ES3055114T3 - Reagents and methods for elemental imaging mass spectrometry of biological samples - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a reactivos y su uso para espectrometría de masas de imágenes elementales de muestras biológicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Reactivos y métodos para la espectrometría de masas con imágenes elementales de muestras biológicasANTECEDENTES

[0003] La obtención de imágenes de muestras biológicas, como frotis celulares o secciones de tejido, suele limitarse a unos pocos canales distinguibles. Por ejemplo, la multiplexidad de la microscopía de fluorescencia tradicional se ve limitada por la superposición espectral de las emisiones de fluoróforos. El reciente desarrollo de la espectrometría de masas con imágenes de muestras teñidas con anticuerpos marcados con elementos permite obtener imágenes de muchas más proteínas simultáneamente, ya que cada proteína se asocia a un elemento o isótopo único a través de un anticuerpo intermedio. La obtención de imágenes de varias proteínas permite la caracterización de diversos tipos celulares dentro de la misma muestra basándose en la expresión proteica. Sin embargo, otras características de la muestra, como las estructuras intracelulares y extracelulares, pueden no visualizarse fácilmente mediante la tinción con anticuerpos. La fluorescencia y la microscopía óptica, que utilizan tinciones histoquímicas para visualizar estas estructuras, a menudo no permiten visualizar fármacos que contienen metales ni metales pesados tóxicos acumulados. Muchos métodos de espectrometría de masas pueden detectar niveles macroscópicos de metales en muestras biológicas, pero no pueden detectarlos con resolución subcelular ni en combinación con tinciones de anticuerpos o histoquímicas.

[0004] A diferencia de los metales que se detectan debido a su acumulación por la exposición ambiental o porque son componentes de fármacos, los reactivos marcados elementalmente (como los anticuerpos) deben sintetizarse tomando el anticuerpo, por ejemplo, y conjugándolo con el marcador elemental. Sin embargo, las técnicas actuales están limitadas por su aplicabilidad a tipos específicos de proteínas, lo que impide el desarrollo de un sistema verdaderamente modular para generar reactivos. WO2017/004203A1 se refiere a métodos y composiciones para detectar simultáneamente ARN y proteína en una muestra biológica por espectrometría de masas. WO2007/137418A1 se refiere a una nueva clase de biomoléculas marcadas que han sido diseñadas específicamente para operar en conjunción con la detección de análisis elemental, para proporcionar determinaciones de biomarcadores multiplexadas de alta sensibilidad. Patterson, et al., ACS Chemical Biology, 2014, 9, 592-605 se refiere a químicas bioortogonales utilizadas para marcar diversas clases de biomoléculas en células y otros entornos complejos.

[0005] CAMPO TÉCNICO

[0006] La presente divulgación se refiere a reactivos y su uso para espectrometría de masas de imágenes elementales de muestras biológicas.

[0007] RESUMEN

[0008] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención proporciona un SBP con etiqueta de masa, que comprende un SBP y una etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador covalente, donde el enlazador está formado, al menos en parte, por un producto de reacción química clic promovida por la deformación, y donde la etiqueta de masa comprende un polímero con una pluralidad de grupos quelantes de metales cargados con átomos marcadores del mismo isótopo metálico.

[0009] Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos, reactivos, kits y muestras biológicas para la obtención de imágenes de reactivos con etiquetas de masa (por ejemplo, de metal) mediante espectrometría de masas elemental, como se describe en este documento. Los reactivos y métodos descritos en este documento se refieren generalmente a aplicaciones en la obtención de imágenes por espectrometría de masas de muestras biológicas. Ciertos reactivos descritos en este documento incluyen tinciones histoquímicas, fármacos que contienen metales y metales pesados tóxicos detectables mediante espectrometría de masas con imágenes elementales, así como miembros de pares de unión específicos (SBP) conjugados con marcadores de masa mediante una nueva química de acoplamiento denominada química clic. Esta química, descubierta por los inventores, es especialmente adecuada para su aplicación en el campo de los SBP con marcado de masa. Algunos métodos descritos en este documento incluyen la obtención de imágenes de una combinación de anticuerpos con marcadores de masa (p. ej., metálicos), tinciones histoquímicas, fármacos que contienen metales y/o metales pesados tóxicos mediante espectrometría de masas elemental. En ciertos aspectos, la obtención de imágenes se realiza con resolución subcelular, lo que permite relacionar la distribución de los marcadores metálicos y de masa.

