FI68654C - Foerfarande och anordning foer bestaemning av totalmaengden baterier och somatiska celler i natursuspension saosom mjoe lknder en maetningsgaong - Google Patents

Description

1 63654

Menetelmä ja laite bakteerien ja somaattisten solujen kokonaismäärien määrittämiseksi yhdellä mittauskerralla luonnon suspensiosta kuten maidosta. - Förfarande och anordning för bestämning av totalmängden bakterier och somatiska celler i natursuspension säsom mjölk, under en mätningsgang.

Keksinnön kohteena on menetelmä bakteerien ja somaattisten solujen kokonaismäärien määrittämiseksi yhdellä mittauskerralla luonnon suspensiosta kuten maidosta, jossa menetelmässä suspensiosta otetaan näyte, johon lisätään DNA-väriainetta, joka tekee näytteen sisältämät somaattiset solut ja bakteerit sopivassa herätevalossa fluorisoiviksi, ja näyte johdetaan virtaus-sytometriin, jossa näytteeseen kohdistetaan mainittu herätevalo ja ensimmäisellä detektorilla havaitaan fluoresenssipulssit, jotka muutetaan sähköisiksi pulsseiksi ensimmäisessä mittaus-kanavassa ja toisella detektorilla havaitaan valonsirontapuls-sit, jotka muunnetaan sähköisiksi pulsseiksi toisessa mittaus-kanavassa, jolloin tulostukseen hyväksytään vain ne pulssit, jotka saadaan molemmista mittauskanavista samanaikaisesti, ja lasketaan intensiteetiltään määrättyjen erottelurajojen sisäpuolella olevat pulssit. Keksinnön kohteena on myös laite menetelmän suorittamiseksi, johon laitteeseen kuuluu näyteastia, elimet näytteen käsittelemiseksi, näytteen annostelija annos-telusuuttimineen, virtaussytometri, jossa on näytteeseen kohdistettu valonlähde ja kaksi valopulssidetektoria, joista toinen on näytteestä tulevien fluoresenssipulssien ja toinen on samasta näytteestä tulevien valonsirontapulssien havaitsemista varten, jolloin kumpaankin detektoriin liittyy muunnin valo-pulssien muuntamiseksi sähköisiksi pulsseiksi kahdessa erillisessä, rinnakkaisessa mittauskanavassa, joissa molemmissa on pulssinkorkeusanalysaattori intensiteetiltään määrättyjen erot-telurajojen sisäpuolella olevien pulssien valitsemiseksi laskentaan, minkä lisäksi laitteeseen kuuluu vertailuelin rinnakkaisissa mittauskanavissa samanaikaisesti esiintyvien sähköisten pulssien valitsemiseksi yksittäisten solujen tai bakteerien luentaperusteeksi.

2 68654

Yleisin luonnon alkuperää olevien suspensioiden bakteereiden kokonaismäärän määritystapa on ns. "plate count"-menetelmä, jossa näyte viljellään kasvualustalla ja lasketaan kasvaneet bakteeripesäkkeet. Menetelmä on hidas, sillä jotkut bakteerit vaativat jopa vuorokausien kasvatuksen. Lisäksi menetelmä antaa helposti virheellisiä lukemia, koska varsinkin luonnon suspensioissa bakteerit usein esiintyvät monen kappaleen muodostamina miselleinä tai ketjuina, joista kasvaa yksi pesäke kuten myös yhdestä ainoasta bakteerista. Samat haitat on menetelmässä, jossa näyte suodatetaan membraanille, joka asetetaan kasvatusalustalle. Lisäksi luonnon alkuperää olevat suspensiot on usein vaikeata suodattaa.

Tämä vaikeus on myös menetelmässä, jossa mikroskoopin ja kuvaputken avulla luetaan valikoivasti DNA-väriaineella värjättyjä herätevalossa fluorisoivia partikkeleita, tässä tapauksessa bakteereja. Lisäksi suodattamisen helpottamiseksi käytettävät lisäaineet saattavat tuhota näytteen osasia ja pilkkoutumis-tuotteet voivat aiheuttaa virhelukemia.

