FI58501B

FI58501B - Foerfarande foer framstaellning av ett antigenkomplex foer blockering av allergiska reaktioner

Info

Publication number: FI58501B
Application number: FI772945A
Authority: FI
Inventors: Arthur Malley
Original assignee: Research Corp
Priority date: 1976-10-12
Filing date: 1977-10-06
Publication date: 1980-10-31
Also published as: DK448677A; SE8205313D0; NO773465L; US4140679A; US4158705A; FR2382460B1; LU78273A1; FR2382458B1; NO822838L; SE427419B; GB1552056A; FI772945A; CA1099258A; SE8205313L; NL7711026A; CH636524A5; NO147860B; NO147860C; FR2382460A1; JPS5347516A

Description

RSSr^l M <11)KUU.LUTUSJULKA,SU CO cm

Ka 1 j ' * uTLÄccNi NCJSKmPT o o o U1 1¾¾¾ ^4¾ ^ v :'2 ' nl ^ (51) Kv.ik?/int.a3 C 07 G 7/00, A 61 K 39/36 SUOMI—FINLAND (21) Pwwttlhskeniw—rwwtwweimlng 7729^5 (22) H*k«ml*pllv« —An*ekBlnf«d** 06.10.77 ' (23) Altapuvt-Gihijheed·* 06.10.77 (41) Tullut |ulklMlul — BIMt off«ntllg ^ ^ g

Patentti· ja rakisterlhallltut (44) NlhttvitolpMW(,,. kuuL,ttltolwl,

Patent· och regitterttyrelten AmMon utitgd oeh utukrifun pubiiemd g1 1Q gQ

(32)(33)(31) Pyyd*«y «uolkeu*—i*f»rd prlorlttt 12 >10 76 USA(US) 731^1^ Toteennäytetty-Styrkt "" (71) Research Corporation, U05 Lexington Avenue, New York, N.Y., USA(US) (72) Arthur Malley, Portland, Oregon, USA(US) (71*) Ruska & Co (5I*) Menetelmä antigeenikompleksin valmistamiseksi allergiareaktioiden estämistä varten - Förfarande för framställning av ett antigenkomplex för blockering av allergiska reaktioner Tämä keksintö koskee menetelmää multivalenttisen antigeenikompleksin valmistamiseksi allergiareaktioiden estämistä varten, joka kompleksi on ainakin yhden timotei-antigeeni D-fragmentin ja proteiinin tai peptidin kompleksi ja jolla on yleinen kaava

OH

ΗΟ_τ**-γ°νΓχ/3-°H

L^JvJLo-G ' -G"-0-T

missä G* ja G” tarkoittavat glukoosia ja missä ainakin yhteen glukoosi-yksiköistä G* ja G" on kovalenttisesti sitoutunut farmaseuttisesti hyväksyttävä peptidi tai proteiini, ja T tarkoittaa treoniinia tai peptidiä, joka on sitoutunut rakenteen loppuosaan treoniinimolekyylin välityksellä.

Menetelmät allergioiden ja allergisten reaktioiden käsittelemiseksi ovat tähän saakka käsittäneet sen, että henkilölle annetaan antigeeniä, joka aloittaa vasta-aineiden muodostuksen, jotka kilpailevat niiden vasta-aineiden kanssa, joiden muodostumisen herkiste aiheuttaa, jolloin hillitään tai vähennetään allergiareaktioita.

58501 2 Tähän saakka tavallinen tapa allergiapotilaiden käsittelyssä käsittää allergiaa aiheuttavan aineen raa’an uutteen valmistuksen vesipitoisessa puskuriliuoksessa. Sitten potilaita käsitellään raa’an uutteen ensin pienillä ja sen jälkeen kasvavilla annoksilla pitkänä aikana. Tavallisesti kolmen tai useamman vuoden käsittely on välttämätön, ennen kuin todetaan huomattavaa pysyvää paranemista. Käsittelyn edistyessä potilaalle annettavan raa'an uutteen määrää lisätään vähitellen. Lisätyn annoksen määrä ja annostelun tiheys riippuu potilaan yksilöllisestä herkkyydestä ja r e akti oas teestä aikaisempiin annoksiin.

Koko raa’an herkisteuutteen ruiskutus pitkien aikajaksojen aikana saa aikaan estävien tai kilpailevien vasta-aineiden muodostumisen. On esitetty teorioi ta,että estävät vasta-aineet kilpailevat allergiavasta-aineen kanssa antigeenistä ja antavat suojan allergiapotilaalle.