[0010] La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que la química clic es compatible con la reacción de moléculas, como las macromoléculas biológicas, con los marcadores de masa. Dichas moléculas con marcadores de masa son útiles para el marcado de muestras con los marcadores de masa, de forma muy similar a como se realizaría una metodología tradicional de inmunohistoquímica (IHQ) con reactivos marcados con fluorescencia.

[0011] Con frecuencia resulta útil unir dos componentes, como un SBP y una etiqueta. Para que sea útil, la química de enlace debe ser modular, de modo que pueda adaptarse a diversos escenarios, tanto con respecto a la etiqueta como al SBP. La química de enlace, en particular cuando se utilizan células vivas, debe ser atóxica, tanto en términos de reactivos como de productos, incluyendo subproductos.

[0012] Los métodos actuales para unir etiquetas de masa a biomoléculas están limitados por la química de la reacción existente. En particular, antes de la presente divulgación, la conjugación dependía de la presencia de un grupo sulfhidrilo en la biomolécula (p. ej., cisteína en una proteína). En algunos casos, no hay sulfhidrilo disponible, y en tal caso, una molécula no podría ser etiquetada con una etiqueta de masa. Ejemplos de tales proteínas incluyen aglutinina de germen de trigo (que se une a N-acetil-D-glucosamina y grupos de azúcar de ácido siálico) y faloidina (un péptido que se une a la actina), ninguno de los cuales comprende grupos sulfhidrilo. Alternativamente, para generar el sulfhidrilo, puede ser necesario (al menos parcialmente) reducir la proteína, rompiendo los enlaces disulfuro existentes. Cuando esto ocurre, la estructura de la proteína reducida puede alterarse de tal manera que la proteína (p. ej., un anticuerpo) puede perder afinidad y/o especificidad por el objetivo previsto, y así evitar que el conjugado proteína-etiqueta de masa actúe como una cepa fiable.

[0013] En consecuencia, existe la necesidad de una forma de unir etiquetas de masa a moléculas que no requiera la presencia de un grupo sulfhidrilo en la molécula. Los inventores abordan esta necesidad proporcionando un método para unir SBP y etiquetas de masa mediante química de clic. La química de clic es un concepto introducido por Barry Sharpless a finales de la década de 1990. Su concepto central es una fuerza impulsora termodinámica elevada que impulsa una reacción de forma rápida e irreversible, obteniendo un alto rendimiento de un único producto con alta especificidad (en algunos casos, con regio y estereoespecificidad). Las reacciones suelen producir pocos subproductos tóxicos, o ninguno, y muchas son susceptibles de llevarse a cabo en condiciones fisiológicas, es decir, en un tampón acuoso, a pH aproximadamente neutro y tolerante a las sales típicas del tampón, siendo el producto resultante estable en estas condiciones. Aquellas que no cumplen estrictamente estos criterios se caracterizan, no obstante, por su alto rendimiento, simplicidad y posibilidad de llevarse a cabo en disolventes inocuos o de fácil eliminación. De importancia adicional es que las reacciones moleculares son bioortogonales, lo que significa que proceden sin interactuar con ninguna de las funcionalidades típicamente vistas en sistemas biológicos, tales como aminas, amidas, carbonilos, ácidos, etc.

