FI114141B - Stabiilit kuivapulverit - Google Patents

Description

Stabiilit kuivapulverit 114141 Tämä keksintö koskee hirudiinia sisältäviä koostumuksia ja erityisesti stabiileja pulverivalmisteita.

5

Hirudiini, verijuotikkaissa (Hirudo medicinalis) luonnostaan esiintyvä antikoagulantti ei ole yksi polypep-tidilaji vaan joukko vastaavasti toimivia polypeptidejä, käsittäen ainakin neljä tyypillistä edustajaa, joille on 10 annettu nimet hirudiinimuunnos 1 (HV1), hirudiinimuunnos 2 (HV2) (vrt. EP-A n:o 158 564), hirudiinimuunnos 3 (PA) [vrt. PCT-hakemus n:o 86/03493] ja "des-(Vai)2-hirudiini" (vrt. EP-A n:o 158 986). Muunnokset eroavat toisistaan rakenteeltaan muutamien aminohappojen osalta (erityisesti, 15 HVl:n N-terminaalinen sekvenssi on Val-Val-Tyr, HV2:n ja HV3:n Ile-Thr-Tyr ja "des-(Vai)2-hirudiinin" Thr-Tyr), mutta niille on yhteistä hydrofobisten aminohappojen kertymä N-terminuksessa ja polaaristen aminohappojen kertymä C-ter-minuksessa, sulfaattimonoesterinä esiintyvä tyrosiinitähde 20 (Tyr63), kolme disulfidisiltaa ja antikoagulanttiaktiivi- suus.

Muutaman viime vuoden aikana hirudiinimuunnoksia koodaavia cDNArita ja synteettisiä geenejä on kloonattu ja ilmennetty 25 mikrobi-isännissä. Vaikka ilmentämistuotteista puuttuu sul-faattimonoesteriryhmä Tyr63:sta - ja ne nimettiin siksi V.: "desulfatohirudiineiksi" - niillä osoittautui olevan lähi- • '·· main sama biologinen aktiivisuus kuin luonnollisilla, sul- : : fatoiduilla hirudiineilla. Desulfatohirudiinin muunnos HV1 • 30 on ilmennetty Escherichia colissa (EP-A n:ot 158 564 ja 168 :': 342) ja Saccharomyces cerevisiaessa (EP-A n:ot 168 342, 200 655, 225 633, 252 854 ja 341 215). Samoin, desulfatohiru-: diini HV2 on ilmennetty Escherichia colissa (EP-A n:o 158 564) ja Saccharomyces cerevisiaessa (EP-A n:o 200 655, PCT-• 35 hakemus n:o 86/01224), ja des-( Vai )2-desulfatohirudiini on ilmennetty Escherichia colissa (EP-A n:o 158 986).

2 114141 Tämän keksinnön mukaisesti käsitteen "hirudiini" tarkoitetaan käsittävän hirudiinin, desulfatohirudiinin, hiru-diinimuunnoksen tai desulfatohirudiinimuunnoksen tai niiden mutantin, joita on kuvattu kirjallisuudessa, ja erityisesti 5 desulfatohirudiiniyhdisteen tai sen mutantin, joka on saa tavissa transformoidusta mikro-organismista jossa on desul-fatohirudiinia tai sen mutanttimuotoa koodaavaa DNA:ta. Sellaisia desulfatohirudiineja ovat esimerkiksi desulfato-hirudiinimuunnos HV1, HV1 modifioitu (a, b), HV2, HV2 10 modifioitu (a, b, c), HV3, HV3:n ja des(Vai)2-desulfatohirudiinin muunnokset.

