FI58425B - Antimikrobiell komposition - Google Patents

Description

rl KUULUTUSjULKAISU rftior 3|Ϊα [B] (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 504^b c (45) ; - -" · : x :. :· :: - :: :;i (51) K».ik?/!nt.a.3 A 01 N 37A4 // A 01 N 33/10 SUOM I—FI N LAN D pi) hwiwMimw-PitiwwiWiii 2^02/73 (22) Hakemltpllvt—Aiweknlnpdtg 31.07.73 ^ ^ (23) AlkupUv*—GlM|h«tsd*f 31.07.73 (41) Tulkit lulktMki) — Bllvh afTmtllg 01.02.7^

Patentti· ja rekisterihallitus /44} Nlhtlvllulptnon |t kuuLjulfcalauii pvm. ·—

Patent- och registerstyreisan Ameku utiugd och utUkrift«n pubitc«nd 31.10.80 (32)(33)(31) Pyyduttjr utuolkuu» —Bugirt prtoritvt 31.07.72 Ruotsi-Sverige(SE) 9953/72 (71)(72) Sven-Gunnar Hesselgren, Ängsholmen, Drottningholm, Ruotsi-Sverige(SE) (7^) Oy Roister Ab (5U ) Antimikrobinen yhdistelmä - Antimikrobiell komposition

Keksinnön kohteena on uusi antiaikrobinen yhdistelmä, jota edullisesti voidaan käyttää esim. hammashoitoon.

Dodekyyli-di**(aminoetyyli)-glysiini, jatkossa lyhennetty DAGiksi, luetaan amfoteerisiin elektrolyytteihin kuuluvaksi, joita tavallisesti sanotaan amfolyytti-saippuoiksi. Näissä aineissa, jotka siten ovat sekä anioni- että kationi-aktiivi-sia, yhdistyvät kationi-aktiivieten bakteereja torjuvat ominaisuudet anioni-aktii-visten aineiden pinta-aktiiviseen ja likaairrottavaan kykyyn. Vastakohtana esim. inverttisaippuoille eivät amfolyyttisaippuat yhdessä munanvalkuaisen kanssa saostu ollenkaan tai korkeintaan hyvin vähän. On tunnettua, että DAG pienissä väkevyyksissä ja lyhyin vaikutusajoin tehoaa gram-positiivisiin ja gramnegatiivisiin bakteereihin sekä sieniin. Yhdisteen vaikutusta suun mikroflooraan ja mahdollisuuksia sen käyttöön odontologisesti ei alan kirjallisuudessa tähän mennessä ole käsitelty.

On myös tunnettua, että klooriheksidiini on tehokas grampositiivisia ja gramnegatiivisia bakteereita sekä sieniä vastaan. Klooriheksidiiniä, joka on emäs, voidaan tällöin käyttää suolan muodossa, kuten esim. diglukonaattina liukenee 5 8425 helposti veteen), diasetaattina (liukenee vähemmän veteen kuin diglukonaatti;, dikloridina (liukenee veteen ainoastaan 0,06 %:iin asti) tai monofluorifosfaattina.

Nyt on tämän keksinnön mukaisesti yllättäen käynyt ilmi, että DAG yhdessä klooriheksidiinidiglukonaatin kanssa antaa mikrobeja torjuvan yhdistelmän tai estoaineen, jonka vaikutus näihin organismeihin on tehostunut.

Keksinnön mukainen antimikrobinen yhdistelmä on niinmuodoin tunnettu siitä, että se vaikuttavina aineosina sisältää dcdekyyli-di(aminoetyyli)-glusii-niä ja klooriheksidiinidiglukonaattia.

Keksintö ei rajoitu joihinkin määrättyihin suhteisiin näiden kahden aineosan välillä, koska on käynyt ilmi, että pienikin määrä jompaakumpaa komponenttia suhteessa toiseen komponenttiin vastaavissa vaikutusainepitoisuuksissa antaa tehostuneen vaikutuksen verrattuna komponenttien vaikutukseen yksittäin. Suhteet ja vaikutusaineen kokonaismäärä valitaan huomioonottaen kummankin komponentin sisäinen myrkyllisyys, aiottu käyttöalue, teho ja käyttömuoto.

