ES3074558T3 - Cell culture method, method for producing product, and cell culture device - Google Patents

Abstract

Proporcionar: un método de cultivo celular que comprende el uso de un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular y el cultivo de las células mediante la liberación de un gas que contiene un 30% en volumen o más de oxígeno a la suspensión celular desde un difusor dispuesto en el recipiente de cultivo, donde el tamaño promedio de poro de una parte liberadora de gas del difusor es de 1 a 300 μm inclusive, y el área superficial (A m2) de la parte liberadora de gas del difusor, la cantidad (X m3) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo y el caudal (Q m3/min) del gas liberado desde el difusor satisfacen una relación específica; un método para producir un producto, dicho método comprende el método de cultivo celular; y un dispositivo de cultivo celular que permite llevar a cabo el método de cultivo celular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método de cultivo celular, método para producir el producto y dispositivo de cultivo celular

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] 1. Campo de la invención

[0005] La presente divulgación se refiere a un método de cultivo celular, un método de producción de producto y un dispositivo de cultivo celular.

[0006] 2. Descripción de la técnica relacionada

[0007] El cultivo celular se realiza con el fin de aumentar el número de células que tienen propiedades útiles, haciendo que las células produzcan un producto o similares.

[0008] Como método o dispositivo de cultivo celular convencional utilizado para el cultivo celular, se mencionan JP1993-503848A (JP-H05-503848A), WO2011/070791A y JP2016-536122A.

[0009] El documento JP1993-503848A (JP-H05-503848A) divulga un método para suministrar nutrientes gaseosos en forma de burbuja a células en un biorreactor al menos parcialmente lleno con un medio, que se caracteriza por el punto de que el tiempo de retención de la burbuja es igual al tiempo de solución de los nutrientes gaseosos en el medio.

[0010] El documento WO2011/070791A divulga un método de cultivo para cultivar células o microorganismos disolviendo oxígeno o dióxido de carbono en una solución de cultivo que contiene nutrientes, que incluye un proceso de cultivo de células o microorganismos suministrando un gas que incluye oxígeno o dióxido de carbono a un cuerpo poroso para generar burbujas que tienen un 50 % de diámetro de 200 µm o menos en una solución de cultivo, obteniéndose el 50 % de diámetro en la distribución de tamaño basada en volumen y conteniendo la solución de cultivo al menos uno de un hidrolizado de proteína o un agente citoprotector para proteger células, disolviendo de ese modo oxígeno o dióxido de carbono en la solución de cultivo que contiene nutrientes.

[0011] El documento JP2016-536122A divulga un dispositivo de aireación como un dispositivo de aireación utilizado en el momento del cultivo celular, que incluye un elemento base y una pluralidad de elementos de aireación que están instalados de manera unible y desmontable al elemento base, cada uno de los elementos de aireación incluye un material permeable al gas y una entrada que está configurada para conectarse a una fuente de gas y está en comunicación fluida con el material permeable al gas.

[0012] Sumario de la invención

[0013] El cultivo celular puede realizarse mientras se descarga un gas que incluye oxígeno en una suspensión celular que contiene células. Se especula que la descarga hace que se suministre oxígeno a la suspensión celular.

[0014] En el caso de realizar un cultivo celular, existe la demanda de aumentar la concentración de células en la suspensión celular lo más alta posible. En particular, en la producción de fármacos biomédicos, tal como en un caso en el que se produce un producto (por ejemplo, anticuerpo) mediante cultivo celular, es importante aumentar la concentración celular en la suspensión celular con el fin de mejorar la productividad del producto.

[0015] Por esta razón, es necesario disolver una gran cantidad de oxígeno en la suspensión celular y suministrar una cantidad suficiente de oxígeno a las células que tienen una alta concentración celular.

[0016] Como método para descargar oxígeno a una suspensión celular, se conoce un método en el que se instala un burbujeador en el recipiente de cultivo.

[0017] Con el fin de descargar una cantidad suficiente de oxígeno a las células, se utilizó una técnica de solución de una gran cantidad de oxígeno en una suspensión celular como técnica general. En este método, se minimiza un diámetro de orificio promedio en una parte de descarga de gas en un burbujeador para mejorar la solubilidad del oxígeno y se aumenta el caudal del gas que incluye oxígeno (consultar, por ejemplo, JGC Technical Journal, Vol.

[0018] 01, n.º.01 (2011), Application of microbubbles to culture).

[0019] Sin embargo, los inventores de la presente invención observaron que en un caso en el que el volumen de suspensión celular es grande (por ejemplo, el volumen de suspensión celular es de 0,5 m<3>o más) como en el caso tal como una escala de producción en masa, es difícil cultivar células a una concentración celular alta con el método tal como el método descrito anteriormente, ya que no se puede disolver una cantidad suficiente de oxígeno para el cultivo celular en la suspensión celular y el daño a las células es grande.

[0020] Esto se debe presumiblemente a que el oxígeno es difícil de disolver en la suspensión celular mediante el método anterior, el coeficiente de capacidad de transferencia de oxígeno kLa (a continuación en el presente documento, puede denominarse "kLa") no es tan alto, el daño a las células debido a las burbujas descargadas aumenta a medida que disminuye el diámetro promedio del orificio de la parte de descarga de gas en el burbujeador, y el daño a las células aumenta debido a la descarga de un gas que incluye una gran cantidad de oxígeno.

[0021] Específicamente, se especula de la siguiente manera; cuando un gas que incluye oxígeno se descarga desde el burbujeador, las células se dañan por la energía transferida cuando las burbujas chocan con las células o las burbujas se rompen a sí mismas, pero la energía aumenta a medida que disminuye el diámetro del orificio del burbujeador, es decir, a medida que las burbujas que tienen diámetros pequeños están presentes, y a medida que aumenta el caudal del gas que incluye oxígeno, por lo que aumenta el daño a las células.

[0022] En este caso, el kLa descrito anteriormente es un coeficiente proporcional de una ecuación de velocidad que representa una velocidad de solución de gas oxígeno en la suspensión celular. Cuanto más alta es el kLa, más rápidamente se disuelve el oxígeno en la suspensión celular, por lo que puede suministrarse más oxígeno a la suspensión celular y, por tanto, pueden cultivarse células a una concentración celular elevada. Se especula que kLa aumenta a medida que disminuye el diámetro de la burbuja.

[0023] Es decir, el aumento de kLa y la supresión del daño a las células tienen una relación de compensación en la técnica relacionada, y estos difícilmente se lograron de forma compatible.

[0024] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de cultivo celular en el que es posible el cultivo celular a una alta concentración celular incluso en un caso en el que un volumen de suspensión celular es grande, y se suprime el daño a las células, un método de producción de producto que incluye el método de cultivo celular, y un dispositivo de cultivo celular que permite el método de cultivo celular.

[0025] Los medios para resolver los problemas anteriores incluyen los siguientes aspectos.

[0026] <1> Un método de cultivo celular que comprende: usar un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células; y descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular desde un burbujeador dispuesto en el recipiente de cultivo para cultivar las células,

[0027] en el que un diámetro medio de orificio en una porción de descarga de gas en el burbujeador es de 1 µm o más y 300 µm o menos,

[0028] las células que se van a cultivar son células animales, y

[0029] un área de superficie A (m<2>) de la porción de descarga de gas en el burbujeador, un volumen X (m<3>) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo y un caudal Q (m<3>/min) del gas que se descarga del burbujeador satisfacen la expresión 1-1, la expresión 1-2 y la expresión 1-3.

[0032]

[0034] <2> El método de cultivo celular según <1>, en el que en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo se envía desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv (µm) de burbujas del gas de aire satisface la expresión 2-1.

[0036]

[0038] <3> El método de cultivo celular según <1> o <2>, en el que en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo se envía desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, en la distribución de diámetro de burbuja, una proporción de un volumen acumulado de burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de 20 µm o más y 500 µm o menos es del 30 % en volumen o más de un volumen total de las burbujas en la distribución de diámetro de burbuja.

[0039] <4> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <3>, en el que un coeficiente de capacidad de transferencia de oxígeno kLa (hr<-1>) por el burbujeador en el cultivo es 15 o más.

[0040] <5> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <4>, en el que en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, se envía un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, el Q (m<3>/min), el A (m<2>), una densidad ρl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad ρg (kg/m<3>) del gas de aire, una viscosidad µl (kg/m/s) de la solución de medición, y una aceleración gravitacional g (m/s<2>) satisfacen la expresión 3-1.

[0042]

[0044] <6> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <5>, en el que en el cultivo, Q (m<3>/min) y A (m<2>) satisfacen la expresión 4-1.

[0046]

[0048] <7> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <6>, en el que en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo se envía desde el burbujeador a la medición solución, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas, un nivel de líquido ZL (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en el cultivo, una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv (µm) de burbujas en la distribución de diámetro de burbuja, una densidad ρl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad ρg (kg/m<3>) del gas de aire, una aceleración gravitacional g (m/s<2>) y una viscosidad µl (kg/m/s) de la solución de medición satisfacen la expresión 5-1.

[0050]

[0052] <8> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <7>, en el que X (m<3>), un nivel de líquido ZL (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular, y una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador satisfacen la expresión 6-1 y la expresión 6-2.

[0055]

[0057] <9> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <8>, en el que una concentración celular en la suspensión celular es de 4 × 10<7>células/ml o más.

[0058] <10> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <9>, en el que un método para cultivar células es el cultivo de perfusión.

[0059] <11> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <10>, en el que el recipiente de cultivo es un tanque de cultivo de un solo uso.

[0060] <12> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <11>, en el que el burbujeador es un burbujeador de metal sinterizado.

[0061] <13> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <12>, en el que una forma de la parte de descarga de gas del burbujeador es una forma de plano circular, una forma de plano poligonal o una forma de cilindro. <14> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <13>, en el que se incluye una pluralidad de los burbujeadores como burbujeador.

[0062] <15> El método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <13>, en el que el burbujeador está configurado para incluir una pluralidad de unidades, incluyendo cada una uno o más burbujeadores, y el caudal del gas se ajusta para cada una de las unidades.

[0063] <16> Un método de producción de producto que comprende: cultivar células con el método de cultivo celular según uno cualquiera de <1> a <15>, y obtener un producto producido por las células cultivadas.

[0064] <17> El método de producción del producto según <16>, en el que el producto es un anticuerpo.

[0065] <18> Un dispositivo de cultivo celular que comprende: un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células, en el que se cultivan las células, y

[0066] un burbujeador para descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular en el recipiente de cultivo,

[0067] en el que un diámetro medio de orificio en una porción de descarga de gas en el burbujeador es de 1 µm o más y 300 µm o menos, y

[0068] un área A (m<2>) del burbujeador y un volumen Xmax (m<3>) de la suspensión celular con el que se puede llenar al máximo el recipiente de cultivo satisfacen la expresión 7-1 y la expresión 7-2.

[0071]

[0073] <19> El dispositivo de cultivo celular según <18>, en el que un nivel de líquido ZLmax (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en un caso en el que el recipiente de cultivo está lleno al máximo con la suspensión celular, y una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador satisfacen la expresión 8-1.

[0075]

[0077] <20> El dispositivo de cultivo celular según <18> o <19>, en el que el Xmax (m<3>), un nivel de líquido ZLmax (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en un caso en el que el recipiente de cultivo está lleno al máximo con la suspensión celular, y una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador satisfacen la expresión 9-1 y la expresión 9-2.

[0080]

[0082] <21> El dispositivo de cultivo celular según un cualquiera de <18> a <20>, en el que el recipiente de cultivo es un tanque de cultivo de un solo uso.

[0083] <22> El dispositivo de cultivo celular según uno cualquiera de <18> a <21>, en el que el burbujeador es un burbujeador de metal sinterizado.

[0084] <23> El dispositivo de cultivo celular según uno cualquiera de <18> a <22>, en el que una forma de la parte de descarga de gas del burbujeador es una forma de plano circular, una forma de plano poligonal o una forma de cilindro.

[0085] <24> El dispositivo de cultivo celular según uno cualquiera de <18> a <23>, en el que se incluye una pluralidad de los burbujeadores como el burbujeador.

[0086] <25> El dispositivo de cultivo celular según uno cualquiera de <18> a <23>, en el que el burbujeador está configurado para incluir una pluralidad de unidades, incluyendo cada una uno o más burbujeadores, y un caudal del gas es ajustable para cada una de las unidades.

[0087] <26> El dispositivo de cultivo celular según uno cualquiera de <18> a <25>, en el que el dispositivo de cultivo celular es un dispositivo de cultivo celular de perfusión.

[0088] Según la realización de la presente invención, se proporciona un método de cultivo celular en el que es posible el cultivo celular a una alta concentración celular incluso en un caso en el que una suspensión celular tiene un gran volumen, y se suprime el daño a las células, un método de producción de producto que incluye el método de cultivo celular, y un dispositivo de cultivo celular que permite el método de cultivo celular.

[0089] Breve descripción de las figuras

[0090] Las figuras 1A-C son diagramas esquemáticos de ejemplos de formación de burbujeadores de metal sinterizado que son ejemplos de burbujeadores usados en la presente divulgación.

[0091] La figura 2 es un diagrama esquemático en perspectiva en sección transversal que ilustra un ejemplo de un aspecto en el que un recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores.

[0092] La figura 3 es un diagrama de configuración esquemático que ilustra un ejemplo de una configuración de un dispositivo de cultivo celular aplicable a la implementación del método de producción de producto según la presente divulgación.

[0093] Descripción de las realizaciones preferidas

[0094] A continuación en el presente documento, se describirán un método de cultivo celular, un método de producción de producto y un dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación. Sin embargo, las realizaciones según la presente divulgación no se limitan a las siguientes realizaciones y pueden implementarse con modificaciones apropiadas.