Edullisia desulfatohirudiineja ovat ne, joilla on kaava (SEKVENSSI ID NO: 1) 15

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Va] Cys Gly Gin Gly Asn Xaa Cys Ile Leu Gly Ser 20 20 25 30

Asp Gly Glu Xaa Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 I 1 · 25 Gin Ser Xaa Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Xaa ·.1: 50 55 60 • · · !1;·.1 (i) ’** 30 jossa • 1 : a) Xaa kohdassa 27, 36 ja 47 kussakin on Lys, Xaa kohdassa : : ’ 51 on His ja Xaa kohdassa 62 on peptiditähde Glu-Tyr-Leu-

Gin (HV1), tai .·1·. 35 · 3 114141 b) Xaa kohdassa 27 on Ile tai Glu ja Xaa kohdissa 36, 47, 51 ja 62 ovat kuten on määritelty a)-kohdassa (HV1 modifioitu a), tai 5 c) Xaa kohdassa 36 on Ile tai Glu ja Xaa kohdissa 27, 47, 51 ja 62 ovat kuten on määritelty a)-kohdassa (HV1 modifioitu a), tai d) Xaa kohdassa 47 on Ile tai Glu ja Xaa kohdissa 27, 36, 10 51 ja 62 ovat kuten on määritelty a)-kohdassa (HV1 modifi oitu a), tai e) Xaa kohdassa 51 on Leu tai Asp ja Xaa kohdissa 27, 36, 47 ja 62 ovat kuten on määritelty a)-kohdassa (HV1 modifi- 15 oitu a), tai f) Xaa kohdassa 62 on Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu-Gln, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg, Glu-Asp-Lys-Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tyr- 20 Leu-Gln-Pro tai Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg ja Xaa kohdissa 27, 36, 47 ja 51 ovat kuten on määritelty a)-kohdassa (HV1 modifioitu b), · tai joilla on kaava (SEKVENSSI ID N:O 2) 25

Leu Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15· ' 2Q Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 I 1

Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45

• I 1 M

35 i 4 114141

Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60

Gin <H> 5 65 tai joilla on kaava (SEKVENSSI ID N:O 3) 10 Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 15

Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Xaa Leu 20 rn 50 55 60

Gin 65 :/·! (III) : 25 jossa sekvenssissä • » a) Xaa kohdassa 47 on Asn ja Xaa kohdassa 63 on Tyr (HV2), tai * t I · • · » » 30 b) Xaa kohdassa 47 on Lys, Arg tai His ja Xaa kohdassa 63 on Tyr (HV2 modifioitu a), tai ·' ‘ c) Xaa kohdassa 63 on Glu tai Asp ja Xaa kohdassa 47 on Asn (HV2 modifioitu b), tai joilla on rakennekaava (SEKVENSSI ,···. 35 id N:0 4) 1 I • « 5 5 114141

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15 | Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30

Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro 10 35 40 45

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60 15 Gin 65 (IV) tai joilla on kaava (SEKVENSSI ID N:0 5) 20

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 V. 25 ^ly Ser Asn CV3 Gly lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 I I » ··; Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro G : 35 40 45 • * * 30

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Xaa Leu 50 55 60

Gin 35 65 Γν (V) 6 114141 HV3 ja mainitun HV3:n muunnokset, joille on tunnusomaista primäärirakenteen lyhentymä 1 tai 2 aminohapolla N-ter-minuksessa tai 18, 10, 9, 6, 4 tai 2 aminohapolla C-ter-minuksessa.

5

Erityisen edullisia desulfatohirudiiniyhdisteitä ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa Xaa-ryhmät ovat kuten on määritelty a)-kohdassa tai kaavan III mukainen yhdiste, jossa Xaa kohdassa 47 on Lys ja Xaa kohdassa 63 on Tyr.

10

Edullisin hirudiini on kaavan I mukainen desulfatohirudiini HV1, jossa Xaa kohdissa 27, 36 ja 47 on kussakin Lys, Xaa kohdassa 51 on His ja Xaa kohdassa 62 on peptiditähde Glu-Tyr-Leu-Gln.

15 Tässä keksinnössä käytettyjä hirudiineja voidaan valmistaa synteettisesti, esimerkiksi kemiallisesti tai mieluummin yhdistelmätekniikoilla, tai verijuotikkaista eristämällä.

