ES3061069T3 - Peptides for treatment and prevention of nonalcoholic fatty liver disease - Google Patents

Peptides for treatment and prevention of nonalcoholic fatty liver disease

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Abstract

La presente invención se refiere a péptidos para el tratamiento o la prevención de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), el hígado graso no alcohólico (HGNA), la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), la esteatosis hepática (hígado graso), la inflamación del hígado, la cirrosis, el carcinoma hepatocelular o la fibrosis, especialmente la fibrosis hepática. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Péptidos para el tratamiento y la prevención de la enfermedad del hígado graso no alcohólico
[0003] Campo de la invención
[0004] La presente invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, se refiere al tratamiento de enfermedades hepáticas, en particular esteatosis hepática, especialmente hepatitis esteatósica no alcohólica y al tratamiento de fibrosis. En particular, se refiere a un péptido como se define en las reivindicaciones y su uso terapéutico, especialmente en el tratamiento de una enfermedad hepática o de fibrosis.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] NAFLD (enfermedad del hígado graso no alcohólico), definida por la presencia de acumulación hepática de triglicéridos en los hepatocitos en ausencia de cualquier otra etiología de enfermedad hepática, es la causa más común de enfermedad hepática crónica en el mundo occidental. Su fenotipo clínico-histológico se extiende desde el hígado graso no alcohólico (NAFL) hasta la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), caracterizada por inflamación hepática y fibrosis progresiva, que conduce a cirrosis y enfermedad hepática en etapa terminal, así como a carcinoma hepatocelular.
[0007] Mientras que la prevalencia estimada de NAFLD varía del 6 al 33 % en la población general, la prevalencia de NASH solo varía del 3 al 5 %, pero la cirrosis relacionada con NASH se ha convertido en la segunda indicación principal para el trasplante de hígado en los Estados Unidos. Las hospitalizaciones por NAFLD han aumentado en un 97 % desde el año 2000.
[0008] Actualmente no hay medicamentos aprobados para prevenir o tratar NAFLD o NASH.
[0009] Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos tratamientos para prevenir o tratar la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y la esteatosis hepática (hígado graso).
[0010] La fibrosis es una condición patológica en la que el tejido conectivo fibroso invade cualquier órgano, normalmente como consecuencia de una inflamación u otra lesión. Se conocen varios compuestos para tratar la fibrosis, pero lo hacen de manera inadecuada. Por lo tanto, los intentos de desarrollar una fibrosis clínicamente eficaz no han tenido éxito y aún existe la necesidad de encontrar tratamientos para la fibrosis.
[0011] Los documentos WO00/18895, EP0251244 y WO2017/036852 divulgan péptidos derivados de la proteína PKC. El documento CN102477074 divulga una composición que comprende un tripéptido PAK. Varman et al (2007, Journal of Clinical Investigation, 117, 739-745) divulga un oligonucleótido antisentido contra PKCε para su uso en el tratamiento de NAFLD y Moya et al (2012, PLOS ONE, 7, 1-17) propone aumentar los niveles de Foxa1 para el tratamiento de NAFL y resistencia a la insulina.
[0012] Sumario de la invención
[0013] Sorprendentemente, los inventores proporcionan péptidos del dominio quinasa de la PKCα y derivados de los mismos que disminuyen específicamente la expresión del miembro 2 de la familia de portadores de soluto 27 (SLC27A2) comúnmente conocido como FATP2 (proteína de transporte de ácidos grasos 2) en tejido adiposo. Los péptidos son capaces, después de 3 meses de una única inyección, de disminuir el fenómeno de la esteatosis en el hígado, en particular capaces de disminuir el tamaño de las gotitas de lípidos en el hígado, el nivel de dos biomarcadores de daño hepático (es decir, AST y ALT) y la relación entre el peso del hígado y el peso corporal. Además, los péptidos son capaces de disminuir la fibrosis, como se muestra por su capacidad para regular a la baja la ruta de lipogénesis de novo (por ejemplo, disminución de ACC (acetil-CoA carboxilasa) y para disminuir el contenido de proteína hepática LOXL2 y los niveles circulantes, deteniendo de este modo la fibrosis progresión. In vivo, se ha observado una disminución significativa del contenido de triglicéridos hepáticos y del área de fibrosis con un tratamiento con los péptidos, lo que demuestra un efecto antiesteatósico y antifibrosis.
[0014] Por consiguiente, la presente invención es como se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
[0015] La invención se refiere a un péptido, en donde
[0016] - el péptido es capaz de disminuir la expresión de FATP2 en tejido adiposo;
[0017] - el péptido no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
[0018] - el péptido adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa;
[0019] - el péptido tiene una longitud inferior a 60 aminoácidos, y
[0020] - la secuencia peptídica comprende VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)
[0021] en donde R y S llevan el grapado.
[0022] Preferiblemente, el péptido comprende 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)serina.
[0023] La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido como se ha definido anteriormente.
[0024] Se refiere además a un péptido de acuerdo con la presente divulgación o una composición farmacéutica que lo comprende para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis.
[0025] Opcionalmente, la fibrosis es una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica e infarto de miocardio antiguo, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal o una fibrosis cutánea.
[0026] Breve descripción de los dibujos
[0027] Figura 1: Efecto del tratamiento PATAD dirigido al tejido adiposo sobre los niveles de expresión de transportadores y receptores de ácidos grasos clave
[0028] n = 4 animales por grupo, se usó GAPDH como gen de referencia. Hay 6 isoformas de FATP (FATP1-6 también conocidas como SLC27A1-SLC27A6).
[0029] Fatp1 (proteína de transporte de ácidos grasos 1), Fatp2 (proteína de transporte de ácidos grasos 2), Fatp3 (proteína de transporte de ácidos grasos 3), Fatp4 (proteína de transporte de ácidos grasos 4), Fatp5 (proteína de transporte de ácidos grasos 5), Fatp6 (proteína de transporte de ácidos grasos proteína 6), FFAR1 (receptor de ácidos grasos libres 1), FFAR2 (receptor de ácidos grasos libres 2), FFAR3 (receptor de ácidos grasos libres 3), FFAR4 (receptor de ácidos grasos libres 4)
[0030] "Scrambleless" se refiere a la combinación de los dos péptidos con los mismos residuos de aminoácidos que en las formas grapadas pero reorganizados aleatoriamente con una estructura de hélice alfa mantenida: Secuencia peptídica aleatorizada A y Secuencia peptídica aleatorizada B. "Grapar" se refiere a una combinación de dos péptidos grapados: Secuencia peptídica grapada A y Secuencia peptídica grapada B. La Figura 1A representa los niveles de expresión de las isoformas de FATP y FFAR en el tejido adiposo inyectado con PATAD donde el nivel de expresión de FATP2 se reduce significativamente.
[0031] Las Figuras 1B y 1C representan los niveles de expresión de las isoformas de FATP y FFAR en el hígado y el músculo después de la inyección subcutánea de PATAD.
[0032] Figura 2: El péptido ADPIF es más activo que el péptido PATAD en la reducción del nivel de expresión de FATP2 en el tejido adiposo y en el aumento de los niveles circulantes de GLP-1
[0033] (A) En este conjunto de experimentos se usaron ratones macho de 4 meses de edad alimentados con una dieta rica en grasas/rica en glucosa. Niveles de expresión normalizados de FATP2 en el tejido adiposo de los diferentes ratones 11 días después de la condición indicada en el eje X. n = 4 animales por grupo, se usó GAPDH como gen de referencia
[0034] (B) Concentración circulante de GLP-1 en los mismos ratones 11 días después de la inyección que muestra que PATAD y ADPIF pudieron restaurar los niveles circulantes de GLP1 a los controles magros donde los ratones inyectados revueltos presentaban concentraciones de GLP-1 disminuidas.
[0035] Figura 3: Efecto sobre el hígado y la aspartato transaminasa circulante (AST) y la alanina transaminasa (ALT) después de 3 meses de tratamiento con PATAD y ADPIF dirigido al tejido adiposo
[0036] (A) Tinción fluorescente de criosecciones de hígado fijado de ratones tratados con control (izquierda) y PATAD (derecha) 3 meses después de una única inyección de PATAD.
[0037] (B) Se representó la relación de hígado frente a peso corporal por edad en días para n = 1 animal por grupo para péptido PATAD
[0038] (C) Valores medios de AST y ALT medidos mediante el enfoque de ELISA en plasma de ratones con el tratamiento indicado. n = 4 muestras por grupo.
[0039] PATAD y ADPIF son ambos eficaces para reducir los niveles circulantes de AST y ALT. ADPIF es más activo en la reducción de los niveles circulantes de ALT, lo que se traduce en una mejora de la lesión de las células hepáticas.
[0040] Figura 4. El péptido ADPIF es más activo que el péptido PATAD en la prevención de la hiperglucemia
[0041] (A) Serie de puntos de tiempo en días a los 30 minutos de bolo de glucosa en obesos inducidos por dieta masculina en ayunas (DIO) (CTL HFD) y controles (CTL Chow diet) después de una única inyección de PATAD (PATAD 417) o ADPIF (CPC péptido A -MRP) tratamiento en el día 0. El bolo de glucosa se inyecta por vía subcutánea, lo que evita el hígado y va directamente al torrente sanguíneo.
[0042] (B) Efecto sobre la tolerancia a la glucosa en obesos inducidos por dieta masculina en ayunas (DIO) (CTL HFD) y controles (dieta CTL Chow) mediante la medida del área bajo la curva antes (D-5) en el momento del tratamiento y después (D 6) tratamiento con péptidos PATAD (PATAD 417) y ADPIF (PATAD 417-MRP). Figura 5. ADPIF es más activo que PATAD en la disminución del contenido de proteína hepática de lisil oxidasa como la proteína 2 (LOXL2) y la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4) en ratones DIO macho.
[0043] (A) LOXL2 es un actor clave conocido para la progresión de la fibrosis. Resultados de ELISA que miden LOXL2 en extractos de hígado 3 meses después de la inyección de vehículo, PATAD o ADPIF en el tejido adiposo subcutáneo. Se observa una disminución significativa en el contenido de proteína hepática después del tratamiento con PATAD o ADPIF, siendo ADPIF el péptido más eficaz. n = 4 ratones por grupo.
[0044] (B) FABP4 es un actor clave de los procesos mediados por lípidos en la célula y está elevado en el hígado asociado con NAFLD. Medimos el contenido de proteína FABP4 3 meses después de la inyección única de aleatorización o PATAD o ADPIF. FABP4 se reduce significativamente después de la inyección de PATAD o ADPIF, siendo ADPIF más activo que PATAD.
[0045] Figura 6. Efecto de ADPIF sobre ceramidas en el contenido y perfil hepático. Las ceramidas son un grupo de lípidos activos biológicos que se sabe que están implicados en NAFLD. Medimos y determinamos el efecto de las inyecciones de ADPIF en el perfil de ceramidas después de 3 inyecciones de ADPIF a una frecuencia de una inyección por semana en el tejido adiposo subcutáneo. ADPIF induce globalmente una disminución en el contenido de ceramidas hepáticas con variaciones entre las diferentes ceramidas.
[0046] Figura 7. Efecto sobre el contenido de triglicéridos hepáticos después de 3 meses de tratamiento con ADPIF dirigido al tejido adiposo.
[0047] La tinción fluorescente de criosecciones de hígado fijado de ratones tratados con control (izquierda) y ADPIF (derecha) 3 meses después de una inyección de ADPIF única que muestra una disminución en el diámetro de las gotas de lípidos que indica una disminución general en los triglicéridos totales en el hígado. Los ratones eran ratones macho DIO de 7 meses de edad al final del experimento.
[0048] Figura 8. El tratamiento con péptido ADPIF regula a la baja los genes de la vía de lipogénesis de novo después de 11 días en ratones macho DIO.
[0049] 11 días después de la inyección de péptido ADPIF en el tejido adiposo, los niveles de expresión hepática de ácido graso sintasa (Fasn), acetil-CoA carboxilasa (Acc) y factor de transcripción de unión al elemento regulador de esteroles 1 (Srebf1) se redujeron significativamente en comparación con el control, lo que indica que la de novo se detuvo la lipogénesis en el hígado de los ratones tratados con ADPIF.
[0050] Figura 9. El tratamiento con ADPIF reduce las lesiones fibróticas en el hígado.