Pelkkään partikkelikokoon perustuvia laskentamenetelmiä ei luonnon suspensioissa voida käyttää, kuten partikkelien aiheuttaman johtokyvyn muutoksiin elektrolyyttisessä liuoksessa perustuvia menetelmiä, sillä myös elottomat eli ei-DNA:ta sisältävät samankokoiset partikkelit antavat elektrodien välistä kulkiessaan samanlaiset pulssit kuin elolliset.

Näytteen bakteerikasvun aiheuttaman impedanssin muutokseen perustuvat menetelmät ovat hitaita eivätkä mittaa suoraan bakteereiden määrää eli yksittäisiä bakteereita ja lisäksi menetelmät vaativat tietyn suhteellisen korkean bakteereiden vähimmäispitoisuuden toimiakseen.

Virtaussytometria (FCF, flow cyto fluorometry) on kehittynyt sytometrisissa tutkimuksissa ja etenkin syöpä- ja kromosomi-tutkimuksissa sangen pitkälle. Periaatteena on, että DNA:ta sisältävät partikkelit, eli siis erilaiset solut mukaanlukien mikrobit, värjätään sellaisella spesifisellä värittömällä ai- 3 68654 neella, joka tunkeuduttuaan soluihin sitoutuu niiden DNA:hän (alfa-helixiin) ja vasta sitouduttuaan aiheuttaa sopivassa herätevalossa fluoresenssi-ilmiön. Solujen lähettämän fluoresenssin intensiteetin eli DNA-määrän perusteella eri jakaan-tumisvaiheissakin olevien solujen lukumäärä voidaan laskea herkällä läpivirtaussytometrillä.

Luonnon suspensioissa kuten maidossa on kuitenkin myös muita sellaisia osasia, jotka fluorisoivat, kuten solujen hajoamisen yhteydessä extrasellulaariseen tilaan joutuneita irrallisia DNA-molekyylejä, solujen muita hajoamistuotteita (intra-sellulaarisia osia sekä soluseinämän osia) ja rasvapallukoi-ta, ja jotka aiheuttavat fluoresenssillaan virhemahdollisuuksia, joita tunnetuissa menetelmissä ei ole onnistuttu eliminoimaan.

Keksinnön mukaisen menetelmän ja laitteen eräs tärkeä käyttösovellutus on maidon ja maitotuotteiden laadun määritys ja utaretulehduksen toteaminen. Tällöin bakteereiden määrityksen lisäksi on tarpeen määrittää maidosta myös lehmän utareista sinne joutuvat somaattiset solut. Tunnettujen menetelmien ja laitteiden epäkohtana on se, että bakteerimäärät ja somaattisten solujen määrät on mitattava erikseen erillisillä mit-tauskerroilla.

US-patenttijulkaisusta 3 824 402 tunnettu menetelmä perustuu tämän keksinnön kanssa samaan lähtökohtaan, eli käytetään hyväksi kahta rinnakkaista mittauskanavaa, joista toinen havaitsee valonsirontapulssit ja toinen fluoresenssipulssit. Täten voidaan mittaustarkkuutta olennaisesti parantaa, mutta tunnetussa menetelmässä pulssien samanaikainen esiintyminen tarkistetaan jo ennen pulssinkorkeusanalysaattoreita, joten vertailuun tulevat pulssit sisältävät suuren määrän sellaisiakin pulsseja, jotka eivät ole bakteerien tai somaattisten solujen aiheuttamia. Vaikka virhelähteiden aiheuttamat pulssit myöhemmin pääosin karsiutuvatkin pulssinkorkeusanalysaattoreissa, aiheuttaa osa virhelähteistä jommassa kummassa kanavassa dis-kriminointirajojen sisäpuolella olevia pulsseja, jotka ilmeises- 4 68654 ti tulevat hyväksytyksi luentaan, koska niiden samanaikaisuus tarkistettiin ja todettiin ennen diskriminointia. Koska diskriminaattoreilta saatuja pulsseja ei enää verrata keskenään, ei tämä tunnettu menetelmä tarjoa mahdollisuutta suorittaa samalla kertaa sekä bakteerien että somaattisten solujen määrien mittaamista samasta näytteestä.