Seuraavassa esitetään joukko kokeita, jotka on suoritettu käyttäen DAG:ia ja klooriheksidiinidiglukonaattia, 1,1'-heksametyleeni-bis-^5-(p-kloorifenyyli)-biguanidi7~diglukonaattia kutakin erikseen sekä keksinnön mukaisina yhdistelminä, ts. sisältäen DAG:ia ja klooriheksidiinidiglukonaattia. Yhdistelmänäytteissä käytettiin yhtä suuria paino-osia kumpaakin komponenttia jollei toisin ilmaista.

Kokeissa käytettiin mikro-organismien Streptococcus faecalis ja Eecherichia coli:n puhtaaksi viljeltyjä viljelmiä sekä hammasplakkiainetta erilaisissa olosuhteissa sekä fosfaattipuskuria ja steriiliä sylkeä. Käytännön menettely viljelyn, puhdistamisen, kokoamisen ja jatkokäsittelyn suhteen suoritettiin tavanomaisella tavalla mikro-organismien homogeenisten suspensioiden saamiseksi. Hammasplakki otettiin kokeen yhteydessä samalta henkilöltä koko ajan, jolloin plakinotto tapahtui aamulla ennen mitään suuhygienisiä toimenpiteitä. Tuoretta sylkeä kerättiin joukolta luovuttajia ja sädesteriloitiin Cobolt 60:11a (Radona Irradation,

Skärhamn) suljetuissa lasiputkissa säteilyannoksen noustessa 3,2 M rad:iin asti.

Kokeet suoritettiin 3T°C:ssa kun esikokeet 20° ja 3T°C:ssa eivät osoittaneet eroja inaktivoimisvaikutuksen suhteen.

Väkevyydeltään erilaisia vesiliuoksia kustakin kolmesta estoaineesta valmistettiin perusliuoksesta dodekyyli-di-(aminoetyyli)-glysiini (TH. Goldschmidt, A.G., Chemische Fabriken, Essen) sekä klooriheksidiinidiglukonaatista (ICI, London).

K.

3 58425

Kokeet suoritettiin seuraavalla tavalla: 1 ml homogenisoituja bakteerisuspensioita tai homogenisoitu testiaine sekoitettiin 1 ml:n kanssa inhibiittoriliuosta 8 ml:ssa steriiliä fosfaattipuskuria tai 8 ml:ssa steriloitua sylkeä. Vaikutusajan umpeuduttua membraani-suodatettiin sopiva määrä seosta sekä pestiin steriloidulla vedellä estoaineen poistamiseksi suotimesta (Millipore, MF, HA 0,1+5 ^um). Uusiintumiskelpoisten solujen laskemiseksi suoritettiin inkubointi 37°C:ssa 2U-U8 tunnin aikana membraanisuotimet sijoitettuna veriagarlevyilie (5 % hevosen verta). Pesukertojen lukumäärä, joka tarvittiin poistamaan estoaine määrättiin erillisin kokein, käyttäen käytettyjen estoaineiden voimakkainta väkevyyttä ja bakteerisuspensiota, jonka tiheys tunnetaan.

Suoritettujen kokeiden tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa, jotka ilmaisevat eloonjääneiden organismien lukumäärän ilmaistuna logaritmisinä lukuina 1+ minuutin estokäsittelyn jälkeen. A ilmaisee dodekyyli-di-(aminoetyyli)-glysii-nin (DAG), B klooriheksidiinidiglukonaatin ja C yhdistelmän näistä kahdesta aineesta.

Taulukossa 1 on esitetty tulokset kokeista pestyillä Escherichia coli-bakteerisuspensioilla fosfaattipuskurissa, pH 7*0.

