ES3071645T3 - Aerosolized compositions comprising mitochondria and methods of use thereof - Google Patents

Aerosolized compositions comprising mitochondria and methods of use thereof

Info

Publication number
ES3071645T3
ES3071645T3 ES24188510T ES24188510T ES3071645T3 ES 3071645 T3 ES3071645 T3 ES 3071645T3 ES 24188510 T ES24188510 T ES 24188510T ES 24188510 T ES24188510 T ES 24188510T ES 3071645 T3 ES3071645 T3 ES 3071645T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mitochondria
composition
mitochondrial
lung
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES24188510T
Other languages
English (en)
Inventor
James D Mccully
Nido Pedro J Del
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boston Children's Hospital
Original Assignee
Boston Children's Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston Children's Hospital filed Critical Boston Children's Hospital
Application granted granted Critical
Publication of ES3071645T3 publication Critical patent/ES3071645T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B6/00—Apparatus or devices for radiation diagnosis; Apparatus or devices for radiation diagnosis combined with radiation therapy equipment
    • A61B6/52—Devices using data or image processing specially adapted for radiation diagnosis
    • A61B6/5211—Devices using data or image processing specially adapted for radiation diagnosis involving processing of medical diagnostic data
    • A61B6/5217—Devices using data or image processing specially adapted for radiation diagnosis involving processing of medical diagnostic data extracting a diagnostic or physiological parameter from medical diagnostic data
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1203—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules in a form not provided for by groups A61K51/1206 - A61K51/1296, e.g. cells, cell fragments, viruses, virus capsides, ghosts, red blood cells, viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/08—Clinical applications
    • A61B8/0883—Clinical applications for diagnosis of the heart
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B8/00—Diagnosis using ultrasonic, sonic or infrasonic waves
    • A61B8/48—Diagnostic techniques
    • A61B8/481—Diagnostic techniques involving the use of contrast agents, e.g. microbubbles introduced into the bloodstream

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

Esta divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas en aerosol que contienen mitocondrias, métodos para preparar y utilizar dichas composiciones, y dispositivos para administrarlas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] Composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias y métodos de uso de las mismasDescripción
[0002] CAMPO TÉCNICO
[0003] La presente divulgación se refiere a composiciones aerosolizadas que contienen mitocondrias, métodos de preparación y uso de las composiciones, y dispositivos para administrar las composiciones.
[0004] ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
[0005] Las mitocondrias son orgánulos unidos por doble membrana que se encuentran en el citoplasma de células eucariotas nucleadas. Se encuentran en casi todas las células del cuerpo humano, excepto en los glóbulos rojos. Son el sitio principal del metabolismo energético de la célula y generan trifosfato de adenosina (ATP) para diferentes funciones celulares. Normalmente, más del 90 % de las necesidades de ATP de una célula son cubiertas por las propias mitocondrias de la célula.
[0006] Las mitocondrias están compuestas por dos membranas concéntricas, que tienen funciones especializadas. La membrana mitocondrial interna contiene proteínas para la ATP sintasa. La membrana mitocondrial externa, que contiene un gran número de proteínas integrales de membrana, encierra todo el orgánulo.
[0007] La estructura de las mitocondrias tiene sorprendentes similitudes con la de algunos procariotas modernos. De hecho, se cree que las mitocondrias se originaron a partir de una antigua simbiosis cuando una célula nucleada envolvió a un procariota aeróbico. En la relación de simbiosis, la célula hospedadora pasó a depender del procariota engullido para la producción de energía, y la célula procariota comenzó a depender del entorno protector proporcionado por la célula hospedadora.
[0008] Debido a la función principal de las mitocondrias en el metabolismo celular, el daño y la disfunción en las mitocondrias pueden causar una variedad de enfermedades humanas. El daño a las mitocondrias puede ser causado por lesiones, toxicidad, quimioterapia y cambios relacionados con la edad. En particular, la lesión por isquemia/reperfusión puede causar daño mitocondrial, lo que tendrá un impacto negativo en el consumo de oxígeno y la síntesis de energía. Los tratamientos que involucran las mitocondrias pueden ser particularmente útiles para los trastornos relacionados con las mitocondrias. Algunos tratamientos tempranos implican la administración de mitocondrias mediante inyección intramuscular e inyección intraarterial. Existe la necesidad de administrar mitocondrias a varios sitios objetivo de un sujeto a través de diferentes vías de administración para diversos propósitos.
[0009] SUMARIO
[0010] La presente divulgación proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones aerosolizadas) que contienen mitocondrias, métodos de preparación y uso de las composiciones, y dispositivos para administrar las composiciones. En un aspecto, la divulgación proporciona métodos para administrar una composición que contiene mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a través del tracto respiratorio. En algunas realizaciones, la composición es una composición aerosolizada. En algunas realizaciones, la composición es una solución líquida. En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio, comprendiendo el método administrar una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias al sujeto a través del tracto respiratorio.
[0011] En algunas realizaciones, la composición es una composición aerosolizada. En algunas realizaciones, la composición se convierte en una forma de aerosol antes de la administración al sujeto mediante el uso de un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador de dosis medida presurizado, o un inhalador de dosis medida presurizado activado por la respiración.
[0012] En algunas realizaciones, la forma de aerosol de la composición comprende gotículas que tienen un tamaño medio de 0,01 a 1000 microlitros (por ejemplo, de 0,1 a 1000 microlitros, de 1 a 1000 microlitros, de 0,1 a 100 microlitros, de 0,1 a 500 microlitros o de 1 a 500 microlitros). En algunas realizaciones, la gotícula tiene un tamaño de al menos 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 microlitros. En algunas realizaciones, la gotícula tiene un tamaño menor a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 microlitros.
[0013] En algunas realizaciones, la composición comprende mitocondrias con capacidad respiratoria.
[0014] En algunos casos, el sujeto presenta insuficiencia respiratoria, función respiratoria reducida, inflamación pulmonar, carcinoma pulmonar, arrugas en la piel, calvicie y/o cáncer. En algunos casos, el sujeto presenta una lesión pulmonar aguda.
[0015] En algunas realizaciones, la concentración de mitocondrias en la composición es aproximadamente 1x10<4>a 5 x 10<9>ml<-1>(por ejemplo, aproximadamente 1x10<5>a 5 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<6>a 5 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<7>a 5 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<5>a 1 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<6>a 1 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<7>a 1 x 10<8>ml<-1>, 1 x 10<6>a 5 x 10<7>ml<-1>, 1 x 10<6>a 1 x 10<7>ml<-1>, 1 x 10<6>a 5 x 10<7>ml<-1>, 5 x 10<6>a 1x10<8>ml<-1>). En algunas realizaciones, la concentración es al menos o aproximadamente 1 x 10<4>ml<-1>, 5 x 10<4>ml<-1>, 1 x 10<5>ml<-1>, 5 x 10<5>ml<-1>, 1 x 10<6>ml<-1>, 5 x 10<6>ml<-1>, 1 x 10<7>ml<-1>, 5 x 10<7>ml<-1>, 1 x 10<8>ml<-1>, 5 x 10<8>ml<-1>o 1 x 10<9>ml<-1>, 5 x 10<9>ml<-1>o 1 x 10<10>ml<-1>. En algunas realizaciones, la concentración es inferior a 1 x 10<4>ml<-1>, 5 x 10<4>ml<-1>, 1 x 10<5>ml<-1>, 5 x 10<5>ml<-1>, 1 x 10<6>ml<-1>, 5 x 10<6>ml<-1>, 1 x 10<7>ml<-1>, 5 x 10<7>ml<-1>, 1 x 10<8>ml<-1>, 5 x 10<8>ml<-1>o 1 x 10<9>ml<-1>, 5 x 10<9>ml<-1>o 1 x 10<10>ml<-1>.
[0016] En algunas realizaciones, al sujeto se le administra 1 x 10<5>a 1 x 10<9>de mitocondrias por dosis (por ejemplo, 1 x 10<5>a 5 x 10<8>, 1 x 10<6>a 5 x 10<8>, 1 x 10<7>a 5 x 10<8>, 1 x 10<5>a 1 x 10<8>, 1 x 10<6>a 1 x 10<8>, 1 x 10<7>a 1 x 10<8>, 1 x 10<6>a 5 x10<7>, 1 x 10<6>a 1 x 10<7>, 1 x 10<6>a 5 x 10<7>, 5 x 10<6>a 1 x 10<8>mitocondrias por dosis). En algunas realizaciones, la dosis es al menos 1 x 10<4>, 5 x 10<4>, 1 x 10<5>, 5 x 10<5>, 1 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 5 x 10<8>o 1 x 10<9>, 5 x 10<9>o 1 x 10<10>mitocondrias por dosis. En algunas realizaciones, la dosis es inferior a 1 x 10<4>, 5 x 10<4>, 1 x 10<5>, 5 x 10<5>, 1 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 5 x 10<8>o 1 x 10<9>, 5 x 10<9>o 1 x 10<10>mitocondrias por dosis.
[0017] En algunos casos, las mitocondrias son autógenas, alogénicas o xenogénicas.
[0018] En algunas realizaciones, la composición comprende además una solución seleccionada del grupo que consiste en: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma. En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más osmolitos seleccionados del grupo que consiste en: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina.
[0019] En algunas realizaciones, la composición incluye además un agente farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición comprende además un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0020] En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a las mitocondrias mediante un enlace covalente, está incrustado en las mitocondrias o está internalizado dentro de las mitocondrias. En algunas realizaciones, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico es un agente de diagnóstico terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a las mitocondrias mediante un enlace covalente.
[0021] En algunas realizaciones, el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está incrustado o internalizado en las mitocondrias.
[0022] En algunas variantes, las mitocondrias están modificadas genéticamente.
[0023] En algunas realizaciones, las mitocondrias comprenden polipéptidos exógenos.
[0024] En algunas realizaciones, las mitocondrias comprenden polinucleótidos exógenos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARN nucleares o ARNip.
[0025] En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición aerosolizada que comprende una pluralidad de gotículas líquidas que comprenden un tampón, en donde al menos una gotícula líquida en la pluralidad de gotículas líquidas comprende al menos una mitocondria.
[0026] En algunas realizaciones, el tampón se selecciona del grupo que consiste en: K+-HEPES con un pH de 7 a 8, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), suero y plasma.
[0027] En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más osmolitos seleccionados del grupo que consiste en: trehalosa, sacarosa, manosa, glicina, prolina, glicerol, manitol, sorbitol, betaína y sarcosina.
[0028] En algunas realizaciones, la composición incluye además un agente farmacéutico.
[0029] En algunas realizaciones, la composición comprende además un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0030] En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, está incrustado en la mitocondria o está internalizado dentro de la mitocondria.
[0031] En algunas realizaciones, el agente mitocondrial se selecciona del grupo que consiste en un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico o un agente de diagnóstico.
[0032] En algunas realizaciones, el agente mitocondrial comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el agente mitocondrial está unido a la mitocondria por un enlace covalente. En algunas realizaciones, el agente mitocondrial está incrustado en o internalizado dentro de la mitocondria.
[0033] En algunas realizaciones, la pluralidad de gotículas tienen un tamaño medio de 1 a 1000 microlitros.
[0034] En algunas realizaciones, la mitocondria está modificada genéticamente.
[0035] En algunas realizaciones, la mitocondria comprende polipéptidos exógenos.
[0036] En algunas realizaciones, la mitocondria comprende polinucleótidos exógenos.
[0037] En algunas realizaciones, las mitocondrias antes de la administración al sujeto se incuban con una composición que comprende una enzima.
[0038] En algunas realizaciones, la composición comprende mitocondrias autólogas, mitocondrias alogénicas, mitocondrias xenogénicas o una mezcla de las mismas.
[0039] En un aspecto, la divulgación se refiere a un dispositivo para administrar mitocondrias a un sujeto a través del tracto respiratorio, comprendiendo el dispositivo: una carcasa; un depósito ubicado dentro de la carcasa para una composición que contiene mitocondrias; un generador de aerosoles para producir una forma de aerosol de la composición; y una salida a través de la cual la composición se administra al tracto respiratorio del sujeto.
[0040] En algunas realizaciones, el dispositivo es un nebulizador, un pulverizador nasal o un inhalador. En algunas realizaciones, el generador de aerosol es un nebulizador ultrasónico.
[0041] En algunas realizaciones, el generador de aerosol es un dispositivo de malla vibratoria. En algunas realizaciones, el generador de aerosol comprende un compresor de aire, en donde el compresor de aire hace que el aire comprimido fluya a través de la composición y convierte la composición en una forma de aerosol.
[0042] En un aspecto, la divulgación proporciona un dispositivo para administrar mitocondrias a un sujeto a través del tracto respiratorio, el cual comprende: una carcasa; una composición que comprende mitocondrias dispuestas dentro de la carcasa; y una salida configurada para administrar la composición desde la carcasa al tracto respiratorio del sujeto y aerosolizar la composición a medida que esta pasa a través de él.
[0043] Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que suele entender una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. En el presente documento se describen los métodos y materiales que se utilizan en la presente invención; también se pueden utilizar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
[0044] Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras, así como de las reivindicaciones.
[0045] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0046] La Figura 1es un diagrama esquemático que muestra un método para aislar mitocondrias.
[0047] La Figura 2Aes un tejido muscular esquelético que se obtuvo utilizando un sacabocados para biopsias.
[0048] La Figura 2Bson imágenes microscópicas de mitocondrias aisladas bajo iluminación de contraste de fase (campo claro, BF) (panel izquierdo), bajo fluorescencia marcada con MitoTracker Red CMXRos (panel central) y la imagen combinada (el panel derecho).
[0049] La Figura 2Ces un gráfico que muestra los resultados del rendimiento de mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido.
[0050] La Figura 2Dson imágenes de microscopía electrónica de transmisión de mitocondrias aisladas.
[0051] La Figura 2Ees un gráfico de barras que muestra los resultados de los ensayos de actividad del complejo mitocondrial I-V.
[0052] La Figura 2Fes un gráfico de barras que muestra los resultados del consumo de oxígeno en el estado 3 (activo) (respiración estimulada por ADP).
[0053] La Figura 2Ges un gráfico de barras que muestra los resultados del índice de control respiratorio (RCI; estado 3/estado 4) para el consumo de oxígeno inducido por malato (complejo I) e inducido por succinato (complejo II) en mitocondrias autólogas del músculo pectoral mayor.
[0054] La Figura 3Ason imágenes de microscopio superpuestas que revelan mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de los cardiomiocitos.
[0055] La Figura 3Bson imágenes de microscopio superpuestas que revelan mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de los cardiomiocitos.
[0056] La Figura 3Cson imágenes de microscopio superpuestas que revelan mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de los cardiomiocitos.
[0057] La Figura 3Dson imágenes de microscopio superpuestas que revelan mitocondrias trasplantadas localizadas dentro de los cardiomiocitos.
[0058] La Figura 4Aes una imagen que muestra una imagen transversal representativa obtenida mediante tomografía por emisión de positrones (PET) de ratas a las que se les administró<18>F Rodamina 6-G mitocondrias (6 x 10<7>) administrada a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
[0059] La Figura 4Bes una imagen que muestra una imagen coronal representativa obtenida por PET de ratas a las que se les administró<18>F Rodamina 6-G mitocondrias (6 x 10<7>) administrada a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
[0060] La Figura 4Ces una imagen que muestra una imagen representativa de los pulmones obtenida mediante PET de ratas a las que se les administró<18>F Rodamina 6-G mitocondrias (6 x 10<7>) administrada a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar.
[0061] La Figura 5Aes una imagen de tinción inmunohistoquímica de tejido pulmonar de ratón tras la administración de mitocondrias exógenas mediante un nebulizador.
[0062] La Figura 5Bes una imagen de tinción inmunohistoquímica de tejido pulmonar de ratón tras la administración de mitocondrias exógenas por vía arterial pulmonar.
[0063] La Figura 6son imágenes de pulmones de ratón tras 2 horas de isquemia aguda por lesión pulmonar (ALI) en el pulmón izquierdo y 24 horas de recuperación. El círculo rojo indica los pulmones que se someten al procedimiento ALI. El pulmón derecho se indica con la letra R, el pulmón izquierdo con la letra L. El corazón (H) se muestra en el centro.
[0064] La Figura 7Aes un gráfico de barras que muestra la resistencia pulmonar en los pulmones de ratones (n=4) sometidos a 2 horas de isquemia en el pulmón izquierdo después de 24 horas de recuperación. El vehículo o las mitocondrias se administraron por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o mediante nebulizador (N).
[0065] La Figura 7Bes un gráfico de barras que muestra la elastancia en los pulmones de ratones sometidos a 2 horas de isquemia en el pulmón izquierdo tras 24 horas de recuperación. El vehículo o las mitocondrias se administraron por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o mediante nebulizador (N).
[0066] La Figura 8Aes un gráfico de barras que muestra la cuantificación del ADNmt libre circulante determinado por PCR en tiempo real en muestras de sangre completa en ratones BALB/cJ que recibieron solo tampón de respiración (Sham) o mitocondrias (3 x 10<7>de mitocondrias en tampón de respiración).
[0067] LaFigura 8Bson imágenes de tejido pulmonar teñido con hematoxilina y eosina.
[0068] La Figura 8Cson imágenes de tejido pulmonar teñido con la tinción tricrómica de Masson.
[0069] La Figura 8Dson imágenes de microscopía electrónica de transmisión de los tejidos pulmonares del lóbulo inferior derecho.
[0070] La Figura 9Aes una imagen que muestra la cuantificación de la captación mitocondrial y la biodistribución. Imágenes PET-microCT de Mitocondrias marcadas con<18>F-rodamina 6G (1 x 10<9>) administradas a los pulmones de ratas Wistar mediante inyección en el tronco pulmonar.
[0071] La Figura 9Bes una imagen que muestra la cuantificación de la captación mitocondrial y la biodistribución. Imágenes PET-microCT de mitocondrias marcadas con<18>F-rodamina 6G (1 x 10<9>) administradas a los pulmones de ratas Wistar en forma de aerosol mediante nebulización.
[0072] La Figura 10Aes una imagen inmunohistoquímica (100x) que muestra mitocondrias exógenas de fibroblastos cardíacos humanos, administradas a través de la vía vascular, siendo captadas por el tejido pulmonar.
[0073] La Figura 10Bes una imagen inmunohistoquímica (100x) que muestra mitocondrias exógenas de fibroblastos cardíacos humanos, administradas mediante nebulización, siendo absorbidas por el tejido pulmonar.
[0074] La Figura 11Aes un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la distensibilidad dinámica para pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular.
[0075] La Figura 11Bes un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar en cuanto a la resistencia de los pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular.
[0076] La Figura 11Ces un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la amortiguación tisular para pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular.
[0077] La Figura 11Des un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la capacidad inspiratoria para pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular.
[0078] La Figura 11Ees un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la presión inspiratoria máxima para pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular.
[0079] La Figura 12Amuestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la distensibilidad dinámica para pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
[0080] La Figura 12Bes un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar en cuanto a la resistencia de los pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
[0081] La Figura 12Ces un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la amortiguación tisular para pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
[0082] La Figura 12Des un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de la función pulmonar de la capacidad inspiratoria para pulmones que reciben mitocondrias mediante nebulización.
[0083] La Figura 12Ees un gráfico de barras que muestra los resultados de del análisis de la función pulmonar de la presión respiratoria máxima para pulmones que reciben mitocondrias vía nebulización.
[0084] La Figura 13muestra los resultados del análisis de la función pulmonar, en particular los bucles representativos de presión-volumen.
[0085] La Figura 14Ason imágenes que muestran tinción con hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TUNEL e imágenes de microscopía electrónica de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que reciben el vehículo a través de administración vascular; barras de escala: 500 μm.
[0086] La Figura 14Bson imágenes que muestran tinción con hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TU-NEL e imágenes de microscopía electrónica de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que reciben mitocondrias a través de la administración vascular; barras de escala: 500 μm.
[0087] La Figura 14Cson imágenes que muestran tinción con hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TU-NEL e imágenes de microscopía electrónica de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que recibieron el vehículo mediante nebulización; barras de escala: 500 μm.
[0088] La Figura 14Dson imágenes que muestran tinción con hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TU-NEL e imágenes de microscopía electrónica de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para pulmones que recibieron las mitocondrias mediante nebulización; barras de escala: 500 μm.
[0089] La Figura 14Eson imágenes que muestran tinciones de hematoxilina y eosina (H&E), tinción de mieloperoxidasa (MPO), TU-NEL e imágenes de microscopía electrónica de transmisión (EM) de secciones de tejido pulmonar para el grupo simulado; barras de escala: 500 μm.
[0090] La Figura 15Aes un gráfico de barras que muestra la gravedad de la lesión del tejido pulmonar a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo por vía vascular (Vehículo V), las mitocondrias por vía vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0091] La Figura 15Bes un gráfico de barras que muestra el recuento de neutrófilos a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0092] La Figura 15Ces un gráfico de barras que muestra los núcleos marcados con TUNEL por cada 100 núcleos a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo a través de la administración vascular (Vehículo V), las mitocondrias a través de la administración vascular (Mito V) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0093] La Figura 15Des un gráfico de barras que muestra la gravedad de la lesión del tejido pulmonar a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), las mitocondrias mediante administración vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0094] La Figura 15Ees un gráfico de barras que muestra el recuento de neutrófilos a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias mediante administración vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0095] La Figura 15Fes un gráfico de barras que muestra los núcleos marcados con TUNEL por cada 100 núcleos a las 24 horas de reperfusión para los pulmones que recibieron el vehículo mediante nebulización (Vehículo Neb), las mitocondrias mediante administración vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0096] La Figura 15Ges un gráfico de barras que muestra la relación peso húmedo/peso seco en porcentaje a las 24 horas de reperfusión para pulmones que recibieron vehículo por vía vascular (Vehículo V), mitocondrias por vía vascular (Mito V), vehículo por nebulización (Vehículo Neb), mitocondrias por vía vascular (Mito Neb) y el grupo simulado. Tras 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, se evaluaron secciones teñidas con H&E (15x) para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente; cuanto peor sea la lesión tisular, mayor será la puntuación (1-5). El análisis de la gravedad de la lesión tisular muestra una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas, sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones tratados con Mito V y Mito Neb, en comparación con los tratados con Vehículo V y Vehículo Neb.
