl^:ssa).

Mikroanalyysi, yhdisteelle C33H5q°8 (584,84) : 30 laskettu C 67,77 %, H 10,34 %; saatu C 67,78 %, H 10,50 %.

13

Rakenne varmistettiin C NMR:llä (antibiootti X-14889A » deskarboksiantibiootti X-14889B). Antibiootti X-14889A on tehokas in vitro gram-positiivisia mikro-orga-35 nismeja vastaan. MIC: 6,25-1,57 ^ug/ml.

10 78731

Esimerkki 4

Antibiootin X-14889B natriumsuolan eristäminen säiliö- fermentoinnista

Samasta pylväästä, josta antibiootti X-14889A eristet-5 tiin fraktioista 54-64 (katso esimerkki 3), käsiteltiin fraktioita 124-200 samalla tavalla kuin on kuvattu esimerkissä 3. Kiteytys dietyylieetteristä lisäämällä heksaania antoi tulokseksi antibiootin X-14889B natriumsuolan hemi-hydraattina.

10 Sp. 139-140°C, = 5,9° (cl MeOHtssa), 7,4° (cl CHCl^:ssa).

Mikroanalyysi yhdisteelle C3^H^g010Na.1/2 H20 (659,84): laskettu C 61,89 %, H 9,17 %, Na 3,48 %, H20 1,37 %; saatu C 61,92 %, H 9,27 %, Na 3,55 %, H20 1,71 %.

15 Antibiootin X-14889B rakenne määritettiin sen tallium- suolan röntgensädeanalyysillä (antibiootti X-14889B on tunnetun antibiootin lysoselliinin isomeeri). Antibiootin X-14889B Na-suola on tehokas in vitro gram-positiivisia mikro-organismeja vastaan. MIC: 6,25-0,09 ^ug/ml.

20 Esimerkki 5

Antibiootin X-14889C natriumsuolan eristäminen

Samasta pylväästä, josta eristettiin antibiootit X-14889A ja -B (katso esimerkit 3 ja 4), fraktiot 251-300 antoivat antibiootin X-14889C natriumsuolan esimerkissä 3 25 kuvatulla menetelmällä. Antibiootin X-14889C natriumsuola kiteytyi dietyylieetteristä lisättäessä heksaania mono-hydraattina.

Sp. 139-141°C, /Mq5 - 19,3° (cl CHCl3:ssa). Mikroanalyysi yhdisteelle C33H570-| QNa-H2° (654,82): 30 laskettu C 60,53 %, H 9,08 %, Na 3,51 %, H20 2,75 %; saatu C 60,99 %, 61,24 %, H 9,16 %, 8,79 %, Na 3,68 %, H20 2,00 %.

Rakenne määritettiin röntgensädekristallografisesti (antibiootti X-14889C on lysoselliinin alempi homologi).

11 78731

Esimerkki 6

Antibiootin X-14889D eristäminen

Antibiootin X-14889C emäliemen uudelleenkromatogra-fointi metyleenikloridilietteellä täytetyllä 30 g:n silika-5 geelipylväällä (Davison grade 62), eluointi 400 ml:11a mety-leenikloridia ja sen jälkeen 400 ml :11a dietyylieetteri/ heksaania (1:1) antoi antibiootin X-14889D (vedetön antibiootti X-14889A).

Sp. 117°C.

10 Mikroanalyysi yhdisteelle (566,82): laskettu C 69,93 %, H 10,31 saatu C 69,60 %, 69,87 %, H 10,36 %, 10,28 %.

Rakenne määritettiin röntgensädekristallografisesti. Antibiooteilla X-14889, A, C ja D on mikrobienvastai-15 nen teho lukuisia organismeja vastaan kuten on esitetty seuraavassa taulukossa.

