ES3068176T3

ES3068176T3 - Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment

Info

Publication number: ES3068176T3
Application number: ES18784599T
Authority: ES
Inventors: Marcela Maus; Bryan Choi
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2026-05-28
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CA3090546A1; JP2025032089A; US20210038646A1; JP2021512635A; EP3752170A4; EP3752170A1; CN111971053A; WO2019157533A1; AU2019218989B2; AU2019218989A1; AU2026204039A1

Abstract

La presente invención proporciona métodos y composiciones para su uso en el tratamiento del cáncer, lo cual puede lograrse ventajosamente mediante la focalización en el microambiente tumoral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Linfocitos T con receptores quiméricos para el antígeno dirigidos al microambiente tumoral

[0003] CAMPO TÉCNICO

[0004] La tecnología descrita en el presente documento se refiere a la inmunoterapia.

[0005] ANTECEDENTES

[0006] Los receptores quiméricos para el antígeno (CAR) ofrecen una forma de dirigir la respuesta de los linfocitos T citotóxicos hacia células diana que expresan un antígeno diana seleccionado, normalmente un antígeno tumoral o un antígeno asociado al tumor. Los CAR son una adaptación del receptor de linfocitos T, en el que el dominio de unión al antígeno se sustituye por el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al antígeno diana en cuestión. La unión del antígeno diana en la superficie de una célula diana por un CAR expresado en un linfocito T ("linfocito T-CAR" o "T-CAR") promueve la destrucción de la célula diana. El documento de patente WO 2017/040324 A1 se refiere a linfocitos T-CAR que presentan un anticuerpo biespecífico que se une a una diana en una célula tumoral.

[0007] SUMARIO

[0008] La invención proporciona linfocitos T con receptores quiméricos para el antígeno (CAR) que comprenden una molécula de ácido nucleico heteróloga, en donde la molécula de ácido nucleico heteróloga comprende:

[0009] (a) un primer polinucleótido que codifica un CAR que comprende:

[0010] un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno asociado a tumores,

[0011] un dominio transmembranario, y

[0012] un dominio de señalización intracelular, opcionalmente en donde

[0013] (i) el dominio de unión al antígeno del CAR comprende opcionalmente un anticuerpo, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo de dominio único o un ligando;

[0014] (ii) el dominio transmembranario del CAR comprende un dominio bisagra/transmembranario de CD8, que comprende opcionalmente la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 37, 46, 58 y 66, o una variante de las mismas; y/o

[0015] (iii) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular CD3ζ, que opcionalmente comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30, 39, 48, 60 y 68, o una variante de las mismas; y

[0016] (b) un segundo polinucleótido que codifica un agente terapéutico que comprende un activador de linfocitos T biespecífico secretado que se une a un antígeno asociado a tumores o a un antígeno asociado a Treg, en donde el CAR y el agente terapéutico se producen en forma de una poliproteína, que se escinde para generar moléculas separadas de CAR y de agente terapéutico.

[0017] El primer y el segundo polinucleótido están incluidos dentro de una única molécula de polinucleótido. Además, en algunas realizaciones, el CAR incluye además uno o más dominios coestimuladores (por ejemplo, 4-1BB; véase también más adelante).

[0018] En diversas realizaciones, el agente terapéutico es o incluye un reactivo de anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un activador de linfocitos T biespecífico (BiTE); véase también más adelante).

[0019] En diversas realizaciones, el CAR y el agente terapéutico se producen en forma de una poliproteína (y, por lo tanto, pueden estar codificados dentro de una única molécula de ácido nucleico), que se escinde para generar moléculas separadas de CAR y de agente terapéutico. En algunas realizaciones, la poliproteína incluye un resto escindible (por ejemplo, un péptido 2A, como P2A o T2A; véase también más adelante) entre el CAR y el agente terapéutico. En algunas realizaciones, cada uno del CAR y el agente terapéutico se expresan de forma constitutiva. En algunas realizaciones, la expresión del CAR y del agente terapéutico está impulsada por un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1α). En algunas realizaciones, el agente terapéutico se expresa bajo el control de un promotor inducible (por ejemplo, el promotor NFAT), que es opcionalmente inducible por la señalización del receptor de linfocitos T o del CAR. En algunas realizaciones, el CAR se expresa bajo el control de un promotor constitutivo y el agente terapéutico se expresa bajo el control de un promotor inducible (por ejemplo, el promotor NFAT), que es opcionalmente inducible por la señalización del receptor de linfocitos T o del CAR.

[0020] En diversas realizaciones, el dominio de unión al antígeno del CAR es o incluye un anticuerpo, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo de dominio único (por ejemplo, un anticuerpo de camélido) o un ligando.

[0021] En diversas realizaciones, el dominio transmembranario del CAR incluye un dominio bisagra/transmembranario CD8, que opcionalmente incluye la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 37, 46, 58 y 66, o una variante de las mismas.

[0022] En diversas realizaciones, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización intracelular CD3ζ, que opcionalmente incluye o consiste en la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30, 39, 48, 60 y 68, o una variante de las mismas.

[0023] En diversas realizaciones, se incluye un dominio coestimulador 4-1BB, que opcionalmente incluye o consiste en la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29, 38, 47, 59 y 67, o una variante de las mismas. En diversas realizaciones, el dominio de unión al antígeno del CAR o el agente terapéutico se une a un antígeno asociado a tumores (véase, por ejemplo, más adelante). En diversas realizaciones, el antígeno asociado a tumores al que se une el dominio de unión al antígeno del CAR o el agente terapéutico es un antígeno asociado a tumores sólidos. En diversas realizaciones, el antígeno asociado a tumores al que se une el dominio de unión al antígeno del CAR o el agente terapéutico incluye la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII), EGFR, CD19, el antígeno prostático específico de membrana (PSMA) o el receptor alfa 2 de la IL-13 (IL-13Rα2), y opcionalmente el dominio de unión al antígeno del CAR o el agente terapéutico incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 27, 33, 36, 42, 45, 51, 55, 57, 63, 65 y variantes de las mismas.

[0024] En diversas realizaciones, el agente terapéutico se une a un antígeno asociado a Treg. En diversas realizaciones, el antígeno asociado a Treg al que se une el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en glucoproteína A predominante en repeticiones (GARP), péptido asociado a la latencia (LAP), CD25 y antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), y opcionalmente el dominio de unión al antígeno del CAR, o el agente terapéutico incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 9, 15, 25 y variantes de las mismas.

[0025] La invención proporciona además linfocitos T-CAR que incluyen un polinucleótido que codifica un CAR, en donde el CAR incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembranario (por ejemplo, bisagra/TM de CD8; véanse, por ejemplo, más abajo para ejemplos adicionales) y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, CD3z; véanse, por ejemplo, más abajo para ejemplos adicionales); y el dominio de unión al antígeno se une a un antígeno asociado a tumores. En diversas realizaciones, el CAR incluye además uno o más dominios coestimuladores (por ejemplo, 4-1BB; véase, por ejemplo, más abajo, para ejemplos adicionales). En diversos ejemplos, el dominio de unión al antígeno del CAR incluye un scFv o un anticuerpo de dominio único, que opcionalmente incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 9, 15, 25 y variantes de las mismas.

[0026] La invención proporciona además linfocitos T-CAR que incluyen una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, o 100 %) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 13.

[0027] Además, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican poliproteínas que incluyen un polipéptido CAR y un agente terapéutico, como se describe en el presente documento.

[0028] La invención proporciona además poliproteínas que incluyen un polipéptido CAR y un agente terapéutico, como se describe en el presente documento.

[0029] La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más linfocitos T-CAR, moléculas de ácido nucleico o poliproteínas como se describe en el presente documento.

[0030] También se incluye en la invención una composición farmacéutica que incluye uno o más linfocitos T-CAR o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto, incluidos pacientes (por ejemplo, pacientes humanos) que padecen una enfermedad o afección (por ejemplo, cáncer (como el glioblastoma); véase también más adelante). En diversas realizaciones, los métodos se dirigen al microambiente tumoral, con lo que, por ejemplo, se reduce la toxicidad sistémica. En diversas realizaciones, el cáncer se caracteriza por la presencia de uno o más tumores sólidos. En diversas realizaciones, el cáncer se caracteriza por Treg infiltradas en el tumor.

[0031] La invención proporciona además un producto de linfocitos T-CAR para su uso en un método de tratamiento de un sujeto (por ejemplo, un paciente, como un paciente humano) que padece cáncer, modificado genéticamente para secretar un anticuerpo tóxico para el tumor, en donde, al dirigir la toxicidad contra el cáncer localmente al microambiente tumoral, se reduce la toxicidad sistémica. En diversas realizaciones, el linfocito T-CAR está modificado genéticamente para administrar un activador de linfocitos T biespecífico contra CTLA4, CD25, GARP, LAP, IL15, CSF1R o EGFR, o un anticuerpo biespecífico (dirigido contra, por ejemplo, EGFR y CD3) al microambiente tumoral.

[0033] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende uno o más linfocitos T-CAR, linfocitos T-CAR, moléculas de ácido nucleico o poliproteínas de la invención para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método la administración al paciente de la composición farmacéutica, en donde el cáncer es opcionalmente un glioblastoma. Los métodos incluyen la administración al paciente de un linfocito T-CAR, modificado genéticamente para secretar un activador de linfocitos T biespecífico que se une a un antígeno asociado al tumor o a un antígeno asociado a los linfocitos T reguladores (Treg), en donde el agente terapéutico que comprende el activador de linfocitos T biespecífico secretado que se une a un antígeno asociado al tumor o a un antígeno asociado a los linfocitos Treg sería, por sí solo, incapaz de entrar o penetrar el tejido u órgano. En diversas realizaciones, el tejido u órgano se encuentra en el sistema nervioso. En diversas realizaciones, el sistema nervioso es el sistema nervioso central (por ejemplo, el cerebro). En diversas realizaciones, la enfermedad o patología es un glioblastoma. En diversas realizaciones, el agente terapéutico es un anticuerpo anti-EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) o un anticuerpo anti-EGFRvIII.

[0035] La invención también incluye el uso de los linfocitos T-CAR, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, composiciones farmacéuticas y otras composiciones y moléculas en el uso de la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección descrita en el presente documento, o en el uso de la preparación de un medicamento.

[0037] Definiciones

[0039] Por conveniencia, a continuación se proporciona el significado de algunos términos y frases usados en la descripción, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. A menos que se indique lo contrario, o se deduzca implícitamente del contexto, los siguientes términos y frases incluyen los significados que se proporcionan a continuación. Las definiciones se proporcionan para ayudar a describir realizaciones particulares, y no pretenden limitar la tecnología reivindicada, ya que el alcance de la tecnología está limitado únicamente por las reivindicaciones. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta tecnología. Si existe una discrepancia aparente entre el uso de un término en la técnica y su definición proporcionada en el presente documento, prevalecerá la definición proporcionada en la memoria descriptiva.

[0041] Las definiciones de términos comunes en inmunología y biología molecular pueden encontrarse en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19.ª edición, publicado por Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green y Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; y Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737.

[0043] Todos los términos "disminución", "reducido", "reducción" o "inhibir" se usan en el presente documento para referirse a una disminución en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, "reducir", "reducción" o "disminución" o "inhibir" suelen significar una disminución de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia (por ejemplo, la ausencia de un tratamiento o agente determinado) y pueden incluir, por ejemplo, una disminución de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o más. Como se usa en el presente documento, "reducción" o "inhibición" no abarca una inhibición o reducción completa en comparación con un nivel de referencia. La "inhibición completa" es una inhibición del 100 % en comparación con un nivel de referencia. Cuando sea aplicable, una disminución puede ser preferiblemente hasta un nivel aceptado como dentro del intervalo normal para un individuo sin un trastorno determinado.

[0045] Todos los términos "aumentado", "aumentar", "potenciar" o "activar" se usan en el presente documento para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, los términos "aumentado", "aumentar", "potenciar" o "activar" pueden significar un aumento de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente un 20 %, o al menos aproximadamente un 30 %, o al menos aproximadamente un 40 %, o al menos aproximadamente un 50 %, o al menos aproximadamente un 60 %, o al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 %, o al menos aproximadamente un 90 % o hasta un aumento del 100 % inclusive, o cualquier aumento entre el 10 %-100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos un aumento aproximadamente doble, o al menos aproximadamente triple, o al menos aproximadamente cuádruple, o al menos aproximadamente quíntuple o al menos aproximadamente décuple, o cualquier aumento entre doble y décuple o más en comparación con un nivel de referencia. En el contexto de un marcador o síntoma, un "aumento" es un aumento estadísticamente significativo de dicho nivel.

[0047] Como se usa en el presente documento, un "sujeto" significa un ser humano o un animal. Normalmente, el animal es un vertebrado, como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen, por ejemplo, chimpancés, macacos cangrejeros, monos araña y macacos, por ejemplo, de la India. Los roedores incluyen, por ejemplo, ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen, por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, por ejemplo, gatos domésticos, especies caninas, por ejemplo, perros, zorros, lobos, especies aviares, por ejemplo, pollos, emús, avestruces, y peces, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los términos "individuo", "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento.

[0049] Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, caballo o vaca, pero no están limitados a estos ejemplos. Los mamíferos distintos de los humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de enfermedad, por ejemplo, cáncer. Un sujeto puede ser macho o hembra.

[0051] Un sujeto puede ser alguien a quien se le haya diagnosticado o identificado previamente que padece o tiene una afección que requiere tratamiento (por ejemplo, glioblastoma, glioma, leucemia u otro tipo de cáncer, entre otros) o una o más complicaciones relacionadas con dicha afección y, opcionalmente, ya se haya sometido a tratamiento para la afección o para la o las complicaciones relacionadas con la afección. Alternativamente, un sujeto también puede ser alguien a quien no se le haya diagnosticado previamente dicha afección o complicaciones relacionadas. Por ejemplo, un sujeto puede ser alguien que presente uno o más factores de riesgo de la afección o una o más complicaciones relacionadas con la afección, o un sujeto que no presente factores de riesgo.

[0053] Un "sujeto que necesita" tratamiento para una afección particular puede ser un sujeto que padezca dicha afección, al que se le haya diagnosticado dicha afección o que corra el riesgo de desarrollar esa afección.

[0055] Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal, por ejemplo, un ser humano, en donde el animal no puede mantener la homeostasis y en donde, si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa deteriorándose. Por el contrario, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el que el animal es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si no se trata, un trastorno no causa necesariamente un mayor deterioro del estado de salud del animal.

[0056] Como se usan en el presente documento, las expresiones "antígeno tumoral" y "antígeno canceroso" se usan indistintamente para referirse a antígenos que se expresan de forma diferencial en las células cancerosas y que, por lo tanto, pueden aprovecharse para atacar dichas células cancerosas. Los antígenos cancerosos son antígenos que pueden estimular potencialmente respuestas inmunitarias aparentemente específicas del tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos pueden caracterizarse como aquellos que normalmente están silenciosos (es decir, no se expresan) en células normales, aquellos que se expresan solo en ciertas etapas de diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente, como los antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos de cáncer están codificados por genes celulares mutantes, como los oncogenes (por ejemplo, el oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante) y proteínas de fusión resultantes de deleciones internas o translocaciones cromosómicas. Otros antígenos del cáncer pueden estar codificados por genes víricos, como los que transportan los virus tumorales de ARN y ADN. Se han definido muchos antígenos tumorales en términos de múltiples tumores sólidos: MAGE 1, 2 y 3, definidos por la inmunología; MART-1/Melan-A, gp100, antígeno carcinoembrionario (CEA), HER2, mucinas (es decir, MUC-1), antígeno prostático específico (PSA) y fosfatasa ácida prostática (PAP). Además, se ha demostrado que proteínas víricas como algunas codificadas por el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de Epstein-Barr (VEB) y el virus del papiloma humano (VPH) son importantes en el desarrollo de carcinoma hepatocelular, linfoma y cáncer de cuello uterino, respectivamente. A continuación se proporcionan ejemplos de antígenos tumorales, e incluyen, por ejemplo, EGFR, EGFRvIII, CD19, PSMA, BCMA, IL13Ra2, etc.

[0057] Como se usan en el presente documento, "antígeno Treg" o "antígeno asociado a Treg" se usan indistintamente para referirse a los antígenos que son expresados por linfocitos T reguladores (Treg). Estos antígenos pueden ser opcionalmente el objetivo de las células y los métodos de la invención. A continuación se proporcionan ejemplos de antígenos Treg, e incluyen, por ejemplo, GARP, LAP, CD25 y CTLA4.

[0058] Como se usa en el presente documento, el término "quimérico" se refiere al producto de la fusión de porciones de al menos dos o más moléculas de polinucleótidos diferentes. En una realización, el término "quimérico" se refiere a un elemento de expresión génica producido mediante la manipulación de elementos conocidos u otras moléculas de polinucleótidos.