Taulukko 1

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu _0,001 0,01 0,1_1^0_ A 2‘106 2Ί06 1Ί02 0 2‘106 B 2 ΊΟ** 2Ί02 0 0 2 ·106 C 6-105 2*10° 0 0 2·106

Esitetyistä arvoista näkyy, että estoaineen A (DAG) pitoisuudet 0,001 ja 0,01 mg/ml eivät vaikuttaneet alkuperäiseen bakteerilukuun suspensiossa (2*10^). Estoaineelle B (klooriheksidiinisuola) vastaavissa väkevyyksissä saatiin bakteerivähentymä, joka graafisena esityksenä on eksponentiaalinen. Estoaine C:llä (DAG + klooriheksidiinisuola) saatiin ainoastaan vähäinen inaktivointi aikaan väkevyydessä 0,001 mg/ml, mutta sensijaan bakteerisidinen vaikutus 0,01 mg/ml-väkevyykeissä ja suuremmissa oli suurempi kuin käytettäessä DAG:ia tai klooriheksidiiniä yksinään.

Taulukossa 2 on esitetty vastaavat koetulokset Streptococcus faecalis-bakteerisuspensiolle.

11 58425

Taulukko 2

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu 0,001 0,01 0,1_1^0_ A 2*10^ 2*106 3*102 0 2Ί06 B 1·105 5-102 7·10° 0 2·106 C 2*106 8-101 0 0 2·106 Näissä vastaavissa kokeissa Streptococcus faecalis :11a saatiin kuten taulukosta 2 käy ilmi, eroja inaktivoimiskyvyssä, jotka ovat samankaltaisia kuin taulukoi 1 kokeissa.

Sameilla tavalla kuin näissä esimerkeissä tehtiin vertailukokeita näillä eri estoaineilla Streptococcus faecalis-bakteerisuspensioilla steriilissä syljessä, jonka pH oli 7*3. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu 0,001 0,01 0,1 1,0 A 1·107 1·107 1*107 1-101* 1·107 B 1·107 7·106 5·103 9·102 1·10Τ C 1·10τ 5.·106 '7· ίο2 .1*10° 1·107

Tulokset osoittavat* että syljessä vaadittiin korkeampia eetoainepitoisuuk-sia saman bakteerimäärän vähentämiseksi kuin fosfaattipuskurissa. Eri estoaineiden vaikutusten välinen suhde oli sensijaan sama kuin edellisissä kokeissa.

Suoritettiin lisäkokeita eri estoaineiden vaikutuksen tutkimiseksi homogenoidussa hammasplakissa fosfaattipuskurissa* jonka pH oli 7*0. Hammasplakki saatettiin sekä aerobisen että anaerobisen viljelyn alaiseksi. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1* (aerobinen viljely) ja taulukossa 5 (anaerobinen viljely).

Taulukko U

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu __0,001 0,1_0A_1^0_ A 1-10 7 7·106 1·106 3Ί02 1·107 B 1·107 1*106 5'10U 7*102 1·107 c 1·107 1·105 1·103 1-101 1·107 5 58425

Taulukko 5

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu _0,001 0,01 0,1_1,0 ____ A 7*107 9‘106 2Ί06 2‘102 7‘107 B 7 *107 7*10^ 8-101* 3*103 7* 107 C 7’107 7*105 6-101* 1*10° 7* 107

Edellä esitetyistä arvoista käy ilmi, että näiden eri preparaattien plakin inaktivoimiskyky jäi samaksi kuin edellä eistetyissä kokeissa puhtaaksi viljellyillä kannoilla. Niinmuodoin antoi estoaine A (DAG) teholtaan huonoimman tuloksen ja estoaine C, ts. DAG:N ja klooriheksidiinin yhdistelmä parhaan vaikutuksen vertailukelpoisissa estoaineväkevyyksissä.

Vastaavat kokeet homogenoidulla hammasplakilla sylkeen suspendoituna osoittivat, että vaaditaan suurempia inhibiittoriväkevyyksiä vastaaviin tuloksiin pääsemiseksi kuin fosfaattipuskurissa. Sensijaan näiden kolmen preparaatin anti-mikrobisen vaikutuksen sisäinen suhde ei muuttunut.

Yhdistelmäpreparaatin (C) lisääntynyt inaktivoimiskyky suhteessa DAG:n (A) ja klooriheksidiiniin (B) vastaavissa väkevyyksissä on luettavissa tehostuneeksi (synergeettiseksi) vaikutukseksi näiden aineiden yhdessä ollessa.

