FI72716C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara 2-hydroximetyl-3,4,5-trihydroxipiperidinderivat. - Google Patents

Description

7271 6

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten 2-hydroksi-metyyli-3,4,5-trihydroksipiperidiinijohdannaisten valmistamiseksi 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 782607

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten 2-hdyroksimetyyli-3,4,5-tri-hydroksipiperidiinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on 10 yleinen kaava I

CH20H /R

HO-/ \—H (I)

HO OH

15 jossa R on mahdollisesti ryhmillä fenyyli, nitrofenyyli tai halogeenifenyyli substituoitu C.^ g-alkyyliryhmä tai C2_g-alkenyyli- tai C2_g-alkynyyliryhmä, sekä niiden suolojen ja stereoisomeerien valmistamiseksi.

20 Näitä uusia kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyt tää lääkkeinä etenkin sokeritautia, hyperlipemiaa ja liikalihavuutta vastaan sekä vaikuttamaan eläimillä liha/rasva-suhteen lihaosuutta edistävästi.

Keksintö koskee lisäksi kaavan I mukaisten yhdistei-25 den farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, kuten esimerkiksi klorideja, sulfaatteja, asetaatteja, karbonaatteja ja oksalaatteja, ja yhdisteiden stereoisomeereja.

On havaittu, että uudet kaavan I mukaiset yhdisteet ovat vahvoja ct-glukosidaasien, varsinkin disakkaridaasien 30 inhibiittoreita. Sen vuoksi uudet yhdisteet ovat arvokkaita, moniin aineenvaihduntatapahtumiin vaikuttavia aineita.

DE-hakemusjulkaisusta 2 656 602 tunnettuun 2-hydroksi-metyyli-3,4,5-trihydroksipiperidiiniin verrattuina uusilla yhdisteillä on edullisia terapeuttisia ominaisuuksia.

2 7271 6

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista,

että 1-desoksinojirimysiini, jolla on yleinen kaava II

CH OH >^NH

5 fe) (I1’

H0 OH

saatetaan reagoimaan reaktiokykyisen alkylointiaineen kanssa, jolla on yleinen kaava IV

Z-R. (IV) 10 jossa R merkitsee samaa kuin edellä, ja Z on alkylointiai-neissa tavallinen, helposti poistuva ryhmä, esimerkiksi ha-logenidiryhma, ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan suolaksi ja/tai haluttaessa saatu kaavan I mu-15 kainen yhdiste jaetaan stereoisomeerikseen.

1-desoksinojirimysiinin ja alkylointiaineen välisestä reaktiosta esitetään esimerkkinä reaktio allyylibromidin kanssa:

CH„OH

CH-OH <_ 20 >-nh >“n-gh2-ch=ch2 HO-/ \ + Br-CH2-CH=CH2 _HBr> H0 \ /

/ OH OH

OH 0H

Kaavan II mukainen lähtöaine on tunnettu, ja sitä saa-25 daan joko katalyyttisestä hydraamalla fermentoinnilla saatua nojirimysiiniä /S. Inouye et. ai, Tetrahedron 23 (1968) 2125-21447 tai uuttamalla mulperipuun kuoresta (DE-hakemus-julkaisu 2 656 602) tai myös täysin synteettisesti. Eräällä uudella, edullisella tavalla 1-desoksinojirimysiiniä voidaan 30 myös valmistaa viljelemällä tavanomaisissa fermentointias-tioissa heimoon Bacillaceae kuuluvia organismeja tavallisissa ravintoliuoksissa lämpötila-alueella noin 15 - noin 80°C

18- vrk ilmastaen, linkoamalla solut, ja eristämällä desok-siyhdiste viljelyliemestä tai solu-uutteesta tavallisin 35 puhdistusmenetelmin. (DE-hakemusjulkaisu 26 58 563.

3 7271 6

Kaavan IV mukaiset reaktiokykyiset alkylointiaineet ovat tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin. Reaktio kaavan II mukaisen yhdisteen kanssa suoritetaan inertissä, orgaanisessa liuottimessa lämpötilassa huo-5 neen lämpötilasta kiehumapisteeseen ja mahdollisesti käyttäen mukana happoa sitovaa ainetta.