[0097] La Figura 16muestra resultados cuantificados del análisis de citocinas del LBA; todos los valores se expresan como media ± SEM. n = 4 para todos los grupos.
[0098] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0099] La presente divulgación se refiere a composiciones que contienen mitocondrias (por ejemplo, mitocondrias viables y funcionales), métodos para preparar y utilizar dichas composiciones, y dispositivos para administrar las composiciones al tracto respiratorio de un sujeto. La presente divulgación demuestra que las mitocondrias pueden administrarse eficazmente al sujeto a través del tracto respiratorio, y que la administración de la composición en forma de aerosol que contiene mitocondrias al tracto respiratorio es, inesperadamente, tan eficaz como la administración intraarterial.
[0100] La presente divulgación también proporciona métodos que permiten generar de forma segura y fiable composiciones farmacéuticas que comprenden mitocondrias viables y funcionales. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden tener un mayor valor terapéutico, un mayor valor comercial y un menor coste de producción por dosis terapéutica.
[0101] En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para administrar mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a las células que recubren y rodean el tracto respiratorio. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser absorbidas por las células y, una vez localizadas intracelularmente, las mitocondrias son capaces de conferir uno o más efectos biológicos. Estos efectos biológicos incluyen, entre otros, la producción de energía para la célula mediante la respiración, la producción de ATP (es decir, la conversión de ADP en ATP), la regulación del metabolismo celular, el inicio del ciclo del ácido cítrico o del ciclo de Krebs, la producción de calor, el almacenamiento de iones de calcio, la señalización a través de especies reactivas de oxígeno mitocondriales, la regulación del potencial de membrana, la inducción de la apoptosis (muerte celular programada), la participación en la señalización de calcio (por ejemplo, apoptosis inducida por calcio), la síntesis de hemo y/o esteroides, y el inicio de la señalización hormonal, etc.
[0102] Composiciones en aerosol
[0103] La presente divulgación proporciona composiciones en aerosol que comprenden mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados. La presente divulgación demuestra que los orgánulos celulares (por ejemplo, las mitocondrias) en una composición aerosolizada o en forma de aerosol pueden permanecer viables y funcionales, y por lo tanto pueden administrarse eficazmente al tracto respiratorio de un sujeto.
[0104] Según se utiliza en el presente documento, el término "aerosol" se refiere a una suspensión de partículas finas o gotículas en un gas portador. Según se utiliza en el presente documento, el término "aerosolización" se refiere al proceso o acto de convertir una composición en forma de aerosol. La composición aerosolizada comprende una pluralidad de partículas (por ejemplo, gotículas, partículas sólidas, gotículas líquidas o partículas de hidrogel). En algunas realizaciones, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de aproximadamente o menos de 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm o 1000 μm. En algunas realizaciones, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de aproximadamente o mayor de 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm o 1000 μm. En algunas realizaciones, la partícula tiene un tamaño (por ejemplo, un diámetro) de 500 nm a 10 μm, de 500 nm a 100 μm, de 1 μm a 10 μm, de 1 μm a 100 μm, de 5 μm a 100 μm, de 10 μm a 100 μm o de 1 μm a 500 μm. Según se utiliza en el presente documento, el término "diámetro" se refiere a la longitud del segmento de línea recta más largo cuyos extremos se encuentran ambos en la superficie de una partícula.
[0105] En algunas realizaciones, la composición aerosolizada comprende partículas (por ejemplo, gotículas) de diferentes tamaños. En algunas realizaciones, aproximadamente o al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de las partículas son de 500 nm a 10 μm, de 500 nm a 100 μm, de 1 μm a 10 μm, de 1 μm a 100 μm, de 5 μm a 100 μm, de 10 μm a 100 μm o de 1 μm a 500 μm.
[0106] En algunas realizaciones, las partículas en la composición aerosolizada pueden tener un tamaño medio (por ejemplo, un diámetro medio) de aproximadamente o menos de 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm,5 μm,6 μm, 7 μm,8 μm,9 μm, 10 μm,20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm,400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm o 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas pueden tener un tamaño medio (por ejemplo, un diámetro medio) de aproximadamente o mayor de 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm,90 μm,100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm o 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas pueden tener un tamaño medio (por ejemplo, un diámetro medio) de 500 nm a 10 μm, de 500 nm a 100 μm, de 1 μm a 10 μm, de 1 μm a 100 μm, de 5 μm a 100 μm, de 10 μm a 100 μm o de 1 μm a 500 μm. Según se utiliza en el presente documento, el término "tamaño medio" se refiere al tamaño medio (por ejemplo, el diámetro) determinado en función del volumen. Cuando se utiliza el término tamaño medio, se entiende que describe el tamaño de partícula que divide la población por la mitad, de manera que el 50 % de la población, en términos de volumen, es mayor o menor que este tamaño.
[0107] Las composiciones en aerosol pueden elaborarse mediante diversos dispositivos conocidos en la técnica. Los dispositivos ejemplares que pueden convertir la composición en una forma de aerosol antes de la administración incluyen, por ejemplo, un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador, un inhalador de niebla suave, un nebulizador de chorro, un nebulizador de ondas ultrasónicas, un inhalador de dosis medida presurizado, un inhalador de dosis medida presurizado activado por la respiración o un dispositivo de malla vibratoria. Estos dispositivos pueden utilizar diversos gases portadores, tales como, por ejemplo, oxígeno, aire, nitrógeno o aire comprimido.
[0109] La composición antes de la aerosolización puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un compuesto o composición útil para facilitar el almacenamiento, la estabilidad, la administración, la focalización celular y/o la entrega de las mitocondrias y/o del agente mitocondrial combinado. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, vehículos adecuados, diluyentes, disolventes, excipientes, modificadores de pH, osmolitos, sales, colorantes, modificadores de reología, lubricantes, recubrimientos, rellenos, agentes antiespumantes, polímeros, hidrogeles, tensioactivos, emulsionantes, adyuvantes, conservantes, fosfolípidos, ácidos grasos, mono-, di- y triglicéridos y sus derivados, ceras, aceites y agua. En algunas modalidades, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados se suspenden en agua, solución salina, tampón, tampón de respiración o tampón mitocondrial estéril para su administraciónin vivo. En una composición descrita en el presente documento pueden incluirse sales, soluciones tampón o sistemas tampón farmacéuticamente aceptables, incluyendo, sin limitación, solución salina, solución tampón de fosfato, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución tampón respiratoria. Los vehículos con capacidad para facilitar la entrega a una célulain vivo, tales como liposomas, pueden utilizar materiales para facilitar la administración de mitocondrias o de agentes mitocondriales combinados a las células objetivo.
[0111] Los ejemplos de soluciones tampón incluyen, pero no se limitan a, una solución tampón de respiración (por ejemplo, 250 mmol/l de sacarosa, 20 mmol/l de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/l de K+-EGTA, pH 8,0). Los osmolitos ejemplares incluyen, sin limitación, la trehalosa, la sacarosa, la manosa, la glicina, la prolina, el glicerol, el manitol, el sorbitol, la betaína y la sarcosina.
[0113] Mitocondrias aisladas y agentes mitocondriales combinados
[0115] Las mitocondrias que se utilizan en los métodos descritos aquí pueden aislarse o provenir de cualquier fuente, por ejemplo, de células o tejidos cultivados. Las células ejemplares incluyen, pero no se limitan a, células de tejido muscular, fibroblastos cardíacos, células cultivadas, células HeLa, células de cáncer de próstata, levadura, células sanguíneas, células cultivadas y, entre otras, cualquier mezcla de las mismas. Los tejidos ejemplares incluyen, pero sin limitación, el tejido hepático, el músculo esquelético, el corazón, el cerebro, la sangre y el tejido adiposo (por ejemplo, el tejido adiposo marrón). Las mitocondrias pueden aislarse de células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En algunos casos, las mitocondrias se aíslan de células con una modificación genética, por ejemplo, células con ADN mitocondrial modificado o ADN nuclear modificado.
[0117] Las mitocondrias pueden aislarse de células o tejidos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, se recogen muestras de tejido o de células y posteriormente se homogeneizan. Tras la homogeneización, las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación repetida. Como alternativa, el homogeneizado celular puede filtrarse a través de filtros de malla de nailon. Los métodos típicos para aislar mitocondrias se describen, por ejemplo, en McCully et al., Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection (Inyección de mitocondrias aisladas durante reperfusión temprana para cardioprotección), Am J Physiol 296, H94-H105. PMC2637784 (2009); Frezza et al., Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts (Aislamiento de orgánulos: mitocondrias funcionales de hígado, músculo y fibroblastos cultivados de ratón). Nature protocols, 2(2), 287-295 (2007); Patente US20180057610; y Patente US20180057610A1.
[0119] Las mitocondrias para el tratamiento pueden aislarse de células o tejidos de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En algunos casos, las mitocondrias se extraen de células o tejidos cultivados de un sujeto, y estas mitocondrias se le reintroducen al mismo sujeto. En otros casos, se recolectan mitocondrias de células o tejidos cultivados de un segundo sujeto, y estas mitocondrias se administran a un primer sujeto. En algunos casos, las mitocondrias se obtienen de células o tejidos cultivados de una especie diferente (por ejemplo, ratones, cerdos, levaduras).
[0120] La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un agente mitocondrial combinado. Los agentes mitocondriales combinados incluyen, por ejemplo, mitocondrias que están físicamente asociadas con un agente, como un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de imagen.
[0121] Un agente terapéutico puede ser cualquier agente que tenga un uso terapéutico o profiláctico. Entre los agentes terapéuticos ejemplares se incluyen, por ejemplo, agentes terapéuticos para trastornos relacionados con la isquemia, agentes citotóxicos para el tratamiento del cáncer, entre muchos otros. En algunos casos, las mitocondrias pueden suministrar agentes terapéuticos a células específicas, por ejemplo, a células tumorales. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un inhibidor intracelular, un desactivador, una toxina, una sustancia detenida y/o una sustancia citostática/citotóxica que, una vez dentro de una célula, inhibe, destruye, detiene, modifica y/o altera la célula de tal manera que ya no puede funcionar normalmente y/o sobrevivir. El agente terapéutico puede ser un agente que restaure la función adecuada de una célula, por ejemplo, un vector de ADN para la terapia génica. Un agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un compuesto inorgánico u orgánico; una molécula pequeña (de menos de 500 daltons) o una molécula grande; una molécula proteínica, como un péptido, polipéptido, proteína, proteína modificada postraduccionalmente o anticuerpo; o una molécula de ácido nucleico, como ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, ARN de doble cadena, ARN de cadena simple o una molécula de ácido nucleico de triple hélice. En algunas modalidades, un agente terapéutico puede ser un producto natural derivado de cualquier organismo conocido (por ejemplo, de un animal, una planta, una bacteria, un hongo, un protista o un virus) o de una biblioteca de moléculas sintéticas. En algunas realizaciones, un agente terapéutico puede ser un compuesto monomérico o polimérico. Algunos ejemplos de agentes terapéuticos incluyen agentes citotóxicos, vectores de ADN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), microARN (ARNmi), péptidos reactivos, nanopartículas, microesferas y moléculas fluorescentes.
[0122] Un agente de diagnóstico es un agente que tiene uso diagnóstico. Dado que las mitocondrias transportan un agente de diagnóstico al interior de la célula, en algunas modalidades, dicho agente puede diseñarse para determinar el estado interno de la célula, por ejemplo, el pH y el estrés oxidativo.
[0123] Un agente de contraste es una sustancia que se emplea para su uso en técnicas de imagen. Las técnicas o modalidades incluyen, entre otras, rayos X, tomografía computarizada (TC), resonancia magnética (RM), gammagrafía, fluorescencia, ultrasonido, etc. El agente de imagen puede ser fluorescente y/o radiactivo. En algunas realizaciones, un agente de obtención de imágenes también puede ser un agente de diagnóstico. Los agentes de obtención de imágenes ejemplares incluyen, pero sin limitación, los fluoróforos MitoTracker (Thermo Fisher Scientific Inc.), CellLight® RFP, BacMam 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.), los colorantes fluorescentes pHrodo sensibles al pH (Thermo Fisher Scientific Inc.),<18>F-Rodamina 6G,<18>Rodamina B marcada con flúor, nanopartículas magnéticas de óxido de hierro y nanopartículas a base de oro y platino.
[0124] Como se ha discutido anteriormente, un agente mitocondrial combinado comprende una mitocondria y un agente que están en contacto físico directo y/o indirecto entre sí. Por ejemplo, un agente puede estar vinculado a las mitocondrias, unido a ellas, incrustado en la membrana mitocondrial o total o parcialmente encerrado en ellas. En algunos casos, un agente farmacéutico puede unirse a las mitocondrias de forma covalente. En algunos casos, el agente se une a los componentes de la membrana mitocondrial directamente mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace carboxamida y un enlace disulfuro), o indirectamente mediante un conector (por ejemplo, un conector peptídico) u otro agente unido covalentemente. En otros casos, un agente puede unirse a las mitocondrias de forma no covalente, por ejemplo, a través de interacciones hidrofóbicas, interacciones de Van der Waals y/o interacciones electrostáticas, etc.
[0125] En algunas realizaciones, un agente mitocondrial combinado puede comprender dos o más tipos diferentes de agentes; por ejemplo, dos tipos diferentes de agentes terapéuticos, tres tipos diferentes de agentes de imagen, un agente terapéutico y un agente de imagen, un agente terapéutico y un agente de diagnóstico, etc. Un profesional experto comprenderá que cualquier variación es posible.
[0126] Un enlazador particularmente útil para unir las mitocondrias y un agente proporciona una liberación sostenida del agente tras la inyección. Esto puede lograrse, por ejemplo, utilizando un grupo funcional hidrazona. Por ejemplo, se forma una hidrazona para unir covalentemente un agente a los componentes de la membrana mitocondrial. Una vez que este agente mitocondrial combinado es absorbido por las células, el cambio de pH dará como resultado la hidrólisis de la hidrazona, liberando el agente unido dentro de la célula.
[0127] En algunas realizaciones, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de obtención de imágenes pueden unirse a la membrana mitocondrial externa utilizando química de superficie funcionalizada. En algunos casos, las químicas heterobifuncionales pueden unir un agente terapéutico, un agente de diagnóstico y/o un agente de imagen a la superficie mitocondrial, y una vez internalizados, estos agentes pueden liberarse mediante interacciones con esterasas intercelulares (por ejemplo, mediante la interacción con un éster acetoximetílico) o mediante una estrategia de activación con luz ultravioleta o luz infrarroja cercana. Las estrategias de activación con luz UV y activación con luz infrarroja cercana se describen, por ejemplo, en Zhou et al., "Progress in the Field of Constructing Near-Infrared Light-Responsive Drug De-livery Platforms (Avances en el campo del desarrollo de plataformas de administración de fármacos sensibles a la luz del infrarrojo cercano)", Journal of Nanoscience and Nanotech-nology 16.3 (2016): 2111-2125; Bansal et al., "Photocon-trolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications (Sistemas de administración de nanopartículas fotocontroladas para aplicaciones biomédicas)", Accounts of chemical research 47.10 (2014): 3052-3060; Barhoumi et al., "Ultraviolet light-mediated drug delivery: Principles, applications, and challenges (Administración de fármacos mediante luz ultravioleta: principios, aplicaciones y desafíos)", Journal of Controlled Release 219 (2015): 31-42; y la Patente US20180057610A1.
[0128] Los profesionales expertos comprenderán que, en algunos casos, una composición descrita en el presente documento puede incluir más de un tipo de agente mitocondrial combinado. Por ejemplo, se incluyen composiciones que comprenden mitocondrias, en las que esencialmente cada mitocondria está asociada con múltiples tipos de agentes. También se incluyen composiciones que comprenden mitocondrias, en las que cada mitocondria está emparejada con un solo tipo de agente, pero en las que la composición comprende una mezcla de pares mitocondria/agente.
[0129] Métodos para la elaboración de agentes mitocondriales combinados
[0130] Los profesionales expertos comprenderán que un agente puede vincularse a las mitocondrias de diversas maneras, por ejemplo, uniéndose a ellas, incrustándose parcial o totalmente en la membrana mitocondrial, encerrándose en ellas o encapsulándose dentro de ellas.
[0131] Sin desear quedar ligado a teoría alguna ni a ningún enfoque en particular, se cree que la membrana externa de las mitocondrias es adherente y, por lo tanto, particularmente susceptible a la combinación con diversos agentes. En algunas realizaciones, los agentes farmacéuticos pueden unirse a la membrana externa de las mitocondrias simplemente mediante incubación. Por ejemplo, una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos puede mezclarse completamente con mitocondrias aisladas en un tampón, por ejemplo, un tampón de respiración, a una temperatura favorable para las mitocondrias aisladas, por ejemplo, de 0 °C a 26 °C, de 0 °C a 4 °C, o aproximadamente entre 0 °C, 4 °C y 26 °C. Este procedimiento es útil para unir una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos (por ejemplo, nanopartículas, vectores de ADN, vectores de ARN) a las mitocondrias.
[0132] En algunas realizaciones, los cationes orgánicos (por ejemplo, rodamina y tetrametilrosamina) son fácilmente secuestrados por las mitocondrias funcionales debido al potencial eléctrico de la membrana mitocondrial. Las membranas mitocondriales sanas mantienen una diferencia de potencial eléctrico entre el interior y el exterior del orgánulo, denominada potencial de membrana. Este potencial de membrana es el resultado directo de los procesos funcionales mitocondriales y puede perderse si las mitocondrias no funcionan correctamente. Los cationes liposolubles son secuestrados por las mitocondrias como consecuencia de su carga positiva y de su solubilidad tanto en los lípidos de la membrana interna como en el espacio acuoso de la matriz. De manera similar, en otras modalidades, los aniones pueden unirse a la membrana externa de las mitocondrias debido a su carga negativa. Para vincular las mitocondrias con estos agentes farmacéuticos, debe mezclarse completamente una cantidad eficaz de agentes farmacéuticos con mitocondrias aisladas en un tampón, por ejemplo, un tampón de respiración, a una temperatura favorable para las mitocondrias aisladas, por ejemplo, aproximadamente 0 °C o 4 °C.
[0133] El agente terapéutico, diagnóstico y/o de imagen puede unirse a fosfolípidos, péptidos o proteínas de la membrana mitocondrial mediante un enlace químico. Por ejemplo, moléculas como fluoróforos (pHrodo Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.)) y partículas metálicas (por ejemplo, nanopartículas magnéticas de óxido de hierro de 30 nm (Sigma)) pueden unirse covalentemente a grupos amina expuestos en proteínas y péptidos expuestos en la membrana externa de mitocondrias intactas mediante conjugados de éster de succinimidilo. Estos reactivos reaccionan con grupos amina alifáticos no protonados, incluyendo el extremo amina de las proteínas y el grupo s-amino de los residuos de lisina, que crea un enlace carboxamida estable. En otro ejemplo, cuando el agente farmacéutico, por ejemplo, MitoTracker® Orange CMTMRos (Invitrogen, Carlsbad, CA, ahora Thermo-Fisher Scientific, Cambridge, MA), se mezcla con mitocondrias funcionales, se oxida y después reacciona con los tioles de las proteínas y los péptidos de las mitocondrias para formar conjugados.
[0134] Existen numerosos grupos químicos reactivos disponibles para unir agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o de imagen a la superficie de las mitocondrias (por ejemplo, ácido carboxílico, amina funcionalizada, etc.).
[0135] Los agentes pueden unirse a la membrana mitocondrial externa o interna mediante enlaces proteicos, enlaces amínicos u otros métodos de unión. Como alternativa, o además, puede unirse un agente a la membrana mitocondrial mediante interacción hidrofóbica, interacción de Van der Waals y/o interacción electrostática.
[0136] En muchos casos, los agentes terapéuticos, los agentes de diagnóstico y los agentes de imagen pueden simplemente mezclarse con mitocondrias aisladas e incubar en un tampón (por ejemplo, tampón de respiración) durante un período de tiempo suficiente (por ejemplo, unos minutos, 5 minutos, 10 minutos o 1 hora) en condiciones favorables (por ejemplo, de 0 °C a 26 °C, de 0 °C a 4 °C, o aproximadamente 0 °C, 4 °C, 26 °C, pH 7,2~8,0).
[0137] En McCully et al, Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection (Inyección de mitocondrias aisladas durante la fase temprana de la reperfusión con fines cardioprotectores), Am J Physiol 296, H94-H105, se describen métodos ejemplares para la preparación de agentes mitocondriales combinados. PMC2637784 (2009); y Masuzawa et al., Masuzawa etal, Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heartfrom ischemia-reperfusion injury (El trasplante de mitocondrias derivadas autólogas protege al corazón de la lesión por isquemia-reperfusión), Am J Physiol 304, H966-982. PMC3625892 (2013); y la Patente US20180057610A1.
[0138] Métodos de tratamiento
[0139] Los métodos que se describen en este documento incluyen métodos para el tratamiento de diversas enfermedades (por ejemplo, trastornos pulmonares, trastornos respiratorios), lesiones por isquemia-reperfusión y otras enfermedades que se describen en este documento. En general, los métodos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende mitocondrias aisladas o un agente mitocondrial combinado, como se describe en el presente documento, a un sujeto que necesita, o que se ha determinado que necesita, dicho tratamiento. En algunas realizaciones, la composición se administra por a través del tracto respiratorio.