[0059] Por "activadores de linfocitos T biespecíficos", "construcciones de anticuerpos BiTE" o "BiTE" se entiende polipéptidos que incluyen cada uno fragmentos variables de cadena única (scFv) unidos en tándem. Opcionalmente, los scFv están unidos por un conector (por ejemplo, un conector rico en glicina). Un scFv del BiTE se une al receptor de linfocitos T (TCR) (por ejemplo, a la subunidad CD3ε) y el otro se une a un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno asociado a tumores).

[0060] En algunas realizaciones, "activación " puede referirse al estado de un linfocito T que ha sido estimulado lo suficiente como para inducir una proliferación celular detectable. En algunas realizaciones, la activación puede referirse a la producción inducida de citocinas. En otras realizaciones, la activación puede referirse a funciones efectoras detectables. Como mínimo, un "linfocito T activado", como se usa en el presente documento, es un linfocito T proliferativo.

[0061] Como se usan en el presente documento, las expresiones "unión específica" y "se une específicamente" se refieren a una interacción física entre dos moléculas, compuestos, células y/o partículas, en donde la primera entidad se une a la segunda, entidad diana, con mayor especificidad y afinidad que con la que se une a una tercera entidad que no es una diana. En algunas realizaciones, la unión específica puede referirse a una afinidad de la primera entidad por la segunda entidad diana, que es al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más mayor que la afinidad por la tercera entidad no diana en las mismas condiciones. Un reactivo específico para una diana determinada es aquel que muestra una unión específica para esa diana en las condiciones del ensayo que se está utilizando. Un ejemplo no limitativo incluye un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une a una proteína compañera de unión relacionada (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o coestimuladora presente en un linfocito T).

[0062] Un "ligando estimulador", como se usa en el presente documento, se refiere a un ligando que, cuando está presente en una célula presentadora de antígenos (APC, por ejemplo, un macrófago, una célula dendrítica, un linfocitos B, una APC artificial y similares), puede unirse específicamente a un compañero de unión relacionado (denominado en el presente documento "molécula estimuladora" o "molécula coestimuladora") en un linfocito T, mediando así una respuesta primaria del linfocito T, incluyendo, entre otros, la proliferación, la activación, el inicio de una respuesta inmunitaria y similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos en la técnica y abarcan, entre otros, una molécula del MHC de clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 superagonista y un anticuerpo anti-CD2 superagonista.

[0063] Una "molécula estimuladora", como se usa el término en el presente documento, significa una molécula en un linfocito T que se une específicamente a un ligando estimulador relacionado presente en una célula presentadora de antígenos.

[0064] "Ligando coestimulador", como se usa el término en el presente documento, incluye una molécula en una APC que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en un linfocito T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media una respuesta de los linfocitos T, incluyendo, entre otros, la proliferación, la activación, la diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, 4-1BBL, OX40L, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, el ligando coestimulador inducible (ICOS-L), la molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, el receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que se une al receptor similar a Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3. Un ligando coestimulador también puede incluir, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, como, entre otros, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, el antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente a CD83.

[0065] Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión relacionado en un linfocito T que se une específicamente a un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por parte del linfocito T, como, entre otros, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otros, una molécula del MHC de clase I, BTLA, un receptor similar a Toll, CD27, CD28, 4-1 BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, el antígeno asociado a la función linfocitaria 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y CD83.

[0067] En una realización, el término "manipulado" y sus equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento pueden referirse a una o más alteraciones diseñadas por el ser humano de un ácido nucleico, por ejemplo, el ácido nucleico dentro del genoma de un organismo. En otra realización, manipulado puede referirse a alteraciones, adiciones y/o deleciones de genes. Una "célula manipulada" puede referirse a una célula con un gen añadido, delecionado y/o alterado. El término "célula" o "célula modificada" y sus equivalentes gramaticales, como se usan en el presente documento, pueden referirse a una célula de origen humano o animal no humano.

[0069] Como se usa en el presente documento, el término "unido operativamente" se refiere a una primera molécula de polinucleótido, como un promotor, conectada con una segunda molécula de polinucleótido transcribible, como un gen de interés, en la que las moléculas de polinucleótidos están dispuestas de tal manera que la primera molécula de polinucleótidos afecta a la función de la segunda molécula de polinucleótidos. Las dos moléculas de polinucleótidos pueden formar parte o no de una única molécula de polinucleótidos contigua y pueden ser adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está vinculado de manera operativa a un gen de interés si el promotor regula o media la transcripción del gen de interés en una célula.

[0071] En las diversas realizaciones descritas en el presente documento, se contempla además que se incluyen variantes (naturales o de otro tipo), alelos, homólogos, variantes modificadas de forma conservadora, y/o variantes de sustitución conservadora de cualquiera de los polipéptidos particulares descritos. En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la materia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteren un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora", en la que la alteración da lugar a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido químicamente similar y conserva la actividad deseada del polipéptido. Dichas variantes modificadas conservativamente se suman a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos interespecíficos y los alelos compatibles con la divulgación.

[0073] Un aminoácido determinado puede sustituirse por un residuo con características fisicoquímicas similares, por ejemplo, sustituyendo un residuo alifático por otro (como Ile, Val, Leu o Ala entre sí), o la sustitución de un residuo polar por otro (como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn). Otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, las sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobia similares, son bien conocidas. Los polipéptidos que comprenden sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden someterse a ensayo en uno cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento para confirmar que se conserva la actividad deseada, por ejemplo, la actividad del receptor mediada por el ligando y la especificidad de un polipéptido nativo o de referencia.

[0075] Los aminoácidos pueden agruparse según similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, 2.ª ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polares sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H). Alternativamente, los residuos naturales pueden dividirse en grupos según las propiedades comunes de sus cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas implicarán el cambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones conservadoras particulares incluyen, por ejemplo: Ala por Gly o por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o por His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Ala o por Pro; His por Asn o por Gln; Ile por Leu o por Val; Leu por Ile o por Val; Lys por Arg, por Gln o por Glu; Met por Leu, por Tyr o por Ile; Phe por Met, por Leu o por Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp; y/o Phe por Val, por Ile o por Leu.

[0077] En algunas realizaciones, un polipéptido descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) puede ser un fragmento funcional de una de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un "fragmento funcional" es un fragmento o segmento de un péptido que conserva al menos un 50 % de la actividad del polipéptido de referencia natural según un ensayo conocido en la técnica o descrito más adelante en el presente documento. Un fragmento funcional puede comprender sustituciones conservadoras de las secuencias divulgadas en el presente documento.

[0079] En algunas realizaciones, un polipéptido descrito en el presente documento puede ser una variante de un polipéptido o molécula como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la variante es una variante modificada de forma conservadora. Las variantes de sustitución conservadora pueden obtenerse mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos nativas, por ejemplo. Una "variante", como se menciona en el presente documento, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un polipéptido nativo o de referencia, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la del polipéptido nativo o de referencia debido a una o a una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos variantes abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con una secuencia de ADN nativa o de referencia, pero que codifican una proteína variante o un fragmento de la misma que conserva la actividad del polipéptido no variante. En la técnica se conoce una amplia variedad de enfoques de mutagénesis específica de sitio basados en la PCR, que pueden ser aplicados por un experto en la materia. La secuencia de aminoácidos o de ADN variante puede ser idéntica en al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o más a una secuencia nativa o de referencia. El grado de homología (porcentaje de identidad) entre una secuencia nativa y una mutante puede determinarse, por ejemplo, comparando las dos secuencias usando programas informáticos de libre acceso que se emplean habitualmente para este fin en internet (por ejemplo, BLASTp o BLASTn con la configuración predeterminada).

[0080] Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa pueden llevarse a cabo mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocidas por un experto en la materia. Las mutaciones pueden introducirse, por ejemplo, en loci concretos mediante la síntesis de oligonucleótidos que contengan una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción deseadas. Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar una secuencia de nucleótidos alterada que tiene codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción requerida. Las técnicas para realizar dichas alteraciones están bien establecidas e incluyen, por ejemplo, las divulgadas por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes de EE. UU. n.º 4.518.584 y 4.737.462. Cualquier residuo de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación adecuada de un polipéptido también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la formación de entrecruzamientos anómalos. Por el contrario, pueden añadirse enlace o enlaces de cisteína a un polipéptido para mejorar su estabilidad o facilitar la oligomerización.

[0081] Como se usa en el presente documento, el término "ADN" se define como ácido desoxirribonucleico. El término "polinucleótido" se usa en el presente documento de forma intercambiable con "ácido nucleico" para indicar un polímero de nucleósidos. Normalmente, un polinucleótido está compuesto por nucleósidos que se encuentran de forma natural en el ADN o el ARN (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) unidos por enlaces fosfodiéster. Sin embargo, el término abarca moléculas que comprenden nucleósidos o análogos de nucleósidos que contienen bases modificadas química o biológicamente, esqueletos modificados, etc., independientemente de que se encuentren o no en ácidos nucleicos naturales, y dichas moléculas pueden ser preferibles para ciertas aplicaciones. Cuando en la presente solicitud se hace referencia a un polinucleótido, se entiende que proporcionan tanto el ADN, ARN, como en cada caso tanto las formas monocatenarias como bicatenarias (y los complementos de cada molécula monocatenaria). "Secuencia de polinucleótidos", como se usa en el presente documento, puede referirse al material polinucleotídico en sí mismo y/o a la información de la secuencia (es decir, la sucesión de letras usadas como abreviaturas de las bases) que caracteriza bioquímicamente a un ácido nucleico específico. Una secuencia de polinucleótidos presentada en el presente documento se presenta en dirección 5' a 3', a menos que se indique lo contrario.

[0082] El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos. Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento. Un péptido es un polipéptido relativamente corto, normalmente de entre 2 y 60 aminoácidos de longitud. Los polipéptidos usados en el presente documento contienen normalmente aminoácidos tales como los 20 L-aminoácidos que se encuentran más comúnmente en las proteínas. Sin embargo, pueden usarse otros aminoácidos y/o análogos de aminoácidos conocidos en la técnica. Uno o más de los aminoácidos de un polipéptido pueden estar modificados, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química como un grupo hidrato de carbono, un grupo fosfato, un grupo ácido graso, un conector para la conjugación, la funcionalización, etc. Un polipéptido que tiene un resto no polipeptídico asociado a él de forma covalente o no covalente sigue considerándose un "polipéptido". Las modificaciones ejemplares incluyen la glucosilación y la palmitoilación. Los polipéptidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando tecnología de ADN recombinante o sintetizarse por medios químicos, como la síntesis convencional de péptidos en fase sólida, etc. La expresión "secuencia de polipéptidos" o "secuencia de aminoácidos", como se usa en el presente documento, puede referirse al material polipeptídico en sí mismo y/o a la información de la secuencia (es decir, la sucesión de letras o códigos de tres letras usados como abreviaturas de los nombres de los aminoácidos) que caracteriza bioquímicamente a un polipéptido. Una secuencia de polipéptidos presentada en el presente documento se presenta en dirección aminoterminal a carboxiterminal, a menos que se indique lo contrario.

[0083] En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido CAR) está comprendido en un vector. En algunos de los aspectos descritos en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido determinado como se describe en el presente documento, o cualquier módulo del mismo, está unida de manera operativa a un vector. El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para su administración a una célula hospedadora o para su transferencia entre diferentes células hospedadoras. Como se usa en el presente documento, un vector puede ser vírico o no vírico. El término "vector" abarca cualquier elemento genético que sea capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que pueda transferir secuencias genéticas a las células. Un vector puede incluir, entre otros, un vector de clonación, un vector de expresión, un plásmido, un fago, un transposón, un cósmido, un cromosoma artificial, un virus, virión, etc.

[0084] Como se usa en el presente documento, el término "vector de expresión" se refiere a un vector que dirige la expresión de un ARN o polipéptido a partir de secuencias unidas a secuencias reguladoras de la transcripción en el vector. Las secuencias expresadas serán a menudo, aunque no necesariamente, heterólogas a la célula. Un vector de expresión puede comprender elementos adicionales; por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, lo que le permite mantenerse en dos organismos, por ejemplo, en células humanas para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y la amplificación. El término "expresión" se refiere a los procesos celulares implicados en la producción de ARN y proteínas y, según proceda, en la secreción de proteínas, incluyendo, cuando sea aplicable, entre otros, por ejemplo, la transcripción, el procesamiento de transcritos, la traducción y el plegamiento, la modificación y el procesamiento de proteínas. Los "productos de expresión" incluyen ARN transcrito a partir de un gen, y polipéptidos obtenidos mediante la traducción de ARNm transcrito a partir de un gen. El término "gen" significa la secuencia de ácido nucleico que se transcribe (ADN) a ARNin vitrooin vivocuando se une operativamente a secuencias reguladoras apropiadas. El gen puede incluir o no regiones que preceden y siguen a la región codificante, por ejemplo, secuencias 5' no traducidas (5'UTR) o "conductoras" y secuencias 3' UTR o "traseras", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

[0086] Como se usa en el presente documento, el término "vector vírico" se refiere a una construcción de vector de ácido nucleico que incluye al menos un elemento de origen vírico y tiene la capacidad de encapsidarse en una partícula de vector vírico. El vector vírico puede contener un ácido nucleico que codifique un polipéptido como se describe en el presente documento en lugar de genes víricos no esenciales. El vector y/o la partícula pueden utilizarse con el propósito de transferir ácidos nucleicos a las células, ya seain vitrooin vivo. Se conocen numerosas formas de vectores víricos en la técnica.

[0088] Por "vector recombinante" se entiende un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heteróloga o "transgén" capaz de expresarsein vivo. Debe entenderse que los vectores descritos en el presente documento pueden, en algunas realizaciones, combinarse con otras composiciones y terapias adecuadas. En algunas realizaciones, el vector es episomal. El uso de un vector episomal adecuado proporciona un medio para mantener el nucleótido de interés en el sujeto en un ADN extracromosómico con un elevado número de copias, eliminando así los posibles efectos de la integración cromosómica.

[0090] Como se usan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", "tratar" o "mejora" se refieren a tratamientos terapéuticos, en donde el objetivo es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o la gravedad de una afección asociada a una enfermedad o trastorno, por ejemplo, glioblastoma, glioma, leucemia linfoblástica aguda u otro cáncer, enfermedad o trastorno. El término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento es generalmente "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es "eficaz" si se reduce o detiene la progresión de una enfermedad. Es decir, el "tratamiento" incluye no solo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también el cese o, al menos, la ralentización del progreso o empeoramiento de los síntomas en comparación con lo que cabría esperar en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, el alivio de uno o más síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad, remisión (ya sea parcial o total) y/o disminución de la mortalidad, ya sea detectable o indetectable. El término "tratamiento" de una enfermedad también incluye proporcionar el alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluido el tratamiento paliativo).

[0092] Como se usa en el presente documento, el término "composición farmacéutica" se refiere al agente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un portador de uso común en la industria farmacéutica. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, según el criterio médico razonable, adecuadas para su uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acordes a una relación beneficio/riesgo razonable. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un portador farmacéuticamente aceptable puede ser un portador distinto del agua. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un portador farmacéuticamente aceptable puede ser una crema, una emulsión, un gel, un liposoma, una nanopartícula y/o un ungüento. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un portador farmacéuticamente aceptable puede ser un vehículo artificial o manipulado, por ejemplo, un portador en el que el principio activo no se encontraría en la naturaleza.

[0094] Como se usa en el presente documento, el término "administrar" se refiere a la introducción de una composición terapéutica o farmacéutica como se divulga en el presente documento en un sujeto mediante un método o vía que dé lugar a la administración, al menos parcial, del agente en un lugar deseado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes como se divulgan en el presente documento pueden administrarse por cualquier vía adecuada que dé lugar a un tratamiento eficaz en el sujeto.

[0095] El término "estadísticamente significativo" o "significativamente" se refiere a la significación estadística y, en general, significa una diferencia de dos desviaciones estándar (2DE) o mayor.

[0096] A excepción de en los ejemplos operativos o donde se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o, condiciones de reacción, usados en el presente documento se deben entender como modificados en todos los casos por el término «aproximadamente». El término "aproximadamente", cuando se usa en relación con porcentajes, puede significar ±1 %.

[0097] Como se usa en el presente documento, el término "que comprende" significa que también pueden estar presentes otros elementos además de los elementos definidos presentados. El uso de "que comprende" indica inclusión más que limitación.

[0098] La expresión “que consiste en” se refiere a composiciones, métodos y sus respectivos componentes, como se describen en el presente documento, que son excluyentes de cualquier elemento no citado en esa descripción de la realización.

[0099] Como se usa en el presente documento, la expresión “que consiste esencialmente en” se refiere a aquellos elementos necesarios para una realización dada. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afecten materialmente a la característica o características básicas, novedosas o funcionales de esa realización de la tecnología.

[0100] Los términos en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque en la práctica o en las pruebas de presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. La abreviatura " e.g." deriva del latín exempli gratia y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura "e.g." es sinónimo del término "por ejemplo". En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, la divulgación descrita en el presente documento no se refiere a un proceso para clonar seres humanos, procesos para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos, usos de embriones humanos con fines industriales o comerciales, ni procesos para modificar la identidad genética de animales que es probable que les cause sufrimiento sin ningún beneficio médico sustancial para el ser humano o el animal, ni tampoco a los animales resultantes de dichos procesos.