Keksinnön mukaiset inhibiittorit sopivat lääkkeiksi seuraavilla indikaatioilla:

Sokeritaudin esiaste, mahakatarri, ummetus, maha-suoli-10 infektiot, meteorismi, ilmavaivat, verenpainetauti, ateros-kleroosi ja varsinkin liikalihavuus, sokeritauti ja hyper-lipoprotemia.

Vaikutusspektrin laajentamiseksi voi olla suositeltavaa yhdistää ne glukosidihydrolaasien inhibiittorien kanssa, jol-15 loin nämä lääkeaineet täydentävät toisiaan. Yhdistelmät voivat sisältää keksinnön mukaisia inhibiittoreita keskenään tai yhdistelminä tunnettujen inhibiittorien kanssa. Saattaa esimerkiksi olla tarkoituksenmukaista yhdistää keksinnön mukaisia sakkaraasi-inhibiittoreita tunnettujen amylaasi-in-20 hibiittorien kanssa.

Monissa tapauksissa ovat edullisia myös keksinnön mukaisten inhibiittorien ja tunnettujen oraalisten sokeritau-tilääkkeiden ( (*>-sytotrooppisia sulfonyylivirta-ainejohdannaisia ja/tai verensokeriin vaikuttavia biguanidineja) sekä 25 myös veren lidipitoisuutta alentavien lääkkeiden, kuten klo-fibraatin, nikotiinihapon, kolestyramiinin yhdistelmät.

Yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisina koostumuksina laimentamattomina, esim. jauheina tai gelatiinipäällyk-sessä tai yhdistettyinä kantaja-aineen kanssa.

30 Farmaseuttiset valmisteet voivat sisältää vaihtelevia määriä inhibiittoria, esim. 0,1-99,5 %, yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävä, myrkyttömiä, inertin kantaja-aineen kanssa, joka voi sisältää yhtä tai useampaa kiinteätä, puoli-kiinteätä tai nestemäistä laimennus- tai täyteainetta ja/tai 35 myrkytöntä, inerttiä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää apuainetta. Tällaiset farmaseuttiset valmisteet ovat edullises- 1! __ 7271 6 ti annostusyksikköinä, so. fysikaalisesti rajoitettuina, määrätyn inhibiittorimäärän sisältävinä yksikköinä, jotka vastaavat annoksen osaa tai useampikertaista annosta, joka on tarpeen halutun estovaikutuksen saamiseksi. Annostuskyksi-5 köt voivat sisältää 1, 2, 3, 4 tai useampia yksikköannoksia tai 1/2, 1/3 tai 1/4 yksikköannoksesta. Yksikköannos sisältää edullisesti sellaisen määrän vaikuttavaa ainetta, jolla saavutetaan haluttu estovaikutus lääkeannossa etukäteen määrätyllä annostusohjelmalla annettaessa yksi tai useampia 10 annostusyksiköitä, jolloin koko päiväannos, puolet, kolmannes tai neljännes päiväannoksesta annetaan tavallisesti kaikkien päivän mittaan nautittujen pää- ja väliaterioiden yhteydessä. Myös muita terapeuttisia aineita voidaan tällöin ottaa. Vaikka annostuksen ja annostusohjelman ammattimies 15 jokaisessa tapauksessa suunnittelee huolella erikseen ottaen huomioon potilaan iän, painon ja kunnon, sairauden laadun ja vakavuuden, niin annostus on tavallisesti noin 1 - noin 4 1C SIY/kg vuorokaudessa. Joissakin tapauksissa voi riittää pienempi annos, ja joissakin tapauksissa on suurempi annos.

20 Oraaliin lääkeantoon voidaan käyttää kiinteitä ja nes temäisiä annostusyksiköitä, esim. jauheita, tabletteja, dra-geita, kapseleita, rakeita, suspensioita, liuoksia jne.

Jauheet valmistetaan hienontamalla vaikuttava aine sopivan hienoksi ja sekoittamalla se samoin hienonnetun farma-25 seuttisen kantaja-aineen kanssa. Vaikka kantaja-aineena normaalisti käytetään syötävää hiilihydraattia, esim. tärkkelystä, laktoosia, sakkaroosia tai glukoosia, joita myös tässä tapauksessa voidaan käyttää, niin on kuitenkin edullisempaa käyttää ei-metabolisoituvaa hiilihydraattia, kuten esim.

