FI77672B - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara n-nitroso-n-( -kloretyl)karbamoylpeptidderivat. - Google Patents

Description

1 77672

Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten N-nitro-so-N-( fi> -kloorietyyli)karbamoyylipeptidijohdannaisten valmistamiseksi 5 Keksinnön kohteena on menetelmä uusien, terapeutti sesti käyttökelpoisten N-nitroso-N-(β-kloorietyyli)karbamoyylipeptidi johdannaisten valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava (I)

NO

10 ci-ch2-ch2-n-co-nh--R (I) n jossa R on ryhmä, joka on johdettu oligopeptidistä poistamalla pääteaminoryhmä tai, jos oligopeptidi sisältää diami-15 nokarboksyylihapon, Lu -asemassa oleva aminoryhmä tai sekä pääteaminoryhmä että ίΟ-aminoryhmä, jolloin oligopeptidi on gastriini- tai öi>-melanotropiinifragmentti tai gastrii-nin analogi, joka sisältää norleusiiniosan ja jolla on tämän hormonin luonteenomainen biologinen vaikutus; ja n on 20 1 tai 2; ja näiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi.

Yleiskaavan (I) mukaisten yhdisteiden happoadditio-suolat voivat olla terapeuttisesti hyväksyttävien epäorgaanisten tai orgaanisten happojen kanssa muodostettuja happoadditiosuoloja.

25 On tunnettua, että N-nitrosourean yft-kloorietyyli- johdannaisilla esimerkiksi 1,3-bis-(y3-kloorietyyli)-1-nitrosourealla, lyhennettynä BCNU, /T.P. Johnston, G.S. McCaleb, J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 6 (1963) 669.7 ja 1-( J2-kloorietyyli)-l-nitroso-3-sykloheksyyliurealla, 30 lyhennettynä CCNU, /Ϊ.Ρ. Johnston, G.S. McCaleb, P.S.

Opliger, J.A. Montgomery, J. Med. Chem. 9 (1966) 8927 on merkittävä kasvaimia tuhoava vaikutus, mikä tekee mahdolliseksi käyttää mainittuja yhdisteitä ihmisten hoidossa.

2 77672

Nitrosokloorietyyliurean yleinen haitta on se, että sen vaikuttava annos on erittäin lähellä myrkylli-syysarvoa. Olisi erittäin tärkeätä alentaa mainittujen yhdisteiden myrkyllisyyttä tai lisätä niiden vaikutusta.

5 Periaatteessa vaikutusta voidaan kohottaa valmis tamalla yhdisteitä, jotka sisältävät sytostaattisen ryhmän lisäksi myös molekyyliosan, joka takaa sen, että molekyyli kiinnittyy kasvainkudoksen soluihin suurella affiniteetilla. Siten saadaan aikaan tietyssä mielessä 10 spesifinen vaikutus, ja voidaan käyttää pienempää annosta, joka vähentää yhdisteen yleistä myrkyllisyyttä.

Luonnossa esiintyvät peptidit, erityisesti poly-peptidihormonit, kiinnittyvät erittäin suurella affiniteetilla halutun elimen reseptoreihin. Tästä syystä voi-15 daan odottaa, että myös mainittujen luonnon peptidien N-nitroso-N-(y3-kloorietyyli)karbamoyylijohdannaisten affiniteetti on huomattava, mutta ainoastaan ja yksinomaan sellaiseen paikkaan, joka pystyy tunnistamaan ja identifioimaan peptidiosan rakenteen. Tästä syystä täy-20 dellistä peptidimolekyyliä ei tarvita, ja riittää, että valmistetaan molekyylin se fragmentti (aktiivinen keskus) , jolla on luonteenomainen biologinen vaikutus. Ainoa olennaisen tärkeä ennakkoehto on se, että substituutio ei vaikuta kielteisesti tunnusomaiseen biologiseen 25 vaikutukseen, so. substituoituva aminoryhmä ei saa olla välttämätön tavoiteltavan biologisen vaikutuksen kannalta. Ct^-melanotropiinin fragmentilla ja gastriinin C-terminaalisella tetrapeptidifragmentilla on muiden ohella edellä mainittu ominaisuus.

30 Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien yleisen kaavan (I) mukaisten N-nitroso-N-( ^-kloorietyyli)karba-moyylipeptidijohdannaisten ja niiden happoadditiosuolo-

II

3 77672 jen valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) vapaan aminoryhmän sisältävä peptidi, jolla on yleinen kaava (II) 5 (H0N)R' (II) i n jossa R' on ryhmä, joka on johdettu oligopeptidistä poistamalla pääteaminoryhmä, tai jos oligopeptidi sisältää diami-nokarboksyylihapon, cJ-asemassa oleva aminoryhmä tai sekä 10 pääteaminoryhmä että &J-aminoryhmä, tai mainitun ryhmän suojausryhmällä suojattu johdannainen, jolloin oligopeptidi on gastriini- tai 0L/-melanotropiinifragmentti tai gast-riinin analogi, joka sisältää norleusiiniosan ja jolla on tämän hormonin luonteenomainen biologinen vaikutus; ja n 15 on 1 tai 2, saatetaan reagoimaan isosyanaatin kanssa, jolla on kaava (III) ci-ch2-ch2-nco (III) 20 ja näin saatu yhdiste, jolla on yleinen kaava (IV) ci-ch2-ch2-nh-co-nhT-R' (IV) n 25 jossa R' ja n merkitsevät samaa kuin edellä, nitrosoidaan tai b) peptidi, jolla on yleinen kaava (II) (H2N)nR' (II) 30 jossa R' ja n merkitsevät samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan aktiivisen esterin kanssa, jolla on yleinen kaava (V) 4 77672

NO

C1-CH2-CH2-i!i-CO-OQ (v) 5 jossa Q on peptidikemiassa yleisesti käytetty, hiilivedys tä johdettu, mahdollisesti substituoitu, aktiivisen esterin muodostama ryhmä, ja haluttaessa molekyylissä olevat suojausryhmät poistetaan ja haluttaessa saatu yhdiste muutetaan happoadditiosuolak- 10 seen.