20 Tämän keksinnön mukaisesti käsitteellä "mutantti” tarkoitetaan proteiineja (muteiineja), joilla on verisuonitukoksia estävää vaikutusta ja jotka eroavat natiivista hirudiinista tai desulfatohirudiinista yhden tai monen mutaation osalta (vrt. EP-hakemukset n:o 352 227 ja n:o 352 228). Mainittuja 25 mutantteja koodaava DNA, joka voidaan valmistaa alalla tun-. : netuilla menetelmillä, esimerkiksi kohdennetulla mutage- ···’ neesillä, kloonataan ja ilmennetään mikrobi-isännissä kuten

Escherichia coli ja Saccharomyces cerevisiae.

• I · • ' 30 Keksinnössä käytetyt hirudiiniyhdisteet voivat olla vapaas sa muodossa mutta myös suolamuotoinaan. Koska ne sisältävät : vapaita aminoryhmiä useissa aminohappotähteissään, yhdis- .’· 1 teet voivat olla happoadditiosuolamuodossa. Sopivia happo- additiosuoloja ovat erityisesti farmakologisesti hyväksyt-···. 35 tävät suolat tavanomaisten terapeuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa. Tyypillisiä epäorgaanisia happoja ovat • · · i V ovat halogeenivetyhapot (kuten kloorivetyhappo), ja myös 7 114141 rikkihappo, fosforihappo ja pyrofosforihappo. Tyypillisiä orgaanisia happoja ovat erityisesti areenisulfonihapot (kuten bentseenisulfonihappo tai p-tolueenisulfonihappo), tai alemmat alkaanisulfonihapot (kuten metaanisulfonihappo), 5 kuin myös karboksyylihapot kuten etikkahappo, maitohappo, palmitiinihappo, steariinihappo, omenahappo, viinihappo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska keksinnössä käytetyt yhdisteet kuitenkin sisältävät useissa aminohappotähteissä myös vapaita karboksyyliryhmiä, jotka antavat 10 happaman luonteen koko peptidille, yhdisteet voivat olla myös suoloina epäorgaanisten tai orgaanisten emästen, esimerkiksi natriumin, kaliumin, kalsiumin tai magnesiumin suoloina, tai myös ammoniumin suoloina, jotka ovat peräisin ammoniakista tai farmakologisesti hyväksyttävästä orgaani-15 sesta typpeä sisältävästä emäksestä. Koska ne kuitenkin sisältävät yhtä aikaa vapaita karboksyyliryhmiä ja vapaita aminoryhmiä, ne voivat olla myös sisäisten suolojen muodossa. Farmakologisesti hyväksyttävät suolat ovat edullisia.

20 Yksi ongelma kehitettäessä hirudiinia sisältävää annos-telumuotoa on sen heikko pysyvyys vesiliuoksissa ja pul-verimuodossa. 1

Huono pysyvyys voidaan havaita kun hirudiinia analysoidaan ,·. 25 kromatografisilla menetelmillä, kuten käänteisfaasi-HP- LClllä (RP-HPLC).

» · · RP-HPLC menetelmä: Käytetään LiChroCART 125-4-kolonnia (Merck LiChrosper 100 RP-18 5 pm). Liuotin A on 0,5% ammo-30 niumasetaatti asetonitriili/vesi-seoksessa (10:90), (tilavuus: tilavuus); liuotin B on 0,5% ammoniumasetaatti aseto- · nitriili/vesi-seoksessa (25:75). Eluutio suoritetaan 45 : : °C:ssa käyttäen virtausnopeutta 0,5 ml/min. Binäärieluutio *t; on lineaarinen gradientti alkaen ajan hetkellä nolla

• I

... 35 23%:11a liuotinta B ja saavuttaen 46% liuotinta B 24 minuu- ·;' tin jälkeen. 2 minuutin jälkeen 70%:ssa liuotinta B kolonni ; tasapainotetaan 7 minuutin ajan 23%:ssa liuotinta B.

8 114141

Kuviossa 1 esitetään vedessä olevan yhdistelmähirudiinin HV1(CGP 39393) tyypillinen kromatogranuni RP-HPLC:tä (1 mg/ml hirudiinia) käyttäen.