30 selluloosajohdannaisia.

Voidaan myös lisätä makeutusaineita, makuaineita, säilöntäaineita, dispergointiaineita ja värejä.

Kapselit voidaan valmistaa täyttämällä edellä kuvattu jauheseos valmiisiin gelatiinikuoriin. Jauheseokseen voidaan 35 ennen täyttämistä lisätä liukastusainetta, kuten piihappo-geeliä, talkkia, magnesiumstearaattia, kalsiumstearaattia 5 7271 6 tai kiinteätä polyetyleeniglykolia. Seokseen voidaan myös sisällyttää hajoamista edistävää ainetta tai liukenemista edistävää ainetta, kuten agaria, kalsiumkarbonaattia tai natriumkarbonaattia, jotta kapseleita otettaessa inhibiitto-5 ri tulisi helpommin hyväksikäytettävään muotoon.

Tablettien valmistus tapahtuu esimerkiksi valmistamalla karkea tai hieno jauheseos lisäämällä siihen liukastus-ainetta ja hajoamista edistävää ainetta. Tästä seoksesta muodostetaan sitten tabletit. Jauheseos valmistetaan jauha-10 maila sopivalla tavalla vaikuttava aine, ja sekoittamalla siihen laimennusainetta tai kantapaineita, kuten edellä kuvattiin. Voidaan myös lisätä sideaineita, kuten karboksime-tyyliselluloosaa, alginaatteja, gelatiinia tai polyvinyyli-pyrrolidoneja, liukenemista hidastavia aineita, kuten para-15 fiiniä, resorptiota edistävää ainetta, kuten esim. kvater-nääristä suolaa ja/tai absorptioainetta, kuten bentoniittia, kaoliinia tai dikalsiumfosfaattia. Jauheseos voidaan rakeistaa yhdessä sideaineen, kuten siirapin, tärkkelystahnan, akaasiakumin tai selluloosa- tai polymeerimateriaalien liuos-20 ten kanssa. Senjälkeen tuote puristetaan suurisilmäisen seulan lävitse. Vaihtoehtoisesti jauheseos voidaan puristaa tableteiksi tabletointikoneessa, ja saadut laadultaan epätasaiset kappaleet murskata sopivaan raekokoon. Jotta syntyneet rakeet eivät takertuisi tabletointikoneen suulakkeisiin, 25 niihin voidaan lisätä liukastusainetta, kuten steariinihap-poa, stearaattisuolaa, talkkia tai mineraaliöljyä. Tämä liukastettu seos puristetaan sitten tableteiksi. Vaikuttavat aineet voidaan myös yhdistää happojuoksuisten, inerttien kantaja-aineiden kanssa ja muodostaa suoraan tableteiksi jät-30 tämällä pois rakeistus- tai murskaamisvaiheet. Tuote voidaan päällystää kirkkaalla tai läpinäkymättömällä päällysteellä, esim. shellakka-, sokeri tai polymeeripäällysteellä ja kiil-loitetulla vahakerroksella. Tällaiseen päällysteeseen voidaan lisätä väriaineita, jotta voitaisiin erottaa erilaiset 35 annosyksiköt.

6 7271 6

Oraalisti käytettäviä valmistemuotoja, liuoksia, siirappeja, eliksiirejä voidaan valmistaa annostusyksiköiksi siten, että tietty valmistemäärä sisältää tietyn vaikuttavan aineen määrän. Siirappi voidaan valmistaa liuottamalla vai-5 kuttava aine vesiliuokseksi, joka sisältää sopivia makuaineita. Eliksiirit voidaan valmistaa käyttäen myrkyttömiä, alkoholipitoisia kantaja-aineita. Suspensiot valmistetaan dispergoimalla yhdiste myrkyttömään kantaja-aineeseen. Voidaan myös lisätä liuotinvälittäjä ja emulgointiaineita, 10 esim. etoksiloituja isostearyylialkoholeja ja polyoksiety-leenisorbitaaniestereitä, säilöntäaineita, makua parantavia aineita, esim. piparminttuöljyä tai sakkariinia.

Annostusohjeet voidaan ilmoittaa pakkauksen päällä. Annostus voidaan lisäksi varmistaa käyttämällä vaikuttavat 15 aineet hidastetusti vapauttavia valmisteita, esim. sisällyttämällä vaikuttava aine polymeerimateriaaliin, vahaan tms.