[0015] De interés en la presente divulgación es la conjugación de un miembro de un par de enlace específico (como se discute más adelante), denominado en este documento un SBP, con una etiqueta de masa (es decir, una etiqueta que comprende un componente que cuando se ioniza produce un ion de una masa característica que puede detectarse, por ejemplo, al menos un átomo de marcado). Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un método para unir un SBP a una etiqueta de masa, que comprende los pasos de:

[0017] (i) proporcionar el SBP y la etiqueta de masa; y

[0018] (ii) conjugar el SBP a la etiqueta de masa donde al menos un paso en la conjugación comprende una reacción de química de clic promovida por tensión.

[0020] Por lo tanto, ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un SBP con etiqueta de masa, que comprende un SBP y una etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador covalente, formado al menos en parte por un producto de reacción química clic promovido y deformado.

[0022] El panel de reactivos que permite el concepto inventivo descrito aquí permite marcar diversos tipos de reactivos con etiquetas de masa utilizando el mismo tipo de química. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan kits para el marcaje de SBP, así como kits de SBP con etiqueta de masa generados mediante la química clic descrita aquí, opcionalmente kits que comprenden SBP con etiqueta de masa y otros reactivos que contienen átomos marcadores, por ejemplo, intercaladores de ADN. Asimismo, ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para etiquetar una muestra usando una SBP etiquetada con masa de la divulgación, opcionalmente son métodos para etiquetar una muestra usando múltiples de dichas SBP etiquetadas con masa, por ejemplo en donde las SBP etiquetadas con masa incluyen SBP de diferentes tipos, por ejemplo una SBP de anticuerpo (incluyendo múltiples SBP de anticuerpo), una SBP de ácido nucleico (incluyendo múltiples SBP de ácido nucleico), una lectina (incluyendo múltiples lectinas), un azúcar (incluyendo múltiples azúcares) y un intercalador de ADN (incluyendo múltiples intercaladores de ADN). De manera similar, ciertos aspectos de la presente divulgación incluyen el uso de una SBP marcada con masa de la divulgación para marcar una muestra, tal como el uso de múltiples SBP marcadas con masa para marcar una muestra, por ejemplo, en donde las SBP marcadas con masa incluyen SBP de diferentes tipos, por ejemplo, una SBP de anticuerpo (incluyendo múltiples SBP de anticuerpo), una SBP de ácido nucleico (incluyendo múltiples SBP de ácido nucleico), una lectina (incluyendo múltiples lectinas), un azúcar (incluyendo múltiples azúcares) y un intercalador de ADN (incluyendo múltiples intercaladores de ADN). En consecuencia, ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan una muestra marcada según la divulgación, como una muestra marcada con una SBP marcada por masa de la divulgación, opcionalmente una muestra marcada con múltiples SBP marcadas por masa, por ejemplo, donde las SBP marcadas por masa incluyen SBP de diferentes tipos, por ejemplo, una SBP de anticuerpo (incluyendo múltiples SBP de anticuerpo), una SBP de ácido nucleico (incluyendo múltiples SBP de ácido nucleico), una lectina (incluyendo múltiples lectinas), un azúcar (incluyendo múltiples azúcares) y un intercalador de ADN (incluyendo múltiples intercaladores de ADN).

[0024] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para realizar citometría de masas, por ejemplo, citometría de masas por imágenes, en una muestra de la divulgación, preparada de acuerdo con lo anterior.

[0025] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un aparato de citometría de masas, como un aparato de citometría de masas por imágenes que comprende una muestra según la divulgación.

[0026] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0027] FIGURA 1. Tinción con rojo de rutenio del estroma de la mucosa.

[0028] FIGURA 2. Sección FFPE de intestino de ratón teñida con tinción tricrómica (A) y tinción ldU (8).

[0029] FIGURA 3. Imagenología posfijación de OsO4 por LA-ICP-EM de una sección de tejido preparada para microscopía electrónica.

[0030] FIGURA 4. Espectrometría de masas de imágenes elementales de cisplatino en xenoinjerto de tumor pancreático humano a ratones inmunodeficientes.

[0031] FIGURA 5. Efectos del cisplatino en la proliferación tumoral, daño al ADN y distribución de cisplatino en el tumor. FIGURA 6. Efectos y distribución del cisplatino en el intestino delgado.