[0095] En la presente divulgación, el intervalo numérico representado mediante el uso de "a" significa un intervalo que incluye los valores numéricos antes y después de "a" como el valor mínimo y el valor máximo, respectivamente. En los intervalos numéricos descritos etapa a etapa en la presente divulgación, el valor límite superior o el valor límite inferior descrito en un intervalo numérico puede reemplazarse con el valor límite superior o el valor límite inferior del intervalo numérico descrito etapa a etapa en otras etapas. Además, en los intervalos numéricos descritos en la presente divulgación, el valor límite superior o el valor límite inferior de un intervalo numérico puede reemplazarse con el valor mostrado en los ejemplos.

[0096] En la presente divulgación, una combinación de dos o más aspectos preferidos es un aspecto más preferido. En la presente divulgación, en un caso en el que hay una pluralidad de sustancias correspondientes a cada componente, a menos que se especifique particularmente lo contrario, la cantidad de cada componente significa la cantidad total de la pluralidad de sustancias.

[0097] En la presente divulgación, el número de referencia idéntico se da a los mismos elementos constituyentes, y se puede omitir la descripción de los mismos.

[0098] En la presente divulgación, los dibujos ilustran un ejemplo de aspectos preferidos, y la invención según la presente divulgación no se ve limitada por el contenido de los dibujos.

[0099] En la presente divulgación, el término "proceso" incluye no solo un proceso independiente sino también un proceso que no se puede distinguir claramente de otros procesos, siempre que se logre el propósito previsto del proceso.

[0100] Método de cultivo celular

[0101] El método de cultivo celular según la presente divulgación incluye usar un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células y descargar un gas que incluye el 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular desde un burbujeador dispuesto en el recipiente de cultivo para cultivar las células (en lo sucesivo, también denominado "proceso de cultivo celular")), en el que un diámetro de orificio promedio en una porción de descarga de gas en el burbujeador es de 1 µm o más y de 300 µm o menos, y un área superficial A (m<2>) en la porción de descarga de gas en el burbujeador, un volumen X (m<3>) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo y un caudal Q (m<3>/min) del gas que se descarga del burbujeador satisfacen la expresión 1-1, la expresión 1-2 y la expresión 1-3.

[0104]

[0106] El método de cultivo celular según la presente divulgación incluye usar un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células; y descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular desde un burbujeador dispuesto en el recipiente de cultivo para cultivar las células.

[0107] Se especula que en un caso de descarga del gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno, el oxígeno se descarga en la suspensión celular, lo que permite el cultivo celular a una alta concentración celular.

[0108] Además, el diámetro promedio del orificio de la porción de descarga de gas utilizada en el método de cultivo celular según la presente divulgación es de 1 µm o más y 300 µm o menos. Se especula que en un caso en el que el diámetro promedio del orificio es de 1 µm o más, el diámetro de burbuja de las burbujas del gas, incluido el oxígeno, no es demasiado pequeño, pero se suprime el daño a las células. Además, se especula que en un caso en el que el diámetro promedio del orificio es de 300 µm o menos, el diámetro de la burbuja no es demasiado grande, pero el kLa aumenta fácilmente y, por lo tanto, el cultivo celular puede realizarse a una concentración celular alta. Además, en el método de cultivo celular según la presente divulgación, A (m<2>) y X (m<3>) satisfacen la expresión 1-1 y la expresión 1-2.

[0109] Aquí, en el caso en el que se cambia la capacidad del recipiente de cultivo convencional, por ejemplo, en el caso en el que la longitud de cada lado del recipiente de cultivo se aumenta en 10 veces, el volumen de suspensión celular se aumenta en 10 × 10 × 10 = 1000 veces. En ese caso, es común hacer que la longitud de cada lado del burbujeador sea 10 veces, obteniendo así el área del burbujeador, aumentada en 10 × 10 = 100 veces (ley de escala).

[0110] Por otra parte, en el método de cultivo celular en la presente descripción, el A/X tiene un valor dentro de un intervalo específico. Esto significa que, por ejemplo, en el caso en el que el volumen de suspensión celular X aumenta 1000 veces, el área superficial A de la parte de descarga de gas en el burbujeador también aumenta 1000 veces. Además, en un caso en el que la Q/X es 0,001 o más, se especula que el oxígeno necesario para el cultivo celular se suministra suficientemente a la suspensión celular y la concentración celular aumenta fácilmente.

[0111] Además, en un caso en el que el Q/X es 0,1 o menos, se especula que el daño a las células se suprime fácilmente. Es decir, el método de cultivo celular según la presente divulgación se basa en los nuevos hallazgos de que en un caso en el que un volumen de líquido X de la suspensión celular en el recipiente de cultivo, un área de superficie A de la parte de descarga de gas en el burbujeador, un caudal Q del gas y un diámetro de orificio promedio de la parte de descarga de gas en el burbujeador se ajustan dependiendo del volumen de suspensión celular, el cultivo celular puede realizarse a una concentración celular alta mientras se suprime el daño a las células incluso en un caso en el que el X es un gran volumen de 0,5 m<3>o más.

[0112] Todos los documentos JP1993-503848A (JP-S05-503848A), WO2011/070791A y JP2016-536122A no describen ni sugieren la idea técnica del método de cultivo celular según la presente divulgación, en el que el A/X se establece dentro de un intervalo específico y un diámetro de orificio promedio de la parte de descarga de gas en el burbujeador se establece dentro de un intervalo específico. Además, todos ellos no describen ni sugieren los efectos del método de cultivo celular según la presente divulgación, con el que el cultivo celular puede realizarse a una alta concentración celular mientras se suprime el daño a las células estableciendo el A/X y el diámetro de orificio promedio en un valor específico.

[0113] A continuación en el presente documento se describirá cada requisito en el método de cultivo celular según la presente divulgación.

[0114] Proceso de cultivo celular

[0115] El método de cultivo celular según la presente divulgación incluye un proceso de cultivo celular.

[0116] En el proceso de cultivo celular, se utiliza un recipiente de cultivo celular que contiene una suspensión celular que contiene células e incluye un burbujeador para descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno.

[0117] Recipiente de cultivo

[0118] Como recipiente de cultivo, se puede utilizar un dispositivo de cultivo general (también denominado biorreactor), un recipiente conocido utilizado en el dispositivo de cultivo general u otro recipiente adecuado sin limitación particular. Como dispositivo de cultivo, se puede usar un dispositivo de cultivo en tanque de tipo fermentador, un dispositivo de cultivo de tipo elevador de aire, un dispositivo de cultivo de tipo matraz de cultivo, un dispositivo de cultivo de tipo matraz giratorio, un dispositivo de cultivo de tipo microportador, un dispositivo de cultivo de tipo lecho fluidizado, un dispositivo de cultivo de tipo fibra hueca, un dispositivo de cultivo de tipo botella de rodillo, un dispositivo de cultivo de tipo tanque lleno o similares.

[0119] Además, el recipiente de cultivo es preferiblemente un tanque de cultivo de un solo uso desde el punto de vista de homogeneizar el entorno de cultivo o similares.

[0120] Burbujeador

[0121] El recipiente de cultivo incluye un burbujeador para descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno.

[0122] El gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno no está particularmente limitado, pero es preferible un gas que incluye 50 % en volumen o más de oxígeno, es más preferible un gas que incluye 70 % en volumen o más de oxígeno, y es aún más preferible un gas que incluye 90 % en volumen o más de oxígeno, y es particularmente preferible gas oxígeno puro.

[0123] El recipiente de cultivo en la presente divulgación puede incluir además un burbujeador que descarga un gas que incluye otro gas (por ejemplo, aire y gas CO<2>) además del burbujeador que descarga el gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno.

[0124] En la presente divulgación, en el caso de que simplemente se describa como "burbujeador", esto significa un "burbujeador en el que el diámetro promedio del orificio de la porción de descarga de gas es de 1 µm o más y 300 µm o menos y que descarga un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno, a menos que se especifique particularmente lo contrario.

[0125] Es decir, en el cálculo del área de superficie A de la parte de descarga de gas en el burbujeador, no se incluyen el caudal Q (m3/min) del gas descargado desde el burbujeador, y similares, un burbujeador que tiene un diámetro de orificio promedio que está fuera del intervalo anterior y un burbujeador que descarga un gas que incluye el otro gas descrito anteriormente.

[0126] Como burbujeador, se puede usar cualquier burbujeador conocido sin limitación particular siempre que satisfaga el diámetro promedio del orificio descrito anteriormente y el A/X descrito anteriormente. Los ejemplos del burbujeador incluyen un burbujeador de boquilla que tiene una forma de boquilla y que descarga burbujas desde una abertura, un burbujeador de anillo que tiene una forma de anillo cilíndrico con orificios y que descarga burbujas desde los orificios, un burbujeador que usa una lámina permeable al gas o un material polimérico no tejido, y un burbujeador de metal sinterizado que tiene un filtro de metal sinterizado en la parte de descarga de burbujas. Entre ellos, es preferible un burbujeador de metal sinterizado desde el punto de vista de satisfacer fácilmente el requisito descrito anteriormente del diámetro promedio del orificio.

[0127] Como filtro de metal sinterizado en el burbujeador de metal sinterizado, por ejemplo, se usa un filtro obtenido sinterizando polvo fino de cobre, níquel, titanio, tantalio, aluminio, platino, carburo de tungsteno, carburo de titanio o acero inoxidable, o una aleación que incluya estos.

[0128] En las figuras 1A-C, se ilustran diagramas esquemáticos de ejemplos de formación de burbujeadores de metal sinterizado que son ejemplos de burbujeadores usados en la presente divulgación.

[0129] En la figura 1A, un burbujeador de metal sinterizado 10 incluye un filtro de metal sinterizado en forma de cilindro 12, una parte de soporte 14 y una parte de suministro de gas 16. El filtro de metal sinterizado 12 está en contacto con una suspensión celular en el recipiente de cultivo, y el gas suministrado desde la parte de suministro de gas 16 se descarga en la suspensión celular a través del filtro de metal sinterizado 12.

[0130] En la figura 1B, el burbujeador de metal sinterizado 10 tiene la misma configuración que la del burbujeador de metal sinterizado 10 en la figura 1A, excepto que el filtro de metal sinterizado 12 tiene una forma plana circular. En la figura 1C, el burbujeador de metal sinterizado 10 tiene la misma configuración que la del burbujeador de metal sinterizado 10 en la figura 1A, excepto que el filtro de metal sinterizado 12 tiene una forma plana poligonal (cuadrada).

[0131] Aquí, en las figuras 1A-C, el área superficial A de la porción de descarga de gas en el burbujeador en la presente descripción se refiere al área superficial (m<2>) de la porción del filtro de metal sinterizado 12 en el burbujeador de metal sinterizado 10, desde el cual se descarga el gas. Específicamente, el área superficial A se refiere al área superficial del filtro de metal sinterizado en forma de cilindro 12 en la figura 1A, el área del círculo que tiene la forma de plano circular en la figura 1B, o el área del polígono que tiene la forma de plano poligonal en la figura 1C. En un burbujeador de boquilla o un burbujeador de anillo que no tiene el filtro de metal sinterizado 12, el área de superficie A de la porción de descarga de gas en el burbujeador se refiere al área de la abertura del burbujeador. La parte de descarga de gas en la presente divulgación se refiere al filtro de metal sinterizado 12 en el burbujeador de metal sinterizado 10 o la abertura en el burbujeador de boquilla o el burbujeador de anillo.

[0132] La forma de la porción de descarga de gas en el burbujeador en la presente descripción es preferiblemente una forma plana circular, una forma plana poligonal o una forma cilíndrica.

[0133] Entre estos, es preferible una forma plana circular ya que las burbujas pueden expulsarse uniformemente y se suprime la coalescencia de las burbujas.

[0134] Además, uno de los aspectos preferidos en la presente divulgación es un aspecto en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores.

[0135] En un caso en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores, las formas de las porciones de descarga de gas de cada burbujeador pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, con respecto a la forma de la porción de descarga de gas, puede usarse en combinación un burbujeador que tiene una forma plana circular y un burbujeador que tiene una forma plana poligonal. En un caso en el que los burbujeadores que tienen una parte de descarga de gas de forma diferente entre sí se usan en combinación, es preferible usar una combinación de al menos dos de una forma de plano circular, una forma de plano poligonal y una forma de cilindro.

[0136] El número de burbujeadores en el aspecto anterior no está particularmente limitado, pero es preferiblemente de 2 a 100, más preferiblemente de 2 a 50, y aún más preferiblemente de 2 a 20.

[0137] Además, otro de los aspectos preferidos en la presente divulgación es un aspecto en el que el burbujeador está configurado para incluir una pluralidad de unidades, cada una de las cuales incluye uno o más burbujeadores, y el caudal del gas es ajustable para cada una de las unidades.

[0138] En este aspecto, el número de burbujeadores incluidos en cada una de las unidades no está particularmente limitado, pero es preferiblemente de 1 a 50, más preferiblemente de 1 a 20, y aún más preferiblemente de 2 a 10. Además, en este aspecto, el número de unidades no está particularmente limitado, pero es preferiblemente de 2 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, y aún más preferiblemente de 2 a 5.

[0139] La figura 2 es una vista en perspectiva en sección transversal esquemática que ilustra un ejemplo de un aspecto en el que un recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores.

[0140] La figura 2 es una vista en sección transversal tomada a lo largo de un plano que incluye la dirección vertical del recipiente de cultivo.