Edellä mainittujen valmisteiden lisäksi voidaan valmistaa vaikuttavia aineita sisältäviä elintarvikkeita, esim. sokeria, leipää, perunatuotteita, hedelmämehua, olutta, 20 suklaata ja muita makeistuotteita sekä säilykkeitä, kuten marmeladia, joihin tuotteisiin lisätään terapeuttisesti vaikuttava määrä ainakin yhtä keksinnön mukaista inhibiittoria.

Keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita sisältävät ravintoaineet sopivat sekä aineenvaihduntahäiriöistä kärsiville 25 potilaille dieettiruuaksi että terveiden henkilöiden ravinnoksi ennalta ehkäisemään ravinnon avulla aineenvaihdunta-häiriöt.

Keksinnön mukaisilla inhibiittoreilla on lisäksi kyky suuresti vaikuttaa eläimillä ei-toivotun rasvanmuodostuksen 30 osuutta alentavasti ja niukka rasvaisen lihan (laiha liha) osuutta lisäävästi. Tällä on erityisesti merkitystä maatalouden hyötyeläinten kasvatuksessa ja ruokinnassa, erityisesti sikojen, mutta myös muiden hyöty eläinten ja lemmikkieläinten kasvatuksessa. Inhibiittorien käytöllä voidaan li-35 säksi saavuttaa huomattavaa eläinten ruokinnan rationalisointia sekä ajan ja määrän että myös laadun suhteen. Koska 7 72716 ne vaikuttavat tietyssä määrin ruuansulatusta hidastavasti, pitenee ravintoaineiden viipymisaika ruuansulatuskanavassa, mikä vaikuttaa ad libitum ruokinnassa säästöjä. Keksinnön mukaisia inhibiittoreita käytettäessä saadaan useissa ta-5 pauksissa lisäksi huomattava arvokkaan proteiinirehun säästö.

Vaikuttavia aineita voidaan siten käytännöllisesti katsoen käyttää kaikilla eläinruokinnan aloilla rasvaosuutta vähentävänä aineena sekä rehun valkuaisainetta säätävänä 10 aineena.

Vaikuttavien aineiden teho on tällöin jokseenkin riippumaton eläimen lajista ja sukupuolesta. Erityisen arvokkaiksi vaikuttavat aineet ovat osoittautuneet eläinlajeilla, joilla määrättyinä elämänvaiheina on taipumus vahvaan ras-15 voittumiseen.

Esimerkkeinä eläimistä, joilla inhibiittoreita voidaan käyttää rasvaosuuden vähentämiseen ja/tai ravinnon valkuaisaineen säästämiseen, voidaan mainita seuraavat hyöty- ja lemmikieläimet: lämminveriset eläimet, kuten nautakarja, 20 siat, hevoset, lampaat, vuohet, kissat, koirat, kaniinit, turkiseläimet, kuten minkit, chinchillat, muut lemmikkieläimet, kuten marsut ja hamsterit, larboratorio- ja eläintarha-eläimet, kuten rotat, hiiret, apinat jne. linnut, kuten broilerit, kanat, hanhet, ankat, kalkkunat, kyyhkyset, papukai-25 jät, ja kanarialinnut, sekä kylmäveriset eläimet, kuten kalat, esim. karpit, ja matelijat, esim. käärmeet.

Eläimille annettava, halutun vaikutuksen saavuttamiseen tarvittava vaikuttavan aineen määrä voi vaikuttavan aineen edullisten ominaisuuksien vuoksi vaihdella suuresti.

30 Se on edullisesti noin 0,5 mg - 2,5 g, varsinkin 10-100 mg/ rehu-kg vrkrssa. Sen nauttimisen kestoaika voi vaihdella joistakin tunneista tai päivistä useampiin vuosiin. Sopiva vaikuttavan aineen määrä ja sopiva sen nauttimisaika riippuvat läheisesti ruokinnan tavoitteesta. Ne riippuvat varsin-35 kin eläimen lajista, iästä, sukupuolesta, terveydentilasta ja eläimen pitämisen tarkoituksesta, ja ne voi alan ammattimies helposti määrätä.