Tämän keksinnön mukaiseen menetelmään soveltuva suojausryhmä voi olla edullisesti t-butoksikarbonyyli-ryhmä, Menetelmässä b) käytetyissä yleiskaavan (V) mukaisissa lähtöaineissa Q on edullisesti fenyyliryhmä, joka 15 on substituoitu yhdellä tai useammalla elektroneja puoleensa vetävä],lä ryhmällä.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaan voidaan menetellä seuraavasti: e^Tjijelanotropiini on 13 aminohaposta muodostunut poly-: 20 peptidihormoni. Sen pienemmillä fragmenteilla, muun muassa ^terminaalisella tripeptidillä, on edelleen hormoonin tunnusomaiset biologiset vaikutukset /helv. 58 (1975) 1528; FEBS Letters 67 (1976) 45/. C-terminaalisen tri-peptidin rakenne näkyy kaavassa (VI).

25 H,,N-CH-CO-N —CH-C0-NH-CH-C0-NHo 2 I 1 I I 2 (CH0). CH- CH0 CH..-CH-CH, (VI) | 2 4 v 2 j 2 J o NH2 XCH2 30 Kaavan (VI) mukainen tripeptidi sisältää kaksi primaarista aminoryhmää, jotka voidaan muuttaa vastaaviksi N-nitroso-N-( yö-kloorietyyli)karbamoyylijohdannaisiksi edellä kuvatuin menetelmin. Tätä tarkoitusta varten

II

5 77672 tunnetun, kaavan (VI1 mukaisen tripeptidin annetaan reagoida /^-kloorietyyli-isosyanaatin kanssa, ja näin saatu oL ,$^bis-($-kloo;rietyylikarbamoyyii) tripeptidi nitrosoidaan jollakin nitrosoivalla aineella, edullisesti natriumnitriitillä hapon ollessä läsnä, tai 5 nitrosyylikloridilla tai typpidioksidilla, jne. Nitrosoinnin jälkeen saadaan kaavan (VII) mukaista bis^-nitroso johdannaista,

NO

10 I

C0-N-CH7-CH7-Cl (vn) NH-CH-CO-N—CH-CO-NH-CH-CO-NR, •Il ! 2 is (CH2)4 CH2 CH2 CH3-CH-CH3 NH CH,

CO-N—Ct-L-CHyCI 20 NO

Kaavan (VII) mukainen bis-nitrosojohdannainen voidaan valmistaa myös yksivaiheisella reaktiolla.

25

Kaavan (VII mukainen C-terminaalinen tripeptidi asyloisaan N-nitroso-N-(β -kloorietyyli)karbamii- ni.hapon aktiivisella esterillä, edullisesti p-nitro- fenyyliesterillä, 1-hydroksibentsotriatsolin ollessa läsnä, 30

Kaavan (VI) mukaisen C-terminaalisen tripeptidin monokarbamoyylijohdannaiset voidaan luonnollisesti ya]mistaa kumnaakin menetelmää käyttäen; tällöin lähtöaineena käytettävän tripeptidin toinen aminoryhmä on suo-. . jattu, edullisesti t-butoksikarbonyyliryhmällä.

6 77672

Substituoidun karbamoyyliryhmän muodostumisen jälkeen suojausryhmä voidaan poistaa selektiivisesti tunnettuja menetelmiä käyttäen (esim. käsittelemällä suolahapolla ja muurahaishapolla!..

5 Gastriini on 1-7 maitohaposta muodostunut poly- peptidiuormoni. Sen C-terminaalisella tetrapeptidillä, so, tetrapeptidin norleusiinianalogilla, on hormoonin tunnusomaiset biologiset vaikutusominaisuudet. C-termi-naalisen tetrapeptidin rakenne näkyy kaavassa (VIII).

10 HjN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH

CH2 (CH2)äCH3 (CHjICOOH CHjC,Hi bo

15 A

Mainittu tunnettu tetrapeptidi ^Nature 207 (19561 1356/ voidaan muuttaa vastaavaksi kaavan (IX)

20 NO

:o-n-ch,-ch.-ci I 22 NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH, I I I I 2 CHj (CHjl^CHj (CH2!2-C00H CH2-C6Hs <ix)

25 vO

H

mukaisesti N-nitroso-N-(-kloorietyyli)karbamoyvii-johdannaiseksi menetelmällä, joka esitettiin melanotro- 3° piinin fragmentin yhteydessä.

Il 7 77672 Tämän keksinnön mukaisten uusien yhdisteiden farmakologinen aktiivisuus osoitetaan tutkimustuloksin käyttäen tutkittavina yhdisteinä ^g^bis-Zfr-nitroso-N-(β -kloorietyyliLkarbamoyyliZ-lysyyli-'-prolyyli-valiini-amidia (josta jäljempänä käytetään nimitystä yhdiste 5 VII) ja /N-rnitroso-N-(0-kloorietyyli) karbamoyyli/-lysyyli-prolyyli-valiiniamidihydrokloridia (josta jäljempänä puhutaan yhdisteenä X). Saadut tulokset on koottu seuraaviin taulukoihin I ja II.

Taulukossa I esitetään yhdisteiden X ja VII vaiku-10 tus vatsakalvonsisäisesti istutettuun L-1210 -leukemiaan hiirillä. Sekä yhdiste X että yhdiste VII osoittautui aktiivisemmaksi kuin vertailuyhdisteinä käytetyt 1/3-bis-(X?-kloorietyyli)-1-nitrosourea (josta jäljempänä käytetään lyhennettä BCNU) ja 2-/3-(2-kloori-15 etyyli)-3-nitrosoureidg7-2-deoksi-D-glykopyranoosi (josta jäljempänä käytetään nimitystä kloorisotisiini).

yhdisteellä X on kaava

NO

C0-N-CH„-CH_C1 I 2 2 NH-CH-CO-N-CH-CO-NH-CH-CO-NH- ( X ) III I 2 <fH2>4 C«2 ,CH2 CH(CH3>2 NH2 XCH2 8 77672 + m m h en οί evien > 3 m 3 ^ 5 0*3 cm λ 1¾ Φ ij [811¾¾ VOVOVOVOVOVOVOVOVONO 8 ^ ä 3 \ \\ \\ \\ \\ \ VO Ό VO Ό .VO VO VO Ό Ό VO .