[0051] (A) Imágenes de inmunotinción de criosecciones de hígado de DIO-NASH no tratada y DIO-NASH tratada con ADPIF, 3 meses después de la inyección de ADPIF en el tejido adiposo subcutáneo. El colágeno IV y LOXL2 se expresa altamente en la DIO-NASH no tratada y se reduce en la DIO-NASH tratada con ADPIF. (B) Como también se secreta LOXL2, medimos el efecto de ADPIF en los niveles de circulación de LOXL2 y descubrimos que el tratamiento con ADPIF (3 meses después de una inyección única) redujo los niveles de LOXL2 a la mitad.
[0052] (C) Las secciones de hígado se analizaron mediante microscopía electrónica transmitida para identificar los depósitos fibróticos en el hígado no tratado con DIO-NASH. No se encontraron tales depósitos fibróticos en el hígado tratado con DIO-NASH 3 meses después de la inyección de ADPIF en el tejido adiposo subcutáneo. Figura 10. Impacto del tratamiento con ADPIF en los lípidos de lisofosfatidilcolinas (LPC).
[0053] Las lisofosfatidilcolinas (LPC) son sustratos para una enzima profibrótica, la autotaxina, que es una enzima clave en la generación de ácido lisofosfatídico. Este último es un lípido bioactivo conocido por desempeñar un papel en la progresión fibrótica que afecta al hígado, pero también al riñón y otros tejidos blandos. Por lo tanto, medimos el nivel de los diferentes (LPC) en páncreas (A), tejido adiposo (B), hígado (C) y plasma (D). El tratamiento con ADPIF (administrado a una frecuencia de una inyección subcutánea de 25 µg por ratón durante un período de 3 semanas y luego los ratones se sacrificaron después de 1 semana después de la última inyección), induce una disminución selectiva de ciertas LPC en los diferentes tejidos analizados. LPC 18:2 es el lípido que se reduce principalmente después del tratamiento con ADPIF tanto en el páncreas, el tejido adiposo y el hígado.
[0054] Figura 11. El péptido ADPIF protege el riñón de la fibrosis
[0055] Las criosecciones de riñones de DIO-NASH tratados con vehículo y DIO-NASH tratados con ADPIF se inmunotiñeron para Colágeno IV, ZO-1 y los núcleos. Se observan más depósitos de colágeno IV en el vehículo DIO-NASH que en el tratado con ADPIF.
[0056] Descripción detallada de la invención
[0057] Sorprendentemente, los inventores proporcionan péptidos del dominio quinasa de la PKCα y derivados de los mismos que disminuyen específicamente la expresión de FATP2 (proteína de transporte de ácidos grasos 2) en tejido adiposo (Figura 1A). Los péptidos son capaces, después de 3 meses de una única inyección, de disminuir el fenómeno de la esteatosis en el hígado, en particular capaces de disminuir el tamaño de las gotitas de lípidos en el hígado, el nivel de dos biomarcadores de daño hepático (es decir, AST y ALT) y la relación entre el peso del hígado y el peso corporal (Figura 3). Además, los péptidos son capaces de disminuir la fibrosis, como se muestra por su capacidad para regular a la baja la ruta de lipogénesis de novo (por ejemplo, disminución de ACC (acetil-CoA carboxilasa) (Figura 8) y para disminuir el nivel de proteína de LOXL2 en el hígado y en circulación (Figuras 5 y 9A), deteniendo así la progresión de la fibrosis. Los péptidos también son capaces de disminuir el depósito de colágeno en el riñón. In vivo, se ha observado una disminución significativa del área de fibrosis con un tratamiento con los péptidos, lo que demuestra un efecto antifibrosis.
[0058] Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a
[0059] - un péptido como se define en el presente documento;
[0060] - una composición farmacéutica que comprende un péptido como se define en el presente documento;
[0061] - un péptido como se define en el presente documento para su uso como un fármaco o el uso de un péptido como se define en el presente documento para la fabricación de un fármaco; y
[0062] - un péptido o una composición farmacéutica que comprende el péptido para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis, especialmente una fibrosis seleccionada del grupo que consiste en una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica y miocárdica antigua infarto, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal y una fibrosis cutánea.
[0063] Definiciones
[0064] ALMS1, proteína 1 del síndrome de Alström, es una proteína codificada por el gen ALMS1. Se ha descubierto que mutaciones en el gen ALMS1 son causantes del síndrome de Alström. Se describe en varias bases de datos, en concreto UniProt ID No Q8TCU4; ID de gen n.º 7840, ID de HGNG n.º 428. Se divulgan secuencias de referencia en Genbank en NM_015120.4 para ARNm y NP_055935.4 para proteína.
[0065] Los términos "Proteína quinasa C" y "PKC" (EC 2.7.11.13) son equivalentes y se refieren a una familia de enzimas de proteína quinasa que están implicadas en el control de la función de otras proteínas a través de la fosforilación de grupos hidroxilo de aminoácidos de serina y treonina. residuos en estas proteínas. Las PKC típicamente se activan mediante señales tales como aumentos en la concentración de diacilglicerol (DAG) o iones de calcio (Ca2+). Las PKC desempeñan funciones importantes en varias cascadas de transducción de señales.
[0066] La familia de PKC comprende al menos quince isoenzimas en humanos, divididas en tres subfamilias principales, PKC convencionales (o clásicas), PKC novedosas y PKC atípicas.
[0067] Las (c)PKC convencionales comprenden las isoformas α, βI, βII y γ. Estas PKC requieren Ca<2+>, DAG y un fosfolípido tal como fosfatidilserina para la activación.
[0068] Las PKC novedosas (n) incluyen las isoformas δ, ε, η y θ. Estas PKC requieren DAG, pero no requieren Ca2<+>para la activación.
[0069] Las (a)PKC atípicas incluyen la ζ, , e isoformas λ. Estas PKC no requieren ni Ca2+ ni diacilglicerol para la activación.
[0070] La proteína quinasa C tipo alfa, también denominada αPKC, PKC-A o PKC-alfa, pertenece a una familia de proteínas quinasas específicas de serina y treonina que pueden activarse por calcio y el segundo mensajero diacilglicerol. Se describe en varias bases de datos, en concreto, UniProt ID N.º P17252, Gene ID N.º 9393, HGNG ID N.º 5578. Se divulgan secuencias de referencia en Genbank en NM_02737.2 para ARNm y NP_002728.1 para proteína. La secuencia de proteína de αPKC humana se divulga en SEQ ID NO: 1.
[0071] El dominio de quinasa de la αPKC es de la posición 339 a la posición 595 como se divulga en la SEQ ID NO: 1 y se muestra en SEQ ID NO: 2.
[0072] "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente": La descripción en el presente documento de cualquier aspecto de la divulgación que utiliza términos tales como referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar soporte para un aspecto similar de la divulgación que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento particular o elementos, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. Por ejemplo, un péptido o proteína descrito en el presente documento que comprende una secuencia particular debe entenderse que también describe un péptido o proteína que consiste en esa secuencia, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. Por "consiste esencialmente en" se entiende que el péptido o proteína consiste en esa secuencia, pero también puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones, eliminaciones o una mezcla de los mismos, preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones, eliminaciones o una mezcla de los mismos. En particular, por "consistir esencialmente en", puede entenderse que el péptido puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos adicionales en el N y/o C-terminal final, preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos adicionales, y/o 1, 2 o 3 sustituciones, deleciones, adiciones o una mezcla de los mismos. Preferiblemente, el número de sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de las mismas depende de la longitud de la secuencia. Por ejemplo, el porcentaje de sustituciones, deleciones, adiciones o una mezcla de las mismas puede ser no superior al 30 %, preferiblemente no superior al 25 %.
[0073] Como se usa en el presente documento, el término "sustitución" se refiere al intercambio de un único aminoácido por otro en una secuencia peptídica.
[0074] Como se usa en el presente documento, el término "deleción" se refiere a la eliminación de un único aminoácido en una secuencia peptídica.
[0075] Como se usa en el presente documento, el término "inserción" o "adición" son equivalentes y se refieren a la adición de un único aminoácido en una secuencia peptídica.
[0076] Por "sustituciones, adiciones, deleciones" se entiende una sustitución, adición, deleción de un aminoácido. Entonces, cuando se hace referencia a "1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, adiciones, eliminaciones o una mezcla de las mismas", "1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de los mismos" o "1, 2 o 3 sustituciones, deleciones, adiciones o una mezcla de los mismos", significa respectivamente "1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustituciones, adiciones, deleciones y una mezcla de las mismas", "1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de los mismos" o "1, 2 o 3 modificaciones de un aminoácido seleccionado de sustituciones, deleciones, adiciones o una mezcla de los mismos". "1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de las mismas" también significa "de 1 a 5 sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de las mismas". "1, 2 o 3 sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de las mismas" también significa "de 1 a 3 sustituciones, adiciones, deleciones o una mezcla de las mismas".
[0077] En las secuencias peptídicas divulgadas en el presente documento, los aminoácidos se representan por su código de una letra de acuerdo con la siguiente nomenclatura: A: alanina; C: cisteína; D: ácido aspártico; E: ácido glutámico; F: fenilalanina; G: glicina; H: histidina; I: isoleucina; K: lisina; L: leucina; M: metionina; N: asparagina; P: prolina; Q: glutamina; R: arginina; S: serina; T: treonina; V: valina; W: triptófano e Y: tirosina.
[0078] Como se usa en el presente documento, los términos "identidad de secuencia" o "identidad" se refieren a una correspondencia exacta de aminoácido a aminoácido de dos péptidos. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.
[0079] La identidad de secuencia puede determinarse mediante la alineación de dos secuencias peptídicas usando algoritmos de alineación globales o locales, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando algoritmos de alineación global (por ejemplo, Needleman Wunsch) que alinea las secuencias de manera óptima a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación local (por ejemplo, Smith Waterman). Las secuencias entonces pueden denominarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando comparten (cuando se alinean de forma óptima mediante, por ejemplo, los programas GAP o BESTFIT usando parámetros predeterminados) al menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia. GAP usa el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. Una alineación global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares.
[0080] Por "aumentado", "aumentar" o "mejorar" se pretende hacer referencia a una medición aumentada en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % en comparación con la medición medida en ausencia de la molécula ensayada en las mismas condiciones. Por "disminución" o "disminución" se pretende hacer referencia a una medición disminuida en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % en comparación con la medición medida en ausencia de la molécula analizada en las mismas condiciones.
[0081] Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento", "tratar" o "tratar" se refiere a cualquier acto destinado a mejorar el estado de salud de los pacientes, tal como curar, aliviar o retrasar la enfermedad. Incluye tratamiento preventivo, así como terapéutico. Por ejemplo, puede referirse a un retraso o un bloqueo de la evolución de NAFLD a NASH, de NASH a NASH con fibrosis, de NASH a cirrosis, de NASH o cirrosis a carcinoma hepatocelular. El término tratamiento designa en particular la corrección, retardo o reducción de la esteatosis hepática. El término "tratamiento" también designa una mejora en la esteatosis hepática, en la inflamación hepática, en la fibrosis hepática, en las enzimas hepáticas (aminotransferasas tales como AST y ALT) y/o en el índice de hígado graso (Bedgni et al, BMC Gastroenterol. 2 de noviembre de 2006; 6:33). En particular, el tratamiento reduce o disminuye o retrasa la esteatosis hepática, la inflamación hepática, la fibrosis hepática, las enzimas hepáticas (aminotransferasas tales como AST y ALT) y/o el índice de hígado graso. En el contexto de la fibrosis, puede referirse a un retraso o un bloqueo de la evolución de la fibrosis. En particular, el término tratamiento designa en particular la corrección, retardo o reducción de la fibrosis.
[0082] Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un péptido de la presente divulgación o de una composición farmacéutica de la presente divulgación que trata o retrasa la progresión o el inicio de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), no alcohólico hígado graso (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), fibrosis hepática, inflamación hepática, cirrosis o carcinoma hepatocelular. También puede referirse a una cantidad de un péptido de la presente divulgación o de una composición farmacéutica de la presente divulgación que trata o retrasa la fibrosis.
[0083] Como se usa en el presente documento, los términos "principio activo", "ingrediente activo" e "ingrediente farmacéutico activo" son equivalentes y se refieren a un componente de una composición farmacéutica que tiene un efecto terapéutico.
[0084] Como se usa en el presente documento, el término "efecto terapéutico" se refiere a un efecto inducido por un ingrediente activo, tal como un péptido de la presente divulgación, o por una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación, capaz de tratar o retrasar la progresión o el inicio de una enfermedad tal como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), fibrosis hepática, inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular o fibrosis.