8 72716

Keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita annetaan eläimille tavallisilla menetelmillä. Niiden antamistapa riippuu varsinkin eläimen lajista, käyttäytymisestä ja yleiskunnosta. Anto voidaan suorittaa oraalisti kerran päivässä tai 5 kaksi kertaa päivässä säännöllisin tai epäsäännöllisin aikavälein. Tarkoituksenmukaisinta on useimmiten antaa vaikuttavia aineita suun kautta varsinkin eläinten ruokinta- ja/tai juomarytmiä noudattaen.

Vaikuttavat aineet voivat olla puhtaina aineina tai 10 valmisteina, jolloin valmiste voi olla joko esiseoksena, so. seoksena myrkyttömien, inerttien kantaja-aineiden kanssa, tai myös koko ravintoannoksen osana lisärehuna tai yksinään annetun sekarehun seososana. On myös mahdollista antaa niitä sopivina valmisteina juomaveden kanssa.

15 Vaikuttavia aineita voidaan mahdollisesti antaa sopi vina muotoina myös valmisteina muiden ravinto- ja vaikuttavien aineiden kanssa, esim. mineraalisuolojen, hivenaineiden, vitamiinien, valkuaisaineiden, energiaa antavien aineiden (esim. tärkkelys, sokeri, rasvat), väriaineiden ja/tai 20 makuaineiden tai muiden rehun lisäaineiden, kuten kasvua edistävien aineiden kanssa. Vaikuttavia aineita voidaan antaa eläimille niiden ruokinnan aikana tai sen jälkeen.

Edullisesti vaikuttavia aineita annetaan oraalisti rehun tai juomaveden kanssa, jolloin niitä tarpeen mukaan li-25 sätään rehun ja/tai juomaveden koko määrään tai vain osaan niistä.

Vaikuttavat aineet voidaan lisätä rehuun ja/tai juomaveteen tavallisin menetelmin yksinkertaisesti puhtaina aineina, edullisesti hienojakoisessa muodossa, tai valmis-30 teiden muodossa sekoitettuina syötävien, myrkyttömien kantaja-aineiden kanssa tai myös esiseoksena tai rehuväkevöit-teenä.

Rehu ja/tai juomavesi voi sisältää keksinnön mukaista vaikuttavaa ainetta esimerkiksi noin 0,001-5,0 % varsinkin 35 0,02-2,0 % (paino-%). Vaikuttavan aineen edullisin pitoisuus rehussa ja/tai juomavedessä riippuu varsinkin eläinten naut- 7271 6 timasta rehu- ja/tai juomavesimäärästä, ja sen voi jokainen ammattimies helposti määrätä.

Rehun laatu ja koostumus eivät tällöin merkitse. Voidaan käyttää kaikkia tavallisia kaupallisia tai erityisiä 5 rehukoostumuksia, jotka edullisesti sisältävät tavallisia, suunnitelmallisen ravistemuksen kannalta tasapainotettuja energia- ja valkuaisaineita sekä vitamiineja ja mineraali-aineita. Rehu voi sisältää esimerkiksi kasviaineita, esim. öljykakkurohetta, viljarouhetta, viljasivutuotteita, mutta 10 myös heinää, säiliörehua, juurikkaita ja muita rehukasveja, sekä myös eläinkunnan tuotteita, kuten liha-, ja kalatuotteita, luujauhoa, rasvaa, vitamiineja, esim. A-, D-, E-, K-ja B-kompleksi-vitamiineja sekä erityisiä proteiinilähteitä, kuten hiivoja sekä tiettyä aminohappoja, mineraaliaineita 15 ja hivenaineita kuten fosforia ja rautaa, sinkkiä, mangaania, kuparia, kobolttia, jodia ym.

Esiseokset voivat sisältää edullisesti noin 0,1-50 %, varsinkin 0,5-5,0 % (paino-%) esim. N-metyyli-1-desoksinoji-rimysiiniä erilaisten syötävien kantaja-aineiden ja/tai mi-20 neraalisuolojen kanssa, esim. rehukalkin (kalsiumkarbonaatti) kanssa, ja ne valmistetaan tavallisilla sekoitusmenetelmillä.

Rehuseokset sisältävät edullisesti 0,001-5,0 %, varsinkin 0,02-2 % (paino-%) esimerkiksi N-metyyli-1-desoksino-jirimysiiniä tavallisten rehuseoskomponenttien ohella, esim. 25 viljarouheen, öljykakkurouheen, eläinvalkuaisen, mineraali-aineiden, hivenaineiden ja vitamiinien ohella. Niitä voidaan valmistaa tavallisin sekoitusmenetelmin.