NaF:n vaikutuksen tutkimiseksi puhtaaksiviljeltyihin bakteereihin tai ham-masplakkiin sekoittuneeseen mikroflooraan suoritettiin lisäkokeita lisäten natrium-fluoridia (NaP) yhdistelmäestoaineeseen, joka koostui DAG:stä sekoitettuna kloori-heksidiiniglukonaattiin. Tehdyissä erilliskokeissa on käynyt ilmi, että NaF pelkästään ei ole tutkittujen mikro-organismien suhteen bakteerisidinen aine.

Taulukossa 6 esitetään tulokset saaduista kokeista yhdistelmäestoaineella C, ts. joka sisältää yhtä monta paino-osaa DAG:tä ja klooriheksidiinidiglukonaat-tia. Tällöin käytettiin toisessa osakokeessa 30 mg:n NaF-lisäystä ml:aa kohti eetoaineliuosta kokeessa, joka suoritettiin vesi väliaineena sekä kolmannessa osakokeessa, joka suoritettiin sylki väliaineena. Testi organismina käytettiin Streptococcus faecalis:ia. Kuten aikaisemmissakin taulukoissa annetaan myös taulukossa 6 eloonjääneiden organismien lukumäärä 1* minuutin estokäsittelyn jälkeen.

6 b 8 4 2 5

Taulukko 6

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu _ 0,001 0,01 0,1_1^0____ C 2·10Τ 8·102 0 0 2·10Τ C + NaF vesi 7 väliaineena 2*10 3· 10j 0 0 2*10* C + NaF sylki , väliaineena 2·1θ' 2·10* 5*10 0 2·10*

Lisäksi suoritettiin kaksi koetta fluoridi-pitoisilla estoaineliuoksilla D, jotka tilavuusyksikköä kohti sisälsivät 10 mg DAG:tä 1 mg klooriheksidiinidi-glukonaattia ja 30 mg NaF:ia. Ensimmäisessä kokeessa testiorganismina oli Streptococcus faecalis. Toisessa kokeessa testiaineena oli hammasplakki. Tulokset näistä kahdesta kokeesta ovat mainitussa järjestyksessä taulukoissa 7 ja Θ, jotka ilmoittavat eloonjääneiden organismien lukumäärän U minuutin estokäeittelyn jälkeen.

Taulukko 7

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu 0,001 0,01________ D 3*105 0 5*10^

Taulukko 8

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu __0,001 0,01_Ojl______ D 1+-106 6*103 0 5‘106 Näiden kolmen koesarjan (taulukot 6-8) tuloksista käy ilmi, että 30 mg:n NaF-lisäys/ml estoaineliuosta ei vaikuttanut tämän keksinnön mukaisien estoaineiden inaktivoimistehoon, vaan saatiin samat koetulokset kuin kokeissa ilman NaF:n lisäystä. Tämä päti sekä puhtaaksiviljeltyjen bakteereiden että hammasplakin kohdalla suspendoituina joko fosfaattipuskuriin tai sylkeen.

Lisäkokeissa tutkittiin yhdistelmäpreparaatin bakteerisidisiä ominaisuuksia Streptococcus faecalis:ia vastaan käyttäen vaihtelevia määriä kahta kyseessäolevaa komponenttia niitä samalla verraten muihin testattavina olleisiin estoaineisiin.

Koe tehtiin U:llä estoaineliuoksella E, F, G, H, vaikuttavan aineen eri pitoisuuksin, jolloin liuokset suhteellisesti ilmaistuna esitetyssä järjestyksessä sisälsivät 1,0 osaa DAG:tä (E), 0,1 osaa klooriheksidiinidiglukonaattia + 0,9 osaa DAG:tä (F), 7 68425 0,0 osaa klooriheksidiinidiglukonaattia (G), ja 0,9 osaa klooriheksidiinidigluko-naattia + 0,1 osaa DAG:tä (H). Eloonjääneiden organismien lukumäärä k minuutin estoaineille alttiina olon jälkeen on esitetty seuraavassa taulukossa 9·