Keksinnön tarkoituksena on saada aikaan mainittua tyyppiä oleva menetelmä j a laite, joka on siten parannettu, että virhemahdollisuudet saadaan eliminoiduksi ja mittaustarkkuus parannetuksi samalla kun menetelmää ja laitetta voidaan käyttää bakteerimäärien ja solumäärien samanaikaiseen mittaamiseen.

Tämän tarkoituksen saavuttamiseksi on keksinnön mukainen menetelmä tunnettu siitä, että somaattisten solujen kokonaismäärä ja bakteerien kokonaismäärä mitataan yhdellä mittauskerralla samasta näytteestä yhdistämällä molempien mittauskanavien pulssit selektiivisesti siten, että yhdistettäväksi hyväksyttävät pulssit valitaan ensin molemmissa mittaus-kanavissa erikseen olevilla pulssinkorkeusdiskriminaattoreilla sellaisten rajojen sisäpuolelle, että diskriminaattoreilta saatavat pulssit ovat saman suuruisia kuin toisaalta solujen ja toisaalta bakteerien erikseen spesifisesti aiheuttamat pulssit, ja että täten valikoidut, joko solujen tai bakteerien diskriminointirajojen sisäpuolella olevat pulssit yhdistetään hyväksymällä niistä solujen ja bakteerien luentaperusteeksi vain sellaiset pulssit, jotka ovat aiheutuneet yhtäaikaa havaituista fluoresenssi-ja valonsirontapulsseista. Laite on tunnettu siitä, että pulssinkorkeus-diskriminaattoreiden ulostulot on liitetty mainittuun vertailuelimeen eri diskriminaattoreilta samanaikaisesti saatavien, solujen tai bakteerien diskriminointirajojen sisäpuolella olevien pulssien yhdistämiseksi selektiivisesti solujen ja bakteerien kokonaismäärien laskemiseksi.

Keksinnön mukaisen menetelmän olennainen parannus US-patenttijulkaisusta 3 824 402 tunnettuun menetelmään nähden on siinä, että amplitudivalinnan ja samanaikaisuuden toteamisen jälkeen keksinnössä vielä selektiivisesti hyväksytään pareittain tulosluentaan sellaiset sironta- ja fluoresenssi-pulssit, jotka pareittain vaaditaan erikseen somaattisilta soluilta ja erikseen bakteereilta (siis esim. bakteerin sirontapulssi ja solun fluo-resenssipulssi eivät tulosta mitään). Tähän ei US-patenttijulkaisusta 3 824 402 tunnetulla menetelmällä päästä eikä pyritä.

5 68654

Keksinnössä on tärkeää se, että luentaa häiritsevät turhat amplitudipulssit seulotaan heti pois sekä sironta- että ennenkaikkea fluoresenssipuolella, koska laitteella analysoidaan -12 somaattisten solujen lisäksi (DNA:ta 10 g luokkaa) baktee- -15 reja, joiden DNA-rtiäärä on vain 10 g luokkaa ja näin ollen tarvittava lukemistarkkuus on oltava suurempi. On ilmeistä, ettei US-patenttijulkaisun 3 824 402 mukaisella järjestelyllä voida ainakaan hyväksyttävällä luotettavuudella mitata bakteerimääriä.

Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan viittaamalla oheisiin piirustuksiin, joissa kuvio la esittä bakteerien ja solujen antamia eri suuruisia fluoresenssipulsseja, jolloin pystyakselilla on pulssien intensiteetti ja vaaka-akselilla pulssien esiintymisaika bakteerien ja solujen kulkiessa mitta-kennon läpi.

Kuvio Ib esittää bakteerien fluoresenssin ja solujen fluoresenssin intensiteettijakaumia niiden kappalemäärien funktiona. Bakteerien intensiteettijakauma (käyrä B) jää olennaisesti erottelurajojen B_^_ sisäpuolelle ja solujen intensiteettijakauma (käyrä C) jää olennaisesti erottelurajojen C_T sisäpuolelle. Solujen ja bak-teerien intensiteetit eroavat tuhatkertaisesti toisistaan, eivätkä aiheuta keskinäisiä virheitä luennassa.

Kuvio 2 esittää keksinnön mukaisen laitteen kaaviota ja kuvio 3 esittää laitteen ja menetelmän toimintakaaviota.

