FI77892B - Foerfarande foer immobilisering av en enzymproducerande mikroorganism eller ett enzym producerat medelst denna. - Google Patents

Description

1 77892

Menetelmä entsyymiä tuottavan mikro-organismin tai sillä tuotetun entsyymin immobilisoimiseksi

Keksintö koskee menetelmää entsyymiä tuottavan mik-5 ro-organismin tai sillä tuotetun entsyymin immobilisoimiseksi.

Mikrobisista soluista peräisin olevien entsyymien käyttö spesifisten kemiallisten muunnosten aikaansaamiseksi on hyvin tunnettu. Toteutettaessa tällaisia muunnoksia 10 soluvapaata entsyymivalmistetta, repeytyneitä soluja tai ehjiä soluja voidaan käyttää biokatalyytin lähteenä. Vapaata entsyymiä tai solua voidaan tehokkaasti käyttää panos-tyyppisissä prosesseissa mutta ne eivät sovi jatkuviin teollisuusmittakaavaisiin prosesseihin. Tämä vaikeus on joh-15 tanut lisääntyneeseen kiinnostukseen immobilisoitujen entsyymien eri muotojen valmistusta kohtaan.

US-patentissa 3 779 869 (julkaistu 18.12.1973) esitetään glukoosi-isomeraasi-aktiivisuuden stabilointi käsittelemällä ehjiä bakteerisoluja glutaarialdehydillä. Glutaa-20 rialdehydin käyttö repeytyneiden solujen immobilisoimiseksi koossapysyvän kiinteän tuotteen saamiseksi, jolla on glukoosi-isomeraasi-aktiivisuus, on esitetty US-patentissa 3 980 521 (julkaistu 14.9.1976).

US-patentti 4 060 456 (julkaistu 29.11.1977) käsit-25 tää mikrobisen soluaineksen, jolla on glukoosi-isomeraasi-aktiivisuus, stabiloinnin käsittelemällä kationisella poly-elektrolyytti-flokkulointiaineella kuten polyetyleeni-imii-nillä tai polyvinyylipyrrolidonilla. Polyelektrolyyttien, kuten polyamiinien ja kationisten polyakryyliamidien käyt-50 tö mikrobisolujen, joihin liittyy aktiivisia entsyymejä, stabiloinnissa on esitetty US-patentissa 3 989 569 (julkaistu 2.11.1976).

Ono et ai. kuvaavat Aspergillus niger'istä saatavan naringinaasin immobilisointia adsorboimalla entsyymi 55 tanniini-aminoheksyyliselluloosaan, joka on valmistettu saattamalla aminoheksyyliselluloosa reagoimaan syaani- 2 77892 bromidilla aktivoidun kiinan gallotanniinin kanssa, Agric. Biol. Chem., 42 (10), 1847 - 1853 (1978).

Ohba et ai. esittävät julkaisussa Biotechnology and Bioengineering, Voi. XX, Pp 665 - 676 (1978) , että pul-5 lulanaasi voidaan menestyksellisesti immobilisoida lisäämällä parkkihappoa termofiilin Streptomyces flavochromo-genes'in viljelysuodokseen tanniini-pullulanaasi-adduktin muodostamiseksi, joka sitten voidaan sitoa TEAE-selluloo-saan.

10 US-patentissa 4 212 943 (julkaistu 16.7.1980) esi tetään bakteerisoluryhraä, jolla on lisääntynyt osaskovuus, joka on aikaansaatu saattamalla bakteerisolumassa kosketukseen glutaarialdehydin tai syanuurihalidin ja kationisen polymeerin, joka on saatu polymeroimalla epihalohydriini ja 15 alkyleenipolyamiini, silloitetun reaktiotuotteen kanssa.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää entsyymiä tuottavan mikro-organismin tai sillä tuotetun entsyymin im-mobilisoimiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan reaktiotuote a) saattamalla vesipitoinen väliai-20 ne, joka sisältää entsyymin tai bakteerisolumassan, jolla on biokatalyyttinen aktiivisuus, kosketukseen tanniinin kanssa ja pitkäketjuisen, kationisen polyamiiniflokkuloin-tiaineen kanssa, joka on poly(etyleeni-imiini) tai epi-halogeenihydriini/polyamiini-kopolymeeri, joka on saatu 25 polymeroimalla epihalogeenihydriini alkyleenipolyamiinin kanssa, jonka kaava on Rj^NRNI^, jossa R on alempi alkylee-ni ja R^ ja R2 tarkoittavat alempaa alkyyliä, jolloin epi-halogeenihydriini/polyamiini-moolisuhde on noin 0,60:1 -2,7:1, ja jolloin polymeroinnissa alkyleenipolyamiini on 30 saatettu reagoimaan noin 50 - 90 %:n kanssa polymeroita-vasta epihalogeenihydriinimäärästä antaen reaktion jatkua kunnes reaktioväliaine saavuttaa oleellisesti tasaisen viskositeetin, ja epihalogeenihydriinin loppuosa on saatettu enenevin määrin reagoimaan kationisen polymeerin saamisek-35 si, jolloin polymerointilämpötila on noin 60 - 120 °C; sekä kationisen polyamiiniflokkulointiaineen silloitusainee- i 3 77892 na käytettävän glutaarialdehydin kanssa; ja b) erottamalla reaktiotuote vesipitoisesta väliaineesta.

Keksinnön mukaisen immobilisointimenetelmän on havaittu antavan paljon kovemman reaktiotuotteen kuin alan 5 aikaisemmat menetelmät vaikuttamatta immobilisoidun aineen biokatalyyttiseen aktiivisuuteen. Parantuneen fysikaalisen lujuuden ansiosta voidaan välttää heikompiin järjestelmiin liittyvät ongelmat käytettäessä niitä pidempiä ajanjaksoja pylväspatjareaktorissa, koska aineet, joilla on pienempi 10 lujuus, pyrkivät pehmenemään tai turpoamaan, mistä voi olla seurauksena virtauksen pieneneminen tai pysähtyminen ja/tai kanavoituminen.