»In vitro Minimiestopitoisuus (^ug/ml)

Mikro-organismi X-14889A X-14889C X-14889D

20 G( + ) cocci

Streptococcus faecium ATCC 8043 1,57 0,08 125

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 6,25 5 125 25 Micrococcus luteus ATCC 9341 6,25 5 G(-t-) sauvat Bacillus mecaterium ATCC 8011 6,25 2,5 1000 30 1 r

Bacillus βρ. E ATCC 27359 3,13 0,63 7,9

Bacillus subtilis ATCC 558 3,13 1,25 1000

Bacillus sp. TA ATCC 27860 3,13 1,25 1000 6( + ) säikeet 35

Mycobacterium phlei ATCC 355 100 50 1000

Streptomvces cellulosae ATCC 3313 100 10 1000 ’2 78731

Homeet

Paecilomvces varioti ATCC 28820 100 125 1000

Penicillium diaitatum 5 ATCC 26821 100 250 1000

Hiivat

Candida albicans NRRL 477 100 62;5 1000

Saccharomvces cerevisiae 10 ATCC 4226 100 500 1000 * Määritettynä agar-diffuusiomenetelmällä.

Kuten edellä on esitetty, esillä olevan keksinnön 15 mukaisilla antibiooteilla ja niiden suoloilla on tiettyjen gram-positiivisten bakteerien kasvuun haitallisesti vaikuttavat ominaisuudet. Ne ovat käyttökelpoisia pesuliuoksissa saniteettitarkoituksiin kuten käsien pesussa ja puhdistettaessa saastuneiden huoneiden tai laboratorioiden laitteita, 20 lattioita tai kalusteita.

Kun näitä antibiootteja käytetään desinfiointiaineina, tulisi alan ammattimiehen ottaa huomioon kulloinkin kysymyksessä olevan antibiootin minimiestoväkevyys laskettaessa kohdeorganismiä vastaan käytettävän antibiootin pitoisuus.

25 Antibiootilla X-14889C on myös seuraavat aktiivi suudet s (A) Teho sian punatautia vastaan

Antibiootin X-14889C natriumsuolalla on in vitro -teho sian punatautia aiheuttavaa organismia Treponema hyodys-30 enteriae vastaan tehon ollessa 5 ^ug/ml. Sian punatautia aiheuttavan Treponema hyodysenteriaen vastaisen tehon tutkimuksessa veriagarlevyt, jotka sisälsivät kahden nelinkertaisen laimennoksen muodostaman sarjan antibioottia ja ipronidatsolia, joka on sian punatautia vastustava aine, 35 ympättiin kymmenkertaisilla laimennoksilla T. hyodysenteriae-kantoja (H 78, H 140, H 179). Kun oli inkuboitu 48 tuntia 13 78731 42°C:ssa anaerobisissa olosuhteissa, merkittiin muistiin mini-miestoväkevyydet yhdisteiden pienimpinä pitoisuuksina, jotka täydellisesti estivät laimeimman ympin jokaisesta T. hyödys-enteriae -kannasta.

5 (B) Teho Plasmodium berghei -organismia vastaan

Antibiootin X-14889C natriumsuolalla on in vitro -teho Plasmodium bergheitä vastaan subkutaanisena annoksena 22 mg/kg.

(C) Teho ravinnon tehokkuuden parantajana eläimillä 10 Antibiootin X-14889C natriumsuolalla on in vitro -teho ravinnon tehokkuuden parantajana märehtijöillä. Antibiootin pitoisuudella 50 ppm oli haihtuvien rasvahappojen kokonaismäärä 154,3 % verrattuna 100 %:iin vertailuarvoon vakiomene-telmällä ruokitulla kokeessa käytetyllä märehtijällä.

15 Edellä esitettyjen in vitro -tulosten perusteella on oletettavissa, että antibiootin X-14889C, jota jäljempänä nimitetään "antibiootiksi" tai "antibioottiseksi yhdisteeksi", antaminen ehkäisee ja hoitaa ketoosia sekä parantaa ravinnon hyväksikäyttöä naudoilla tai sioilla. Ketoosia aiheuttava 20 mekanismi on propionaattiyhdisteiden puutteellinen tuotanto. Nykyään suositeltu hoito on propionihapon tai sellaisten rehujen antaminen, jotka ensisijaisesti muodostavat propio-naatteja. On ilmeistä, että propionaatin muodostumisen edistäminen tavanomaisista rehuista vähentää ketoosin esiinty-25 mistä.