[0141] En la figura 2, un recipiente de cultivo 100 contiene una suspensión celular 102. Además, tres unidades de burbujeadores 110, comprendiendo cada una cuatro burbujeadores 10, están formadas sobre una superficie interna inferior 104 del recipiente de cultivo 100. El burbujeador 10 es el burbujeador ilustrado en la figura 1A, en el que la parte de suministro de gas tiene forma de cilindro. Una parte de suministro de gas 112 está acoplada a cada unidad de burbujeador 110, y el gas suministrado desde cada parte de suministro de gas 112 se descarga desde cada unidad de burbujeador 110. Mediante el ajuste de la cantidad de gas suministrado a cada una de la pluralidad de partes de suministro de gas 112, el caudal del gas se puede ajustar para cada unidad.

[0142] En un caso en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores, el área superficial A se refiere al valor total de las áreas superficiales de todos los burbujeadores.

[0143] Además, en la presente divulgación, el diámetro de orificio promedio de la parte de descarga de gas en el burbujeador se refiere al diámetro de orificio promedio del filtro de metal sinterizado 12 en el burbujeador de metal sinterizado 10.

[0144] El diámetro de orificio promedio del filtro de metal sinterizado 12 puede determinarse a partir del diámetro de partícula separado del 95 %. Es decir, el diámetro de orificio promedio del filtro de metal sinterizado 12 puede calcularse realizando una prueba de filtración usando partículas estándar y calculando un diámetro de partícula con una tasa de rechazo del 95 % (es decir, un diámetro de partícula separado del 95 % en una prueba de permeación de partículas).

[0145] En un burbujeador de boquilla o un burbujeador de anillo que no tiene el filtro de metal sinterizado 12, el área de superficie A de la parte de descarga de gas en el burbujeador se refiere a la suma de las áreas de las aberturas de la boquilla. En este caso, el diámetro medio de orificio se refiere al valor medio de los diámetros de orificio de las aberturas de la boquilla.

[0146] El diámetro del orificio de la abertura puede obtenerse tomando una imagen de la abertura con un aumento apropiado y analizando la imagen. En el caso en el que la forma de la abertura no es un círculo, el diámetro del orificio se calcula como un diámetro de círculo equivalente. En la presente divulgación, el diámetro de círculo equivalente es un diámetro de un círculo que tiene un área igual al área de un plano tal como una abertura. En un caso en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores, el diámetro de orificio promedio de la parte de descarga de gas en al menos un burbujeador puede ser de 1 µm o más y 300 µm o menos. Sin embargo, el valor total del área de superficie de la porción de descarga de gas en el burbujeador que satisface el requisito descrito anteriormente del diámetro promedio del orificio es preferiblemente del 60 % en área o más, más preferiblemente del 80 % en área o más, y aún más preferiblemente del 90 % en área o más, con respecto al valor total del área de superficie de las porciones de descarga de gas de todos los burbujeadores que descargan un gas que incluye el 30 % en volumen o más de oxígeno contenido en el recipiente de cultivo.

[0147] Además, en un caso en el que el recipiente de cultivo incluye dos o más burbujeadores que tienen filtros de metal sinterizado que tienen diferentes diámetros de orificio promedio, el diámetro de orificio promedio de cada filtro de metal sinterizado se pondera por la relación de área de superficie en cada burbujeador de modo que se calcula el diámetro de orificio promedio de las partes de descarga de gas en los burbujeadores en todo el recipiente de cultivo. Específicamente, en un caso donde se incluyen un burbujeador que incluye una porción de descarga de gas que tiene un diámetro de orificio promedio de 10 µm y un área de superficie de 0,01 m<2>y un burbujeador que incluye una porción de descarga de gas que tiene un diámetro de orificio promedio de 100 µm y un área de superficie de 0,02 m<2>, el área de superficie A es 0,03 m<2>, y el diámetro de orificio promedio de las porciones de descarga de gas de los burbujeadores en todo el recipiente de cultivo se calcula como (10 µm × 0,01 m<2>+ 100 µm × 0,02 m<2>)/(0,01 m<2>+ 0,02 m<2>) = 70 µm.

[0148] Diámetro medio del orificio de la parte de descarga de gas

[0149] El diámetro promedio del orificio de la porción de descarga de gas en el burbujeador es preferiblemente de 1 µm o más, más preferiblemente de 2 µm o más, y aún más preferiblemente de 10 µm o más, desde el punto de vista de suprimir el daño celular.

[0150] Además, el diámetro de orificio promedio es preferiblemente de 300 µm o menos, más preferiblemente de 200 µm o menos, y aún más preferiblemente de 100 µm o menos, desde el punto de vista del aumento de kLa para aumentar la concentración de células cultivadas.

[0151] En un caso en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores, el diámetro de orificio promedio de la parte de descarga de gas de los burbujeadores en todo el recipiente de cultivo, que se pondera por el área de superficie, está preferiblemente dentro del intervalo anterior. Es más preferible que el diámetro de orificio promedio de cada uno de la pluralidad de burbujeadores esté dentro del intervalo anterior.

[0152] Además, la relación de apertura del burbujeador es preferiblemente del 5 % o más, más preferiblemente del 10 % o más, y aún más preferiblemente del 15 % o más, desde el punto de vista de suprimir la coalescencia de las burbujas en la porción de descarga de gas del burbujeador, suprimir un aumento en el diámetro de las burbujas y aumentar fácilmente el kLa. Además, la relación de apertura del burbujeador es preferiblemente del 80 % o menos, más preferiblemente del 60 % o menos, y aún más preferiblemente del 50 % o menos, desde el punto de vista de suprimir la eyección desigual de burbujas desde el burbujeador, aumentar el kLa y suprimir fácilmente el daño a las células. La relación de apertura del burbujeador se puede calcular de la siguiente manera, midiendo la densidad del material utilizado para el burbujeador y la densidad del propio burbujeador.

[0153] Relación de apertura del burbujeador (%) = (densidad del material utilizado para el burbujeador - densidad del propio burbujeador) / densidad del material utilizado para el burbujeador x 100

[0154] Área de superficie A de la porción de descarga de gas y volumen X de la suspensión celular

[0155] El área de superficie A (m<2>) de la porción de descarga de gas en el burbujeador y el volumen Xm (m<3>) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo satisfacen la expresión 1-1 y la expresión 1-2.

[0158]

[0160] Aquí, el A/X puede ser de 0,004 o más, es preferiblemente de 0,006 o más, más preferiblemente de 0,008 o más, y aún más preferiblemente de 0,010 o más, desde el punto de vista de suprimir la coalescencia de las burbujas en la porción de descarga de gas del burbujeador, suprimir un aumento en el diámetro de las burbujas y aumentar fácilmente el kLa.

[0161] Además, el A/X puede ser de 0,1 o menos, es preferiblemente de 0,05 o menos, más preferiblemente de 0,03 o menos, y aún más preferiblemente de 0,025 o menos, desde el punto de vista de suprimir la eyección no uniforme de burbujas, aumentar el kLa, y suprimir fácilmente el daño a las células.

[0162] Además, la X puede establecerse dependiendo del tipo de célula a cultivar y el propósito del cultivo; sin embargo, la X puede ser 0,5 m<3>o más, preferiblemente 1,0 m<3>o más, y más preferiblemente 1,1 m<3>o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la cantidad del producto obtenido en un caso en el que el método de cultivo celular según la presente divulgación se usa para el método de producción de producto o desde el punto de vista de obtener fácilmente un gran número de células.

[0163] El límite superior de la X no está particularmente limitado, pero por ejemplo, puede ser de 10 m<3>o menos.

[0164] Caudal de gas y volumen de suspensión celular

[0165] En el cultivo, el caudal Q (m<3>/min) del gas descargado desde el burbujeador y el volumen X (m<3>) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo satisfacen la expresión 1-3.

[0167]

[0169] En un caso en el que el recipiente de cultivo incluye una pluralidad de burbujeadores, el caudal Q del gas se refiere al valor total de los caudales del gas en todos los burbujeadores.

[0170] El Q/X puede ser de 0,001 o más, es preferiblemente de 0,003 o más, más preferiblemente de 0,005 o más, y aún más preferiblemente de 0,01 o más, desde el punto de vista de que el oxígeno necesario para el cultivo celular se suministra suficientemente a la suspensión celular y la concentración celular aumenta fácilmente.

[0171] Además, el Q/X puede ser de 0,1 o menos, es preferiblemente de 0,07 o menos, más preferiblemente de 0,05 o menos, y aún más preferiblemente de 0,03 o menos, desde el punto de vista de suprimir fácilmente el daño a las células.

[0172] Diámetro medio volumétrico de las burbujas Dv de las burbujas

[0173] En un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, un gas de aire que tiene el mismo caudal que el del gas que incluye el 30 % en masa de oxígeno descargado desde el burbujeador en el cultivo se envía desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv (µm) de burbujas del gas de aire preferiblemente satisface la expresión 2-1.

[0175]

[0177] Además, dado que es difícil medir la distribución del diámetro de burbuja de las burbujas y la velocidad final de las burbujas en caso de usar la suspensión celular, en la presente divulgación, la distribución del diámetro de burbuja de las burbujas, la velocidad final de las burbujas o similares se determina por el valor medido usando la solución de medición.

[0178] El Dv es preferiblemente de 50 µm o más, más preferiblemente de 80 µm o más, y aún más preferiblemente de 100 µm o más, desde el punto de vista de suprimir el daño a las células.

[0179] Además, el Dv es preferiblemente de 800 µm o menos, más preferiblemente de 600 µm o menos, aún más preferiblemente de 500 µm o menos, y de manera particularmente preferible de 400 µm o menos, desde el punto de vista de aumentar el kLa para permitir el cultivo celular a una alta concentración celular.

[0180] El método de medición detallado de la distribución del diámetro de la burbuja (distribución del volumen acumulado) es el siguiente.

[0181] Como dispositivo de medición, se usa FBRM Particle Track G400 fabricado por Mettler-Toledo International Inc. Se inserta un sensor de diámetro de burbuja de FBRMG 400, desde arriba del recipiente de cultivo, en una posición a 20 mm del burbujeador en la dirección de altura (dirección vertical) del recipiente de cultivo, en el que la suspensión celular se reemplaza con la solución de medición, y la medición se realiza para obtener la distribución de diámetro de burbuja.

[0182] El volumen de la solución de medición es el mismo que el volumen líquido de la suspensión celular en el cultivo. Como condiciones de medición, se utiliza el modo de medición basado en números, y la medición se realiza con un intervalo de muestreo de 10 segundos y un promedio de migración de 20 puntos. Además, se activó la función de corrección de partículas atascadas para eliminar la detección de puntos fijos en la superficie de la lente de medición. El rango de medición es de 1 µm a 4.000 µm, y la sección de medición se divide en 200 intervalos como el intervalo de datos sobre una base logarítmica. En este memento, en un caso en el que el diámetro medido de la siguiente sección es D(n+1) con respecto al diámetro medido D(n) de la n-ésima sección, se establece la ecuación A.

[0185]

[0186] Usando esta condición de ajuste, se miden los datos en BLANCO bajo la condición de un caudal de aireación de cero y los datos durante la aireación. En un caso en el que la frecuencia de los datos medidos durante la aireación en una sección de datos D(n) se indica mediante f(n), y la frecuencia de los datos en BLANCO en una sección de datos D(n) se indica mediante f0(n), el tratamiento descrito en la expresión B se realiza para obtener los datos tratados en BLANCO g(n).

[0189]

[0191] A continuación, los datos medidos basados en números se convierten en datos de medición basados en volumen V(n) realizando el cálculo descrito en la ecuación C.

[0194]

[0196] Además, el diámetro medio en volumen Dv se obtiene realizando el cálculo descrito en la ecuación D.

[0199]

[0201] La distribución acumulativa basada en volumen G(n) se obtiene según la ecuación E.

[0204]

[0206] La distribución de volumen acumulativo puede obtenerse usando la ecuación anterior.

[0207] Distribución del diámetro de la burbuja

[0208] En la distribución de diámetro de burbuja, una proporción del volumen acumulado de las burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de 20 µm o más y 500 µm o menos es preferiblemente del 30 % en volumen o más del volumen total de las burbujas en la distribución de diámetro de burbuja, desde el punto de vista de suprimir el daño celular.

[0209] La proporción del volumen acumulado de las burbujas de aire se obtiene usando la ecuación E dividiendo el valor, que se obtiene restando el volumen acumulado de las burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de menos de 20 µm del volumen acumulado de las burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de 500 µm o menos, por el volumen total de las burbujas.

[0210] La proporción del volumen acumulado es preferiblemente del 30 % en volumen o más, preferiblemente del 50 % en volumen o más, más preferiblemente del 70 % en volumen o más, y aún más preferiblemente del 90 % en volumen o más, desde el punto de vista de la supresión del daño celular.

[0211] El valor límite superior de la proporción del volumen acumulado no está particularmente limitado; sin embargo, puede ser, por ejemplo, del 100 % en volumen o menos.

[0212] Coeficiente de capacidad de transferencia de oxígeno kLa

[0213] El coeficiente de capacidad de transferencia de oxígeno kLa en el momento del cultivo es preferiblemente de 15 hr<-1>o más desde el punto de vista de aumentar la concentración de células cultivadas y suprimir fácilmente el daño a las células.

[0214] Además, el kLa es más preferiblemente de 15 h<-1>o más, aún más preferiblemente de 20 h<-1>o más, de manera particularmente preferible de 25 h<-1>o más, y lo más preferiblemente de 30 h<-1>o más, desde el punto de vista de aumentar la concentración de células cultivadas y suprimir fácilmente el daño a las células.

[0215] El valor límite superior del kLa no está particularmente limitado; sin embargo, puede ser, por ejemplo, de 100 h<-1>o menos.