Keksinnön mukaisella menetelmällä immobilisoitava biokatalyyttinen aines voi olla koko fermentointituote tai 15 suodos tai siitä peräisin oleva osittain puhdistettu aines. Tällä järjestelmällä voidaan immobilisoida kokonaisia tai repeytyneitä soluja sekä myös vapaita entsyymejä.

Inunobilisoitavan materiaalin talteenotto suoritetaan käyttäen pitkäketjuista, kationista polyamiiniflokkulointi-20 ainetta, joka saatetaan reagoimaan ylimäärän kanssa silloi-tusainetta muodostamaan silloitusaine/flokkulointiaine-ad-dukti.

Edullinen flokkulointiaine on epihalogeenihydrii-ni/polyamiini-kopolymeeri, joka on todettu yhteensopivak-25 si elintarvikkeiden kanssa ja jota on kaupallisesti saatavissa (BETZ 1180, Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania) BETZ 1180:n molekyylipaino on pienempi kuin yksi miljoona, se sisältää n. 0,288 millimoolia aminoryh-miä grammaa kohti liuosta (ninhydriini-määrityksen perus-30 teella) ja sitä markkinoidaan liuoksena, joka sisältää 30 paino-% kuiva-ainetta, laskettuna liuoksen kokonaispainosta. Tämä yhdiste on esitetty US-patenteissa 3 915 904 ja 3 953 330. Yhdiste on näissä kuvattu vesiliukoiseksi ka-tioniseksi polymeeriksi, joka on saatu polymeroimalla epi-35 halohydriini alkyleenipolyamiinin kanssa, jolla on kaava R-j^NRNE^, jossa R on alempi alkyleeni, jossa on 2 - n. 6 4 77892 hiiliatomia ja ja R2 ovat kumpikin alempi alkyyli, jossa on n. 1 - n. 6 hiiliatomia, jolloin epihalohydriinin moolisuhde polyamiiniin on väliltä n. 0,60:1 - n. 2,7:1, ja jolloin polymerointi käsittää alkyleenipolyamiinin saat-5 tamisen reagoimaan n. 50 - n. 90 %:n kanssa polymeroitavas-ta epihalohydriinimäärästä sallien reaktion jatkua kunnes reaktioväliaine saavuttaa pääasiallisesti tasaisen viskositeetin ja jäljellä olevan epihalohydriinin osan saattamisen differentiaalisesti reagoimaan kationisen polymeerin saami-10 seksi polymeroimislämpötilan ollessa n. 60 - n. 120 °C.

Silloittuminen voidaan aikaansaada tuomalla flokku-lointiaine ja glutaarialdehydi erikseen biokatalyytin sisältävään väliaineeseen tai, edullisesti esireaktiolla, joka antaa adduktin lisättäväksi väliaineeseen. Immobilisoi-15 tavan aineen reaktiopotentiaali silloitusaineen suhteen tulisi määrittää, koska silloitusaineen ylimäärästä voi olla seurauksena biokatalyyttisen aktiivisuuden häviötä tai tarpeettomia kustannuksia. Reaktiivisuuden määrittämiseksi glutaarialdehydin suhteen käytetään formol-titraukseksi ni-20 mitettyä menetelmää. Tämä menetelmä, joka osoittaa aldehy-dillä immobilisoitavan aineen helposti reagoivan amiinisi-sällön määrän, on seuraava: 100 ml:n annos immobilisoitavaa ainetta otetaan 250 ml:n dekantterilasiin. Lisätään 50 - 75 ml vettä aineen 25 ohentamiseksi sekoittamisen helpottamiseksi. Lisätään mag-neettisekoitin ja aine säädetään pH-arvoon 8,5 käyttäen pH-mittaria ja natriumhydroksidiliuosta. Kun pH on pysyvästi arvossa 8,5 (annetaan seisoa pari minuuttia solun sisäistä muutosta varten), lisätään 3 ml 37-%:sta (paino/paino) 30 reagenssilaatuista formaldehydiä, jota on stabiloitu 10 -15 %:lla (paino/paino) metanolia. Tämän jälkeen pH laskee, mikä johtuu vapaiden amiiniryhmien reaktiosta aldehydin kanssa.

Käyttäen natriumhydroksidin standardiliuosta kuten 35 1,0 N, pH säädetään takaisin arvoon 8,5 ja ylläpidetään kunnes se on muuttumaton 5 minuuttia (vaaditaan n. 20-25 i , 77892

D

minuutin kokonaisaika). Tarvittu alkalimäärä on formol-tit-rausarvo ilmaistuna yksikössä mekv/dl.

Flokkulointiaineen määrä materiaalin maksimiaggre-goitumista varten määritetään eräällä edullisella työsken-5 telymenetelmällä. Käytetään asteittaista lisäysmenetelmää ja maksimiflokkuloituminen todetaan ylimääräisin lisäyksin päällä oleviin nesteisiin, jotka on saatu linkoamalla flok-kuloitua ainetta. pH läheltä neutraalia on tavallisesti paras tätä määritystä varten, vaikkakin jonkin verran vaihte-1° lua sallitaan, jos biokatalyytin pysyvyys tämän vaatii.

Flokkuloitava materiaali voi olla materiaali sellaisenaan tai sellainen, johon on lisätty tanniinia ja/tai silloitusainetta. Flokkulointiaine voi olla polyamiini tai polyamiinin reaktiotuote silloitusaineen kanssa. Optimime-nettelyn tulisi perustua seuraavan menettelyn tuloksiin flokkulointiainevaatimusten määrittämiseksi maksimiflokku-loitumisen ja halutun biokatalyytin erotettavuuden saavuttamiseksi vieraasta nesteestä.