Tässä menetelmässä käytetään tunnetulla tavalla hyväksi eri suuruisten DNA-konsentraatioiden lähettämiä eri suuruisia fluo-resenssipulsseja. Ylimäärä fluoresenssin aiheuttavaa väriainetta saatetaan näytteen solujen ja bakteereiden sisään, missä se -11...-12 sitoutuu DNA:han. Solujen DNA-määrä on luokkaa 10 g, 6 68654 kun taas bakteereiden DNA-määrä on huomattavasti pienempi, -15 10 g. Käytännössä tämä merkitsee sitä, että bakteereiden fluoresenssi on luokkaa 1/1000 solujen fluoresenssista (kuvio 1), eikä ole pelättävissä niiden sekoittumista toisiinsa.

Kuten jo todettiin, on luonnon suspensioissa, kuten maidossa muitakin osasia, jotka fluorisoivat. Sellaisten osasien aiheuttamien virhemahdollisuuksien eliminoimiseksi käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä fluoresenssipulssien rekisteröimisen lisäksi valonsirontapulsseja, jotka niinikään ovat spesifisen suuruisia. Tulostuksessa hyväksytään vain solujen ja bakteerien yht'aikaiset oikean suuruiset (määrättyjen erottelu-rajojen sisäpuolella olevat) fluoresenssi- ja valonsironta-pulssit, ja näin saadaan eliminoitua ei-toivottujen osasten muuten mahdollisesti aiheuttamat virheet.

Osittain tämä voidaan välttää jo sopivalla näytteen esikäsittelyllä. Esim. lämmittämällä näyte +45 - +55°C lämpötilaan liukenevat luonnon suspensioiden rasvapallukat suurimmaksi osaksi, eivätkä ne pääse aiheuttamaan virheitä, jotka eivät olisi korjattavissa keksinnön mukaisella menettelyllä, jossa käytetään fluoresenssi- ja valonsirontapulssien yhteisvaikutusta .

Seuraavassa luetellaan kuviossa 2 esitetyn laitteen rakenneosat : 1. Näytteensäilytysastia 2. Näyteastia 3. Näytteen käsittelyastia 4. Astia laimenninpuskuria ja väriainetta varten 5. Käsitellyn näytteen annostelija 6. Annostelusuutin 7. Virtaussytometri 8. Valonlähde 9. Valosirontadetektori 10. Fluoresenssidetektori 11. Muunnin valopulssien muuntamiseksi sähköpulsseiksi

II

68654 12. Vahvistin 13. Pulssinkorkeusanalysaattori, jolla voidaan valita tiettyjen erottelurajojen sisäpuolella olevat pulssit 14. Looginen AND-elin samanaikaisesti samojen erottelurajojen sisäpuolella esiintyvien, fluoresenssiin ja valosirontaan perustuvien pulssien havaitsemiseksi 15. Tulostusyksikkö elimeltä 14 saatavien pulssien määrän laskemiseksi ja ilmaisemiseksi.

Seuraavassa selostetaan menetelmän suoritustapaa.