[0216] El kLa se puede medir mediante el método descrito en (1) a (4) a continuación.

[0217] (1) Preparación de la disolución

[0218] Según el mismo método que el método en la medición de la distribución de diámetro de burbuja, se prepara un recipiente de cultivo en el que se reemplaza la suspensión celular en el recipiente de cultivo con la solución de medición.

[0219] (2) Preparación del sensor de concentración de oxígeno

[0220] Como sensor de concentración de oxígeno, se utiliza Inpro 6800/12/220 fabricado por Mettler-Toledo International Inc. Una membrana, cuerpo de membrana de O2 T-96 fabricado por Mettler-Toledo International Inc., se inserta dentro del sensor y, además, un electrolito de O<2>, electrolito de O2 fabricado por Mettler-Toledo International Inc., se incluye en el mismo.

[0221] Como medidor de indicación de concentración de oxígeno, se utiliza el M400 Tipo 3 fabricado por Mettler-Toledo International Inc.

[0222] Las tablas de oxígeno cero para los sensores InLab (tableta de sulfito de sodio) fabricadas por Mettler-Toledo International Inc. se disuelven en 40 ml de agua pura, seguido de una espera de 5 minutos.

[0223] El sensor de concentración de oxígeno se coloca en la solución y se deja reposar durante 20 minutos. Después de 5 minutos, se realiza una calibración de punto cero del sensor de concentración de oxígeno.

[0224] Suponiendo que la altura del sensor de concentración de oxígeno es del 0 % en el centro de la solución de medición en la dirección de la altura, la altura de la superficie líquida de la solución de medición es del 100 % y la altura de la superficie inferior de la solución de medición es del -100 %, el sensor de concentración de oxígeno se inserta en una posición de una altura del -100 % al 0 %.

[0225] La solución de medición se mantiene caliente a 37 °C.

[0226] Mientras se agita, la aireación se realiza mediante aire de un burbujeador que tiene un diámetro de orificio de 20 µm, a 0,02 vvm durante 24 horas. En la presente divulgación, "vvm" representa el doblez del volumen utilizado para la aireación por 1 minuto con respecto al volumen de líquido.

[0227] (En el caso en el que el líquido puede saturarse con aire, el diámetro del orificio del burbujeador y el caudal no importan).

[0228] Cuando se completa la aireación, la calibración se realiza estableciendo Aire como 100 %.

[0229] (3) Desgasificación de oxígeno

[0230] La solución de medición se mantiene caliente a 37 °C.

[0231] N<2>se suministra desde un burbujeador que tiene un diámetro de orificio de 20 µm a la solución de medición en el recipiente de cultivo (por ejemplo, 0,02 vvm).

[0232] Se espera hasta que la concentración de oxígeno caiga por debajo del 3 %.

[0233] Cuando la concentración de oxígeno es del 3 % o menos, se detiene el suministro de N<2>y se detiene la agitación. En un caso en el que el volumen de la parte sin solución en el espacio superior del recipiente de cultivo se indica mediante V (L), se suministra aire al espacio superior del recipiente de cultivo a un caudal de V/3 (l/min) durante 15 minutos para reemplazar N<2>en el espacio superior con aire. (En un caso en el que se puede reemplazar cinco veces la V con aire, el caudal y el tiempo no importan).

[0234] (4) Medición

[0235] Cuando se completa el reemplazo, se establecen una condición de agitación predeterminada y una condición de aireación de gas predeterminada, y se mide la concentración de oxígeno. Se usa aire como el gas. Los valores representados por la expresión KL se representan en el eje vertical junto con el tiempo (h) en el eje lateral. La concentración de oxígeno se calcula a partir de la pendiente de la gráfica en un intervalo en el que la concentración de oxígeno en la solución es del 20 % al 80 % de la concentración de oxígeno saturado en un caso en el que se airea el aire.

[0236]

[0238] En la fórmula anterior, In representa el logaritmo natural, C* representa la concentración de oxígeno saturado, C<0>representa la concentración de oxígeno en el momento de inicio de la medición y C representa la concentración de oxígeno medida.

[0239] Además, kLa se puede calcular con referencia al contenido descrito en "DECHEMA Biotechnologie Recommendations for process engineering characterization of single-use bioreactors and mixing systems by using experimental methods, Fecha de publicación: enero de 2016”.

[0240] Velocidad de descarga de gas

[0241] En el proceso de cultivo, en un caso donde un gas de aire que tiene el mismo caudal que el caudal Q (m<3>/min) del gas que incluye 30 % en volumen de oxígeno descargado desde el burbujeador en el cultivo se envía desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, el Q (m<3>/min), el A (m<2>), una densidad ρl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad ρg (kg/m<3>) del gas de aire, una viscosidad µl (kg/m/s) de la solución de medición y una aceleración gravitacional g (m/s<2>) satisfacen preferiblemente la expresión 3-1.

[0243]

[0245] Aquí, (Q/A/60) en la expresión 3-1 representa la velocidad de descarga del gas, y {3 × 10<-8>× (ρl - ρg) × g}/(18 × µl)} representa la velocidad final de las burbujas en la solución de medición en un caso en el que el diámetro de burbuja promedio en volumen Dv es de 175 µm.

[0246] Es decir, la expresión 3-1 representa que la relación de la velocidad de descarga del gas a la velocidad final de las burbujas (la velocidad de descarga del gas / la velocidad final de las burbujas, también denominada "relación A") es 0,1 o más y 5 o menos.

[0247] En el caso en el que la relación A es 0,1 o más, se especula que el kLa aumenta fácilmente, y el daño a las células se suprime fácilmente ya que se aplica fácilmente una presión uniforme al burbujeador y se suprime la descarga no uniforme de burbujas desde la parte de descarga de gas del burbujeador.

[0248] Por otro lado, en un caso en el que la relación A es 5 o menos, se especula que se suprime que se descargue una siguiente burbuja antes de que la burbuja que se ha descargado del burbujeador se eleve en la solución y, por lo tanto, las burbujas se agregan y coalescen en la salida del burbujeador. Por consiguiente, se especula que la aparición de eventos tales como un aumento en el diámetro de la burbuja y la distribución no uniforme del diámetro de la burbuja se reduce, el kLa aumenta fácilmente y la concentración de células cultivadas aumenta fácilmente. La relación A es preferiblemente de 0,1 o más, más preferiblemente de 0,2 o más, aún más preferiblemente de 0,4 o más, y lo más preferiblemente de 0,5 o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas y suprimir fácilmente el daño a las células.

[0249] Además, la relación A es preferiblemente de 5 o menos, más preferiblemente de 4 o menos, aún más preferiblemente de 3 o menos, y lo más preferiblemente de 2 o menos, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas.

[0250] En el momento del cultivo, el caudal Q (m<3>/min) del gas descargado desde el burbujeador y el A (m<2>) satisfacen preferiblemente la expresión 4-1.

[0252]

[0254] Q/A representa la velocidad de descarga de gas (m/min) tal como se describió anteriormente.

[0255] En un caso en el que Q/A es de 0,1 m/min o más, dado que se aplica fácilmente una presión uniforme al burbujeador y se suprime la descarga no uniforme de burbujas desde la parte de descarga de gas del burbujeador, el kLa aumenta fácilmente y se especula que el daño a las células se suprime fácilmente.

[0256] En el caso en el que Q/A es de 5 m/min o menos, se especula que se suprime que las burbujas se agregan y se unen en la salida del burbujeador. Por consiguiente, se especula que la aparición de eventos tales como un aumento en el diámetro de la burbuja y la distribución no uniforme del diámetro de la burbuja se reduce, el kLa aumenta fácilmente y la concentración de células cultivadas aumenta fácilmente.

[0257] Q/A es preferiblemente de 0,1 o más, más preferiblemente de 0,2 o más, aún más preferiblemente de 0,4 o más, y lo más preferiblemente de 0,5 o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas y suprimir fácilmente el daño a las células.

[0258] Además, Q/A es preferiblemente de 5 o menos, más preferiblemente de 4 o menos, aún más preferiblemente de 3 o menos, y lo más preferiblemente de 2 o menos, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas.

[0259] Tiempo de retención

[0260] Un nivel de líquido ZL (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en el cultivo, una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv de burbujas en la distribución de diámetro de burbuja, una densidad ρl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad ρg (kg/m<3>) del gas de aire, una aceleración gravitacional g (m/s<2>) y una viscosidad ρl (kg/m/s) de la solución de medición satisfacen preferiblemente la expresión 5-1.

[0262]

[0264] En este caso, la altura Zs (m) se refiere a la distancia desde la superficie de fondo interior del recipiente de cultivo hasta la parte más superior de la parte de suministro de gas del burbujeador.

[0265] En la expresión 5-1, (ZL - Zs) representa la distancia migrada hasta que las burbujas descargadas del burbujeador alcanzan la superficie del líquido.

[0266] Además, en la expresión 5-1, {Dv<2>× 10<-12>× (ρl - ρg) × g}/(18 × µl)} representa la velocidad final de las burbujas que tienen el diámetro de burbuja promedio en volumen Dv en la solución de medición.

[0267] Es decir, la expresión 5-1 representa el(los) tiempo(s) de retención de la burbuja en la solución de medición, que es un valor obtenido al dividir la distancia de migración de una burbuja entre la velocidad final de la burbuja. En un caso en el que el tiempo de retención es de 2 segundos o más, se especula que aumenta la cantidad de oxígeno suministrado desde las burbujas, aumenta fácilmente el kLa y aumenta fácilmente la concentración de células cultivadas en el momento del cultivo.

[0268] Además, en un caso en el que el tiempo de retención es de 300 segundos o menos, se especula que el daño a las células se suprime fácilmente.

[0269] El tiempo de retención es preferiblemente de 2 segundos o más, más preferiblemente de 15 segundos o más, aún más preferiblemente de 30 segundos o más, y de manera particularmente preferible de 40 segundos o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente el kLa y aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas en el momento del cultivo.

[0270] El tiempo de retención es de preferiblemente 300 segundos o menos, más preferiblemente 200 segundos o menos, aún más preferiblemente 150 segundos o menos, y de manera particularmente preferible 120 segundos o menos, desde el punto de vista de suprimir fácilmente el daño a las células.

[0271] Forma del recipiente de cultivo

[0272] La X (m<3>), el ZL (m) y la Zs (m) satisfacen preferiblemente al menos una seleccionada del grupo que consiste en la expresión 6-1 y la expresión 6-2 y más preferiblemente satisfacen ambas.

[0275]

[0277] Zs/ZL en la expresión 6-1 es una relación del nivel de líquido ZL (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo a la superficie superior de la suspensión celular, a la altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo a la superficie de instalación del burbujeador. En un caso en el que la relación es de 0,5 o menos, el burbujeador se instala en una posición por debajo del centro de la altura desde la superficie inferior interna hasta la superficie de líquido en la dirección de altura en el recipiente de cultivo.

[0278] Se especula que kLa aumenta fácilmente y la concentración de células en el momento del cultivo aumenta fácilmente ya que la posición inferior del burbujeador proporciona el tiempo de retención más largo de las burbujas descargadas del burbujeador.

[0279] El Zs/ZL es preferiblemente de 0,5 o menos, más preferiblemente de 0,3 o menos, aún más preferiblemente de 0,2 o menos, y de manera particularmente preferible de 0,1 o menos, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración celular en el momento del cultivo.

[0280] El límite inferior de Zs/ZL no está particularmente limitado, y puede adoptarse un aspecto (Zs/ZL = 0) en el que se forma un burbujeador en la superficie inferior.

[0281] (4 × X/ZL/3.14)<0.5>en la expresión 6-2 representa un diámetro de círculo equivalente en un plano horizontal a la superficie inferior del recipiente de cultivo, en un caso de suponer que el diámetro interno del recipiente de cultivo no cambia debido al cambio en la dirección de altura.

[0282] Es decir, (4 × X/ZL/3,14)<0,5>en la expresión 6-2 representa un valor de la relación de la altura de la superficie líquida de la suspensión celular en el recipiente de cultivo al diámetro de círculo equivalente (la altura de la superficie líquida/ el diámetro de círculo equivalente, también denominado "relación B").

[0283] En un caso en el que la relación B es de 0,5 segundos o más, se especula que el tiempo de retención de las burbujas aumenta, el kLa aumenta fácilmente y la concentración de células cultivadas en el momento del cultivo aumenta fácilmente.

[0284] En el caso en el que la relación B es 4 o menos, se especula que la concentración de oxígeno se hace fácilmente homogénea en el recipiente de cultivo y se asegura fácilmente un área inferior suficiente para disponer de un burbujeador que tiene el área necesaria (el área de superficie A).

[0285] La relación B es preferiblemente de 0,5 o más, más preferiblemente de 0,8 o más, aún más preferiblemente de 1,0 o más, y de manera particularmente preferible de 1,2 o más, desde el punto de vista de aumentar el tiempo de retención de la burbuja, aumentar fácilmente el kLa y aumentar fácilmente la concentración de células cultivadas en el momento del cultivo.

[0286] Además, la relación B es preferiblemente de 4 o menos, más preferiblemente 3 o menos, aún más preferiblemente 2,5 o menos, y de manera particularmente preferible 2 o menos, desde el punto de vista de homogeneizar fácilmente la concentración de oxígeno en el recipiente de cultivo y asegurar fácilmente un área inferior suficiente para disponer de un burbujeador que tenga el área necesaria (el área superficial A).

[0287] Elemento agitación

[0288] El recipiente de cultivo en la presente divulgación puede incluir además un elemento de agitación.