Otetaan 500 ml:n annos flokkuloitavaa materiaalia 20 ja säädetään pH arvoon 7,0 2N natriumhydroksidiliuoksella tai 2N kloorivetyhappoliuoksella. Flokkulointivalmistetta lisätään sitten asteittain tunnetusta määrästä pitäen pH arvossa 7. Lisäämistä jatketaan kunnes saadaan aikaan flokkuloituminen ja seoksen annetaan sekoittua n. 10 minuuttia. 25 otetaan pieniä näytteitä (kaksi 1,7 ml:n näytettä) ja lin-gotaan 10 000 x g:ssa 5 minuuttia. Päällä olevat nesteet kaadetaan pieniin koeputkiin.

Toiseen päällä olleista nesteistä lisätään pieni määrä flokkulointiainetta samalla sekoittaen ja huolelli-30 sesti tarkkaillen. Jos lisää flokkuloitumista havaitaan, lisätään vielä enemmän flokkulointiainetta pääannokseen sekoittaen ja pitäen pH arvossa 7. (Tämän lisäyksen tulisi olla 10 tai 20 % ensimmäisestä lisätystä määrästä). 10 minuutin sekoittamisen jälkeen näytteenotto ja linkoaminen 35 toistetaan.

Tätä menettelyä jatketaan kunnes ei enää havaita 6 77892 flokkuloitumista lisättäessä edelleen flokkulointiainetta päällä olevaan nesteeseen. Kun flokkulointiainetta on ylimäärin, voidaan toinen päällä olevan nesteen näyte tarkistaa lisäämällä pieni määrä alkuperäistä flokkuloitavaa ai-5 netta tai lisäämällä laimeata tanniiniliuosta.

Tällä menettelyllä saadaan hyvä arvio käytettävästä flokkulointiaineen optimimäärästä. Jos biokatalyytti on liukoinen solun ulkopuolinen aine, silloin menettelyä voidaan muunnella pH:n ja päällä olevien nesteiden tarkistako misen suhteen biokatalyyttisen aktiivisuuden toteamiseksi, sillä biokatalyytin maksimisaostuminen ei satu yhteen materiaalin päämassan maksimiaggregoitumisen kanssa.

Termi "tanniini" käsittää joko hydrolysoituvan tai kondensoidun tyypin. Sopivia tanniinilähteitä ovat kastan-15 jän puu ja kaarna sekä pekaanin kuori yhtä hyvin kuin mantelin kuoret. Quebracho on edullinen tanniinilähde taloudellisten näkökohtien kannalta. Quebracho-tanniinin ohella parkkihappo (molekyylipaino 3100 - 3400), gambiiri-tannii-ni (molekyylipaino 520) ja myrabolaani-tanniinit (molekyy-20 lipaino 1900) ovat sopivia.

Käytettävän nimenomaisen tanniinin valitsemisen jälkeen on toivottavaa määrätä polykationisen flokkulointiaineen suhteellinen stökiometria tanniinin kanssa mitä niiden koflokkuloitumiseen ja reaktiivisuuteen silloitusaineen 25 kanssa tulee.

Polyamiini-flokkulointiaineen reaktiivisuus aldehy-din suhteen voidaan määrittää edellä kuvatun formol-titraus-menetelmän pienellä muunnoksella. Yhden desilitran näytteen asemesta flokkulointiainetta tulisi käyttää 3 ml (tai g) ja 30 laimennettuna vedellä 150 - 175 ml:ksi. Menettelyn loppuosan tulisi olla sama ja lopputiitteri ilmaistaan yksikössä mekv/ml tai g flokkulointiainetta.

Tanniinin koflokkuloitumisen ekvivalenttisuus flok-kulointiaineelle määritetään modifioimalla edellä esitet-35 tyä menettelyä optimiflokkulointiainemäärän määritykselle. Yksi millilitra (tai g) flokkulointiainetta laimennetaan 7 77892 500 ml:ksi vedellä ja pH säädetään arvoon 7 2N natrium-hydroksidilla tai 2N kloorivetyhappoliuoksella. Pitäen pH arvossa 7 ja sekoittaen lisätään 4 g/dl tanniiniliuosta tunnetusta määrästä kunnes tapahtuu saostuminen. 10 minuu-5 tin sekoittamisen jälkeen otetaan kaksi 1,7 ml:n näytettä ja lingotaan 10 000 x g:ssa 5 minuuttia. Päällä olevat nesteet kaadetaan pieniin koeputkiin ja tehdään edelleen pieniä laimennetun flokkulointiaineliuoksen tai tanniiniliuok-sen lisäyksiä tarkkaillen samalla saostumista sen määrittäkö miseksi kumpaa ainetta, tanniinia tai flokkulointiainetta, on ylimäärin liuoksessa. Lisäyksiä jatketaan kunnes tannii-niliuoksen enempi lisääminen ei enää anna saostumaa. Lisätyn tanniinin määrä voidaan sitten ilmaista ekvivalenttina 1 ml:n (tai g:n) flokkulointiainetta koflokkuloitumiselle. 15 Kun flokkulointiainetta käytetään reaktiotuotteenaan silloitusaineen kanssa, on flokkuloitumisvoimakkuus jonkin verran alentunut verrattuna reagoimattomaan aineeseen. Tan-niiniekvivalentti voidaan määrittää suoraan käyttäen reaktiotuotetta edellä esitetyssä menetelmässä.

20 Edellä esitettyjen titrimetristen menetelmien käyttö reagenssimäärien määrittämiseksi on preparatiivisesti toivottava immobilisoitaessa kaupallisesti sopivia määriä bio-katalyyttiä. Jos niiden käyttö ei kuitenkaan ole käytännöllistä, voidaan saada optimimäärien läheinen likiarvo käyt-25 tämällä 0,5 - 1,0 g/litra tanniinia, 1,0 - 1,5 g/litra flokkulointiainetta ja 0,7 - 2,5 g/litra silloitusainetta jokaista 10 g:aa/litra kohti ainesta, joka voidaan ottaa talteen vesipitoisesta väliaineesta flokkuloimalla.