[0140] Como se utiliza en este contexto, "tratar" significa aliviar al menos un síntoma del trastorno (por ejemplo, dificultad para respirar, respiración rápida, bajo nivel de oxígeno en la sangre, insuficiencia pulmonar, insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardíaca (por ejemplo, insuficiencia cardíaca derecha)). En algunas modalidades, el tratamiento produce una mejora en las funciones pulmonares (por ejemplo, aumento del nivel de oxígeno en la sangre, reducción de la resistencia, reducción de la elastancia). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar la fibrosis pulmonar, infecciones pulmonares (por ejemplo, por coronavirus), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, embolia pulmonar, cáncer de pulmón, hipertensión pulmonar o linfangioleiomiomatosis. En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar la neumonía.
[0141] Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente a lo largo de la presente memoria descriptiva y se refieren a un animal, humano o no humano, al que se le proporciona tratamiento según los métodos de la presente invención. La presente invención contempla aplicaciones veterinarias y no veterinarias.
[0142] Un paciente humano puede ser un adulto o un niño, como por ejemplo un recién nacido. Por ejemplo, el sujeto humano puede tener al menos o aproximadamente 60 años, por ejemplo, al menos aproximadamente 65 años, 70 años, 75 años o al menos o aproximadamente 80 años. El sujeto humano puede tener menos de 18 años o aproximadamente esa edad, por ejemplo, 15 años, 10 años, 9 años, 8 años, 7 años, 6 años, 5 años, 4 años, 3 años, 2 años, o menos de 1 año o aproximadamente esa edad.
[0143] Además de los seres humanos, los sujetos de estudio pueden incluir, entre otros, animales no humanos, como ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, hurones, gatos, perros y primates. Se incluyen, por ejemplo, primates no humanos (como monos, chimpancés, gorilas, etc.), roedores (como ratas, ratones, jerbos, hámsteres, hurones, conejos), lagomorfos, cerdos (como cerdos, cerdos miniatura), equinos, caninos, felinos, bovinos y otros animales domésticos, de granja y de zoológico.
[0144] La administración de las composiciones descritas en este documento puede realizarse por diversos medios, por ejemplo, vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, transdérmica (tópica), transmucosa, rectal, nasal, instilación nasal, insuflación (por ejemplo, aerosoles nasales), inhalación (por la nariz o la boca), intrapulmonar, intratraqueal, inyección intraperitoneal, infusión o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la composición se administra por a través del tracto respiratorio.
[0145] En un aspecto, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a los pulmones o al corazón para disminuir el aturdimiento y permitir la retirada gradual de los órganos de un procedimiento quirúrgico (por ejemplo, cirugía pulmonar o cirugía cardíaca). En algunas modalidades, los métodos implican la administración de mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados a través del tracto respiratorio.
[0146] En un aspecto, las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse en los oídos, los ojos, la piel (por ejemplo, para reducir las arrugas) o la cabeza (por ejemplo, para la calvicie).
[0147] Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto como un tratamiento único, o bien, como tratamientos múltiples; por ejemplo, un tratamiento que se continúe de forma intermitente o continua durante aproximadamente 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 días, un año, indefinidamente o hasta que un profesional sanitario determine que la administración de las mitocondrias o del agente mitocondrial combinado ya no es necesaria.
[0148] Las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a un sujeto en una sola dosis o en dosis múltiples administradas cada 5 minutos o cada 12 a 24 horas. En algunas realizaciones, pueden administrarse mitocondrias aisladas o agentes mitocondriales combinados a un sujeto cada 5-10 minutos (por ejemplo, cada 5 minutos, cada 10 minutos).
[0149] Cabe destacar que, en algunos casos, los efectos de las mitocondrias dependen de la duración del período de tiempo transcurrido entre el momento de su aislamiento y el momento de su uso. Por lo tanto, en algunos casos, las mitocondrias se aíslan recientemente y son viables. Las mitocondrias o agentes mitocondriales combinados pueden administrarse a un sujeto en aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después de que se aíslen las mitocondrias. En algunos casos, las mitocondrias o agentes mitocondriales combinados se administran a un sujeto en aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después de empezar el proceso de aislamiento de mitocondrias. En algunos casos, las mitocondrias y/o los agentes mitocondriales combinados pueden almacenarse durante un breve período de tiempo (por ejemplo, aproximadamente o al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos o 60 minutos) antes de su uso.
[0150] También se observa que, en algunos casos, las mitocondrias congeladas y descongeladas no son viables ni eficaces para ciertos tratamientos descritos en este documento, por ejemplo, el tratamiento de lesiones por isquemia/reperfusión. Por lo tanto, en algunos casos, las mitocondrias no se congelan ni se descongelan después de su aislamiento de los tejidos y/o células.
[0151] En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar trastornos relacionados con los pulmones, los oídos, los ojos, la piel y el cuero cabelludo. Por ejemplo, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar el cáncer, las arrugas (por ejemplo, las arrugas en la piel) o la calvicie. En algunos casos, las composiciones y los métodos descritos en este documento se utilizan para mejorar las funciones de diversos tejidos y órganos (por ejemplo, pulmones, oídos, ojos, piel).
[0152] Administración a través del tracto respiratorio
[0153] La mucosidad (de 1 a 10 μm de espesor) que recubre el epitelio pulmonar y el tensioactivo que recubre los alvéolos (de 0,1 a 0,2 μm de espesor) constituyen barreras físicas para la absorción pulmonar de partículas extrañas. Además, las proteasas y peptidasas asociadas a la membrana (epiteliales y endoteliales) e intracelulares (macrófagos, linfocitos, neutrófilos y mastocitos) degradan fácilmente los péptidos y proteínas administrados (Agu et al., "The lung as a route for systemic delivery of therapeutic proteins and peptides (El pulmón como vía para la administración sistémica de proteínas y péptidos terapéuticos)". Respiratory research 2,4 (2001): 198). También se ha demostrado que los macrófagos pulmonares secretan o liberan peroxidasas de corta duración, mediadores inflamatorios e inmunomoduladores (incluidos el factor estimulante de colonias de granulocitos, interleucinas, leucotrienos y proteasas), y otras moléculas como parte de un mecanismo de defensa del huésped.
[0154] No obstante, la presente divulgación demuestra que la administración de una composición que comprende mitocondrias o agentes mitocondriales combinados a través del tracto respiratorio puede promover eficazmente la función pulmonar, reducir la resistencia pulmonar, reducir la elastancia pulmonar, reducir el área isquémica y/o reducir el edema y el daño celular en los pulmones.
[0155] Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse por vía respiratoria mediante diversos medios, como por ejemplo, administración nasal, instilación nasal, insuflación (por ejemplo, aerosoles nasales), inhalación (por la nariz o la boca), administración intrapulmonar, administración intratraqueal o cualquier combinación de las mismas. Como se utiliza en el presente documento, el término "instilación nasal" se refiere a un procedimiento que administra un agente terapéutico directamente en la nariz y sobre las membranas nasales, de manera que una porción del agente terapéutico puede pasar a través de la tráquea y llegar a los pulmones. Debido a la limitación funcional que a veces presentan los pulmones que necesitan tratamiento, en ocasiones no es posible administrar un agente terapéutico de forma eficaz a los lugares objetivo de los pulmones (por ejemplo, bronquiolos o alvéolos) mediante la administración por el tracto respiratorio. En estos casos, puede administrarse primero al paciente un agente que pueda despejar las vías respiratorias. En algunas modalidades, estos agentes pueden inducir la dilatación de las vías bronquiales y/o la vasodilatación muscular. Estos agentes incluyen, pero sin limitación, agonistas de los receptores beta2 adrenérgicos, agentes anticolinérgicos y corticosteroides. En algunas modalidades, puede utilizarse un agente para el tratamiento del asma.
[0156] Las composiciones farmacéuticas aptas para su administración por vía respiratoria pueden incluir, por ejemplo, soluciones líquidas, soluciones acuosas (cuando son solubles en agua) o dispersiones, etc. En algunas realizaciones, estas composiciones pueden comprender uno o más tensioactivos.
[0157] En el presente documento, el término "tracto respiratorio" se refiere a los conductos de aire que van desde la nariz hasta los alvéolos pulmonares, incluyendo la nariz, la garganta, la faringe, la laringe, la tráquea, los bronquios y cualquier parte de los pulmones. En algunos casos, la composición se administra a los pulmones o a cualquier parte del sistema respiratorio.
[0158] En algunas realizaciones, las composiciones pueden administrarse a un sujeto mediante un sistema de administración que puede convertir la composición en una forma de aerosol, por ejemplo, un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador, un inhalador de niebla suave, un nebulizador de chorro, un nebulizador de ondas ultrasónicas, un inhalador de dosis medida presurizado, un inhalador de dosis medida presurizado activado por la respiración o un dispositivo de malla vibratoria. Según se utiliza presente documento, el término "inhalador" se refiere a un dispositivo para administrar composiciones en forma de aerosol o polvo seco que se inhala (se respira de forma natural o se introduce mecánicamente en los pulmones) a través de la nariz o la boca. En algunas modalidades, los inhaladores incluyen, por ejemplo, un ventilador pasivo o activo (mecánico con o sin tubo endotraqueal), un nebulizador, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medida y un inhalador de dosis medida presurizado. Una vez que las mitocondrias se depositan o se localizan cerca de las células, una parte de ellas puede ser absorbida por las células.
[0159] En algunas realizaciones, los dispositivos pueden utilizar aire (por ejemplo, oxígeno, aire comprimido) o energía ultrasónica para descomponer soluciones y suspensiones en pequeñas partículas de aerosol (por ejemplo, gotículas) que pueden inhalarse directamente desde la boquilla del dispositivo. En algunas modalidades, los dispositivos utilizan una malla/membrana con orificios perforados con láser (por ejemplo, de 1000 a 7000 orificios) que vibra en la parte superior del depósito de líquido y, de este modo, expulsa una niebla de gotitas muy finas a través de los orificios.
[0160] El sistema de administración también puede contar con un sistema de administración de dosis unitaria. El volumen de solución o suspensión administrado por dosis puede variar desde aproximadamente 5 a aproximadamente 2000 microlitros, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 microlitros, o desde aproximadamente 50 a aproximadamente 500 microlitros. Los sistemas de administración para estas diversas formas farmacéuticas pueden ser frascos cuentagotas, unidades de plástico exprimibles, atomizadores, nebulizadores o aerosoles farmacéuticos, ya sea en envases de dosis unitaria o de dosis múltiples.
[0161] En algunas realizaciones, el dispositivo consiste en una pequeña botella rígida a la que se acopla un pulverizador dosificador. La dosis medida puede administrarse introduciendo la composición en una cámara de volumen definido, la cual tiene una abertura dimensionada para aerosolizar y formar un rocío cuando se comprime un líquido en la cámara. La cámara se comprime para administrar la composición. En ciertos dispositivos, la cámara tiene un sistema de pistón. Estos dispositivos están disponibles en el mercado.
[0162] Como alternativa, puede utilizarse un frasco flexible con una abertura o hueco dimensionado para aerosolizar una formulación en aerosol mediante la formación de un rocío al apretarlo. La abertura suele estar en la parte superior del frasco, y esta suele tener forma cónica para que se ajuste parcialmente a las fosas nasales y así administrar eficazmente la formulación en aerosol. Preferiblemente, el inhalador nasal debe proporcionar una cantidad dosificada de la formulación en aerosol, para la administración de una dosis medida del agente terapéutico. En algunas realizaciones, la aerosolización de una formulación líquida para su inhalación en los pulmones implica el uso de un propelente. El propelente puede ser cualquiera de los que se utilizan habitualmente en la técnica. Ejemplos específicos, no limitantes, de dichos propelentes útiles son un clorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono o un hidrocarburo, incluyendo el trifluorometano, el diclorodifluorometano, el diclorotetrafluoroetanol y el 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos.
[0163] La presente divulgación también proporciona formulaciones en aerosol y formas farmacéuticas para su uso en el tratamiento de pacientes con diversas enfermedades pulmonares. En general, estas formas farmacéuticas contienen el agente terapéutico en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Entre los diluyentes farmacéuticamente aceptables en este tipo de formulaciones en aerosol se incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina, solución salina tamponada, solución de dextrosa y similares. En ciertas realizaciones, un diluyente que puede utilizarse en la presente invención o en la formulación farmacéutica es una solución salina tamponada con fosfato o una solución salina tamponada generalmente con un pH entre 7,0 y 8,0 (por ejemplo, pH 7,4), o agua.
[0164] La formulación en aerosol también puede incluir, opcionalmente, excipientes, diluyentes, agentes solubilizantes o emulsionantes, tensioactivos y otros componentes farmacéuticamente aceptables.
[0165] La formulación puede incluir un excipiente. El vehículo es una macromolécula soluble en el sistema circulatorio y fisiológicamente aceptable, entendiéndose por aceptación fisiológica que los expertos en la materia aceptarían la inyección de dicho vehículo en un paciente como parte de un régimen terapéutico. Preferiblemente, el vehículo de administración debe ser relativamente estable en el sistema circulatorio y tener una vida media plasmática aceptable para su eliminación. Dichas macromoléculas incluyen, entre otras, la lecitina de soja, el ácido oleico y el trioleato de sorbitán.
[0166] Las formulaciones también pueden incluir otros agentes útiles para el mantenimiento del pH, la estabilización de la solución o la regulación de la presión osmótica. Algunos ejemplos de estos agentes son, entre otros, las sales, como el cloruro de sodio o el cloruro de potasio, y los carbohidratos, como la glucosa, la galactosa o la manosa, y similares.
[0167] La presente divulgación contempla además formulaciones en aerosol que comprenden la composición descrita en el presente documento y otro agente terapéuticamente eficaz.
[0168] En algunos casos, la composición puede administrarse en los vasos sanguíneos. La sangre puede transportar las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado a un sitio objetivo, por ejemplo, un órgano, un tejido o un sitio lesionado. Por ejemplo, los vasos sanguíneos pulmonares (como las venas pulmonares) pueden transportar las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado hasta los pulmones. En algunos casos, la composición aquí descrita puede utilizarse para mejorar la función de los pulmones, los oídos, los ojos y la piel.
[0169] En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía oral o nasal para lograr un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables pueden nebulizarse mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente desde el nebulizador, o bien, el nebulizador puede conectarse a una mascarilla facial o a un respirador de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden administrarse por vía oral o nasal mediante dispositivos que administran la formulación de forma adecuada. Para su administración por inhalación, las composiciones pueden suministrarse en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono, o mediante un nebulizador. Dichos métodos incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos n.° 6.468.798; n.° 6.695.227; n.° 7.431.222; US20050224608.
[0170] Por tanto, en algunas realizaciones, la composición del aerosol puede administrarse a las vías respiratorias, los pulmones, los oídos, los ojos, las fosas nasales, el recto, la piel y la cabeza. En algunas realizaciones, la composición se administra en los pulmones, las fosas nasales, el recto, el intestino, la piel y los ojos para tratar cánceres o tumores en estas zonas.
[0171] En algunas modalidades, la composición se administra mediante un pulverizador de dosis medida, un frasco exprimible, un inhalador de dosis medida presurizado, un respirador o una mascarilla facial y una tienda de campaña. Los sistemas de administración de aerosoles, como el inhalador de dosis medida presurizado y el inhalador de polvo seco, se describen en Newman, SP, Aerosols and the Lung, Clarke, SW y Davia, D. editores, págs.197-22. El paciente también puede inhalar la composición a través de un respirador, cuyo caudal se ajustará en función de la comodidad y las necesidades del paciente. Esto se determina mediante gráficos pulmonares (es decir, frecuencia respiratoria, volúmenes corrientes, etc.). La composición también puede prepararse para permitir la inhalación por parte del sujeto mediante una mascarilla o una tienda de campaña. En ciertos casos, la composición puede envasarse en un dispositivo portátil (por ejemplo, un inhalador portátil) y administrarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un paciente que no se encuentra en un entorno hospitalario. En los envases pueden envasarse diferentes concentraciones de la composición.
[0172] Una forma conveniente de administrar eficazmente la composición a los alvéolos es seleccionar un nebulizador que produzca partículas suficientemente pequeñas (por ejemplo, que produzca partículas con un diámetro medio de partícula inferior a 5,0 micrómetros (μm), preferiblemente con un diámetro medio de partícula de entre 0,2 y 4,0 μm, y aún mejor, con un diámetro medio de entre 0,2 y 2 μm). Como alternativa a la selección de diámetros medios de partícula pequeños para lograr una deposición sustancial en los alvéolos, puede administrarse una dosis muy alta de la composición, con un diámetro medio de partícula mayor. En dicho enfoque, es beneficioso que la composición particular no sea demasiado irritante a la dosis requerida y que haya una cantidad suficiente de partículas en la población total con un diámetro comprendido entre 0,5 y aproximadamente 5 μm para permitir su deposición en los alvéolos. Para la administración en las vías respiratorias proximales, el tamaño medio de las partículas puede ser mayor. Por ejemplo, los diámetros medios de partícula adecuados generalmente pueden ser inferiores a unos 15 μm, por ejemplo, de unos 4 μm a unos 15 μm, por ejemplo, de unos 5 μm a unos 10 μm. La composición puede ser aerosolizada mediante cualquier método adecuado. Para su uso en humanos u otros primates, el aerosol puede generarse utilizando un sistema nebulizador médico que lo administra a través de una boquilla, mascarilla facial, etc., desde donde el sujeto puede inhalar el aerosol hacia los pulmones. En la técnica se conocen diversos nebulizadores que pueden utilizarse en el método descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.º 4.268.460; la Patente de Estados Unidos N.º 4.253.468; la Patente de Estados Unidos N.º 4.046.146; la Patente de Estados Unidos N.º 3.826.255; la Patente de Estados Unidos N.º 4.649.911; la Patente de Estados Unidos N.º 4.510.829. La elección de un sistema nebulizador dependerá de si se desea la administración alveolar o a través de las vías respiratorias (es decir, tráquea, bronquios primarios, secundarios o terciarios, etc.).
[0173] Algunos ejemplos de nebulizadores útiles para la administración alveolar son el nebulizador Acorn 1 y el sistema nebulizador Respirgard II™, ambos disponibles comercialmente a través de Marquest Medical Products, Inc., Inglewood, Colorado. Otros nebulizadores disponibles en el mercado para su uso con la presente invención incluyen el nebulizador UltraVent™ disponible de Mallinckrodt, Inc. (Maryland Heights, Mo.); el nebulizador Wright (Wright, BM, Lancet (1958) 3:24-25); y el nebulizador DeVilbiss (Mercer et al., Am. Ind. HYR. Assoc. J. (1968) 29:66-78; T. T. Mercer, Chest (1981) 80:6 (Sup) 813-817). Los nebulizadores útiles para la administración de fármacos por las vías respiratorias incluyen los que se utilizan habitualmente en el tratamiento del asma. Estos nebulizadores también están disponibles comercialmente. Un experto en la materia puede determinar la utilidad de un nebulizador en particular midiendo el tamaño medio de las partículas que genera, por ejemplo, con un impactador en cascada Mercer de 7 etapas (Intox Products, Albuquerque, N. Mex.).
[0174] La cantidad total de la composición administrada al sujeto dependerá de varios factores, entre ellos la cantidad total aerosolizada, el tipo de nebulizador, el tamaño de las partículas, los patrones respiratorios del sujeto, la gravedad de la enfermedad pulmonar, la concentración en la solución aerosolizada y la duración de la terapia de inhalación. La cantidad de compuesto medida en los alvéolos puede ser sustancialmente menor de lo que cabría esperar a partir de la cantidad de compuesto presente en el aerosol, ya que una gran parte del compuesto puede ser exhalada por el sujeto o quedar atrapada en las superficies internas del aparato nebulizador.
[0175] Los profesionales cualificados podrán diseñar fácilmente protocolos eficaces, sobre todo si se optimiza el tamaño de las partículas del aerosol. En algunos casos, resulta útil administrar dosis más altas al tratar afecciones más graves. Si es necesario, el tratamiento puede repetirsead hocen función de los resultados obtenidos. Si se repite el tratamiento, puede controlarse al huésped mamífero para asegurar que no haya una respuesta inmunitaria adversa al mismo. La frecuencia de los tratamientos depende de varios factores, como la cantidad de compuesto administrado por dosis, así como la salud y el historial clínico del paciente. En el presente documento, la "cantidad nebulizada" o "cantidad aerosolizada" de la composición se refiere a la cantidad que realmente sale del aparato en forma de aerosol, es decir, la cantidad introducida en el aparato menos la cantidad retenida en el depósito y en las superficies internas del aparato al finalizar una sesión de tratamiento.
[0176] Trastornos pulmonares
[0177] Los agentes terapéuticos que se describen en el presente documento pueden utilizarse para tratar diversos trastornos pulmonares. El paciente puede tener cualquier enfermedad pulmonar que pueda beneficiarse del tratamiento, por ejemplo, isquemia, lesión por perfusión, hipoplasia pulmonar, hernia diafragmática congénita (HDC), síndrome de Poland, enfermedades de la pared torácica (por ejemplo, pectus excavatum), neumonectomía, displasia broncopulmonar, lesión pulmonar y lesión por inhalación, asma, fibrosis quística, etc. Por ejemplo, el paciente puede tener hipoplasia pulmonar. En algunas realizaciones, puede administrarse al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende mitocondrias aisladas, por ejemplo, a través de las vías respiratorias. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), la lesión pulmonar aguda (LPA), la insuficiencia respiratoria, la reducción de la función respiratoria y/o la inflamación pulmonar.
[0178] En algunas realizaciones, los métodos aquí descritos pueden utilizarse para tratar la fibrosis pulmonar, infecciones pulmonares (por ejemplo, por virus, coronavirus, gripe, bacterias u hongos), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, embolia pulmonar, cáncer de pulmón, hipertensión pulmonar o linfangioleiomiomatosis. En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar la neumonía. En algunas realizaciones, puede identificarse al sujeto como alguien que presenta un desarrollo pulmonar insuficiente, incompleto o lento. Como alternativa o adicionalmente, el sujeto podría presentar algún daño en los pulmones. Por ejemplo, el sujeto puede ser un fumador habitual o un trabajador frecuentemente expuesto a la inhalación de humo.