Kalliiseen ja aikaa vievään menetelmään herkkyyden poistamiseksi potilaalta liittyy monia selviä epäkohtia. Hyvin usein raa’an uutteen antamisesta on seurauksena vakava allergiareaktio, jos annokset eivät ole olleet huolellisesti valvottuja ja annosteltuja. Edelleen kilpailevien vasta-aineiden muodostuminen allergiapotilaassa aiheuttaa hyvin usein sivuvaikutuksia, jotka voivat olla potilaalle vahingollisempia kuin itse allergiareaktio.

Erittäin merkityksellistä on se, että tähän saakka käytetty aikaisemmin tunnettu menetelmä herkkyyden poistamiseksi potilaalta ei ole ollut kokonaisuudessaan menestyksellinen. Monissa tapauksissa aikaa vievästä herkkyyden poistomenetelmästä ei ole tuloksena riittävää suojaa potilaalle, joka vielä jatkuvasti kärsii allergiasta joutuessaan antigeenin vaikutuksen alaiseksi.

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada kompleksi, joka soveltuu annettavaksi allergiapotilaalle ja joka neutraloi olemassa olevat vasta-aineet sekä täydellisesti estää sellaisten vasta-aineiden muodostuksen, jotka joko kilpailevat allergeenisen antigeenin kanssa tai ovat sille ominaisia.

Valmistettaessa tällaisia komplekseja, jotka estävät allergisen reaktion on aikaansaatu menetelmä allergisten henkilöiden käsittelemiseksi aLler- 3 58501 giareaktioiden estämistä varten. Kysymyksessä oleva kompleksi voidaan valmistaa ruiskutettavaksi valmisteeksi sen antamiseksi allergiapoti-laalle allergiareaktioiden estämistä varten.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tunnusomaista se, että timotei-antigeeni D-fragmentti»jolla on antigeeninen determinant-tikaava

OH

HO—T^0yO~°H ^JLJ-O-G-G-O-T

missä G tarkoittaa glukoosia ja T:llä on sivulla 1 mainittu merkitys, saatetaan reagoimaan aktivoimisaineen, esimerkiksi syanhalogenidin kanssa ja saatetaan näin muodostunut aktivoitu välituote reagoimaan farmaseuttisesti hyväksyttävän peptidin tai proteiinin, esimerkiksi ihmisen seerumalbumiinin, lysiinin ja glutamiinihapon d-aminohappokopoly-meerin tai ihmisen IgG:n kanssa.

Viime aikoina on timotein siitepölystä eristetty ja kuvattu erilaisia allergeenisia antigeenifragmentteja, katso Malley et ai, Immunochemistry 1975, osa 12, sivut 551 - 55**. Erittäin tärkeä monivalenttinen allergeeni, joka sisältyy timotein siitepölyyn, on aikaisemmin tunnettu , antigeeninä B. Antigeenin B yksivalenttinen antigeeninen determinantti-rakenne, jota tavallisesti nimitetään antigeeniksi D, on: XOrÖ-'-

|| O-G-G-O-T

OH O

jossa G tarkoittaa glukoosia ja T tarkoittaa treoniinia tai peptidiä sidottuna mainittuun ra -kenteeseen treoniinimolekyylim välityksellä.

Antigeenin D fragmentit, jotka tunnetussa tekniikassa on identifioitu antigeeniksi D^, antigeeniksi ja antigeeniksi Dy eroavat antigeeni sen determinanttirakenteen glukoosiosaan treoniinimolekyyIin välityk- 4 58501 sellä sidotun peptidi-hännän'* koon suhteen (katso J. Immunology 99, 825, 1967; Immunochemistry, 1, 237, 1964; 12, 551, 1975; WHO Symposium on Allergen Standardization, toim. P.T. Perkins, Geneve, 1974; Develop. Biol. Standard 29, 29, 1975). Antigeenin molekyyli-paino on noin 5000. Antigeenin molekyylipaino on noin 2500. Antigeeni Dj on fragmentti, jossa glukoosiosaan sidottuna molekyylinä on yksinään treoniini. Eräissä tapauksissa treoniinin sijasta seriini on liitetty glukoosiosaan johtuen sen koodin "väärin lukemisesta", joka määrää erityisten aminohappojen lisäyksen proteiinisynteesin aikana.