5 Kuviossa 1 pääpiikin suhteellinen pinta-ala on 95,15%.

Hirudiinin säilyttäminen vedessä huoneenlämpötilassa johtaa sivutuotteiden lisääntymiseen ajan mukana. Tämä ilmenee pääpiikin pinta-alan pienenemisenä ja pienten piikkien pinta-alan suurenemisena. Esiintyviä muutoksia voidaan nopeut-10 taa käyttämällä lämpötilakuormituskokeita, toisin sanoen säilytystä korotetussa lämpötilassa.

Me olemme nyt havainneet että magnesium- tai kalsiumsuoloja voidaan käyttää lisäämään hirudiinin pysyvyyttä.

15

Siten tässä keksinnössä tuotetaan kylmäkuivattu farmaseuttinen koostumus, joka sisältää hirudiinia ja kalsiumin ja/tai magnesiumin vesiliukoista suolaa.

20 Sopiviin vesiliukoisiin suoloihin kuuluvat magnesiumsulfaatti, magnesiumkloridi ja kalsiumkloridi.

Keksinnön mukainen koostumus voidaan saada aikaan muodos-; tamalla ainesosien vesiliuos ja sitten kylmäkuivaamalla se ; 25 tavanomaisella tavalla. On tärkeätä, että valmiste on tehty ,: kylmäkuivaamalla liuos, kuivien aineosien yksinkertaisella ,··, sekoittamisella ei ole vaikutusta pysyvyyteen.

i ; : ' Metalli-ionin (magnesium ja/tai kalsium) molaarinen suhde i * · 30 hirudiinin vastaavaan voi olla 40:1 saakka, mieluummin välillä 4:1 - 20:1, mieluiten välillä 8:1 - 16:1, esimerkiksi : 10:1 tai suurempi.

I » *

Myös sokeri voidaan haluttaessa lisätä koostumukseen.

.... 35

Sopiviin sokereihin kuuluvat mannitoli, trehaloosi, sak-: karoosi, sorbitoli, fruktoosi, glukoosi, maltoosi, laktoosi * · 9 114141 ja dekstraani. Edullisia sokereita ovat mannitoli ja treha-loosi.

Sokerin määrä liuoksessa ennen kylmäkuivausta voi olla sel-5 lainen, että aikaansaadaan pitoisuus välillä 5-50% (paino/-tilavuus) ja edullisesti 5-20% (paino/tilavuus). Liuos ennen kylmäkuivausta on edullisesti isotoninen.

Liuoksen pH ennen kylmäkuivausta voi olla arvojen 4 ja 9 10 välillä, edullisesti arvojen 7 ja 8 välillä.

Hirudiinin pitoisuus liuoksessa ennen kylmäkuivausta voi olla välillä 0,1-500 mg/ml, edullisesti välillä 20-80 mg/ml.

15

Kylmäkuivattu tuote on pysyvä pitkiä ajanjaksoja ilman jäähdytetyn säilytyksen tarvetta. Lisäksi, tuotteen veteen liuottamisen jälkeen, tuloksena oleva liuos on myös pysyvä pitkiä ajanjaksoja, esimerkiksi 2:sta 3:een viikkoa, vaik-20 kakin pysyvyys liuoksessa ei ole yhtä hyvä kuin kylmäkuivatun pulverin pysyvyys.

Kylmäkuivattu tuote uudelleen liuottamalla tehtyjä liuoksia voidaan käyttää vakioampullien, esitäytettyjen ruiskujen, 25 tai moniannostelujärjestelmien tuotannossa. Liuoksia voi-daan tietenkin käyttää myös välittömästi annettaviksi.

Keksintöä valaistaan seuraavin esimerkein, joissa annetut !,* prosenttiosuudet ovat painoon perustuvia.