[0032] FIGURA 7. Características histológicas de la piel identificadas por IMQ y distribución de platino tras el tratamiento con cisplatino.

[0033] FIGURA 8. Distribución de cisplatino en riñón e hígado.

[0034] FIGURA 9. Cinética de la distribución de cisplatino medida utilizando cisplatino monoisotópico.

[0035] FIGURA 10. Efectos del cisplatino en la proliferación tumoral, daño al ADN y distribución de 195Pt en OCIP23. FIGURA 11. Efectos del cisplatino en la proliferación celular y la captación de platino determinados por citometría de masas.

[0036] FIGURA 12. Distribución de platino en criostato y secciones FFPE.

[0037] FIGURA 13. Distribución de platino en intestino grueso.

[0038] FIGURA 14. Distribución de platino en piel de ratón no tumoral.

[0039] FIGURA 15. Distribución de platino en riñón de ratón no tumoral.

[0040] FIGURA 16. Análisis de imagen con el Definiens Developer.

[0041] FIGURA 17. Espectro de RMN<1>H de la etiqueta de masa basada en polímero del extremo TCO en D<2>O.

[0042] FIGURA 18. (A) Las PBMC humanas se tiñeron con el kit Maxpar Human PBMCs Basic II Phenotyping 172145 Panel y anticuerpo anti-CD57 (HCD57)-<172>Yb humano. (B) Los anticuerpos CD4-<145Nd>, CD14-<160>Gd y CD16-<165>Ho conjugados con química de clic a 1-2 µg/mL y CD57(HCD57)-<172>Yb (clase IgM) reemplazaron a los respectivos anticuerpos en el panel de fenotipado básico. (A) y (B) muestran la estrategia de activación para células individuales vivas. (C) Gráfico de barras que compara la intensidad de señal media [normalizada a EQ<TM>Four Element Calibration Beads (Fluidigm)] para los anticuerpos marcados con Maxpar (rojo) frente a los anticuerpos conjugados con química de clic (verde). (D) Gráfico de contornos e (E) histograma de distribución de señal para células CD57+CD4-CD3+.

[0043] FIGURA 19: (A) Imagen pseudocolor IMQ representativa de células Ramos humanas teñidas con WGA-<174>Yb, CD45-<154>Sm y el intercalador de ADN<191>/<193>Ir. (B) y (C) muestran imágenes representativas de IMQ de células humanas mixtas KG1a, CCRF-CEM y Ramos. Las células se tiñeron con anticuerpos<147>Sm CD20,<148>Nd-CD34 y<145>Nd-CD4 antes de la tinción con lectina. Se utilizó WGA-<174>Yb tratado con N-acetilglucosamina (NAG) para teñir las células Ramos como control negativo. WGA-<174>Yb sin tratar se utiliza para teñir células humanas KG1a y CCRF-CEM (D) Histogramas representativos de CyTOF® de células Ramos teñidas con WGA-<174>Yb tratado con NAG (distribución izquierda) con y WGA-<174>Yb (distribución derecha) sin tratamiento con NAG (E) Valores de intensidad de señal media (normalizada a perlas EQ) de células humanas KGi a, CCRF-CEM y Ramos (NAG+/-) teñidas con WGA-<174>Yb según lo analizado por CyTOF. Barra de escala = 100 µm.

[0044] FIGURA 20: Representación viSNE bidimensional de poblaciones de células de sangre completa humana que muestra las ubicaciones de las principales poblaciones celulares (A) y la distribución de la intensidad de WGA (B). Las poblaciones de sangre completa humana se modelaron en función de la tinción de superficie de 29 objetivos. (C) Cuantificación de intensidades medias de WGA marcadas con metal para poblaciones de células seleccionadas en sangre completa humana 1 para discriminación de tamaño.