[0101] Otros términos se definen en la descripción de los diversos aspectos y realizaciones de la tecnología, como se expone a continuación.

[0102] La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, los linfocitos T-CAR de la invención pueden usarse para administrar moléculas terapéuticas para el tratamiento del cáncer. En un ejemplo, los linfocitos T-CAR de la invención pueden usarse para administrar anticuerpos que de otro modo serían tóxicos (por ejemplo, anti-CTLA4 o anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab)) u otras moléculas (por ejemplo, citocinas) al microambiente tumoral, donde pueden permitir de manera ventajosa la activación de los linfocitos infiltrantes tumorales circundantes, proporcionar un bloqueo de puntos de control y agotar los linfocitos T reguladores (Treg). Los linfocitos T-CAR de la invención pueden dirigirse además contra antígenos de Treg, para facilitar dirigirse a los linfocitos Treg. Además, ciertos linfocitos T-CAR de la invención pueden usarse para administrar moléculas codificadas genéticamente (por ejemplo, anticuerpos o citocinas) a regiones del cuerpo (por ejemplo, el sistema nervioso central, incluido el cerebro) a las que estas moléculas no podrían llegar de otro modo. En un ejemplo, los linfocitos T-CAR dirigidos contra EGFRvIII pueden usarse para atacar tumores cerebrales y pueden administrar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos contra EGFR, como el cetuximab; véase también más adelante) a los tumores. La invención proporciona, por lo tanto, la elección de linfocitos Treg como diana codificada genéticamente en el microambiente tumoral. Además, la invención proporciona la administración codificada genéticamente de anticuerpos que no pueden penetrar en ciertos tejidos, y podría potenciar la potencia de las terapias con linfocitos T al ampliar la especificidad de la diana antitumoral. La invención proporciona, en consecuencia, una terapia con linfocitos T modificados genéticamente para el cáncer.

[0103] Otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

[0104] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0105] La Fig.1 es un gráfico que muestra la destrucción de la línea celular diana de glioma humano U87vlll por parte de los linfocitos T-CAR-EGFRvIII en función de la relación linfocitos T-CAR-EGFRvIII:células diana U87vIII. Se incubaron células no transducidas con células diana como control negativo.

[0106] Las Fig.2A y 2B son una serie de superposiciones de rayos X que muestran la localización del tumor que expresa EGFRvIII (U87vlll) en un modelo subcutáneo de glioma humano. La Fig. 2A muestra ratones tratados con células no transducidas como control negativo. La Fig. 2B muestra ratones tratados con T-CAR-EGFRvlll el día 4 tras la implantación (fila superior), con un tratamiento con éxito para el día 21 (fila inferior).

[0107] Las Fig.3A y 3B son una serie de superposiciones de rayos X que muestran la localización del tumor que expresa EGFRvIII (U87vlll) en un modelo intracraneal de glioma humano. La Fig. 2A muestra ratones tratados con células no transducidas (UTD) como control negativo en el día 5 (D5; arriba) y D11 (abajo). La Fig. 2B muestra ratones tratados con T-CAR-EGFRvIII el día 2 tras la implantación en el D5 (fila superior) y en el D21 (fila inferior).

[0108] Las Fig.4A y 4B son fotomicrografías que muestran la inmunohistoquímica del tejido tumoral de un paciente cinco días después de la infusión de T-CAR-EGFRvIII. La Fig. 4A muestra linfocitos T teñidos para CD3. La Fig. 4B muestra células CD25+. CD25 es la cadena alfa del receptor de IL-2, un marcador de linfocitos T activados o reguladores.

[0109] Las Fig. 5A-5C son micrografías de fluorescencia que demuestran cualitativamente la supresión por parte de las Treg de la actividad antitumoral de los linfocitos T-CAR (rojo) tras 18 horas de coincubación con células de glioma humano (verde) in vitro. La Fig. 5A muestra la concentración relativa de linfocitos T-CAR no específicos respecto a las células de glioma. La Fig. 5B muestra la concentración relativa de linfocitos T-CAR-EGFRvIII respecto a las células de glioma sin Treg en el cultivo. La Fig.5C muestra la concentración relativa de linfocitos T-CAR-EGFRvIII respecto a las células de glioma con Treg incluidos en el cultivo.

[0110] La Fig.5D es un gráfico que muestra lecturas cuantitativas de la confluencia de objetos verdes como medida de la viabilidad de las células de glioma en función del tiempo (hasta 48 horas). La línea superior representa los resultados mostrados en la Fig.5A (crecimiento de las células de glioma), la línea inferior representa los resultados mostrados en la Fig.5B (muerte de las células de glioma) y la línea del medio representa los resultados mostrados en la Fig.5C (resistencia de las células de glioma a la muerte inducida por T-CAR).

[0111] Las Fig. 6A-6C son gráficos de citometría de flujo que muestran la expresión de LAP (eje x) y GARP (eje y) en linfocitos T de control (Fig.6A), Tregs no activados (Fig.6B) y Treg activados (Fig.6C). Los Treg se seleccionaron a partir de Leukopak en CD4+CD25+CD127- y se expandieron con perlas de CD3/CD28 durante siete días en presencia de IL-2. El día 1, se transdujeron para expresar GFP. Tras la eliminación de las perlas el día 7, los Treg expandidos se dejaron en reposo durante cuatro días antes de congelarlos. Tras la descongelación, los Treg se tiñeron para determinar la expresión de LAP y GARP tras un reposo nocturno (sin activación) o una activación nocturna con anti-CD3 y anti-CD28. Se usaron linfocitos T no transducidos (CD4+ y CD8+) del mismo donante se usaron como controles de expresión (Fig.6A).

[0112] Las Fig. 7A y 7B son histogramas de citometría de flujo correspondientes a los resultados mostrados en las Fig. 6A-6C, que muestran la expresión de LAP (Fig.7A) y GARP (Fig.7B).

[0113] Las Fig.8A-8D son dibujos esquemáticos de construcciones CAR para dirigirse a antígenos asociados a los Treg. La Fig.8A muestra una construcción CAR dirigida contra LAP que tiene un scFv anti-LAP con su cadena ligera (L) y su cadena pesada (H) dispuestas en dirección 5’ a 3', respectivamente (T-CAR-LAP-L-H). La Fig. 8B muestra una construcción CAR dirigida contra LAP que tiene un scFv anti-LAP con su cadena pesada (H) y su cadena ligera (L) dispuestas en dirección 5’ a 3', respectivamente (T-CAR-LAP-H-L). La Fig. 8C muestra una construcción CAR dirigida contra GARP que tiene un dominio de unión de anticuerpo de camélido anti-GARP (T-CAR-GARP). La Fig. 8D muestra una construcción CAR dirigida contra EGFR que tiene un anticuerpo de camélido anti-GARP.

[0114] Las Fig.9A y 9B son gráficos que muestran la destrucción de Treg diana en función de la relación entre los linfocitos T-CAR y los linfocitos Treg diana. Los Treg se transdujeron con GFP, y la citotoxicidad se cuantificó mediante la monitorización de la expresión de GFP. La Fig.9A muestra la destrucción de Treg activados, y la Fig.9B muestra la destrucción de Treg no activados. T-CAR-LAP -H-L fue más eficaz en la destrucción de Treg no activados en comparación con T-CAR-LAP-L-H.

[0115] Las Fig.10A y 10B son gráficos que muestran la destrucción de Treg diana por diversos linfocitos T-CAR anti-Treg (es decir, T-CAR-GARP, T-CAR-LAP-H-L, T-CAR-LAP-L-H o células de control no transducidas) en una proporción de 1:1 de linfocitos T-CAR a Treg durante cuatro días. Las Fig. 10A y 10B muestran los resultados del mismo experimento realizado en dos donantes diferentes.

[0116] Las Fig.11A-11D son gráficos que muestran la destrucción de linfocitos Treg diana en función de la proporción de linfocitos T-CAR respecto a linfocitos Treg diana por parte de los linfocitos T-CAR dirigidos contra LAP tras tres días de cocultivo. Las Fig.11A y 11B muestran el número de células diana restantes en el cocultivo, como se mide mediante citometría de flujo. Una línea discontinua indica el número de células diana en una muestra de control que no contiene células CAR. La Fig.11A muestra Treg no activados como células diana, mientras que la Fig.11B muestra Treg activados como células diana. Las Fig.11C y 11D muestran el porcentaje de citotoxicidad, como se mide mediante la expresión de luciferasa por células diana. La Fig. 11C muestra Treg no activados como células diana, mientras que la Fig.11D muestra Treg activados como células diana. En cada una de 11A-11D, los círculos representan T-CAR-LAP-H -L, los cuadrados representan T-CAR-LAP-L-H y los triángulos representan células CAR no transducidas.

[0117] Las Fig. 12A y 12B son histogramas de citometría de flujo que muestran la expresión de GARP (Fig. 12A) y LAP (Fig.12B) por parte de las células HUT78.

[0118] Las Fig.13A y 13B son gráficos que muestran la destrucción de las células HUT78 en función de la relación entre los linfocitos T-CAR y las células diana por parte de los linfocitos T-CAR dirigidos contra LAP tras tres días de cocultivo. La Fig. 13A muestra el número de células diana que quedan en el cultivo tras tres días, como se mide mediante citometría de flujo. Una línea discontinua indica el número de células diana en una muestra de control que no contiene células CAR. La Fig. 13B muestra el porcentaje de citotoxicidad medido por la expresión de luciferasa por células diana. Los círculos representan T-CAR-LAP-H -L, los cuadrados representan T-CAR-LAP-L-H y los triángulos representan células CAR no transducidas.

[0119] Las Fig. 14A y 14B son histogramas de citometría de flujo que muestran la expresión de GARP (Fig. 14A) y LAP (Fig.14B) por parte de las células SeAx.

[0120] Las Fig.15A y 15B son gráficos que muestran la destrucción de células SeAx diana en función de la relación entre linfocitos T-CAR y células diana por parte de los linfocitos T-CAR dirigidos contra GARP y LAP tras 24 (Fig. 15A) horas y 48 horas (Fig.15B) de cocultivo, como se mide mediante la expresión de luciferasa por células diana. Los cuadrados representan T-CAR-GARP, los triángulos apuntando hacia arriba representan T-CAR-LAP-H-L, los triángulos apuntando hacia abajo representan linfocitos T-CAR-LAP-H-L y los rombos representan células CAR no transducidas.

[0121] Las Fig.16A-16C son fotografías de transferencias Western que muestran la presencia de componentes proteicos de los sobrenadantes obtenidos de cultivos de linfocitos T-CAR-EGFR-GARP. Las Fig.16A y 16B muestran el gel completo, incluidas las escalas de referencia de peso molecular. Las Fig. 16C es una exposición más prolongada de la región inferior del gel mostrado en la Fig.16B, en la que se identifica con una flecha una banda entre 10 y 15 kD, lo que indica la presencia de un anticuerpo de camélido.

[0122] La Fig.17 es un dibujo esquemático de CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR y un BiTE.

[0123] La Fig. 18 es un dibujo esquemático de un BiTE que tiene un dominio anti-EGFR derivado de cetuximab y un dominio anti-CD3 derivado de blinatumomab.

[0124] La Fig. 19 es un conjunto de fotografías que muestran un experimento de transferencia Western que verifica la presencia de BiTE en el carril 2.

[0125] Las Fig. 20A y 20B son un conjunto de gráficos de citometría de flujo que muestran la unión de BiTE expresado por células HEK293 transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) al EGFR expresado por células K562 (Fig. 20A) y al CD3 expresado por células Jurkat (Fig.20B).

[0126] Las Fig. 21A y 21B son un conjunto de gráficos de citometría de flujo que muestran la unión de BiTE expresado por células SupT1 transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) al EGFR expresado por células K562 (Fig. 21A) y al CD3 expresado por células SupT1 que expresan CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) (Fig.21B).

[0127] Las Fig. 22A y 22B son un conjunto de gráficos de citometría de flujo que muestran la unión de BiTE expresado por células ND4 transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) al EGFR expresado por células K562 (Fig.21A) y al CD3 expresado por células ND4 que expresan CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) (Fig.21B).

[0128] La Fig.23 es un gráfico que muestra la destrucción de células U87vlll por parte de las células ND4 incubadas con BiTE secretado por células HEK293T que fueron transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), en función de la relación entre células efectoras (ND4 no transducidas) y células diana (U87vlll). Los cuadrados representan el grupo experimental en el que el sobrenadante contenía BiTE, y los círculos representan un control negativo que no contenía BiTE.

[0129] La Fig. 24 es un esquema de una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR bajo el control de un promotor EF1α y GFP bajo el control de un promotor NFAT.

[0130] Las Fig.25A y 25B son un conjunto de gráficos de citometría de flujo que muestran la expresión de GFP por parte de células transducidas con la construcción de la Fig. 24. El histograma rojo muestra la expresión de GFP en células no estimuladas; el histograma azul muestra la expresión de GFP en células estimuladas con PMA e ionomicina; y el histograma naranja muestra la expresión de GFP en células recubiertas con PEPvlll.

[0131] La Fig. 26A es un dibujo esquemático de GFP-CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR y un BiTE expresado de forma constitutiva.

[0132] La Fig. 26B es un dibujo esquemático de GFP-CAR-EGFR-BiTE-(CD19-CD3), una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR y un BiTE expresado de forma constitutiva.

[0133] La Fig.27A es un dibujo esquemático de BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR, una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR y un BiTE expresado de forma inducible.

[0134] La Fig.27B es un dibujo esquemático de BiTE-(CD19-CD3)-CAR-EGFR, una molécula de ácido nucleico ejemplar que codifica un CAR y un BiTE expresado de forma inducible.

[0135] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0136] La invención proporciona enfoques mejorados para la terapia basada en linfocitos T con receptores quiméricos para el antígeno ("linfocitos T-CAR"). En general, las mejoras se refieren a diferentes aspectos de la selección de dianas en la terapia antitumoral, por ejemplo, la selección de dianas del microambiente tumoral.

[0137] Como se explica más adelante, los presentes inventores han demostrado que los linfocitos T reguladores (también denominadas en el presente documento "Treg"), que desempeñan un papel en la supresión de la respuesta inmunitaria de un sujeto contra los tumores (por ejemplo, en el microambiente tumoral), pueden ser seleccionados como diana por linfocitos T-CAR. La invención proporciona, por tanto, linfocitos T-CAR que secretan anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, activadores de linfocitos T biespecíficos) contra uno o más antígenos o marcadores de Treg (por ejemplo, GARP, LAP, CTLA4 y CD25; véase también más adelante). En un ejemplo, se usa un linfocito T-CAR que tiene un CAR específico para EGFRvIII para seleccionar como diana tumores cerebrales (por ejemplo, glioblastomas). Dichos linfocitos T-CAR también pueden usarse para administrar moléculas terapéuticas, tales como reactivos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de cadena única, anticuerpos de dominio único [por ejemplo, anticuerpos de camélidos] o anticuerpos biespecíficos [por ejemplo, activadores de linfocitos T biespecíficos]) a estos tumores. Estos métodos son particularmente ventajosos, ya que, en efecto, facilitan la administración de anticuerpos al cerebro, a pesar de la barrera hematoencefálica a través de la cual los anticuerpos no suelen atravesar. Estos enfoques, así como los métodos y composiciones relacionados, se describen con más detalle a continuación.

[0138] Receptores quiméricos para el antígeno

[0139] La tecnología descrita en el presente documento proporciona CAR mejorados para su uso en inmunoterapia. A continuación se analizan los CAR y las diversas mejoras.

[0140] Los términos "receptor quimérico para el antígeno" o "CAR" o "CARs", como se usan en el presente documento, se refieren a receptores de linfocitos T manipulados, que injertan una especificidad de ligando o antígeno a los linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T intactos, linfocitos T de memoria central, linfocitos T de memoria efectores o combinaciones de los mismos). Los CAR también se conocen como receptores artificiales de linfocitos T, receptores quiméricos de linfocitos T o inmunorreceptores quiméricos.

[0141] Un CAR coloca un dominio quimérico extracelular de unión a la diana que se une específicamente a una diana, por ejemplo, un polipéptido, expresado en la superficie de una célula a la que se dirige la respuesta de los linfocitos T, en una construcción que incluye un dominio transmembranario y dominio o dominios intracelulares de una molécula de receptor de linfocitos T. En una realización, el dominio extracelular quimérico de unión a la diana comprende el dominio o dominios de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno expresado en una célula que va a ser la diana de una respuesta de linfocitos T. Las propiedades del dominio o dominios de señalización intracelular del CAR pueden variar según se conoce en la técnica y según se divulga en el presente documento, pero el dominio o dominios quiméricos de unión a la diana/antígeno hacen que el receptor sea sensible a la activación de la señalización cuando el dominio quimérico de unión a la diana/antígeno se une a la diana/antígeno en la superficie de una célula diana.