Antigeenin rakennekaavan kversitiinifraktiot on sidottu glukoosiosiin vastaavien molekyylien OH-ryhmistä muodostetuilla eetterisidoksilla. Treoniinisidos glukoosiosaan on myöskin sellobioosifraktion OH-ryhmän ja treoniinin OH-ryhmän välittämä eetterisidos. Stökiometristen huomioiden perusteella oletetaan, että aktivoiminen tapahtuu ensisijaisesti kversitiinimolekyylin vieressä olevassa glukoosimolekyyIissä. Kuitenkin on ymmärrettävää, että keksinnön mukaan valmistetut kompleksit muodostuvat glukoosin aktivoimismekanismilla riippumatta aktivoitumisen tarkasta paikasta sellobioosifraktiossa. Tarkkaan ei tiedetä, mikä OH-ryhmä sellobioosifraktiossa käsittää sidospaikan.

Kuten edellä olevasta rakenteesta käy selville, molekyyli on avoin eri kohdissa konjugoituakseen hyvin erilaisten reagoivien aineiden kanssa. Voidaan valmistaa monia monivalenttisia konjugaatteja, joiden voidaan odottaa rakenteensa ansiosta aloittavan allergiset reaktiot.

On todellakin huomattu, että proteiinien tai peptidien liittäminen molekyylin muihin kohtiin kuin glukoosi- tai hiilihydraattiosiin johtaa konjugaatioihin, jotka aloittavat allergiset reaktiot.

Termiä "monivalenttinen" käytetään allergologiassa konjugaatin yhteydessä ilmoittamaan, että molekyylissä on käytettävissä useita kohtia allergiareaktion estämiseen.

Termi1lä"konjugaatti" tarkoitetaan konventionaalista kemiallista yhdistettä, missä kyseiset reagenssit ovat kemiallisesti sitoutuneet toisiinsa -‘ vastakohtana kompleksille, missä reagenssit ovat sitoutuneet vain löysästi toisiinsa vetysidoksien ym. avulla.

Yllättäen on huomattu, että peptidin tai proteiinin sitoutuminen antigeeni D-fragmenttiin glukoosiosan välityksellä johtaa kompleksiin, joka ei aloita allergisia reaktioita, vaan pikemminkin täydellisesti neutraloi 5 58501 allergia-vasta-aineen ja estää tai ehkäisee allergia-vasta-aineiden muodostumisen.

Niinpä näitä komplekseja voidaan antaa allergia- potilaalle allergiareaktion täydelliseksi estämiseksi tarvitsematta pitkää ja aikaavievää sekä kallista, edellä esitettyä herkkyyden poistomenetelmää. Koska kompleksien antaminen estää täydellisesti allergia-vasta-aineiden muodostumisen, estetään itse allergiareaktio samoin kuin mitkä tahansa sivuvaikutukset, jotka aiheutuvat niiden kilpailevien vasta-aineiden muodostumisesta, joita muodostuu tavallisen herkkyyden poistomenetelmän mukaan.

Timotei-antigeeni D-fragmentti voi olla kovalenttisesti sidottu ainakin' yhden glukoosiosan välityksellä mihin tahansa sopivaan peptidiin tai proteiiniin. On ymmärrettävää, että mikä tahansa peptidi tai proteiini, joka soveltuu annettavaksi allergiapotilaalle, voi olla kovalenttisesti sidottu antigeenifragmenttiin. Edullisia peptidejä ja proteiineja ovat ihmisen seerumalbumiini, lysiinin ja glutamiini-hapon d-aminohappokopolymeeri (d-GL), ihmisen IgG sekä muut homologiset ja samantapaiset proteiinit tai d-amiiiohappokopolymeerit.