* · 30

Esimerkki 1 • « : * » .· · Yhdistelmädesulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Ciba Geigyltä) vesiliuoksia valmistetaan liuottamalla sitä veteen tai alla ··, 35 taulukossa 1 annettujen suolojen 150 mmolaarisiin liuok siin. pH vaihteli välillä 4,12-4.31. Kaikissa tapauksissa V hirudiinin pitoisuus on 30 mg/ml.

t f 10 114141

Liuokset kylmäkuivataan ja säilytetään 46 °C:ssa. Eri aikoina näytteitä liuotetaan veteen siten, että hirudiinin pitoisuus on 1 mg/ml, ja pääpiikki mitataan RP-HPLC:llä.

Saadut tulokset esitetään alla taulukossa 1.

5

Taulukkko 1 pääpiikin pinta-ala (%) ajan kuluttua 10 Systeemi 11 18 26 34 48 päivää päivää päivää päivää päivää vesi 84,3 83,5 81,9 81,2 75,4 1,43% MgCl2 95,0 96,3 95,6 94,9 91,5 15 1,67% CaCl2 95,5 96,2 96,4 95,8 93,5 1,8% MgS04 94,2 94,2 93,2 92,9 91,2 20 Voidaan nähdä, että pysyvyys säilyy korkealla tasolla jopa säilytettäessä pitkiä ajanjaksoja 46 °C:ssa.

Esimerkki 2 25 Yhdistelmädesulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Ciba-Geigyltä) ' vesiliuoksia valmistetaan liuottamalla sitä erilaisiin suo- I ; i laliuoksiin seuraavasti.

> i »

MgCl2 - 120 mMol (1,14%) 30 CaCl2 - 120 mMol (1,33%)

MgS04 - 28 7 mMol (3,46%) i I · » · ‘ ‘ Kaikissa tapauksissa osmolaarisuus on noin 300 ja pH sääde- tään noin 7:ksi lisäämällä NaOH:ta.

* 35 • * 11 114141

Liuokset kylmäkuivataan ja tuloksena olevat pulverit säilytetään 79 °C:ssa. Tietyn säilytysajan jälkeen näyte liuotetaan uudelleen veteen siten, että hirudiinin pitoisuus on 1 mg/ml, ja pääpiikki mitataan RP-HPLC:llä. Saadut tulokset 5 esitetään alla Taulukossa 2.

Taulukko 2 pääpiikin pinta-ala (%) ajan kuluttua 10 ----

Systeemi 1 4 11 22 päivä päivää päivää päivää vesi 78,0 59,2 50,9 43,6 15 MgCl2 95,7 95,0 85,9 83,9

CaCl2 96,0 97,0 89,3 90,1

MgS04 95,9 92,2 80,5 83,9 20 ; Voidaan nähdä, että tuotteet ovat pysyviä jopa säilytettyinä 79 °C:ssa.

* · « 25 Esimerkki 3

• I

= * i: Yhdistelmädesulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Ciba-Geigyltä) I t V · vesiliuoksia valmistetaan liuottamalla sitä veteen ja seok siin, jotka on muodostettu isotonisesta CaCl2-liuoksesta ‘ 30 (120 mM) ja isotonisesta mannitoliliuoksesta (5%). Kaikissa t · *;*; tapauksissa hirudiinin pitoisuus on 30 mg/ml.

» > ' I \ *

Liuokset kylmäkuivataan ja tuloksena olevat pulverit säily- t * ' tetään 79 °C:ssa. Tietyn säilytysajan jälkeen näyte liuote- 35 taan uudelleen veteen siten, että hirudiinin pitoisuus on 1

i I

. I I % * 12 114141 mg/ml, ja pääpiikin pinta-ala mitataan RP-HPLC:llä. Saadut tulokset esitetään alla Taulukossa 3.