Hei ·§ ^ 810 5 etoOi-if^jnr-irvOooen H S 8.5^50 --jorjooo^ooo

I >j _ jjj Jä I I | I | | | | | I

S Ä-s g § ΓΜ

»—I

Λ

J

w 3 0 ^ 1 P L§ ! eS^S^ cneninenevir^cvioenen •S-SeP OOOOl^OOOvHJ-OQOCn

e g 1 A Λ Λ AI

3 3 £2 00»n0vr\0vn000 * $p g S r- o r^· oven oo oi o- .$ et et .-h et ev h h et h A A Λ Λ o»

So,® OOOOiOOOOOO

2Π5 et en vr\ o ό et o en {> et < H H Ovi r-i

5 S

•UM.

; S h

2>- o H

^ ra X > li 9 77672

St- S £35 S

ο) 3 •w- 5} r-ί H -P o · 3 ie § ^ JS o Μ·ΗϊβΉ VO VO VO VO r-l » ^ y \ \\ \\ 9 »g o vo m vo vo o s λ I % H 1 Λ S 3 m l «c ;3 tn jz ^ :¾ i Π. « ® N, “i $ 5 g fifl" i ί fi? 1 11 nil i g £ : J§ H MJ ä

m Φ oi H

a is * 43 s

-¾ 5 «s* I

P m *· m js H .

.g Eh H 5* -h G a > 3 I* 3»j°i 3 8S3\äll ί "λ”" c 5^1^ ^ = 83 I 11-811¾¾ s e Λί ro o -h ω Φ h m

x jf)43 ϊηονηοο S S 8 5 U 3 I H

AI f< H Jj «.... .. Il II

0 ω o 3 oo o o\ vo v£>^ 1 Λ " st si —§

EH £ rj w S EH EH

,« w, or 3 II II n II n U II H

S S' o g -H

H <T oo o/ vo oo o-h -H

308 Jm * l -U O -r-\

(3 W > >H

3 I * S “ S

a „ SIJ3I1 | s§ ^ * f ^ £ 8 I 3 S3 s 3 -+3asärgSä P ti n 3 8 § a > 10 77672

Taulukossa XX esitetään yhteenyetona yhdisteen X farmakologiset ominaisuudet.

Taulukko II

5 Myrkyllinen annos: 133-200 mg/kg vatsakalvonsisäisesti Käsitellään hiiriä, joihin on tartutettu L-1210:

Annostus mg/kg ILS % Elossa pysyneiden eläinten määrä 40 vuorokauden kuluttua 10 3 x. 10 ip 80 % 3 x 50 ip 150 % 1 x 133 ip - 60 % 1 x 200 myrkyllinen

Edellä esitetyt tiedot osoittavat, että uudet ^ yleiskaavojen (Xl ja (Vili mukaiset peptidijohdannaiset oyat huomattavasti aktiivisempia ja vähemmän myrkyllisiä kuin vertailuyhdisteinä käytetyt BCNU ja kloori-sotisiini.

20 ?° C0-N-CHo-CH0Cl

2 2 (XII

NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH2 ch2 ch2 ch2 ch2 _ _ I * * 5 Hf * ch/ch3/2 COOH Ph

NO

00-N-CH2- CH2-C1 (xii) NH-CH „C0-NH-CH—CO — NH.-CH. - CO - NH-CH-CO-NH-.HC1 3Q 2 ! | I f * /CH2/4 % /CH2 CH/CH3/2 J ^CH, NH2 11 π 77672

Taulukko III

Tutkimus vaikutuksen ja kemiallisen rakenteen keskinäisestä riippuvuudesta hiirillä,jotka potevat L-1210 -leukemiaa käyttäen yhdisteitä, jotka ovat saman’* 5 tapaisia kuin kaavan (X) mukainen yhdiste.

yhdiste Annos mg/kg ILS %

XI 7 O

28 10 10 46 50 100 myrkyllinen XII 15 20 45 10 100 35 15 15Q 230

Taulukko IV

Kaavan (X) mukaisen yhdisteen vaikutus hiirillä, 20 jotka potevat L-12i0 -leukemiaa, käytettäessä sitä yhdessä muiden lääkkeiden kanssa

Yhdiste Käsittely ILS Elossapysymis-%

Annos Vuorokausi % 25 _mg/kg_ 1 X 12,5 1 50 2 X 50,0 1 87 3 BCNU 5 1 25

30 4 BCNU 20 1 HO

5 yhdistetty käsittely 2+3 325 35 6 yhdistetty käsittely 1+4 325 12 77672

Taulukko rv (jatkuu) Käsittely

Yhdistetty Annos Vuorokausi ILS E]ossapysymis mg/ kg % % 3 BCNU 5 1 25

5 k BCNU 20 1 ILO

5 yhdistetty käsittely 2+3 325 6 yhdistetty käsittely 1 + k 325 10 7 X 1x25 2 ^

8 syklofoseamidi i+U

9 dibromidolsitoli O

10 BCNU 1x10 2 77 15 11 yhdistetty käsittely 7 + 8 77 ^ yhdistetty käsittely 20 7 + 9 hk 13 yhdistetty käsittely 7+10 70 lU X 1x50 3 33 25 15 BCNU 1x20 3 70 l8 yhdistetty käsittely + 15 60 11 13 77672

Taulukko y

Kaayan CX). mukaisen yhdisteen vaikutus 1^1210 -leukemiaa potevien hiirien elossa pysymiseen VV

5 Käsittely χχ IL'S Elossapysymis-%

Yhdiste Annos Vuorokausi % mg/kg X 1x12j51 50 1X50 1 87 10 1x133 1 *»o 1x25 2 kk 1x25 3 33 15 1x100 3 ^5 3x10 1,5,9 80 3x50 1,5,9 250

Jtxio 1,2,5,6 110 20 x vatsakalvonsisäinen anto mainittuna päivänä siir-rostamisesta.