[0289] En el caso en el que el recipiente de cultivo se agita mediante el elemento de agitación, se especula que las burbujas descargadas desde el burbujeador también se agitan, el kLa aumenta fácilmente y la concentración celular a la que es posible el cultivo celular aumenta fácilmente.

[0290] El elemento de agitación no está particularmente limitado, y puede usarse un elemento de agitación usado en un burbujeador conocido, y los ejemplos del mismo incluyen un agitador que tiene una paleta de agitación.

[0291] La posición del agitador que tiene una paleta de agitación, el tamaño de la paleta de agitación y similares no están particularmente limitados y pueden diseñarse dependiendo del tipo de célula a usar, el volumen de suspensión celular, la cantidad de oxígeno a suministrar o la posición, número, tamaño o similares del burbujeador. Además, con el fin de agitar rápidamente las burbujas que salen del burbujeador y suprimir la coalescencia de las burbujas, es preferible disponer un elemento de agitación en una posición cercana al burbujeador.

[0292] Como método que usa otro que no sea el agitador que tiene una paleta de agitación, por ejemplo, puede mencionarse un método de agitación del recipiente de cultivo o un método de circulación de la suspensión celular en el recipiente de cultivo con una bomba o similares.

[0293] Células

[0294] Las células que se van a cultivar en el método de cultivo celular según la presente divulgación son células animales. Las células pueden ser células ES, células iPS, diversas células madre o similares.

[0295] Las células a cultivar en el método de cultivo celular según la presente divulgación pueden ser células que producen un producto. En un caso en el que se cultivan células que producen un producto, el producto se produce por las células, y en un caso en el que se recoge el producto, puede realizarse la producción de sustancia usando las células.

[0296] Es decir, un aspecto preferido según la presente divulgación es un método de producción de producto que incluye cultivar células con el método de cultivo celular según la presente divulgación y obtener un producto producido por las células cultivadas.

[0297] Las células utilizadas para producir un producto no están particularmente limitadas y pueden ser cualquiera de las células animales. Son preferibles células animales tales como células CHO, células BHK-21, células C127, células NS0 y células SP2/0-Ag14, y son más preferibles células CHO porque se han llevado a cabo muchos análisis y se han establecido técnicas de ingeniería genética. Incluso en un caso en el que las células no producen originalmente el producto deseado o la cantidad de producción es pequeña, el producto deseado puede producirse de manera eficiente, por ejemplo, introduciendo un vector de expresión, tal como un plásmido, que codifica una proteína requerida para producir el producto en la célula. El producto producido por las células en la presente divulgación no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia producida por las células en una suspensión celular, y los ejemplos de la misma incluyen alcoholes, enzimas, antibióticos, ácidos nucleicos, proteínas recombinantes y anticuerpos. Entre ellos, el producto es preferiblemente una proteína recombinante o un anticuerpo y más preferiblemente un anticuerpo.

[0298] El método para obtener el producto no está particularmente limitado, y puede usarse un método conocido.

[0299] En un caso en el que se produce un anticuerpo en células animales, el tipo de anticuerpo no está particularmente limitado, y ejemplos de los mismos incluyen anticuerpo anti-receptor de IL-6, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo antiglipicano-3, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-GPIIb/IIIa, anticuerpo anti-TNF, anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-Her2/neu, anticuerpo anti-RSV, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD52, anticuerpo anti-IgE, anticuerpo anti-CD11a, anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-VLA4. Los ejemplos de anticuerpos que se van a producir incluyen no solo anticuerpos monoclonales derivados de animales tales como seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos y monos, sino también anticuerpos modificados artificialmente tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos biespecíficos.

[0300] La concentración de células en la suspensión celular contenida en el recipiente de cultivo no está particularmente limitada y puede determinarse teniendo en cuenta el tipo de célula y similares. Sin embargo, dado que la mayor concentración de células en la suspensión celular contenida en el recipiente de cultivo da el mayor número de células y la mayor cantidad de producción de un producto en un caso en el que las células producen el producto, es preferible que la concentración de células sea alta.

[0301] A partir de estos hechos, la concentración de células en la suspensión celular contenida en el recipiente de cultivo es preferiblemente de 4 × 10<7>células/ml o más, más preferiblemente de 5 × 10<7>células/ml o más, y aún más preferiblemente de 6 × 10<7>células/ml.

[0302] El límite superior de la concentración celular no está particularmente limitado, pero por ejemplo, es preferible 30 × 10<7>células/ml o menos desde el punto de vista de mejorar la tasa de supervivencia celular.

[0303] Como medio usado para el cultivo celular, puede usarse un medio líquido usado habitualmente para el cultivo celular. Por ejemplo, se puede utilizar medio OptiCHO (Thermo Fisher Scientific, Inc., 12681011), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, medio F-12K, medio F12 de Ham, medio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio 5A de McCoy, medio L-15 de Leibovitz y serie 300 de EX-CELL (marca comercial) (JRH Biosciences), CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich Co. LLC), CD-CHO (Invitrogen), ISCHO-V (FUJIFILM Irvine Scientific), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich Co. LLC), y similares.

[0304] Puede añadirse al medio suero tal como suero de ternera fetal (FCS). Como alternativa, el medio puede ser un medio libre de suero tal como un medio completamente sintético.

[0305] El medio puede complementarse con componentes adicionales tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos e hidrolizados de proteínas vegetales.

[0306] Aunque el pH del medio varía dependiendo de las células que se van a cultivar, el medio es generalmente de pH 6,0 a 8,0, preferiblemente de pH 6,8 a 7,6, y más preferiblemente de pH 7,0 a 7,4.

[0307] La temperatura de cultivo es generalmente de 30 °C a 40 °C, preferiblemente de 32 °C a 37 °C, y más preferiblemente de 36 °C a 37 °C, y la temperatura de cultivo puede cambiarse durante el cultivo.

[0308] El cultivo se puede realizar en una atmósfera que tiene una concentración de CO<2>del 0 % en volumen al 40 % en volumen y preferiblemente en una atmósfera que tiene una concentración de CO<2>del 2 % en volumen al 10 % en volumen.

[0309] En el cultivo, el medio puede reemplazarse, airearse y agitarse según sea necesario.

[0310] Cultivo de perfusión

[0311] El cultivo celular es preferiblemente un cultivo de perfusión. El cultivo de perfusión es un método de cultivo en el que se añade medio fresco y al mismo tiempo se elimina el medio utilizado. En el caso de usar el cultivo de perfusión, también es posible lograr una alta concentración de células que exceda 1 × 10<8>células/mL. Un cultivo de perfusión típico comienza con un inicio de cultivo por lotes que dura 1 o 2 días, posteriormente se añade un medio de cultivo de suministro nuevo al cultivo de forma continua, escalonada y/o intermitente, y el medio usado se retira al mismo tiempo. En el cultivo de perfusión, pueden usarse métodos tales como sedimentación, centrifugación y filtración para retirar el medio usado mientras se mantiene la concentración celular. La perfusión puede ser continua, escalonada o intermitente, o una combinación de las mismas. El número de días del cultivo de perfusión es preferiblemente de 5 días a 150 días, más preferiblemente de 10 días a 100 días y aún más preferiblemente de 20 días a 80 días. Es preferible que el número de días del cultivo de perfusión sea de 5 días o más ya que el número de células obtenido es grande y la cantidad de producción de un producto es grande en el caso en el que las células producen el producto. Es preferible que el número de días del cultivo de perfusión sea de 150 días o menos desde el punto de vista de evitar la obstrucción de la membrana de filtración utilizada en el cultivo de perfusión y evitar la contaminación.

[0312] El cultivo de perfusión puede realizarse usando, por ejemplo, un dispositivo de cultivo celular de perfusión descrito más adelante.

[0313] La extracción de la suspensión celular del recipiente de cultivo puede realizarse normalmente usando una bomba, pero pueden usarse otras unidades de alimentación de líquido disponibles. La suspensión celular extraída del recipiente de cultivo se somete a tratamientos tales como la recogida del producto y la eliminación de las células muertas. La suspensión celular extraída del recipiente de cultivo puede desecharse parcialmente o devolverse al recipiente de cultivo después de tratamientos tales como la recogida del producto y la eliminación de las células muertas.

[0314] En un caso en el que se produce una pérdida del medio debido a los tratamientos anteriores, la pérdida se puede compensar, por ejemplo, suministrando un medio fresco al recipiente de cultivo.

[0315] Método de producción del producto

[0316] El método de producción de producto según la presente divulgación incluye:

[0317] cultivar células mediante el método de cultivo celular según la presente divulgación (a continuación en el presente documento, también denominado "proceso de cultivo celular"); y

[0318] obtener un producto producido por las células cultivadas (a continuación en el presente documento, también denominado "proceso de recogida de producto").

[0319] En el método de producción de producto según la presente divulgación, dado que el método de cultivo celular según la presente divulgación se usa para el cultivo, se especula que las células se cultivan a una concentración celular alta y se suprime el daño a las células. Por consiguiente, se especula que la cantidad de producción del producto aumentó y la calidad del producto puede mejorarse.

[0320] Proceso de cultivo celular

[0321] El proceso de cultivo celular es el mismo que el proceso de cultivo celular en el método de cultivo celular descrito anteriormente según la presente divulgación.

[0322] Como las células que producen un producto, pueden usarse las células que producen un producto ejemplificado anteriormente, y como los productos, puede producirse el producto ejemplificado anteriormente. El producto es preferiblemente un anticuerpo.

[0323] Proceso de recogida del producto

[0324] Como la recogida de producto en el proceso de recogida de producto, la suspensión celular puede recogerse simplemente. Por ejemplo, puede recogerse un líquido obtenido retirando al menos una parte de las células de la suspensión celular usando un filtro o una centrífuga, y se usa un método conocido sin limitación particular. En un caso de desear mejorar la pureza del producto, cambiar el disolvente del producto o cambiar la forma del producto a, por ejemplo, una forma de potencia, la suspensión celular o el líquido pueden someterse a tratamiento adicional. Además, en un caso en el que el cultivo celular se realiza mediante el cultivo de perfusión descrito anteriormente, puede recogerse una parte de la suspensión celular mientras se perfunde, o puede recogerse una parte de la suspensión celular como un líquido que se obtiene retirando al menos una parte de células de la parte de suspensión celular, que se filtra o centrifuga mientras se perfunde.

[0325] Por ejemplo, el producto puede purificarse mediante un tratamiento de purificación. El producto obtenido puede purificarse hasta una alta pureza. En un caso en el que el producto es un polipéptido tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, la separación y purificación del producto puede llevarse a cabo usando el método de separación y purificación ordinario usado para un polipéptido. Por ejemplo, una columna de cromatografía para cromatografía de afinidad o similar, un filtro, ultrafiltración, precipitación salina, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y electroforesis de enfoque isoeléctrico pueden seleccionarse y combinarse adecuadamente para separar y purificar un polipéptido; sin embargo, la presente invención no se limita a los mismos. La concentración del polipéptido obtenido puede medirse midiendo la absorbancia o mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

[0326] En el dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación, se proporcionan un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células y un burbujeador para descargar un gas que incluye el 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular en el recipiente de cultivo celular, un diámetro de orificio promedio del burbujeador es de 1 µm o más y de 300 µm o menos, y un área superficial A (m<2>) del burbujeador, un volumen Xmax (m<3>) de la suspensión celular con el que puede llenarse al máximo el recipiente de cultivo satisfacen la expresión 7-1 y la expresión 7-2.

[0329]

[0331] Los respectivos elementos constituyentes tales como el recipiente de cultivo y el burbujeador en el dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación tienen los mismos significados que los respectivos elementos constituyentes en el método de cultivo celular descrito anteriormente según la presente divulgación, y lo mismo se aplica para los aspectos preferidos.

[0332] Además, en el aspecto preferido del dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación, X en el método de cultivo celular según la presente divulgación debe leerse como Xmax descrito más adelante.

[0333] A continuación en el presente documento se describirán puntos que no se describen en el método de cultivo celular según la presente divulgación.

[0334] Xmax es, por ejemplo, el valor máximo del volumen de suspensión celular usado generalmente en el dispositivo de cultivo celular, y el valor máximo del volumen utilizable de la suspensión celular en el catálogo del dispositivo de cultivo celular se determina como Xmax.

[0335] En un caso en el que un volumen utilizable de la suspensión celular no se determina particularmente en el dispositivo de cultivo celular, el volumen utilizable puede determinarse teniendo en cuenta la realización, por ejemplo, el 80 % en volumen de la capacidad del recipiente de cultivo.

[0336] Aquí, el A/Xmax es preferiblemente de 0,004 o más, más preferiblemente de 0,006 o más, aún más preferiblemente de 0,008 o más, y de manera particularmente preferible de 0,01 o más, desde el punto de vista de suprimir la coalescencia de las burbujas en la porción de descarga de gas del burbujeador, suprimir un aumento en el diámetro de las burbujas y aumentar fácilmente el kLa.

[0337] Además, el A/Xmax es preferiblemente de 0,1 o menos, más preferiblemente de 0,05 o menos, aún más preferiblemente de 0,03 o menos, y de manera particularmente preferible de 0,025 o menos, desde el punto de vista de suprimir la eyección no uniforme de burbujas, aumentar el kLa y suprimir fácilmente el daño a las células. Además, la Xmax se establece dependiendo del tipo de célula que se va a cultivar y el propósito del cultivo; sin embargo, la X es preferiblemente de 0,5 m<3>o más, más preferiblemente de 1,0 m<3>o más, y aún más preferiblemente de 1,1 m<3>o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la cantidad del producto obtenido en un caso en el que el método de cultivo celular según la presente divulgación se usa para el método de producción de producto o desde el punto de vista de obtener fácilmente una gran cantidad de células.