[0142] En lo que respecta a los dominios de señalización intracelulares, los denominados CAR de "primera generación" incluyen aquellos que proporcionan únicamente señales de CD3zeta (CD3ζ) tras la unión al antígeno. Los denominados CAR de "segunda generación" incluyen aquellos que proporcionan tanto dominios de coestimulación (por ejemplo, CD28 o CD 137) como de activación (CD3ζ), y los denominados CAR de "tercera generación" incluyen aquellos que proporcionan múltiples dominios de coestimulación (por ejemplo, CD28 y CD137) y dominios de activación (por ejemplo, CD3ζ). En diversas realizaciones, el CAR se selecciona para que tenga una alta afinidad o avidez por la diana/antígeno; por ejemplo, los dominios de unión a la diana o al antígeno derivados de anticuerpos tendrán generalmente una mayor afinidad y/o avidez por el antígeno diana que un receptor de linfocitos T natural. Esta propiedad, combinada con la alta especificidad que se puede seleccionar para un anticuerpo, proporciona una selección como diana de los linfocitos T altamente específica por parte de los linfocitos T-CAR.

[0143] Como se usa en el presente documento, un "linfocito T-CAR" o "T-CAR" se refiere a un linfocito T que expresa un CAR. Cuando se expresan en un linfocito T, los CAR tienen la capacidad de redirigir la especificidad y la reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de una manera no restringida por el MHC, aprovechando las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígenos no restringido por el MHC confiere a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad de reconocer un antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, eludiendo así un mecanismo importante de escape tumoral.

[0144] Como se usa en el presente documento, la expresión "dominio extracelular de unión a la diana" se refiere a un polipéptido que se encuentra en el exterior de la célula que es suficiente para facilitar la unión a una diana. El dominio extracelular de unión a la diana se unirá específicamente a su compañero de unión, es decir, a la diana. Como ejemplos no limitativos, el dominio extracelular de unión a la diana puede incluir un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o un reactivo de anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une a una proteína compañera de unión relacionada. En este contexto, un ligando es una molécula que se une específicamente a una parte de una proteína y/o receptor. El compañero de unión relacionado de un ligando útil en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede encontrarse generalmente en la superficie de una célula. La unión ligando:compañero relacionado puede dar lugar a la alteración del receptor portador del ligando, o activar una respuesta fisiológica, por ejemplo, la activación de una vía de señalización. En una realización, el ligando puede ser no nativo del genoma. Opcionalmente, el ligando tiene una función conservada en al menos dos especies.

[0146] Reactivos de anticuerpos

[0148] En diversas realizaciones, los CAR descritos en el presente documento comprenden un reactivo de anticuerpo o un dominio de unión al antígeno del mismo como dominio extracelular de unión a la diana.

[0150] Como se usa en el presente documento, el término "reactivo de anticuerpo" se refiere a un polipéptido que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno dado. Un reactivo de anticuerpo puede comprender un anticuerpo o un polipéptido que comprenda un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, un reactivo de anticuerpo puede comprender un anticuerpo monoclonal o un polipéptido que comprenda un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de la cadena pesada (H) (abreviada en el presente documento V<H>) y una región variable de la cadena ligera (L) (abreviada en el presente documento V<L>). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). El término "reactivo de anticuerpo" abarca fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab y sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv, CDR y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (véase, por ejemplo, de Wildt et al., Eur. J. Immunol.26(3):629-639, 1996)), así como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD o IgM (así como subtipos y combinaciones de los mismos). Los anticuerpos pueden proceder de cualquier fuente, incluyendo ratones, conejos, cerdos, ratas y primates (humanos y primates no humanos), y anticuerpos primatizados. Los anticuerpos también incluyen midicuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y similares. Los dominios de unión de anticuerpos totalmente humanos pueden seleccionarse, por ejemplo, a partir de bibliotecas de presentación en fagos usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Además, los reactivos de anticuerpos incluyen anticuerpos de dominio único, como los anticuerpos de camélidos.

[0152] Las regiones VH y VL pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones estructurales" ("FR"). La extensión de la región estructural y de las CDR se ha definido con precisión (véase Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación del NIH n.º 91-3242, y Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917, 1987). Cada V<H>y V<L>se compone normalmente de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de extremo amino a extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0154] En una realización, el anticuerpo o reactivo de anticuerpo no es un anticuerpo o reactivo de anticuerpo humano (es decir, el anticuerpo o reactivo de anticuerpo es de ratón), pero ha sido humanizado. Un "anticuerpo o reactivo de anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo o reactivo de anticuerpo no humano que ha sido modificado a nivel de la secuencia proteica para aumentar su similitud con las variantes de anticuerpos o reactivos de anticuerpos producidas naturalmente en humanos. Un enfoque para humanizar anticuerpos emplea el injerto de CDR murinas u otras no humanas en estructuras de anticuerpos humanos.

[0155] En una realización, el dominio extracelular de unión a la diana de un CAR comprende o consiste esencialmente en un fragmento Fv de cadena única (scFv) creado mediante la fusión de los dominios V<H>y V<L>de un anticuerpo, generalmente un anticuerpo monoclonal, a través de un péptido conector flexible. En diversas realizaciones, el scFv se fusiona con un dominio transmembranario y con un dominio de señalización intracelular del receptor de linfocitos T, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular manipulado como se describe en el presente documento. En otra realización, el dominio extracelular de unión a la diana de un CAR comprende un anticuerpo de camélido.

[0157] Los dominios de unión de anticuerpos y las formas de seleccionarlos y clonarlos son bien conocidos por los expertos en la materia. En una realización, el reactivo de anticuerpo es un reactivo de anticuerpo anti-GARP y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o 25, o comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior a la secuencia de SEQ ID NO: 3 o 25. En otra realización, el reactivo de anticuerpo es un reactivo de anticuerpo anti-LAP y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 o 15, o comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior a la secuencia de SEQ ID NO: 9 o 15. En otra realización, el reactivo de anticuerpo es un reactivo de anticuerpo anti-EGFR o anti-EGFRvIII y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21, 27, 33, 36, 42, 45, 55, 57 o 65, o comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior a la secuencia de SEQ ID NO: 21, 27, 33, 36, 42, 45, 55, 57 o 65. En otra realización, el reactivo de anticuerpo es un reactivo de anticuerpo anti-CD19 y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 51 o 63, o comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior a la secuencia de SEQ ID NO: 51 o 63. En otra realización, el reactivo de anticuerpo es un reactivo de anticuerpo anti-CD3 y comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34, 43, 52, 56 o 64, o comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 34, 43, 52, 56 o 64. En diversos ejemplos, el anticuerpo puede seleccionarse de C225, 3C10, Cetuximab y 2173.

[0159] En una realización, los CAR útiles en la tecnología descrita en el presente documento comprenden al menos dos regiones que se dirigen específicamente al antígeno, un dominio extracelular, un dominio transmembranario y un dominio de señalización intracelular. En dichas realizaciones, las dos o más regiones que se dirigen específicamente al antígeno se dirigen al menos a dos antígenos diferentes y pueden estar dispuestas en tándem y separadas por secuencias conectoras. En otra realización, el CAR es un CAR biespecífico. Un CAR biespecífico es específico de dos antígenos diferentes.

[0161] Diana/antígeno

[0163] Cualquier fragmento de la superficie celular puede ser diana de un CAR. A menudo, la diana será un polipéptido de la superficie celular que puede expresarse de forma diferencial o preferencial en una célula a la que se desea dirigir una respuesta de linfocitos T. Para dirigirse a los Treg, los reactivos de anticuerpos pueden dirigirse contra, por ejemplo, glucoproteína A predominante en repeticiones (GARP), péptido asociado a la latencia (LAP), CD25, CTLA-4, ICOS, TNFR2, GITR, OX40, 4-1BB y LAG-3. Para dirigirse a tumores o células cancerosas, los dominios de anticuerpos pueden dirigirse contra, por ejemplo, EGFR o EGFRvIII, como se describe en el presente documento. Dirigirse a antígenos tumorales o antígenos asociados a tumores que sean específicos de los tumores puede proporcionar un medio para dirigirse a linfocitos T, al tiempo que se evita o, al menos, se limita el daño colateral a células o tejidos no tumorales. Los ejemplos no limitativos de antígenos tumorales adicionales, antígenos asociados a tumores u otros antígenos de interés incluyen CD19, CD37, BCMA (miembro 17 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF17); ID de gen del NCBI: 608; Sec. Ref. del NCBI NP_001183.2) y ARNm (por ejemplo, Sec. Ref. del NCBI NM_001192.2), CEA, receptor de laminina inmaduro, TAG-72, E6 y E7 del VPH, BING-4, canal de cloro activado por calcio 2, ciclina B1, 9D7, Ep-CAM, EphA3, her2/neu, telomerasa, mesotelio, SAP-1, survivina, familia BAGE, familia CAGE, familia GAGE, familia MAGE, familia SAGE, familia XAGE, NY-ESO-1/LAGE-1, PRAME, SSX-2, Melan-A/MART-1, gp100/pmel17, tirosinasa, TRP-1/-2, MC1R, BRCA1/2, CDK4, MART-2, p53, Ras, MUC1, TGF-βRII, IL-15, IL13Ra2 y CSF1R.

[0165] Dominio transmembranario

[0167] Cada CAR descrito en el presente documento incluye un dominio transmembranario que une el dominio extracelular de unión a la diana con el dominio de señalización intracelular.

[0169] Como se usa en el presente documento, "dominio transmembranario" (dominio TM) se refiere a la región generalmente hidrófoba del CAR que atraviesa la membrana plasmática de una célula. El dominio TM puede ser la región transmembranaria o un fragmento de la misma de una proteína transmembranaria (por ejemplo, una proteína transmembranaria de tipo I u otra proteína transmembranaria), una secuencia hidrófoba artificial, o una combinación de los mismos. Aunque en el presente documento se proporcionan ejemplos específicos y se usan en los Ejemplos, otros dominios transmembranarios serán evidentes para los expertos en la materia y pueden usarse en relación con realizaciones alternativas de la tecnología. Una región transmembranaria seleccionada o un fragmento de la misma preferiblemente no interferiría con la función prevista del CAR. Como se usa en relación con un dominio transmembranario de una proteína o polipéptido, "fragmento del mismo" se refiere a una parte de un dominio transmembranario que es suficiente para anclar o unir una proteína a una superficie celular.

[0171] En una realización, el dominio transmembranario de un CAR o fragmento del mismo se deriva de o comprende el dominio transmembranario de CD8 (por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 37, 46, 58 o 66, o variantes de las mismas). En una realización alternativa, el dominio transmembranario o fragmento del mismo del CAR descrito en el presente documento comprende un dominio transmembranario seleccionado del dominio transmembranario de una cadena alfa, beta o zeta de un receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDI la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFI), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDI Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDI Ia, LFA-1, ITGAM, CDI Ib, ITGAX, CDI Ic, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D y/o NKG2C.

[0173] CD8 es un antígeno que se encuentra preferentemente en la superficie celular de los linfocitos T citotóxicos. CD8 media las interacciones célula-célula dentro del sistema inmunitario y actúa como correceptor de los linfocitos T. CD8 consiste en cadena alfa (CD8α) y una cadena beta (CD8β). Se conocen secuencias de CD8a para varias especies, por ejemplo, CD8a humano (ID de gen del NCBI: 925), polipéptido (por ejemplo, RefSeq del NCBI NP_001139345.1) y ARNm (por ejemplo, RefSeq de, NCBI NM_000002.12). CD8 puede referirse al CD8 humano, incluidas variantes naturales, moléculas y alelos de las mismas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, por ejemplo, en aplicaciones veterinarias, CD8 puede referirse al CD8 de, por ejemplo, perro, gato, vaca, caballo, cerdo y similares. Los homólogos y/u ortólogos del CD8 humano son fácilmente identificados para dichas especies por un experto en la materia, por ejemplo, usando la función de búsqueda de ortólogos del NCBI o buscando en los datos de secuencia disponibles para una especie determinada una secuencia similar a una secuencia de referencia de CD8.

[0175] 4-1BBL es una glucoproteína transmembranaria de tipo 2 que pertenece a la superfamilia del TNF. 4-1BBL se expresa en los linfocitos T activados. Se conocen secuencias de 4-1BBL para varias especies, por ejemplo, 4-1BBL humano, también conocido como TNFSF9 (ID de gen del NCBI: 8744), polipéptido (por ejemplo, RefSeq del NCBI NP_003802.1) y ARNm (por ejemplo, RefSeq del NCBI NM_003811.3). 4-1BBL puede referirse al 4-1BBL humano, incluidas variantes naturales, moléculas y alelos de las mismas. En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, por ejemplo, en aplicaciones veterinarias, 4-1BBL puede referirse al 4-1BBL de, por ejemplo, perro, gato, vaca, caballo, cerdo y similares. Los homólogos y/u ortólogos del 4-1BBL humano son fácilmente identificados para dichas especies por un experto en la materia, por ejemplo, usando la función de búsqueda de ortólogos del NCBI o buscando en los datos de secuencia disponibles para una especie determinada una secuencia similar a una secuencia de referencia de 4-1BBL.

[0177] Dominio coestimulador

[0179] Cada CAR descrito en el presente documento comprende opcionalmente el dominio intracelular de una o más moléculas coestimuladoras o dominios coestimuladores. Como se usa en el presente documento, el término "dominio coestimulador" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o los receptores de Fc que proporcionan una segunda señal necesaria para la activación y el funcionamiento eficaces de los linfocitos T tras la unión al antígeno. En un ejemplo, se puede usar un dominio intracelular (ICD) de 4-1BB (véase, por ejemplo, más adelante y SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29, 38, 47, 59, 67 o variantes de las mismas). Ejemplos ilustrativos adicionales de dichas moléculas coestimuladoras incluyen CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En una realización, el dominio intracelular es el dominio intracelular de 4-1BB. 4-1BB (CD137; TNFRS9) es una molécula coestimuladora inducida por la activación y es un regulador importante de las respuestas inmunitarias.

[0181] Dominio de señalización intracelular

[0183] Los CAR descritos en el presente documento comprenden un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de un polipéptido CAR que participa en la transducción del mensaje de la unión efectiva del CAR a un antígeno diana al interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, la activación, la producción de citocinas, la proliferación y la actividad citotóxica, incluida la liberación de factores citotóxicos a la célula diana unida al CAR, u otras respuestas celulares provocadas tras la unión del antígeno al dominio extracelular del CAR. En diversos ejemplos, el dominio de señalización intracelular es de CD3ζ (véase, por ejemplo, más adelante y SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30, 39, 48, 60, 68 o variantes de las mismas). Ejemplos no limitativos adicionales de dominios de señalización intracelulares que contienen ITAM y que son de uso particular en la tecnología incluyen aquellos derivados de TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3θ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.

[0185] CD3 es un correceptor de linfocitos T que facilita la activación de linfocitos T cuando se une simultáneamente a la coestimulación adecuada (por ejemplo, la unión de una molécula coestimuladora). Un complejo de CD3 consiste en 4 cadenas distintas; CD3 de mamíferos consiste en cadena CD3γ, una cadena CD3δ y dos cadenas CD3ε. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como receptor de linfocitos T (TCR) y con CD3ζ para generar una señal de activación en los linfocitos T. Un complejo TCR completo comprende un TCR, CD3ζ y el complejo CD3 completo.

[0187] En algunas realizaciones de cualquier aspecto, un polipéptido CAR descrito en el presente documento comprende un dominio de señalización intracelular que comprende un motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor o ITAM de CD3 zeta (CD3ζ). En algunas realizaciones de cualquier aspecto, el ITAM comprende tres motivos del ITAM de CD3ζ (ITAM3). En algunas realizaciones de cualquier aspecto, los tres motivos del ITAM de CD3ζ no están mutados y, por lo tanto, incluyen secuencias nativas o naturales. En algunas realizaciones, la secuencia de CD3ζ comprende la secuencia de un CD3ζ como se establece en las secuencias proporcionadas en el presente documento.

[0189] Los CAR individuales y otros componentes de la construcción descritos en el presente documento pueden usarse entre sí e intercambiarse dentro y fuera de diversas construcciones descritas en el presente documento, como pueden determinar los expertos en la materia. Cada uno de estos componentes puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias correspondientes establecidas en el presente documento, o variantes de las mismas.

[0190] Se puede encontrar una descripción más detallada de los CAR y los linfocitos T-CAR en Maus et al., Blood 123:2624-2635, 2014; Reardon et al., Neuro-Oncology 16:1441-1458, 2014; Hoyos et al., Haematologica 97:1622, 2012; Byrd et al., J. Clin. Oncol. 32:3039-3047, 2014; Maher et al., Cancer Res 69:4559-4562, 2009; y Tamada et al., Clin. Cancer Res.18:6436-6445, 2012.