Kuten edellä on mainittu, on olennaista, että peptidi tai proteiini on sidottu antigeeni D-fragmentin glukoosiosaan. Proteiinin tai peptidin liittäminen molekyylin mihin tahansa muuhun osaan johtaa kompleksiin, joka aloittaa pikemmin kuin estää allergiareaktion. Kovalenttinen sidos voidaan aikaansaada aktivoimalla antigeeni D-fragmentti syanhalo-genidilla. Tätä menetelmää on kuvannut yksityiskohtaisesti Axen et ai julkaisussa Nature, 214, 1302-1304 (196.7) ja Cuatrecasas et ai julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei., US, 6l, 636-643 (1968). Syanhalogenidi reagoi glukoosiryhmän hydroksyyliryhmän kanssa syanaattiestereiden muodostamiseksi. Reaktio tapahtuu nopeimmin pH-arvossa 10 - 12. Syanaatti voi reagoida edelleen lisähydroksyyliryhmien kanssa imido-karbonaatti-välituotteen muodostamiseksi. Syklinen imidokarbonaatti, jota muodostuu päätuotteena syanhalogenidin reagoitua glukoosiosan kanssa, on hyvin reaktiokykyinen amiinien kanssa, niin että saadaan N-imidokarbonaatteja, isokarbamideja tai N-karbonaatteja. Proteiinin ja syanhalogenidilla aktivoidun glukoosiosan välisen sidoksen tarkka luonne on tuntematon. Kuitenkin riippumatta tarkasta mekanismista välituote, joka muodostuu syanhalogenidin reagoidessa antigeeni D-fragmentin kanssa, on hyvin reaktiokykyinen muodostamaan peptidien ja proteiinien kanssa kompleksin, jossa peptidi tai proteiini on kovalenttisesti sidottu glukoosiosan välityksellä antigeenin D-fragmenttiin.

6 58501

Antigeeni D-fragmentin sellobioosifraktio voidaan aktivoida myöskin sidoksen muodostumiseksi proteiiniin tai peptidiin menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Immunol. 20, 1061, (1971): ch2oh ch2oh { \r~ ®— hapetus ^ \/* " V—O —

-o-Af J Na,0« -°\ J

I—r li n OH 0 0 ch2oh J— 0 proteiini^ l/ yo- pemsty8> esIm.

-O-Ah oA NaBH. -> /\N/\

HO | OH

R

ch2oh /CH2 n'

R

Kun antigeeni D-fragmentin karboksyyliryhmät aktivoitiin Woodwardin reagenssilla K, jättäen kversitiini-glukoosi-glukoosiosa koskemattomaksi,aiheutti saatu konjugaatti esimerkiksi ihmisen seerumalbumiinin kanssa antigeenin aikaansaamia histamiinin vapautumisreaktioita, kuten on todettu välittömillä ihokokeilla. Niinpä on ilmeistä, että kompleksin ominaisuudet allergiareaktion estämiseksi riippuvat peptidin tai proteiinin konjugaatiosta antigeeni D-fragmentin kanssa glukoosiosan välityksellä.

7 58501

On selvää, että antigeeni D-fragmentti. voidaan liittää proteiini- tai peptidimolekyyIin eri kohtiin. Tavallisesti on edullista sitoa noin 2,0 - 30 moolia, s-opivimmin 5 - 20 moolia antigeeni D-fragmenttia 1 mooliin proteiinia tai peptidiä. Moolisuhdetta voidaan vaihdella vaihtelemalla reagoivien aineiden moolisuhdetta valmistusmenetelmässä.

Edellä selostetut antigeeni-proteiinikompleksit voidaan sisällyttää mihin tahansa sopivaan väliaineeseen, kuten puskuroituun suolaliuokseen allergiapotilaalle antamista varten.

Tavallisia lisäaineita, apuaineita ja muita aineita voidaan lisätä valmisteeseen ruiskutusta varten. Kuitenkin on ymmärrettävää, että ne eivät ole välttämättömiä.

Tavallisesti valmisteet ruiskutetaan ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti.

Tavallisesti ruiskutettavat annokset, jotka sisältävät valmistekomplek-sia noin 0,01 - 0,25 mg, sopivimmin 0,025 - 0,1 mg/kg kehon paino, ovat riittäviä aikaansaamaan allergiareaktion estokyvyn hyväksyttävän tason.

On ymmärrettävää, että annoksen suuruuden määräävät eri tekijät, kuten kompleksin kestoaika verenkierrossa, hoidossa olevan potilaan vasta-ainetiitteri, potilaan vastustuskyvyn tila ja IgE-vasteen hillinnän kestoaika.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut tuotteet ovat käyttökelpoisia käsiteltäessä ruoholle herkkiä potilaita allergiaoireiden vähentämiseksi. Kompleksit ehkäisevät allergiavasta-aineiden muodostumisen ruohon siitepölyantigeeneja vastaan ja neutraloivat lisäksi potilaan elimistössä olemassa olevat vasta-aineet. On ymmärrettävää, että keksintö on käyttökelpoinen estettäessä ei ainoastaan timotein aiheuttamia allergiareaktioita, vaan myöskin pyörtänölusteen ja muiden ruohojen siitepölyjen, jotka ristireagoivat, aiheuttamia allergiareaktioita.