[0085] Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier ingrediente excepto los ingredientes activos que están presentes en una composición farmacéutica. Su adición puede tener como objetivo conferir una consistencia particular u otras propiedades físicas o gustativas al producto final. Un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable debe estar desprovisto de cualquier interacción, en particular química, con los ingredientes activos.
[0086] Como se usa en el presente documento, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" son intercambiables y se refieren a un animal, preferiblemente a un mamífero, incluso más preferiblemente a un ser humano, incluyendo adulto, niño, recién nacido y ser humano en la etapa prenatal.
[0087] En el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores de ± 10 % del valor especificado. Por ejemplo, "aproximadamente 50" comprende valores de ± 10 % de 50, es decir, valores en el intervalo entre 45 y 55. Preferiblemente, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores de ± 5 % del valor especificado.
[0088] Como se usa en el presente documento, "enfermedad del hígado graso no alcohólico" y "NAFLD" se refieren a una enfermedad definida por la presencia de esteatosis macrovascular en presencia de menos de 20 g de ingesta de alcohol por día. NAFLD es la enfermedad hepática más común en los Estados Unidos y se asocia comúnmente con resistencia a la insulina/diabetes mellitus tipo 2 y obesidad. NAFLD se manifiesta por esteatosis, esteatohepatitis, cirrosis y, a veces, carcinoma hepatocelular. Para una revisión de NAFLD, véase Tolman y Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Riesgo. Manag., 3(6): 1153-1163.
[0089] Como se usa en el presente documento, los términos "esteatosis", "esteatosis hepática" e "hígado graso" se refieren a la acumulación de triglicéridos y otras grasas en las células hepáticas.
[0090] Como se usa en el presente documento, la expresión "esteatohepatitis no alcohólica" o "NASH" se refiere a inflamación y daño hepáticos causados por una acumulación de grasa en el hígado. NASH es parte de un grupo de afecciones llamadas enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD). La NASH se asemeja a la enfermedad hepática alcohólica, pero ocurre en personas que beben poco o nada de alcohol. La característica principal de la NASH es la grasa en el hígado, junto con la inflamación y el daño. La mayoría de las personas con NASH se sienten bien y no son conscientes de que tienen un problema hepático. Sin embargo, NASH puede ser grave y puede conducir a cirrosis, en la que el hígado se daña y cicatriza permanentemente y ya no puede funcionar correctamente. Por lo general, se sospecha primero de NASH en una persona que se encuentra que tiene elevaciones en las pruebas hepáticas que se incluyen en los paneles de análisis de sangre de rutina, como la alanina aminotransferasa (ALT) o la aspartato aminotransferasa (AST). Cuando una evaluación adicional no muestra una razón aparente para la enfermedad hepática (como medicamentos, hepatitis viral o uso excesivo de alcohol) y cuando las radiografías o los estudios de imágenes del hígado muestran grasa, se sospecha NASH. El único medio para probar un diagnóstico de NASH y separarlo del hígado graso simple es una biopsia hepática. Como se usa en el presente documento, el término "cirrosis", definido histológicamente, es un proceso hepático difuso caracterizado por fibrosis y conversión de la arquitectura hepática normal en nódulos estructuralmente anormales.
[0091] NAFLD puede diferenciarse de NASH por la puntuación de actividad de NAFLD (NAS), la suma de las puntuaciones de histopatología de una biopsia hepática para esteatosis (0 a 3), inflamación lobular (0 a 2) y balonización hepatocelular (0 a 2). Un NAS de <3 corresponde a NAFLD, 3-4 corresponde a NASH limítrofe y >5 corresponde a NASH. La biopsia también se puntúa para fibrosis (0 a 4).
[0092] Péptidos
[0093] El uno o más péptidos de acuerdo con la presente divulgación presentan los siguientes rasgos característicos: - no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
[0094] - preferiblemente, adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa;
[0095] - comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de un segmento del dominio quinasa de una PKC (proteína quinasa C), preferiblemente un segmento de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 25 residuos consecutivos del dominio quinasa de una PKC (proteína quinasa C); y - la secuencia peptídica puede comprender 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones de aminoácidos seleccionadas de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de las mismas dentro de dicha secuencia de un segmento de la dominio quinasa de la PKC.
[0096] El uno o más péptidos pueden presentar además uno o varios de los siguientes rasgos característicos:
[0097] - tiene una longitud de menos de 80 aminoácidos, más preferiblemente menos de 60 aminoácidos, aún preferiblemente menos de 40 aminoácidos, e incluso más preferiblemente menos de 30 aminoácidos;
[0098] - tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 5 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 5 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos;
[0099] - se modifica por un entrecruzamiento;
[0100] - es capaz de interferir con la interacción ALMS1-PKC, en particular para disminuir o evitar la interacción entre ALMS1 y αPKC; o no puede interferir con la interacción ALMS 1-PKC, en particular para disminuir o evitar la interacción entre ALMS 1 y αPKC;
[0101] - modifica los niveles de expresión de la expresión de FATP en tejido adiposo, preferiblemente disminuye la expresión de FATP2 en tejido adiposo;
[0102] - disminuye la esteatosis hepática, la cantidad de grasa en el hígado, el tamaño de las gotas de grasa en el hígado y/o el índice de hígado graso;
[0103] - induce los niveles de expresión de la hemo oxigenasa 1 en los adipocitos.
[0104] El uno o más péptidos pueden presentar además uno o varios de los siguientes rasgos característicos:
[0105] - tiene una longitud de menos de 80 aminoácidos, más preferiblemente menos de 60 aminoácidos, aún preferiblemente menos de 40 aminoácidos, e incluso más preferiblemente menos de 30 aminoácidos;
[0106] - tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 5 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 5 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos;
[0107] - se modifica por un entrecruzamiento;
[0108] - no puede interferir con la interacción ALMS1-PKC, en particular para disminuir o evitar la interacción entre ALMS1 y αPKC;
[0109] - modifica los niveles de expresión de la expresión de colágeno IV y LOXL2 (homólogo de lisil oxidasa 2), preferiblemente disminuye la expresión de colágeno IV y LOXL2, en particular la expresión de LOXL2 en hígado y/o plasma;
[0110] - disminuye la fibrosis.
[0111] - Es capaz de disminuir el contenido de lípidos de lisofosfatidilcolina (LPC) en los tejidos y en la circulación, preferiblemente la LPC 18:2.
[0112] En un aspecto de la divulgación, el péptido de la presente divulgación comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de un segmento del dominio quinasa de una PKC (proteína quinasa C). La PKC se puede seleccionar de PKC convencional, PKC novedosa y PKC atípica. En particular, la PKC se puede seleccionar de la PKC convencional. Preferiblemente, la PKC se puede seleccionar del grupo que consiste en PKC α, βI, βII y γ. Más preferiblemente, la PKC se puede seleccionar del grupo que consiste en PKC α, βI y βII. Incluso más preferiblemente, la PKC es una PKC α, preferiblemente una PKC α humana, más preferiblemente una PKC α humana de SEQ ID NO: 1. El dominio quinasa de la αPKC humana se divulga en la SEQ ID NO: 2.
[0113] El segmento del dominio cinasa de una PKC tiene al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 25 residuos consecutivos del dominio cinasa de una PKC. En un aspecto, el segmento del dominio quinasa de una PKC tiene de 5 a 40 residuos consecutivos del dominio quinasa de una PKC (opcionalmente, de 5 a 30 o de 5 a 25 o de 7 a 25 o de 8 a 25 o de 9 a 25 o de 10 a 25 o de 11 a 25 o de 12 a 25).
[0114] El dominio de quinasa de PKC del que se selecciona el segmento tiene preferiblemente al menos un 40 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 2, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO: 2.
[0115] Preferiblemente, dicha secuencia de un segmento del dominio quinasa de una PKC corresponde a al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % de la secuencia del péptido. En un aspecto particular, la secuencia peptídica de acuerdo con la presente divulgación consiste en la secuencia de un segmento de SEQ ID NO: 1.
[0116] Cuando el segmento del dominio de quinasa de una PKC comprende una metionina y/o una prolina y/o una arginina, entonces la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo una o más sustituciones) para eliminar todos los residuos de prolina, y /o todos los residuos de metionina y/o todos los residuos de arginina. Por ejemplo, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de prolina. Como alternativa, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de metionina. De lo contrario, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de arginina. En un aspecto, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de prolina y metionina. En otro aspecto, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de prolina y arginina. En un aspecto adicional, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de metionina y arginina. Más preferiblemente, la secuencia puede modificarse (es decir, introduciendo sustitución o sustituciones) para eliminar todos los residuos de prolina, todos los residuos de metionina y todos los residuos de arginina.
[0117] Preferiblemente, el péptido comprende no más de 20, preferiblemente no más de 15, más preferiblemente no más de 10, modificaciones de aminoácidos seleccionadas de sustituciones, deleciones, adiciones y una mezcla de las mismas. En un aspecto particularmente preferido, el péptido puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos seleccionadas de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5, más preferiblemente 1, 2 o 3.
[0118] Por ejemplo, el péptido tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % de identidad con la secuencia de un segmento del dominio de quinasa PKC, preferiblemente de SEQ ID N.º 2. En un aspecto, la parte de la secuencia del péptido correspondiente a la SEQ ID NO: 2 tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidad con la secuencia de un segmento de la SEQ ID NO: 2.
[0119] Por ejemplo, la secuencia de un segmento del dominio de quinasa de la PKC puede pertenecer a las secuencias entre las posiciones 339 y 432 de SEQ ID NO: 1, entre las posiciones 434 y 544 de SEQ ID NO: 1, entre las posiciones 546 y 561 de SEQ ID NO: 1, entre las posiciones 563 y 565 de SEQ ID NO: 1, o entre las posiciones 568 y 595 de SEQ ID NO: 1.
[0120] En un aspecto de la divulgación, la secuencia de un segmento del dominio quinasa de PKC puede no incluir los siguientes residuos: G433, E545, S562, S566 de SEQ ID NO: 1.
[0121] En un aspecto, el péptido de la presente divulgación tiene una estructura de hélice alfa. Como se usa en el presente documento, los términos "hélice alfa", "hélice α", "hélice α de Pauling-Corey-Branson clásica" y "hélice 3.613" son equivalentes y se refieren entre sí. El término "hélice alfa" se refiere a un motivo común en la estructura secundaria de las proteínas que es una conformación (hélice) enrollada a la derecha o en espiral en la que cada grupo N-H de la columna vertebral dona un enlace de hidrógeno al grupo C=O de la columna vertebral del amino ácido localizado tres o cuatro residuos antes a lo largo de la secuencia de proteína. Una alfa hélice tiene un número promedio de residuos por giro de hélice de aproximadamente 3,6 residuos y 13 átomos están implicados en el anillo formado por el enlace de hidrógeno.
[0122] En un aspecto particular, el péptido de la presente divulgación tiene una estructura de hélice alfa y/o tiene una secuencia que es predictiva de una estructura de hélice alfa. Los métodos para determinar la estructura de un péptido son bien conocidos por el experto en la materia, tales como dicroísmo circular o RMN. Del mismo modo, los métodos para predecir una estructura de hélice alfa de un péptido son bien conocidos por el experto en la materia, tal como STRIDE (Frishman D., Argos P., Proteins, vol. 23, n.º 4, 1995, pág. 566-579); DEFINIR (Richards FM, Kundrot CE, Proteins, vol. 3, n.º 2, 1988, pág. 71-84); DSSP (Touw et al. Nucleic Acids Research 2015; 43: D364-D368; Kabsch y Sander. Biopolymers. 1983, 22, 2577-2637).
[0123] Las alfa hélices están ubicadas en el dominio cinasa en las siguientes ubicaciones: 372-377; 381-392; 425-432; 437-456; 466-468; 502-504; 507-510; 518-533; 543-552; 563-572; 577-579; 587-593 y 595-597 de SEQ ID NO: 1.
[0125] De acuerdo con, el péptido de la divulgación puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias:
[0127] - VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3);
[0128] - LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4);
[0129] - LDN;
[0130] - PDY;
[0131] - PEII (SEQ ID NO: 5);
[0132] - SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6);
[0133] - EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7);
[0134] - PAK;
[0135] - GERDVRE (SEQ ID NO: 8);
[0136] - AFF.
[0138] En un aspecto particular de la divulgación, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias:
[0140] - VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); y
[0141] - GERDVRE (SEQ ID NO: 8).