[0192] En una realización, el CAR comprende además un dominio conector. Como se usa en el presente documento, "dominio conector" se refiere a una región oligopeptídica o polipeptídica de aproximadamente 2 a 100 aminoácidos de longitud, que une entre sí cualquiera de los dominios/regiones del CAR como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los conectores pueden incluir o estar compuestos por residuos flexibles, como la glicina y la serina, de modo que los dominios proteicos adyacentes puedan moverse libremente entre sí. Se pueden usar conectores más largos cuando sea deseable garantizar que dos dominios adyacentes no interfieran estéricamente entre sí. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles. Los ejemplos de conectores escindibles incluyen los conectores 2A (por ejemplo, T2A), los conectores similares a 2A o sus equivalentes funcionales y combinaciones de los mismos. En diversos ejemplos, se usan conectores que tienen secuencias como se exponen en el presente documento, o variantes de las mismas. Debe entenderse que la indicación de un conector particular en una construcción en una ubicación concreta no significa que solo pueda usarse ese conector en ese lugar. Más bien, diferentes secuencias de conectores (por ejemplo, P2A y T2A) pueden intercambiarse entre sí (por ejemplo, en el contexto de las construcciones de la presente invención), como pueden determinar los expertos en la materia. En una realización, la región del conector es T2A derivada del virus Thosea asigna. Los ejemplos no limitativos de conectores que pueden usarse en esta tecnología incluyen T2A, P2A, E2A, BmCPV2A y BmIFV2A. Conectores como estos pueden usarse en el contexto de poliproteínas, como las descritas a continuación. Por ejemplo, pueden usarse para separar un componente de CAR de una poliproteína de un componente de agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo, como un scFv, un anticuerpo de dominio único (por ejemplo, un anticuerpo de camélido) o un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un BiTE)) de una poliproteína (véase más adelante).

[0194] En algunas realizaciones, un CAR como se describe en el presente documento comprende opcionalmente además una molécula indicadora, por ejemplo, para permitir la obtención de imágenes no invasivas (por ejemplo, tomografía por emisión de positrones TEP). En un CAR biespecífico que incluye una molécula indicadora, el primer dominio de unión extracelular y el segundo dominio de unión extracelular pueden incluir una molécula indicadora diferente o la misma. En un linfocito T-CAR biespecífico, el primer CAR y el segundo CAR pueden expresar una molécula indicadora diferente o la misma. En otra realización, un CAR como se describe en el presente documento comprende además una molécula indicadora (por ejemplo, higromicina fosfotransferasa (hph)) de la que pueden obtenerse imágenes sola o en combinación con un sustrato o una sustancia química (por ejemplo, 9-[4-[<18>F]fluoro-3-(hidroximetil)butil]guanina ([<18>F]FHBG)). En otra realización, un CAR como se describe en el presente documento comprende además nanopartículas de las que pueden obtenerse imágenes fácilmente usando técnicas no invasivas (por ejemplo, nanopartículas de oro (GNP) funcionalizadas con<64>Cu<2+>). El marcado de linfocitos T-CAR para la obtención de imágenes no invasivas se revisa, por ejemplo, en Bhatnagar et al., Integr. Biol. (Camb).

[0195] 5(1):231-238, 2013, y Keu et al., Sci. Transl. Med.18; 9(373), 2017.

[0196] En el presente documento se demuestran GFP y mCherry como marcadores fluorescentes útiles para la obtención de imágenes de un CAR expresado en un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T-CAR). Se espera que, en esencia, cualquier proteína fluorescente conocida en la técnica pueda usarse como marcador fluorescente para este fin. Para aplicaciones clínicas, no es necesario que el CAR incluya un marcador fluorescente o una proteína fluorescente. En cada caso de las construcciones particulares descritas en el presente documento, por lo tanto, cualquier marcador presente en las construcciones puede eliminarse. La invención incluye las construcciones con o sin los marcadores. En consecuencia, cuando se hace referencia a una construcción específica en el presente documento, puede considerarse como incluida en la invención, con o sin marcadores o etiquetas (incluidas, por ejemplo, las etiquetas de histidina).

[0197] En una realización, la secuencia del polipéptido CAR corresponde a, comprende o comprende una secuencia con una identidad de secuencia al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o superior a la de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1, 7 o 13, o la combinación de SEQ ID NO: 21-24, 27-30, 36-39, 45-48, 57-60 o 65-68. Como pueden determinar los expertos en la materia, los diversos componentes funcionalmente similares o equivalentes de estos CAR pueden intercambiarse o sustituirse entre sí, así como por otros componentes similares o funcionalmente equivalentes conocidos en la técnica o enumerados en el presente documento.

[0198] Anticuerpos y moléculas relacionadas administradas por linfocitos T-CAR

[0199] Como se ha señalado anteriormente, los linfocitos T-CAR de la invención pueden usarse opcionalmente para administrar reactivos de anticuerpos (u otras moléculas terapéuticas, por ejemplo, citocinas) a tumores, como al microambiente tumoral. En diversas realizaciones, los reactivos de anticuerpos están codificados por la misma molécula de ácido nucleico que el CAR, facilitando así la transducción de células (por ejemplo, linfocitos T) para que expresen tanto un CAR como un reactivo de anticuerpo. En dichos ejemplos, el reactivo de anticuerpo puede expresarse, por ejemplo, de tal manera que esté separado del CAR (y opcionalmente de otras proteínas, por ejemplo, marcadores) por secuencias conectoras escindibles (por ejemplo, un conector 2A, como, por ejemplo, P2A o T2A; véase más arriba). El reactivo de anticuerpo puede expresarse bajo el control del mismo promotor que el CAR (por ejemplo, mediante un promotor EF1α), y puede expresarse de forma constitutiva. En otros ejemplos, el reactivo de anticuerpo se expresa bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, un promotor que se expresa tras la activación de los linfocitos T (por ejemplo, un promotor NFAT). Dicho promotor inducible puede usarse, por ejemplo, para garantizar que el anticuerpo se exprese únicamente tras la activación de los linfocitos T y, por lo tanto, solo, por ejemplo, cuando el linfocito T-CAR se encuentre dentro del microambiente tumoral, lugar en el que puede ser ventajoso limitar la producción de anticuerpos. Como es conocido en la técnica, las secuencias codificantes del CAR pueden situarse en 5' o en 3' respecto a las secuencias codificantes del reactivo de anticuerpo en diversos diseños de vectores dentro de la invención.

[0200] En diversos ejemplos, los anticuerpos expresados dentro de un linfocito T-CAR (por ejemplo, a partir de la misma molécula de ácido nucleico que el CAR) son anticuerpos de cadena única o anticuerpos de dominio único como se describe en el presente documento (scFV o camélidos). En el caso de los anticuerpos de cadena única, las cadenas pueden estar en el orden L-H o H-L, y opcionalmente pueden estar separadas entre sí por un conector (por ejemplo, un conector basado en glicina).

[0201] En diversos ejemplos, los anticuerpos son anticuerpos biespecíficos, incluyendo, por ejemplo, activadores de linfocitos T biespecíficos (BiTEs). Dichas moléculas pueden dirigirse a los linfocitos T (por ejemplo, mediante la unión a CD3), así como a un antígeno tumoral (por ejemplo, EGFR, EGFRvIII o CD19; véase también más arriba), y pueden usarse para potenciar la respuesta de los linfocitos T, por ejemplo, en el microambiente tumoral. Los dos componentes de un BiTE pueden estar opcionalmente separados entre sí por un conector (por ejemplo, un conector basado en glicina).

[0202] Los reactivos de anticuerpos pueden dirigirse contra, por ejemplo, antígenos tumorales o antígenos Treg, como los descritos en el presente documento, u otros antígenos (por ejemplo, EGFR, EGFRvIII, CD19, CTLA4, CD25, GARP, LAP, IL-15, IL13Ra2, CSF1R, etc.)

[0203] Además de administrar opcionalmente reactivos de anticuerpos, como se describe en el presente documento, los linfocitos T-CAR de la invención pueden usarse para administrar otras moléculas terapéuticas, incluyendo, por ejemplo, citocinas y toxinas.

[0204] Otros componentes de los CAR y construcciones relacionadas (o variantes de los mismos), como se describe en el presente documento, tales como Igκ (por ejemplo, SEQ ID NO: 32, 41, 50, 54, 62, o variantes de las mismas), el conductor CD8 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 14, 20, o variantes de los mismos) y secuencias relacionadas, pueden seleccionarse para su uso en la elaboración de construcciones de la invención, como resultará evidente para un experto en la materia.

[0205] Células y terapia

[0207] Un aspecto de la tecnología descrita en el presente documento se refiere a un linfocito T que comprende cualquiera de los polipéptidos CAR descritos en el presente documento (opcionalmente junto con otra molécula terapéutica, por ejemplo, un reactivo de anticuerpo (por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de camélido o un BiTE) o una citocina); o un ácido nucleico que codifique cualquiera de los polipéptidos CAR descritos en el presente documento (opcionalmente junto con otra molécula terapéutica, por ejemplo, un reactivo de anticuerpo (por ejemplo, un scFv, un anticuerpo de camélido o una citocina). En una realización, el linfocito T comprende un anticuerpo, un reactivo de anticuerpo, una parte de unión al antígeno del mismo, cualquiera de los CAR descritos en el presente documento, o una citocina, o un ácido nucleico que codifique dicho anticuerpo, reactivo de anticuerpo, parte de unión al antígeno, cualquiera de los CAR descritos en el presente documento o una citocina. El linfocito T o el tejido pueden ser de origen humano, de primate, de hámster, de conejo, de roedor, de vaca, de cerdo, de oveja, de caballo, de cabra, de perro o de gato, pero puede usarse cualquier otra célula de mamífero. En una realización preferida de cualquier aspecto, el linfocito T es humano.

[0209] Como también se describe en el presente documento, la célula es una célula inmunitaria. Como se usa en el presente documento, "célula inmunitaria" se refiere a una célula que desempeña un papel en la respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias son de origen hematopoyético e incluyen linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos T; linfocitos citolíticos naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos. También se describe en el presente documento que la célula es un linfocito T; una célula NK; una célula NKT; linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos T; y células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.

[0211] En una realización, el linfocito T se obtiene de un individuo que padece o ha sido diagnosticado con cáncer, un trastorno de células plasmáticas o una enfermedad autoinmune.

[0213] "Cáncer", como se usa en el presente documento, puede referirse a una hiperproliferación de células cuya característica única, la pérdida del control celular normal, da lugar a un crecimiento desregulado, falta de diferenciación, invasión de tejido local y metástasis, y puede ser glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple o un tumor sólido. Los ejemplos no limitativos de leucemia incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (LLC). En una realización, el cáncer es LLA o LLC. Los ejemplos no limitativos de linfoma se incluyen linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma linfocítico pequeño (LLP), linfoma de células del manto (LCM), linfomas de la zona marginal, linfoma de Burkitt, leucemia de células peludas (LCP) y linfoma de linfocitos T (por ejemplo, linfoma periférico de linfocitos T (LPLT), incluyendo linfoma cutáneo de linfocitos T (LCLT) y linfoma anaplásico de células grandes (LACG). En una realización, el cáncer es LDLBG o linfoma folicular. Los ejemplos no limitativos de tumores sólidos se incluyen tumor adrenocortical, sarcoma alveolar de partes blandas, carcinoma, condrosarcoma, carcinoma colorrectal, tumores desmoides, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, tumores endocrinos, tumor del seno endodérmico, hemangioendotelioma epitelioide, sarcoma de Ewing, tumores de células germinales (tumor sólido), tumor de células gigantes de hueso y tejido blando, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, melanoma, nefroma, neuroblastoma, sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcomatoso (NRSTS), osteosarcoma, sarcoma paraespinal, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial y tumor de Wilms. Los tumores sólidos pueden encontrarse en huesos, músculos u órganos, y pueden ser sarcomas o carcinomas. Se contempla que cualquier aspecto de la tecnología descrita en el presente documento pueda usarse para tratar todo tipo de cánceres, incluidos los cánceres no enumerados en la presente solicitud. Como como se usa en el presente documento, el término "tumor" se refiere a un crecimiento anormal de células o tejidos, por ejemplo, de tipo maligno o de tipo benigno.

[0215] Como se usa en el presente documento, una "enfermedad o trastorno autoinmunitario" se caracteriza por la incapacidad del sistema inmunitario de distinguir entre una célula extraña y una célula sana. Esto da lugar a que el sistema inmunitario ataque a las células sanas de la persona para provocar su muerte celular programada. Los ejemplos no limitativos de una enfermedad o trastorno autoinmunitario incluyen artritis inflamatoria, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades inflamatorias intestinales, LES y vasculitis, inflamación alérgica, como el asma alérgica, la dermatitis atópica y la hipersensibilidad de contacto. Otros ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con la autoinmunidad, pero no debe interpretarse que están limitados a ellos, incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Graves (hiperactividad tiroidea), tiroiditis de Hashimoto (hipoactividad tiroidea), enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, síndrome de Guillain-Barré, esclerosis biliar primaria/cirrosis, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, fenómeno de Raynaud, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, polimialgia reumática, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, síndrome de fatiga crónica (SFC), psoriasis, enfermedad de Addison autoinmune, espondilitis anquilosante, encefalomielitis aguda diseminada, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia aplásica, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave, síndrome de opsoclono-mioclono, neuritis óptica, tiroiditis de Ord, pénfigo, anemia perniciosa, poliartritis en perros, síndrome de Reiter, arteritis de Takayasu, anemia hemolítica autoinmunitaria por anticuerpos calientes, granulomatosis de Wegener y fibromialgia (FM).

[0216] En una realización, el linfocito T se obtiene de un paciente que padece un trastorno del sistema inmunitario que da lugar a una actividad anormalmente baja del sistema inmunitario, o trastornos de inmunodeficiencia, lo que dificulta la capacidad de combatir un agente extraño (por ejemplo, un virus o una célula bacteriana).

[0217] Una célula plasmática es un glóbulo blanco producido a partir de linfocitos B cuya función es generar y liberar los anticuerpos necesarios para combatir las infecciones. Como se usa en el presente documento, un "trastorno o enfermedad de las células plasmáticas" se caracteriza por la multiplicación anómala de una célula plasmática. Las células plasmáticas anómalas son capaces de "desplazar" a las células plasmáticas sanas, lo que da lugar a una disminución de la capacidad para combatir un objeto extraño, como un virus o una célula bacteriana. Los ejemplos no limitativos de trastornos de células plasmáticas incluyen amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenström, mieloma osteosclerótico (síndrome POEMS), gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS) y mieloma de células plasmáticas.

[0218] Los linfocitos T pueden obtenerse de un sujeto usando técnicas estándar conocidas en el campo. Por ejemplo, los linfocitos T pueden aislarse de la sangre periférica extraída de un donante o paciente. Los linfocitos T pueden aislarse de un mamífero. Preferiblemente, los linfocitos T se aíslan de un ser humano.

[0219] Una célula, por ejemplo un linfocito T, puede manipularse para que comprenda cualquiera de los polipéptidos CAR descritos en el presente documento (incluidos los polipéptidos CAR que están unidos de forma escindible a reactivos de anticuerpos, como se describe en el presente documento); o un ácido nucleico que codifique cualquiera de los polipéptidos CAR (y también un reactivo de anticuerpo codificado genéticamente) descritos en el presente documento. En una realización, cualquiera de los polipéptidos CAR (junto con un reactivo de anticuerpo como se describe en el presente documento) descritos en el presente documento se expresan a partir de un vector lentivírico. El vector lentivírico se usa para expresar el polipéptido CAR (y también el reactivo de anticuerpo) en una célula usando técnicas estándar de infección.

[0220] Los retrovirus, como los lentivirus, proporcionan una plataforma conveniente para la administración de secuencias de ácido nucleico que codifican un gen o un gen quimérico de interés. Una secuencia de ácido nucleico seleccionada puede insertarse en un vector y encapsidarse en partículas retrovíricas usando técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a las células, por ejemplo,in vitrooex vivo.Los sistemas retrovíricos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.º 5.219.740; Kurth y Bannert (2010) "Retroviruses: Molecular Biology, Genomics and Pathogenesis", Calster Academic Press (ISBN: 978-1-90455-55-4); y Hu et al., Pharmacological Reviews 52:493-512, 2000. El sistema lentivírico para la administración eficiente de ADN puede adquirirse en OriGene; Rockville, MD. En realizaciones alternativas, el polipéptido CAR (y el reactivo de anticuerpo) de cualquiera de los CAR descritos en el presente documento se expresan en el linfocito T mediante transfección o electroporación de un vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica el CAR. Los métodos de transfección o electroporación son conocidos en la técnica.

[0221] La expresión eficaz del polipéptido CAR (y, opcionalmente, del reactivo de anticuerpo o la citocina) de cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento puede evaluarse usando ensayos estándar que detectan el ARNm, el ADN o el producto génico del ácido nucleico que codifica el CAR (y el reactivo de anticuerpo o la citocina opcionales). Por ejemplo, RT-PCR, FACS, transferencia Northern, transferencia Western, ELISA o inmunohistoquímica.