Astiassa 1 säilytettävään näytteeseen on näytteenottohetkellä lisätty mikrobinkasvuinhibiittoria kuten 0,2 % natriumatsidia. Mittaus voidaan suorittaa näytteenottoa olennaisesti myöhempänä ajanhetkenä. Näyte tyhjennetään näyteastiaan 2, jossa se lämmitetään +45 - +55°C:een sekä homogenoidaan esim. viemällä edestakaisin φ 500 y:n neulan läpi. Samaan lämpötilaan saatetaan astiassa 4 oleva laimennuspuskuri, jollaiseksi käy esim. fysiologinen fosfaattipuskuri pH 7,4 ja jossa on mukana DNA-väriainetta esim. 20 - 100 yg etidiumbromidia/ml. Laimennus-puskuria lisätään näytteen yhteen osaan 3-9 osaa astiassa 3, jossa ne sekoitetaan ja inkuboidaan mainitussa lämpötilassa 1-10 min. Astiasta 3 otetaan annostelijalla 5 näyte, joka ruiskutetaan suuttimen 6 kautta mainitussa lämpötilassa olevalle sytometrin 7 mittakennolle luentaa varten. Detektorissa 10 olevalla fluoresenssivalonmonistinputkella ja detektorissa 9 olevalla valonsirontavalonmonistinputkella havaitaan kaikki näytteen partikkeleista saatavat valopulssit, jotka muutetaan muuntimilla 11 sähköisiksi signaaleiksi. Vahvistimilla 12 vahvistetut signaalit viedään erikseen omille pulssinkorkeusana-lysaattoreilleen 13, joilla valikoidaan signaaleista sellaiset pulssit, jotka ovat yhtä suuria kuin solujen ja bakteerien aiheuttamat. Kuviossa 3 on esitetty ylimpänä valonsirontapuls-sien analysointia ja alempana samanaikaista fluoresenssipuls-sien analysointia. Vasemmalla sulkeissa esitetyt numerot viit-taavat niihin laiteosiin, joissa vastaavat toiminnot tapahtuvat. Molempiin pulssinkorkeusanalysaattoreihin 13 on asetet- 8 68654 tu tietyt erottelurajät soluja (CDL) ja bakteereita (BDL) varten. Nämä erottelurajät on valittu kuviossa Ib havainnollistetulla tavalla.

Kuviossa 3 alimpana on esitetty viisi erilaista partikkelia, jotka lähinnä tulevat kyseeseen luonnon suspensioita mitattaessa. Nämä partikkelit ovat: B = bakteeri C = solu R - rasvapallukka tai vastaava, ei kiinteän muodon omaava DNA = irrallinen DNA-molekyyli solun hajoamisen jälkeen

Fri = irrallinen soluseinämäfragmentti, joka saattaa antaa heikon fluoresenssin käytetyllä luenta-aallon pituudella sekä sattumanvaraisen valonsironnan Fr2 = samanlainen fragmentti, joka ei fluorisoi ja antaa vain heikon valonsironnan.

Kuten jo kuvion 1 yhteydessä esitettiin, ovat solut ja bakteerit fluoresenssinsa perusteella hyvin erotettavissa toisistaan, ja sama pätee myös niiden valonsironnan suhteen. Solut aiheuttavat suuren sironnan ja bakteerit pienen, ja solut ja bakteerit ovat hyvin erotettavissa toisistaan myös tämän perusteella. Molempien diskriminointialueet (B ja C ) voidaan säätää suhteellisen väljiksi, eivätkä ne missään tapauksessa pääse sekoittumaan toisiinsa intensiteettierojen ollessa tuhatkertaista luokkaa fluoresenssin aiheuttamissa pulsseissa, sekä tätä pienemmät mutta olennaisesti poikkeavat valonsiron-nassakin.

Sen sijaan bakteerien detektio edellyttää virtaussytometriltä, että sen hydrodynaaminen fokusointipiste ja optinen fokusoin-tipiste ovat samat, ja että käytetään ring-efektien välttämiseksi mieluiten suoraa läpinäkyvää lasialustaa, jolle näyte-suspensio ruiskutetaan ja jonka yhteydessä on esim. sen alapuolella fluoresenssipulssien havaitsemista varten öljyimmer-sio-optiikka ja valonmonistinputki ja yläpuolella valonsiron-tapulsseille oma luentasysteeminsä.

li 9 68654

Analysaattoreilta 13 saatavat valonsirontahavainnon tulos ja fluoresenssihavainnon tulos yhdistetään selektiivisesti siten, että tulostukseen hyväksytään vain ne pulssit, jotka on saatu yht'aikaa fluoresenssista ja valonsironnasta ja jotka ovat määrättyjen erottelurajojen sisäpuolella. Toisin sanoen jokaisen näytteessä olevan partikkelin tulee antaa yht'aikaa oikean suuruinen fluoresenssi- ja valonsirontapulssi, jotta ne hyväksytään luentaan. Erottelurajät määrätään etukäteen mittauskoh-teesta riippuen halutun suuruisiksi.

Solujen erottelurajojen sisäpuolella olevien samanaikaisten fluoresenssi- ja valonsirontapulssien määrä tulostetaan solujen määränä ja bakteerien erottelurajojen sisäpuolella olevien samanaikaisten fluoresenssi- ja valonsirontapulssien määrä tulostetaan bakteerien määränä.