Edellä esitetyn, biokatalyytin immobilisointimene-50 telmän on havaittu olevan tehokas riippumatta siitä onko biokatalyytti ehjien solujen, repeytyneiden solujen tai vapaan entsyymin muodossa. Entsyymejä tuottavia organismeja (ja niillä tuotettuja entsyymejä), jotka voidaan immo-bilisoida tällä menetelmällä, ovat Streptomyces olivaceous, 55 s. griseus, S. olivochromogenes, S. phaeochromogenes,

Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, 8 77892 B. awamori, B. subtilis, Aspergillus niger, A. oryzae ja Protaminobacter rubrum.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki I

5 Biokatalyyttiosasia fermentointisuodoksesta (liukoi nen entsyymi)

Uudelleen muodostettu glukoamylaasisuodos valmistettiin liuottamalla 80 g hienonnettua glukoamylaasival-mistetta 2000 ml:aan vettä. 1900 ml:n annos syntynyttä liu-10 osta flokkuloitiin 11 ml:lla poly(etyleeni-imiinin) 5 g/dl liuosta vedessä pH:ssa, joka oli säädetty arvoon 7 käyttämällä etikkahappoa. Tämä poly(etyleeni-imiinin) (PEI) määrä oli 20-%:sesti ylimääräinen määrään nähden, joka määritettiin tarpeelliseksi flokkulointia varten.

15 Flokkuloituun lietteeseen lisättiin 9,6 ml parkki- hapon (NF-laatuista) 4 g/dl liuosta vedessä. Tämä on park-kihappomäärä, jonka havaittiin olevan ekvivalentti käytetyn PEI-ylimäärän flokkuloinnille.

Glutaarialdehydi (3 mekv) lisättiin laimennoksena 20 0,6 ml 25-%:sta (paino/paino) glutaarialdehydiliuosta n.

100 ml:ssa vettä. Tämä määrä perustui stökiömetriseen tarpeeseen, joka määritettiin formol-titrauksella.

Loppu-pH säädettiin arvoon 6,5 - 7,5 käyttäen IN natriumhydroksidiliuosta ja 1 tunnin seisomisen jälkeen 25 huoneen lämpötilassa kasaantunut kiinteä aine otettiin talteen linkoamalla n. 10 000 x g:ssa 15 minuuttia. Kostea kiinteä aine suulakepuristettiin sitten ja vermisellin muotoiset osaset kuivattiin tyhjöuunissa lievällä ilman si-säänvuodolla 50 °C:ssa 16 tuntia. Syntynyt kuivattu puris-30 te murrettiin osasiksi. Osasten havaittiin sisältävän halutun biokatalyyttisen (glukoamylaasi) aktiivisuuden, kun ne pantiin liuokseen, jossa oli 1 g/dl maltoosia 0,1M natriumasetaattipuskurissa, jonka pH oli 4,2 50 °C:ssa.

Biokatalyyttinen aktiivisuus määritettiin glukoosipitoi- 35 suuden lisäyksellä substraatissa määritettynä tarkistamal-

R

la DEXTROSTIX -reagenssiliuskoilla. Glukoosipitoisuus kas- 9 77892 voi n. 0 mg:sta/dl 20 mg:aan/dl 2 minuutissa huoneen lämpötilassa seoksessa, jossa oli 50 ml substraattia 200 mg:n kanssa biokatalyyttiä. Seosta inkuboitiin sitten sekoittaen 50 °C:ssa. 40 minuutin kuluttua glukoosipitoisuus oli yli 5 250 mg/dl.

Osaset suodatettiin, pestiin ja siirrettiin tuoreeseen annokseen edellä kuvattua substraattia, jossa ne jälleen osoittivat toivottua biokatalyyttistä vaikutusta, jolloin glukoosipitoisuus kasvoi yli 250 mg/dl:ksi 40 minuu-10 tissa. Inkuboitu vertailusubstraatti osoitti n. 0 mg/dl 40 minuutin kuluttua. Imeytymisen jatkuessa substraattiin osaset säilyttivät fysikaalisen eheytensä ilman merkittävää pehmenemistä.

Esimerkki II

15 Biokatalyyttiosasia kokonaiskäymistuotteesta Tässä esimerkissä käytettiin fermentointiliuosta, joka oli tuotettu Streptomyces olivaceous -mutanttikannal-la ja sisälsi solun sisäistä glukoosi-isomeraasia. Solujen kuivapaino oli 7,5 g/litra. Formaldehydin reaktion formol-20 tiitteri määritettiin pH-arvossa 8,5 7,4 mekv/l:ksi.

Seuraavat lisäykset tehtiin 1 l:n annokseen käymis-lientä: yhteensä 1,0 g Quebracho-uutetanniinia lisättiin esiliuotuksen jälkeen veteen väkevyydessä 4 g/dl. Tämä tehtiin tuotteen alku-pH:ssa 5,15. pH säädettiin sitten arvoon 25 9,0 2N natriumhydroksidilla.

Epihalohydriini/polyamiini-kopolymeerivalmiste (BETZ 1180 firmasta BETZ Laboratories Inc.), jota tämän jälkeen nimitetään polyamiini-flokkulointiaineeksi, sekoitettiin glutaarialdehydin kanssa lisäämällä polyamiini vesipitoi-30 seen glutaarialdehydiliuokseen, jonka väkevyys oli n. 3,5 % (paino/paino). Polyamiini oli esilaimennettu veteen n.

2 %:n kuiva-ainepitoisuuteen ja pH säädetty arvoon 9,0, joka ylläpidettiin amiinin lisäyksen ajan. Lopullinen seos sisälsi 1,77 g/dl glutaarialdehydiä ja 1,3 g/dl polyamii-35 nia, mikä antoi aldehydiylimääräksi 0,34 mekv/ml. Glutaarialdehydin ja polyamiinin seos lisättiin pH-arvoon 9 sää- 10 77892 dettyyn fermentointituotteeseen, joka sisälsi tanniinia määrässä 112,5 ml/1 alkuperäistä tuotetilavuutta. Tämän havaittiin olevan tavallinen tarve tällaisten fermentointi-liemien flokkuloimiseksi. Lopullinen glutaarialdehydivä-5 kevyys oli 30 mekv/1 ylimäärin stökiometriseen tarpeeseen nähden.