[0143] Opcionalmente, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); LDN; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); LDN; AFF; PDY; XDY; PEII (SEQ ID NO: 5); XEII (SEQ ID NO: 18); PAK; XAK; en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. Preferiblemente, X es un aminoácido favorable para una estructura secundaria de hélice α. Por ejemplo, X puede seleccionarse del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y. En un aspecto, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. En particular, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3); VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9); VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10); VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11); LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12); SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13); EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14); GERDVRE (SEQ ID NO: 8); GEXDVRE (SEQ ID NO: 15); GERDVXE (SEQ ID NO: 16); GEXDVXE (SEQ ID NO: 17); en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. Por ejemplo, el péptido puede comprender al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA o VECTTVEKEVLA (SEQ ID NO: 19).
[0145] Opcionalmente, el péptido comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustitución(es), deleción(es), adición(es) o una mezcla de las mismas, preferiblemente, 1, 2, 3, 4 o 5 sustitución(es), deleción(es), adición(es) o una mezcla de las mismas, más preferiblemente, 1, 2 o 3 sustitución(es).
[0147] Opcionalmente, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) con opcionalmente modificación(es) de un aminoácido seleccionado de 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es), y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LDN; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14) con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LDN; AFF; PDY; XDY; PEII (SEQ ID NO: 5); XEII (SEQ ID NO: 18); PAK; XAK; en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. Preferiblemente, X es un aminoácido favorable para una estructura secundaria de hélice α. Por ejemplo, X puede seleccionarse del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y.
[0149] En un aspecto de la divulgación, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) con opcionalmente modificación(es) de un aminoácido seleccionado de 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LMYHIQQV (SEQ ID NO: 4) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; LXYHIQQV (SEQ ID NO: 12) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; SVDWWAYGVLLYEMLA (SEQ ID NO: 6) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; SVDWWAYGVLLYEXLA (SEQ ID NO: 13) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; EDEDELFQSIME (SEQ ID NO: 7) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; EDEDELFQSIXE (SEQ ID NO: 14) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. Preferiblemente, X es un aminoácido favorable para una estructura secundaria de hélice α. Por ejemplo, X puede seleccionarse del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y.
[0151] En particular, el péptido de la divulgación puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA (SEQ ID NO: 3) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKRVLA (SEQ ID NO: 9) con opcionalmente modificación(es) de un aminoácido seleccionado de 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTMVEKXVLA (SEQ ID NO: 10) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; VECTXVEKXVLA (SEQ ID NO: 11) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVRE (SEQ ID NO: 8) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVRE (SEQ ID NO: 15) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GERDVXE (SEQ ID NO: 16) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; GEXDVXE (SEQ ID NO: 17) con opcionalmente 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos; en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R. Preferiblemente, X es un aminoácido favorable para una estructura secundaria de hélice α. Por ejemplo, X puede seleccionarse del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y.
[0153] Por ejemplo, el péptido puede comprender al menos una de las siguientes secuencias: VECTMVEKRVLA o VECTTVEKEVLA (SEQ ID NO: 19).
[0155] En un aspecto de la divulgación, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en al menos una de las siguientes secuencias:
[0157] a) VECTXVEKXVLALLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 20) en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R, preferiblemente, un aminoácido favorable a una estructura secundaria de hélice α, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, aún más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos;
[0158] b) VECTMVEKRVLALLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 21) en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R, preferiblemente, un aminoácido favorable a una estructura secundaria de hélice α, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, aún más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos;
[0159] c) VECTXVEKRVLALLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 22) en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R, preferiblemente, un aminoácido favorable a una estructura secundaria de hélice α, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, aún más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos;
[0160] d) VECTMVEKXVLALLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 23) en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R, preferiblemente, un aminoácido favorable a una estructura secundaria de hélice α, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, aún más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, con opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos;
[0162] y la secuencia de cualquier segmento de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 25 residuos consecutivos de cualquier secuencia a) a d).
[0164] En otro aspecto particular, el péptido de acuerdo con la presente divulgación se diseña o modifica para mantenerlo en una conformación alfa helicoidal. Como se conoce en la técnica, esto se puede lograr a través de una variedad de métodos, que incluyen la modificación de la secuencia de aminoácidos con sustitución de aminoácidos no críticos para los efectos biológicos, el uso de aminoácidos no naturales, la ciclación de péptidos y modificaciones al péptido columna vertebral o adición de enlaces químicos entre aminoácidos en la cadena peptídica. Tales modificaciones se pueden hacer a los péptidos, por ejemplo, para aumentar su estabilidad térmica y de proteasa.
[0166] En particular, el péptido de la presente divulgación se modifica mediante un entrecruzamiento químico. Por ejemplo, el péptido puede ser un péptido grapado. En un aspecto, el péptido de la presente divulgación está grapado. El término "péptido grapado" o "péptido cosido", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido modificado artificialmente en el que la estructura secundaria del péptido se estabiliza con uno o más enlaces cruzados moleculares artificiales (puentes) que conectan vueltas adyacentes de hélices α en el péptido. Los métodos para preparar péptidos grapados son bien conocidos en la técnica, por ejemplo en Verdine & Hilinski (2012, Methods Enzymol, 503, 3-33), WO10033617 y WO10011313.
[0168] En un aspecto, los entrecruzamientos del péptido grapado de la presente divulgación son entrecruzamientos i+3, y/o i+4, y/o i+7. En un péptido, un "entrecruzamiento i+3" es un entrecruzamiento entre un aminoácido, el aminoácido "i" y otro aminoácido presente a una distancia de 3 residuos de aminoácido del i aminoácido. En un péptido, un "entrecruzamiento i+4" es un entrecruzamiento entre un aminoácido, el aminoácido "i" y otro aminoácido presente a una distancia de 4 residuos de aminoácido del i aminoácido. En un péptido, un "entrecruzamiento i+7" es un entrecruzamiento entre un aminoácido, el aminoácido "i" y otro aminoácido presente a una distancia de 7 residuos de aminoácido del aminoácido i.
[0169] Para las secuencias más cortas, en particular aquellas que incluyen de tres a cuatro residuos, el entrecruzamiento es i+3 e i+4 y se introduce entre residuos que están fuera de esta secuencia. Cuando las secuencias son lo suficientemente largas, se prefiere el entrecruzamiento de i+7.
[0170] Para ilustrar este aspecto de la divulgación sobre un péptido particular, el péptido puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una de las siguientes secuencias:
[0171] VECTMXEKRVLAX (SEQ ID NO: 24)
[0172] VECTXXEKRVLAX (SEQ ID NO: 25)
[0173] VECTMXEKXVLAX (SEQ ID NO: 26)
[0174] VECTXXEKXVLAX (SEQ ID NO: 27)
[0175] VECTXXEKXVLAXLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 28)
[0176] VECTMXEKRVLAXLDKXXFLTQLHS (SEQ ID NO: 29)
[0177] VECTXXEKRVLAXLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 30)
[0178] VECTMXEKXVLAXLDKPPFLTQLHS (SEQ ID NO: 31)
[0179] en donde los residuos que están en negrita y subrayados X llevan el grapado y es cualquier derivado de aminoácido adecuado para el grapado; y
[0180] en donde X es cualquier aminoácido excepto M, P y R, preferiblemente, un aminoácido favorable a una estructura secundaria de hélice α, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en A, D, N, C, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, aún más preferiblemente A, D, N, G, Q, E, H, L, K, F, S, W e Y, y
[0181] teniendo la secuencia opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de las mismas, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos.
[0182] Por ejemplo, en el contexto de un grapado i+7, el primer X es un 2-(7-octenil)aminoácido (por ejemplo, una 2-(7-octenil)alanina o una 2-(7-octenil)arginina) y el segundo X es un 2-(4-pentenil)aminoácido (por ejemplo, una 2-(4-pentenil)alanina o una 2-(4-pentenil)serina). Combinaciones específicas puede ser 2-(7-octenil)alanina y 2-(4-pentenil)alanina; 2-(7-octenil)alanina y 2-(4-pentenil)serina; 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)alanina; o 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)serina.
[0183] En un aspecto particular de la divulgación, el péptido es
[0184] VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)
[0185] en donde R y S llevan el grapado, siendo preferiblemente 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)serina, respectivamente;
[0186] teniendo la secuencia opcionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es), deleción(es), adición(es) y una mezcla de las mismas, más preferiblemente, 1, 2 o 3 modificación(es) de un aminoácido seleccionado de sustitución(es) deleción(es), adición(es) y una mezcla de los mismos.
[0187] En un aspecto particular, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es un péptido cíclico. Como se usa en el presente documento, el término "péptido cíclico" o "péptido circular" son equivalentes y se refieren a un péptido en el que el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, o el extremo N-terminal y la cadena lateral de otro aminoácido, preferiblemente el aminoácido C-terminal, o el extremo C-terminal y la cadena lateral de otro aminoácido, preferiblemente el aminoácido N-terminal, o la cadena lateral de un aminoácido y la cadena lateral de otro aminoácido, preferiblemente el aminoácido N-terminal el aminoácido y el aminoácido C-terminal, están unidos con un enlace covalente que genera una estructura de anillo. Como se usa en el presente documento, el término "terminal N", "terminal amino", "terminal NH2", "extremo terminal N" y "terminal amina" son equivalentes y se refieren al grupo amina libre (-NH2) presente en el primer aminoácido del péptido. Como se usa en el presente documento, el término "terminal C", "terminal carboxilo", "terminal carboxi", "extremo terminal C" y "terminal COOH" son equivalentes y se refieren al grupo carboxilo libre (-COOH) presente en el último aminoácido del péptido.
[0188] En un aspecto, el péptido de acuerdo con la presente divulgación tiene una longitud de menos de 80 aminoácidos, más preferiblemente menos de 60 aminoácidos, aún preferiblemente menos de 40 aminoácidos, e incluso más preferiblemente menos de 30 aminoácidos. En un aspecto particular, el péptido de acuerdo con la presente divulgación tiene una longitud de menos de 25 aminoácidos. En otro aspecto particular, el péptido de acuerdo con la presente divulgación tiene una longitud de menos de 20 aminoácidos, preferiblemente de menos de 15 aminoácidos. Preferiblemente, el péptido tiene una longitud mínima mayor que 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos. Por ejemplo, el péptido tiene una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos; más preferiblemente de al menos 6 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos.
[0189] En un aspecto, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es capaz de interferir con la interacción ALMS1-PKC, en particular para disminuir o evitar la interacción entre ALMS1 y αPKC. En otras palabras, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es capaz de bloquear la interacción entre ALMS 1 y αPKC. Como alternativa, el péptido de acuerdo con la presente divulgación no es capaz de interferir con la interacción ALMS1-PKC, en particular para disminuir o evitar la interacción entre ALMS1 y αPKC. En otras palabras, el péptido de acuerdo con la presente divulgación no es capaz de bloquear la interacción entre ALMS1 y αPKC.
[0190] Para determinar el efecto de un péptido sobre la unión de αPKC a ALMS1, puede llevarse a cabo cualquier tecnología conocida por el experto en la materia, en particular cualquier método adecuado para determinar interacciones de proteínas. Por ejemplo, ALMS1 o αPKC nativos recombinantes o purificados pueden unirse a un barco de resonancia de plasmón superficial y la otra molécula fluir sobre el chip para evaluar la afinidad de unión, por ejemplo, en una máquina Biacore (General Electric, EE. UU.).
[0191] El efecto del uno o más péptidos sobre la unión de αPKC a ALMS1 se determina midiendo la unión de αPKC a ALMS1 en ausencia y en presencia del uno o más péptidos ensayados y comparando las uniones de αPKC a ALMS1.
[0192] En particular, se puede realizar un ensayo de inmunoprecipitación usando ALMS1 como cebo. El ensayo puede llevarse a cabo con células, en particular adipocitos, cultivadas en ausencia y/o presencia de insulina, preferiblemente en ausencia de insulina. Los péptidos a ensayar se añaden en el medio de cultivo. A continuación, se inmunodetecta la αPKC.
[0193] Por "disminuido", "disminuir" o "evitar" se pretende hacer referencia a una unión disminuida en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % en comparación con la unión medida en ausencia de la molécula ensayada en las mismas condiciones.
[0194] En un aspecto, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es capaz de disminuir la expresión de FATP2 en tejido adiposo.
[0195] FATP2 también se denomina miembro 2 de la familia 27 de transportadores de solutos (SLC27A2). Esta proteína se divulga en la base de datos UniProtKB con el número 014975. El gen se describe en la base de datos UniGene en Hs.11729. Pueden encontrarse secuencias de referencia en NCBI en NP_003636.2 y NM_003645.3 para la isoforma 1 y en NP_001153101.1 y NM_001159629.1 para la isoforma 2.