In vitro -tulosten perusteella on ennalta odotettavissa, että antibiootti X-14889C parantaa rehun hyväksikäyttöä märehtivillä eläimillä kun sitä annetaan eläimille oraalisesti. Helpoin tapa antaa antibioottia on sen sekoit-30 taminen eläinten rehuun.

Antibioottia voidaan kuitenkin sopivasti antaa myös muilla tavoilla. Se voidaan esimerkiksi upottaa tabletteihin, lääkejuomiin, isoihin pillereihin tai kapseleihin ja annostella eläimille. Antibioottisen yhdisteen formulointi tällai-35 siksi annosmuodoiksi voidaan toteuttaa eläinlääketieteellisen farmasian alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

14 78731

Kapseleita valmistetaan helposti täyttämällä gela-tiinikapselit halutun antibiootin millä tahansa halutulla muodolla. Haluttaessa antibiootti voidaan laimentaa inertillä jauhemaisella laimentimella kuten sokerilla, tärkkelyksellä 5 tai puhdistetulla kiteisellä selluloosalla sen tilavuuden suurentamiseksi, jotta kapselien täyttö on helpompaa.

Antibioottitabletteja tehdään tavanomaisilla farmaseuttisilla menetelmillä. Tablettien tuotanto on hyvin tunnettu ja pitkälle kehitetty ala. Aktiivisen aineosan lisäksi 10 tabletti sisältää tavallisesti perusmassan, hajoitusaineen, absorbentin, sideaineen ja luistoaineen. Tyypillisiä perus-massoja ovat laktoosi, hieno kuorrutussokeri, natriumkloridi, tärkkelys ja mannitoli. Tärkkelys on myös hyvä hajoitusaine kuten alginiinihappokin. Joskus käytetään myös pinta-aktiivi-15 siä aineita kuten natriumlauryylisulfaattia ja dioktyyli-natriumsulfosukkinaattia. Yleisesti käytettyihin absorbent-teihin taas kuuluvat tärkkelys ja laktoosi kun taas öljymäi-sissä aineissa käytetään myös magnesiumkarbonaattia. Usein käytettyjä sideaineita ovat gelatiini, liimat, tärkkelys, 20 dekstriini ja lukuisat selluloosajohdannaiset. Yleisesti käytettyihin luistoaineisiin kuuluvat magnesiumstearaatti, talkki, parafiinivaha, erilaiset metal1isäippuat ja poly-etyleeniglykoli.

Antibioottinen yhdiste voidaan antaa sitä hitaasti 25 luovuttavana isona pillerinä. Tällaisia pillereitä tehdään kuten tabletteja paitsi että käytetään keinoja, joiden avulla antibiootin liukeneminen hidastuu. Pillereitä tehdään tehoaineen vapauttamiseksi pitkien aikavälien kuluessa. Hidasta liukenemista varten valitaan veteen hyvin niukka-30 liukoinen antibiootin muoto. Ainetta kuten rautaviilajauhoa lisätään pillerin tiheyden suurentamiseksi ja sen pitämiseksi paikallaan pötsin pohjalla.

Antibiootin liukenemista hidastetaan käyttämällä liukenemattomien aineiden muodostamaa matriksia, johon lääke-35 aine upotetaan. Esimerkiksi sellaiset aineet kuin kasvikunnan vahat, puhdistetut mineraalivahat ja veteen liukene- 15 78731 mattomat polymeeriset aineet ovat käyttökelpoisia.

Antibioottia sisältäviä lääkejuomia valmistetaan helpoimmin valitsemalla antibiootin vesiliukoinen muoto. Jos jostain syystä halutaan käyttää liukenematonta muotoa, voi-5 daan tehdä suspensio. Vaihtoehtoisesti lääkejuoma voidaan valmistaa liuokseksi fysiologisesti hyväksyttävään liuotti-meen kuten polyetyleeniglykoliin.

Antibiootin liukenemattomista muodoista voidaan valmistaa suspensioita aineisiin, jotka eivät toimi liuottimina, 10 kuten kasvikunnan öljyihin kuten maapähkinä-, maissi- tai seesamiöljyyn, glykoliin kuten propyleeniglykoliin tai poly-eetteriglykoliin tai veteen, riippuen valitusta antibiootin muodosta.