Polyamiini/glutaarialdehydiadduktin lisäämisen jälkeen pH säädettiin jälleen arvoon 9. Seoksen annettiin seistä n. 3 tuntia ja kasautunut kiinteä aine suodatettiin 10 tyhjössä ja pidätettiin paperikiekoille. Saatu kakku poistettiin paperista ja pursotettiin käsin käyttäen 10 ml:n muoviruiskua, jonka aukon läpimitta oli 1,5 mm. Puristetta kuivattiin muutama tunti kuvun alla kohtuullisella ilmavirtauksella ja sitten kiertoilmauunissa 60 °C:ssa 8 tuntia.

15 Vertailua varten tehtiin muita valmisteita, joissa joku reagensseista jätettiin pois tai käytettiin ainoastaan tanniinia tai glutaarialdehydiä kasauman talteenottamisek-si. Näissä tapauksissa muodostuneet kasautumat eivät usein olleet talteenotettavissa helposti suodattamalla ja niin ne 20 lingottiin ja niistä poistettiin vesi, puristamalla paperi-kerroksen välissä siten, että niiden kosteus oli vertailukelpoinen suodatuskakkukosteuden kanssa. Muut talteenotto-olosuhteet pysyivät samoina. Kun joko polyamiini tai glutaa-rialdehydi jätettiin pois, adduktia ei valmistettu mutta 25 reagensseja käytettiin samoissa laimennuksissa kuin adduk-tivalmistetta. Tanniini itsessään arvioitiin myös pH-arvos-sa 7 mikä antoi paremman flokkuloitumisen kuin pH-arvossa 9.

Edellä kuvatulla tavalla valmistetut kuivatut aineet 30 hierrettiin pehmeästi käsin huhmarella ja petkeleellä ja hierretty aines, joka läpäisi Tyler-seulalukua nro 24 vastaavan seulan ja kerääntyi Tyler-seulalukua nro 28 vastaavalle seulalle, säilytettiin. Aines arvioitiin lujuuden suhteen uudelleenhydratoinnin jälkeen puristuskennossa ja 35 suhteellinen lujuus määritettiin työstä, joka tarvittiin puristamaan näyte murto-osaan alkuperäisestä uudelleenhyd-ratusta tilavuudesta.

77892 11

Kovuus ilmaistaan suhteessa bakteerisolukasauman osasten puristuslujuuteen. Käytettiin Instron Universal Tester Model 1102-laitteita samalla tavalla kuin on kuvattu US. patentissa nro 3 935 069. Tätä laitetta on saatavis-5 sa firmasta Instron Corporation, Canton, Massachusetts.

Kuormitus eli testikenno, jota käytetään edellä mainitun Instron Tester-laitteen kanssa käsittää läpinäkyvän akryylimuovisylinterin, jonka sisäläpimitta on 1,720 tuumaa (4,37 cm) ja ulkoläpimitta 2,520 tuumaa (6,54 cm) ja korkeus 10 8,5625 tuumaa (21,8 cm). Pohjaosassa on 0,25 tuumaa (0,635 cm) paksu porras, jossa on 1,5 tuuman (3,81 cm) aukko muodostamaan tuki mikrosuodattimelle. Sopiva mikrosuodatin on keh-ruusuulake, jota käytetään tekstiilien kehruussa, ja jossa on 14 500 aukkoa,joiden läpimitta on n. 0,008 tuumaa 15 (0,2032 mm).

Tyypin 304 ruostumattomasta teräksestä tehty mäntä, läpimitta 1,693 tuumaa (4,3 cm) ja pituus 5,375 tuumaa (13,66 cm) on asennettu niin, että se liukuu samankeskeisesti edellä mainittuun sylinteriin.Sopivat merkit on sijoitettu 20 pitkin kuormituskennoa osoittamaan näytteen syvyys 4 tuumaa (10,17 cm). Laitteet on myös järjestetty alennetun paineen tai tyhjön aikaansaamiseksi kuormituskennon pohjalle ja kaiken mikrosuodattimen läpäisevän nesteen kokoamiseksi.

Jos bakteerisolukasauman näyte sijoitetaan kuormi-25 tuskennon yläpuolelle ja näytteeseen kohdistetaan puristus männän kautta, näyte puristuu. Puristus, joka tarvitaan puristamaan näytettä annetun määrän on osoitus näytteen kovuudesta.

Tulokset tästä kokeesta on esitetty taulukossa I.

i2 77892

Taulukko I

Näyte Suhteellinen lujuus kuvattu käsittely = 100 5 tanniini jätetty pois 68 glutaarialdehydi jätetty pois 49 polyamiini jätetty pois ei mitään * pelkästään glutaarialdehydi ei mitään * ainoastaan tanniini (pH 9) ei mitään * 10 ainoastaan tanniini (pH 7) ei mitään * * Nämä näytteet menettivät osastensa yhtenäisyyden kun ne hydratoitiin uudelleen ja niiden lujuus oli riittämätön oikeata testausta varten.

15 Kaikilla edellä esitetyillä osasilla oli haluttu biokatalyyttinen (glukoosi-isomeraasi)-aktiivisuus.

Esimerkki III

Biokatalyyttiosasia fermentointituotteesta Tässä esimerkissä fermentointituotteen talteenotos-20 sa Streptomyces olivaceus -mutanttikannasta, glutaarialdehy-din ylimäärä vähennettiin 30 mekv/l:sta 4 mekv/l:aan lopullisessa seoksessa.

Käytetty menetelmä oli ainoastaan osan polyamiini/ glutaarialdehydi-adduktin lisääminen, mitä seurasi lisää 25 polyamiinia (sama laimennus) antamaan flokkuloituminen.