[0196] Por "disminución" o "disminución" se pretende hacer referencia a una expresión disminuida en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % en comparación con la expresión medida en ausencia del péptido en el mismas condiciones. La expresión puede medirse a nivel de proteína (por ejemplo, con anticuerpos) o a nivel de ARNm. La expresión se puede medir a nivel de proteína mediante cualquier método disponible, tal como inmunohistoquímica, transferencia de Western semicuantitativa o mediante matrices de proteínas o anticuerpos. Los anticuerpos dirigidos a FATP2 están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Origene, ref TA350424 o TA333990; o Santa Cruz Biotechnology, ref sc-393906.
[0197] La expresión también puede medirse a nivel de ARNm mediante cualquier método disponible. Preferiblemente, el nivel de expresión de FATP2 se determina midiendo la cantidad de los transcritos de ARNm mediante RT-PCR cuantitativa, RT-PCR cuantitativa en tiempo real, PCR con tecnología Nanostring o mediante tecnología de secuenciación de alto rendimiento tal como RNA-Seq o tecnologías de secuenciación que usan microfluidos sistemas. Más específicamente, la expresión se mide mediante el método especificado en la sección de Ejemplos. En un aspecto particular, el efecto sobre la expresión de FATP2 provocado por el péptido en el tejido adiposo es preferiblemente específico de FATP2. En este aspecto, el péptido puede tener ningún o menos efecto sobre la expresión de las otras FATP, es decir, FATP1, FATP3, FATP4, FATP5 y FATP6, en el tejido adiposo, en particular de un mamífero.
[0198] En un aspecto, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es capaz de disminuir la esteatosis hepática, la cantidad de grasa en el hígado, el tamaño de las gotitas de grasa en el hígado y/o el índice de hígado graso.
[0199] En un aspecto particular, el péptido de acuerdo con la presente divulgación presenta las siguientes características - no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
[0200] - adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa; y
[0201] - comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de un segmento del dominio quinasa de una PKC (proteína quinasa C).
[0202] y presentan además una, dos, tres, cuatro o todas las siguientes características:
[0203] - modifica los niveles de expresión de la expresión de FATP en tejido adiposo, preferiblemente disminuye la expresión de FATP2 en tejido adiposo;
[0204] - disminuye la esteatosis hepática, la cantidad de grasa en el hígado, el tamaño de las gotas de grasa en el hígado y/o el índice de hígado graso;
[0205] - tiene una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 4 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos;
[0206] - adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa;
[0207] - se modifica por un entrecruzamiento.
[0208] En un aspecto más específico, el péptido de acuerdo con la presente divulgación presenta las siguientes características:
[0209] - disminuye la esteatosis hepática, la cantidad de grasa en el hígado, el tamaño de las gotas de grasa en el hígado y/o el índice de hígado graso;
[0210] - no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
[0211] - tiene una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 4 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos;
[0212] - adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa.
[0213] En otro aspecto más específico, el péptido de acuerdo con la presente divulgación presenta las siguientes características:
[0214] - disminuye la expresión de FATP2 en tejido adiposo;
[0215] - no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
[0216] - tiene una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 40 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 4 aminoácidos y menos de 30 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 4 aminoácidos y menos de 25 aminoácidos;
[0217] - adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa.
[0218] En un aspecto, el péptido de acuerdo con la presente divulgación es capaz de disminuir la expresión de colágeno, en particular colágeno IV, y LOXL2. Preferiblemente, disminuye la expresión de LOXL2, en particular, la expresión de LOXL2 en hígado y/o plasma.
[0219] Puede ser capaz de disminuir el contenido de lípidos de lisofosfatidilcolina (LPC) en los tejidos y en la circulación, preferiblemente la LPC 18:2.
[0220] El péptido de acuerdo con la presente divulgación puede comprender adicionalmente un resto que facilita su captación o entrada celular, en particular un PTD (dominio de transducción de proteínas). PTD generalmente comprende una cierta secuencia de aminoácidos de 10 a 20 aminoácidos (Matsushita y Matsui, (2005), J Mol Med 83, 324-328; Vivès et al, Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). El PTD se compone principalmente de aminoácidos básicos como la arginina o la lisina, y los ejemplos representativos del PTD incluyen péptidos ricos en arginina como el poli R<8>(RRRRRRRR (SEQ ID NO: 33)) o (RRPRRRPRRPRRPRRP (SEQ ID NO: 34)), antenapedia o péptido de penetratina tal como (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 35)) o HIV-Tat (YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 36)).
[0221] El péptido de acuerdo con la presente divulgación puede estar hecho de aminoácidos naturales y/o aminoácidos no naturales. El término "aminoácidos no naturales" se define como un análogo o derivado de un aminoácido natural (es decir, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, lisina, arginina, ácido glutámico, glutamina, ácido aspártico, asparagina, histidina, tirosina, fenilalanina, triptófano, serina, prolina, treonina, cisteína, metionina). Presentan una cadena lateral modificada, p. más cortos, más largos o con diferentes grupos funcionales. Se contemplan los isómeros D y L, en particular porque los isómeros D no son sensibles a las proteasas. Además, también se contemplan modificaciones en algunos o todos los enlaces peptídicos para aumentar la resistencia a la proteólisis, en particular por (-CO-NH-) por (-CH<2>-NH-), (-NH-CO-), (-CH<2>-O-), (-CH<2>-S-), (-CH<2>-CH<2>-), (-CO-CH<2>-), (-CHOH-CH<2>-), (-N=N-) y/o (-CH=CH-). El péptido puede presentar un extremo carboxílico C terminal (-COO-) y uno amídico (-CONH<2>). El péptido también puede ser una secuencia D-retro-inversa de un péptido como se divulga en el presente documento. El terminal N puede modificarse, especialmente con un radical acetilo.
[0222] Opcionalmente, el péptido puede PEGilarse para aumentar su estabilidad. Además opcionalmente el péptido puede formularse en soluciones no acuosas de disolventes próticos tales como propilenglicol y polietilenglicol. El péptido también puede envasarse en formulación de liberación retardada de microesferas de poliácido láctico co-glicólico. Existen muchos sistemas de suministro de liberación mantenida y muchos de estos son apropiados para su uso en la presente divulgación. Por ejemplo, son adecuadas las composiciones de liberación lenta basadas en polímeros basadas en polímeros degradables tales como PLGA, polilactato o poliglicolato, al igual que las composiciones de depósito basadas en lípidos, tales como las descritas en los documentos WO2005/117830 y/o WO2006/075124. La formulación de agentes activos en formulaciones de depósito de polímero biodegradable está bien establecida y es bien conocida en la técnica, y los péptidos de la presente divulgación pueden formularse, por lo tanto, con estos usando "métodos" conocidos. Preferiblemente, la composición de la presente divulgación es capaz de liberar el péptido a una concentración funcional durante al menos 1 mes.
[0224] En un aspecto adicional, el péptido de acuerdo con la presente divulgación disminuye el fenómeno de la esteatosis y cualquier trastorno hepático asociado con NAFLD o NASH en el hígado. El fenómeno de la esteatosis en el hígado puede evaluarse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. En particular, se evalúa mediante el método descrito en la sección de ejemplos. Por ejemplo, la esteatosis puede medirse mediante formación de imágenes o biopsia. Los péptidos que disminuyen el fenómeno de la esteatosis en el hígado pueden cribarse convenientemente para usar cualquier tecnología conocida en la técnica. En particular, un método para evaluar la esteatosis en el hígado puede comprender cualquier método adecuado para medir la grasa en el hígado, el tamaño de las gotas de lípido en el hígado y/o medir el índice de hígado graso (Bedgni et al, BMC Gastroenterol. 2 de noviembre de 2006; 6:33).
[0226] Por "un péptido" se pretende hacer referencia a un péptido como se ha divulgado anteriormente o una combinación de diferentes péptidos como se ha divulgado anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar 2, 3, 4, 5 o 6 péptidos diferentes, preferiblemente 2 o 3, más preferiblemente 2.
[0228] Combinaciones
[0230] El o los péptidos de acuerdo con la presente divulgación se pueden usar en combinación con uno o más fármacos activos adicionales, por ejemplo, un fármaco antidiabético, un agente hipolipidémico, un agente contra la obesidad, un agente antihipertensivo, un anti- fármaco esteatósico, un agente antiinflamatorio y un agonista de los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas.
[0232] Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a:
[0234] - un péptido o una composición farmacéutica que comprende un péptido como se divulga en el presente documento para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad, en combinación con uno o más fármacos activos adicionales, en particular como se divulga en el presente documento; en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis, especialmente una fibrosis seleccionada del grupo que consiste en una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica e infarto de miocardio antiguo, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal y una fibrosis cutánea;
[0235] - una composición farmacéutica que comprende un péptido como se divulga en el presente documento y uno o más fármacos activos adicionales, en particular como se divulga en el presente documento, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), no alcohólica hígado graso (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis, especialmente una fibrosis seleccionada del grupo que consiste en una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica e infarto de miocardio antiguo, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal fibrosis, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal y una fibrosis cutánea;
[0236] - un producto, preparación combinada o kit que comprende un péptido de acuerdo con la presente divulgación y uno o más fármacos activos adicionales, en particular como se divulga en el presente documento, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis, especialmente una fibrosis seleccionada del grupo que consiste de una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica e infarto de miocardio antiguo, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal y una fibrosis de la piel.
[0238] En particular, se puede usar una cantidad efectiva terapéutica o subterapéutica de uno o más fármacos activos adicionales. Por "subterapéutico" se pretende hacer referencia a una cantidad que puede ser, por ejemplo, el 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 % de la dosis terapéutica convencional (en particular para la misma indicación y/o la misma vía de administración y/o frecuencia de administración).
[0240] El fármaco antidiabético puede ser, por ejemplo, insulina, derivados de insulina y miméticos; secretagogos de insulina tales como las sulfonilureas (por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida); gliflozinas tales como emplagliflozina y dapagliflozina; gliburida y Amaryl; liraglutida (NN2211); ligandos de receptor de sulfonilurea insulinotrópicos tales como meglitinidas, p. ej. nateglinida y repaglinida; tiazolidinedionas (por ejemplo, rosiglitazona (AVANDIA), troglitazona (REZULIN), pioglitazona (ACTOS), balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazona que potencian la acción de la insulina (por ejemplo, mediante sensibilización a la insulina), promoviendo así la utilización de glucosa en tejidos periféricos; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa-IB (PTP-1B) tales como PTP-112; inhibidores de la proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP) tales como torcetrapib, inhibidores de GSK3 (glucógeno sintasa quinasa-3) tales como SB-517955, SB-4195052, SB-216763, NN-57-05441 y NN-57-05445; ligandos de RXR tales como GW-0791 y AGN-194204; inhibidores del cotransportador de glucosa dependiente de sodio tales como T-1095 o canagliflozina; inhibidores de glucógeno fosforilasa A tales como BAY R3401; biguanidas tales como metformina y otros agentes que actúan promoviendo la utilización de glucosa, reduciendo la producción de glucosa hepática y/o disminuyendo la producción de glucosa intestinal; inhibidores de alfa-glucosidasa tales como acarbosa y miglitol y otros agentes que ralentizan la digestión de carbohidratos y, por consiguiente, la absorción desde el intestino y reducen la hiperglucemia posprandial; GLP-1 (péptido similar al glucagón-1), análogos de GLP-1 tales como exendina-4 y miméticos de GLP-1; e inhibidores de DPPIV (dipeptidilpeptidasa IV) tales como vildagliptina. También puede ser un fármaco antidiabético descrito en Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633, figuras 1 a 7. El fármaco antidiabético también puede incluir una molécula que evita la unión de αPKC y ALMS 1, como las divulgadas en el documento WO 2015/114062.
[0242] El agente hipolipemiante puede ser, por ejemplo, inhibidores de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, p. ej. lovastatina, pitavastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, atorvastatina, rosuvastatina y rivastatina; inhibidores de escualeno sintasa; ligandos de FXR (receptor X de farnesoides) y LXR (receptor X hepático) tales como ácido obeticólico; secuenciadores de ácidos biliares, tales como colestiramina y colesevelam; fibratos; ácido nicotínico y aspirina; aramchol, un agonista del receptor acoplado a proteína G transmembrana (TGR) 5.
[0244] El agente antiobesidad puede ser, por ejemplo, orlistat, rimonabant, fentermina, topiramato, qnexa y locaserina.