[0338] El límite superior del Xmax no está particularmente limitado, pero por ejemplo, puede ser de 10 m<3>o menos. En el dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación, es preferible que un nivel de líquido ZLmax (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en un caso en el que el recipiente de cultivo está lleno al máximo con la suspensión celular, y una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador satisfaga la expresión 8-1.

[0339] El ZLmax - Zs representa la distancia desde la superficie líquida de la suspensión celular hasta la superficie del suelo del burbujeador en un caso en el que el recipiente de cultivo se llena al máximo con la suspensión celular. En el caso en el que (ZLmax - Zs)/0.02 es 2 o más, se especula que kLa aumenta fácilmente y la concentración de células en el momento del cultivo aumenta fácilmente ya que el tiempo de retención de las burbujas descargadas del burbujeador es largo.

[0340] Además, en un caso en el que (ZLmax - Zs)/0,02 es 300 o menos, se especula que el daño a las células se suprime fácilmente ya que el tiempo de retención de las burbujas no es demasiado largo.

[0341] El (ZLmax - Zs)/0.02 es preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 15 o más, aún más preferiblemente 30 o más, y lo más preferiblemente 40 o más, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración celular de células en el momento del cultivo.

[0342] Además, (ZLmax - Zs)/0,02 es preferiblemente de 300 o menos, más preferiblemente de 200 o menos, aún más preferiblemente de 150 o menos, y lo más preferiblemente de 120 o menos, desde el punto de vista de suprimir fácilmente el daño a las células.

[0343] En el dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación, es preferible que Xmax (m<3>), ZLmax (m) y Zs (m) satisfagan la expresión 9-1 y la expresión 9-2.

[0346]

[0348] El Zs/ZLmax en la expresión 9-1 es una relación del nivel de líquido ZL (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo a la superficie superior de la suspensión celular en un caso en el que el recipiente de cultivo está lleno al máximo con la suspensión celular, a la altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo a la superficie de instalación del burbujeador. En el caso en el que la relación es de 0,5 o menos, el burbujeador se instala en una posición por debajo del centro de la altura desde la superficie inferior interna hasta la superficie líquida en la dirección de la altura en el recipiente de cultivo en el caso en el que el recipiente de cultivo se llena al máximo con la suspensión celular.

[0349] Se especula que kLa aumenta fácilmente y la concentración de células en el momento del cultivo aumenta fácilmente ya que la posición inferior del burbujeador proporciona el tiempo de retención más largo de las burbujas descargadas del burbujeador.

[0350] El Zs/ZLmax es preferiblemente de 0,5 o menos, preferiblemente 0,3 o menos, más preferiblemente 0,2 o menos, y aún más preferiblemente 0,1 o menos, desde el punto de vista de aumentar fácilmente la concentración celular en el momento del cultivo.

[0351] El límite inferior de Zs/ZL no está particularmente limitado, y puede adoptarse un aspecto (Zs/ZLmax = 0) en el que se forma un burbujeador en la superficie inferior.

[0352] (4 × Xmax/ZLmax/3,14)<0,5>en la expresión 9-2 representa un diámetro de círculo equivalente en un plano horizontal a la superficie inferior del recipiente de cultivo, en el caso de suponer que el diámetro interno del recipiente de cultivo no cambia debido al cambio en la dirección de altura.

[0353] Es decir, ZLmax/{(4 × Xmax/ZLmax/3,14)<0,5>} en la expresión 9-2 representa un valor de la relación de la altura de la superficie líquida de la suspensión celular en el recipiente de cultivo en un caso en el que el recipiente de cultivo se llena al máximo con la suspensión celular con respecto al diámetro de círculo equivalente (la altura de la superficie líquida/ el diámetro de círculo equivalente, también denominado "relación C").

[0354] En un caso en el que la relación C es de 0,5 segundos o más, se especula que el tiempo de retención de las burbujas aumenta, el kLa aumenta fácilmente y la concentración celular en el momento del cultivo aumenta fácilmente.

[0355] En el caso en el que la relación C es 4 o menos, se especula que la concentración de oxígeno se hace fácilmente homogénea en el recipiente de cultivo y se asegura fácilmente un área inferior suficiente para disponer de un burbujeador que tiene el área necesaria (el área de superficie A).

[0356] La relación C es preferiblemente de 0,5 o más, preferiblemente de 0,8 o más, más preferiblemente de 1,0 o más, y aún más preferiblemente de 1,2 o más, desde el punto de vista de aumentar el tiempo de retención de la burbuja, aumentar fácilmente el kLa y aumentar fácilmente la concentración celular en el momento del cultivo.

[0357] Además, la relación C es preferiblemente de 4 o menos, preferiblemente de 3 o menos, más preferiblemente de 2,5 o menos, y aún más preferiblemente de 2 o menos, desde el punto de vista de homogeneizar fácilmente la concentración de oxígeno en el recipiente de cultivo y asegurar fácilmente un área inferior suficiente para disponer de un burbujeador que tenga el área necesaria.

[0358] El dispositivo de cultivo celular descrito en la presente divulgación es preferiblemente un dispositivo de cultivo celular de perfusión.

[0359] El dispositivo de cultivo celular de perfusión no está particularmente limitado siempre que sea un dispositivo que pueda realizar el cultivo de perfusión descrito anteriormente y pueda tener un diseño conocido.

[0360] Se describirá colectivamente un ejemplo del método de cultivo celular, el método de producción de producto y el dispositivo de cultivo celular según la presente divulgación con referencia a la figura 3. La figura 3 es un diagrama de configuración esquemático que ilustra un ejemplo de una configuración de un dispositivo de cultivo celular 200 aplicable a la implementación del método de producción de producto según la presente divulgación.

[0361] En la figura 3, el dispositivo de cultivo celular 200 incluye el recipiente de cultivo 100 que contiene una suspensión celular, una unidad de filtro 20 que tiene una membrana de filtro 24 que realiza un tratamiento de separación de membrana en la suspensión celular extraída del recipiente de cultivo 100, un canal de flujo 52 para devolver los componentes bloqueados por la membrana de filtro 24 al recipiente de cultivo 100, un canal de flujo 53 para pasar los componentes que han permeado a través de la membrana de filtro 24 y un tanque de recogida 40 conectado al canal de flujo 53.

[0362] Un dispositivo de agitación que tiene una paleta de agitación 11 y un burbujeador 10 se proporcionan dentro del recipiente de cultivo 100. En un caso en el que se gira la paleta de agitación 11, se agita el medio contenido en el recipiente de cultivo 100 y, por lo tanto, se mantiene la homogeneidad del medio. Además, el kLa se aumenta fácilmente agitando las burbujas descargadas del burbujeador 10.

[0363] El número, la posición y similares del burbujeador 10 pueden ser los mismos que los descritos en el método de cultivo celular descrito anteriormente según la presente divulgación.

[0364] El canal de flujo 51 tiene un extremo conectado a la parte inferior del recipiente de cultivo 100 y el otro extremo conectado a una entrada 20a de la unidad de filtro 20. Una flecha 66 indica la dirección de flujo de la suspensión celular en el canal de flujo 51. Una bomba PU1 para extraer la suspensión celular contenida en el recipiente de cultivo 100 y enviar la suspensión celular extraída a la unidad de filtro 20 se proporciona en el medio del canal de flujo 51. Como bomba PU1, por ejemplo, puede usarse una bomba de tipo levitación magnética. La presión de envío de líquido puede medirse mediante un manómetro 60 instalado entre la bomba PU1 y la unidad de filtro 20. La presión de envío de líquido de la bomba PU1 puede ajustarse mediante el grado de apertura de una válvula de pinzamiento V proporcionada en el canal de flujo 52. Además, el caudal de envío de líquido se puede ajustar por la velocidad de rotación de la bomba PU1.

[0365] Además, puede usarse una bomba alternativa como bomba PU1. En un caso en el que se utiliza una bomba alternativa para PU1, no es necesario conectar un extremo del canal de flujo 51 a la parte inferior del recipiente de cultivo 100. Debido al movimiento alternativo de PU1, las flechas 66, 68 y 70 se invierten con respecto a la figura 3, y la suspensión celular se extrae del recipiente de cultivo. En un caso en el que las flechas 66, 68 y 70 se invierten en la dirección ilustrada en la figura 3, la suspensión celular se devuelve al recipiente de cultivo.

[0366] La unidad de filtro 20 incluye un recipiente 21 y una membrana de filtro 24 que divide el espacio dentro del recipiente 21 en un lado de suministro 22 y un lado de permeación 23 y realiza un tratamiento de separación de membrana en la suspensión celular extraída del recipiente de cultivo 100. Una flecha 68 indica la dirección de flujo de la suspensión celular en la unidad de filtro 20. Además, la unidad de filtro 20 tiene, en el lado de suministro 22, una entrada 20a en la que fluye la suspensión celular y una salida 20b desde la que fluye la suspensión celular. La suspensión celular extraída del recipiente de cultivo 100 pasa a través de la membrana de filtro 24 mientras fluye hacia el interior del recipiente 21 a través de la entrada 20a y fluye hacia el exterior del recipiente 21 a través de la salida 20b. La unidad de filtro 20 realiza el tratamiento de separación de membrana mediante un método de tipo de flujo tangencial en el que un componente que tiene un tamaño pequeño se envía al lado de permeación 23 mientras que un líquido objetivo para el tratamiento de separación de membrana fluye a lo largo de la superficie de membrana de la membrana de filtro 24 (en la dirección paralela a la superficie de membrana). En el tratamiento de separación por membrana mediante un método de tipo de flujo tangencial, puede formarse un flujo en el que la suspensión celular extraída del recipiente de cultivo 100 circula en una dirección en paralelo a lo largo de la superficie de membrana de la membrana de filtro 24, o puede formarse un flujo en el que la suspensión celular se mueve en vaivén a lo largo de la superficie de membrana de la membrana de filtro 24. En un caso de formación de un flujo circulante, puede usarse adecuadamente un dispositivo de trayectoria de flujo de cultivo de perfusión KrosFlo (KML-100, KPS-200, KPS-600) fabricado por Spectrum LifeSciences LLC, serie PuraLev fabricada por LEVITRONIX, o similares. En un caso en el que se forma un flujo alternativo, puede usarse preferiblemente el sistema ATF fabricado por REPLIGEN.

[0367] Las células contenidas en la suspensión celular no penetran a través de la membrana de filtro 24, fluyen fuera del exterior del recipiente 21 a través de la salida 20b y se devuelven al interior del recipiente de cultivo 100 a través del canal de flujo 52. Una flecha 70 indica la dirección de flujo de la suspensión celular en el canal de flujo 52. Por otro lado, un producto tal como un anticuerpo contenido en la suspensión celular permea a través de la membrana de filtro 24 y se expulsa al exterior del recipiente 21 a través de una salida de expulsión 20c proporcionada en el lado de permeación 23. El canal de flujo 53 que tiene una bomba PU2 se conecta al lado de permeación 23, y un líquido permeado que incluye un producto (por ejemplo, anticuerpo) permeado en el lado de permeación 23 se recoge en el tanque de recogida 40 a través del canal de flujo 53. Una flecha 74 indica la dirección de flujo del líquido permeado en el canal de flujo 53. La bomba PU2 puede ser una bomba peristáltica o una bomba de tipo de levitación magnética.

[0368] Como membrana de filtro 24, es posible usar un filtro de malla formado tejiendo un elemento fibroso en forma de malla. En el caso de usar el filtro de malla, es posible promover la expulsión de componentes innecesarios para el cultivo celular, que incluye cuerpos celulares muertos y restos celulares, al lado de permeación, en comparación con el caso de usar una membrana de fibra hueca. Como resultado, los componentes innecesarios para el cultivo celular pueden eliminarse eficazmente del recipiente de cultivo 100 y, por tanto, puede mejorarse la proliferación de células en el recipiente de cultivo 100.

[0369] Puede usarse una membrana de fibra hueca como membrana de filtro 24. En un caso en el que se usa la membrana de fibra hueca, el riesgo de la permeación celular en el lado de permeación puede reducirse en comparación con un caso en el que se usa el filtro de malla. Además, es posible reducir el riesgo de obstrucción de la membrana de filtro 24, causado por la entrada de células. Por consiguiente, puede reducirse la pérdida de células.

[0370] Un producto (por ejemplo, anticuerpo) contenido en el líquido permeado que ha permeado a través de la membrana de filtro 24 y recogido en el tanque de recogida 40 se envía, a través del canal de flujo 56, a una parte de tratamiento de purificación (no ilustrada en la figura) en la que se realiza la purificación del producto (por ejemplo, anticuerpo). El líquido permeado recogido puede almacenarse por el momento en el tanque de recogida 40 o puede enviarse directamente a la parte de tratamiento de purificación sin almacenarse en el tanque. En un caso en el que se almacena en el tanque de recogida 40, la influencia en la parte de tratamiento de purificación puede minimizarse incluso en un caso en el que cambia el caudal del líquido permeado.

[0371] Una flecha 76 indica la dirección en la que fluye el líquido permeado en el canal de flujo 56, y C indica la migración del líquido permeado utilizado en el tratamiento de purificación.

[0372] El dispositivo de cultivo celular 200 tiene un canal de flujo 54 para suministrar un medio nuevo al recipiente de cultivo 100, y una bomba PU3 proporcionada en el medio del canal de flujo 54. A indica un puerto de suministro de medio fresco, y la flecha 62 indica la dirección en la que la suspensión celular fluye en el canal de flujo 54. La bomba PU3 puede ser una bomba peristáltica o una bomba de tipo de levitación magnética.