Parkkihappoa lisättiin 0,5 g ja 1,0 g litraa kohti alkuperäistuotetta käyttäen vesipitoista liuosta, jonka pitoisuus oli 4 g/dl. Muut talteenotto-olosuhteet olivat kuten edellisessä esimerkissä. Saadut uudelleenhydratoitujen 30 osasten lujuudet on esitetty taulukossa II.

i3 77892

Taulukko II

Näyte Suhteellinen lujuus parkkihappo jätetty pois = 100 5 parkkihapon pitoisuus 1 g/1 110 parkkihapon pitoisuus 0,5 g/1 111 parkkihappo jätetty pois, 30 mekv/l:n aldehydiylimäärä 94 10 Parkkihappomäärä 1 g/1 oli samanarvoinen 27 %:n po- lyamiini/glutaarialdehydi-adduktia koflokkulointia varten (13,5 % 0,5 g/1 määrälle).

Esimerkki IV

Biokatalyyttiosasia fermentointituotteesta 15 Tämän kokeen lähtöaineena oli Streptomyces olivaceus -mutanttikannan fermentointituote. Sen kuivasolupitoisuus oli 7,35 g/1, pH 7,3 ja aldehydireaktiivisuuskapasiteetti 44,7 mekv/1 pH 8,5:ssa.

227 l:n annosta fermentointituotetta käsiteltiin 20 2,5 N natriumhydroksidilla pH:n saattamiseksi arvoon 9,0.

25 1 polyamiini/glutaarialdehydi-adduktia, joka oli valmistettu kuten esimerkissä II, lisättiin sitten vähitellen ja sekoittaen. Loppu-pH oli 8,8. Yhden tunnin varovaisen sekoittamisen jälkeen kasautunut kiinteä aine otettiin tal-25 teen suodattamalla. Kiinteä kakku suulakepuristettiin, kuivattiin kiertoilmaHa 60 °C:ssa ja jauhettiin karkeiksi osasiksi.

Samalla tavalla lisättiin 257 l:aan tuotetta 257 g Quebracho-tanniini-uutetta vesiliuoksena, jonka pitoisuus 30 oli 3,9 g/dl. Yhden tunnin kuluttua lisäämisestä pH säädettiin 7,2-9,0 2,5 N natriumhydroksidilla. Sen jälkeen li sättiin sekoittaen 28,3 1 polyamiini/glutaarialdehydi-ad-duktia vähitellen.

Talteenoton jälkeen kuten ensimmäisessä annoksessa 35 ilman tanniinia, samankokoisia osasia arvioitiin mekaanisen lujuuden suhteen uudelleenhydratoinnin jälkeen. Näytteelle ilman tanniinia määrättiin suhteellinen lujuus 100, i4 77892 kun taas tanniinia sisältävän näytteen suhteellisen lujuuden havaittiin olevan 190.

Näillä osasilla oli haluttu biokatalyyttinen (glukoo-si-isomeraasi)aktiivisuus.

5 Esimerkki V

Biokatalyyttiosasia fermentointituotteesta Käytettiin toista esimerkissä IV kuvatuntyyppistä fermentointia, jossa kuivasolupitoisuus oli 6,26 g/1 ja pH oli 5,3. Aldehydireaktiivisen aineen sisältö pH-arvossa 8,5 10 oli 32,1 mekv/1. Käyttäen samanlaista menettelyä kuin edellisessä esimerkissä olivat reagoivien aineiden määrät seu-raavat:

Annos 1: 200 l:n tuote 18,8 litraa polyamiini/glutaarialdehydiä 15 Annos 2: 189 l:n tuote 189 g Quebracho-tanniini-uutetta 17,7 litraa polyamiini/glutaarialdehydiä Kummankin panoksen annokset, joilla oli sama osasko-ko, arvioitiin lujuuden suhteen uudelleenhydratoinnin jäl-20 keen.

Näyte Suhteellinen lujuus ilman tanniinia = 100 tanniinia lisäten 224 25

Osasilla oli haluttu biokatalyyttinen (glukoosi-isomeraasi)aktiivisuus.

Esimerkki VI

Biokatalyyttiosasia fermentointituotteesta 30 Bacillus licheniformis ATCC 31604 -mutanttikannan fermentointituote dekantoitiin sen erottamiseksi pienestä määrästä ei-solumaista tiivistä sakkaa. Formol-titrauksel-la määritetty aldehydireaktiivisuussisältö oli pH-arvossa 8,5 91,3 mekv/1.

35 Otettiin 500 ml:n annos ja säädettiin pH arvoon 8. Sitten lisättiin 150 ml polyamiini/epihalohydriini ja i5 77892 glutaarialdehydiadduktia esimerkin II mukaisesti valmistettuna. Tämä määrä oli jonkin verran ylimääräinen määrään verrattuna, joka tarvitaan parasta flokkuloitumista varten. Sitten lisättiin Quebracho-tanniini-uutetta 10 ml 4 g/dl:n 5 liuoksena. Yhden tunnin seisomisen jälkeen kasautunut kiinteä aine otettiin talteen linkoamalla ja suulakepuristet-tiin sitten käyttäen muoviruiskua ja kuivattiin 60 °C:ssa kiertoilmauunissa.

Osasia saatiin jauhamalla kuivattu aines varovasti. 10 Kun nämä osaset hydratoitiin uudelleen 40 %:n paino/paino glukoosiliuoksessa ne säilyttivät fysikaalisen eheytensä ja biokatalyyttisen (glukoosi-isomeraasi)aktiivisuutensa jatkuvan liuottamisen jälkeen 70 °C:ssa 24 tunnin aikana.