[0245] El agente antihipertensivo puede ser, por ejemplo, diuréticos de asa tales como ácido etacrínico, furosemida y torasemida; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) tales como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perinodopril, quinapril, ramipril y trandolapril; inhibidores de la bomba de membrana Na-K-ATPasa tales como digoxina; inhibidores de la endopeptidasa neutra (NEP) tales como sacubitril; inhibidores de ACE/NEP tales como omapatrilat, sampatrilat y fasidotril; antagonistas de la angiotensina II tales como candesartán, eprosartán, irbesartán, losartán, telmisartán y valsartán, en particular valsartán; combinaciones de inhibidores de NEP y antagonistas de angiotensina II tales como sacubitril y valsartán (es decir, Entresto); inhibidores de renina tales como ditekiren, zankiren, terlakiren, aliskiren, RO 66-1132 y RO-66-1168; bloqueadores de receptores beta-adrenérgicos tales como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, propranolol, sotalol y timolol; agentes inotrópicos tales como digoxina, dobutamina y milrinona; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipina, bepridilo, diltiazem, felodipina, nicardipina, nimodipina, nifedipina, nisoldipina y verapamilo; antagonistas del receptor de aldosterona; e inhibidores de aldosterona sintasa.
[0247] El agonista de los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas puede ser, por ejemplo, fenofibrato, pioglitazona, rosiglitazona, tesaglitazar, BMS-298585, L-796449, los compuestos descritos específicamente en la solicitud de patente WO 2004/103995 es decir, los compuestos de los ejemplos 1 a 35 o los compuestos enumerados específicamente en la reivindicación 21, o los compuestos descritos específicamente en la solicitud de patente WO 03/043985 es decir, compuestos de los ejemplos 1 a 7 o compuestos enumerados específicamente en la reivindicación 19 y especialmente (R)-1-{4-[5-metil-2-(4-trifluorometil-fenil)-oxazol-4-ilmetoxi]-bencenosulfonil}- 2,3-dihidro-1H-indol-2-carboxílico o una sal del mismo.
[0249] Otros fármacos de interés pueden ser, por ejemplo, cenicriviroc, simtuzumab, selonsertib, emricasan. En un aspecto particular, el uno o más fármacos activos adicionales usados en combinación con el péptido pueden seleccionarse entre: un análogo de GLP-1 tal como liraglutida, ácido obeticólico, una gliflozina, simtuzumab (GS 6624), cenicriviroc, aramchol, una galectina 3 tal como GR-MD-02, un agonista de TGR5 y un agonista dual de FXR/TGR5 tal como INT-777 o INT-767, y emricasan.
[0251] El agente antiinflamatorio puede ser cualquier fármaco conocido por el experto, tal como agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo ácido salicílico, ibuprofeno en sus diversas formas y naproxeno en sus diversas formas, un antiinflamatorio esteroideo tal como corticosteroides, un anticuerpo anti-TNF alfa antiinflamatorio y combinaciones de los mismos. La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc.
[0252] Las composiciones farmacéuticas o terapéuticas de la presente divulgación pueden formularse para una administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares. El péptido usado en la composición farmacéutica de la presente divulgación está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz.
[0253] La composición farmacéutica que comprende el péptido se formula de acuerdo con práctica farmacéutica estándar (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y JC Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) conocido por un experto en la materia.
[0254] En un aspecto, la presente divulgación proporciona una formulación estable para inyección parenteral de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación que comprende un péptido o una sal del mismo, en donde el péptido se ha secado y luego se reconstituye en un disolvente antes de su uso. El péptido (o, en aspectos donde la formulación comprende dos o más péptidos, cada uno de los péptidos) se mezcla con un tampón no volátil y se seca hasta un polvo de péptido seco. Los tampones adecuados incluyen, pero sin limitación, tampones de glicina, tampones de citrato, tampones de fosfato y mezclas de los mismos. En un aspecto, el tampón es un tampón de glicina. En otro aspecto, el tampón es una mezcla de tampón citrato y tampón fosfato. En algunos aspectos, en donde la formulación comprende dos o más péptidos, el primer y segundo tampón son los mismos. En algunos aspectos, en donde la formulación comprende dos o más péptidos, el primer y el segundo tampón son diferentes. Como alternativa, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede almacenarse en un estado acuoso. La solución puede contener, si se desea, aditivos o excipientes adicionales, que deben ser compatibles con el principio activo y, si no se eliminan durante la etapa de liofilización, también deben ser compatibles con la vía de administración. Para la administración parenteral, la composición puede inyectarse por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Preferiblemente, la composición o péptido se inyecta o se inyectará por vía subcutánea, en particular en el tejido graso.
[0255] Preferiblemente puede colocarse con una minibomba osmótica u otro dispositivo de suministro controlado implantado en el cuerpo. Preferiblemente, puede mezclarse con otros compuestos para hacer una formulación de liberación lenta de depósito. Una vía de administración preferida es la inyección subcutánea, por ejemplo, mediante el uso de un dispositivo de dispensación desechable o de múltiples unidades, similar a una pluma de insulina. El péptido también puede administrarse mediante un dispositivo que permite la administración subcutánea sin ninguna aguja, un sistema no invasivo.
[0256] Además, el péptido puede administrarse usando cualquier sistema de administración de fármacos disponible. En particular, se contempla el uso de la enzima hialuronidasa humana recombinante, rHuPH20, para posibilitar y optimizar la administración subcutánea de fármacos para terapias coadministradas apropiadas.
[0257] Con la tecnología, algunos productos biológicos y compuestos que se administran por vía intravenosa pueden administrarse por vía subcutánea o debajo de la piel, proporcionando potencialmente una mejor experiencia para los pacientes y aumentando la eficiencia del sistema de salud al reducir el tiempo de administración, el dolor de inyección y las reacciones en el sitio de infusión.
[0258] En un aspecto, el péptido de la presente divulgación puede mezclarse con otros compuestos para hacer una formulación de liberación lenta de depósito. Esta entonces puede inyectarse por vía subcutánea para formar un depósito de liberación lenta.
[0259] Para la administración oral, la composición se puede formular en formas de dosificación oral convencionales tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos y preparaciones líquidas tales como jarabes, elixires y gotas concentradas. Se pueden usar portadores o diluyentes sólidos no tóxicos que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, magnesio, carbonato y similares. Para comprimidos formados por compresión, también son necesarios aglutinantes, que son agentes que imparten cualidades cohesivas con los materiales en polvo. Por ejemplo, pueden usarse como aglutinantes almidón, gelatina, azúcares tales como lactosa o dextrosa y gomas naturales o sintéticas. También son necesarios disgregantes en los comprimidos para facilitar la disolución del comprimido. Los desintegrantes incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polímeros reticulados. Además, también se incluyen lubricantes y deslizantes en los comprimidos para evitar la adhesión del material del comprimido a las superficies en el proceso de fabricación y para mejorar las características de flujo del material en polvo durante la fabricación. El dióxido de silicio coloidal se usa más comúnmente como emoliente y los compuestos tales como el talco o los ácidos esteáricos se usan más comúnmente como lubricantes.
[0260] Para la administración transdérmica, la composición puede formularse en forma de pomada, crema o gel y podrían usarse penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la permeación, tales como dimetilsulfóxido, dimetilacetamida y dimetilformamida.
[0261] Para la administración transmucosa, se pueden usar aerosoles nasales, inhalación intrapulmonar, supositorios rectales o vaginales. En un aspecto, la composición puede administrarse por vía intrapulmonar usando una formulación de polvo seco o líquida administrada usando un dispositivo de administración de fármaco intrapulmonar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. El compuesto activo se puede incorporar en cualquiera de las bases de supositorio conocidas mediante métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales bases incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles (carbowaxes), monoestearato de polietilensorbitán y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusión o la velocidad de disolución.
[0262] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse para liberar el fármaco activo de manera sustancialmente inmediata tras la administración o en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminado después de la administración.
[0263] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender uno o más péptidos de la presente divulgación asociados con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes y/o vehículos se eligen de acuerdo con la forma de administración como se describe anteriormente.
[0264] En un aspecto particular, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación comprende entre 0,01 ng y 10 g del péptido de la presente divulgación. En un aspecto, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación comprende entre 0,1 ng y 1 g del péptido de la presente divulgación.
[0265] Aunque tienen diferentes significados, los términos "que comprende", "que tiene", "que consiste en" y "que contiene" pueden sustituirse uno por el otro en toda la solicitud.
[0266] Aspectos y ventajas adicionales de la presente divulgación se describirán en los siguientes ejemplos, que deberían considerarse como ilustrativos y no limitantes.
[0267] Ejemplos
[0268] Ejemplo 1: Efecto del tratamiento PATAD dirigido al tejido adiposo sobre los niveles de expresión de transportadores y receptores de ácidos grasos clave 11 días después de la inyección
[0269] Como la inyección subcutánea de PATAD se refiere a la restauración de la absorción de glucosa en el tejido adiposo, los inventores midieron los niveles de expresión de las 6 isoformas para las FATP (1-6) (proteína de transporte de ácidos grasos 1-6) y las 4 isoformas de la FFAR (Free Fatty Acid Receptor) para evaluar cualquier efecto sobre estos genes.
[0270] Curiosamente, las inyecciones de PATAD indujeron una disminución muy específica y drástica en FAPT2 en el tejido adiposo, lo que permite correlacionar el efecto del tratamiento con PATAD directamente en la caída de expresión de FATP2 (Figura 1A). Dado que se demostró anteriormente que el péptido PATAD no circula en el cuerpo, que su efecto se limitaba al tejido adiposo y también en función de su mecanismo de acción que es interferir con la interacción ALMS1-PKC, la acción novedosa de PATAD en el tejido adiposo es para disminuir FATP2. Los niveles de expresión de los transportadores y receptores en los otros dos órganos principales pueden estar relacionados con el efecto indirecto (Figura 1B-C).
[0271] Ejemplo 2: El péptido ADPIF es más activo que el péptido PATAD en la disminución de los niveles de expresión de FATP2 en el tejido adiposo
[0272] Se inyectó a los ratones una dosis única de péptido de aleatorización o PATAD o ADPIF. 11 días después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se tomaron muestras de tejido adiposo para la extracción de ARN seguido de PCR en tiempo real. El nivel de expresión de FATP2 es similar al control magro mientras que PATAD, aunque eficaz para reducir los niveles de expresión de FATP2 en el tejido adiposo, es menos eficaz que ADPIF (Figura 2A).
[0273] Ejemplo 3: ADPIF es eficaz para aumentar los niveles circulantes de GLP-1 11 días después de la inyección de tejido adiposo.
[0274] Se inyectó a los ratones una dosis única de péptido de aleatorización o PATAD o ADPIF. 11 días después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se obtuvo plasma y se usó para la determinación de GLP1 circulante de ratones con el tratamiento indicado. Tanto PATAD como ADPIF restauraron altos niveles circulantes de GLP1, induciendo ADPIF un aumento mayor que PATAD (Figura 2B).
[0275] Ejemplo 4: Efecto protector sobre el hígado después de 3 meses de una única inyección de tejido adiposo dirigida al tratamiento con PATAD o ADPIF
[0276] Los ratones presentados se sacrificaron y se tomaron muestras de su plasma y órganos para su análisis. La relación de peso de hígado a peso corporal frente a edad se determinó y se presentó en la Figura 3B. El tamaño del hígado en respuesta al tratamiento con PATAD disminuyó claramente en comparación con los controles que eran controles masculinos diabéticos DIO que recibieron solo el vehículo. La criosección de los hígados se tiñó a continuación con Adipored y DAPI para detectar el nivel de gotitas de lípidos. Los ratones tratados con PATAD o ADPIF mostraron claramente una disminución en el tamaño de las gotas de lípido hepático (Figura 3A, panel derecho; Figura 7, panel derecho). La función hepática se evalúa mediante dos biomarcadores potentes relacionados con el hígado, en concreto (AST (aspartato aminotransferasa) y ALT (alanina aminotransferasa)), cuyos niveles aumentan proporcionalmente con el daño hepático. Curiosamente, los ratones tratados con PATAD o ADPIF (después de un período de 3 meses con una única inyección subcutánea de péptido) muestran una disminución dramática en estos dos biomarcadores hepáticos robustos (Figura 3C) que indican un efecto protector de PATAD y ADPIF en el hígado relacionado con un disminución del fenómeno de la esteatosis. PATAD y ADPIF son ambos eficaces para reducir los niveles circulantes de AST y ALT. ADPIF es más activo en la reducción de los niveles circulantes de ALT, lo que se traduce en una mejora de la lesión de las células hepáticas.