Sopivat fysiologisesti hyväksyttävät lisäaineet ovat 15 tarpeen antibiootin pitämiseksi suspendoituneena. Lisäaineet voidaan valita sakeuttimista kuten karboksimetyyliselluloo-sasta, polyvinyylipyrrolidonista, gelatiinista ja alginaa-teista. Monet pinta-aktiivisten aineiden luokat auttavat antibiootin suspendoinnissa. Esimerkiksi lesitiini, alkyyli-20 fenoli-polyetyleenioksidiadduktit, naftaleenisulfonaatit, alkyylibentseenisulfonaatit ja polyoksietyleenisorbitoli-esterit ovat käyttökelpoisia suspensioiden tekemiseksi nesteisiin, jotka eivät toimi liuottimina.

Lisäksi voidaan käyttää monia aineita, jotka vaikut-. . 25 tavat nesteen hydrofiilisyyteen, tiheyteen ja pintajänni tykseen, apuna tehtäessä suspensioita yksittäistapauksissa. Esimerkiksi silikoni-vaahdonestoaineet, glykolit, sorbitoli ja sokerit voivat olla käyttökelpoisia suspendointiaineita.

Suspendoitava antibiootti voidaan toimittaa viljeli-30 jälle suspensiona tai antibiootin ja lisäaineiden kuiva-seoksena, joka laimennetaan ennen käyttöä.

Antibiootti voidaan antaa myös märehtijöiden juomavedessä. Se saatetaan juomaveteen lisäämällä veteen sopiva määrä antibiootin vesiliukoista ja veteen suspendoituvaa 35 muotoa. Antibiootin formulointi sen lisäämiseksi juomaveteen noudattaa samoja periaatteita kuin lääkejuomien valmistus.

ie 78731 Käytännöllisin tapa käsitellä eläimiä antibioottisella yhdisteellä on yhdisteen formulointi rehun lisäaineeksi.

Minkä tahansa tyyppiseen rehuun voidaan lisätä lääkkeeksi antibioottisia yhdisteitä; näihin rehuihin kuuluvat tavan-5 omaiset kuivarehut, nestemäiset rehut ja rehupelletit.

Menetelmät lääkeaineiden saattamiseksi eläinten rehuihin ovat hyvin tunnettuja. On tavallista, että lääkkeellä saostettujen rehujen raaka-aineeksi tehdään konsentroitu lääke-esiseos. Tyypillinen lääke-esiseos voi sisältää esi-10 merkiksi noin 1 g:sta noin 400 g:aan lääkeainetta 454 g:ssa esiseosta. Laaja alue johtuu lopulliseen rehuun halutun lääkeainepitoisuuden laajasta alueesta. Esiseokset voivat olla joko nestemäisiä tai kiinteitä.

Märehtijöiden rehujen formulointi siten, että ne 15 sisältävät oikean määrän antibioottia, joka on käyttökelpoinen hoitoon, on hyvin tunnettua. On tarpeen vain laskea yhdisteen määrä, joka halutaan annettavaksi kullekin eläimelle, ottaa huomioon päivittäinen rehumäärä, jonka eläin syö, ja antibioottisen yhdisteen pitoisuus käytettävässä 20 esiseoksessa, ja laskea antibioottisen yhdisteen tai esi-seoksen sopiva pitoisuus rehuissa.

Kaikki formulointi-, sekoitus- ja pelletointimenetel-mät, joita tavallisesti käytetään eläinrehujen valmistuksen alalla, ovat täysin sopivia antibioottista yhdistettä sisäl-25 tävien rehujen tuottamiseksi.

In vitro -tulosten perusteella antibiootin oraalinen anto muuttaa edullisesti propionaattien suhteellista tuotantoa asetaattien tuotantoon nähden pötsissä. Sen vuoksi voidaan olettaa, että sama käsittely olisi edullista myös 30 monogastrisillä eläimillä, jotka fermentoivat kuituista kasviainesta umpisuolessa, koska olisi oletettavissa, että edullinen muutos propionaatti/asetaatti-suhteessa tapahtuisi annettaessa oraalisesti kyseistä antibioottia. Hevoset, siat ja kaniinit ovat esimerkkejä eläimistä, jotka sulatta-35 vat osan ravinnostaan fermentoimalla sen umpisuolessa.