[0179] Tratamiento de las lesiones relacionadas con la isquemia
[0180] Los métodos descritos en este documento pueden utilizarse para tratar la isquemia pulmonar. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad eficaz de mitocondrias aisladas a través del tracto respiratorio. Las mitocondrias pueden ser internalizadas por las células de los pulmones.
[0181] La lesión por reperfusión es el daño tisular causado por el suministro de sangre cuando esta regresa al tejido después de un período de isquemia o falta de oxígeno. La ausencia de oxígeno y nutrientes durante el período isquémico provoca inflamación y daño oxidativo cuando se restablece el flujo sanguíneo. La respuesta inflamatoria conduce además a la lesión por reperfusión en el tejido. Por lo tanto, en algunos casos, el tratamiento también implica la administración de inmunosupresores al paciente. Los inmunosupresores pueden administrarse, por ejemplo, por separado, pero también como tratamiento concomitante con el agente mitocondrial. Como alternativa, o adicionalmente, los inmunosupresores pueden unirse a las mitocondrias para formar un agente mitocondrial combinado, que puede utilizarse para el tratamiento. Los bisfosfonatos son inmunosupresores particularmente útiles.
[0183] En algunas realizaciones, el sujeto presenta lesión pulmonar aguda (LPA). La lesión pulmonar aguda suele estar asociada a insuficiencia respiratoria aguda e hipoxemia refractaria. En algunas realizaciones, el sujeto presenta infiltrados pulmonares bilaterales compatibles con edema pulmonar en ausencia de hipertensión auricular izquierda. La lesión pulmonar aguda (LPA) complica una amplia variedad de afecciones médicas y quirúrgicas, y refleja la respuesta pulmonar a una lesión pulmonar o a factores desencadenantes. La causa más común de ALI es la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) puede producirse con el intercambio de gases extracorpóreo, la derivación cardiopulmonar y la ventilación pulmonar, y se ha demostrado que tiene efectos profundos sobre la función pulmonar y la viabilidad celular, además de contribuir significativamente al aumento de la morbilidad y la mortalidad tanto en pacientes pediátricos como adultos. Se estima que la incidencia de lesión pulmonar aguda en pacientes adultos sometidos a cirugía cardíaca oscila entre el 53,8 % y el 73,5 %. En pacientes pediátricos, la lesión pulmonar aguda está presente en el 8-10 % de los pacientes que requieren ventilación mecánica. Tanto en pacientes pediátricos como adultos, la lesión pulmonar aguda (LPA) tiene una mortalidad estimada del 20 al 75 %. Actualmente, no existen metodologías viables para tratar la lesión pulmonar aguda (LPA) que se produce por isquemia-reperfusión (IRI) con el objetivo de aumentar la supervivencia y la función pulmonar.
[0185] Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar la lesión pulmonar aguda (LPA). Por ejemplo, puede administrarse una cantidad eficaz de una composición en aerosol que contenga mitocondrias o agentes mitocondriales combinados al tracto respiratorio de un sujeto. Por ejemplo, aproximadamente o al menos 1 x 10<7>de las mitocondrias pueden administrarse en el pulmón. Las mitocondrias inyectadas son internalizadas por las células endoteliales y pueden proporcionar un mayor consumo de oxígeno, reducir la resistencia y la elastancia pulmonar, aumentar la distensibilidad y/o reducir el área isquémica.
[0187] Vasodilatación y flujo sanguíneo
[0189] Los métodos que se describen en el presente documento pueden aumentar significativamente el flujo sanguíneo sin alterar la presión arterial media ni la frecuencia cardíaca. La capacidad de aumentar el flujo sanguíneo sin aumentar la frecuencia cardíaca permite su uso clínico en lesiones de tipo anginoso, en lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión y en áreas de daño tisular donde se necesitaría un mayor flujo sanguíneo y suministro de oxígeno. Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse en intervenciones arteriales para eliminar coágulos u obstrucciones en los vasos sanguíneos.
[0191] Los métodos descritos en el presente documento también pueden utilizarse para aumentar el flujo sanguíneo y/o el suministro de oxígeno a diversos órganos o tejidos (por ejemplo, el corazón o los pulmones), e inducir la vasodilatación en los órganos. En algunos casos, las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden utilizarse para disminuir la resistencia vascular en un órgano (por ejemplo, el corazón o los pulmones). Las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden utilizarse para aumentar el flujo sanguíneo. Las mitocondrias aisladas y/o los agentes mitocondriales combinados pueden añadirse a un agente de contraste y utilizarse para identificar y eliminar obstrucciones en los órganos.
[0193] Cabe destacar que los efectos de las composiciones dependen del tiempo transcurrido entre el aislamiento y el momento de su uso. Los efectos vasodilatadores disminuyen a medida que se prolonga el tiempo transcurrido desde el aislamiento. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que las mitocondrias recién aisladas contienen ciertas sustancias químicas que pueden aumentar el flujo sanguíneo. Por lo tanto, en algunos métodos, las mitocondrias se aíslan recientemente y son viables. Por ejemplo, las mitocondrias o agentes mitocondriales combinados se administran a un sujeto en aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 70 minutos, aproximadamente 80 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 100 minutos, aproximadamente 110 minutos, aproximadamente 120 minutos después del momento en que comienza el proceso de aislamiento de mitocondrias o después de que las mitocondrias se aíslan. En algunos casos, las mitocondrias o agentes mitocondriales combinados se administran a un sujeto en aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 60 minutos (por ejemplo, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 60 minutos) después de que comience el proceso de aislamiento de las mitocondrias o después de que estas hayan sido aisladas.
[0195] En algunos casos, aumentar el flujo sanguíneo no es deseable (por ejemplo, en el tratamiento de la isquemia/reperfusión pulmonar o en el tratamiento del cáncer). En estos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados pueden almacenarse durante un breve período de tiempo (por ejemplo, de unos 30 a unos 60 minutos) antes de su uso. Este método puede utilizarse para aumentar la viabilidad de los tejidos (por ejemplo, para tratar lesiones por isquemia/reperfusión) sin provocar un aumento del flujo sanguíneo. En estos casos, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se administran a un sujeto al menos 60 minutos (por ejemplo, unos 65 minutos, unos 70 minutos, unos 80 minutos, unos 90 minutos, unos 100 minutos, unos 110 minutos, unos 120 minutos) después del momento en que comienza el proceso de aislamiento de las mitocondrias o después de que las mitocondrias se hayan aislado.
[0196] Obtención de imágenes
[0197] Los agentes de obtención de imágenes pueden adherirse a las mitocondrias, a menudo mediante la incubación conjunta de las mitocondrias con dichos agentes. Estos agentes de imagen incluyen, entre otros, los fluoróforos MitoTracker y pHrodo de Thermo Fisher Scientific Inc.<18>F-Rodamina 6G y nanopartículas de óxido de hierro. Los agentes mitocondriales combinados que incluyen un agente de imagen pueden administrarse al sujeto por vía respiratoria. Los tejidos que contienen las mitocondrias marcadas pueden examinarse mediante técnicas de imagen, como la tomografía por emisión de positrones (PET), la microtomografía computarizada (μCT), la resonancia magnética (RM), el microscopio de campo claro y la microscopía de superresolución 3D, entre otras. Los profesionales cualificados comprenderán que pueden utilizarse otras técnicas o modalidades de imagen. Entre ellas se incluyen, pero no se limitan a, rayos X, gammagrafía, fluorescencia y ultrasonido.
[0198] La tomografía por emisión de positrones es una técnica de imagen que produce una imagen tridimensional del cuerpo y puede utilizarse en los métodos descritos en el presente documento. El sistema detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radioisótopo emisor de positrones (trazador). Posteriormente, mediante análisis informático, se construyen imágenes tridimensionales de la concentración del trazador dentro del cuerpo. Los grupos de marcadores útiles incluyen isótopos radioactivos, tales como<11>C,<13>N,<15>O,<18>F,<64>Cu,<68>Ga,<81>mKr,<82>Rb,<86>Y,<89>Zr, 111In,<123>I,<124>I,<133>Xe,<201>Tl,<125>I,<35>S<14>C,<3>H. En algunos métodos, las mitocondrias pueden ser marcadas con isótopos radiactivos, por ejemplo,<18>F, o mediante moléculas que incorporan isótopos radiactivos, por ejemplo,<18>F-Rodamina 6G, Rodamina B marcada con<18>F. Una vez que las células diana internalizan las mitocondrias, puede emplearse la técnica de imagen PET, o una técnica similar, para visualizar las células diana. La resonancia magnética es una técnica de diagnóstico por imagen médica que permite visualizar la anatomía y los procesos fisiológicos del cuerpo, y puede utilizarse en los métodos que se describen en este documento. En algunos casos, puede utilizarse en combinación con otras técnicas de imagen, por ejemplo, la PET. Las imágenes adquiridas con ambos dispositivos pueden tomarse de forma secuencial, en la misma sesión, y combinarse en una única imagen superpuesta (corregistrada). Las exploraciones PET/RM pueden utilizarse para diagnosticar afecciones de salud en humanos y animales, por ejemplo, con fines de investigación, médicos y agrícolas.
[0199] La microtomografía computarizada utiliza rayos X para crear secciones transversales de un objeto físico que pueden usarse para recrear un modelo virtual sin destruir el objeto original, y puede utilizarse en los métodos descritos en este documento. En algunos casos, se utiliza en combinación con otras técnicas de imagen, por ejemplo, la PET. Las imágenes adquiridas con ambos dispositivos pueden tomarse de forma secuencial, en la misma sesión, y combinarse en una única imagen superpuesta (corregistrada). De este modo, las imágenes funcionales obtenidas mediante PET, que muestran la distribución espacial de la actividad metabólica o bioquímica en el cuerpo, pueden alinearse o correlacionarse con mayor precisión con las imágenes anatómicas obtenidas mediante tomografía computarizada (TC). La reconstrucción de imágenes bidimensionales y tridimensionales puede realizarse mediante un software y un sistema de control comunes.
[0200] La microscopía de iluminación estructurada 3D, 3D-SIM o microscopía de superresolución 3D, permite la visualización 3D completa de las estructuras dentro de las células y puede utilizarse en los métodos descritos en este documento. La microscopía de iluminación estructurada es un método de imagen capaz de duplicar la resolución espacial de la microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional mediante el uso de luz de iluminación espacialmente estructurada. Mejora la resolución espacial al recopilar información del espacio de frecuencias fuera de la región observable.
[0201] Los métodos descritos, es decir, los que incluyen la administración de mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, son útiles para diagnosticar diversas enfermedades, como cánceres (por ejemplo, de pulmón, cerebro, páncreas, melanoma, próstata y colon), enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, infarto de miocardio, aterosclerosis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, diabetes, síndrome del intestino irritable, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn) y enfermedades inflamatorias.
[0202] Los métodos que utilizan agentes con fines de imagen son bien conocidos en el arte y se describen, por ejemplo, en Bartholoma et al., Biological characterization of F18- labeled Rhodamine B, a potential positron emission tomography perfusion tracer, Nucl Med Biol40,1043-1048, PMC3820364 (2013); Bartholoma et al., 18F-labeled rhodamines as potential myocardial perfusion agents: comparison of pharmacokinetic properties of several rhodamines, Nucl Med Biol 42, 796-803, PMC4567415 (2015): y Pacak et al., Superparamagnetic iron oxide nanoparticles function as a long-term, multi-modal imaging label for non-invasive tracking of implanted progenitor cells, PLoS ONE 9, e108695, PMC4177390 (2014).
[0203] Administración de medicamentos
[0204] La presente memoria descriptiva proporciona métodos para administrar agentes farmacéuticos, por ejemplo, a las células y/o tejidos de un paciente. Las mitocondrias son captadas por las células tisulares mediante un proceso de internalización dependiente de la actina, lo que proporciona una forma de administrar agentes farmacéuticos directamente en las células. En algunos casos, los agentes mitocondriales combinados ingresan a los tejidos pulmonares o a los vasos sanguíneos a través del tracto respiratorio.
[0205] Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno puede unirse o adherirse a las mitocondrias. Los profesionales cualificados comprenderán que la unión del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno a las mitocondrias o a un agente mitocondrial combinado permite dirigir las mitocondrias o el agente mitocondrial combinado a sitios específicos, por ejemplo, a células y/o tejidos diana. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno están diseñados para atacar tipos de células específicos, por ejemplo, células musculares lisas en el pulmón, células inmunitarias, macrófagos, etc.
[0206] En algunas modalidades, la presente divulgación proporciona métodos para administrar un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, ARNmi), un vector, un péptido o una proteína a un sitio objetivo (por ejemplo, tejido pulmonar). Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse como transportadoras para introducir un ácido nucleico o un péptido en una célula. En algunos casos, pueden administrarse agentes mitocondriales combinados que incluyen polímeros de ácidos nucleicos a un sujeto para reemplazar un gen mutado que causa la enfermedad, para inactivar o "eliminar" un gen mutado, o para introducir un nuevo gen en el sujeto. Entre los polímeros de ácidos nucleicos ejemplares se incluyen, entre otros, el ADN de doble cadena, el ADN de cadena simple, el ARN de doble cadena, el ARN de cadena simple o las moléculas de ácido nucleico de triple hélice. En ciertos casos, los polímeros de ácidos nucleicos son ADN, ARN de interferencia (ARNpi) y microARN.
[0207] Minimizar la cardiotoxicidad
[0208] La quimioterapia es un tratamiento común para diversos tipos de cáncer; sin embargo, también causa varias complicaciones graves. La cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia es una complicación que limita el uso clínico de los agentes quimioterapéuticos. Ciertos agentes quimioterapéuticos, como las antraciclinas, son muy eficaces contra las leucemias linfoblásticas y mieloblásticas agudas, pero son particularmente dañinos para el corazón debido a sus efectos sobre las mitocondrias. El daño a las mitocondrias conduce además a la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia. Angsutararux et al., Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. 2015;2015:795602. doi: 10.1155/2015/795602 (2015); Guoetal., Cardiovascular toxicities from systemic breast cancer therapy, Front Oncol. 4:346. doi: 10.3389/fonc.2014.00346. eCollection (2014).
[0209] La presente divulgación proporciona métodos para minimizar la cardiotoxicidad inducida por la quimioterapia. Estos métodos consisten en administrar una cantidad eficaz de mitocondrias aisladas y/o un agente mitocondrial combinado a un paciente a través de las vías respiratorias. Si el paciente necesita ser tratado con quimioterapia (por ejemplo, porque se lo ha recetado un médico o un veterinario), se le puede tratar con mitocondrias y/o un agente mitocondrial combinado, antes, durante y/o después de la administración de la quimioterapia. Por ejemplo, los pacientes pueden ser tratados con mitocondrias y/o un agente mitocondrial combinado comenzando inmediatamente después de la administración, como un tratamiento único o continuando de forma intermitente o continua durante aproximadamente 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 días, un año, indefinidamente o hasta que un médico determine que la administración de las mitocondrias y/o el agente mitocondrial combinado ya no es necesaria.
[0210] Trasplante de órganos/tejidos
[0211] La presente divulgación también incluye métodos para trasplantar órganos, tejidos, masas de células y/o células aisladas. Los métodos pueden incluir un paso que consiste en exponer el/los órgano/s, tejidos, masa de células y/o células aisladas a mitocondrias o agentes mitocondriales combinados antes del trasplante. Estas exposiciones pueden ocurririn situy/oex vivo. Los órganos, tejidos y/o células aisladas pueden estar expuestos a una composición que comprende mitocondrias o agentes mitocondriales combinados (por ejemplo, una composición en aerosol).
[0212] Se puede realizar la exposición de un órgano o tejido a composiciones que comprenden mitocondrias o agentes mitocondriales combinadosex vivoy/oin situpor cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la exposición puede realizarseex vivoen cualquier cámara o espacio que tenga el volumen suficiente para sumergir el órgano o tejido, total o parcialmente, en la composición. Como otro ejemplo, el órgano puede exponerse a composiciones que comprenden mitocondrias o agentes mitocondriales combinados colocando el órgano en cualquier recipiente adecuado y haciendo que las composiciones que comprenden mitocondrias o agentes mitocondriales combinados "cubran" el órgano, de manera que este quede expuesto a un flujo continuo de la composición.
[0213] Una cantidad efectiva de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados es una cantidad que resulta eficaz para mejorar la supervivencia y/o la función de órganos o célulasin vivoy/oin vitro. En el contexto del trasplante de células individuales o masas de células, por ejemplo, donantes y/o receptores de trasplantes, una cantidad efectiva de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados es una cantidad que se administra al donante y/o receptor del trasplante suficiente para mejorar la supervivencia de la célula o masa de células, por ejemplo, para reducir la pérdida de la célula o masa de células, y/o para mejorar el rendimiento funcional de una célula trasplantada o una masa de células. En el contexto del trasplante de órganos y tejidos, por ejemplo, donantes y/o receptores de trasplantes, una cantidad eficaz de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados es una cantidad que se administra al donante y/o receptor del trasplante suficiente para mejorar la supervivencia del órgano, tejido o células de interés, por ejemplo, para reducir la pérdida de células que componen el órgano o tejido, y/o para mejorar el rendimiento funcional de un órgano.
[0214] En algunos casos, la administración de la composición a través de las vías respiratorias se realiza antes de extraer el órgano del donante. En algunos casos, la administración de la composición a través de las vías respiratorias se realiza después de que el órgano haya sido trasplantado al receptor. En algunos casos, la administración de la composición (por ejemplo, la composición en aerosol) se realiza antes de la extracción del órgano, después de la extracción del órgano y, posteriormente, después de la implantación en el receptor. En algunos casos, la administración de la composición se realiza durante la cirugía de trasplante (por ejemplo, trasplante de pulmón, trasplante de corazón).
[0215] Tratamiento del cáncer
[0216] Los métodos descritos en este documento también proporcionan tratamiento para ciertos tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón). Después de haber administrado al sujeto las composiciones que se describen en el presente documento a través del tracto respiratorio, las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados pueden ser absorbidos por las células tumorales. En algunas realizaciones, puede administrarse un agente citostático o citotóxico al tumor para eliminar las células cancerosas. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, por ejemplo, antraciclina.
[0217] Entre los tipos de cáncer que pueden tratarse utilizando los métodos y composiciones descritos en la presente divulgación se incluyen, por ejemplo, el cáncer de boca/faringe, el cáncer de esófago, el cáncer de laringe, el cáncer de pulmón o cualquier cáncer del tracto respiratorio.
[0218] Además, en algunas realizaciones, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno puede unirse o adherirse a las mitocondrias. Los profesionales expertos comprenderán que la unión del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno a las mitocondrias o a agentes mitocondriales combinados permite que las mitocondrias o los agentes mitocondriales combinados se dirijan a sitios específicos, por ejemplo, a células y/o tejidos específicos. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno están diseñados para atacar tipos de células específicos, por ejemplo, células cancerosas.
[0219] Dosificación
[0220] Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr los resultados beneficiosos o deseados. Por ejemplo, una cantidad terapéutica es aquella que logra el efecto terapéutico deseado. Esta cantidad puede ser igual o diferente de una cantidad profilácticamente eficaz, que es la cantidad necesaria para prevenir la aparición de la enfermedad o de sus síntomas. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico (es decir, la dosis eficaz) depende de los agentes terapéuticos seleccionados. Las composiciones pueden administrarse desde una o más veces al día hasta una o más veces por semana; incluyendo una vez cada dos días. El profesional cualificado comprenderá que ciertos factores pueden influir en la dosis y el momento necesarios para tratar eficazmente a un paciente, entre ellos, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, el estado de salud general y/o la edad del paciente, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos.
[0221] La dosificación, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los agentes terapéuticos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los agentes que presentan altos índices terapéuticos. Si bien pueden utilizarse agentes que presenten efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos agentes al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios. La forma de estimar un rango seguro para un paciente humano se describe, por ejemplo, en la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA,Food and Drug Administration). "Guidance for industry: estimating the Attorney Docket No.:36443-0037EP2 maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers (Guía para la industria: estimación de la dosis inicial máxima segura en ensayos clínicos iniciales de terapias en voluntarios adultos sanos (Expediente n.° 36443-0037EP2))". Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER,Center for Drug Evaluation and Research) (2005).
[0223] Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios en animales pueden utilizarse para formular un rango de dosis para su uso en humanos. La dosis de dichos agentes debe estar preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyan la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier agente utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
[0225] Los profesionales cualificados comprenderán que la cantidad de mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, por ejemplo, composiciones que comprenden mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados, que debe administrarse a un paciente variará en función de, por ejemplo, el tipo de trastorno que se esté tratando, la vía de administración, la duración del tratamiento, el tamaño del área a tratar y/o la ubicación del sitio de tratamiento en el paciente, entre otros factores. Los profesionales cualificados podrán determinar las dosis a administrar en función de estas y otras variables. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad total de aproximadamente 1 x 10<10>a 1 x 10<14>de mitocondrias a un sujeto (por ejemplo, para tratar la isquemia localizada en los pulmones). En el caso de lesiones focales pequeñas, pueden administrarse 1 x 10<3>a 1 x 10<6>mitocondrias al paciente. Por lo tanto, una cantidad efectiva de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados (o composiciones que los contengan) es la cantidad total de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados suficiente para producir el efecto terapéutico deseado. Una cantidad eficaz puede ser, por ejemplo, al menos o aproximadamente 1 x 10<2>mitocondrias o agentes mitocondriales combinados por ejemplo, de aproximadamente 1 x10<3>a aproximadamente 1 x10<14>, de aproximadamente 1 x 10<4>a aproximadamente 1 x 10<13>, de aproximadamente 1 x 10<5>a aproximadamente 1 x 10<12>, de aproximadamente 1 x 10<6>a aproximadamente 1 x 10<11>, de aproximadamente 1 x 10<7>a aproximadamente 1 x 10<10>, de aproximadamente 1 x 10<3>a aproximadamente 1 x 10<7>, de aproximadamente 1 x 10<4>a aproximadamente 1 x 10<6>, de aproximadamente 1 x10<7>a aproximadamente 1 x 10<14>o de aproximadamente 1 x10<8>a aproximadamente 1 x 10<13>, de aproximadamente 1 x 10<9>a aproximadamente 1 x 10<12>, de aproximadamente 1 x 10<5>a aproximadamente 1 x 10<8>; o al menos o aproximadamente 1 x 10<3>, 1 x 10<4>,1 x10<5>,1 x 10<6>,1 x10<7>, 1 x10<8>, 1 x10<9>, 1 x10<10>, 1 x10<11>, 1 x 10<12>, 1 x 10<13>, o al menos o aproximadamente 1 x 10<14>, o por ejemplo, una cantidad superior a 1 x 10<14>. En el presente documento, el término "cantidad total" en el contexto de la administración a un paciente puede referirse a la cantidad total de mitocondrias o agentes mitocondriales combinados en una sola administración o en administraciones múltiples, según el régimen de dosificación que se esté realizando.