Esiseoksissa ja rehuseoksissa olevat vaikuttavat aineet voidaan edullisesti suojata ilman, valon ja/tai kos-30 teuden vaikutusta vastaan peittämällä niiden pinta sopivilla aineilla, esim. myrkyttömillä vahoilla tai gelatiinilla.

Linnuille tarkoitetun rehuseoksen, joka sisältää keksinnön mukaista vaikuttavaa ainetta, koostumus on esimerkiksi seuraava: 35 200 g vehnää, 340 g maissia, 360,3 g soijarouhetta, 60 g naudantalia, 15 g dikalsiumfosfaattia, 10 g kalsiumkar- 7271 6 10 bonaattia, 4 g jodipitoista keittosuolaa, 7,5 g vitamiini-mineraaliseosta ja 3,2 g vaikuttavan aineen esiseosta sekoitettuna huolella 1 kg:aan rehua.

Vitamiini-mineraaliseos sisältää: 5 6000 k.y. A-vitamiinia, 1000 k.y. D^-vitamiinia, 10 mg E-vitamiinia, 1 mg K^-vitamiinia, 3 mg riboflaviinia, 2 mg pyridoksiinia, 2C ug B^2~vitamiinia, 5 mg kalsiumpantotenaat-tia, 30 mg nikotiinihappoa, 200 mg koiiinikloridia, 200 mg MnS04-H20, 140 ZnS04.7H20 100 mg FeS04.7H20 ja 20 mg 10 CuS04.5H20.

Vaikuttavan aineen esiseos sisältää esimerkiksi halutun määrän esim. 1600 mg N-metyyli-2-desoksinojirimysiiniä ja lisäksi 1 g DL-metioniinia sellaisessa määrässä soija-papu jauhoa, että esiseosta saadaan 3,2 g.

15 Sioille tarkoitetusta rehuseoksesta, joka sisältää kaa van I mukaista vaikuttavaa ainetta, esitetään seuraava koostumus: 630 g rehuviljarouhetta (sisältää 20C g maissi-, 150 g ohra-, 150 g kaura- ja 130 g vehnärouhetta), 80 g kalajauhoa, 60 g soijarouhetta, 58,8 g tapiokajauhoa, 38 g oluthii-20 vaa, 50 g vitamiini-mineraali-seosta sioille (koostumus esim. sama kuin kananpojilla) 30 g pellavansiemenkakkujauhoa, 30 g maissitärkkelysjauhoa, 10 g soijaöljyä, 10 g sokeri-ruokomelassia ja 2 g vaikuttavan aineen esiseosta (koostumus esim. sama kuin kananpojilla) sekoitettuna huolella 1 kg:aan 2 5 rehua.

Esitetyt rehuseokset sopivat edullisesti kananpoikien ja sikojen kasvatukseen ja lihottamiseen. Niitä voidaan kuitenkin käyttää samoina tai samankaltaisina koostumuksina myös muiden eläinten kasvatukseen ja lihottamiseen.

30 Inhibiittoreita voidaan käyttää yksinään tai myös eri laisina seoksina toistensa kanssa.

Sakkaraasi-inhibitiokoe in vitro

Sakkaraasi-inhibitiokokeella on mahdollista määrittää aineen entsyymi-inhibitioaktiviteetti vertaamalla liuotetun 35 suolistodisakkaridaasikompleksin aktiivisuutta inhibiittorin läsnäollessa ja ilman inhibiittoria (ns. 100 l-arvo). Subst- 11 7271 6 raattina, joka määrää inhibitiokokeen spesifisyyden, käytetään tällöin käytännöllisesti katsoen glukoosivapaata sakkaroosia (glukoosi <100 ppm); entsyymiaktivisuusmääritys perustuu glu-koosidehydrogenaasin ja kofaktorina olevan nikotinamidi-5 adeniinidinukleotidin vapauttaman glukoosin spektrofotomet-riseen määritykseen.