/käsiteltyjen hiirien \ -/käsittelemättömien hiirien\ TT ς % _ \ elossapysymisaika_' velossapysymisaika_'χ ^ Qq 25 Käsittelemättömien hiirien elossapysymisaika xxx elossapysymis-% 60. vuorokautena siirrostuksesta 14 77672

Taulukko VI.

X; yaikutus kiinteisiin kasvaimiin

Ai S^qq hiirien kasvain (s.c.l Annos 100 mg/kg tai 5 x 20 mg/kg vatsakalvonsisäisesti (käsiteltäessä siirrostusta seuraavasta päivästä alkaen) on tehoton.

BL Lewisin keuhkomelanooma ja B^-melanooma -etäispesäkkeitä muodostava hiirien kasvain ^ Lewisin Keskimääräinen ’ ILS B -melanooma keuhkokasvain aik^^vrkT13 % Keskimääräinen e]ossa-

• käsittely pysymisaika (vrk) ILS

_____% vertailu 21.0 - 2 6.0 (x) 100 mg/kg 22,0 ** 31,5 21,0 5x20 mg/kg 27,0 29 35,0 35

BNCU

20 mg/kg 28,5 36 **2,0 6l 20 5x4 mg/kg 25,0 19 34,0 31 vatsakalsonsisäinen anto siirrostusta seuraavasta päivästä alkaen C) Ihmisen loiskasvaimet (s.c.) HT18 (kiillemelanooma) 25 vertailu - keskimääräinen TD 22,5 vuorokautta 100 mgAg >50,0 " CT) =>1,0 5 jx 20 mg/kg 56,25 " 1,5 BT22 (paksunsuolen limasyöpä) vertailu 17,0 vuorokautta 30 100 mg/kg 24,0 n . . 0,29 5 x 20 mgAg 21,5 " 0,26 li 77672 ΗΓ1.7 (paksunsuolen rauhasrakenteinen syöpä) vertailu 16,5 vuorokautta 100 mg/kg 14,75 " 0,0 5 x 20 rog/kg 15,0 " 0,0 5 Käsittelyajankohta: kasvaimen koon ollessa noin 8 mm^ Käsi ttelytapa: i.p.

TD = kasvaimen koon kaksinkertaistuminen, Ke = käsitelty, Ko = vertailu _ , , . , . . ^e " TOKo , GD = kasvun hidastuminen = -

10 TD

Ko

Uusista yhdisteistä saadaan farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät vaikuttavana aineosana Vähintään yhtä yleiskaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen happoadditiosuolaa sekä kiinteitä tai nestemäisiä 1 b farmaseuttisia kantaja-aineita. Mainitut farmaseuttiset yalmisteet sisältävät tavallisia farmaseuttisia kantaja-ja apuaineita, ja ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetuin lääketeollisuuden menetelmin. Valmisteet voidaan Viimeistellä esimerkiksi tablettien, kapseleiden, ampullien ja muiden sellaisten muotoon.

Tämän keksinnön muut yksityiskohdat selviävät seu-raavista esimerkeistä, . .

Esimerkki 1 ¢,, bis- (/3 -kloorietyylikarbamoyyli) lysyyli-prolyyli-valiiniamidi 736 mg (1,6 mmol) lysyyli-prolyyli-val1iniamidi- diasetaattia /Relv. 58 (1978) 2106/ liuotetaan 8 ml:aan dimetyyliformamidia ja jäähdytetään 0°C:een. Lisätään pisaroittain 0,46 ml (3,2 mmol) trietyyliamiinia ja 0,34 ml (4 mmol) β -kloorietyyli-isosyanaattia. Reaktio- seosta sekoitetaan 0°C:ssa 4 tuntia, jonka jälkeen sen annetaan seisoa, ja sitten se tislataan alipaineessa.

Jäännös sckoiLeLaan veteen, saostunut tuote erotetaan suodattamalla ja kuivataan. Näin saadaan 480 mg otsikon 3 5 mukaista tuotetta; ie 77672 saanto on 54 %

Sp. = 183-185°C; R^ = 0,75 (n-^butanoli-pyridiini-jääetikka-vesi-seos suhteessa 4:1:1:1; TLC Kieselgel G. Merck). C22H39N705C12 (552'5) 2 Laskettu: C: 47,82 % Saatu : C: 47,90% H: 7,11 % H: 7,60% N; 17,74 % N: 17,41%

Cl: 12,83 % Cl: 13,26% j g Esimerkki 2 *i,&-bis/N-nitroso-N- ( & -kloorietyy] i) karbamoyy] i/ly-syyli-prolyyli-valiiniamidi 460 mg (1 mmol) lysyyli-prolyy]iva!iiniamididiase-taattia /ilelv. 58 (1978) 2106/ liuotetaan 6 m] : aan dime-15 tyyliformamidia, jonka jälkeen lisätään 0,28 ml (2 mmol) trietyyliamiinia ja 548 mg (2 mmol) N-nitroso-/6 -kloori-etyylikarbamoyyli-p-nitrofenolia sekä näiden jälkeen 270 mg (2 mmol) 1-hydroksibentsotriatsolia. 2 tunnin kuluttua dimetyyliformamidi tislataan pois alipaineessa, 20 jäännös liuotetaan 30 ml:aan etyyliasetaattia, ja sitä uutetaan vedellä. Etyyliasetaattikerros kuivataan ja haihdutetaan. Jäännöstä käsitellään vedettömällä eetterillä, eetteri dekantoidaan, ja öljy kuivataan. Muodostunut vaahtomainen kiinteä aine puhdistetaan sili-25 kageenlillä täytetyssä pylväässä. Kerätään fraktiot ja tislataan liuotin pois alipaineessa. Jäännös jauhetaan vedettömässä petrolieetterissä ja suodatetaan. Näin saadaan 312 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 51%. Otsikon mukainen yhdiste: = 0,80 (metanoli- 30 etyyliasetaatti—seos suhteessa 1:3, TLC Kieselgel G. Merck) Lähtöaine: R^ = 0,88 (etyyliasetaatti-pyridiini-jää- etikka-vesi-seos suhteessa 240:20:6:11, 35 TLC Kieselgel G. Merck)