[0227] Composiciones farmacéuticas
[0229] La divulgación proporciona composiciones que comprenden mitocondrias aisladas, composiciones que comprenden agentes mitocondriales combinados, composiciones que comprenden tanto mitocondrias aisladas como agentes mitocondriales combinados, y métodos para utilizar dichas composiciones.
[0231] Una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede incluir mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye soluciones salinas, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. En algunas realizaciones, el vehículo farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato, solución salina, tampón de Krebs, solución de Tyrode, medio de contraste u omnipaque, o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es un tampón mitocondrial estéril (300 mM de sacarosa; 10 mM de K+-HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico tamponado con potasio, pH 7,2); 1 mM de K+-EGTA (ácido etilenglicol tetraacético tamponado con potasio, pH 8,0)). En algunas realizaciones, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un tampón respiratorio (250 mM de sacarosa, 2 mM de KH<2>PO<4>, 10 mM de MgCl<2>, 20 mM de tampón K-HEPES (pH 7,2) y 0,5 mM de K-EGTA (pH 8,0)).
[0233] Las composiciones farmacéuticas suelen formularse para que sean compatibles con la vía de administración prevista.
[0235] Una composición farmacéutica puede formularse para diversos usos clínicos, por ejemplo, diagnóstico por imagen, tratamiento de heridas, tratamiento de lesiones, preservación de órganos, mejora de las funciones mitocondriales en órganos o tejidos y cuidado de la piel. En algunos casos, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un agente de contraste para fines de diagnóstico por imagen. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir agentes antisépticos, agentes antibacterianos (por ejemplo, antibióticos), agentes antifúngicos, desinfectantes, agentes analgésicos, agentes anestésicos, esteroides, suplementos nutricionales, aceites esenciales, etc. Un agente anestésico es un fármaco que puede prevenir el dolor durante una cirugía o un tratamiento. Entre los analgésicos más representativos se incluyen, entre otros, el paracetamol, los antiinflamatorios no esteroideos, los salicilatos, el ibuprofeno y la lidocaína. Los agentes antibacterianos ejemplares incluyen, sin limitación, el alcohol diclorobencílico, el amilmetacresol y los antibióticos. Los antibióticos ejemplares incluyen penicilinas, carbapenémicos, cefalosporinas, aminoglucósidos, bacitracina, gramicidina, mupirocina, cloranfenicol, tiamfenicol, lincomicina, clindamicina, macrólidos, novobiocina, polimixinas, rifamicinas, espectinomicina, tetraciclinas, vancomicina, teicoplanina, estreptograminas, agentes antifolato, sulfonamidas, trimetoprima, pirimetamina, nitrofuranos, mandelato de metenamina, hipurato de metenamina, nitroimidazoles, quinolonas, fluoroquinolonas, isoniazida, etambutol, pirazinamida, ácido para-aminosalicílico, cicloserina, capreomicina, etionamida, protionamida, tiacetazona y viomicina. Los agentes antisépticos son sustancias antimicrobianas que se pueden aplicar a los tejidos vivos o a la piel para reducir la posibilidad de infección, septicemia o putrefacción. Los antisépticos ejemplares incluyen, sin limitación, la clorhexidina y sus sales, el cloruro de benzalconio y sus sales, el triclosán y el cloruro de cetilpiridinio. Los agentes antifúngicos ejemplares incluyen, sin limitación, tolnaftato, miconazol, fluconazol, clotrimazol, econazol, ketoconazol, itraconazol, terbinafina, anfotericina, nistatina y natamicina. Los esteroides ejemplares incluyen, sin limitación, acetato de prednisona, valerato de prednisona, prednisolona, dipropionato de alclometasona, acetónido de fluocinolona, dexametasona, metilprednisolona, desonida, pivolato, pivolato de clocortolona, acetónido de triamcinolona, prednicarbato, propionato de fluticasona, flurandrenolida, furoato de mometasona, desoximetasona, betametasona, dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de betametasona, benzoato de betametasona, diacetato de diflorasona, fluocinonida, halcinonida, amcinonida, propionato de halobetasol y propionato de clobetasol. Los suplementos nutricionales ejemplares incluyen, sin limitación, vitaminas, minerales, productos a base de hierbas y aminoácidos. Las vitaminas incluyen, sin limitación, la vitamina A, las del grupo B, la vitamina C, las del grupo D, la vitamina E y la vitamina K. Los aceites esenciales incluyen, entre otros, los derivados de la menta, la salvia, el abeto, la lavanda, la albahaca, el limón, el enebro, el romero, el eucalipto, la caléndula, la manzanilla, la naranja y similares. Muchos de estos agentes se describen, por ejemplo, en la Patente WO 2008152626.
[0237] Las composiciones que contienen mitocondrias y/o agentes mitocondriales combinados pueden formularse en cualquier forma, por ejemplo, líquida, semisólida o sólida. Las composiciones ejemplares incluyen líquidos, cremas, ungüentos, pomadas, aceites, emulsiones y formulaciones liposomales, entre otras.
[0239] Las mitocondrias aisladas o los agentes mitocondriales combinados pueden incluirse en composiciones diseñadas para su uso en trasplantes de órganos, tejidos o células. La composición puede incluir mitocondrias aisladas y/o agentes mitocondriales combinados y un líquido adecuado para su administración a pacientes y/u órganosin situoex vivo, por ejemplo, para el mantenimiento de órganos, tejidos o célulasex vivo. En general, el líquido será una solución acuosa. Los ejemplos de soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución Celsior™, solución Perfadex™, solución Collins, solución de citrato, medios de cultivo de tejidos (por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)), solución de histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK) y solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (Oxford Text-book of Surgery, Morris y Malt, Eds., Oxford University Press, 1994).
[0241] La solución de almacenamiento en frío de la Universidad de Wisconsin se considera una solución estándar para el trasplante de órganos. Incluye lo siguiente: 100 mM de lactobionato de potasio, 25 mM de KH<2>PO<4>, 5 mM de MgSO<4>, 30 mM de rafinosa, 5 mM de adenosina, 3 mM de glutatión, 1 mM de alopurinol y 50 g/l de hidroxietil almidón. Se pueden añadir mitocondrias aisladas o agentes mitocondriales combinados a estos líquidos para la conservación de órganos, tejidos y células.
[0243] Cuando se administran por determinadas vías, como el tracto respiratorio (por ejemplo, la nariz, una traqueostomía o mediante un tubo endotraqueal), los tensioactivos pueden permitir que la composición llegue a las vías respiratorias distales. Así, en algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, soluciones líquidas, soluciones acuosas (cuando son solubles en agua), formulaciones en aerosol, dispersiones, polvos estériles, etc.) pueden comprender uno o más tensioactivos.
[0245] El tensioactivo puede seleccionarse del grupo que comprende tensioactivos no iónicos, catiónicos, aniónicos y zwitteriónicos. También pueden utilizarse mezclas de tensioactivos. Las clases ejemplares de tensioactivos incluyen los sulfatos de éter de alcohol, los sulfatos de alcohol, las alcanolamidas, los alquilsulfonatos, los óxidos de amina, los tensioactivos anfotéricos, los tensioactivos aniónicos, los derivados de la betaína, los tensioactivos catiónicos, los disulfonatos, el dodecilbenceno, el ácido sulfónico, los alcoholes etoxilados, los alquilfenoles etoxilados, los ácidos grasos etoxilados, los hidrótropos de ésteres de glicerol, los lauril sulfatos, los mono y diglicéridos, los tensioactivos no iónicos, los ésteres de fosfato, los tensioactivos cuaternarios y los derivados del sorbitán.
[0247] Para que sea apto para su administración a través de las vías respiratorias, también pueden utilizarse otros vehículos farmacéuticos adecuados. Estos sistemas de transporte incluyen, por ejemplo, liposomas, nanopartículas y micropartículas, ciclodextrinas, microemulsiones, micelas, suspensiones o soluciones. En algunas modalidades, estos transportadores están hechos de lípidos (por ejemplo, liposomas, niosomas, microemulsiones, micelas lipídicas, nanopartículas lipídicas sólidas) o compuestos de polímeros (por ejemplo, polimermicelas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas, no-ogeles, nanocápsulas). Estos transportadores pueden llevar el agente terapéutico a los pulmones de forma controlada. También pueden utilizarse nanotransportadores. La terapia localizada del órgano diana generalmente requiere dosis totales más pequeñas para lograr resultados clínicamente efectivos. Para alcanzar este objetivo, los nanotransportadores pueden diseñarse para que se degraden lentamente, reaccionen a estímulos y actúen en sitios específicos.
[0248] Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden incluirse en un envase, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden prepararse en una forma adecuada para su conversión a aerosol (por ejemplo, mediante un nebulizador adecuado).
[0249] EJEMPLOS
[0250] La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
[0251] Ejemplo 1: Aislamiento de mitocondrias de músculo esquelético autólogo del sujeto
[0252] Las mitocondrias se aislaron a partir de tejido muscular esquelético autólogo. La procedencia del tejido dependía del punto de entrada y acceso quirúrgico. El trasplante mitocondrial de alta eficacia generalmente requiere mitocondrias recién aisladas, viables y funcionales. Las mitocondrias no viables (por ejemplo, mitocondrias previamente congeladas), las fracciones mitocondriales (proteínas, complejo IV), el ADN y el ARN mitocondriales, y el ATP o ADP exógenos generalmente no tienen la funcionalidad suficiente.
[0253] Métodos
[0254] Para permitir el aislamiento de mitocondrias viables competentes para la respiración, se desarrolló un método rápido para el aislamiento y purificación de mitocondrias que puede realizarse en 20-30 minutos (Figura 1). Las principales ventajas de este método son: (1) requiere solo una pequeña cantidad de tejido que se puede aislar usando un punzón de biopsia n.° 6 (<0,01 g de tejido); (2) utiliza un proceso estandarizado de disociación de tejido que permite una homogeneización uniforme y consistente del tejido que no se logra fácilmente con métodos de homogeneización manual; y (3) el uso de filtración diferencial, en lugar de centrifugación, elimina los pasos de centrifugación repetitivos y que consumen mucho tiempo y acorta el tiempo de preparación. En resumen, se obtuvieron dos pequeños fragmentos de tejido muscular esquelético (< 0,1 gramos) utilizando un punzón de biopsia n.° 6. El tejido se homogeneizó en un volumen de 5 ml de tampón de aislamiento (300 mmol/Ll de sacarosa, 10 mmol/l de HEPES-KOH, 1 mmol/l de EGTA-KOH, pH 7,4) y luego se incubó durante 10 minutos con la enzima Subtilisina A en hielo. El tejido digerido se filtró a través de una serie de filtros previamente humedecidos con tampón de aislamiento, y las mitocondrias se precipitaron posteriormente mediante centrifugación a 9 x G durante 5 minutos a 4 °C.
[0255] Resultados
[0256] Las Figuras 2A-2G muestran resultados representativos para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético. La Figura 2A muestra tejido muscular esquelético obtenido mediante punción con sacabocados. La Figura 2B muestra imágenes microscópicas representativas de mitocondrias aisladas bajo iluminación de contraste de fase (campo claro, BF) (panel izquierdo) y bajo fluorescencia marcada con MitoTracker Red CMXRos (panel central). La imagen combinada se muestra en el panel derecho. Las mitocondrias obtenidas mediante este método tienen, en promedio, una viabilidad superior al 99 %. La Figura 2C muestra resultados representativos del rendimiento mitocondrial por gramo de tejido húmedo. La Figura 2D muestra imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión de mitocondrias aisladas. Las mitocondrias aisladas eran electrodensas y menos del 0,01 % de las mitocondrias estaban fracturadas o dañadas (*). La Figura 2E muestra resultados de actividad representativos para el complejo mitocondrial IV. La Figura 2F muestra los resultados representativos del consumo de oxígeno en estado 3 (activo) (respiración estimulada por ADP). La Figura 2G muestra resultados representativos para el índice de control respiratorio (RCI; estado 3/estado 4) para el consumo de oxígeno inducido por malato (complejo I) e inducido por succinato (complejo II) en mitocondrias autólogas del músculo pectoral mayor energizadas. Los datos indicaron que las mitocondrias aisladas mantienen el potencial de membrana y la viabilidad. Además, los datos indicaron que el consumo de oxígeno y el índice de control respiratorio para el complejo I inducido por malato y el complejo II inducido por succinato eran iguales a los de las mitocondrias aisladas mediante otros métodos.
[0257] Ejemplo 2: Las mitocondrias aisladas estuvieron presentes y viables durante al menos 28 días después de la inyección en el miocardio.
[0258] Una vez aisladas mediante el método descrito en el Ejemplo 1, las mitocondrias se utilizaron inmediatamente para el trasplante mitocondrial.
[0259] Dosis mitocondrial
[0260] Se realizaron experimentos para determinar la dosis óptima de mitocondrias autólogas. Estos experimentos han demostrado que 2 x 10<5>mitocondrias por gramo de tejido húmedo proporcionan una eficacia óptima.
[0261] Entrega de mitocondrias aisladas
[0262] Las mitocondrias aisladas se administraron mediante inyección directa en la región isquémica del pulmón por infusión vascular o mediante un nebulizador.
[0263] (a). La inyección directa de mitocondrias proporciona una distribución localizada de las mismas. Las mitocondrias se inyectaron en la arteria pulmonar o en la aurícula derecha utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 28. (b). La administración intravascular de mitocondrias simplifica su llegada a los tejidos y permite una amplia distribución de mitocondrias autólogas dentro del tejido.
[0264] (c). Administración de mitocondrias mediante nebulizador. Para aumentar la aplicabilidad y permitir una intervención temprana no quirúrgica, así como una intervención postoperatoria, las mitocondrias autólogas se administraron a los pulmones mediante un nebulizador.
[0265] La administración vascular proporciona una administración localizada. Se realizaron experimentos preliminares para demostrar la seguridad y la eficacia de la administración de mitocondrias autólogas mediante administración intravascular a través de la aurícula derecha y a través de la arteria pulmonar. Los resultados de los experimentos preliminares demostraron que el trasplante mitocondrial autólogo administrado por cualquiera de estas vías proporciona una administración y captación de mitocondrias específicas para cada tejido, y que es seguro y eficaz, mejorando significativamente la función pulmonar tras 2 horas de isquemia y 24 horas de recuperación.
[0266] Resultados
[0267] La microscopía de fluorescencia y la resonancia magnética han demostrado que las mitocondrias trasplantadas estuvieron presentes y fueron viables durante al menos 28 días después de su inyección en el miocardio. La mayoría de las mitocondrias se encontraron inicialmente en los espacios intersticiales entre las células. A los 30 minutos de la administración, las mitocondrias trasplantadas fueron internalizadas en las células mediante endocitosis y se observaron dentro de los cardiomiocitos, cerca del sarcolema, entre las líneas Z de los sarcómeros, y en grupos alrededor de las mitocondrias endógenas dañadas, así como cerca del núcleo. El recuento de mitocondrias inyectadas ha demostrado que el 43,52 % ± 4,46 (media ± error estándar) de las mitocondrias inyectadas están unidas a los cardiomiocitos o se encuentran dentro de ellos. Se utilizaron microscopía de superresolución tridimensional y microscopía electrónica de transmisión para determinar el destino intracelular de las mitocondrias exógenas endocitadas en cardiomiocitos derivados de células iPS humanas y fibroblastos cardíacos primarios. Los resultados mostraron que las mitocondrias aisladas se incorporaban a las células cardíacas en cuestión de minutos y luego eran transportadas por endocitosis al interior de las células, donde se fusionaban con la red mitocondrial endógena.
[0268] Las Figuras 3A-3D muestran resultados representativos de la captación y el transporte endocítico de mitocondrias extracelulares en cardiomiocitos. La Figura 3A muestra imágenes representativas de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPS-CM) que fueron expuestos a mitocondrias HCF marcadas con oro durante 2,5, 5 y 10 minutos y que fueron analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las mitocondrias marcadas presentaban depósitos electrodensos y eran visibles en los tres momentos del estudio, tanto fuera de las células, junto a la superficie celular apical, durante la endocitosis, como dentro de las células (de izquierda a derecha, indicadas por flechas). Las imágenes son representativas de cuatro experimentos realizados a los 5 minutos; las barras de escala miden 0,5 μm. La Figura 3B muestra imágenes representativas de imágenes 3D SR-SIM de cuatro colores que muestran la colocalización de mitocondrias exógenas con endosomas tempranos a las 4 horas. Los núcleos se tiñeron con DAPI y tanto las mitocondrias endógenas como las exógenas se detectaron con el anticuerpo MTC02. Se muestra la imagen combinada (izquierda) y cada color (derecha); las barras de escala representan 10 μm. La Figura 3C muestra imágenes representativas superpuestas de microscopio de mitocondrias y endosomas tardíos de HCF a la hora; las barras de escala representan 10 μm. La Figura 3D muestra imágenes representativas superpuestas de microscopio de mitocondrias con lisosomas a las 4 h; las barras de escala miden 10 μm. En las Figuras 3C y 3D, las flechas indican ejemplos de mitocondrias exógenas asociadas a cada compartimento, que también reaccionaron con el anticuerpo antimitocondria MTC02. Los núcleos se tiñeron con DAPI y las imágenes representan doce volúmenes separados analizados en cada momento (0,5, 1, 2 y 4 h); barras de escala, 0,5 μm.
[0269] Las mitocondrias trasplantadas no eran proarrítmicas, como lo demuestran el análisis de electrocardiogramas seriados de 12 derivaciones y el mapeo óptico. No se observaron taquicardia ventricular, bradicardia, fibrilación ni defectos en el sistema de conducción ni heterogeneidad de la repolarización, y no hay cambios en el ECG seriado, la duración del QRS ni el intervalo QT corregido asociados con el trasplante mitocondrial. No se observaron cambios en las alteraciones del movimiento de la pared ventricular, la hipertrofia del ventrículo izquierdo, la disfunción valvular, la fibrosis ni el derrame pericárdico, ni en el momento de la inyección ni en ningún momento hasta 4 semanas después del trasplante de mitocondrias autólogas. Además, las mitocondrias trasplantadas no produjeron ninguna respuesta inmunitaria ni inflamatoria. La respuesta autoinmune, medida mediante anticuerpos antimitochondriales utilizando inmunofluorescencia indirecta, fue indetectable.
[0271] Las mitocondrias trasplantadas pueden actuar tanto de forma extracelular como intracelular. Una vez trasplantadas, las mitocondrias mantienen su viabilidad y función durante al menos 28 días, el límite temporal de los estudios realizados hasta la fecha. Las mitocondrias trasplantadas también pueden aumentar de inmediato los niveles de ATP miocárdico y la síntesis de ATP, y alterar rápidamente el proteoma miocárdico. El análisis proteómico realizado 10 minutos después de la inyección, cuando se observaron por primera vez mejoras en la función ventricular mediante ecocardiografía epicárdica, mostró que las vías proteicas para la mitocondria y la generación de metabolitos precursores para la energía y la respiración celular son significativamente más elevadas en los corazones tratados en comparación con los corazones de control (P < 0,05, puntuación de enriquecimiento > 2,0). Entre los 10 y los 60 minutos posteriores al trasplante, las mitocondrias trasplantadas fueron internalizadas en los cardiomiocitos mediante endocitosis dependiente de actina. El número de mitocondrias internalizadas en los cardiomiocitos binucleados fue de 40,9 ± 11 por núcleo después de 1 hora y de 218,7 ± 63,7 después de 24 horas. Una vez internalizadas, las mitocondrias trasplantadas aumentan aún más (p<0,05) el contenido celular de ATP y regulan positivamente las citocinas cardioprotectoras (factor de crecimiento epidérmico, oncogén relacionado con el crecimiento, IL-6 y proteína quimiotáctica de monocitos-3). Estas citoquinas se asocian con una mejor función cardíaca al estimular el crecimiento, la proliferación y la migración celular, mejorar la vascularización, brindar protección contra la apoptosis de los cardiomiocitos y mejorar la recuperación funcional cardíaca y la remodelación cardíaca independientemente de la regeneración de los miocitos cardíacos. La isquemia también daña el ADN mitocondrial y reduce la síntesis de ATP, alteraciones que se han asociado con una mala recuperación tras la cirugía cardíaca en humanos. Este ejemplo demostró que el trasplante mitocondrial reemplazó, al menos parcialmente, el ADN mitocondrial dañado con ADN mitocondrial intacto y restauró la función de las células miocárdicas.
[0273] Ejemplo 3: Estudios preliminares en animales y humanos:
[0275] La eficacia del trasplante mitocondrial se validó en una serie de modelosin vitroein vivode corazón animal perfundido. Los resultados de estos estudios demostraron que el trasplante mitocondrial rescata la viabilidad celular del miocardio y mejora significativamente la función miocárdica post-isquémica tras una lesión por isquemia-reperfusión.