[0373] Con el fin de evitar que la concentración de células en el recipiente de cultivo 100 se vuelva excesivamente alta, se realiza un tratamiento de sangrado celular en el que una parte de las células en el recipiente de cultivo 100 se extrae en un momento adecuado durante el período de cultivo. En el tratamiento de sangrado celular, las células en el recipiente de cultivo 100 se expulsan al exterior del recipiente de cultivo 100 a través del canal de flujo 55. Una flecha 64 indica la dirección en la que fluye la suspensión celular en el canal de flujo 55, y B indica la migración de la suspensión celular utilizada en el tratamiento de sangrado celular.

[0374] En el dispositivo de cultivo celular 200 ilustrado en la figura 3, el tratamiento de separación se realiza mediante el tratamiento de separación por membrana con la unidad de filtro 20, pero la unidad de filtro 20 puede reemplazarse con una parte de tratamiento que realiza el tratamiento de separación según un método conocido tal como un método de agregación sónica o un método de centrifugación.

[0375] Como se describió anteriormente, según la presente divulgación, puede proporcionarse el método de cultivo celular en el que es posible el cultivo celular a una alta concentración celular, y se suprime el daño a las células, un método de producción de producto que incluye el método de cultivo celular, y un dispositivo de cultivo celular que permite el método de cultivo celular. En el caso del método de producción de producto, el producto producido puede usarse para, por ejemplo, fármacos biomédicos y medicina regenerativa.

[0376] Ejemplos

[0377] A continuación en el presente documento, la presente divulgación se describirá en detalle con referencia a los ejemplos, pero la presente divulgación no se limita a estos ejemplos. En los presentes ejemplos, "%" y "parte" significan respectivamente "% en masa" y "parte en masa", a menos que se especifique lo contrario.

[0378] Ejemplo de referencia 1: ejemplos de referencia 1-1 a 1-4

[0379] Con el fin de investigar el diámetro medio de orificio de la parte de suministro de gas en el burbujeador, en el que se suprime el daño a las células, se llevó a cabo un cultivo semicontinuo que tenía una escala de 1,2 l mientras se cambiaba el diámetro medio de orificio.

[0380] El daño celular se evaluó a partir del número de células y la tasa de supervivencia celular (viabilidad) después del cultivo.

[0381] Procedimiento experimental

[0382] 1,2 l de un medio (Thermo Fisher Scientific, Inc., medio OptiCHO) al que se añadió glutamina (Gln) de modo que la concentración fuera de 8 mM (mol/l) en un recipiente de cultivo que tenía un volumen total de 3 l.

[0383] Se sembraron células CHO a una concentración de 2 × 10<5>células/ml en el medio añadido.

[0384] Se llevó a cabo el cultivo durante 3 días (72 horas) en las condiciones de una velocidad de rotación de agitación de 180 revoluciones por minuto (rpm), un gas de superficie superior Aire de 15 ml/min y CO<2>de 0,75 ml/min. Después del cultivo anterior durante 3 días, se descargó oxígeno de cada burbujeador de modo que la concentración de oxígeno en la suspensión celular se controló al 50 % (la concentración de saturación de oxígeno en el aire se estableció al 100 %). En ese momento, además del oxígeno, el nitrógeno fluía de manera similar desde el burbujeador, de modo que el caudal total de gas desde el burbujeador era de 0,03 vvm. A partir de entonces, el cultivo se controló todo el tiempo en las condiciones anteriores hasta el final del cultivo. El burbujeador utilizado tenía una forma plana circular, un diámetro de 6 mm y un área de 0,000028 m<2>.

[0385] Además, después del cultivo anterior durante 3 días, Cellboost 7a (Alimentación A) fabricado por General Electric Company, que tiene un volumen de líquido correspondiente al 2 % del volumen de suspensión celular, y Cellboost 7b (Alimentación B) fabricado por General Electric Company, que tiene un volumen de líquido correspondiente al 0,2 % del volumen de suspensión celular, se añadieron diariamente una vez al día.

[0386] Además, el cultivo anterior se realizó mientras se medía glucosa (Glc) y Gln (glutamina) en la suspensión celular. Desde el día 3 del cultivo, se añadieron diariamente 450 g/l de una solución de Glc una vez al día al 0,75 % del volumen de suspensión celular en un caso en el que la Glc era inferior a 4,0 g/l, y se añadieron diariamente 200 mM de Gln una vez al día al 0,5 % del volumen de suspensión celular en un caso en el que la Gln era inferior a 1,5 mM. El cultivo se realizó durante un total de 14 días, y el número de células y la tasa de supervivencia celular se evaluaron diariamente mediante el método de azul de tripano usando un autoanalizador de células vivas y muertas Vi-CELLXR (nombre del producto, fabricado por Beckman Coulter, Inc.).

[0387] Se evaluó el daño celular evaluando la densidad celular más alta alcanzada durante 14 días después de iniciar el suministro de oxígeno de cada burbujeador y la tasa de supervivencia celular en el día 14. Los criterios de evaluación son los siguientes, y los detalles de las condiciones de cultivo y los resultados de la evaluación se muestran en la tabla 1 a continuación.

[0388] Criterios de evaluación

[0389] A: La concentración celular es de 2 × 10<7>células/ml o más y la tasa de supervivencia celular es del 80 % o más. B: La concentración de células es de 1 × 10<7>células/ml o más, y la tasa de supervivencia celular es del 50 % o más, pero A no es aplicable.

[0390] C: No se aplica ninguna de las opciones A y B.

[0391] Tabla 1

[0393]

[0394]

[0396] Con el fin de investigar el caudal de oxígeno vvm por volumen de cultivo, al que se suprimió el daño a las células, se llevó a cabo un cultivo que tenía una escala de 1.2 l usando diferentes caudales de aireación de gas. El daño celular se evaluó a partir del número de células y la viabilidad celular después del cultivo.

[0397] Procedimiento experimental

[0398] 1.2 l de un medio (Thermo Fisher Scientific, Inc., medio OptiCHO) al que se agregó Gln de modo que la concentración de Gln fuera de 8 mM en un recipiente de cultivo que tenía un volumen total de 3 l.

[0399] Se sembraron células CHO a una concentración de 2 × 10<5>células/ml en el medio.

[0400] El cultivo se llevó a cabo durante 3 días (72 horas) en condiciones de una velocidad de rotación de agitación de 180 rpm, un gas de espacio de cabeza de aire de 15 ml/min y CO<2>de 0,75 ml/min.

[0401] Desde el día 3 (después de 72 horas), se descargó oxígeno desde un burbujeador que incluía una parte de suministro de gas que tenía un diámetro medio de orificio de 20 µm, de modo que la concentración de oxígeno en la suspensión celular se controló al 50 % (la concentración de saturación de oxígeno en el aire se estableció al 100 %). En ese momento, además del oxígeno, el nitrógeno fluía de manera similar desde el burbujeador, de modo que el caudal total de gas desde el burbujeador era el valor que se muestra en la tabla. A partir de entonces, el cultivo se controló todo el tiempo en las condiciones anteriores hasta el final del cultivo. El burbujeador utilizado tenía una forma plana circular, un diámetro de 6 mm y un área de 0,000028 m<2>.

[0402] Además, a partir del día 3, Cellboost 7a (Alimentación A) fabricado por General Electric Company, que tiene un volumen de líquido correspondiente al 2 % del volumen de suspensión celular, y Cellboost 7b (Alimentación B) fabricado por General Electric Company, que tiene un volumen de líquido correspondiente al 0,2 % del volumen de suspensión celular, se añadieron diariamente una vez al día.

[0403] Además, el cultivo anterior se realizó mientras se medía Glc y Gln en la suspensión celular. Desde el día 3 del cultivo, se añadieron 450 g/l de una solución de Glc diariamente una vez al día al 0,75 % del volumen de suspensión celular en un caso en el que la Glc era inferior a 4,0 g/l, y se añadieron 200 mM de Gln diariamente una vez al día al 0,5 % del volumen de suspensión celular en un caso en el que la Gln era inferior a 1,5 mM. El cultivo se realizó durante un total de 14 días, y el número de células y la tasa de supervivencia celular se evaluaron diariamente mediante el método de azul de tripano usando un autoanalizador de células vivas y muertas Vi-CELLXR (nombre del producto, fabricado por Beckman Coulter, Inc.).

[0404] Se evaluó el daño celular evaluando la densidad celular más alta alcanzada durante 14 días después de iniciar el suministro de oxígeno de cada burbujeador y la tasa de supervivencia celular en el día 14. Los criterios de evaluación son los siguientes, y los detalles de las condiciones de cultivo y los resultados de la evaluación se muestran en la tabla 2 a continuación.

[0405] Criterios de evaluación

[0406] A: La concentración celular es de 2 × 10<7>células/ml o más y la tasa de supervivencia celular es del 80 % o más. B: La concentración de células es de 2 × 10<7>células/ml o más, y la tasa de supervivencia celular es del 60 % o más, pero A no es aplicable.

[0407] C: La concentración de células es de 1 × 10<7>células/ml o más, y la tasa de supervivencia celular es del 50 % o más, pero A no es aplicable.

[0408] D: Ninguno de A, B y C es aplicable.

[0409] Tabla 2

[0411]

[0413] Acerca del ejemplo de referencia 1 y el ejemplo de referencia 2

[0414] El ejemplo de referencia 1 y el ejemplo de referencia 2 son ejemplos en los que el volumen de suspensión celular en cultivo se establece en 1,2 l (= 0,0012 m<3>).

[0415] Aquí, por ejemplo, en el ejemplo de referencia 1 o el ejemplo de referencia 2, en un caso en el que el volumen de suspensión celular se escala hasta 0,5 m<3>(417 veces), es habitual establecer el área del burbujeador A en {(417)<1/3>}<2>= 55,8 veces a partir de la ley de escala descrita anteriormente.

[0416] En ese caso, el valor de A/X se cambia a (55.8/417) veces y, por lo tanto, se convierte en 0,0032 desde el 0,024 actual.

[0417] Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo comparativo 3-7 descrito más adelante, se demuestra que la capacidad de suministro de oxígeno es baja en un caso en el que A/X es inferior a 0,004.

[0418] Es decir, puede observarse que, por ejemplo, incluso en un caso en el que el ejemplo descrito en el ejemplo de referencia 1 o el ejemplo de referencia 2 simplemente se amplía basándose en la idea técnica convencional, el sistema ampliado resultante tiene una baja capacidad de suministro de oxígeno, y puede realizarse el método de cultivo celular según la presente divulgación.

[0419] Ejemplos 3-1 a 3-15 y ejemplos comparativos 3-1 a 3-8

[0420] Se utilizó un recipiente de cultivo en el que se cambiaron el tamaño y la forma del recipiente de cultivo, el área de superficie de diámetro de orificio promedio, la posición de instalación y similares del burbujeador tal como se muestra en la tabla 3 a continuación, y se realizó la medición o el cálculo de cada parámetro mostrado en la tabla 3 o la tabla 4.

[0421] Como recipiente de cultivo, en el ejemplo 3-1 al ejemplo 3-5, el ejemplo 3-7 al ejemplo 3-15 y el ejemplo comparativo 3-1 al ejemplo comparativo 3-6, se usó el reactor 1 como recipiente de cultivo de un solo uso, y en los ejemplos 3-6 y los ejemplos comparativos 3-7 a 3-8, se usó un dispositivo basado en el reactor 2 como recipiente de cultivo de un solo uso.

[0422] ·· Reactor 1

[0423] Diámetro de la bolsa del tanque de cultivo: 1,22 m; altura total de la bolsa del tanque de cultivo: 2,3 m; volumen de líquido con el que el tanque de cultivo puede llenarse al máximo: 2.000 l; nivel de líquido en la bolsa del tanque de cultivo (2.000 l): 1,83 m; impulsor de agitación: 4 palas (ángulo de pala: 40 °); diámetro de agitación: 419 mm; tipo de burbujeador: metálico sinterizado; forma del burbujeador: disco plano; diámetro de poro del burbujeador: 20 µm; tamaño del burbujeador: 8 discos de φ25 mm; posición de instalación del burbujeador: directamente debajo del impulsor de agitación.

[0424] ··Reactor 2

[0425] Diámetro de la bolsa del tanque de cultivo: 0,96 m; altura total de la bolsa del tanque de cultivo: 1,8 m; volumen de líquido con el que el tanque de cultivo puede llenarse al máximo: 1.000 l; nivel de líquido en la bolsa del tanque de cultivo (1.000 l): 1,45 m; impulsor de agitación: 3 palas (ángulo de pala: 40 °); diámetro de agitación: 318 mm; tipo de burbujeador: metálico sinterizado; forma del burbujeador: disco plano; diámetro de poro del burbujeador: 20 µm; tamaño del burbujeador: 8 discos de φ25 mm; posición de instalación del burbujeador: directamente debajo del impulsor de agitación.

[0426] La distribución del diámetro de la burbuja y kLa se midieron mediante el método descrito anteriormente.

[0427] Además, en cada uno de los ejemplos y ejemplos comparativos, en un caso en el que el burbujeador está compuesto por una pluralidad de unidades, el caudal de gas era ajustable para cada unidad.

[0428] Además, en la tabla 3, la descripción en la columna de "rotación de agitación" indica la velocidad de rotación de la paleta de agitación, y la descripción en la columna de "P/V de agitación" indica el par de agitación (la potencia requerida para la agitación por unidad de volumen de líquido (W/m<3>)).

[0429] En la tabla 3, la descripción en la columna de "diámetro del orificio" indica el diámetro medio del orificio de la parte de descarga de gas en el burbujeador descrito anteriormente.