II

17 77672 ^=185 (N-nitrosoryhmä, 397 nm) C22H37N9°7C12 (611'51)

Laskettu: Cl: 11,59 % Saatu: Cl: 11,18% N ; 20,61 % N: 20,07% ^ Esiinerk^l 3 gt , /*> -bis-/N-nitroso-N- (/ff-k3 oorietyyli) karbamoyyl \J 3ysyy3 i-prolyy3i-valiiniamidi 552 mg:aan (1 mmol) u. /^-bis-( (h -kloorietyy3 i-10 karbamoyy3i)lysyyli-pro3yyli-valiiniamidia lisätään 10 m3 99%-ista muurahaishappoa, jonka jä3keen siihen 3isätään pisaroittaan tunnin aikana 500 mg natrium-nitriittiä ja 3 ml vettä. Seuraavana päivänä reaktio-seos haihdutetaan alipaineessa. Jäännöstä käsitellään 15 vedellä, suodatetaan ja pestään vedellä. Näin saadaan 460 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 75 %.

= 0,80 (metanoli-etyyliasetaatti -seos suhteessa 1:3, TLC Kieselgel G. Merck) 2Q E. = 184 (N-nitrosoryhmä, 39 7 nm) C22H37N9°7C12 (611.,51)

Laskettu: Cl 11,59 % Saatu: Cl: 11,41 % N 20,61 % N: 20,10 % 25 Esimerkki 4 -*WN-nitroso-N- (/fl-kloorietyyli)karbamoyyliy-£-t-bu-tyloksikarbonyyli-lysyyli-prolyyli-valiiniamidi 614 mg (3 mmol) ζ,-t-butoksikarbonyyli-lysyyli-prolyyli-valiiniamiditosylaattia /Helv. 46 (1963) 8707 30 liuotetaan 10 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia, jonka jälkeen lisätään 0,14 ml( 1 mmol)trietyyliamiinia, 274 mg (3 mmol) N-nitroso-/0 - k]oorietyy3ikarbamoyy3i-p-nitrofenolia ja 136 mg (1 mmol) 1-hydroksibentso-35 triatsolia, ja reaktio suoritetaan esimerkin 2 mukai- ie 77672 sei]a tavalla. Näin saadaan 250 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 43%.

Otsikon mukainen yhdiste: = 0,90 (kloroformi-metanoli -seos suhteessa 9:1 TLC Kieselgel G. Merck)

C

Lähtöaine:

Rf = 0,80 (n-butanoli-jääetikka-vesi - seos suhteessa 4:1:1. Kieselgel G. Merck) £ = 90 (N-nitrosoryhmä, 397 nm) 10 C24H42N7°7C1 <576'10)

Laskettu: Cl 6,15 % Saatu: Cl: 6,00 % N J 7,02 % N: 16,61 % b)^-/N-ni troso-N-( -kloorietyyl i)karbamoyyli/lysyyli-15 prolyyli-valiiniamidihydrokloridi 200 mg oi -/N-nitroso-N- (/6-kl oorietyyl i) karbamoyyl ±A £-t-butoksikarbonyyli-lysyyli-prolyyli-valiiniamidia sekoitetaan 6 ml:aan 0,17N muurahaishanpoa suolahapossa, 2q liuoksen annetaan seisoa 5 minuuttia j > sitten se haihdutetaan. Jäännös liuotetaan veteen, ja sitä uutetaan etyyliasetaatilla. Vesikerros kylmäkuivataan. Näin saadaan 140 mg otsikon mukaista yhdistettä.

Rf = 0,10 (n-butanoli-jääetikka-vesi -seos suhteessa 25 4:1:1, Kieselgel G, Merck) C19H35N7°5C12 (512'44)

Laskettu: Cl: 13,84% Saatu Cl: 13,72 % N: 1.9,13% N: 18,81 % £,= 88 (N-nitrosoryhmä, 397 nm) 30 Esimerkki 5 /fc -kloorietyylikarbamoyyli-tryptofyyl i-norleusv’rli- <*.-asparagyylifenyylialaniiniamidi 615 mg (1 mmol) tryptofyyli-norleusyyli-^aspara- gyyli-fenyylialaniiniamidihydrokloridia /Nature 207 35 (1956) 1356/ liuotetaan 6 ml:aan vedetöntä dimetyyli- I! 19 77672 formamidia, jonka jälkeen lisätään 0,14 ml ( 1 mmol) trietyyliamiinia ja 0,1 ml (1»2 mmol)-kloorietyyli-isosyanaattia, ja reaktio suoritetaan esimerkin 1 mukaisella tavalla. Näin saadaan 600 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 88%.

5 Sulamispiste: 201"202°C

C33H42N7°7C1 (684,19)

Laskettu: Cl; 5,18 % Saatu; Cl: 4,94 % N: 14j 33 % N : 13,78 %

Esimerkki 6 10 /fo-^nitroso-N- (rt -kloorietyyli) karbamoyyli7tryptofyy] i-norleusyyli-^asparagyyli-fenyylialaniiniamidi 684 mg;n (1 mmol) β —kloorietyylikarbamoyyli-trypto-fenyy1 i-norleusyy 1 i-<*· -asparagyyl i-fenyy 1 ialaniini-amidia annetaan reagoida liuoksen kanssa, jossa on 300 mg 15 natriumnitriittiä ja 2 ml vettä , esimerkin 3 mukaisella tavalla. Näin saadaan 605 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 85 %.

Rj =0,80 (n-butanoli-jääetikka-vesi -seos suhteessa 4:1;1, KieselgelG, Merck) 20 C33H41N8°8C1 <713'20>

Laskettu; Cl: 4,97 % Saatu: Cl: 4,73 % N; 15,71 % N: 15,28 % NO; 4,20 % NO: 3,87 %

Koska itse peptidin absorptio on nitrosoryhmän 25 absorptioalueella, nitrosoryhmä määritetään tässä esimerkissä Loon ja Dionin menetelmällä /*J. Pharm. Sei.54 (1965) 8097.