Kun tarkastellaan vielä kuviota 3, havaitaan, että rasvapallu-kat (R) saattavat fluorisoida jossain määrin luenta-aallon pituudella, mikäli pallukoita yleensä on jäljellä lämmityksen jälkeen. Mm. jotkut vitamiinit saattavat aiheuttaa pallukoi-den pinnalla tällaisen fluoresenssin, joka saattaa pahimmassa tapauksessa osua bakteereiden diskriminaatioalueeseen, muttei solujen. Rasvapallukoilla on kuitenkin suuri valonsironta, huomattavasti bakteerien sirontaa suurempi, eivätkä rasva-pallukat tule hyväksytyiksi eivätkä ne pääse aiheuttamaan virhelukemia tämän takia.

DNA-molekyylit, esim. solujen ja tumien hajoamisen yhteydessä suspensioon päässeet, antavat epämääräisen suuruisen fluoresenssin, joka saattaa osua bakteereiden alueelle. Koska niillä ei kuitenkaan ole vaadittavaa valonsirontaa, ne eivät pääse häiritsemään luentaa. Kokonaiset tumat, jotka ovat peräisin hajonneista soluista, menetelmä seuloo niinikään haluttaessa pois niiden valonsironnan perusteella.

10 68654

Luonnon suspensioissa on myös solujen hajoamisen yhteydessä syntyneitä erilaisia "roskia" kuten soluseinämäfragmentteja. Nämä (Fr2) eivät joko fluorisoi lainkaan, mikä on tavallisin tapaus, tai ne fluorisoivat toisella aallonpituudella kuin näytteen emission luenta tapahtuu. Joissakin harvoissa tapauksissa ne (Fri) saattavat fluorisoida sattumanvaraisesti merkityksettömän vähän luettavallakin aallonpituudella. Koska näiden fragmenttien muoto saattaa olla mikä tahansa, on niiden valon-sirontakin siitä johtuen hyvin erilaista ja sattumanvaraista. Osa sirontaa saattaa osua bakteerien diskriminaatio-alueeseen.

Muut luonnon suspensioissa esiintyvät partikkelit, niiden osaset tai vastaavat ovat verrattavissa luennan kannalta edellä mainittuihin ja niiden luentavirheitä aiheuttavat osuudet saadaan eliminoiduksi selostetulla keksinnön mukaisella järjestelyllä.

Menetelmällä ja laitteella on seuraavia etuja: 1. Menetelmä luo edellytykset tarkkaan luentaan. Säätämällä näytteen homogenisointiastetta saadaan haluttaessa määritetyksi joko yksittäiset bakteerit tai misellit.

2. Menetelmällä ja laitteella saadaan määritetyksi samasta ja yhdellä tavoin käsitellystä näytteestä sekä solujen että bakteerien kokonaismäärät.

3. Näytteeseen voidaan lisätä näytteenottohetkellä mikrobi-kasvuinhibiittoria, joka estää näytteen solujen ja bakteerien määrien muutokset, jolloin solujen ja bakteerien määritys voi tapahtua säilötyistä näytteistä.

4. Menetelmää ja laitetta voidaan soveltaa rutiinityöskentelyyn» jossa sarjatyönä suoritetaan bakteerien ja solujen määritykset.

Il

Claims (6)