Sakkaraasi-inhibiittoriyksikkö (SIY) määritellään sellaiseksi inhibitioaktiivisuudeksi, joka määritellyssä koe-panoksessa alentaa yhden yksikön verran sakkarolyyttistä ak-10 tiivisuutta (sakkaraasiyksikkö = SY); sakkaraasiyksikkö määritellään tällöin entsyymiaktiviteettiksi, joka etukäteen määritellyissä olosuhteissa hajottaa yhden /imolin sakkaroosia minuutissa ja siten vapauttaa yhden yumolin glukoosia, joka määritetään kokeessa, ja fruktoosia, jota ei kokeessa 15 huomioida.

Suolistodisakkaridaasikompleksia saadaan sian ohutsuo-lilimakalvosta trypsiinisulatuksella, saostamalla 66-%:ises-ta etanolista -20°C:ssa, lisäämällä sakkaan 10-mmoolaarista fosfaattipuskuria (pH 7,0) ja lopuksi dialysoimalla samaa 20 puskuria vastaan.

10 puitaan koeliuosta, joka on valmistettu siten, että koepanoksen ekstinktio on vähintään 10 %, muttei kuitenkaan yli 25 % 100 %-arvon alapuolella, lisätään 100 μ1 suolisto-disakkaridaasikompleksin laimennusta 0,1-m maleinaattipus-25 kurissa (pH 6,25), ja seosta esi-inkuboidaan 10 min 37°C:ssa. Diasakkaridaasikompleksin laimennus on säädettävä aktiivisuuteen 0,1 SY/ml. Tämän jälkeen sakkarolyyttinen reaktio pannaan alulle lisäämällä 100 yul 0,4 -m sakkaroosiliuosta (SERVA 35579) 0,1-m maleinaattipuskurissa pH-arvossa 6,25 30 ja päätetään 20 minuutin inkubaatioajan jälkeen 37°C:ssa lisäämällä 1 ml glukoosidehydrogenaasireagenssia £1 pullo-linen lyofiilisoitua glukoosidehydrogenaasi-mutarotaasi-seosta (MERCK 14053) ja 33,17 mg /5-nikotinamidiadeniinidi-nukleotidia (vapaa happo, BOEHRINGER, puhtausaste I) 250 3 5 ml:ssa 0,5-m trispuskuria, pH 7,6.7. Glukoosin osoittamiseksi seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa, ja glukoosi 12 7271 6 määritetään fotometrillä aaltopituudella 340 mm reagenssi-koetta (sisältää entsyymin, muttei) sakkaroosia vastaan.

Inhibiittorien estoaktiivisuuden laskemista vaikeuttaa se, että jo vähäiset muutokset koesysteemissä esimerkiksi 5 vähäinen vaihtelu 100 %-arvojen määrityksissä, vaikuttavat koetulosten arvoihin sellaisina määrinä, joita ei voi jättää huomioonottamatta. Nämä vaikeudet voidaan välttää suorittamalla jokainen määritys samanaikaisesti standardin kanssa; standardina käytetään kaavan C25H43°18N muka;*-sta· sakkaraasi-10 inhibiittoria, jonka spesifinen estoaktiivisuus on 77 700 SIY/g, ja jota lisäämällä 10-20 ng kokeeseen aikaansaadaan edellä määriteltyä suuruusluokkaa oleva inhibitio. Kun tunnetaan 100 %-arvon ja standardin inhiboiman koepanoksen ekstinktioiden erotus 340 nm:ssä, saadaan 100 %-arvon ja 15 koeliuoksen inhiboiman panoksen ekstinktioiden erotuksesta ottamalla huomioon käytetty inhibiittorin määrä laskettua tunnetulla tavalla ominaisestoaktiivisuus, joka ilmoitetaan sakkaraasi-inhibitio-yksikköinä grammaa kohti (SIY/g).

Spesifinen sakkaraasi-inhibitioaktiivisuus in vitro: 20 1-desoksinojirimysiini 465 000 SIY/g N-metyyli-1-desoksinojirimysiini 2 330 000 SIY/g Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen yhdisteiden arvokkaat ja yllättävät terapeuttiset ominaisuudet ilmenevät myös seuraavista terapeuttisista koetuloksista.