[0045] FIGURA 21: Imágenes IMQ en pseudocolor de células Hela. Los lisosomas se visualizan en rojo con 151Eu-CD107a, los filamentos de actina en verde con faloidina-165Ho y los núcleos en azul con tinción de intercalador de ADN-lr. (B) Imágenes IMQ en pseudocolor de secciones FFPE de colon de ratón. Los filamentos de actina se visualizan en rojo con faloidina-165Ho conjugada con química clic (azida-DBCO), los núcleos en verde con tinción de intercalador de ADN-lr y el moco de células caliciformes en azul con<174>Yb-WGA (DBCO-Azida) conjugado con química clic. Barra de escala = 100 µm.

[0046] FIGURA 22: Células Jurkat y Ramos humanas teñidas con Maxpar y mAb anti-CD3(UCHT1) (2,5 µg/mL) conjugados con química clic. (A) Los histogramas representativos muestran una comparación entre Maxpar y mAb anti-CD3(UCHT1) LEAF conjugados con química click (DBCO-Azida y Tetrazina-TCO). (B) muestran una comparación entre Maxpar y mAb anti-CD3(UCHT1) purificados conjugados con química click (Tetrazina-TCO). (C) muestran una comparación entre Maxpar y mAb anti-CD3(UCHT1) purificados con doble etiqueta (170Er y AlexaFluor594) conjugados con química click (TCO-Tetrazina). Imágenes representativas de IMQ (D) e inmunofluorescencia (IF) (E) de secciones de tejido amigdalino congelado marcadas con rnAb CD3-170Er-AlexaFluor594 con doble etiqueta preparado mediante un método de conjugación de dos pasos (conjugación de tiol-maleimida para el marcado de fluoróforos y química click para el marcado de masas). Se utilizaron intercaladores-<191>Ir (IMQ) y DAPI (IF) para la tinción del núcleo. Barra de escala = 500 µm.

[0047] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0048] La citometría de masas, incluida la citometría de masas por imagen, se basa en la tinción de las especies objetivo (también denominadas analitos en este documento y en la práctica) en una muestra mediante SBP que se unen a analitos específicos (proteínas, ácidos nucleicos, azúcares, metabolitos, etc.).

[0049] Por lo tanto, las SBP unidas a las etiquetas de masa las inmovilizan en la zona donde se encuentra el analito objetivo de la SBP en las células. Para que cada SBP con etiqueta de masa se detecte discretamente, se requiere una etiqueta de masa diferente. Como se explica en la técnica (p. ej., Giesen et al., 2014, Nature methods 11: 417-422; D138, Z102), una ventaja clave sobre la citometría de masas, incluyendo la citometría de masas por imágenes, sobre otras técnicas analíticas es la capacidad para niveles muy altos de multiplexación, debido a la capacidad de los detectores de masas para resolver diferencias de en las masas de iones elementales con solo una unidad de masa atómica de diferencia. Para permitir el mejor uso de la capacidad de los procedimientos analíticos altamente multiplexados, es deseable tener una paleta de reactivos, que se puedan combinar utilizando pasos comunes para lograr los SBP con etiqueta de masa deseados. Por ejemplo, un protocolo estandarizado puede permitir la conjugación de un ácido nucleico a una etiqueta de masa, una proteína a una etiqueta de masa, un péptido a una etiqueta de masa, un azúcar a una etiqueta de masa, etc. realizando las mismas reacciones o al menos muy similares para cada clase de molécula. Del mismo modo, cualquier SBP se puede conjugar a una variedad de diferentes etiquetas de masa utilizando la misma química. Este sencillo enfoque modular permite proporcionar kits para el marcaje de SBP, más sencillos de usar, ya que las mismas condiciones de reacción, la misma duración, etc., permiten marcar múltiples SBP diferentes, cada uno con diferentes marcadores de masa, en paralelo (y, además, como se explica en otra parte del presente documento, a condiciones ambientales).Los SBP con marcadores de masa de la presente divulgación y los métodos de síntesis de los reactivos y sus componentes