11 6 8 6 5 4

1. Menetelmä bakteerien ja somaattisten solujen kokonaismäärien määrittämiseksi yhdellä mittauskerralla luonnon suspensiosta kuten maidosta, jossa menetelmässä suspensiosta otetaan näyte, johon lisätään DNA-väriainetta, joka tekee näytteen sisältämät somaattiset solut ja bakteerit sopivassa herätevalossa fluorisoiviksi, ja näyte johdetaan virtaussytometriin, jossa näytteeseen kohdistetaan mainittu herätevalo ja ensimmäisellä detektorilla havaitaan fluoresenssipulssit, jotka muutetaan sähköisiksi pulsseiksi ensimmäisessä mittauskanavassa ja toisella detektorilla havaitaan valonsirontapulssit, jotka muunnetaan sähköisiksi pulsseiksi toisessa mittauskanavassa, jolloin tulostukseen hyväksytään vain ne pulssit, jotka saadaan molemmista mittaus-kanavista samanaikaisesti, ja lasketaan intensiteetiltään määrättyjen erottelurajojen sisäpuolella olevat pulssit, tunnettu siitä, että somaattisten solujen kokonaismäärä ja bakteerien kokonaismäärä mitataan yhdellä mittauskerralla samasta näytteestä yhdistämällä molempien mittauskanavien pulssit selektiivisesti siten, että yhdistettäväksi hyväksyttävät pulssit valitaan ensin molemmissa mittauskanavissa erikseen olevilla pulssinkorkeusdiskriminaattoreilla sellaisten rajojen sisäpuolelle, että diskriminaattoreilta saatavat pulssit ovat saman suuruisia kuin toisaalta solujen ja toisaalta bakteerien erikseen spesifisesti aiheuttamat pulssit, ja että täten valikoidut, joko solujen tai bakteerien diskriminointirajojen sisäpuolella olevat pulssit yhdistetään hyväksymällä niistä solujen ja bakteerien luentaperusteeksi vain sellaiset pulssit, jotka ovat aiheutuneet yhtäaikaa havaituista fluoresenssi- ja valonsirontapulsseista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että näytteenottohetkellä näytteeseen lisätään mikro-bikasvuinhibiittoria ja bakteereiden muuttumaton kokonaismäärä määritetään näytteenottohetkeä oleellisesti myöhemmin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu i2 6 8 6 5 4 siitä, että mittauksen helpottamiseksi ja bakteerien värjäyksen tehostamiseksi näyte lämmitetään +45 - +55°C lämpötilaan, homogenoidaan tässä lämpötilassa, ja väriaine lisätään näytteeseen tässä lämpötilassa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän käyttösovellutus, tunnettu siitä, että menetelmää käytetään maidon ja maitotuotteiden laadun määritykseen ja utaretulehduksen toteamiseen.

5. Laite patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, johon laitteeseen kuuluu näyteastia (2), elimet (esim. 3, 4) näytteen käsittelemiseksi, näytteen annostelija (5) an-nostelusuuttimineen (6), virtaussytometri (7), jossa on näytteeseen kohdistettu valonlähde (8) ja kaksi valopulssidetekto-ria (9 ja 10), joista toinen (10) on näytteestä tulevien fluo-resenssipulssien ja toinen (9) on samasta näytteestä tulevien valonsirontapulssien havaitsemista varten, jolloin kumpaankin detektoriin liittyy muunnin (11) valopulssien muuntamiseksi sähköisiksi pulsseiksi kahdessa erillisessä, rinnakkaisessa mittauskanavassa, joissa molemmissa on pulssinkorkeusanaly-saattori (13) intensiteetiltään määrättyjen erottelurajojen sisäpuolella olevien pulssien valitsemiseksi laskentaan, minkä lisäksi laitteeseen kuuluu vertailuelin rinnakkaisissa mittaus-kanavissa samanaikaisesti esiintyvien sähköisten pulssien valitsemiseksi yksittäisten solujen tai bakteerien luentaperus-teeksi, tunnettu siitä, että pulssinkorkeusdiskrimi-naattoreiden (13) ulostulot on liitetty mainittuun vertailu-elimeen (14) eri diskriminaattoreilta (13) samanaikaisesti saatavien, solujen tai bakteerien diskriminointirajojen (Cm tai Bdl) sisäpuolella olevien pulssien yhdistämiseksi selektiivisesti solujen ja bakteerien kokonaismäärien laskemiseksi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, jossa selektiivisenä vertailuelimenä on looginen AND-elin (14), tunnettu siitä, että mainitun AND-elimen (14) ulostulossa esiintyy pulssi ainoastaan kun sen sisäänmenossa esiintyy samanaikaisesti li i3 6 8 6 5 4 molemmilta pulssinkorkeusdiskriminaattoreilta (13) saatavat, joko solujen tai bakteereiden erottelurajojen (CDL tai BDL) sisäpuolella olevat pulssit.