Taulukko 3

Systeemi pääpiikin pinta-ala (%) ajan j älkeen 5 Mannitoli CaCl2 1 päivä 20 päivää vesi - 76,3 42,2 1,3%(120mM) 96,1 90,7 1%(55mM) 1,04%(96mM) 94,5 86,9 2%( HOmM) 0,78%( 72mM) 94,1 84,2 10 3%(164mM) 0,52%(48mM) 94,3 87,2 4%(219mM) 0,26%(24mM) 93,8 86,3

Esimerkki 4 15

Yhdistelmädesulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Ciba-Geigyltä) vesiliuoksia tehdään liuottamalla sitä veteen ja seoksiin, jotka on muodostettu MgCl2-liuoksesta (150 mM) ja isotonisesta mannitoliliuoksesta (5%). Kaikissa tapauksissa hiru- ? * * “ 20 diinin pitoisuus on 30 mg/ml ja pH on noin 7,3-7,4.

* · • > · * ( * ! Liuokset kylmäkuivataan ja tuloksena olevat pulverit säily- tetään 76 °C:ssa. Tietyn säilytysajan jälkeen näyte liuote-I taan uudelleen veteen siten, että hirudiinin pitoisuus on 1 > *'; 25 mg/ml, ja pääpiikin pinta-ala mitataan RP-HPLC:llä. Saadut f tulokset esitetään alla Taulukossa 4.

i > I I » t l · ; I ( S * · t · ***** * f » * * * »

* I

t ► 13 114141

Taulukko 4

Systeemi pääpiikin pinta-ala (%) ajan jälkeen

Mannitoli MgCl2 2 päivää 6 päivää vesi ~ 76,3 42,2 , 5 - 1,3%(120mM) 96,1 90,7 2,5%(91,67mM) 0,71%(75mM) 92,6 93,0 3%( HOmM) 0,57%( 60mM) 94,0 92,1 3,5%(164mM) 0,43%(45mM) 93,9 92,5 4%(219mM) 0,29%(30mM) 92,2 90,7 10 4,5%(246mM) 0,14%(15mM) 91,1 87,0

Esimerkki 5 15 Yhdistelmädesulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Ciba-Geigyltä) vesiliuos tehdään liuottamalla sitä liuokseen, joka sisältää 0,52% (48 mM) CaCl2 ja 3% (164 mM) mannitolia. Hirudii-nin pitoisuus on 30 mg/ml. Liuoksen pH on 4,3. Puolet tästä liuoksesta säädetään pH 7,4:ksi NaOH:lla. Molemmat liokset 20 kylmäkuivataan ja säilytetään 46 °C:ssa. Tietyn säilytys-·, : ajan jälkeen näyte liuotetaan uudelleen veteen siten, että ! hirudiinin pitoisuus on 1 mg/ml, ja pääpiikin pinta-ala , mitataan RP-HPLC:llä. Saadut tulokset esitetään alla Taulu- ’· kossa 5. Ne osoittavat hyödyllisen vaikutuksen käyttämällä '··' 25 pH-arvoa välillä 7-8, vaikka hyvät tulokset osoitetaan myös ; ; : pH:ssa 4,3.

14 114141

Taulukko 5 pääpiikin pinta-ala (%) ajan jälkeen

Systeemi . ......... _ _ ....... „ .......

tuore 38 paivaa 67 päivää 105 palvaa 143 paivaa 5 46°C pH 4,3 95,2 91,5 91,3 90,5 87,8 46°C pH 7,4 96,0 95,5 94,8 94,9 95,2

Esimerkki 6 10

Desulfatohirudiinin HV1 (CGP 39393 Cibalta) vesiliuokseen (50 mg/ml) lisätään 0,49% (51,5 mM) magnesiumkloridia, 0,57% (51,5 mM) kalsiumkloridia ja 3,5% täyteaineita man-nitoli, dekstraani 78 kD tai dekstraani 10 kD, tai ei yli-15 määräistä täyteainetta. Säädetään pH 7,4:ksi natriumhydroksidi 11a ja liuokset kylmäkuivataan. Tiettyjen aikojen jälkeen 75 °C:ssa näytteet liuotetaan uudelleen veteen siten, että hirudiinin pitoisuus on 2,5 mg/ml, ja pääpiikin pinta-ala mitataan RP-HPLC:llä. Tulokset taulukossa 6 osoittavat 20 että magnesiumkloridin ja kalsiumkloridin seosta voidaan käyttää hiilihydraatin kanssa tai ilman sitä.