Esimerkki VII

15 Palatinoosia tuottavan entsyymiaktiivisuuden omaavan biomassan immobilisointi

Pienmittakaavaisia fermentointitutkimuksia tehtiin kahdessa 14 l:n Chemapec LF-14 käymisastiassa (työskentely-tilavuus 10 1). Kumpikin käymisastia oli varustettu liuos-20 tetun hapen ja pH:n mittauslaitteella ja kytkettiin jaksottaan putken kautta Perkin-Elmer MGA-1200 prosessikaasun analysointilaitteeseen C02:n, argonin, hapen, typen, H20:n ja NH^sn mittaamiseksi fermentoinnin poistokaasussa; C02 oli tietenkin ensisijaisesti kiinnostava.

25 Fermentoimisväliaine oli juurikas paksumehu, jon ka väkevyys oli 5 Brix ja joka oli täydennetty 0,1 %:lla (NH^)2HPO^ ja 2,0 %:lla maissin liotuslientä.

Käymisastia ympättiin 100 ml:11a Protaminobacter rubrum -ymppiä, joka oli saatu kasvattamalla varastovil-30 jelyä edellä kuvatussa väliaineessa ja jota sitten inku-boitiin 30 °C:ssa pyörittäen samalla kierrosnopeudella 290 r/min kiertoravistimella 24 tuntia ennen ymppäystä.

Noin 15 tunnin kuluttua myöhemmässä stabilointikokeessa käytetty biomassa otettiin talteen käymisastiasta.

35 Keksinnön mukainen immobilisointi (menetelmä 2) ja neljä menetelmää, jotka eivät kuulu tämän keksinnön pii- i6 77892 riin, suoritettiin edellä kuvatulla fermentointiliemellä, jonka formol-titrausarvo oli 0,61 mekv/1. Immobilisointimenetelmiä Menetelmä 1 5 Viisisataa (500) ml kokonaistuotetta säädettiin pH- arvoon 6,5 arvosta 4,95 1,0 N NaOHzlla. Tähän lisättiin 55 ml glutaarialdehydi/polyamiini-adduktia, joka oli valmistettu seuraavasti: 1. 11,67 g BETZ 1180 laimennettiin 100 ml:ksi IVOissa; 10 2. pH säädettiin arvoon 9,0; 3. 17,8 ml 25-%:sta glutaarialdehydiä laimennettiin 100 ml:ksi H2<0:ssa; 4. Glutaarialdehydiin lisättiin hitaasti BETZ 1180 -liuos; 5. pH säädettiin uudelleen arvoon 9,0; 15 ja yhdistelmän annettiin reagoida 25 °C:ssa 1 tunti. Menetelmä 2 500 ml:aan kokonaistuotetta lisättiin hitaasti 12.5 ml Quebracho-tanniinin 4,0 g/dl liuosta kunnes tapahtui solujen flokkuloituminen. Liuos pidettiin 25 °C:ssa 30 20 minuuttia, jona ajankohtana liuoksen pH säädettiin arvoon 6.5 1,0 N NaOH:lla ja lisättiin 65 ml glutaarialdehydi/ polyamiini-liuosta, joka oli valmistettu kuten menetelmässä 1 selostettiin. Liuos pidettiin sitten 25 °C:ssa yhden tunnin ajan.

25 Menetelmä 3 500 ml:aan kokonaistuotetta lisättiin 12,5 ml 4,0-%:sta paino/tilav. Quebracho-tanniinia. Sen jälkeen, kun pH oli säädetty arvoon 6,5 1,0 N NaOH:lla lisättiin 60 ml l,67-%:sta glutaarialdehydiä ja liuos pidettiin 30 25 °C:ssa.

Menetelmä 4 500 ml:aan kokonaistuotetta lisättiin 2,5 ml 10-%:sta paino/tilav. polyetyleeni-imiiniä (PEI). Tämä pidettiin 25 °C:ssa 30 minuuttia. Liuoksen pH säädettiin ar-35 voon 6,5 1,0 N NaOH:lla ja lisättiin 50 ml l,67-%:sta paino/tilav. glutaarialdehydiä. Saatu liuos pidettiin 25 °C:ssa yhden tunnin ajan.

i7 77892

Menetelmä 5

Viisisataa (500) ml kokonaistuotetta titrattiin pH-arvoon 5 10-%:sella PEI-liuoksella. Liuos pidettiin 25 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin 50 ml 5 l,67-%:sta paino/tilav. glutaarialdehydiä.

Kaikissa edellä esitetyissä menetelmissä flokkuloi-tuneiden solujen annettiin laskeutua ja päällä oleva neste dekantoitiin. Jäämälietettä lingottiin kierrosnopeudella 10 000 r/min 10 minuuttia 25 °C:ssa Sorvali RC-2B -sentri-10 fugissa käyttäen GSA-tyyppistä pyörijää. Tiivistynyt, saostunut biomassa puristettiin sitten ihonalaisiin ruiskeisiin käytettävällä 100 ml:n standardiruiskulla puristaen pasta käsin ruiskun aukon (1,1 - 1,5 mm) läpi ilman kiinnitettyä neulaa. Vermiselliä muistuttava puriste kuivattiin 40 °C:ssa 15 kiertoilmauunissa ja murskattiin sitten likimääräismittai-siksi osasiksi lisätestausta varten. Tällaisten testien tulokset on esitetty taulukossa III.

ie 77892 ro

dP

CO i 3 <H G :3 3 d> G I G 3 :3 coovo 4->0> -P d) 3 g

•h » » in r> in <u cn <u -P o > rH

> ro in v v ^ d -h Ό 4J io 3 o

•H M (N (N ID CO 0) 3 O *H -H .G -P

•h gxj^&oonjtuaj

-P Ή O CO -H G

Λί · 3 Λί 3 G cn φ < 3 03 -Γ-Ι-Η ·· g •H 3 3 -rl U ID ui P -P CO 3 -MO -P >1

Φ -P O CO +j >i-P

cn +J id m id o :id -h cn -H -P > · M n G Ci >,01 oo id '»cm Gtn :<d o i-ι :3 +jn n m in n h qi -h ' -h G 3 :3