Esimerkki 7 -nitroso-N-(& -kloorietyyli)karbamoyyli7tryptofyyli-nor-30 leusyyli- o( -asparagyyli—fenyy1jalaniiniamidi 921 mg:n (1,5 mmol) tryptofenyyli-nor] eusyyl i-°k--aspa-ragyyli-fenyyli-alaniiniamidihydrokloridia,7&ature 207 (1956 ) 35 135§/, 0,21 ml:n (1,5 mmol) trietyyliamiinia, 420 mg:n (1,5 imol) N-nitroso-A-kloorietyylikarbamoyyli-p-nitrofenolia ja 200 mg:n (1,5 mmol) 1-hydroksibentsotriatsoiia anne- 20 77672 taan reagoida esimerkin 2 mukaisella tavalla. Näin saadaan 800 mg otsikon mukaista yhdistettä; saanto on 75%.

Rf = 0,80 (n-butanoli-jääetikka-vesi -seos suhteessa 4;1:1, Kieselgel G. Merck) C33H41N8°8C1 (713'2°)

Laskettu: Cl; 4,97 % Saatu: Cl: 4,58 % N: 15,71 % N: 35,32 % NO: 4,20 % NO: 3,92 %

Nitrosoryhmä määritetään esimerkissä 6 mainitulla 10 menetelmällä.

Esimerkki 8 /N-nitroso-N-(β -kloorietyyli)karbamoyyli/glutamyyli-histi-dyyli-fenyylialanyyli-arginyyli-tryptofyyli-glysiini 322 mg:n (0,4 mmol) glutamyyli-histidyyli-fenyyli- 1 ^ aianyyli-arginyyli-tryptofyyli-glysiiniä /tielv. Chim.

Acta 44 (1961 ) 1991^?, 0,056 ml: n trietyyl iamiinia, 120 mg;n (0,44 mol) N-nitroso- /^-kloorietyylietyyli-karbamoyyli-p-nitrofenolia ja 56 mg:n (Oj4 mmol) 1-hydroksi-bentsotriatsolia annetaan reagoida esimerkin 2 mukaisella 20 tayalla. Näin saadaan 133 mg otsikon mukaista yhdisteitä.

= 0,55 (metanoli-asetoni-vesi -seos suhteessa 70:5:25) C42H53N14°11C1 (965' 43)

Laskettu: Cl; 3,67 % Saatu: Cl: 3,22 % 25 N: 20,31 % N: 19,98 % NO; 3,10 % NO: 2,81 %

Nitrosoryhmä määritetään esimerkissä 6 mainitulla menetelmällä.

Esimerkki 9 3® Kylmäkuivattu jauheampulli, joka sisältää 10 mg <k- /N-nitro- so -N-( /3-kloorietyyli)karbampyyli^lysyyli-prolyyli-valiini-amidihydrokloridia

Jauheampulli sisältää 30 mg ^—/N-nitroso-N-(fi -kloorietyyli) karbamoyyli/lysyyli-prolyyli-valiiniamidihydro-35 kloridia (jauheampullia kohti).

Il 2i 77672

Liuotinampulli sisältää 300 mg sorbitolia ja tislattua vettä (ruiskeisiin) 2 mlrksi (yhdessä ampullissa) Valmistetaan liuos, joka sisältää 5 g vaikuttavaa aineosaa litrassa. Mainittu liuos steriloidaa suodattama! laf pakataan ampulleihin ja kylmäkuivataan tunne-5 tulla tavalla. Jauheampullit suljetaan kumikorkilla ja metallisinetillä steriileissä olosuhteissa ja merkitään. Jauheampulli pakataan yhteen liuotinampullin kanssa, joka sisältää 15 g 1%-ista sorbitolin vesi-1iuosta.

1 0 Esimerkki 10

Kapselit, jotka sisältävät 100 mg q«l , £ -bisjfo-nitroso-N- ( /^-kloorietyyli) karbeiroyylj/lysyy 11-prolyyli-va-liiniamidia

Kapselien sisältö on seuraava:

Komponentti Määrä, mg ας,£rbis-/N-nitroso-N-(β -kloorietyyli)karbamo-yyli/-lysyyli-prolyyli-valiiniamidia 100

Carbowax:a 5 20 Talkkia 5

Kiteinen vaikuttava aineosa sekoitetaan aikaisemmin hienoksi jauheeksi homogenisoituun Carbowaxin ja talkin seokseen. Siten saadut rakeet pakataan koviin gelatiini-kapseleihin (kokonaispaino 110 mg) soveltuvaa laitetta 25 käyttäen.

Esimerkki 11

Suolistossa liukeneva kapseli

Esimerkin 10 mukaisesti valmistetut kapselit päällystetään suolissa liukenevalla kerroksella sinänsä tun-30 netuin menetelmin.

Esimerkki 12 /N-nitroso-N-(β -kloorietyyli)karbamoyyli)tryptofyyli-leu-syyli-^-asparagvyl i-fenyylial aniiniamidi (XII) 35 a) 633 mg:n (1 mmol) tryptofyyli-1 eusyyli-^-aspa- 22 7 7 6 7 2 ragyyli-(^-t-butyyliesteri) -fenyylialaniiniamidia /Z. Physiol-Chem. 353 (1972) 1246/ annetaan seisoa 6 ml;ssa 2N etyyliasetaattia suolahapossa, sitten lisätään eetteriä, saostuneet kiteet erotetaan suodattamalla ja pestään eetterillä. Saadaan 590 mg (93) otsikon 5 mukaista yhdistettä, = 0,74 (butanoli-pyridiini-jääetikka-v esi -seos suhteessa 30:20:6:24; Kieselgel G. Merck) b) 921 mg (1,5 mmol) tryptofyyli-leusyyli-p-v -aspa-ragyyli-fenyylialaniiniamidihydrokloridia 1luotetaan 10 10 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia, sen jälkeen lisätään 373 mg (1,5 mmol) N-nitroso-/Ö -kloorietyyli- karbanoyyli-N-hydroksisukkinimidiä ja 0,42 ml (3 mmol) trietyyliamiinia. 15 minuutin sekoittamisen jälkeen dimetyyliformamidi tislataan pois alipaineessa. Jäännöstä uutetaan yedellä, suodatetaan ja pestään vedellä.