25 Suoritetussa rasituskokeessa rottia ruokittiin ravin nolla, jossa oli vaihtelevia määriä keitettyä tärkkelystä sekä tutkittavaa ainetta. Veren glukoosipitoisuus mitattiin 30 min kuluttua ruokinnasta ja vertailuun käytettiin rottia, jotka saivat vain keitettyä tärkkelystä, sekä rottia, jotka 30 eivät saaneet ravintoa.

FR-kuulutusjulkaisusta 2 336 941 tunnetulle desoksino-irimysiinille 13 ?H?0H vr 7271 6 HO ---1--- N>h HO —" 5 rasituskokeessa saatua rasitusarvoa merkittiin suhteellisella arvolla 1. Oheisen liitteen taulukosta käy ilmi kuinka paljon parempia keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut yhdisteet ovat.

HO —^ - H

OH

1 5 _R_ Kerroin CH3 18,9 n-C4H9 11,1 C2H5 24,4 n-C3H7 >16,7 20 iso~C4H9 >16,7 n-C?H15 5,5 «2-© <11,1 CH2-^3 <16,7 25 C H 2 -C H\ _ / 5,5 „-c5h,i n-C6Hi3 7,8 n-C8H17 6,7 30 n-C9H19 <16,7 "-c10H21 <16'7 n_c11H23 1·1 n-C12H25 <16,7 n-CuH29 <16,7 14 7271 6 R__Kerroin CH2-(p^-Cl <1,1 CH2-CH2-CH2-^^ 16,7 _ CH~-CH=CH0 11,1 CH2“C=CH 2,2 <16,7 ch2-<^)-NO, <16,7 10 CH2^0 <16,7 ^2 CH2CH=CH-CH3 47,8

Esimerkki 1: N-allyyli-1-desoksinojirimysiini HOCH

15 hoH )CH2"CH=CH2

HO OH

Seosta, jossa oli 5 g 1-desoksinojirimysiiniä, 30 ml diemtyyliformamidia ja 30 ml vettä, sekoitettiin Ag20:n 20 (5 g) ja allyylibromidin (5 g) kanssa 3 tuntia huoneen läm pötilassa. Sitten hopeasuolat suodatettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin rotaatiohaihduttimessa. Jäännös kiteytettiin etanolista. Saanto: 4,5 g N-allyyli-1-desoksinojirimy-siiniä, sp. 131-132°C.

25 Seuraavat yhdisteet valmistettiin analgoisella taval la. Lopputuotteiden eristäminen ja puhdistus suoritettiin mahdollisesti myös kromatografoimalla vahvasti happamella 0 ionivaihtajalla (H -muoto).

N-proparyyli-1-desoksinoj irimysiini

30 HOCfL

VHNI-CH -C=CH

HOy) HO OH 1

II

Sp.: 160°C (asetonista) 15 7271 6 N-(31,41-diklooribentsyyli)-1-desoksinojirimysiini HOCH_ /ΤΛ .

5 HO OH

Sp.: 130-132°C

N-(p-nitrobentsyyli)-1-desoksinojirimysiini 10 H0CH2 /-Λ HO Λ™#™2

HO OH

Sp.: 144-146°C

15 N-(m-nitrobentsyyli)-1-desoksinoj irimysiini 20 Y_/ N07

HO 0H

Sp.: 168-170°C.

Claims (2)

16 7271 6

1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten 2-hydroksimetyyli-3,4,5-trihydroksipiperidiini-5 johdannaisten valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava I CH0OH JR ^Γ~Ν HO-/ \--H (I) 10 >—c HO OH jossa R on mahdollisesti ryhmillä fenyyli, nitrofenyyli tai halogeenitenyyli substituoitu C^_^g-alkyyliryhmä 15 tai -alkenyyli- tai r _-alkynyyliryhmä, sekä z —6 2—6 niiden suolojen ja stereoisomeerien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 1-desoksinojirimysiini, jolla on yleinen kaava II

20 CH^OH HO OH 25 saatetaan reagoimaan reaktiokykyisen alkylointiaineen kanssa, jolla on yleinen kaava IV Z-R (IV) 30 jossa R merkitsee samaa kuin edellä, ja Z on alkylointi-aineissa tavallinen, helposti poistuva ryhmä, esimerkiksi halogenidiryhmä, ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan suolaksi ja/tai haluttaessa saatu 35 kaavan I mukainen yhdiste jaetaan stereoisomeerikseen. li 17 7271 6

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa R merkitsee bentsyyliä.