15 114141

Taulukko 6 i

Systeemi pääpiikin pinta-ala (%) ajan jälkeen 5 päivää 20 päivää 5 vesi (ei Mg tai Ca) 59,2(4 päivää) 42,2

Mannitoli 74,0 51,4

Dekstraani 78 kD 88,6 82,5 10

Dekstraani 10 kD 88,8 84,2

Ei hiilihydraattia 89,0 84,1 1 » * · 16 114141 SEKVENSSILISTAUS YLEISTIEDOT: (i) HAKIJA:

I (A) NIMI: Ciba-Geigy AG

(B) KATU: Klybeckstrasse 141 (C) KAUPUNKI: Basel (E) MAA: Sveitsi (F) POSTINUMERO: 4002 (G) PUHELIN: 061 969 1111 (H) TELEFAX: 061 969 7976 (I) TELEX: 962991 (ii) KEKSINNÖN NIMI: Stabiilit kuivapulverit (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 5 (iv) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) TIETOKONEOHJELMA: Chemtext Versio 1.50 SEKV ID N:O 1

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 63-66 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ; / (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTISUUS: ei (iv) ANTI-SENSE: ei * * ·

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys

Li’: 15 10 15 • · ·

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Xaa Cys Ile Leu Gly Ser ; .·. 20 25 30 i · ·

Asp Gly Glu Xaa Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro : ’ ‘: 3 5 4 0 4 5 » » * ·.·.*. Gin Ser Xaa Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Xaa 50 55 60 17 114141 SEKV ID N:0 2

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 65 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTISUUS: ei (iv) ANTI-SENSE: ei

Leu Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30

Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45

Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 . 60

Gin '·.· 65 V SEKV ID N:O 3

V (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 65 aminohappoa .il (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ,· · (iii) HYPOTEETTISUUS: ei (iv) ANTI-SENSE: ei 114141 I 18

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys He Leu Gly Ser 20 25 30

Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu He Pro Glu Glu Xaa Leu 50 55 60

Gin 65 SEKV ID N:O 4

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 65 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTISUUS: ei (iv) ANTI-SENSE: ei , . Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15 ' Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys He Leu Gly Ser 20 25 30 * i · Γ: Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro 35 40 45 5··1 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60

Gin 65 ! 114141 19 SEKV ID N:0 5

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET

(A) PITUUS: 66 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTISUUS: ei (iv) ANTI-SENSE: ei

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30

Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45

Gin Ser Hi s Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Tie Pro Glu Asp Ala Tyr 50 55 60

Asp Glu 'hi 65 t t · 1 ·

Claims (11)

1. Kylmäkuivattu farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää hirudiinia ja kalsiumin ja/tai 5 magnesiumin vesiliukoista suolaa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että vesiliukoinen suola on kalsiumkloridi, magnesiumkloridi tai magnesiumsulfaatti. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kalsiumionien ja/tai magnesiumionien molaarinen suhde hirudiiniin on korkeintaan 40:1. 15

4. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää myös sokeria.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että sokeri on mannitoli, trehaloosi, sakkaroosi, sorbitoli, fruktoosi, glukoosi, maltoosi, laktoosi tai dekstraani. V 25

6. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hirudiini on desul-fatohirudiinin muunnos tai sen mutantti.

;·. 7. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen 30 koostumus, tunnettu siitä, että hirudiini on desul- fatohirudiini HV1. * ·

8. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se saadaan aikaan : 35 liuottamalla ainesosat veteen ja sitten kylmäkuivaa- malla liuos. I » 114141

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että liuoksen pH ennen kylmäkuivausta on välillä 4-9.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 8-9 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hirudiinin pitoisuus liuoksessa ennen kylmäkuivausta on 0,1-500 mg/ml.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 8-10 mukainen koostumus, 10 tunnettu siitä, että liuos ennen kylmäkuivausta on isotoninen. * · » t · * ♦ • * t · • · f · · » i * · > · · * I » » t il» » · > * · I 22 114141