Saadaan 980 mg (92 %) otsikon mukaista yhdistettä.

Rf = 0,69(etyyliasetaatti-pyridiini-jääetikka-vesi -seos suhteessa 30:20:6:11; Kieselgel G.Merck) C33H41N8°8C1 (713'20)

Laskettu: Cl: 4,97 % Saatu: Cl: 4,58 % N; 15,71 % N: 15,32 % 20 NO: 4,20 % NO: 3,95 %

Esimerkki 13 a) «ak. -/N-nitroso-N- ( & -klooerietyyli) karbamoyyli/-£-t-bu-tyloksikarbonyyli-glysyyli-lysyyli-prolyyli-valiiniamidi 1,30 g (2,6 mmol) ^-t-butyloksikarbon^yli-glysyyli-25 lysyyli-prolyyli-valiiniamidia /elin. Endrocrinol (1976) 41s7 liuotetaan 13 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia, sitten lisätään 650 mg (2,6 mmol) N-nitroso- -kloo-rietyylikarbamoyyli-N-hydroksisukkinimidiä ja 0,36 ml (2, 6 ml) trietyyliamiinia. 15 minuutin sekoittamisen jälkeen reaktioseos haihdutetaan alipaineessa. Jäännös 30 liuotetaan etyyliasetaattiin, ja sitä uutetaan vedellä.

I! 23 77672

Etyyliasetaattikerros kuiyataan ja haihdutetaan. Saadaan 1,29 g (80 %) otsikon mukaista yhdistettä.

R^ = 0,82 (kloroformi-metano]i -^seos suhteessa 8:2, Kieselqel G, Merck) C16B45V8C:l (633'16) 5 Laskettu: Cl; 5,60 % Saatu: Cl: 5,48 % N; 17,69 % N: 17,3] % t= 91 (N-nitrosoryhmä, 397 nm) b) c^^/N-nitroso^N-(^-kloorietyy]i)karbamoyy]i/glysyyli-10 lysyyli-prolyyli-valiiniamidihydrokloridi (XI) 633 mg:n (1 mmol) oL-/N-nitroso-N-(/3-k]oorietyyli/ -£-t-butyloksikarbonyyli-glysyyli-lysyy] i-prolyyli- valiiniamidia annetaan seisoa 5 minuuttia 10 m]:ssa 0,14 N muurahaishappoa suolahapossa, jonka jälkeen 1 5 liuos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan veteen, ]a sitä uutetaan etyyliasetaatilla, Vesikerros kylmäkuivataan. Saadaan 540 mg (95 %) otsikon mukaista yhdistettä.

Rj = 0,65 (etyyliasetaatti-pyridiini-muurahais-happo-yesi - seos suhteessa 60:20:6:5,5, 20

Kieselqel G. Merck) C21H38N8°6C12 <S69'59>

Laskettu: Cl: 12,45 % Saatu: Cl: 12,01 % N: 19,67 % N: 18,87 % 25 £.= 84 (N-nitrosoryhmä, 397 nm) 24 7 7 6 7 2

Esimerkki 14 0^-£Ν-( £) -kloorietyyli) karbamoyylij- £-t-butyylioksikarbo-nyyli-lysyyliprolyyli-valiiniamidi 614 mg (1 mmol) £,-t-butyylioksikarbonyyli-lysyyli-5 prolyyli-valiiniamiditosylaattia /helv. 46 (1963) 87Q7 liuotetaan 10 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia, saatuun liuokseen lisätään tipoittain 0,14 ml (1 mmol) trietyyli-amiinia ja 0,1 ml (1,2 mmol) yä-kloorietyyli-isosyanaattia samalla sekoittaen ja jäillä jäähdyttäen. Reaktioseoksen 10 annetaan seistä yön yli huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös puhdistetaan kromatografisesti pylväässä, joka on täytetty silika-geelillä. Eluoidaan metanoli:etyyliasetaatti (3:1)-seoksella. Kerätään ne fraktiot, jotka sisältävät päätuotteen 15 ja liuotin tislataan pois alipaineessa. Näin saadaan 430 mg otsikon tuotetta, saanto 78 %.

Otsikon mukainen yhdiste: = 0,90 (metanoli:etyyliasetaatti-seos suhteessa 3:1, TLC, Kieselgel G, Merck); 20 Rf = 0,44 (etyyliasetaatti:pyridiini:jääetikka:vesi- seos suhteessa 240:20:6:11, TLC Kieselgel, Merck); C24H43N6°6C1 i547'1*

Laskettu: Cl 6,48 %

Saatu: Cl 6,56 % 25 Esimerkki 15 c6-/nitroso-N-( yö-kloorietyyli) karbamoyylijlysyyli-prolyy-li-valiiniamidiasetaatti

Liuokseen, jossa on 547 mg (1 mmol) <X-/N-(yö-kloo-rietyyli) karbamoyyli_7- £-t-butyylioksikarbonyyli-lysyyli-30 prolyyli-valiiniamidia ja 10 ml vedetöntä pyridiiniä, lisätään tipoittain -20°C:ssa ja samalla sekoittaen seos, jossa on 1 ml (1,2 mmol) nitrosyylikloridia ja 1 ml dikloo-rimetaania. Tunnin sekoittamisen jälkeen reaktioseos haihdutetaan alipaineessa. Jäännös liuotetaan etyyliasetaat-35 tiin 0°C:ssa ja uutetaan kahdesti jäävedellä. Etyyliase-taattifaasi kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja

II

25 77672 etyyliasetaatti tislataan pois alipaineessa. Jäännöksen annetaan olla muutama tunti 5 ml:ssa 98-100 % muurahaishappoa 0°C:ssa, minkä jälkeen lisätään 1 ml muurahaishappoa, joka sisältää 0,12 mmol kloorivetyhappoa. 10 minuutin 5 kuluttua liuotin haihdutetaan alipaineessa. Jäännös puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä täytetyllä pylväällä 0°C:ssa käyttämällä eluointiin etyyliasetaattirpyridii-ni:jääetikka:vesi-seosta suhteessa 60:20:6:11. Päätuotteen sisältävät fraktiot otetaan talteen, liuotin haihdutetaan 10 ja jäännös lyofilisoidaan liuottamalla se veteen. Saanto 390 mg, 72 %.