Seuraava esimerkki havainnollistaa keksinnön mukaista valmistusmenetelmää.

8 58501

Esimerkki

Antigeeni D-proteiinikompleksin valmistus 90 mg antigeeni fragmenttia (mol.paino noin 5000) pantiin hauteeseen ja pH säädettiin arvoon 10,5 natriumhydroksidiliuoksella. Seokseen tuotiin moottorikäyttöinen sekoitin ja lisättiin 2 g CNBr. pH pidettiin arvossa 10,5 - 0,25 lisäämällä NaOH seuraavan kymmenen minuutin aikana. Sen jälkeen lisättiin 15 ml 0,1 M HaHCO^ puskuriainetta (pH 9), joka sisälsi 0, 15 M NaCl. Sitten lisättiin 45 mg ihmisen seerum-albumiinia (HSA) ja seosta sekoitettiin 4°C:ssa 24 tuntia. Seos väke-vöitiin alipaineessa, jolloin saatiin tuotetta, jossa antigeenin D.^ ja proteiinin suhde oli noin 5:1· Reagoimaton antigeeni poistettiin dialyysin avulla.'

Seuraavat kokeet havainnollistavat keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen kompleksien esto-ominaisuuksia allergiareaktioita vastaan.

Biologisia kokeita Koe 1

Histamiinin vapautuminen apinan keuhkokudoksesta, joka oli passiivisesti herkistetty allergiapotilaiden seerumilla, määrättiin menetelmän mukaan, jonka Malley et ai on esittänyt julkaisussa J. Immunol. 100, 915 (1968). Verihera, jota käytettiin herkistämään apinan keuhkokudosta, oli saatu 20:n timoteille herkän potilaan ryhmästä, joiden potilaiden keskimääräinen allerginen vasta-ainetiitteri oli 1:750. Sitten apinan keuhkokudosta inkuboitiin kaksi tuntia 37°C:ssa seerumin kanssa. Ennen herkisteellä vaikuttamista kudosta inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa estoaineen kanssa. Antigeeninen vaikutus aikaansaatiin inku-boimalla raa'an siitepölyuutteen (WST) optimiväkevyydellä 15 minuuttia 37°C:ssa.

Tulokset on esitetty taulukossa 1, jossa: WST tarkoittaa koko timoteisiitepölyn vesiuutetta, joka. on dialysoitu pienen molekyylipainon omaavien fragmenttien poistamiseksi; tarkoittaa timotei-antigeeni D-fragmentteja, joiden molekyyiipaino on noin 5000; 58501 9 HSA tarkoittaa ihmisen seerumalbumiinia; dGL tarkoittaa glutamiinihapon ja lysiinin d-aminohappokopolymeeria, jonka molekyylipaino on noin 40 000; ja

Rhlg tarkoittaa reesus-IgGrtä.

Kuten taulukossa 1 esitetyistä tuloksista käy selville, keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut kompleksit ovat tehokkaasti vaikuttavia estoaineita allergiareaktioita vastaan.

10 58501 (ft

O

•Ρ » γλ m γ~ W I ΙΓ» Ον 00 d

• > -H

B d C

:o -p O

-p -p ®

p 3 M

h a ή r» -a· »r» H-H-Ptac^ n h n rt d C 3. · » · ·

> > Sj N r- O O

c

•H

c o

O

id

•H

E-» +» a ω

Ifl CM 1 o ooo i* d >— -a· pr -a· -a· c

•H

-P

d to so to

d E E E

oa

3 OOO

•r> · Ό 00 O

C rt CM »rv m o rt . « ·

id > I OOO

H | Ή

O -P

rt c

rt -H

3 O

H I® 3 3 0 ctf T~i -j i~* ·*» f· H. c £ ** ·· 0 3 es >λ sr « » r vo 1-1

•H

P

c rt h E o H

ba o

3 -P

•o o u cc m o o z

id E i G

e 0 -p bo

« < H J

•H (Λ S3 a a k ci ό <-> gs | | | d (f) - T- r-

> rt Q Q Q

58501 11

Koe 2

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen kompleksien passiivista siirtoihoreaktiivisuutta verrattiin niihin antigeeneihin, jotka ovat läsnä timotein Siitepölyssä sekä niihin komplekseihin, jotka on valmistettu konjugoimalla peptidiä tai proteiinia antigeenifragmentteihin muilla kuin glukoosiosalla.