[0430] En la tabla 3, la descripción de "metal sinterizado" en la columna "Tipo" indica que el burbujeador tiene un filtro de metal sinterizado (un elemento de metal sinterizado fabricado por SMC Corporation, hecho de acero inoxidable) en la porción de descarga de gas, la descripción de "malla de poliéster" indica que el burbujeador tiene una malla de poliéster (PETEX, 07-350/34, fabricado por Sefar Filtration Inc.) en la porción de descarga de gas, la descripción de "película permeable al gas" indica que el burbujeador tiene una película permeable al gas (Tyvek 1059B) en la porción de descarga de gas.

[0431] En la tabla 3, la descripción de "forma" indica la forma de la porción de suministro de gas en el burbujeador; la descripción de "cilindro" indica que la porción de suministro de gas en el burbujeador tiene una forma de cilindro, la descripción de "plano circular" indica que la forma de la porción de descarga de gas en el burbujeador es una forma de plano circular, y la descripción del "plano cuadrangular indica que la forma de la porción de descarga de gas del burbujeador es una forma de plano cuadrangular.

[0432] En la tabla 3, la descripción en la columna de "superficie de un burbujeador" indica la superficie media por burbujeador.

[0433] En la tabla 3, la descripción en la columna de "número de unidades" indica el número de unidades de burbujeador utilizadas.

[0434] En la tabla 3, la descripción en la columna "número de burbujeadores por unidad" indica el número de burbujeadores incluidos en cada unidad de burbujeador.

[0435] En la tabla 3, la descripción en la columna de "número total de burbujeadores" indica el número de todos los burbujeadores incluidos en el recipiente de cultivo.

[0436] En la tabla 3, la descripción en la columna "caudal de aire por unidad" indica el caudal del gas de aire suministrado a cada unidad de burbujeador.

[0437] En la tabla 3, en las descripciones en las columnas descritas como X, ZL, D, A, Zs y Q, X, ZL, D, A, Zs y Q son como se describió anteriormente.

[0438] Evaluación del daño celular

[0439] El daño a las células se estimó según los siguientes criterios de evaluación, y los resultados de la evaluación se muestran en la tabla a continuación. A partir de los resultados del ejemplo de referencia 1 y el ejemplo de referencia 2 descritos anteriormente, se especula que el daño celular puede estimarse mediante los siguientes criterios de evaluación. El resultado de la evaluación satisface preferiblemente los criterios de evaluación A, B o C.

[0440] Criterios de evaluación

[0441] A: El diámetro del burbujeador es de 10 µm o más, y el caudal de oxígeno es de 0.03 vvm o menos.

[0442] B: El diámetro del burbujeador es de 2 µm o más, y el caudal de oxígeno es de 0,05 vvm o menos, pero A no es aplicable.

[0443] C: El diámetro del burbujeador es de 1 µm o más, y el caudal de oxígeno es de 0.1 vvm o menos, pero ninguno de A y B es aplicable.

[0444] D: Ninguno de A, B y C es aplicable.

[0445] Evaluación de la capacidad de suministro de oxígeno

[0446] La capacidad de suministro de oxígeno se estimó según los siguientes criterios de evaluación, y los resultados de la evaluación se muestran en la tabla a continuación. Se especula que la mayor kLa permite el cultivo a la mayor concentración celular. El resultado de la evaluación satisface preferiblemente los criterios de evaluación A, B o C.

[0447] Criterios de evaluación

[0448] A: kLa es 25 o más (correspondiente a un número de células de aproximadamente 8 × 10<7>células/ml o más). B: kLa es 20 o más y menos de 25 (correspondiente a un número de células de aproximadamente 6 × 10<7>células/ml a 8 × 10<7>células/ml).

[0449] C: kLa es 15 o más y menos de 20 (correspondiente a un número de células de aproximadamente 4 × 10<7>células/ml a 6 × 10<7>células/ml).

[0450] D: kLa es menor que 15.

[0451] Resistencia a la bolsa de cultivo

[0452] La resistencia de la bolsa de cultivo se evaluó mediante un método descrito en (1) a (5) a continuación.

[0453] Como bolsa de cultivo, se usó una bolsa de tanque de cultivo que tenía el diámetro y la altura total descritos en el reactor 1 o el reactor 2. Se usó una película de polietileno doble para la bolsa. Específicamente, la bolsa se hizo de modo que la superficie de contacto con el líquido se formara de ASIPL-01026 (espesor: aproximadamente 150 µm) y la superficie exterior se formara de ASIPL-01029 (espesor: aproximadamente 150 µm).

[0454] En un caso en el que el área del burbujeador es demasiado grande, el peso del burbujeador aumenta o la superficie de unión entre el burbujeador y la bolsa aumenta y, por lo tanto, la carga se aplica a la bolsa de cultivo, lo que hace que la bolsa de cultivo se dañe fácilmente.

[0455] (1) La bolsa de cultivo está montada en el cuerpo principal del tanque de cultivo.

[0456] (2) La solución de medición anterior con la que se llena al máximo la bolsa se envía a la bolsa de cultivo.

[0457] (3) La solución se drena de la bolsa de cultivo.

[0458] (4) La bolsa de cultivo se desmonta del tanque de cultivo.

[0459] (5) (1) a (4) se repiten hasta que la bolsa de cultivo se dañe (hasta que se formen orificios y/o la solución se filtre). La evaluación se realizó según los siguientes criterios de evaluación. El resultado de la evaluación satisface preferiblemente los criterios de evaluación A, B o C.

[0460] Criterios de evaluación

[0461] A: No se observa ningún daño incluso en el caso en el que la bolsa de cultivo se monta y se desmonta del tanque de cultivo tres veces.

[0462] B: No se observa ningún daño incluso en el caso en el que la bolsa de cultivo se monta en y se desmonta del tanque de cultivo dos veces, pero el daño se observa en el caso en el que la bolsa de cultivo se monta en y se desmonta del tanque de cultivo tres veces.

[0463] C: No se observa ningún daño incluso en el caso en el que la bolsa de cultivo se monta en y se desmonta del tanque de cultivo una vez, pero el daño se observa en el caso en el que la bolsa de cultivo se monta en y se desmonta del tanque de cultivo dos veces.

[0464] D: Se observa daño de la bolsa de cultivo después del primer montaje y desmontaje.

[0465] En la tabla 3, la descripción en la columna de "diámetro del recipiente de cultivo" indica el diámetro de círculo equivalente del recipiente de cultivo calculado según la expresión (4 × X/ZL/3,14)<0,5>.

[0466] En la tabla 4, la descripción en la columna de "ZL/D" indica el valor de ZL/(4 × X/ZL/3,14)<0,5>en la expresión 6-2. Además, en la tabla 4, la descripción en la columna de "expresión 3-1" indica el valor de (Q/A/60)/[{3 × 10<-8>× (ρl -ρg) × g}/(18 × µl)}] en la expresión 3-1.

[0467] Además, en la tabla 4, la descripción en la columna de "expresión 5-1" indica el valor de {Dv<2>× 10<-12>× (ρl-pg) × g/(18 × µl)} en la expresión 5-1.

[0468] En la tabla 4, para el cálculo, se utilizan una aceleración gravitacional g = 9,8 m/s<2>, una densidad de solución de medición ρl (kg/m<3>) = 1.000 kg/m<3>, una densidad de gas de aire ρg = 1,293 kg/m<3>y una viscosidad de solución de medición µl = 8,9 × 10<-4>kg/m/s.

[0469] En la tabla 4, la descripción en la columna de "Relación de volumen acumulado de burbujas que tienen un diámetro de burbuja de 20 µm a 500 µm" indica la relación del volumen acumulado de burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de 20 µm a 500 µm con respecto al volumen total de las burbujas en la distribución de diámetro de burbuja.

[0470] En la tabla 4, la descripción en la columna de "concentración celular supuesta" indica la concentración celular estimada a partir del contenido del ejemplo de referencia 1 y el ejemplo de referencia 2 y el valor de kLa medido. En la tabla 4, las descripciones en las columnas descritas como A/X, Q/A, Q/X, Zs/ZL, Dv y kLa respectivamente indican los valores de los parámetros correspondientes descritos anteriormente.

[0471] A partir de los resultados mostrados en la tabla 3 y la tabla 4, puede observarse que el método de cultivo celular según la presente divulgación permite el cultivo celular a una concentración celular alta incluso en un caso en el que el volumen de suspensión celular es grande, y se suprime el daño a las células.

[0472] Explicación de referencias

[0473] 10: burbujeador (burbujeador de metal sinterizado)

[0474] 11: paleta de agitación

[0475] 12: filtro de metal sinterizado

[0476] 14: porción de soporte

[0477] 16: porción de suministro de gas

[0478] 20: unidad de filtro

[0479] 20a: entrada

[0480] 20b: salida

[0481] 20c: salida de eyección

[0482] 21: recipiente

[0483] 22: lado de suministro

[0484] 23: lado de permeación

[0485] 24: membrana de filtro

[0486] 40: depósito de recogida

[0487] 51: a 56 canales de flujo

[0488] 60: manómetro

[0489] 62, 64, 66, 68, 70, 74, 76: flechas

[0490] 100: recipiente de cultivo

[0491] 102: suspensión celular

[0492] 104: superficie inferior interna

[0493] 110: unidad de burbujeo

[0494] 112: porción de suministro de gas

[0495] 200: dispositivo de cultivo celular

[0496] PU1 a PU3: bombas

[0497] A: puerto de suministro de medio fresco

[0498] B: migración de la suspensión celular utilizada para el tratamiento de sangrado celular C: migración del líquido permeado utilizado para el tratamiento de purificación Válvula de pinzamiento en V

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Método de cultivo celular que comprende:

usar un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células; y descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular desde un burbujeador dispuesto en el recipiente de cultivo para cultivar las células,

en donde un diámetro de orificio promedio de una porción de descarga de gas en el burbujeador es de 1 µm o más y 300 µm o menos,

las células que se van a cultivar son células animales, y

un área de superficie A (m<2>) de la porción de descarga de gas en el burbujeador, un volumen X (m<3>) de la suspensión celular en el recipiente de cultivo y un caudal Q (m<3>/min) del gas que se descarga del burbujeador satisfacen la expresión 1-1, la expresión 1-2 y la expresión 1-3,

2. Método de cultivo celular según la reivindicación 1, en donde en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza por una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, se envía un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv (µm) de burbujas del gas de aire satisface la expresión 2-1,

3. Método de cultivo celular según la reivindicación 1 o 2, en donde en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza por una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, se envía un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, en la distribución de diámetro de burbuja, una proporción de un volumen acumulado de burbujas de aire que tienen un diámetro de burbuja de 20 µm o más y 500 µm o menos es del 30 % en volumen o más de un volumen total de las burbujas en la distribución de diámetro de burbuja.

4. Método de cultivo celular según un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde un coeficiente de capacidad de transferencia de oxígeno kLa (hr<-1>) por el burbujeador en el cultivo es 15 o más.

5. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato de sodio, se envía un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, el Q (m<3>/min), el A (m<2>), una densidad pl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad pg (kg/m<3>) del gas de aire, una viscosidad µl (kg/m/s) de la solución de medición y una aceleración gravitacional g (m/s<2>) satisfacen la expresión 3-1,

6. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde en el cultivo, Q (m<3>/min) y A (m<2>) satisfacen la expresión 4-1,

7. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde en un caso en el que la suspensión celular en el recipiente de cultivo se reemplaza con una solución de medición que es agua pura que contiene 1 g/l de poloxámero 188, 7 g/l de cloruro de sodio y 2 g/l de hidrogenocarbonato

de sodio, se envía un gas de aire que tiene el mismo caudal que el Q (m<3>/min) en el cultivo desde el burbujeador a la solución de medición, y se mide una distribución de diámetro de burbuja en una salida de descarga de gas del burbujeador, un nivel de líquido ZL (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular en el cultivo, una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación del burbujeador, un diámetro de burbuja promedio en volumen Dv (µm) de burbujas en la distribución de diámetro de burbuja, una densidad pl (kg/m<3>) de la solución de medición, una densidad pg (kg/m<3>) de el gas de aire, una aceleración gravitacional g (m/s<2>) y una viscosidad µl (kg/m/s) de la solución de medición satisfacen la expresión 5-1,

8. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde X (m<3>), un nivel de líquido ZL (m) desde una superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie superior de la suspensión celular, y una altura Zs (m) desde la superficie inferior interna del recipiente de cultivo hasta una superficie de instalación de burbujeador satisfacen la expresión 6-1 y la expresión 6-2,

9. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde una concentración celular en la suspensión celular es de 4 x 10<7>células/ml o más.

10. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde un método para cultivar células es el cultivo de perfusión.

11. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el recipiente de cultivo es un tanque de cultivo de un solo uso.

12. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde se incluye una pluralidad de los burbujeadores como burbujeador.

13. Método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el burbujeador está configurado para incluir una pluralidad de unidades, incluyendo cada una uno o más burbujeadores, y el caudal del gas se ajusta para cada una de las unidades.

14. Método de producción de producto que comprende:

cultivar células con el método de cultivo celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y obtener un producto producido por las células cultivadas.

15. Dispositivo de cultivo celular que comprende:

un recipiente de cultivo que contiene una suspensión celular que contiene células, en el que se cultivan las células, y

un burbujeador para descargar un gas que incluye 30 % en volumen o más de oxígeno en la suspensión celular en el recipiente de cultivo,

en donde un diámetro de orificio promedio del rociador es de 1 µm o más y 300 µm o menos, y un área A (m<2>) del burbujeador y un volumen Xmax (m<3>) de la suspensión celular con la que se puede llenar al máximo el recipiente de cultivo satisfacen la expresión 7-1 y la expresión 7-2,