Otsikon yhdiste: R^ = 0,33 (etyyliasetaatti:pyridiini:jääetikka:vesi-seos suhteessa 60:20:6:11, TLC, Kieselgel G, Merck) 15 = 0,64 (etyyliasetaatti:pyridiini:jääetikka:vesi- seos suhteessa 60:40:12:22, TLC, Kieselgel G, Merck).

C21H38N7°7C1 (536'05)

Laskettu: Cl 6,61 %, N 18,29 %

Saatu: Cl 6,32 %, N 17,72 % 20 £: 86,2 (N-nitrosoryhmä, 397 nm).

Claims (9)

1. 26 7 7 6 7 2
2. 1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten N-nitroso-N- Φ -kloorietyyli)karbamoyylipeptidijohdan-5 naisten valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava (I) ~ IJO ci-ch2-ch2-n-co-nh--R (I) n 10 jossa R on ryhmä, joka on johdettu oligopeptidistä poistamalla pääteaminoryhmä tai, jos oligopeptidi sisältää diami-nokarboksyylihapon, CC-asemassa oleva aminoryhmä tai sekä pääteaminoryhmä että CJ-aminoryhmä, jolloin oligopeptidi on gastriini- tai (X-melanotropiinifragmentti tai gastrii-15 nin analogi, joka sisältää norleusiiniosan ja jolla on tämän hormonin luonteenomainen biologinen vaikutus; ja n on 1 tai 2; ja näiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) vapaan aminoryhmän sisältävä peptidi, jolla on 20 yleinen kaava (II) (H2N)nR' (II) jossa R' on ryhmä, joka on johdettu oligopeptidistä poistamalla pääteaminoryhmä, tai jos oligopeptidi sisältää diami-nokarboksyylihapon, ^-asemassa oleva aminoryhmä tai sekä 25 pääteaminoryhmä että ^-aminoryhmä, tai mainitun ryhmän suojausryhmällä suojattu johdannainen, jolloin oligopeptidi on gastriini- tai O^-melanotropiinifragmentti tai gast-riinin analogi, joka sisältää norleusiiniosan ja jolla on tämän hormonin luonteenomainen biologinen vaikutus; ja n 30 on 1 tai 2, saatetaan reagoimaan isosyanaatin kanssa, jolla on kaava (III) ci-ch2-ch2-nco (III) ja näin saatu yhdiste, jolla on yleinen kaava (IV) Γ ci-ch2-ch2-nh-co-nh--R' (IV) L Jn 35 27 7 7 6 7 2 jossa R' ja n merkitsevät samaa kuin edellä, nitrosoidaan, tai b) peptidi, jolla on yleinen kaava (II) (H,N) R' (II) 5 2 " jossa R' ja n merkitsevät samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan aktiivisen esterin kanssa, jolla on yleinen kaava (V) NO
3. 10 Cl-CH2-CH2-fi-CO-OQ (V) jossa Q on peptidikemiassa yleisesti käytetty, hiilivedystä johdettu, mahdollisesti substituoitu, aktiivisen esterin muodostama ryhmä, 15 ja haluttaessa molekyylissä olevat suojausryhmät poistetaan ja haluttaessa saatu yhdiste muutetaan happoadditiosuolak-seen.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään lähtöaineita, joissa suo- 20 jausryhmä on t-butoksikarbonyyliryhmä.
5. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä b), tunnettu siitä, että käytetään kaavan (V) mukaista lähtöainetta, jossa Q on yhdellä tai useammalla elektroneja puoleensa vetävällä ryhmällä substituoitu fenyyliryhmä.
6. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä b), tunnettu siitä, että suoritetaan asylointi huoneen lämpötilassa 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa.
7. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä b) tai patenttivaatimuksessa 2 mukainen menetelmä, tunnet- 30. u siitä, että N-nitroso-N-(β-kloorietyyli)karbamiiniha-pon aktiivisena esterinä käytetään p-nitrofenyyliesteriä.
8. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä a), tunnettu siitä, että nitrosointi suoritetaan typpihapolla tai nitrosyylikloridilla. 28 77672
9. 1. Förfarande för framställning av nya terapeutiskt användbara N-nitroso-N-( y?>-kloretyl) karbamoylpeptidderivat 5 med den allmänna formeln (I) NO ci-ch2-ch2-n-co-nh--R (I) n 10 väri R är en grupp som härletts frän en oligopeptid genom avlägsnande av den terminala aminogruppen eller, ifall oli-gopeptiden omfattar en diaminokarboxylsyra, aminogruppen i Lt'~ställning, eller bctda den terminala aminogruppen och 1C -aminogruppen, varvid oligopeptiden är ett gastrin- eller 15 OCj-melanotropinfragment eller en analog av gastrin, vilken analog omfattar norleusindelen och har den karakteriska biologiska verkan av detta hormon; och n är 1 eller 2; samt syraadditionssalter därav, kännetecknat därav, att man 20 a) omsätter en peptid, vilken omfattar en fri ami- nogrupp och har den allmänna formeln (II) (H2N)nR’ (II) väri R1 är en grupp som härletts frän en oligopeptid genom 25 avlägsnande av den terminala aminogruppen, eller, ifall oligopeptiden omfattar en diaminokarboxylsyra, aminogruppen i UJ -ställning, eller bäda den terminala aminogruppen och LO -aminogruppen, eller är ett derivat av en nämnd grupp som skyddas med en skyddsgrupp, varvid oligopeptiden är ett 30 gastrin- eller oö-melanotropinfragment eller en analog av gastrin, vilken analog omfattar norleusindelen och har den karakteristiska biologiska verkan av detta hormon; och n är 1 eller 2, med ett isocyanat med formeln (III) ci-ch2-ch2-nco (III) och nitroserar den sälunda erhällna föreningen med den allmänna formeln (IV) II 35