[0277] Utilizando protocolos de isquemia-reperfusión en el corazón aislado perfundido y modelosin situde corazón isquémico regional, se demostró que el trasplante mitocondrial autólogo es seguro y eficaz. Los estudios demostraron que tanto la administración directa como la vascular de mitocondrias mejoran significativamente la lesión por isquemia-reperfusión y potencian la viabilidad celular del miocardio y la recuperación funcional post-isquémica del mismo. Estos efectos fueron evidentes durante al menos 28 días, el punto final de los experimentos de supervivenciain situ.
[0279] Los pacientes pediátricos con isquemia-reperfusión significativa requieren soporte mecánico mediante oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO). Se ha demostrado que el uso de la ECMO es una técnica que salva vidas, pero puede provocar complicaciones como hemorragias, respuesta inflamatoria sistémica e infecciones, por lo que solo puede utilizarse durante un período de tiempo limitado. Si no se logra la recuperación miocárdica durante el tiempo que dura el soporte con ECMO, el paciente finalmente sucumbe a las complicaciones de la ECMO, que pueden causar lesión por isquemia-reperfusión tanto durante como después de que el paciente esté canulado. Los estudios han demostrado que la imposibilidad de retirar el soporte ECMO a los pacientes en un plazo de 72 horas es un indicador de pronóstico grave, con una supervivencia global inferior al 30 %. Se realizó un estudio piloto en humanos que demostró que la inyección directa de mitocondrias autólogas mejoró significativamente la función ventricular en cinco pacientes pediátricos, lo que permitió la decanulación de la ECMO. Ninguno de los pacientes experimentó efectos adversos y no se presentaron complicaciones como arritmias, hematomas intramiocárdicos o respuestas inflamatorias. Este estudio piloto fue la primera aplicación clínica de la novedosa técnica de trasplante mitocondrial autólogo para mejorar la función cardíaca en pacientes con lesión por isquemia-reperfusión.
[0281] Ejemplo 4:La administración de mitocondrias exógenas en forma de aerosol al tracto respiratorio da como resultado su localización (e internalización) en las células que recubren el tracto respiratorio.
[0283] Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio dan como resultado su localización (e internalización) en las células que recubren dicho tracto, se preparó un aerosol compuesto por mitocondrias marcadas y se administró mediante un sistema nebulizador, evaluándose posteriormente su biodistribución en el tejido pulmonar.
[0284] Métodos
[0285] Modelo animal
[0286] Para los experimentos se seleccionó el modelo murino de lesión por isquemia-reperfusión pulmonar. Los ratones C57BL/6J están bien caracterizados y constituyen un modelo establecido para su uso en la interfase aire-líquido, lo que permite comparar los resultados.
[0287] Biodistribución
[0288] La visualización de la biodistribución de mitocondrias exógenas en el pulmón se realizó en ratas en lugar de ratones para mejorar la visualización y el análisis de la distribución. El modelo de ratón no proporciona una superficie suficiente para detectar la biodistribución. En resumen, se anestesiaron ratas Wistar (200 g) mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral utilizando un catéter de plástico de calibre 20G y se ventiló mecánicamente a las ratas con un volumen corriente de 10 ml/kg y una frecuencia respiratoria de 130 a 140 respiraciones/min. Se practicó una toracotomía izquierda en el tercer espacio intercostal y se expuso la arteria pulmonar. La biodistribución de mitocondrias exógenas se determinó marcando mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos con Rodamina<18>F 6-G. El uso de mitocondrias humanas en un modelo de rata, ratón o cerdo permite diferenciar entre mitocondrias nativas y mitocondrias trasplantadas basándose en la reactividad inmunológica a un anticuerpo monoclonal anti-mitocondria humana.
[0289] Administración vascular
[0290] El mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos marcadas con Rodamina<18>F 6-G se administraron en bolo en 0,3 ml de tampón de respiración (250 mmol/l de sacarosa, 20 mmol/l de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/l de K+-EGTA, pH 8,0) mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 40 G.
[0291] Administración mediante nebulizador
[0292] Las mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos marcadas con Rodamina<18>F 6-G en 90 μl en solución tampón respiratoria se administraron a todo el pulmón utilizando un nebulizador Flexivent nebulizer, durante un tiempo total de 40 s (10 s de nebulización, seguido de 1 minuto de ventilación mecánica regular, repetido 4 veces).
[0293] Medición de la concentración de mitocondrias
[0294] Tras su administración, se permitió que las mitocondrias circularan durante 30 minutos para facilitar su eliminación, y posteriormente se sacrificó a las ratas mediante una sobredosis de dióxido de carbono. La biodistribución mitocondrial se determinó mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y microtomografía computarizada (μCT) utilizando un sistema de imágenes preclínicas Albira PET/- SPECT/CT (Bruker, Billerica, MA).
[0295] Cuantificar la captación celular de mitocondrias administradas
[0296] Para confirmar la presencia de mitocondrias exógenas en el tejido pulmonar e identificar la captación celular pulmonar, se obtuvieron secciones de los pulmones derecho e izquierdo, se fijaron con parafina y se sometieron a análisis inmunohistoquímico.
[0297] Resultados
[0298] Las Figuras 4A-4C muestran los resultado de mitocondrias<18>F Rodamina 6-G (6 x 10<7>) administradas a los pulmones mediante infusión vascular a través de la arteria pulmonar en un modelo de rata y visualizado mediante tomografía por emisión de positrones (PET) y microtomografía computarizada (μCT) utilizando un sistema de imágenes Alvira (Bruker, Billerica, MA). Estos resultados demuestran que la administración de mitocondrias a los pulmones da como resultado una distribución específica de las mitocondrias trasplantadas en todo el tejido pulmonar.
[0299] Las Figuras 5A-5B muestran los resultados de la detección inmunohistoquímica y la captación celular de mitocondrias exógenas en tejido pulmonar de ratón administradas mediante nebulizador y a través de la arteria pulmonar. Las mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos se detectaron utilizando el anticuerpo antimitocondria humana (MTC02 [biotina] - Abcam, Cambridge, Reino Unido, número de catálogo: #ab79479) y Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y cromógeno de sustrato AEC+ (Dako, Agilent, Santa Clara, CA). El uso de mitocondrias humanas en un modelo de rata, ratón o cerdo permite diferenciar entre mitocondrias nativas y mitocondrias trasplantadas basándose en la reactividad inmunitaria a un anticuerpo monoclonal anti-mitocondria humana. En las figuras, las mitocondrias se muestran como puntos negros. Se detectaron mitocondrias dentro y alrededor de las células endoteliales pulmonares, los neumocitos, el parénquima y los alvéolos.
[0300] Ejemplo 5: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio pueden aliviar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (IPA).
[0301] Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio de un ratón son suficientes para aliviar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (IPA) en un modelo de IPA en ratones, se preparó un aerosol que contenía mitocondrias marcadas y se administró utilizando un sistema nebulizador. Posteriormente, se realizaron ensayos para evaluar la función e integridad pulmonar.
[0302] Métodos
[0303] Modelo animal
[0304] Se utilizaron ratones macho C57BL/6J (de 8 a 10 semanas de edad, procedentes del Laboratorio Jackson, Bar Harbor, ME). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston y cumplen con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales.
[0305] Aislamiento mitocondrial
[0306] Se aislaron mitocondrias del músculo esquelético obtenido de ratones singénicos C57BL/6J. No existe ninguna reacción, directa o indirecta, aguda o crónica, de alorreactividad, alorecognición o de moléculas con patrones moleculares asociados al daño (DAMPs) a las inyecciones únicas o seriadas de mitocondrias singénicas. En resumen, se disecó el músculo esquelético de ratones C57BL/6J y se utilizó inmediatamente para aislar mitocondrias singénicas. Se aislaron las mitocondrias y se determinó el número y la viabilidad de las mitocondrias aisladas. Las mitocondrias aisladas se suspendieron en 0,3 ml de tampón de respiración y se utilizaron inmediatamente para el trasplante mitocondrial.
[0307] Modelo ALI de pulmón murino:
[0308] Se realizó una intervención quirúrgica con oclusión del hilio izquierdo durante 2 horas para inducir una lesión por isquemia/reperfusión. En resumen, se anestesiaron ratones C57BL/6J mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se les mantuvo anestesiados durante la cirugía con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral utilizando un catéter de plástico de calibre 20G y se ventiló mecánicamente a los ratones con un volumen corriente de 10 ml/kg y una frecuencia respiratoria de 130-140 respiraciones/min. Se practicó una toracotomía izquierda en el tercer espacio intercostal y se expuso el hilio pulmonar izquierdo.
[0309] Isquemia pulmonar aguda:
[0310] El hilio izquierdo se ocluyó al final de la espiración durante 2 horas utilizando una pinza microvascular (Roboz Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE. UU.) y el volumen corriente se redujo a 7,5 ml/kg. La incisión quirúrgica se cubrió con una gasa empapada en una solución de heparina que contenía (60 UI de heparina/1 ml). Al finalizar el período de isquemia, se retiró el clip.
[0311] Grupos experimentales:
[0312] Los animales fueron asignados aleatoriamente a tres grupos experimentales:
[0313] (a). Administración vascular (V): Inmediatamente después del período de isquemia y la retirada del clip, se seleccionaron animales al azar para recibir 0,3 ml de solución tampón respiratoria (Vehículo-V) o 0,3 ml de solución tampón respiratoria que contenía mitocondrias (Mitocondrias-V). El vehículo y las mitocondrias se administraron en bolo de 0,3 ml mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 40 G. Las concentraciones de mitocondrias se determinaron mediante los métodos descritos en este documento.
[0314] (b). Nebulización (N): Inmediatamente después del período de isquemia y la retirada del clip, se seleccionaron animales al azar para recibir 90 μl de tampón respiratorio (Vehículo-N) o 90 μl de tampón respiratorio que contenía mitocondrias (Mitocondrias-N). El vehículo y las mitocondrias se administraron a todo el pulmón mediante un nebulizador Flexivent durante un tiempo total de 40 segundos (10 segundos de nebulización seguidos de 1 minuto de ventilación mecánica normal, repetido 4 veces). Se determinaron las concentraciones de mitocondrias. Para tener en cuenta el volumen 2/3 mayor en los estudios con nebulizador (incluidos los lóbulos derecho e izquierdo), se utilizó una concentración 3 veces mayor.
[0315] (c): Los ratones del grupo de control simulado fueron sometidos a una toracotomía sin pinzamiento hiliar y se les aplicó ventilación mecánica durante 2 horas antes de regresar a su jaula. Se requiere un grupo de control simulado para aislar los efectos específicos causados por la anestesia, el traumatismo de la incisión y el posible traumatismo en el tejido animal durante la operación.
[0316] Determinar la concentración mitocondrial óptima necesaria para permitir la mejora de la ALI.
[0317] La administración de 2 x 10<5>mitocondrias autólogas por gramo de tejido húmedo proporciona cardioprotección al corazón. Para determinar la concentración mitocondrial óptima para la seguridad y la eficacia en el pulmón para ALI, se probaron varias dosis, específicamente 2 x 10<5>, 2 x 10<6>y 2 x 10<7>mitocondrias por gramo de tejido húmedo.Análisis funcional pulmonar
[0318] Tras 24 horas de recuperación (reperfusión del pulmón isquémico), los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg). Se realizó una traqueostomía o una intubación endotraqueal utilizando un catéter de plástico de calibre 18G y se ventiló mecánicamente a los ratones. Se practicó una laparotomía media y una esternotomía para exponer el pulmón, y se pinzó el hilio izquierdo para evaluar la función del pulmón izquierdo lesionado. El volumen corriente (VC) se redujo a 5 ml/kg y luego los ratones se conectaron al ventilador especializado para roedores (Flexi-Vent, SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá) para evaluar la presión inspiratoria máxima (PIP), la resistencia del sistema respiratorio (Rrs), la compliancia del sistema respiratorio (Crs), la elastancia del sistema respiratorio (Ers) y la amortiguación tisular (G) del pulmón izquierdo.Análisis de moléculas con patrones moleculares asociados a daños (DAMPs)
[0319] Para determinar si existen lesiones relacionadas con las DAMP asociadas a la inyección de mitocondrias singénicas o alogénicas, se detectó ADN mitocondrial libre circulante. Se utilizaron cebadores únicos que permiten estimar el ADNmt libre circulante, y el método tiene en cuenta las secuencias de inserción mitocondrial nuclear que pueden afectar la cuantificación precisa del ADNmt. En resumen, se extrajo el ADN total (nuclear y mitocondrial) utilizando un kit DNeasy Blood & Tissue siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). El ADN se cuantificó mediante Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE) y se ajustó a 10 ng/µl. El ADN mitocondrial libre circulante (ADNmt) se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.
[0320] Cebadores (Eurofins Genomics, Louisville, KY)for mouse mtDNA (mMitoF1, (5’ → 3’) CTAGAAACCCCG AAACCAAA (SEQ ID NO: 1); mMitoR1 (5’ → 3’) CCA GCTATCACCAAGCTCGT (SEQ ID NO: 2)), y beta-2 microglobulina de ratón (mB2MF1: (5’ → 3’) ATGGGAAG CCGAACATACTG (SEQ ID NO: 3); mB2MR1: (5’ → 3’): CAGTCTCAGTGGGGGTGAAT (SEQ ID NO: 4)) se utilizaron para amplificar el ADNmt del ratón. La PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA). Todos los ensayos se realizaron utilizando un instrumento Eppendorf Mastercyclerep realplex2 (Eppendorf, Hauppauge, NY). Las condiciones de la PCR en tiempo real (qPCR) consisten en una preincubación de 5 minutos a 95 °C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, hibridación a 56 °C durante 15 segundos y extensión a 60 °C durante 15 segundos. Una vez finalizada la reacción de qPCR, se realizó un análisis de curva de fusión que consistió en fundir a 95 °C durante 5 segundos, enfriar a 65 °C durante 60 segundos, seguido de calentar a 95 °C con monitorización continua de la fluorescencia y, finalmente, enfriar a 40 °C durante 30 segundos. El cambio de pliegue del ADNmt se normalizó con respecto al ADN nuclear de copia única utilizando la fórmula 2-ΔCt (ΔCt=CtADNmt-CtB2M).
[0321] Imágenes de tejido pulmonar teñido para evaluar la integridad pulmonar
[0322] Los pulmones fueron recogidos y divididos en 3 partes iguales. Se utilizó la parte superior del pulmón para evaluar el edema tisular calculando la relación peso húmedo/peso seco (w/d). Inmediatamente después de la recolección, se pesó el pulmón (peso húmedo), se colocó en un horno a 70 °C durante 72 horas, luego se volvió a pesar (peso seco) y se calculó la relación de peso húmedo/seco. La parte central del pulmón se fijó inmediatamente en formalina al 10 %. El tejido se incluyó en parafina y se cortó en secciones de 5 μm de espesor. Se utilizaron cortes seriados para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción de mieloperoxidasa y el ensayo TUNEL. Se utilizó la parte basal del pulmón para realizar microscopía electrónica de transmisión con el fin de analizar el daño estructural en el pulmón. Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina se evaluaron como un indicador de la gravedad de la lesión pulmonar mediante un sistema de puntuación. Se analizaron veinticinco campos visuales aleatorios (20X) por sección. La lesión pulmonar se clasificó según la infiltración o acumulación de células inflamatorias en el espacio aéreo o la pared del vaso:
[0323] Grado 1: solo pared;
[0324] Grado 2: pocas células (1-5 células) en el espacio aéreo;
[0325] Grado 3: intermedio; y
[0326] Grado 4: grave (espacio aéreo congestionado).
[0327] Para la congestión intersticial y la formación de membrana hialina, se utilizan los siguientes grados:
[0328] Grado 1: pulmón normal;
[0329] Grado 2: moderado (25 % de la sección pulmonar);
[0330] Grado 3: intermedio (25-50 % de la sección pulmonar); y Grado 4: grave (50 % de la sección pulmonar); Para la hemorragia, se utilizan los siguientes grados.
[0331] Grado 0: ausente; y
[0332] Grado 1: presente.
[0333] Resultados
[0334] La Figura 6 muestra imágenes macroscópicas representativas de pulmones de ratón tras 2 horas de isquemia pulmonar izquierda por isquemia aguda de las extremidades inferiores y 24 horas de recuperación. Los pulmones que fueron sometidos al procedimiento de isquemia están indicados con un círculo rojo. El pulmón derecho se muestra como R, el pulmón izquierdo como L. El corazón (H) se muestra en cada imagen. Los pulmones del vehículo presentaban edema severo y daño celular (Vehículo-V). Por el contrario, los pulmones que recibieron tratamiento con mitocondrias conservaron la estructura celular macroscópica.
[0335] Las Figuras 7A-7B muestran métricas cuantificadas de la integridad pulmonar, específicamente la resistencia y la elastancia pulmonar, en el pulmón del ratón (n=4). La resistencia (Figura 7A) y la elasticidad (Figura 7B) se midieron en pulmones de ratones sometidos a 2 horas de isquemia en el pulmón izquierdo tras 24 horas de recuperación. El vehículo o las mitocondrias se administraron por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda (V) o mediante nebulizador (N). La concentración de mitocondrias fue de 2 x 10<7>mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido pulmonar. Las mitocondrias liberadas por nebulizador fueron 6 x 10<7>mitocondrias por gramo de peso húmedo de tejido pulmonar para tener en cuenta los volúmenes pulmonares añadidos. Estos resultados demuestran que el trasplante mitocondrial administrado por vía vascular o mediante aerosol utilizando un nebulizador preserva significativamente la resistencia y la elastancia pulmonar en comparación con los pulmones tratados con el vehículo. Los resultados tampoco muestran diferencias significativas entre los controles simulados (sin isquemia) y los pulmones isquémicos que recibieron mitocondrias administradas por vía intravascular a través de la arteria pulmonar izquierda o mediante un nebulizador. Se han obtenido resultados similares para la amortiguación tisular y la distensibilidad pulmonar.
[0336] La Figura 8A muestra la cuantificación del ADNmt libre circulante determinado por PCR en tiempo real en muestras de sangre completa en ratones BALB/cJ que recibieron solo tampón de respiración (Sham) o mitocondrias (3 x 10<7>en la solución tampón de respiración). Se obtuvieron muestras de sangre 10 días después de la inyección intraperitoneal. El cambio de expresión del ADN mitocondrial (media ± error estándar) se normalizó con respecto al ADN nuclear de copia única (beta-2 microglobulina). Los resultados no muestran un aumento en el ADNmt libre circulante con las inyecciones de mitocondrias en comparación con el grupo control (P = 0,96). La Figura 8B muestra micrografías representativas de tejido pulmonar teñido con hematoxilina y eosina. La Figura 8C muestra micrografías representativas de tejido pulmonar teñido con la tinción tricrómica de Masson. El análisis histológico pulmonar no mostró diferencias ultraestructurales en las secciones seriadas de pulmón con inyecciones de mitocondrias en comparación con el grupo control (Sham). Todas las secciones muestran epitelios normales de los conductos respiratorios y los alvéolos. La Figura 8D muestra micrografías electrónicas de transmisión representativas del lóbulo inferior derecho. Las imágenes de microscopía electrónica muestran endotelios y membranas basales conservados en todos los grupos. Las barras de escala miden 1 µm. Las flechas indican el espacio alveolar. El análisis histológico y mediante microscopía electrónica del tejido pulmonar no mostró evidencia de inflamación ni de daño celular. No se observaron signos de necrosis de las células miocárdicas, según lo determinado por la tinción con TTC, ni evidencia de un aumento del contenido de colágeno en el tejido miocárdico o en el endotelio pulmonar, ni daño en la membrana basal.
[0337] Ejemplo 6: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio son suficientes para aliviar los síntomas en un modelo de ALI porcino.
[0338] El pulmón porcino tiene volúmenes comparables a los pulmones humanos, lo que lo convierte en un modelo ventajoso para el estudio de la función respiratoria. Los pulmones porcinos tienen linajes celulares y una composición comparable a la de los pulmones humanos. La distribución anatómica general de las vías respiratorias porcinas reproduce la de los humanos, con algunas excepciones menores. El cartílago que rodea las vías respiratorias porcinas tiene una distribución más amplia que en los humanos, extendiéndose más abajo en el árbol traqueobronquial. El pulmón porcino tiene solo 3 generaciones de bronquiolos después de la última placa cartilaginosa antes de llegar al lobulillo, mientras que los humanos tienen aproximadamente 10 generaciones. Otras diferencias menores incluyen bronquiolos terminales porcinos más largos que en los humanos, así como bronquiolos respiratorios porcinos más cortos y menos definidos. Al igual que los humanos, los cerdos poseen un arsenal completo de efectores inmunitarios innatos en el tracto respiratorio para proteger las superficies mucosas, provocar respuestas inflamatorias y orquestar respuestas inmunitarias adaptativas. Por lo tanto, replicar los experimentos en un modelo animal grande (por ejemplo, un modelo porcino) utilizando los mismos instrumentos y protocolos que se usan en humanos puede proporcionar una mayor relevancia para su uso clínico en humanos.
[0339] Métodos
[0340] Modelo animal
[0341] Los cerdos de la raza Yorkshire (machos y hembras, de 40 a 50 kg) se asignan aleatoriamente a cada grupo. El modelo porcino presenta muchas ventajas en términos de relevancia clínica. La fisiología del cerdo se asemeja mucho a la del ser humano adulto, y este modelo puede aportar relevancia quirúrgica para la comprobación experimental antes de su aplicación en humanos. El pulmón de cerdo es un modelo excelente para el pulmón humano normal, y es un modelo establecido de lesión por isquemia-reperfusión pulmonar.