•rl i—I ^'»'»OrH l+J E h Ή -H H E

U O ' ' O ' ' CO -H rH CO

:<d e ro ro u-i t—i T—i M-H >i K -P 3 >i :<d o) a) w a-π -h g -p S -P -P E O 3 tn

cn :<d G * >ιΛ -P -H

Φ -P O n! >ι3·ΡΛί

EH -H ·Η (0 ^ *H rH

CO 3 P -P G O d) o rH 3 3 G -H ·η ft

M cd cd -P M a) -H -H

M tn -p -H i» m m li 3 -H p -P o 3 3 ti φ P Φ Φ 3 cn Οι-P G A! 3 JG > g -H I -H 3 -H o M 3 — -rl rH m>o cn -rl m h rH to G G» -HO-Pcn-Pl

H 3 CU D 3 Λ ft 3 H P (O

G PCO nOPPOJ»

O CU 3 -H G 3 E S Ό 3 -P Q

M 3 Oi 3 O Ή g >,M >n

M -P O ^ E O P -HrH®co:3C

3 cn,* O -PG o 3 to *H

rH -H .y 3 p Λί 3 COO) CP ' · Οι >ι·Η 3 Ρ ·Η ·η 3 ·Η -ro G CO g o 3 Οι-Ρ

3 3 φ 3 3 Φ 3 H -H -H3-P

Eh (¾ ffiJAffiP) H inC-P-POd)

G rH 3-PC0-H4J rH

Φ Φ * 3 3 O -P >1 g :3 d) tn ·· 3 3 M :3

3 -P-P >irl β·Η 3JC H

Ή O g -P .G -Pg-HrHQJ O

G > 3 O co >1 3 Ή g -H Ρί 3 g O P 3 <n cm »den prHcn-Γ-ι a__ P3-P ''III M :3 O O · -P so o o G ai G 10 O G Ή G >i Cp G 3 g-HpQjcno

H 4ΙΛ! ·Η> -H 3 3 3 Ai O

HO) G -P CO A! -P -H rH

-P rH -H -H CO X CO -P

•PO· g O 3 3 ·Η 3 -H

O O) 3 >ιΌ rH CO > 3 rH

G 3 -P -H -H >1 G -H 3 G O

•H -P -H 4J M CO CU -P 3 P -H

33<yirHI--00 00 P-P3-P QiCO -P g cn £ii 3 o r~ o rH r-' ad>i-P G tn Oi tn 3 3 3 en *'''' :3 ad ai 3 E ·· H m 3 > ro ro cm ro ro g G 3 to «d <#> Ή tn

•H CO G rH I 3 G -H

3 0> coa)G3Äoga)> 3 -P Φ 3 01 S H s) id ·Η

3 CO -P ·Η d) d) C0C0 -H

•n-H 3 O g Φ G d) -P

3 P 3 to G 3 3 d) M

:3 H d tn -H 003-H -P 3 g Οι-H rH in 3 .. +j 3

rH G>-HrHj3rH+J3G

d) rH (N ro H· LO d) LO -H Xl A g 3 X Φ

•P d) -H O 2 G 3 -H E

φ AiG-Pgo-HOGtnd)

d 3 :3 M g 00 -h o -H o> -H

φ Cig3HV4JrHg>Pl s rH CM ro

Claims (6)

1. Menetelmä entsyymiä tuottavan mikro-organismin tai sillä tuotetun entsyymin immobilisoimiseksi, t u n - 5. e t t u siitä, että muodostetaan reaktiotuote a) saattamalla vesipitoinen väliaine, joka sisältää entsyymin tai bakteerisolumassan, jolla on biokatalyytti-nen aktiivisuus, kosketukseen tanniinin kanssa ja pitkä-ketjuisen, kationisen polyamiiniflokkulointiaineen kanssa, 10 joka on poly(etyleeni-imiini) tai epihalogeenihydriini/po-lyamiini-kopolymeeri, joka on saatu polymeroimalla epi-halogeenihydriini alkyleenipolyamiinin kanssa, jonka kaava on R^I^NRNI^, jossa R on alempi alkyleeni ja R^ ja R2 tarkoittavat alempaa alkyyliä, jolloin epihalogeenihydriini/ 15 polyamiini-moolisuhde on noin 0,60:1 - 2,7:1, ja jolloin polymeroinnissa alkyleenipolyamiini on saatettu reagoimaan noin 50 - 90 %:n kanssa polymeroitavasta epihalogeenihydrii-nimäärästä antaen reaktion jatkua kunnes reaktioväliaine saavuttaa oleellisesti tasaisen viskositeetin, ja epi-20 halogeenihydriinin loppuosa on saatettu enenevin määrin reagoimaan kationisen polymeerin saamiseksi, jolloin poly-merointilämpötila on noin 60 - 120 °C; sekä kationisen polyamiinif lokkulointiaineen silloitusaineena käytettävän glutaarialdehydin kanssa; ja 25 b) erottamalla reaktiotuote vesipitoisesta väliai neesta .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoitava materiaali on vapaa entsyymi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että immobilisoitava materiaali on ehjien tai hajoitettujen mikro-organismisolujen muodossa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä mikro-organismin Protaminobacter rubrum immobilisoimiseksi, t u n-35 n e t t u siitä, että a) muodostetaan mikro-organismin soluja sisältävä vesipitoinen väliaine, 20 7 7 8 9 2 b) lisätään vesipitoiseen väliaineeseen tanniinia, c) lisätään vesipitoiseen väliaineeseen glutaari-aldehydin ja epihalogeenihydriini/polyamiini-kopolymeerin addukti reaktiotuotteen muodostamiseksi, 5 d) poistetaan reaktiotuote vesipitoisesta väliai neesta, ja e) kuivataan reaktiotuote.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiotuote saatetaan kosketukseen 10 sakkaroosin kanssa sen muuttamiseksi palatinoosiksi.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tanniini on Quebracho-tanniinia ja sitä lisätään vesipitoiseen väliaineeseen ennen adduktia. 21 77892