[0222] En una realización, el polipéptido CAR (y el reactivo de anticuerpo) descrito en el presente documento se expresa de forma constitutiva. También se describe en el presente documento que el polipéptido CAR se expresa de forma constitutiva y que el reactivo de anticuerpo o la citocina opcionales se expresan de forma inducible. En una realización, el polipéptido CAR (y el reactivo de anticuerpo) descrito en el presente documento está codificado por una secuencia de ácido nucleico recombinante.

[0223] Un aspecto de la tecnología descrita en el presente documento se refiere a un linfocito T manipulado para su uso en un método de tratamiento del cáncer, un trastorno de células plasmáticas o una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método: manipular un linfocito T para que comprenda cualquiera de los polipéptidos CAR (y los reactivos de anticuerpos o citocinas opcionales) descritos en el presente documento en la superficie del linfocito T; y la administración del linfocito T manipulado al sujeto. En el caso del cáncer, el método puede estar destinado al tratamiento de un cáncer diagnosticado, a la prevención de la recurrencia del cáncer o para su uso en un contexto adyuvante o neoadyuvante.

[0224] Un aspecto de la tecnología descrita en el presente documento se refiere a los linfocitos T que comprenden cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos) descritos en el presente documento para su uso en un método de tratamiento del cáncer, un trastorno de las células plasmáticas o una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método: la administración de la célula de cualquiera de los linfocitos T que comprenden cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos) descritos en el presente documento.

[0225] Las moléculas de diferenciación de clúster (CD) son marcadores de superficie celular presentes en los leucocitos. A medida que un leucocito se diferencia y madura, su perfil CD cambia. En el caso de que un leucocito se convierta en una célula cancerosa (es decir, un linfoma), su perfil CD es importante para diagnosticar la enfermedad. El tratamiento y el pronóstico de ciertos tipos de cánceres dependen de la determinación del perfil CD de la célula cancerosa. "CDX+", en donde "X" es un marcador CD, indica que el marcador CD está presente en la célula cancerosa, mientras que "CDX-" indica que el marcador no está presente. Un experto en la materia será capaz de evaluar las moléculas CD presentes en una célula cancerosa usando técnicas estándar, por ejemplo, usando inmunofluorescencia para detectar anticuerpos disponibles comercialmente unidos a las moléculas CD.

[0227] En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos, el linfocito T-CAR manipulado se estimula y/o activa antes de su administración al sujeto.

[0229] Administración

[0231] En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se refieren a un linfocito T que comprende cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos) descritos en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos) descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de un sujeto que padezca o haya sido diagnosticado con cáncer, una enfermedad o trastorno de células plasmáticas, o una enfermedad o trastorno autoinmunitaria. Como se usa en el presente documento, "linfocitos T-CAR como se describen en el presente documento" se refiere a una célula de mamífero que comprende cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos o citocinas opcionales) descritos en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos CAR (y reactivos de anticuerpos o citocinas opcionales) descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una "afección" se refiere a un cáncer, una enfermedad o trastorno de células plasmáticas, o una enfermedad o trastorno autoinmunitario. Los sujetos que padecen una afección pueden ser identificados por un médico usando los métodos actuales de diagnóstico de la afección. Los síntomas y/o complicaciones de la afección, que caracterizan estas afecciones y ayudan en el diagnóstico, son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, fatiga, infecciones persistentes y hemorragias persistentes. Las pruebas que pueden ayudar en el diagnóstico de, por ejemplo, la afección, entre otras, análisis de sangre y pruebas de médula ósea, y son conocidas en la técnica para una afección determinada. Los antecedentes familiares de una afección, o la exposición a factores de riesgo de una afección, también pueden ayudar a determinar si es probable que un sujeto padezca la afección o a realizar un diagnóstico de la afección.

[0233] Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto que padezca o haya sido diagnosticado con una afección. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden la administración de una cantidad eficaz de linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento a un sujeto con el fin de aliviar un síntoma de la afección. Como se usa en el presente documento, "aliviar un síntoma de la afección" es mejorar cualquier afección o síntoma asociado a la afección. En comparación con un control equivalente no tratado, dicha reducción es de al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más, como se mide mediante cualquier técnica estándar. Los expertos en la materia conocen diversos medios para administrar las composiciones descritas en el presente documento a los sujetos. En una realización, las composiciones descritas en el presente documento se administran de forma sistémica o local. En una realización preferida, las composiciones descritas en el presente documento se administran por vía intravenosa. En otra realización, las composiciones descritas en el presente documento se administran en el lugar del tumor.

[0235] El término "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de linfocitos T-CAR activados necesaria para aliviar al menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se refiere a una cantidad suficiente del preparado o composición celular para proporcionar el efecto deseado. Por lo tanto, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de linfocitos T-CAR activados que es suficiente para proporcionar un efecto contra la afección cuando se administra a un sujeto típico. Una cantidad eficaz, como se usa en el presente documento, en diversos contextos, también incluiría una cantidad suficiente para retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de la enfermedad (por ejemplo, entre otros, ralentizar la progresión de una afección) o revertir un síntoma de la afección. Por lo tanto, no suele ser factible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso concreto, un experto en la materia puede determinar una "cantidad eficaz" adecuada usando únicamente experimentos rutinarios.

[0237] Las cantidades eficaces, la toxicidad y la eficacia terapéutica pueden evaluarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación. La dosis puede variar en función de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren las composiciones y métodos que presentan índices terapéuticos elevados. Una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Asimismo, puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración de linfocitos T-CAR activados que alcanza una inhibición al 50 % de los síntomas), como se determina en un cultivo celular o en un modelo animal adecuado. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis concreta pueden monitorizarse mediante un bioensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo para el análisis de la médula ósea, entre otros. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento.

[0238] En un aspecto de la tecnología, la tecnología descrita en el presente documento se refiere a una composición farmacéutica que comprende linfocitos T-CAR activados como se describen en el presente documento y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable. Los principios activos de la composición farmacéutica comprenden, como mínimo, linfocitos T-CAR activados, como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, los principios activos de la composición farmacéutica consisten esencialmente en linfocitos T-CAR activados, como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, los principios activos de la composición farmacéutica consisten en linfocitos T-CAR activados, como se describen en el presente documento. Los excipientes farmacéuticamente aceptables para la formulación terapéutica basada en células incluyen soluciones salinas y tampones acuosos, disolución de Ringer y componentes del suero, tales como albúmina sérica, HDL y LDL. Términos como "excipiente", "portador", "portador farmacéuticamente aceptable" o similares se usan indistintamente en el presente documento.

[0239] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende linfocitos T-CAR activados como se describe en el presente documento puede ser una forma farmacéutica parenteral. Dado que la administración de formas farmacéuticas parenterales suele eludir las defensas naturales del paciente contra los contaminantes, los componentes distintos de los propios linfocitos T-CAR son preferiblemente estériles o susceptibles de ser esterilizados antes de su administración a un paciente. Los ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen, pero no se limitan a, disoluciones listas para inyección, productos secos listos para disolverse o suspenderse en un vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección, suspensiones listas para inyección, y emulsiones. Cualquiera de estos puede añadirse al preparado de linfocitos T-CAR activados antes de la administración. Los vehículos adecuados que pueden usarse para proporcionar formas farmacéuticas parenterales de linfocitos T-CAR activados, como se divulga en la presente, son bien conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, sin limitación: solución salina; disolución de glucosa; vehículos acuosos que incluyen, entre otros, cloruro de sodio inyectable, disolución de Ringer inyectable, dextrosa inyectable, mezcla de dextrosa y cloruro de sodio inyectables, y disolución de Ringer lactato inyectable; vehículos miscibles en agua tales como, entre otros, alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol; y vehículos no acuosos tales como, entre otros, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.

[0240] Dosis

[0241] La expresión "forma farmacéutica unitaria", como se usa el término en el presente documento, se refiere a una dosis adecuada para una sola administración. A modo de ejemplo, una forma farmacéutica unitaria puede ser una cantidad de fármaco dispuesta en un dispositivo de administración, por ejemplo, una jeringa o una bolsa de goteo intravenoso. En una realización, una forma farmacéutica unitaria se administra en una sola administración. En otra realización, se pueden administrarse simultáneamente más de una forma farmacéutica unitaria.

[0242] En algunas realizaciones, los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento se administran como monoterapia, es decir, no se administra simultáneamente al sujeto ningún otro tratamiento para la afección. Una composición farmacéutica que comprenda los linfocitos T descritos en el presente documento puede administrarse generalmente en una dosis de 10<4>a 10<9>células/kg de peso corporal, en algunos casos de 10<5>a 10<6>células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Si es necesario, las composiciones de linfocitos T también pueden administrarse varias veces en estas dosis. Las células se pueden administrar usando técnicas de infusión que son comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. Med.319:1676, 1988).

[0243] En ciertos aspectos, puede ser conveniente administrar linfocitos T-CAR activados a un sujeto y, posteriormente, volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar los linfocitos T a partir de ella como se describe en el presente documento, y reinfundir al paciente estos linfocitos T activados y expandidos. Este proceso se puede llevar a cabo múltiples veces a las pocas semanas. En ciertos aspectos, los linfocitos T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de desde 10 cm<3>hasta 400 cm<3>. En ciertos aspectos, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cm<3>, 30 cm<3>, 40 cm<3>, 50 cm<3>, 60 cm<3>, 70 cm<3>, 80 cm<3>, 90 cm<3>o 100 cm<3>.

[0244] Los modos de administración pueden incluir, por ejemplo, la inyección o infusión intravenosa (i.v.). Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía transarterial, intratumoral, intranodal o intramedular. En algunas realizaciones, las composiciones de linfocitos T pueden inyectarse directamente en un tumor, un ganglio linfático o un lugar de infección. En una realización, las composiciones descritas en el presente documento se administran en una cavidad corporal o en un líquido corporal (por ejemplo, ascitis, líquido pleural, líquido peritoneal o líquido cefalorraquídeo).

[0245] En un aspecto ejemplar particular, los sujetos pueden someterse a una leucoaféresis, en donde se recogen, enriquecen o eliminan los leucocitosex vivopara seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, los linfocitos T. Estos aislados de linfocitos T pueden expandirse mediante contacto con una APC artificial, por ejemplo, una aAPC que exprese CDR anti-CD28 y anti-CD3, y tratarse de tal manera que se puedan introducir una o más construcciones CAR de la tecnología, creando así un linfocito T-CAR. Los sujetos que lo necesiten pueden someterse posteriormente a un tratamiento estándar con quimioterapia de alta dosis seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. Tras el trasplante, o de forma simultánea a este, los sujetos pueden recibir una infusión de los linfocitos T-CAR expandidos. En una realización, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

[0246] En algunas realizaciones, se lleva a cabo una linfodepleción en un paciente antes de administrar uno o más linfocitos T-CAR como se describe en el presente documento. En dichas realizaciones, la linfodepleción puede comprender la administración de uno o más de melfalán, Cytoxan, ciclofosfamida y fludarabina.

[0247] La dosis de los tratamientos anteriores que se administrarán a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de dosis para administración humana se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica.

[0248] En algunas realizaciones, se requiere un único régimen de tratamiento. En otras, puede realizarse la administración de una o más dosis o regímenes de tratamiento posteriores. Por ejemplo, tras un tratamiento quincenal durante tres meses, el tratamiento puede repetirse una vez al mes, durante seis meses, un año o más. En algunas realizaciones, no se administran tratamientos adicionales tras el tratamiento inicial.

[0249] La dosis de una composición como se describe en el presente documento puede ser determinada por un médico y ajustada, según sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. En cuanto a la duración y la frecuencia del tratamiento, es habitual que los médicos expertos realicen un seguimiento de los sujetos para determinar cuándo el tratamiento está proporcionando un beneficio terapéutico, y para determinar si se deben administrar más células, interrumpir el tratamiento, reanudarlo o realizar otras modificaciones en el régimen de tratamiento. La dosis no debe ser tan elevada como para causar efectos secundarios adversos, como el síndrome de liberación de citocinas. Generalmente, la dosis variará en función de la edad, el estado y el sexo del paciente, y puede ser determinada por un experto en la materia. El médico individual también puede ajustar la dosis en caso de cualquier complicación.

[0250] Terapia de combinación

[0251] Los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento pueden usarse opcionalmente en combinación entre sí y con otros agentes y terapias conocidos, según lo consideren oportuno los expertos en la materia. En un ejemplo, pueden administrarse en combinación dos o más linfocitos T-CAR dirigidos contra diferentes marcadores de Treg (por ejemplo, GARP, LAP, etc.). En otro ejemplo, se administran en combinación dos o más linfocitos T-CAR dirigidos contra diferentes antígenos tumorales. En otro ejemplo, se administran en combinación uno o más linfocitos T-CAR dirigidos contra un marcador Treg (por ejemplo, GARP, LAP, etc.) y uno o más linfocitos T-CAR dirigidos contra uno o más antígenos tumorales.

[0252] Administrado "en combinación", como se usa en el presente documento, significa que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el transcurso de la afección del sujeto por el trastorno; por ejemplo, los dos o más tratamientos se administran después de que al sujeto se le haya diagnosticado el trastorno y antes de que el trastorno se haya curado o eliminado o de que el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, la administración de un tratamiento está todavía ocurriendo cuando empieza la administración del segundo, de manera que existe un solapamiento en términos de administración. Esto se denomina algunas veces en el presente documento administración "simultánea" o "concurrente". En otras realizaciones, la administración de un tratamiento termina antes de que empiece la administración del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquier caso, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas a un mayor grado, del que se observaría si el segundo tratamiento fuera administrado en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se observa con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, la administración es tal que la reducción en un síntoma, u otro parámetro relacionado con el trastorno, es mayor que lo que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, completamente aditivo, o superior a aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado sea todavía detectable cuando se suministra el segundo. Los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento y el al menos un agente terapéutico adicional pueden administrarse simultáneamente, en la misma composición o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula expresora de CAR descrita en el presente documento puede administrarse primero, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o bien puede invertirse el orden de administración. La terapia T-CAR y/u otros agentes terapéuticos, procedimientos o modalidades pueden administrarse durante periodos de trastorno activo, o durante un periodo de remisión o de enfermedad menos activa. La terapia T-CAR puede administrarse antes de otro tratamiento, conjuntamente con el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión del trastorno.

[0254] Cuando se administran en combinación, los linfocitos T-CAR activados y el agente adicional (por ejemplo, un segundo o tercer agente), o todos, pueden administrarse en una cantidad o dosis que sea mayor, menor o igual a la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En ciertas realizaciones, la cantidad o dosis administrada de los linfocitos T-CAR activados, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, es menor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 %) que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente. En otras realizaciones, la cantidad o dosis de los linfocitos T-CAR activados, el agente adicional (por ejemplo, segundo o tercer agente), o todos, que da lugar a un efecto deseado (por ejemplo, tratamiento del cáncer) es menor (por ejemplo, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 % menor) que la cantidad o dosis de cada agente requerida individualmente para lograr el mismo efecto terapéutico. En otras realizaciones, los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento pueden usarse en un régimen de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radioterapia, un inhibidor de la vía mTOR, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citotoxina, fludarabina, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas o una vacuna peptídica, como la descrita en Izumoto et al., J. Neurosurg.108:963- 971, 2008.

[0256] En una realización, los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento pueden usarse en combinación con un inhibidor del punto de control. Los inhibidores del punto de control ejemplares incluyen inhibidores anti-PD-1 (nivolumab, MK-3475, pembrolizumab, pidilizumab, AMP-224, AMP-514), inhibidores anti-CTLA4 (ipilimumab y tremelimumab), inhibidores anti-PDL1 (atezolizumab, avelomab, MSB0010718C, MEDI4736 y MPDL3280A) e inhibidores anti-TIM3.