0,1 ml veriheraa, joka sisältää vasta-aineita (20:n timoteille herkän potilaan ryhmän herasta keskimääräisen P-K tiitterin ollessa 750) ruiskutettiin ihonsisäisesti ei-allergisen vapaaehtoisen ihoon.

48 tuntia myöhemmin jokaista kohtaa, joka aikaisemmin oli herkistetty ko. veriheralla, käsiteltiin erilaisilla antigeeneillä ja komplekseilla. Annetussa veriherassa olevat allergiavasta-ai.neet reagoivat aller-geenisten antigeeniaineiden kanssa paikallisena allergiareaktiona.

Ellei antigeeniaine aloittanut allergiareaktioita, mitään paikallista reaktiota ei todettu.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla komplekseilla sekä timotein siitepölyssä olevalla antigeeniaineella suoritettujen eri kokeiden'tulokset on esitetty taulukossa 2,missä WST, D1, HSA, dGL

ja Rhlg tarkoittavat samaa kuin taulukossa 1; D2 tarkoittaa timotei-antigeeni D-fragmenttia, jonka molekyylipaino on noin 2500; tarkoittaa timotei-antigeeni D-fragmenttia, jonka molekyylipaino on alle 1000 ja sisältää edellä esitettyä kompleksia, jossa T on treoniini;' ; 12 0 58501

•H

P.

J* cd • Q) *····! ti + bO bO bO hO bO bO + + +

O) OI <D φ <U <D

^ ^ CCCCCCCM^r^r

(XI

3!' std >

bO bOMbOtflbObfl bObObD

•H 3. 33333.3. 333

C

01 I—I o O O O O O LTi Lf\ o

01 OOCOOOO OJCMO

bO ia in m in in in rH

•γΗ p

C

<c 01 Ό

JC

3

tO

•H

P

C

•H

O

bO

3 iHiHr-IiHiHH <—I <—| <—( •<~> ............ ......

C I cxj^roojaoLn O ^ CM λ ii n it

i*J VO C— CM CVJ i-H

I—f

% -H -H

« CO OI

'"d CO OI

cc ί-» ai ai ai bo bo C cd Cd φ a> ai ε cc •h cd cd p £ C C C. C xd

** cd ·Η -h cd E

•H .r-, T3 Ό O

O- -Hl C C -H >, «» o -h cd cd o c =» > C S S > t.

·*? c -H ai T3 Ό -H K

c CQp^JcdOOPO

O I Ϊ2 3i O to O O^niO

« O < tn O Γ2 5:<o

CM

o ai o o

P ω bO

-¾ W < t-J M M iJ < < < <ζ 2 -h coox:o:cjcocococo ^ e KOKccOÄKacac: 2 ·—· e-* i i i i i i iii <d cd CO r-l i—( iH CM CM KV <—( rH ΚΛ

£~< > 3: QQQQQQQQQ

13 58501 ·

Taulukossa 2 esitetyt tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut kompleksit eivät Aloita allergiareaktioita. Lisäksi huomataan, että antigeeni D-fragmenttien ne kompleksit, jotka on konjugoitu proteiinin kanssa muiden osien kuin glukoosiosan välityksellä, ovat voimakkaita allergiareaktioiden aikaansaajia, mikä osoittaa, että antigeeni D-fragmentin konjugoiminen glukoosiosan välityksellä on oleellista.

Seuraava koe havainnollistaa keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen kompleksien kykyä ehkäistä allergiavasta-.aineiden muodostumista.

Koe 3 /

Alustavat tutkimukset osoittivat, että LAF.^ hiiret kehittivät hyvän IgE:n(allergiavasta-aineet) timotein siitepölyä vastaan.

Eläimiin ruiskutettiin vatskakalvon sisäisesti 10 yg WST:ä alunassa ja kolmen viikon kuluttua ne saivat toisen vatsakalvon sisäisen ruiskeen 10 yg WST:ä alunassa. IgE tiitterit kohosivat alkuimmunoinnin jälkeen arvoihin välillä 1/100 ja 1/200 mitattuna PCA:na. IgE tiitterit antigeenin toisen ruiskeen jälkeen kohosivat arvoihin välillä 1/600 ja 1/800 mitattuna PCArna.