[0342] Protocolo experimental
[0343] A los cerdos se les induce la anestesia con Telazol (4-6 mg/kg, IM) y Xilazina (1,1-2,2 mg/kg, IM), seguido de la colocación de un catéter en la vena auricular. El animal es intubado con un tubo endotraqueal con manguito y ventilado mecánicamente mediante ventilación controlada por volumen con TV 10 ml/kg, FiO<2>0,4, PEEP 5 cm H<2>O, RR 12-15 respiraciones/minuto ajustadas para obtener PaCO<2>35-45 mmHg al inicio. La anestesia general se induce con isoflurano (hasta un 3 %) y se mantiene con 0,5-4 %).
[0344] Toma de muestras de sangre
[0345] Se coloca un catéter en la arteria femoral por vía percutánea para monitorizar la presión arterial media (PAM) y para la toma de muestras de sangre arterial durante todo el procedimiento. Como alternativa, puede utilizarse un catéter de la arteria carótida que se coloca mediante una incisión. La vena femoral o la vena yugular pueden canularse con un catéter colocado percutáneamente para la monitorización de la presión venosa central y la toma de muestras de sangre venosa. En los casos en que no sea posible cateterizar estos vasos mediante ecografía, se realiza una incisión y se introduce un catéter en el vaso bajo visualización directa. A continuación, la herida se sutura con hilo Vicryl o PDS (4-0). Se administra heparina sódica a una dosis de 200 UI/kg por vía auricular antes de pinzar el hilio pulmonar izquierdo para alcanzar un tiempo de coagulación activado (ACT) objetivo > 300 segundos. El tiempo de coagulación activado (ACT) se controla durante toda la cirugía; si es necesario, la coagulación se puede ajustar con una dosis adicional de heparina para mantener el ACT por encima de 300 segundos. Si durante la cirugía se produce fibrilación ventricular, se administra al paciente lidocaína al 1 % (5 ml, vía intravenosa). Durante todo el procedimiento, se infunde solución de Ringer lactato o solución salina a través de la vena auricular o la vena femoral para mantener la presión arterial. Tras verificar la anestesia profunda, se realiza una toracotomía izquierda sobre el 5<o>espacio intercostal para acceder al hilio pulmonar izquierdo. Como alternativa, se puede utilizar una esternotomía media si el acceso al hilio es limitado en el abordaje por toracotomía. La arteria pulmonar se canula con un catéter umbilical de PVC para la monitorización de la presión arterial pulmonar (PAP). A continuación, se canula la aurícula izquierda a través de la orejuela izquierda mediante un catéter umbilical de PVC para medir la presión auricular izquierda y para la toma de muestras de sangre. La temperatura corporal central se controla y mantiene continuamente mediante una almohadilla térmica.
[0346] Monitorización del flujo sanguíneo
[0347] Se pueden diseccionar la aorta ascendente y la arteria pulmonar principal, y se les acoplan sondas de flujo transónico para monitorizar el flujo sanguíneo.
[0348] Evaluación de la función miocárdica
[0349] La función miocárdica se puede evaluar colocando un catéter de conductancia directamente en la cavidad del ventrículo derecho e izquierdo. Los catéteres se pueden insertar a través de una sutura en bolsa de tabaco. La sutura en jareta puede prevenir el sangrado y mantener el catéter en su lugar. Como alternativa, el catéter del ventrículo derecho puede colocarse a través del sistema venoso central mediante la vena yugular. Las grabaciones se pueden obtener de forma continua a lo largo de todo el experimento.
[0350] Ecocardiografía
[0351] Puede realizarse una ecocardiografía epicárdica para determinar la función miocárdica. Se obtienen ecocardiogramas epicárdicos bidimensionales al inicio del estudio, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o solución tampón de respiración, y a las 3 horas posteriores a la inyección.
[0352] Aislamiento mitocondrial
[0353] El músculo pectoral mayor o recto abdominal puede localizarse y diseccionarse, y se pueden extraer quirúrgicamente dos pequeños fragmentos de tejido muscular (aproximadamente 0,01 g) mediante un punzón de biopsia, que se utilizarán para el aislamiento mitocondrial en condiciones estériles. El aislamiento mitocondrial puede realizarse en menos de 30 minutos, de acuerdo con los estándares de laboratorio actuales, para mantener su relevancia clínica.
[0354] Isquemia aguda del pulmón izquierdo
[0355] Se puede extirpar un segmento del bronquio principal izquierdo de 1 cm de longitud para eliminar cualquier circulación bronquial. El hilio pulmonar (arteria, venas y bronquio) se pinza durante 90 minutos. La ventilación se puede ajustar para ventilación de un solo pulmón a TV 6 ml/kg, PEEP 5 cmH<2>O, FiO<2>se ajusta en función de niveles de SO<2>. La ventilación pulmonar unilateral se mantiene durante 90 minutos. Si durante el período isquémico la presión máxima de las vías respiratorias, Pmáx, aumenta hasta 20-22 cmH<2>O, la ventilación controlada por volumen se puede cambiar a ventilación controlada por presión con Pmáx 20-22 cmH<2>O para prevenir un barotrauma pulmonar. La oclusión bronquial puede confirmarse visualmente por la desinflación del pulmón izquierdo, con ausencia de movimientos inspiratorios y espiratorios.
[0356] Grupos experimentales:
[0357] (a) Grupo de control simulado: el hilio izquierdo puede diseccionarse pero no pinzarse (no hay isquemia pulmonar izquierda presente) y el animal puede ser monitoreado durante 90 minutos y luego durante 3 horas adicionales durante la reperfusión. Tras 90 minutos de isquemia en el pulmón izquierdo, puede retirarse la pinza hiliar y el pulmón izquierdo recibe una única inyección de 15 ml de solución tampón de respiración estéril (Vehículo-V) o una única inyección de 15 ml de solución tampón de respiración estéril que contiene mitocondrias (Mitocondrias-V). (b) La administración vascular de mitocondrias o inyecciones de vehículo puede administrarse en forma de bolo en la arteria pulmonar izquierda utilizando una aguja de 18 G. El punto de inyección se puede suturar con hilo de Prolene de tamaño 4-0 para controlar el sangrado.
[0358] (c) La administración mediante nebulizador se puede realizar utilizando un nebulizador de grado comercial (Allied Health Care) conectado al circuito del ventilador.
[0359] La reperfusión puede prolongarse durante un período de 3 horas. Los animales permanecen bajo anestesia durante este tiempo.
[0360] Recopilación de datos
[0361] La MAP, la CVP, la PAP y la LAP se registrarán al inicio, al comienzo del período de reperfusión, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o tampón de respiración, y a las 1, 2 y 3 horas durante la reperfusión. Las mediciones respiratorias para la presión máxima inspiratoria, la presión de meseta inspiratoria y la sangre arterial y venosa mixta para la gasometría arterial se realizarán al inicio, al comienzo del período de reperfusión, inmediatamente antes de la inyección de mitocondrias autólogas o tampón respiratorio, y a las 1, 2 y 3 horas durante la reperfusión.
[0362] Lavado broncoalveolar
[0363] El lavado pulmonar izquierdo y derecho puede realizarse al final del período de reperfusión. El lavado broncoscópico puede realizarse introduciendo un catéter por la boca, a través de la tráquea, en el lóbulo caudal, primero del pulmón izquierdo y luego del derecho. A continuación, pueden introducirse 30 ml de solución salina en el pulmón y aspirar el líquido después de un minuto. Posteriormente, pueden introducirse otros 15 ml de solución salina en el pulmón y aspirarla después de un minuto. El líquido aspirado puede utilizarse para su posterior análisis. El líquido de lavado broncoalveolar (LBA) se puede centrifugar inmediatamente a 4 °C a 500 x G durante 5 minutos, y el sobrenadante puede recogerse y almacenarse a -80 °C hasta su posterior análisis para determinar los niveles de expresión de citocinas y quimiocinas. Eve Technology (Calgary, AB, Canadá) puede realizar análisis de citocinas y quimiocinas. Se pueden analizar los siguientes biomarcadores: Eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNgamma, IL-1alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1alfa, MIP-1beta, MIP-2, RANTES, TNFalfa, VEGF. Todas las muestras pueden analizarse por triplicado.
[0364] Mediciones de resultados primarios
[0365] Mediciones hemodinámicas que incluyen, por ejemplo, FC, LVPDP, CF, LVEDP, dP/dT, CO, PVR, LAP y mediciones de la función pulmonar que incluyen, por ejemplo, Oxígeno -PaO<2>, PpvO<2>, OI, SO<2>, AaDO<2>, compliancia, elastancia, resistencia, Cdyn, PEEP, Ccs, PIP, Rrs, Crs, Ers y G (amortiguación tisular del pulmón izquierdo) y bucles de presión y volumen pulmonar pueden realizarse en la línea de base, al comienzo del período de reperfusión, inmediatamente antes del tratamiento con mitocondrias autólogas o tampón respiratorio, y a las 1, 2 y 3 horas de reperfusión. El lavado broncoalveolar de ambos pulmones se realiza al final del período de reperfusión. Se pueden determinar las respuestas bioquímicas y proteómicas, así como las de citocinas, quimiocinas e inmunitarias. Las respuestas inflamatorias pulmonares pueden examinarse analizando la PPI, la OI, la histología y la expresión de citocinas inflamatorias. La apoptosis pulmonar puede determinarse mediante la técnica TUNEL y el edema pulmonar. La función pulmonar antes y después de la isquemia puede determinarse para cada concentración mitocondrial, y pueden realizarse análisis bioquímicos e histológicos para determinar la eficacia de cada concentración.
[0366] Plan estadístico y análisis de datos
[0367] El análisis de potencia indicó que un tamaño de muestra de 6 animales por grupo proporciona más del 85 % de potencia para detectar una diferencia igual al doble de la desviación estándar dentro del grupo (α=0,05, bilateral) y el 82 % para detectar una diferencia igual a 2,5 veces la desviación estándar dentro del grupo (α = 0,0083, bilateral, criterio de significación ajustado de Bonferroni para comparaciones post hoc entre 5 grupos). Para la presencia/ausencia de un hallazgo, 6 animales por grupo tendrían una potencia del 95 % para detectar un efecto que se produzca en al menos el 40 % de los animales, mientras que 10 animales por grupo tendrían una potencia del 95 % para detectar un efecto que se produzca en al menos el 26 % de los animales. Una muestra de 10 animales puede proporcionar una potencia estadística del 80 % (α bilateral = 0,05, β = 0,20) para detectar una diferencia media del 10 % o más entre los grupos de tratamiento y control, asumiendo una desviación estándar combinada del 10 % (tamaño del efecto = 1,0) con una prueba t de Student para grupos independientes (nQuery Advisor versión 7.0, Statistical Solutions, Cork, Irlanda). Este tamaño de muestra también puede proporcionar una potencia del 80 % para detectar una diferencia de 24 horas entre los grupos utilizando una prueba U de Mann-Whitney. Según estudios preliminares y la mortalidad animal, cada grupo experimental suele estar compuesto por aproximadamente entre 6 y 10 animales. Se calcula la media ± el error estándar de la media para todos los datos de todas las variables. Las comparaciones simples entre antes y después de la intervención se realizan mediante una prueba t de Student pareada de dos colas, si los datos tienen una distribución normal, o una prueba de rangos con signo de Wilcoxon para otros datos continuos. Cuando un animal presenta una única variable con distribución normal, se utiliza un análisis de varianza unidireccional para comparar grupos y extensiones del marco del modelo lineal generalizado para evaluar los efectos de otras variables. Cuando se realizan múltiples mediciones en un animal, se puede utilizar el análisis de varianza de modelo mixto (MM-ANOVA) para evaluar la significación estadística con el grupo y/o el fármaco como efectos fijos e incorporar las mediciones repetidas a lo largo del tiempo como un factor intrasujeto. En general, las correlaciones de correlación autorregresiva (AR (1)) pueden utilizarse para modelar la relación entre mediciones a lo largo del tiempo. AR (1) es un método estándar para modelar datos a lo largo del tiempo y significa que las mediciones cercanas entre sí están más correlacionadas que las mediciones más distantes. Para variables que no siguen una distribución normal, pueden realizarse transformaciones de datos para normalizarlos (por ejemplo, transformaciones logarítmicas) o bien, los datos pueden analizarse utilizando ecuaciones de estimación generalizadas.
[0368] Significancia estadística
[0369] Un umbral P < 0,05 indica significación estadística. Las comparaciones post hoc entre grupos se ajustan para comparaciones múltiples mediante una corrección de Bonferroni. La eficacia se puede comparar utilizando la prueba exacta de Fisher. La aleatorización se puede realizar utilizando el paquete de software R basado en una asignación 1:1 utilizando un generador de números uniformes (0,1). El análisis estadístico puede realizarse utilizando SAS versión 9.3 (SAS Institute, Cary, NC).
[0370] Resultados
[0371] Se espera que las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio sean suficientes para aliviar los síntomas en un modelo porcino de ALI (lesión pulmonar aguda).
[0372] EJEMPLO 7: Las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio son suficientes para mejorar los síntomas en un modelo de ALI de ratón.
[0373] Para evaluar si las mitocondrias exógenas preparadas y administradas en forma de aerosol al tracto respiratorio de un ratón son suficientes para aliviar los síntomas de la isquemia pulmonar aguda (IPA) en un modelo de IPA en ratones, se preparó un aerosol que contenía mitocondrias marcadas y se administró utilizando un sistema nebulizador. Posteriormente, se realizaron ensayos para evaluar la función e integridad pulmonar.
[0374] Métodos
[0375] Animales
[0376] Se utilizaron ratones macho C57BL/6J (de 8 a 10 semanas de edad, n = 35; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston y cumplen con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales.
[0377] Aislamiento mitocondrial
[0378] Se disecó el músculo gastrocnemio de ratones C57BL/6J (n = 6) y se utilizó inmediatamente para aislar mitocondrias singénicas. Se aislaron las mitocondrias y se determinó el número y la viabilidad de las mitocondrias aisladas como se describió anteriormente. Las mitocondrias aisladas se suspendieron en 0,3 ml de tampón de respiración (250 mmol/l de sacarosa, 20 mmol/l de tampón K+-HEPES, pH 7,2, 0,5 mmol/l de K+-EGTA, pH 8,0) para el grupo de administración vascular o en 90 μl de tampón de respiración para el grupo de administración por nebulización, y se utilizaron inmediatamente para el trasplante mitocondrial.
[0379] Modelo IRI de pulmón murino
[0380] El protocolo experimental se muestra en la Figura 1. La cirugía se realizó según el procedimiento descrito previamente, con algunas modificaciones. En resumen, se anestesiaron ratones C57BL/6J (n = 29) mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg) y se les mantuvo anestesiados durante la cirugía con isoflurano inhalado al 0,5 %. Se realizó una intubación endotraqueal oral utilizando un catéter de plástico de calibre 20G y se ventiló mecánicamente a los ratones con un volumen corriente de 10 ml/kg y una frecuencia respiratoria de 130-140 respiraciones/min. Se realizó toracotomía izquierda en el 3<er>espacio intercostal y se expuso el hilio pulmonar izquierdo. El hilio izquierdo se ocluyó al final de la espiración durante 2 horas utilizando una pinza microvascular (Roboz Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE. UU.) y el volumen corriente se redujo a 7,5 ml/kg. La incisión quirúrgica se cubrió con una gasa empapada en una solución de heparina que contenía (60 UI de heparina/1 ml). Al finalizar el período de isquemia, se retiró el clip. Los animales fueron asignados aleatoriamente a 2 grupos experimentales: grupo de administración vascular (V) o grupo de nebulización (Neb). En el grupo de administración vascular al comienzo de la reperfusión, se administraron 1 x 10<8>mitocondrias en 0,3 ml de tampón de respiración (Mito V, n = 6) o en 0,3 ml de tampón de respiración (Vehículo V, n = 7) al pulmón izquierdo mediante inyección en la arteria pulmonar izquierda utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 40 G. En el grupo de administración por nebulización al inicio de la reperfusión, se administraron 3 x 10<8>mitocondrias en 90 μl de tampón de respiración (Mito Neb, n = 6) o 90 μl de tampón de respiración (Vehículo Neb, n = 6) a todo el pulmón durante un tiempo total de 40 s (10 s de nebulización seguidos de 1 minuto de ventilación mecánica normal, repetido 4 veces). Se permitió que los ratones se recuperaran y se les devolvió a su jaula durante 24 horas. Los ratones del grupo de control simulado (Sham, n = 4) fueron sometidos a una toracotomía sin pinzamiento hiliar y se les aplicó ventilación mecánica durante 2 horas antes de regresar a la jaula.
[0381] Biodistribución y captación mitocondrial
[0382] En experimentos adicionales, se utilizaron ratas Wistar (200-250 g, n = 6, Charles River Laboratories, Worcester, MA) para visualizar la captación mitocondrial en el pulmón. Se utilizó una rata donante (n = 2) para el aislamiento de mitocondrias singénicas y el marcado mitocondrial con<18>F-rodamina 6G. Se anestesiaron ratas Wistar (n = 3) y se las mantuvo bajo anestesia con isoflurano inhalado al 2-3 %. Posteriormente, en un grupo de ratas, se realizó una esternotomía y se expuso el tronco pulmonar. Las mitocondrias marcadas<18>F-Rodamina 6G (1 x 10<9>en 0,5 ml de tampón respiratorio) se administraron a los pulmones mediante inyección en el tronco pulmonar utilizando una jeringa de tuberculina con una aguja de 30 G.
[0383] En otro grupo de ratas Wistar (n = 3), se administraron mitocondrias marcadas con<18>F-Rodamina 6G (1 x 10<9>en 0,3 ml de tampón respiratorio) a los pulmones en forma de aerosol mediante nebulización. Diez minutos después de la administración de las mitocondrias, los animales fueron sacrificados en una cámara de CO<2>y se les realizó una tomografía por emisión de positrones (PET) y una tomografía microcomputarizada (μCT).
[0384] En un grupo separado de ratones C57BL/6J (n = 4), se aislaron mitocondrias de fibroblastos cardíacos humanos como se describió anteriormente<29>y se administró al tejido pulmonar del ratón mediante nebulizador y a través de la arteria pulmonar. El uso de mitocondrias humanas en pulmones de ratón permitió diferenciar entre las mitocondrias endógenas del ratón y las mitocondrias humanas trasplantadas, basándose en la reactividad inmunitaria a un anticuerpo monoclonal anti-mitocondrial humano (biotina-MTCO2, Abcam, Cambridge, MA). Las mitocondrias se detectaron utilizando el anticuerpo anti-mitocondria humana y se visualizaron utilizando Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y el cromógeno de sustrato AEC+ (Dako, Agilent, Santa Clara, CA), como se ha descrito anteriormente.
[0385] Función pulmonar
[0386] Tras 24 horas de reperfusión, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (70 mg/kg). Se realizó una traqueostomía e intubación endotraqueal utilizando un catéter de plástico de calibre 18G y se ventiló mecánicamente a los ratones. A continuación, se realizó una laparotomía media y una esternotomía para exponer el pulmón, y se pinzó el hilio derecho para evaluar la función del pulmón izquierdo lesionado. El volumen tidal (VT) se redujo a 5 ml/kg y, a continuación, los ratones se conectaron al ventilador especializado para roedores (FlexiVent, SCIREQ, Montreal, Quebec, Canadá) para evaluar la compliancia dinámica del sistema respiratorio (Compliancia dinámica), la resistencia del sistema respiratorio (Resistencia), la amortiguación tisular (como indicador de la resistencia del tejido periférico), la presión inspiratoria máxima y la capacidad inspiratoria del pulmón izquierdo.
[0387] Análisis de tejidos
[0388] Tras 24 horas de reperfusión, se extrajo el pulmón izquierdo y cada pulmón se dividió en 3 partes.
[0389] Se utilizó la parte superior del pulmón izquierdo para evaluar el edema tisular calculando la relación peso húmedo/peso seco (w/d). Inmediatamente después de la recolección, se pesó el pulmón (peso húmedo), se colocó en un horno a 70 °C durante 72 horas, luego se volvió a pesar (peso seco) y se calculó la relación de peso húmedo/seco.
[0390] La parte central del pulmón izquierdo se fijó inmediatamente en formalina al 10 %. El tejido se incluyó en parafina y se cortó en secciones de 5 μm de espesor. Se utilizaron cortes seriados para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción con mieloperoxidasa y el ensayo TUNEL.
[0391] Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina se evaluaron para determinar la gravedad de la lesión pulmonar utilizando un sistema de puntuación descrito previamente. Se analizaron cinco campos visuales aleatorios (15X) por sección. La lesión pulmonar se clasificó utilizando lo siguiente: El grado 1 representaba una histología pulmonar normal; el grado 2 indicaba infiltraciones leves de leucocitos neutrófilos y congestión intersticial leve a moderada; el grado 3 representaba infiltración moderada de leucocitos neutrófilos, formación de edema perivascular y destrucción parcial de la arquitectura pulmonar, y el grado 4 incluía infiltración densa de leucocitos neutrófilos, formación de abscesos y destrucción completa de la arquitectura pulmonar.
[0392] La tinción de mieloperoxidasa (MPO) se realizó como se ha descrito previamente y se evaluaron las secciones para detectar la infiltración de neutrófilos. El número de neutrófilos se determinó en 5 campos visuales aleatorios (15X) por sección.
[0393] El ensayo TUNEL se realizó como se ha descrito anteriormente<29>. El número de núcleos positivos para TUNEL se expresó como un porcentaje de todas las células contadas en 16 campos visuales aleatorios (10x) por sección. La parte basal del pulmón izquierdo se utilizó como se describió previamente para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) con el fin de analizar el daño estructural en el pulmón.