[0258] En una realización, los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento pueden usarse en combinación con un agente antineoplásico. Los agentes antineoplásicos ejemplares incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)), un alcaloide de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), un anticuerpo contra células inmunitarias (por ejemplo, alemtuzumab, gemtuzumab, rituximab, tositumomab), un antimetabolito (incluidos, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de la pirimidina, análogos de la purina e inhibidores de la adenosina desaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con el TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador como la talidomida o un derivado de la talidomida (por ejemplo, lenalidomida). Los agentes antineoplásicos generales que se consideran para su uso en terapias de combinación incluyen anastrozol (Arimidex<®>), bicalutamida (Casodex<®>), sulfato de bleomicina (Blenoxane<®>), busulfán (Myleran<®>), busulfán inyectable (Busulfex<®>), capecitabina (Xeloda<®>), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin<®>), carmustina (BiCNU<®>), clorambucilo (Leukeran<®>), cisplatino (Platinol<®>), cladribina (Leustatin<®>), ciclofosfamida (Cytoxan<®>o Neosar<®>), citarabina, citosina arabinosida (Cytosar-U<®>), citarabina liposomal inyectable (DepoCyt<®>), dacarbazina (DTIC-Dome<®>), dactinomicina (actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine<®>), citrato de daunorrubicina liposomal inyectable (DaunoXome<®>), dexametasona, docetaxel (Taxotere<®>), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin<®>, Rubex<®>), etopósido (Vepesid<®>), fosfato de fludarabina (Fludara<®>), 5-fluorouracilo (Adrucil<®>, Efudex<®>), flutamida (Eulexin<®>), tezacitibina, gemcitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea<®>), idarubicina (Idamycin<®>), ifosfamida (IFEX<®>), irinotecán (Camptosar<®>), L-asparaginasa (ELSPAR<®>), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran<®>), 6-mercaptopurina (Purinethol<®>), metotrexato (Folex<®>), mitoxantrona (Novantrone<®>), mylotarg, paclitaxel (Taxol<®>), phoenix (Itrio 90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel<®>), citrato de tamoxifeno (Nolvadex<®>), teniposida (Vumon<®>), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone<®>), clorhidrato de topotecán inyectable (Hycamptin<®>), vinblastina (Velban<®>), vincristina (Oncovin<®>) y vinorelbina (Navelbine<®>). Los agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos: mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard<®>Chlorethaminacil<®>, Demethyldopan<®>, Desmethyldopan<®>, Haemanthamine<®>, Nordopan<®>, Uracil nitrogen mustard<®>, Uracillost<®>, Uracilmostaza<®>, Uramustin<®>, Uramustine<®>), clormetina (Mustargen<®>), ciclofosfamida (Cytoxan<®>, Neosar<®>, Clafen<®>, Endoxan<®>, Procytox<®>, Revimmune™), ifosfamida (Mitoxana<®>), melfalán (Alkeran<®>), clorambucilo (Leukeran<®>), pipobroman (Amedel<®>, Vercyte<®>), trietilenmelamina (Hemel<®>, Hexalen<®>, Hexastat<®>), trietilentiofosforamina, temozolomida (Temodar<®>), tiotepa (Thioplex<®>), busulfán (Busilvex<®>, Myleran<®>), carmustina (BiCNU<®>), lomustina (CeeNU<®>), estreptozocina (Zanosar<®>) y dacarbazina (DTIC-Dome<®>). Agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, oxaliplatino (Eloxatin<®>); temozolomida (Temodar<®>y Temodal<®>); dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen<®>); melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolisina y mostaza de fenilalanina, Alkeran<®>); altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen<®>); carmustina (BiCNU<®>); bendamustina (Treanda<®>); busulfán (Busulfex<®>y Myleran<®>); carboplatino (Paraplatin<®>); lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU<®>); cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol<®>y Platinol<®>-AQ); clorambucilo (Leukeran<®>); ciclofosfamida (Cytoxan<®>y Neosar<®>); dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC e imidazolcarboxamida, DTIC-Dome<®>); altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen<®>); ifosfamida (Ifex<®>); prednumustina; procarbazina (Matulane<®>); mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, mustina y clorhidrato de mecloroetamina, Mustargen<®>); estreptozocina (Zanosar<®>); tiotepa (también conocida como tiofosfamida, TESPA y TSPA, Thioplex<®>); ciclofosfamida (Endoxan<®>, Cytoxan<®>, Neosar<®>, Procytox<®>, Revimmune<®>); y HCl de bendamustina (Treanda<®>). Los inhibidores de mTor ejemplares incluyen, por ejemplo, temsirolimus; ridaforolimus (anteriormente conocido como deferolimus, (1R,2R,45)-4-[(2R)-2

[0259] [(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04'9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en la publicación PCT n.º WO 03/064383); everolimus (Afinitor<®>o RADOOI); rapamicina (AY22989, Sirolimus<®>); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d] pirimidin-7-il)-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]-pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopirano-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina, sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1) y XL765. Los inmunomoduladores ejemplares incluyen, por ejemplo, afutuzumab (disponible a través de Roche<®>); pegfilgrastim (Neulasta<®>); lenalidomida (CC-5013, Revlimid<®>); talidomida (Thalomid<®>), actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citocinas humanas que incluyen interleucina 1, interleucina 2 e interferón γ, CAS 951209-71-5, disponible de IRX Therapeutics). Las antraciclinas ejemplares incluyen, por ejemplo, la doxorrubicina (Adriamycin<®>y Rubex<®>); bleomicina (Ienoxane<®>); daunorrubicina (clorhidrato de daunorrubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine<®>); daunorrubicina liposomal (liposoma de citrato de daunorrubicina, DaunoXome<®>); mitoxantrona (DHAD, Novantrone<®>); epirubicina (Ellence™); idarubicina (Idamycin<®>, Idamycin PFS<®>); mitomicina C (Mutamycin<®>); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina. Los alcaloides de la vinca ejemplares incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine<®>), vincristina (Oncovin<®>) y vindesina (Eldisine<®>); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ<®>y Velban<®>); y vinorelbina (Navelbine<®>). Los inhibidores del proteasoma ejemplares incluyen bortezomib (Velcade<®>); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-metil-N-((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)-pentanamida); marizomib (NPT0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); y O-metil-N-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

[0261] Un experto en la materia puede identificar fácilmente un agente quimioterapéutico de uso (por ejemplo, véase Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning; Principles of Cancer Therapy, capítulo 85 de Harrison's Principles of Internal Medicine, 18.ª edición; Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, capítulos 28-29 de Abeloff's Clinical Oncology, 2013, Elsevier; y Fischer D. S. (ed.): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4.ª ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003).

[0263] En una realización, los linfocitos T-CAR activados descritos en el presente documento para su uso en el tratamiento de un sujeto en combinación con una molécula que reduce el nivel y/o la actividad de una molécula dirigida contra GITR y/o que modula las funciones de GITR, una molécula que reduce la población de linfocitos Treg, un inhibidor de mTOR, un agonista de GITR, un inhibidor de la cinasa, un inhibidor de la tirosina cinasa no receptora, un inhibidor de CDK4 y/o un inhibidor de BTK.

[0265] Eficacia

[0267] La eficacia de los linfocitos T-CAR activados en, por ejemplo, el tratamiento de una afección descrita en el presente documento, o para inducir una respuesta como se describe en el presente documento (por ejemplo, una reducción de las células cancerosas) puede ser determinada por un médico experto. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz", como se usa el término en el presente documento, si uno o más de los signos o síntomas de una afección descrita en el presente documento se alteran de manera beneficiosa, si otros síntomas clínicamente aceptados mejoran o incluso se alivian, o si se induce una respuesta deseada, por ejemplo, en al menos un 10 % tras el tratamiento según los métodos descritos en el presente documento. La eficacia puede evaluarse, por ejemplo, midiendo un marcador, un indicador, síntoma y/o la incidencia de una afección tratada según los métodos descritos en el presente documento o cualquier otro parámetro medible apropiado. El tratamiento según los métodos descritos en el presente documento puede reducir los niveles de un marcador o síntoma de una afección, por ejemplo, en al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % o más.

[0269] La eficacia también puede medirse por la ausencia de empeoramiento del individuo, como se evalúa mediante hospitalización, o la necesidad de intervenciones médicas (es decir, se detiene la progresión de la enfermedad). Los métodos de medición de estos indicadores son conocidos por los expertos en la materia y/o se describen en el presente documento.

[0271] El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitativos incluyen a un ser humano o un animal) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo, prevenir el empeoramiento de los síntomas (por ejemplo, dolor o inflamación); o (2) aliviar la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, provocar la regresión de los síntomas. Una cantidad eficaz para el tratamiento de una enfermedad significa aquella cantidad que, cuando se administra a un sujeto que la necesita, es suficiente para dar lugar a un tratamiento eficaz, como se define dicho término en el presente documento, para esa enfermedad. La eficacia de un agente puede determinarse evaluando los indicadores físicos de una afección o la respuesta deseada. Un experto en la materia está perfectamente capacitado para monitorizar la eficacia de la administración y/o del tratamiento midiendo uno cualquiera de esos parámetros, o cualquier combinación de parámetros. La eficacia de un enfoque determinado puede evaluarse en modelos animales de una afección descrita en el presente documento. Cuando se usa un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se observa un cambio estadísticamente significativo en un marcador.

[0272] La tecnología descrita en el presente documento se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que en modo alguno deben interpretarse como una limitación adicional.

[0273] EJEMPLOS

[0274] Ejemplo 1. Linfocitos T-CAR dirigidos contra EGFRvIII

[0275] Los linfocitos T-CAR que tienen un grupo de unión al antígeno EGFRvIII (por ejemplo, linfocitos T-CAR-EGFRvIII) representan una terapia celular prometedora para dirigir específicamente células citolíticas al microambiente tumoral, en parte debido a que EGFRvIII se expresa específicamente en el tejido tumoral, mientras que generalmente está ausente en el tejido sano. En este ejemplo, los linfocitos T-CAR-EGFRvIII se probaronin vitroein vivoen dos modelos animales.

[0276] Los linfocitos T de productos de leucoaféresis obtenidos de donantes sanos anonimizados se estimularon con Dynabeads (Human T-Activator CD3/ CD28) en una relación de 3:1 entre perlas y células, y se cultivaron en medio RPMI 1640 completo. Diez días después de la estimulación y la transducción con lentivirus, las células se congelaron y se almacenaron para su uso en ensayos funcionales.

[0277] Se realizaron pruebas iniciales in vitro para caracterizar la capacidad de las células CAR-EGFRvIII de destruir preferentemente las células tumorales en comparación con las células de control no transducidas en un ensayo basado en luciferasa de veinte horas, mostrado en la Fig. 1. Se usó U87vlll, una línea celular de glioma humano, como células diana. La caracterización in vitro demuestra que los linfocitos T-CAR EGFRvIII median una citotoxicidad significativa y específica contra las células U87vlll (Fig.1).

[0278] Para los experimentos in vivo, se recogieron células tumorales U87vlll en fase de crecimiento logarítmico, se lavaron y se administraron a ratones por vía subcutánea en un modelo de xenoinjerto de glioblastoma humano (Fig. 2A y 2B) o por vía intracraneal en un modelo de glioma humano (Fig. 3A y 3B). Para las administraciones intracraneales, la aguja de una jeringa Hamilton de 50 microlitros se colocó usando un marco estereotáctico a 2 mm a la derecha del bregma y 4 mm por debajo de la superficie del cráneo, en la sutura coronal. Para el tratamiento, se infundió una sola vez a los ratones con linfocitos T-CAR (1 × 10<6>linfocitos T transducidos con CAR por ratón) a través de la vena de la cola.

[0279] El potente efecto antitumoral observado in vitro se reflejó en el modelo in vivo de xenoinjerto subcutáneo de glioblastoma humano (Fig. 2A y 2B). En este modelo, los tumores voluminosos ya establecidos (filas superiores) respondieron al T-CAR-EGFRvIII (Fig.2B), mientras que las células no transducidas no impidieron el crecimiento tumoral (Fig. 2A). En el modelo murino de glioma humano intracraneal, los linfocitos T-CAR contra EGFRvIII ralentizaron el crecimiento de los tumores y condujeron a una supervivencia prolongada (Fig.3B) en comparación con las células no transducidas (Fig. 3A). Aunque se inhibió el crecimiento tumoral, los efectos no fueron tan pronunciados como los observados contra los tumores subcutáneos.

[0280] Se observó la presencia de linfocitos T reguladores (Treg) en los tejidos tumorales de pacientes humanos tras el tratamiento con linfocitos T-CAR-EGFRvIII (Fig. 4A y 4B). Para determinar si los Treg que infiltran el cerebro desempeñan un papel funcional en la supresión de los linfocitos T-CAR-EGFRvIII, se realizó un ensayo de supresión de Treg in vitro en el que se incubaron linfocitos T-CAR-EGFRvIII (rojo) y células de glioma (verde) en presencia de Treg durante 18 horas. Los resultados se obtuvieron mediante análisis de células vivas con IncyCyte, como se muestra en las Fig. 5A-5C. Mientras que las células CAR no específicas permitieron la proliferación de las células de glioma (Fig.5A y 5D, línea superior), los linfocitos T-CAR-EGFRvIII destruyeron las células de glioma (Fig.5B y 5D, línea inferior). Sin embargo, la adición de Tregs en el cocultivo redujo significativamente la capacidad de los linfocitos T-CAR-EGFRvIII para destruir las células de glioma diana (Fig.5C y 5D, línea central).

[0281] Ejemplo 2. Diseño y caracterización de linfocitos T-CAR dirigidos contra antígenos asociados a TregLas Fig.6A-6C, 7A y 7B muestran los resultados de un experimento en el que se identificaron LAP y GARP como marcadores asociados a Treg en células de sangre periférica humana. En concreto, entre los Treg humanos que no se activaron ex vivo, aproximadamente un 27 % expresaba LAP, aproximadamente un 4 % era doblemente positivo para LAP y GARP (Fig. 6B). Una vez activados ex vivo usando anti-CD3, anti-CD8 e IL-2, aproximadamente un 30 % expresó LAP, y el número de Treg doblemente positivos para LAP/GARP aumentó al 12,3 % (Fig.6C).

[0283] A continuación, se diseñaron construcciones CAR que codifican CAR dirigidos contra LAP y GARP. En las Fig.8A-8D se muestran ilustraciones esquemáticas de estas construcciones. Las construcciones dirigidas contra Treg incluyen dos CAR dirigidos contra LAP (CAR-LAP-L-H (Fig. 8A) y CAR-LAP-H-L (Fig. 8B); en las que cada scFv anti-LAP presenta una inversión en la disposición de las cadenas pesadas (H) y ligeras (L)), una construcción CAR dirigida contra GARP (CAR-GARP; Fig.8C) y una construcción CAR dirigida contra EGFR que codifica además un anticuerpo de camélido anti-GARP (CAR-EGFR-GARP; Fig. 8D). Las eficiencias de transducción de cada construcción se evaluaron usando citometría de flujo, midiendo el porcentaje de células positivas para mCherry, y se proporcionan a continuación.

[0285] Eficiencias de transducción de las construcciones de CAR diri idos contra Tre

[0287]

[0290] Para probar los linfocitos T-CAR anti-LAP, se cocultivaron linfocitos T-CAR con Treg aislados y expandidos del mismo donante, transducidos para expresar GFP como marcador de Treg. Los Treg se activaron durante la noche con anti-CD3 y anti-CD28 (Fig. 9B) o se mantuvieron en reposo durante la noche (Fig. 9A) antes del ensayo de destrucción. Se sembraron 62.500 linfocitos Treg por pocillo. Se añadieron CAR en la relación indicada a los Treg. Los cultivos se incubaron durante tres días en presencia de 300 ml de IL-2. Se realizó citometría de flujo el día 3 recogiendo 30.000 eventos por pocillo. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como el porcentaje de reducción de células positivas para GFP en comparación con el cultivo de linfocitos T no transducidos con Treg. CART-LAP-H-L fue más eficaz en la destrucción de Treg no activados en comparación con CART-LAP-L-H. A continuación, se compararon los linfocitos T-CAR dirigidos contra LAP con los linfocitos T-CAR dirigidos contra GARP en un ensayo análogo de destrucción de Treg en dos donantes diferentes, con una proporción entre linfocitos T-CAR y Treg de 1:1 durante cuatro días (Fig. 10A y 10B). Las Fig. 11A y 11B caracterizan la destrucción de Treg no activados y activados por linfocitos T-CAR dirigidos contra LAP, en relación con los controles no transducidos, por el número de Treg diana que quedan al final de un cocultivo de tres días en función de la relación entre linfocitos T-CAR y linfocitos Treg. Las Fig.11C y 11D muestran datos análogos del mismo donante, en los que la citotoxicidad se mide mediante la expresión de luciferasa.

[0292] Para caracterizar mejor el efecto de la expresión de antígenos en la función de los linfocitos T-CAR dirigidos contra LAP y contra GARP, se cribaron líneas celulares inmortalizadas para la expresión de los antígenos LAP y GARP, y se evaluó el efecto citotóxico de cada linfocito T-CAR. En primer lugar, las células HUT78, una línea celular derivada de linfocitos T CD4 cutáneos humanos que expresa IL-2, se tiñeron para detectar GARP y LAP (Fig.12A y 12B, respectivamente), y se confirmó la expresión de LAP por células HUT78. A continuación, se evaluó la citotoxicidad mediada por linfocitos T-CAR-LAP-H-L y T-CAR-LAP-L-H mediante ensayos de citotoxicidad (Fig.13A y 13B). A continuación, SeAx, una célula derivada del síndrome de Sezary humano dependiente de IL-2, se tiñó para GARP y LAP (Fig.14a y 14B, respectivamente), y se confirmó la expresión de ambos antígenos. Las células SeAx se cultivaron conjuntamente con linfocitos T-CAR-GARP, T-CAR-LAP-H-L, T-CAR-LAP-L-L y células no transducidas para cuantificar la destrucción mediada por los linfocitos T-CAR a las 24 horas (Fig. 15A) y a las 48 horas (Fig.15B). Cada T-CAR mostró una destrucción superior de la diana SeAx a las 24 horas, con un efecto más pronunciado a las 48 horas. T-CAR-GARP y T-CAR-LAP-H-L destruyeron las células diana SeAx con mayor eficacia que los linfocitos T-CAR-LAP-L-H a las 48 horas.