[0277] Ejemplo 5: El péptido ADPIF es más activo que el péptido PATAD en la prevención de la hiperglucemia.
[0278] Estos son resultados obtenidos de una serie de pruebas de tolerancia a la glucosa (GTT) y datos de dos puntos de tiempo, a saber, 30 minutos y 120 minutos, se usaron para generar estas curvas tanto para el control como para la obesidad inducida por dieta tratada con PATAD (DIO) y el macho diabético de tipo salvaje C57 /B6 ratones (control). Estos datos muestran que el ADPIF basado en péptidos tiene un mejor efecto en la prueba de tolerancia a la glucosa que el péptido PATAD (Figura 4).
[0279] Ejemplo 6. El péptido ADPIF es más activo que los péptidos PATAD para reducir los niveles hepáticos de las proteínas LOXL2 y FABP4
[0280] LOXL2 es la enzima que promueve el desarrollo de lesiones fibróticas al favorecer la polimerización de colágeno y FABP4 es una proteína implicada en el metabolismo de lípidos cuyo nivel aumenta con el aumento de la deposición de lípidos en el hígado. 3 meses después del tratamiento con una inyección única, se usaron extractos de hígado de los ratones con los ratones indicados y estos datos muestran que el péptido ADPIF es más potente que PATAD para disminuir los niveles hepáticos de LOXL2, disminuyendo así la capacidad de generar más lesiones fibróticas en el hígado y en la disminución de los niveles de FABP4, lo que se correlaciona con una disminución en los niveles de triglicéridos hepáticos (Figura 5).
[0281] Ejemplo 7: Perfil de lípidos circulantes en respuesta al tratamiento con ADPIF en el tejido adiposo
[0282] La inyección de tejido adiposo de ADPIF ha demostrado ser inesperadamente protectora del hígado en relación con una disminución específica en los niveles de expresión de FATP2 en el tejido adiposo y un perfil asociado de las FATP y FFAR en los músculos y el hígado. Ya que estos cambios impactan en la población circulante de los diferentes lípidos. Las ceramidas son un grupo de lípidos activos biológicos que se sabe que están implicados en NAFLD. Medimos y determinamos el efecto de las inyecciones de ADPIF en el perfil de ceramidas después de 3 inyecciones de ADPIF a una frecuencia de una inyección por semana en el tejido adiposo subcutáneo. ADPIF induce globalmente una disminución en el contenido de ceramidas hepáticas con variaciones entre las diferentes ceramidas (Figura 6).
[0283] Ejemplo 8: ADPIF es eficaz para disminuir el tamaño de las gotas de lípidos en el hígado
[0284] En la Figura 7, las criosecciones de hígados de ratones tratados (con el mismo regimiento de dosificación que en el ejemplo 6) se tiñeron para gotitas de lípidos que evidenciaron una disminución global en los tamaños de las gotitas de lípidos en el hígado después del tratamiento con ADPIF, lo que indica una disminución en la acumulación de lípidos en el hígado.
[0285] Ejemplo 9: El tratamiento con ADPIF en el tejido adiposo reprimió sorprendentemente los niveles de expresión de lipogénesis clave y enzimas moduladoras en el hígado
[0286] ACC y FASN forman parte de la vía de lipogénesis mediante la cual se sintetizan ácidos grasos en el hígado, junto con el Srebf1, que es una proteína clave implicada en el manejo de lípidos. Después del tratamiento con ADPIF, estas enzimas se reprimieron, lo que indica que la acción de ADPIF después de su administración en el tejido adiposo es capaz de bloquear la lipogénesis de novo en el hígado (Figura 8).
[0287] Ejemplos 10: El tratamiento con ADPIF en el tejido adiposo bloquea la progresión de la fibrosis hepática en el modelo de ratón DIO-NASH
[0288] Se usaron criosecciones de hígado de ratones tratados con ADPIF (igual que en el ejemplo 8) para la inmunodetección de LOXL2 o Colágeno IV y mostraron que ADPIF era eficaz para prevenir la progresión de marcadores fibróticos (Figura 9A). Los niveles de LOXL2 secretada en el plasma también se redujeron significativamente (Figura 9B). Como resultado de la disminución de LOXL2 y la disminución de depósitos de colágeno, las lesiones fibróticas detectadas fácilmente en el hígado DIO-NASH no tratado (Figura 9C, panel izquierdo) en microscopía electrónica transmitida ya no se detectaron en hígados tratados con ADPIF.
[0289] Ejemplo 11. ADPIF reduce selectivamente las lisofosfatidilcolinas dirigidas (LPC) en el hígado y otros tejidos Los contenidos de lípidos para las LPC se analizaron 3 meses después de la inyección de ADPIF en el tejido adiposo para ver cómo ADPIF podría afectar los niveles de LPC, sustrato conocido para la autotaxina, una enzima secretada clave que desempeña un papel en la progresión de la fibrosis. Sorprendentemente, ADPIF fue eficaz en la reducción de LPCS selectiva, en los órganos probados con LPC18:2 presentando la reducción más prominente en el páncreas, tejido adiposo e hígado (Figura 10).
[0290] Ejemplo 12. El péptido ADPIF es eficaz para prevenir los depósitos de colágeno IV en el riñón, por lo tanto, protege el riñón de la fibrosis
[0291] Criosecciones de riñones de ratones tratados con vehículo DIO y ratones tratados con ADPIF DIO 3 meses después del tratamiento, se inmunotiñeron para la deposición de collage IV y la unión estrecha con un anticuerpo ZO-1 para evaluar el efecto del péptido ADPIF en la progresión de la fibrosis en otros tejidos blandos. Sorprendentemente, se observó una clara reducción de colágeno IV en los riñones de los ratones tratados con ADPIF en comparación con los ratones tratados con vehículo, lo que indica que el péptido ADPIF también fue eficaz para proteger el riñón de la fibrosis (Figura 11).
[0292] Materiales y métodos
[0293] Cría de ratones
[0294] Para este estudio, los ratones estaban en un fondo genético C57/BL6. Todos los animales se alojaron en una instalación con temperatura y humedad controladas, con un ciclo de 12 h-luz/12 h-oscuridad alimentados durante toda la fase. Los ratones se alimentarán con una dieta alta en grasas al 60 % de Research Diets (D12492) y agua del grifo se proporcionará ad libitum. Los ratones se alimentaron y se analizaron regularmente para la prueba de tolerancia a la glucosa para su tolerancia a la glucosa y, una vez que eran intolerantes a la glucosa, se usaron para el tratamiento.
[0295] Secuencias peptídicas y síntesis
[0296] PATAD es el nombre dado a una serie de péptidos derivados de la isoforma alfa de PKC que son biológicamente activos con la capacidad de desencadenar la absorción de glucosa específicamente en el tejido adiposo.
[0297] Secuencia peptídica grapada A: VE CTM -[2 - (4-pentenil) alanina]-EK RVL A-[2 - (4-pentenil) alanina]-L DKP PFL TQL HS (SEQ ID NO: 49)
[0298] Secuencia peptídica grapada B: S-[2 - (4-pentenil) alanina]- CKG LMT -[2 - (4-pentenil) alanina]-HP AKR LGC GPE G (SEQ ID NO: 50)
[0299] Secuencia peptídica aleatorizada A: KEVPVDTCHLTLMLLFRSVALKQHPE (SEQ ID NO: 51)
[0300] Secuencia peptídica aleatorizada B: SAECKGRHGTPPGKLMICKGL (SEQ ID NO: 22) ADPIF es el nombre dado a una serie de péptidos derivados de la isoforma alfa de PKC derivada del péptido PATAD y que presentan dos mutaciones específicas.
[0301] Secuencia de ADPIF de péptido grapado: VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)
[0302] en donde R y S llevan el grapado, siendo preferiblemente 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)serina, respectivamente.
[0303] Los péptidos grapados y aleatorizados se adquirieron de CPC, EE. UU. con una pureza del 95 %. Todos los péptidos se disolvieron inicialmente en DMSO y luego se diluyeron en solución salina estéril a una concentración de 10 ng/µl. Se mezclaron 2,5 µL de cada péptido (grapado o revuelto) y luego se inyectaron directamente en el tejido adiposo subcutáneo en cada ratón.
[0304] Régimen de dosificación de los péptidos
[0305] Los ratones de control se inyectaron con los controles Scramble o con vehículo (solución salina al 0,9 %) (grasa retroperitoneal/inyección subcutánea: una inyección en D0 y se realizaron las pruebas indicadas. A los ratones tratados se les inyectó la mezcla de dos péptidos grapados de PATAD y con el péptido grapado de ADPIF siguiendo el mismo procedimiento con los péptidos de PATAD y con el elemento de prueba de péptido de ADPIF (grasa retroperitoneal/inyección subcutánea: una inyección en D0 y se realizaron las pruebas indicadas). En una segunda serie de experimentos, se inyectó ADPIF una vez por semana a una dosis de 25 ug por ratón en el tejido adiposo subcutáneo en el área retroperitoneal durante 3 semanas y los ratones se sacrificaron una semana después de la última inyección. Los ratones se sacrificaron y las muestras de tejido y plasma se aislaron y se mantuvieron a -80 °C para realizar más pruebas.
[0306] Extracción de ARN, síntesis de ADNc, q-PCR y Taqman
[0307] El ARN total se preparó a partir de los diferentes tejidos y células usando un kit RiboPure<™>(n.º de catálogo: AM1924; Ambion) seguido de un tratamiento con ADNasa con el TURBO DNA-free<™>(n.º de catálogo: AM 1907; Ambion). La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel y la concentración de ARN mediante Eppendorf Biophotometer Plus con la cHellma<®>Tray Cell (n.º de catálogo: 105.810-uvs; Hellma). La transcripción inversa de 1 µg de ARN total a ADNc se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc BioRadiScript<™>(n.º de catálogo: 170-8891; BioRad). La amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó en un sistema en tiempo real BioRad CFX96 TM utilizando el iQ<™>SYBR<®>Green Supermix (n.º de catálogo: 170-8886; BioRAd) y conjuntos de cebadores optimizados para dianas ensayadas para PCR instantánea basada en SYBR Green para la PCR instantánea. El análisis Taqman se llevó a cabo con el ensayo de gen específico con la Mezcla maestra avanzada rápida Taqman<®>(n.º de catálogo: 4444557; Applied Biosystems). La expresión de veces normalizada del gen objetivo se calculó usando el umbral de ciclo comparativo (C<t>) método normalizando el ARNm objetivo C<t>a los de GAPDH usando el software CFX Manager versión 1.5 y se verificó usando el programa Lin-Reg (Ruijter et al., 2009). Todos los pares de cebadores se adquirieron de Biorad o de Quantitect.
[0308] Las especificaciones de la imprimación se encuentran en la siguiente tabla:
[0310]
[0312] Los cebadores de Quantitect fueron: Srebf1: QT00167055, Cuenta: QT01554441 y para Fasn: QT00149240.
[0313] Tinción AdipoRed de secciones de hígado
[0314] Los hígados se aislaron y lavaron brevemente en tampón PBS (pH 7,4). después de pesar el hígado seco, para la relación de peso de hígado a cuerpo, una muestra cortada del hígado se colocó en paraformaldehído al 4% (en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2) durante 15 min, se lavó en PBS y se incubó en colorante AdipoRed (1/25; Lonza, Suiza) con DAPI 30 µM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 15 minutos. Después de 3 lavados con PBS, las muestras se montaron en portaobjetos y se tomaron fotografías usando un microscopio Zeiss.
[0315] Experimentos de inmunofluorescencia
[0316] Para los experimentos de inmunofluorescencia, el hígado y los riñones recién muestreados se incluyeron en el Optimal Cutting Temperature Compound<™>(OCT<™>, n.º de catálogo 4583, Tissue-Tek<®>PTU<™>Sakura<®>Finetek, Torrance, California, EE. UU.) y se cortaron criosecciones de 7 µm con Cryostat Leica CM1950. Las criosecciones se lavaron con PBS 1x y se fijaron en una solución de formaldehído al 4 % durante 15 min (n.º de catálogo: F555-4L, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, EE. UU.) y luego se permeabilizó con SDS-PBS al 0,02 % durante 30 segundos. La solución de bloqueo fue albúmina de suero bovino (BSA) al 5 % en PBS. Los anticuerpos primarios se diluyeron en solución de bloqueo y se incubaron durante la noche y los anticuerpos secundarios indicados se diluyeron en PBS durante 30 minutos. Los núcleos se contratiñeron con Hoechst (n.º de catálogo: D1306, Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.). A continuación, los portaobjetos se montaron con Medio de montaje Vectashield<®>(n.º de catálogo: H-1000, Vector Laboratories, Burlingame, California, EE. UU.). Las imágenes se adquirieron y analizaron con el microscopio Zeiss Imager.Z2 equipado con el software Zeiss AxioVision o Zeiss ZEN 2012 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Alemania). Se usaron el anticuerpo anti-colágeno IV, ab6586 de Abcam y el anticuerpo LOXL2, GTX105085 de GeneTex.