Taulukko 9

Estoaine Vaikuttavan aineen määrä, mg/ml Vertailu 0,001 0,01 0,1 E 1*10 7 1*10 7 3* 10** 1*107 F (yhd.) 7·106 2*106 8·103 1-107 g 5·ιο6 5*105 Τ’ΙΟ1 1·107 H (yhä.) 2·106 3·105 2·10Χ 1·107

Saaduista tuloksista kävi ilmi, että tehostunut (synergistinen) vaikutus saatiin aikaan kummallakin yhdistelmäpreparaatilla F ja H. Niinpä siis antoi pieni klooriheksidiinidiglukonaatin lisäys suurempaan DAG-määrään (estoaine F) bakteerit or juntaky kyyn huomattavan lisäyksen verrattuna vastaavaan määrään DAG:ta vaikuttavana aineena (estoaine E) samoissa väkevyyksissä ja päinvastoin lisäsi pieni DAG-lisäys suurempaan määrään klooriheksidiinidiglukonaattia (estoaine H) baktee-rintorjuntatehoa verrattuna klooriheksidiinidiglukonaattiin (G) vastaavissa olosuhteissa.

Näiden edelläsuoritettujen tukimusten pei*usteella, jotka osoittavat kloori-heksidiinidiglukonaiatin ja DAG:n antimikrobisen vaikutusvoiman sekä niiden yhteiskäytöstä syntyvän tehostuneen vaikutuksen perusteella ja myöskin sen perusteella, että NaLF ei vaikuta tämän yhdistelmän inaktivoimisvoimean, esitetään tässä seuranva esimerkki käyttöohjeeksi, joka sopii hammashoidossa suun hygienialle antamaan mikrobivapaan fluori suojatun suuhygienian hammasmädän estämiseksi. Yhdistelmävalmiste on voimakkaasti pinta-aktiivinen ja likaAirroittava ja sinänsä erinomainen täydelliseen hampaiden puhdistukseen. Hammasrakenteen suhteen, kokonaisuudessaan, suoritetut kokeet osoittavat, että tällä valmisteella ei ole todettu olevan mitään elävää hammasrakennetta vahingoittavaa vaikutusta. KlooriheksidiinidiglukonaLatti 0,1 g

Dodekyyli-di-(aminoetyyli)-glysiini 1,0 g »af 3,0 g H20 ad 100 ml Tämän antiseptisen liuoksen pH on noin 7»3 jolla alueella sen bakteereja 8 58425 torjuva vaikutus on tehokkaimillaan. Keksinnön mukaista antimikrobistu yhdistelmää voidaan käyttää lukuisiin eri tarkoituksiin ja erilaisissa muodoissa. Liuosmuodon lisäksi se voi, kuten muutkin antiseptiset aineet olla purtavassa, imettävässä tai voiteen muodossa, joko fluoriyhdisteen mukana tai ilman sitä. Yhdistelmä voi olla aineosana myös muuntyyppisissä suunhoito tai hampaanhoitoaineessa, kuten hammastahnoissa tai voiteissa tai sitä voidaan lisätä tavanomaisiin aineisiin, kuten kiiltoa-antaviin, puhdistaviin, vaahtoamuodostaviin, aromi- tai mauste-aineisiin jne., joita suuhygieniaan käytetään.

Edelläesitettyjä eri yhteyksissä esitettyjä fluoriyhdisteitä, joi ta yleensä käytetään karriesprofylaktisiin tarkoi tuksiin voidaan käyttää suunhoidoilisen Li yleisesti käytettävien fluoripitoisten yhdisteiden kanssa suuontelon hoitoon liittyviin tarkoituksiin esim. hammaskiilteen liukoisuutta happoon estämään ja yleensä suojaamaan hampaita hammasmätää vastaan. Edellämainitun natriumfluoridin asemesta voidaan tähän tarkoitukseen käyttää esim. kaliumfluoridia, tina(II)fluoridia, natriumtina(II)fluoridia, natriummonofluorifosfaattia, jne.

Keksintöä ei rajoita klooriheksidiinin tai klooriheksidiinidiglukonaatin ja DAG:n käyttö yhdistelmänä sellaisenaan vaan mitkä muut tahansa sopivat klooriheksidiinin ja mitkä tahansa DAG:n suolat, joilla on bakteereja torjuva vaikutus tulevat kysymykseen.