Passiivinen ihon anafylaksia (PCA) mitattiin ruiskuttamalla 0,025 ml laimennettua seerumia hiiren tai rotan kylkeen. 72 tuntia (hiiri) tai 3 tuntia (rotta) myöhenlmin eläimiin vaikutettiin WST:llä Evansin sinisessä väriaineessa ruiskuttamalla sitä niihin laskimonsisäisesti. Kiertävän antigeenin ja kudoksen kiinnittyneen IgE:n välinen reaktio aikaansai paikallisen allergiareaktion ja tämä kohta tuli näkyväksi sinisen värin tihkumisesta reagoivaan alueeseen. IgE tiitteri määrättiin alimpana laimennuksena, joka antaa positiivisen PCA-reaktion.

Hiiri-IgE näissä eläimissä tehdään samaa antigeenistä determinanttia vastaan kuin mikä on ilmaistu antigeeni D-fragmenteilla.

Se keksinnön mukainen kompleksi, joka valittiin koetarkoituksia varten,oli:

Antigeeni D2~dGL (D2~dgL): d-glutamiinihaoon ja d-lysiinin (moiekyy-

Upai.no *40 000) ei vastustuskykyä aiheuttava kopolymeeri, jossa oli 14 58501 keskimäärin 2,8 antigeeni Dj-ryhmää/mooli dGL. Konjugoiminen tapahtui muuttamalla sokeriosa CNBr:n kanssa ennen lisäystä dGL:ään.

D2~dGL annettiin vatsakalvon sisäisesti Ja 3 päivää ennen WST:n toista immunisointia.

päivä 0 18 21 28 ruiske WST D2«dGL WST tihkuminen alunassa alunassa

Tulokset: Kontrollieläimillä, jotka saivat suolaliuosta 18 päivänä, on seuraava IgE tiitteri-600j keskimääräinen reaktio 18 eläimessä.

D2~dGL:llä käsitellyt eläimet: PCA tiitteri Eläinryhmä

Pieni annos (0,12 mg

AgD2) 350 6

Keskikokoinen annos (0,6 mg AgD2) 300 6

Suuri annos (1,2 mg

AgD2) <100 6 Nämä arvot osoittavat, että konjugaatti alentaa huomattavasti IgE-tasoa, kun antaminen tapahtuu 3 päivää ennen toista antigeeni-ruisketta, mikä osoittaa vasta-aineen neutralointia ja häviämistä. Samanlaiset kokeet ovat osoittaneet, että antaminen vieläpä 7 päivää ennen toista antigeeniruisketta antaa pääasiallisesti samat tulokset.

Claims

58501 15

1. Menetelmä multivalenttisen antigeenikompleksln valmistamiseksi allergiareaktioiden estämistä varten, joka kompleksi on ainakin yhden timotei-antigeeni D-fragmentin ja proteiinin tai peptidin kompleksi ja jolla on yleinen kaava ^,ΟΗ HO—-°H O-G1-G "-O-T missä G' ja G” tarkoittavat glukoosia ja missä ainakin yhteen glukoosiyksiköistä G’ ja G" on kovalenttisesti sitoutunut farmaseuttisesti hyväksyttävä peptidi tai proteiini,ja T tarkoittaa treoniinia tai peptidiä, joka on sitoutunut rakenteen loppuosaan treoniinimolekyylin välityksellä, tunnettu siitä, että timotei-antigeeni D-fragmentti, jolla on antigeeninen determinant tikaava OH ^JL^JLo-g-g-o-t missä G tarkoittaa glukoosia ja T:llä on edellä mainittu merkitys, saatetaan -reagoimaan aktivoimisaineen, esimerkiksi syanhalogenidin kanssa ja saatetaan näin muodostunut aktivoitu välituote reagoimaan farmaseuttisesti hyväksyttävän peptidin tai proteiinin, esimerkiksi ihmisen seerumalbumiinin, lysiinin ja glutamiinihapon d-aminohappokopoly-meerin tai ihmisen IgG:n kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T on treoniini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T on sellainen treoniinipitoinen peptidi, että fragmentin molekyylipaino on noin 5000.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T on sellainen treoniinipitoinen peptidi, että fragmentin molekyylipaino on noin 2500.