[0317] Para la formación de imágenes de microscopía electrónica en los extractos de hígado, las muestras se sumergieron en glutaraldehído (2,5 %) y paraformaldehído (2,5 %) en tampón de cacodilato (0,1 M, pH 7,4). Las muestras se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1 %, se deshidrataron con alcohol graduado (50, 70, 90 y 100 %) y óxido de propileno durante 30 minutos cada una, y se incluyeron en Epon 812. Se cortaron secciones semifinas a 2 µm en un ultra microtomo (Leica Ultracut UCT) y se cortaron secciones ultrafinas a 70 nm y se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron a 70 kv con un microscopio electrónico Morgagni 268D. Las imágenes fueron capturadas digitalmente por la cámara Mega View III (Soft Imaging System).
[0318] Ensayo bioquímico
[0319] Para la determinación de plasma
[0320] Mediciones de ELISA de AST y ALT
[0321] Se usaron muestras de plasma de los ratones indicados para determinar el contenido de plasma de AST (aspartato aminotransferasa) o ASL (alanina aminotransferasa), ambos indicadores robustos de daño hepático se midieron usando kits de ELISA adquiridos comercialmente. Estos parámetros se determinaron de acuerdo con el procedimiento del fabricante.
[0322] - SEB214Mu (96 pruebas): Kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para aspartato aminotransferasa (AST), Cloud Clone Corp
[0323] - SEA207Mu (96 pruebas): Kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para alanina aminotransferasa (ALT), Cloud Clone Corp
[0324] Para las mediciones de LOXL2 y GLP-1, los dos kits disponibles comercialmente
[0325] Lysyl Oxydase Like Protein 2 (LOXL2), kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, Mus musculus, SEF552Mu, Cloud Clone Corp
[0326] RayBio Human/Mouse/Rat GLP-1 Enzyme Immunoassay Kit, EIA-GLP1, RayBiotech se utilizaron con los procedimientos indicados del fabricante.
[0327] Para las mediciones en los extractos de hígado, se usó el mismo kit para LOXL2 y para FABP4, el kit comercial usado fue el kit Elisa para Fatty Acid Binding Protein 4, Adipocyte (FABP4), SEB693Mu, Cloud Clone Corp.
[0328] Para la composición lipídica en los diferentes tejidos y plasma, todas las muestras se congelaron instantáneamente en el momento del muestreo, inmediatamente después del sacrificio, y se enviaron a la instalación de núcleo lipidómico de Dijon (Plateforme de Lipidomique-uBorgogne INSERM UMR866/Labex LipSTIC).
[0329] Ejemplo 13. Estudio de eficacia in vivo del péptido ADPIF en el modelo STAM de esteatohepatitis no alcohólica Materiales y métodos
[0330] Sustancias de prueba
[0331] El péptido era el péptido ADPIF como se ha descrito anteriormente. La solución de dosificación se preparó de acuerdo con las instrucciones de formulación.
[0332] Inducción de NASH
[0333] Se indujo NASH en 12 ratones macho mediante una única inyección subcutánea de 200 µg de solución de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, EE. UU.) 2 días después del nacimiento y alimentación con dieta alta en grasas (HFD, 57 kcal% grasa, Cat# HFD32, CLEA Japón, Inc., Japón) después de 4 semanas de edad.
[0334] Vía de administración del fármaco
[0335] El péptido se administró por vía subcutánea en el tejido adiposo en un volumen de 100 ml por ratón.
[0336] Dosis de tratamiento
[0337] El péptido se administró a una dosis de 25 microgramos (µg) por ratón una vez a la semana.
[0338] Animales
[0339] Se obtuvieron ratones C57BL/6 (hembra embarazada de 14 días) de Japan SLC, Inc. (Japón). Todos los animales usados en el estudio se alojaron y cuidaron de acuerdo con las Directrices de la Sociedad Farmacológica Japonesa para el Uso de Animales.
[0340] Los animales se mantuvieron en una instalación SPF en condiciones controladas de temperatura (23 ± 2 °C), humedad (45 ± 10 %), iluminación (ciclos de luz artificial y oscuridad de 12 horas; luces desde las 8:00 hasta las 20:00) e intercambio de aire. Se mantuvo una alta presión en la sala experimental para evitar la contaminación de la instalación.
[0341] Los animales se alojaron en jaulas TPX (CLEA Japón) con un máximo de 3 ratones por jaula. Se usó Paper-Clean (Japan SLC) esterilizado para el lecho y se remplazó una vez a la semana.
[0342] Se proporcionó HFD sólido esterilizado ad libitum, colocándose en una tapa metálica en la parte superior de la jaula. Se proporcionó agua pura ad libitum de un frasco de agua equipado con un tapón de caucho y un tubo Sipper. Las botellas de agua se reemplazaron una vez por semana, se limpiaron y esterilizaron en un autoclave y se reutilizaron. Los ratones se identificaron por perforación en la oreja. Cada jaula se etiquetó con un código de identificación específico.
[0343] Medición de bioquímica plasmática
[0344] Para la bioquímica del plasma, se recogió sangre sin ayunar en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japón) y se centrifugó a 1.000 xg durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y almacenó a -80 °C hasta su uso. El nivel de ALT en plasma se midió con FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm, Japón).
[0345] Medición del contenido de triglicéridos hepáticos
[0346] Los extractos de lípidos totales de hígado se obtuvieron mediante el método de Folch (Folch J. y col., J. Biol. Chem.
[0347] 1957;226: 497). Las muestras de hígado se homogeneizaron en cloroformo-metanol (2:1, v/v) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Después de lavar con cloroformo-metanol-agua (8:4:3, v/v/v), los extractos se evaporaron a sequedad y se disolvieron en isopropanol. El contenido de triglicéridos hepáticos se midió mediante la prueba E de triglicéridos (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón).
[0348] Análisis histológicos
[0349] Para la tinción de HE, se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido hepático prefijados en solución de Bouin y se tiñeron con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japón) y solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). La puntuación de actividad de NAFLD (NAS) se calculó de acuerdo con los criterios de Kleiner (Kleiner DE. et al., Hepatology, 2005; 41:1313).
[0350] Para visualizar la deposición de colágeno, las secciones de hígado fijadas de Bouin se tiñeron usando una solución de rojo picro-Sirius (Waldeck, Alemania). Para el análisis cuantitativo del área de fibrosis, se capturaron imágenes de campo claro de secciones teñidas con rojo Sirius alrededor de la vena central usando una cámara digital (DFC295; Leica, Alemania) con un aumento de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron usando el software ImageJ (Instituto Nacional de Salud, EE. UU.).
[0351] Recogida de muestras
[0352] Para las muestras de plasma, el plasma restante se recogió y almacenó a -80 °C para su posterior análisis.
[0353] Para las muestras de hígado, se recogió el lóbulo lateral izquierdo y se cortó en 6 piezas. Dos piezas de lóbulo lateral izquierdo, lóbulos medial izquierdo y derecho y lóbulo caudado se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis. Las otras 2 piezas del lóbulo lateral izquierdo se fijaron en solución de Bouin y luego se incluyeron en parafina. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente para histología. Las piezas restantes del lóbulo lateral izquierdo se incluyeron en O.C.T. compuesto y congelado rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80 °C para su posterior análisis.
[0354] Ensayos estadísticos
[0355] Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba t de Student en GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., EE. UU.). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se asumió una moda o tendencia cuando una prueba de la t unilateral devolvía valores de p < 0,1. Los resultados se expresaron como la media ± DT. Diseño experimental y tratamiento
[0356] Grupos de estudio
[0357] Grupo 1: Péptido ADPIF
[0358] Seis ratones NASH se administraron por vía subcutánea en el vehículo administrado al tejido adiposo complementado con péptido ADPIF a una dosis de 25 mg por ratón una vez a la semana de 4 a 9 semanas de edad. Grupo 2: Vehículo
[0359] Seis ratones NASH se administraron por vía subcutánea en el vehículo administrado al tejido adiposo [DMSO en solución salina] en un volumen de 100 ml por ratón una vez a la semana de 4 a 9 semanas de edad.
[0360] La tabla a continuación resume el programa de tratamiento:
[0362]
[0364] Supervisión y sacrificio de animales
[0365] La viabilidad, los signos clínicos y el comportamiento se controlaron diariamente. El peso corporal se registró antes del tratamiento. Se observaron en los ratones signos clínicos significativos de toxicidad, morbilidad y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Los animales se sacrificaron a las 9 semanas de edad mediante desangrado mediante punción cardíaca directa bajo anestesia con isoflurano (Pfizer Inc.).
[0366] RESULTADOS
[0367] Cambios en el peso corporal y estado general
[0368] o Cambios en el peso corporal
[0369] El peso corporal medio en todos los grupos aumentó gradualmente durante el período de tratamiento. No hubo diferencias significativas en el peso corporal medio en ningún día durante el período de tratamiento entre el grupo de péptido ADPIF y el grupo de vehículo.
[0370] No hubo animales muertos en todos los grupos durante el período de tratamiento. En el presente estudio, ninguno de los animales mostró deterioro en el estado general.
[0371] o Triglicéridos hepáticos
[0372] El grupo de péptido ADPIF mostró una disminución significativa en el contenido de triglicéridos hepáticos en comparación con el grupo de vehículo.
[0373] Tabla 1. Bioquímica
[0374] Parámetro (media ± DE) Péptido de ensayo (n=6) Vehículo (n=6)
[0375] ALT de plasma (U/L) 54 ± 9 55 ± 7
[0377] Triglicéridos hepáticos (mg/g de hígado)
35,1 ± 17,8
75,5 ± 33,0
[0378] - Tinción con rojo de Sirio y el área de fibrosis
[0379] Las secciones de hígado del grupo de vehículos mostraron una mayor deposición de colágeno en la región pericentral del lóbulo hepático. El grupo de péptido ADPIF mostró una disminución significativa en el área de fibrosis (área positiva de rojo de Sirio) en comparación con el grupo de vehículo.
[0380] Tabla 2. Área de fibrosis
[0381] Parámetro (media ± DE) Péptido de ensayo (n=6) Vehículo (n=6)
[0382] Área roja positiva de Sirio (%) 0,62 ± 0,17 0,92 ± 0,23 CONCLUSIÓN
[0383] El tratamiento con péptido ADPIF mostró una disminución significativa en el contenido de triglicéridos hepáticos y el área de fibrosis en comparación con el grupo de vehículo. El péptido ADPIF redujo significativamente el área de fibrosis en comparación con el grupo de vehículo, lo que demuestra un efecto antifibrosis en el presente estudio. En conclusión, el péptido ADPIF mostró efectos antifibrosis en este modelo de NASH.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES
1. Un péptido, en donde
- el péptido puede disminuir la expresión de FATP2 en tejido adiposo;
- el péptido no comprende simultáneamente una metionina, una prolina y una arginina;
- el péptido adopta una estructura secundaria que es una hélice, preferiblemente una hélice alfa; y
- el péptido tiene una longitud de menos de 60 aminoácidos, y
- la secuencia peptídica comprende
VECTTREKEVLASLDKAAFLTQLHS (SEQ ID NO: 32)
en donde R y S llevan el grapado.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende 2-(7-octenil)arginina y 2-(4-pentenil)serina.
3. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso no alcohólico (NAFL), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatosis hepática (hígado graso), inflamación hepática, cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis.
5. El péptido o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la fibrosis es una fibrosis hepática que incluye cirrosis, una fibrosis renal, una fibrosis cardíaca que incluye una fibrosis auricular, una fibrosis endomiocárdica e infarto de miocardio antiguo, una fibrosis pulmonar que incluye fibrosis quística y una fibrosis pulmonar radioinducida, una fibrosis vascular tal como una fibrosis arterial, una fibrosis cerebral, una mielofibrosis, una artrofibrosis, una fibrosis intestinal, una fibrosis peritoneal, una fibrosis retroperitoneal o una fibrosis cutánea.
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