Antibiootin X-14889C saattaminen mihin tahansa edellä ,7 78731 esitettyyn antomuotoon tulisi toteuttaa ottaen huomioon in vitro -tehokkuustaso, joka on edellä esitetty pitoisuudella 50 ppm, ja seuraavassa yhdisteelle annettu LD^-arvo.

Antibiootilla X-14889C on seuraavassa LD^Q-arvoina 5 annettu myrkyllisyys: LDso(PO) =190 mg/kg LD50(IP) = 120 mg/kg

Antibiootit X-14889 A, C ja D ovat polyeetterianti-biootteja ja ne muodostavat erilaisia farmaseuttisesti hyväk-10 syttäviä suoloja. Näitä suoloja valmistetaan kulloinkin kysymyksessä olevan antibiootin vapaasta happomuodosta menetelmillä, jotka ovat hyvin tunnettuja polyeetterityyppisten yhdisteiden alalla; esimerkiksi pesemällä vapaata happoa liuoksessa sopivalla emäksellä tai suolalla. Esimerkkejä 15 tällaisista farmaseuttisesti hyväksyttävistä emäksisistä aineista, jotka pystyvät muodostamaan suoloja keksinnön mukaisessa tarkoituksessa, ovat aikaiimetälliemäkset kuten natrium-hydroksidi, kaliumhydroksidi, litiumhydroksidi ja niiden kaltaiset, maa-alkalimetalliemäkset kuten kalsiumhydroksidi, 20 bariumhydroksidi ja niiden kaltaiset ja ammoniumhydroksidi. Alkaaiimetalli- tai maa-alkalimetallisuolat, jo£ka sopivat farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodostukseen, voivat sisältää sellaisia anioneja kuten karbonaatti, bikarbo-naatti ja sulfaatti.

25 Esimerkkejä orgaanisista emäksistä, jotka muodostavat farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja polyeetteriyhdistei-den kanssa, ovat alemmat alkyyliamiinit, primaariset, sekundaariset ja tertiaariset hydroksi-alempi-alkyyliamiinit kuten etyyliamiini, isopropyyliamiini, dietyyliamiini, 30 metyyli-n-butyyliamiini, etanoliamiini ja dietanoliamiini.

Erityisen edullinen amiini on N-metyyliglukamiini. N-metyyliglukamiinin suolat ovat erityisen arvokkaita vesiliukoisuutensa vuoksi, joka tekee ne sopiviksi parenteraali-seen käyttöön.

35 Antibiootilla X-14889C on myös heikko in vitro -teho pitoisuutena 1 ppm cocci-bakteerien vastaisena aineena lajia Eimeria tenella vastaan.

Claims (1)

1. 2. T^OH °H R, RJ jossa (yhdisteelle X-14889 A) Rx on metyyli, R2 on metyy-15 li, R3 on vety, R4 on metyyli ja R5 on vety ja (yhdisteelle X-14889 B) Rx on metyyli, R2 on metyyli, R3 on vety, R4 on metyyli ja R5 on C02H ja (yhdisteelle X-14889 C) Rt on vety, R2 on metyyli, R3 on vety, R4 on metyyli ja R5 on C02H, ja antibiootilla X-14889 D on kaava 20 Me Me «e — ϊ fi tl Q |h4 Et XI Γ Y*H * n H "U 7^ I Ö H OH ° M* o—/ Me'X Me ^ Me ja antibioottien X-14889 A, C ja D farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii-30 tä, että kantaa Streptomyces X-14889, NRRL 15517 viljellään vesipitoisessa hiilihydraattiliuoksessa, joka sisältää typpiravinnetta, aerobisissa submerssiolosuhteissa, ja sen jälkeen eristetään antibiootit X-14889 A, B, C ja D mainitusta liuoksesta ja haluttaessa antibiootit A, C ja 35 D muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäviksi happoadditio-suoloiksi.