[0394] Análisis del lavado broncoalveolar (LBA)
[0395] Tras la evaluación de la función pulmonar, se realizó un lavado broncoalveolar (LBA) del pulmón izquierdo utilizando 1 ml de solución salina. El líquido BAL se centrifugó inmediatamente a 4 °C a 500 x G durante 5 minutos, y el sobrenadante se recogió y almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis para determinar los niveles de expresión de citocinas y quimiocinas por Eve Technology (Calgary, AB, Canadá). Se analizaron los siguientes biomarcadores: Eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNgamma, IL-1alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, M-CSF, MIG, MIP-1alfa, MIP-1beta, MIP-2, RANTES, TNFalfa, VEGF. Todas las muestras se analizaron por triplicado.
[0396] Análisis estadístico
[0397] Todos los datos fueron recopilados por observadores que desconocían los tratamientos aplicados. Todos los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para todos los datos, excepto para los resultados del análisis de LBA, donde las comparaciones entre grupos se evaluaron con ANOVA unidireccional. La significación estadística se definió mediante un valor P bilateral exacto <0,05.
[0398] Resultados
[0399] Las mitocondrias radiomarcadas con<18>F-Rodamina 6G administradas mediante administración vascular(Figura 9A)o mediante nebulización(Figura 9B)fueron absorbidas de forma difusa por los pulmones y no estaban presentes en ninguna otra región del cuerpo.
[0400] Captación de mitocondrias humanas por el tejido pulmonar
[0401] Las mitocondrias exógenas de fibroblastos cardíacos humanos, administradas mediante infusión vascular(Figura 10A)o mediante nebulización(Figura 10B)se detectaron dentro y alrededor de las células endoteliales pulmonares, los neumocitos, el parénquima y los alvéolos.
[0402] Rendimiento funcional pulmonar
[0403] Después de 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, los ratones que recibieron mitocondrias por vía vascular tuvieron un aumento significativo en la distensibilidad dinámica (10,79 ± 1,11 μl/cmH<2>O) y la capacidad inspiratoria (0,24 ± 0,02 ml) y la resistencia disminuyó significativamente (2,02 ± 0,28 cmH<2>O), Amortiguación del tejido (10,49 ± 0,91 cmH<2>O/ml) y presión inspiratoria máxima (9,48 ± 0,40 cmH<2>O) y en comparación con el Vehículo V (5,91 ± 0,46, 0,127 ± 0,01, 3,33 ± 0,40, 20,02 ± 2,75 y 11,96 ± 0,74 respectivamente, P < 0,05 cada uno; Figura 11A-E). Todos los parámetros funcionales pulmonares en el grupo Mito V no fueron significativamente diferentes en comparación con los pulmones Sham (9,75 ± 0,35, 0,18 ± 0,01, 1,51 ± 0,20, 9,46 ± 0,63 y 8,62 ± 0,20 respectivamente, P > 0,05 cada uno; Figura 11A-E). Todos los parámetros en los pulmones del Vehículo V fueron significativamente diferentes (P < 0,05) en comparación con los pulmones del Sham, excepto la Capacidad Inspiratoria (P > 0,05).
[0404] Después de 2 horas de isquemia y 24 horas de reperfusión, los ratones que recibieron mitocondrias mediante nebulización tuvieron un aumento significativo en la distensibilidad dinámica (7,88 ± 1,05 µl/cmH<2>O) y la capacidad inspiratoria (0,18 ± 0,02 ml) y la resistencia disminuyó significativamente (2,13 ± 0,23 cmH<2>O), Amortiguación del tejido (13,63 ± 1,55 cmH<2>O/ml) y presión inspiratoria máxima (10,18 ± 0,40 cmH<2>O) y en comparación con Vehículo Neb (5,13 ± 0,93, 0,10 ± 0,02, 4,74 ± 0,83, 34,02 ± 5,04 y 11,82 ± 0,53 respectivamente, P < 0,05 cada uno;Figura 12A-D).
[0405] Todos los parámetros funcionales pulmonares en el grupo Mito Neb no fueron significativamente diferentes en comparación con los pulmones Sham (9,75 ± 0,35, 0,18 ± 0,01, 1,51 ± 0,20 y 9,46 ± 0,63 respectivamente, P > 0,05 cada uno; Figura 3D-F, I, J) excepto la presión inspiratoria máxima (8,62 ± 0,20, P < 0,05). Todos los parámetros en los pulmones del grupo de nebulización del vehículo fueron significativamente diferentes (P < 0,05) en comparación con los pulmones del grupo de control.
[0406] Los bucles representativos de presión-volumen demostraron que los grupos Vehículo V y Vehículo Neb tenían una menor capacidad de volumen pulmonar y presiones más altas en comparación con los grupos Mito V, Mito Neb y Sham(Figura 13).
[0407] El análisis H&E mostró una infiltración de células inflamatorias y una congestión intersticial significativamente disminuidas sin signos de destrucción de la arquitectura pulmonar en los pulmones de Mito V y Mito Neb en comparación con Vehículo V y Vehículo Neb, respectivamente (grado 1,8 ± 0,1, grado 2,5 ± 0,1; respectivamente para el grupo de administración vascular; grado 1,7 ± 0,1, grado 2,5 ± 0,1; respectivamente para el grupo de nebulización, P < 0,05, ambos;Figura 14, Figura 15A-E).Se observó una preservación significativamente mejor del tejido pulmonar en los pulmones del grupo control en comparación con todos los demás grupos (grado 1,3 ± 0,1, P < 0,05).
[0408] Se observó una disminución significativa en el recuento de neutrófilos en los grupos Mito V y Mito Neb en comparación con Vehículo V y Vehículo Neb, respectivamente (120,2 ± 5,5, 159,9 ± 6,5; respectivamente para el grupo de administración vascular; 77,8 ± 3,8, 125,7 ± 4,9; respectivamente para el grupo de nebulización, P < 0,05, ambos,Figura 14, Figura 15B, Figura 15E).El recuento de neutrófilos se redujo significativamente en los pulmones del grupo control (55,3 ± 3,6, P < 0,05) en comparación con los pulmones de los grupos Mito V, Vehículo V y Vehículo Neb. No se observó ninguna diferencia significativa en el número de neutrófilos en el grupo Sham en comparación con Mito Neb (P > 0,05).
[0409] El análisis TUNEL mostró una disminución significativa en el recuento de núcleos positivos para apoptosis observados en los grupos Mito V y Mito Neb en comparación con Vehículo V y Vehículo Neb, respectivamente (1,38 ± 0,25, 1,55 ± 0,18; respectivamente para el grupo de administración vascular; 3,1 ± 0,38, 3,15 ± 0,25; respectivamente para el grupo de nebulización, P < 0,05, ambos). No hubo diferencias significativas en el recuento de núcleos positivos para apoptosis en los pulmones del grupo control (0,3 ± 0,1, P < 0,05) en comparación con los grupos Mito V y Mito Neb.(Figura 14, Figura 15C, Figura 15F).
[0410] Tras 24 horas de reperfusión, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) del lóbulo inferior izquierdo mostró endotelio y membranas basales conservados en los grupos Vehículo V y Neb, así como en los grupos Mito V y Neb. No se observaron diferencias en el espacio alveolar. Esto indica que no hay daño en la membrana basal (Figura 4). No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de peso húmedo a seco entre el Vehículo V izquierdo (88,9 ± 0,5 %) y el pulmón derecho (87,1 ± 1,1 %), Mito V izquierdo (88,5 ± 0,3 %) y el pulmón derecho (88,3 ± 0,6 %), el vehículo Neb izquierdo (87,5 ± 1,1 %) y el pulmón derecho (89,2 ± 1,1 %) y Mito Neb izquierdo (88,5 ± 1,2 %) y el pulmón derecho (89,3 ± 0,6 %) y Sham izquierdo (88,7 ± 1,0 %) y el pulmón derecho (90,1 ± 1,0 %; P> 0,05 cada uno;Figura 15G).
[0411] Citocinas del lavado broncoalveolar
[0412] A las 24 horas de reperfusión, no hubo diferencias significativas en las citocinas y quimiocinas entre los grupos.
[0413] (Figura 16).
[0414] Discusión
[0415] El daño mitocondrial, que consiste en la toxicidad inducida por especies reactivas de oxígeno, el fallo de la bioenergética celular, la apoptosis aumentada, la producción de citoquinas y la inmunidad innata, durante la lesión por isquemia-reperfusión desempeña un papel importante en la lesión pulmonar aguda. En este estudio, hemos demostrado la eficacia y la seguridad del trasplante mitocondrial en un modelo murino de isquemia-reperfusión pulmonar. Tras 24 horas de reperfusión después de una lesión isquémica, el trasplante mitocondrial mejora el rendimiento funcional pulmonar y disminuye el daño al tejido pulmonar.
[0417] Estudios previos que investigan la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en ratones han utilizado tiempos de isquemia de entre 60 y 90 minutos. Estos experimentos proporcionaron un análisis detallado del daño en el tejido pulmonar. Sin embargo, o bien no proporcionaron ningún análisis funcional, o bien la función pulmonar se midió en un sistema ex vivo aislado y no fisiológico. En nuestro estudio se utilizó la máquina Flexi-Vent para realizar mediciones funcionalesin vivo. Basándonos en nuestros experimentos preliminares, elegimos un tiempo de isquemia de 2 horas. Tiempos de isquemia más cortos provocaron una lesión por isquemia-reperfusión pulmonar insuficiente y no permitieron la evaluación funcional ni el análisis comparativo entre nuestros grupos de estudio. Se utilizaron mitocondrias radiomarcadas con<18>F-Rodamina 6G para demostrar la distribución de las mitocondrias administradas. Administramos mitocondrias radiomarcadas mediante administración vascular o nebulización. Nuestros resultados muestran la distribución mitocondrial en todo el pulmón en ambos grupos. Las mitocondrias administradas en forma de aerosol mediante nebulización se encontraron a lo largo de la tráquea y el árbol bronquial, lo que sugiere que las mitocondrias se adhieren al tejido de las vías respiratorias ya durante el primer contacto.
[0419] En nuestros estudios, se utilizaron mitocondrias humanas para determinar la captación celular de mitocondrias trasplantadas. Las mitocondrias humanas permiten el marcaje selectivo de las mitocondrias trasplantadas y, por lo tanto, excluyen la posibilidad de marcar las mitocondrias endógenas murinas. Se encontraron mitocondrias humanas en todas las células de los pulmones, lo que demuestra que las mitocondrias administradas mediante irrigación vascular o nebulización se trasplantaron eficazmente.
[0421] En este estudio se utilizaron dos métodos diferentes de administración de mitocondrias. Las mitocondrias pueden ser transportadas al órgano diana a través del sistema vascular. Para permitir un método menos invasivo, pero igualmente relevante desde el punto de vista clínico y de fácil utilización, se empleó la administración mediante nebulización como grupo de estudio adicional. Tras 24 horas de reperfusión, se observó una mejora funcional significativa en los pulmones que recibieron mitocondrias tanto por vía vascular como por nebulización, en comparación con los pulmones que no recibieron el vehículo. En un parámetro funcional, el PIP, se observó una diferencia significativa entre Mito V y Vehículo V, pero no se observó ninguna diferencia significativa al comparar Mito Neb con Vehículo Neb. Esto podría implicar una mayor eficacia de las mitocondrias administradas por vía vascular. Sin embargo, esta observación podría explicarse por el hecho de que las mitocondrias administradas mediante nebulización no llegan tan lejos como las administradas por vía vascular, y habría sido preferible administrar una mayor concentración de mitocondrias debido a su absorción también en la tráquea y el árbol bronquial. Es necesario realizar experimentos para determinar la concentración mitocondrial óptima administrada mediante nebulización. También es importante señalar que el análisis de tejidos mostró una mejora significativa de la viabilidad celular después de 24 horas de reperfusión tanto en Mito V como en Mito Neb en comparación con sus grupos de Vehículo.
[0423] En conclusión, hemos demostrado la eficacia y la seguridad del trasplante mitocondrial en un modelo murino de isquemia-reperfusión pulmonar. Tras 24 horas de reperfusión después de una lesión isquémica, el trasplante mitocondrial mejora la función pulmonar y disminuye el daño al tejido pulmonar. Estos resultados sugieren que esta terapia puede utilizarse para proteger el tejido pulmonar de la lesión por isquemia-reperfusión, reduciendo así la morbilidad y la mortalidad en diversos escenarios clínicos, como el trasplante de pulmón, la reanimación cardiopulmonar, la embolia pulmonar, la septicemia y los episodios y procedimientos hipotensivos durante la derivación cardiopulmonar o el soporte circulatorio mecánico.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno respiratorio, comprendiendo el método administrar dicha composición al sujeto a través del tracto respiratorio, donde la composición es una composición en aerosol, y donde la composición se convierte en forma de aerosol antes de su administración al sujeto mediante el uso de un nebulizador, un vaporizador, un pulverizador nasal, un inhalador de dosis medida presurizado o un inhalador de dosis medida presurizado activado por la respiración.
2. La composición para el uso, según la reivindicación 1, en donde la composición comprende mitocondrias con capacidad respiratoria.
3. La composición para el uso, según la reivindicación 1, en donde:
el sujeto tiene insuficiencia respiratoria, función respiratoria reducida, inflamación pulmonar, carcinoma pulmonar, arrugas en la piel, calvicie y/o cáncer, opcionalmente cuando el sujeto tiene lesión pulmonar aguda; el sujeto tiene isquemia, lesión por perfusión, hipoplasia pulmonar, hernia diafragmática congénita (HDC), síndrome de Poland, enfermedad de la pared torácica, neumonectomía, displasia broncopulmonar, lesión pulmonar, lesión por inhalación, asma, fibrosis quística;
el sujeto presenta síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión pulmonar aguda (LPA), insuficiencia respiratoria, función respiratoria reducida y/o inflamación pulmonar; y el sujeto tiene neumonía.
4. La composición para el uso, según la reivindicación 1, en donde la concentración de mitocondrias en la composición es aproximadamente 1 x 10<5>a 5 x10<8>ml<-1>o aproximadamente 1 x 10<5>a 1 x 10<9>de mitocondrias por dosis.
5. La composición para el uso, según la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a las mitocondrias por un enlace covalente, está incrustado en las mitocondrias, o está internalizado dentro de las mitocondrias, opcionalmente en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico es un agente de diagnóstico terapéutico, u opcionalmente en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, u opcionalmente en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a las mitocondrias por un enlace covalente, u opcionalmente en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está incrustado en o internalizado dentro de las mitocondrias.
6. La composición para el uso, según la reivindicación 1, en donde las mitocondrias comprenden polipéptidos exógenos, o en donde las mitocondrias comprenden polinucleótidos exógenos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARN nucleares o ARNpi.
7. Una composición aerosolizada que comprende una pluralidad de gotículas líquidas que comprenden un tampón, en donde al menos una gotícula líquida en la pluralidad de gotículas líquidas comprende:
al menos una mitocondria.
8. La composición aerosolizada, según la reivindicación 7, en donde la composición comprende además un agente terapéutico o un agente de diagnóstico, en donde el agente terapéutico o el agente de diagnóstico está unido a la mitocondria por un enlace covalente, está incrustado en la mitocondria, o está internalizado dentro de la mitocondria, opcionalmente en donde el agente mitocondrial se selecciona del grupo que consiste en un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico o un agente de diagnóstico, u opcionalmente en donde el agente mitocondrial comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, u opcionalmente en donde el agente mitocondrial está unido a la mitocondria por un enlace covalente, u opcionalmente en donde el agente mitocondrial está incrustado en o internalizado dentro de la mitocondria.
9. Un dispositivo para administrar mitocondrias a un sujeto a través del tracto respiratorio, que comprende: una carcasa;
un depósito dispuesto dentro de la carcasa para una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias, en donde la composición es una composición en aerosol;
un generador de aerosoles para producir una forma de aerosol de la composición; y
un dispositivo de administración a través del cual se suministra la composición a las vías respiratorias del sujeto, en donde el dispositivo es un nebulizador, un pulverizador nasal o un inhalador.
10. El dispositivo, según la reivindicación 9, en donde el generador de aerosol es un nebulizador ultrasónico.
11. El dispositivo, según la reivindicación 9, en donde el generador de aerosol es un dispositivo de malla vibratoria.
12. El dispositivo, según la reivindicación 9, en donde el generador de aerosol comprende un compresor de aire, en donde el compresor de aire hace que el aire comprimido fluya a través de la composición y convierte la composición en una forma de aerosol.
13. Un dispositivo para administrar mitocondrias a un sujeto a través del tracto respiratorio, que comprende: una carcasa;
una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de mitocondrias dispuestas dentro de la carcasa, en donde la composición es una composición aerosolizada; y
una salida configurada para suministrar la composición desde la carcasa hasta las vías respiratorias del sujeto y para aerosolizar la composición a medida que esta pasa a través de ellas.
ES24188510T 2019-04-15 2020-04-15 Aerosolized compositions comprising mitochondria and methods of use thereof Active ES3071645T3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962834020P 2019-04-15 2019-04-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3071645T3 true ES3071645T3 (en) 2026-06-24

Family

ID=72837565

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20790601T Active ES2988040T3 (es) 2019-04-15 2020-04-15 Composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias y sus métodos de uso
ES24188510T Active ES3071645T3 (en) 2019-04-15 2020-04-15 Aerosolized compositions comprising mitochondria and methods of use thereof

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20790601T Active ES2988040T3 (es) 2019-04-15 2020-04-15 Composiciones aerosolizadas que comprenden mitocondrias y sus métodos de uso

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220395531A1 (es)
EP (3) EP4461369B1 (es)
JP (1) JP7590341B2 (es)
CN (1) CN113905724A (es)
ES (2) ES2988040T3 (es)
WO (1) WO2020214644A1 (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES3057779T3 (en) 2016-01-15 2026-03-04 Childrens Medical Ct Corp Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
US20220347212A1 (en) * 2019-05-02 2022-11-03 Children`S Medical Center Corporation Prophylactic and therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
WO2023191495A1 (ko) * 2022-03-29 2023-10-05 주식회사 파이안바이오테크놀로지 동결 및 동결건조된 미토콘드리아 및 이의 용도
AU2023283025A1 (en) * 2022-06-10 2024-11-28 Cellvie Ag Composition and method for cryopreservation of mitochondria
CN115624515A (zh) * 2022-10-13 2023-01-20 广州华茜药业科技有限公司 一种抗皱抗衰的线粒体组合物及其应用
CN115634178A (zh) * 2022-10-13 2023-01-24 广州华茜药业科技有限公司 补充机体细胞能量的线粒体组合物及其制备方法
WO2025184537A1 (en) * 2024-03-01 2025-09-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bio-engineered mitochondria for targeted delivery to cells
WO2026055709A1 (en) * 2024-09-09 2026-03-12 Washington University Mitochondria-facilitated delivery of mrna

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826255A (en) 1972-06-22 1974-07-30 Hudson Oxygen Therapy Sales Co Intermittent positive pressure breathing manifold
YU41046B (en) 1974-08-22 1986-10-31 Schering Ag Medicine inholating device
US4268460A (en) 1977-12-12 1981-05-19 Warner-Lambert Company Nebulizer
US4253468A (en) 1978-08-14 1981-03-03 Steven Lehmbeck Nebulizer attachment
DE3151275C2 (de) 1981-12-24 1986-07-10 SKF GmbH, 8720 Schweinfurt Befestigungsvorrichtung für Werkzeuge
US4649911A (en) 1983-09-08 1987-03-17 Baylor College Of Medicine Small particle aerosol generator for treatment of respiratory disease including the lungs
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
CN1133568C (zh) 1999-01-18 2004-01-07 地球制药株式会社 气溶胶扩散喷雾器
CA2480790A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-16 Kazunori Murakami Use of antithrombin iii in treating acute lung injury
US8616195B2 (en) * 2003-07-18 2013-12-31 Novartis Ag Nebuliser for the production of aerosolized medication
CN1934013A (zh) 2004-03-29 2007-03-21 宝洁公司 气溶胶
US7431222B2 (en) 2005-06-03 2008-10-07 Monterrosa Christopher H Aerosol spray masking device
IL183818A0 (en) 2007-06-10 2007-10-31 Shimon Harpaz Uniformly abrasive confectionery product and process therefor
EP2654865B1 (en) * 2010-12-22 2015-02-25 Koninklijke Philips N.V. Nebulizer device
WO2014113638A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-24 Aer Devices, Inc. Multi-use albuterol maintenance therapy formulations and devices therefor
US20160113887A1 (en) * 2014-06-05 2016-04-28 The Regents Of The University Of California Halogenated ether compounds and methods of inducing anesthesia
US10420798B2 (en) * 2014-12-31 2019-09-24 Taiwan Mitochondrion Applied Technology Co., Ltd Method for treating lung injury and/or diseases related to lung injury
ES3057779T3 (en) 2016-01-15 2026-03-04 Childrens Medical Ct Corp Therapeutic use of mitochondria and combined mitochondrial agents
KR20210016511A (ko) * 2018-05-31 2021-02-16 크리티테크, 인크. 입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 종양 특이적 면역 세포를 대상체로부터 단리하는 방법
CA3112303A1 (en) * 2018-09-17 2020-03-26 Erasmus University Medical Center Rotterdam Adenosomes
BR112022001207A2 (pt) * 2019-07-24 2022-03-15 Luca Science Inc Método de obtenção de mitocôndrias de células e mitocôndrias obtidas

Also Published As

Publication number Publication date
EP4461369A3 (en) 2025-02-12
ES2988040T3 (es) 2024-11-19
CN113905724A (zh) 2022-01-07
WO2020214644A1 (en) 2020-10-22
EP4775269A2 (en) 2026-07-15
EP3955902A1 (en) 2022-02-23
JP2022529262A (ja) 2022-06-20
EP4775269A3 (en) 2026-07-22
US20220395531A1 (en) 2022-12-15
EP4461369B1 (en) 2026-02-25
EP4461369C0 (en) 2026-02-25
JP7590341B2 (ja) 2024-11-26
EP3955902B1 (en) 2024-07-17
EP3955902C0 (en) 2024-07-17
EP3955902A4 (en) 2023-03-22
EP4461369A2 (en) 2024-11-13