[0294] A continuación, se caracterizó la secreción de anticuerpos de camélidos anti-GARP por linfocitos T-CAR-EGFR-GARP mediante transferencia Western (Fig. 16A-16C). Se recogió el sobrenadante de cultivos que contenían linfocitos T-CAR-EGFR-GARP, se trató en condiciones reductoras y no reductoras, y se observó la presencia de una banda entre 10 y 15 kD en el carril que contenía la muestra no reducida (Fig.16C), lo que confirmó la presencia de un anticuerpo de camélido.

[0296] Ejemplo 3. Diseño y caracterización de linfocitos T-CAR secretores de BiTE

[0298] Otro mecanismo proporcionado en el presente documento para mejorar la eficacia de la actividad de linfocitos T-CAR en los microambientes tumorales (por ejemplo, para superar la regulación inmunitaria por parte de los Treg) es mediante un linfocito T-CAR que secreta anticuerpos inmunomoduladores, como un BiTE. Sin querer quedar limitados por la teoría, los presentes inventores han descubierto que la expresión de un anticuerpo inmunomodulador (por ejemplo, un BiTE) a partir de una construcción que también codifica un CAR puede amplificar aún más los efectos antitumorales.

[0299] Una construcción de ácido nucleico ejemplar, CAR-EGFR-BiTE- (EGFR-CD3), que se muestra esquemáticamente en la Fig. 17, incluye un polinucleótido que codifica un CAR unido operativamente en 5' a un polinucleótido que codifica un BiTE. El CAR presenta un dominio de unión al antígeno tumoral que se une al EGFRvIII, lo que dirige el linfocito T-CAR al microambiente de un tumor positivo para EGFRvIII. El BiTE se une en un dominio al EGFR y en el otro dominio al CD3, como se muestra en la Fig. 18, lo que puede (a) potenciar aún más la avidez de unión del linfocito T-CAR del huésped a la célula tumoral o (b) armar a los linfocitos T vecinos (por ejemplo, endógenos) contra el tumor. El BiTE está flanqueado por enlaces escindibles P2A y T2A para permitir la secreción separada del BiTE, mientras que el CAR se dirige a la superficie celular. Otras construcciones de CAR que codifican un BiTE ejemplares (por ejemplo, que codifican un BiTE dirigido a CD19) se representan en las Fig.26A y 26B.

[0300] La secreción de BiTE por los linfocitos T-CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) se confirmó aislando el sobrenadante de cultivos que contenían células SupT1 transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), calculando la concentración de BiTE en el sobrenadante basándose en la DO450 y realizando un análisis por transferencia Western. La concentración de BiTE en el sobrenadante fue de 0,604 ng/ml. Los resultados de un experimento de transferencia Western se muestran en la Fig.19. Se observó una banda en el carril dos de aproximadamente 50-60 kD, lo que indica la presencia de moléculas de BiTE en el sobrenadante.

[0301] A continuación, se evaluó la unión de las moléculas de BiTE mediante citometría de flujo. Se transdujeron células HEK293T con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), y se recogieron los sobrenadantes que contenían BiTE secretados, y se incubaron con células K562 (Fig.20A) y células Jurkat (Fig.20B). Como se muestra en la Fig.20A, los BiTE se unieron a las células K562 que expresaban EGFR y no se unieron a las células K562 que expresaban CD19, lo que confirma la función del dominio de unión a EGFR del BiTE. Como se muestra en la Fig.20B, las células Jurkat que expresaban CD3 mostraron una tinción más intensa para BiTE tras la incubación con el sobrenadante de las células HEK293T que expresaban CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3), en comparación con la tinción para BiTE tras la incubación con el sobrenadante de células HEK293T no transducidas, lo que indica que los BiTE también se unen funcionalmente a CD3.

[0302] Se llevó a cabo un experimento similar usando células SupT1 como huéspedes de transducción para CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3). La Fig. 21A muestra que los BiTE se unieron a las células K562 que expresaban EGFR y no se unieron a las células K562 que expresaban CD19, lo que confirma la función del dominio de unión a EGFR del BiTE expresado por las células SupT1 transducidas. Para confirmar que los BiTE se unían al CD3 expresado en la superficie de la célula SupT1 hospedadora, se tiñeron las células SupT1 transducidas para detectar BiTE. Los resultados, mostrados en la Fig. 21B, confirman que las células SupT1 transducidas dan positivo para BiTE. También se evaluó la capacidad de las células ND4 para secretar BiTE funcionales tras la transducción con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3). La Fig. 22A muestra que los BiTE secretados por las células ND4 transducidas se unieron a las células K562 que expresaban EGFR y no se unieron a las células K562 que expresaban CD19. Como se muestra en la Fig.22B, los BiTE se unieron al CD3 expresado en las células ND4 transducidas desde las que fueron secretados.

[0303] A continuación, se caracterizó in vitro la capacidad de los BiTE secretados por los linfocitos T-CAR transducidos. Los sobrenadantes que contenían BiTE secretados por células HEK293T transducidas con CAR-EGFR-BiTE-(EGFR-CD3) se incubaron con un cocultivo de células ND4 no transducidas y células diana U87vlll en diferentes relaciones. Como se muestra en la Fig.23, las células ND4, cuando se incubaron con BiTE, de forma dependiente de la dosis, lo que indica que los BiTE se unían tanto al CD3 expresado por ND4 como al EGFR expresado por U87vlll en un grado suficiente para inducir la destrucción por parte de las células ND4.

[0304] Para permitir la expresión inducible de BiTE tras la activación de los linfocitos T, se diseñó y sintetizó una construcción que contenía un promotor NFAT. Como se muestra en la Fig. 24, el promotor NFAT precede a un polinucleótido que codifica GFP, y la construcción incluye además un polinucleótido que codifica CAR situado aguas abajo impulsado por EF1α, un promotor constitutivo. Para confirmar la expresión inducible de GFP, se evaluó la expresión de GFP mediante FACS en respuesta a la estimulación del TCR con PMA/ionomicina. Como se muestra en las Fig. 25A y 25B, la estimulación desencadenó la expresión de GFP. Esta expresión inducible se inhibió mediante incubación con PEPvlll. Las construcciones BiTE inducibles que codifican CAR se diseñan colocando el BiTE aguas abajo de un promotor inducible, como un promotor NFAT, como se muestra en las Fig. 27A y 27B.

[0305] Ejemplo 4. Información de secuencias

[0306] Anti-GARP CAR - pMGH 97: Conductor de CD8 - anti-GARP - bisagra TM de CD8 - 4-1BB - CD3z(SEQ ID NO: 1) que comprende la secuencia conductora de CD8 (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2); anti-GARP de camélido (aminoácidos 22-128 de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3); dominio bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 129-197 de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4); ICD de 4-1BB (aminoácidos 198-239 de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5); y CD3ζ (aminoácidos 240-351 de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 6).

[0307]

[0309] Secuencia conductora de CD8 (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8) MALPVTALLLPLALLLHAARP scFv anti-LAP (H-L) (aminoácidos 22-307 de SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9)

[0310]

[0312] ICD de 4-1BB (aminoácidos 377-418 de SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3ζ (aminoácidos 419-530 de SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 12).

[0314]

[0316] CAR anti-LAP (L-H)-pMGH 100: Conductor de CD8 - anti-LAP-bisagra TM de CD8-4-1BB-CD3z(SEQ ID NO: 13) que comprende el conductor de CD8 (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14), scFv anti-LAP (L-H) (aminoácidos 22-307 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15), bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 308-376 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 16), ICD de 4-1BB (aminoácidos 377-418 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17) y CD3z (aminoácidos 419-530 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18).

[0318]

[0320] Conductor de CD8 (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14) MALPVTALLLPLALLLHAARP scFv anti-LAP (L-H) (aminoácidos 22-307 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15)

[0322]

[0323] ICD de 4-1BB (aminoácidos 377-418 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3z (aminoácidos 419-530 de SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 18)

[0324]

[0325] Secuencia de escisión 2A (aminoácidos 494-515 de SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 31) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

[0326] Conductor de IgK (aminoácidos 519-539 de SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 32) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD Anti-GARP de camélido (aminoácidos 540-646 de SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 25).

[0328]

[0330] pMGH113-scFv 3C10-bisagra/TM de CD8-ICD de 4-1BB-CD3z-P2A-conductor de IgK-scFv Cetuximab - scFv CD3-marca de His(SEQ ID NO: 26) que comprende scFv 3C10 (aminoácidos 1-243 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27), bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 244-312 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28), ICD de 4-1BB (aminoácidos 313-354 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 29), CD3z (aminoácidos 355-466 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30), P2A (aminoácidos 467-488 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 31), conductor de IgK (aminoácidos 491-511 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 32), scFv Cetuximab (aminoácidos 512-752 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 33), scFv CD3 (aminoácidos 758-1000 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 34).

[0332]

[0334] Bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 244-312 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28)

[0336]

[0338] ICD de 4-1BB (aminoácidos 313-354 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 29) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0339] CD3z (aminoácidos 355-466 de SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30)

[0341]

[0344] pMGH133-scFv 2173-bisagra/TM de CD8-ICD de 4-1BB-CD3z-P2A-conductor de IgK-scFv Cetuximab-scFv CD3-marca de His(SEQ ID NO: 35) que comprende scFv 2173 (aminoácidos 1-246 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36), bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 247-315 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37), ICD de 4-1BB (aminoácidos 316-357 de SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38), CD3z (aminoácidos 358-469 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 39), P2A (aminoácidos 470-491 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 40), conductor de IgK (aminoácidos 494-514 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 41), scFv Cetuximab (aminoácidos 515-755 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 42), y scFv CD3 (aminoácidos 761-1003 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 43).

[0345]

[0347] P2A (aminoácidos 470-491 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 40) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP Conductor de IgK (aminoácidos 494-514 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 41) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD scFv Cetuximab (aminoácidos 515-755 de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 42)

[0348]

[0350] Bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 247-315 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46)

[0351]

[0353] ICD de 4-1BB (aminoácidos 316-357 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 47) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3z (aminoácidos 358-469 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 48)

[0355]

[0357] P2A (aminoácidos 470-491 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 49) GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP Conductor de IgK (aminoácidos 494-514 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 50) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD scFv CD19 (aminoácidos 515-764 de SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 51)

[0359]

[0361] pMGH135 - (elemento de respuesta NFAT) - conductor de IgK - scFv Cetuximab - scFv de CD3 - marca de His - (promotor EF1a) - scFv 2173 - bisagra/TM de CD8 - ICD de 4-1BB - CD3z(SEQ ID NO: 53) que comprende el conductor de IgK (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54), scFv Cetuximab (aminoácidos 22-262 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55), scFv CD3 (aminoácidos 268-510 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 56), scFv 2173 (aminoácidos 517-762 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 57), bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 763-831 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 58), ICD de 4-1BB (aminoácidos 832-873 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 59), CD3z (aminoácidos 874-985 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 60).

[0362] (elemento de respuesta NFAT)

[0364]

[0366] (Promotor EF1a)

[0367]

[0369] (Nota: los dos polipéptidos mencionados anteriormente se indican con un único identificador de secuencia por comodidad, pero debe entenderse que los componentes CAR y BiTE pueden fabricarse por separado, debido a los dos promotores distintos; véase más arriba.)

[0370] Conductor de IgK (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD scFv Cetuximab (aminoácidos 22-262 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55)

[0372]

[0374] scFv 2173 (aminoácidos 517-762 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 57)

[0376]

[0378] ICD de 4-1BB (aminoácidos 832-873 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 59) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3z (aminoácidos 874-985 de SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 60)

[0380]

[0381] pMGH136-(elemento de respuesta NFAT)-conductor de IgK-scFv CD19-scFv CD3-marca de His-(promotor EF1a)-scFv 2173-bisagra/TM de CD8-ICD de 4-1BB-CD3z(SEQ ID NO: 61) que comprende (elemento de respuesta NFAT), conductor de IgK (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62), scFv CD19 (aminoácidos 22-271 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63), scFv CD3 (aminoácidos 277-519 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 64), scFv 2173 (aminoácidos 526-771 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 65), bisagra/TM de CD8 (aminoácidos 772-840 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 66), ICD de 4-1BB (aminoácidos 841-882 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 67), CD3z (aminoácidos 883-994 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 68).

[0383]

[0385] y los componentes BiTE pueden fabricarse por separado, debido a los dos promotores separados; véase más arriba.)

[0386] Conductor de IgK (aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62) METDTLLLWVLLLWVPGSTGD scFv CD19 (aminoácidos 22-271 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63)

[0388]

[0390] scFv CD3 (aminoácidos 277-519 de SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 64)

[0391]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un linfocito T con receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende:

(a) un primer polinucleótido que codifica un CAR que comprende:

un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno asociado a tumores,

un dominio transmembranario, y

un dominio de señalización intracelular, opcionalmente en donde

(i) el dominio de unión al antígeno del CAR comprende opcionalmente un anticuerpo, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo de dominio único o un ligando;

(ii) el dominio transmembranario del CAR comprende un dominio bisagra/transmembranario de CD8, que comprende opcionalmente la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22, 28, 37, 46, 58 y 66, o una variante de las mismas; y/o

(iii) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular CD3ζ, que opcionalmente comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24, 30, 39, 48, 60 y 68, o una variante de las mismas; y

(b) un segundo polinucleótido que codifica un agente terapéutico que comprende un activador de linfocitos T biespecífico secretado que se une a un antígeno asociado a tumores o a un antígeno asociado a Treg, en donde el CAR y el agente terapéutico se producen en forma de una poliproteína que se escinde para generar moléculas separadas de CAR y de agente terapéutico.

2. El linfocito T-CAR de la reivindicación 1, en donde la poliproteína comprende un resto escindible entre el CAR y el agente terapéutico,

en donde el resto escindible comprende opcionalmente un péptido 2A, y en donde, además, el péptido 2A comprende opcionalmente P2A o T2A.

3. El linfocito T-CAR de la reivindicación 1 o 2, en donde: (a) el CAR y el agente terapéutico se expresan de forma constitutiva, opcionalmente en donde la expresión del CAR y del agente terapéutico está impulsada por un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1α); o

(b) el CAR se expresa bajo el control de un promotor constitutivo y el agente terapéutico se expresa bajo el control de un promotor inducible, que es opcionalmente inducible por la señalización del receptor de linfocitos T o del CAR, en donde el promotor inducible comprende opcionalmente un promotor NFAT.

4. El linfocito T-CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el CAR comprende además uno o más dominios coestimuladores, en donde el dominio coestimulador es opcionalmente un dominio coestimulador 4-1BB, que opcionalmente comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23, 29, 38, 47, 59 y 67, o una variante de las mismas.

5. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el dominio de unión al antígeno del CAR o del agente terapéutico se une a un antígeno asociado a tumores, en donde, opcionalmente, el antígeno asociado a tumores al que se une el dominio de unión al antígeno del CAR o del agente terapéutico es un antígeno asociado a tumores sólidos, o comprende el receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII), EGFR, CD19, el antígeno prostático específico de membrana (PSMA) o el receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Rα2), y opcionalmente el dominio de unión al antígeno del CAR o del agente terapéutico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 27, 33, 36, 42, 45, 51, 55, 57, 63, 65 y variantes de las mismas.

6. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el antígeno asociado a Treg al que se une el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en glucoproteína A dominante en repeticiones (GARP), péptido asociado a la latencia (LAP), CD25 y antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4).

7. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el dominio de unión al antígeno del CAR o del agente terapéutico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 9, 15, 25 y variantes de las mismas.

8. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con, o codifica la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica la poliproteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Una composición farmacéutica que comprende uno o más linfocitos T-CAR, moléculas de ácido nucleico o poliproteínas de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en un método de tratamiento de un paciente con cáncer, comprendiendo el método la administración al paciente de la composición farmacéutica, en donde el cáncer es opcionalmente un glioblastoma.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde, al dirigirse a un microambiente tumoral, se reduce la toxicidad sistémica, o

en donde el cáncer secaracteriza porla presencia de uno o más tumores sólidos o por Tregs que infiltran tumores.

12. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el activador de linfocitos T biespecífico secretado se une a CD3 y a uno de EGFR, EGFRvIII, CD19, CTLA4, CD25, GARP, LAP, IL-15, IL13Ra2 o CSF1R.

13. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o 12, en donde el activador de linfocitos T biespecífico secretado se une a CD3 y a EGFR o a EGFRvIII.

14. El linfocito T-CAR de la reivindicación 1, en donde:

(a) el dominio de unión al antígeno del CAR se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico variante III (EGFRvIII),

el dominio transmembranario comprende un dominio transmembranario de CD8, y

el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular CD3ζ, opcionalmente en donde

(ii) el dominio transmembranario del CAR comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma; y/o

(iii) el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma; y

(b) el activador de linfocitos T biespecífico secretado se une al EGFR y al CD3.

15. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o 14, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

16. El linfocito T-CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o 14, en donde la expresión del CAR y del agente terapéutico es impulsada por un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1α).