[0050] Los reactivos con marcadores de masa de ciertos aspectos de la presente divulgación comprenden varios componentes modulares. El primero es el SBP. El segundo es el marcador de masa. El marcador de masa y el SBP están unidos por un enlazador, formado al menos en parte por la conjugación del marcador de masa y el SBP. El enlace entre el SBP y el marcador de masa también puede comprender un espaciador. Un componente clave de ciertos aspectos de la presente divulgación descritos en el presente documento es la reacción utilizada para generar el enlazador. La reacción es una reacción de clic promovida por la deformación. Este tipo de reacción proporciona ventajas particulares en la conjugación de marcadores de masa y SBP. Esto se debe a que muchas reacciones de química clic dependen de la presencia de un catalizador metálico. Por ejemplo, se han descrito reacciones de química clic catalizadas por cobre o hierro. Dichos metales pueden incorporarse a los componentes que reaccionan entre sí (p. ej., en los grupos de ligadura de metales de la etiqueta de masa). Esto es indeseable, al menos porque la ocupación de los grupos de ligadura de metales de la etiqueta de masa por el catalizador metálico impide que el átomo o átomos marcadores deseados ocupen dichos grupos. En consecuencia, se pierde sensibilidad en el canal de masa deseado. Además, el fondo podría aumentar si el metal que cataliza la reacción fuera el átomo marcador en otro SBP con etiqueta de masa utilizado en una reacción multiplex. Además, los metales catalíticos como el cobre son tóxicos para las células vivas, por lo que si quedara cobre no quelado en la composición del SBP con etiqueta de masa conjugado, esto podría interferir con los procedimientos experimentales posteriores, si estos involucraran material vivo.

[0051] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un método para unir un SBP a una etiqueta de masa, que comprende los pasos de:

[0052] (i) proporcionar el SBP y la etiqueta de masa; y

[0053] (ii) conjugar el SBP con la etiqueta de masa, donde al menos un paso de la conjugación comprende una reacción química de clic promovida por la deformación.

[0054] Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un SBP con etiqueta de masa, que comprende un SBP y una etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador covalente, donde el enlazador está formado, al menos en parte, por un producto de reacción química de clic promovida por la deformación. El enlazador puede formarse únicamente a partir del producto de reacción de la química clic, por ejemplo, el triazol formado a partir de la reacción de un alquino con una azida. Alternativamente, el enlazador puede estar compuesto por átomos adicionales, como los resultantes de la conjugación de un reactivo de la química clic con el SBP o la fracción de etiqueta de masa/quelante de metal (p. ej., la reacción del éster NHS con lisina o la reacción de maleimida sulfhidrilo; y opcionalmente, espaciadores para unir el reactivo de la química clic al SBP y/o a la etiqueta de masa). En adelante, estos se denominarán componentes enlazadores; un primer componente enlazador puede conjugarse con el SBP antes de la reacción de la química clic, y un segundo componente enlazador puede conjugarse con la etiqueta de masa antes de la reacción de la química clic. Juntos, el componente enlazador, si está presente (incluyendo opcionalmente espaciadores), y el producto de la reacción de la química clic forman el enlazador entre la etiqueta de masa y el SBP.

[0055] Reacciones de química clic ejemplares

[0056] Una variedad de diferentes reacciones libres de catalizador metálico, tales como reacciones promovidas por deformación, pueden ser utilizadas de acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación.

[0057] a. Reacción de alquino con azida

[0058] Un primer ejemplo es la reacción entre un alquino deformado y una azida, tal como una cicloadición azida-alquino promovida por deformación entre un derivado de ciclooctino y una azida.

[0061]

[0064] Esquema de reacción (I)

[0065] Aquí, la reacción del ciclooctino y la azida une covalentemente los grupos R<1>y R<2>. Dada la deformación del anillo de alquino, la reacción de una azida orgánica con un alquino cíclico, típicamente ciclooctino, se ha vuelto comúnmente conocida como cicloadición azida-alquino promovida por deformación (SPAAC). En ciertos aspectos de la presente divulgación, R<1>puede ser el SBP y R<2>puede ser la etiqueta de masa. Alternativamente, R<2>puede ser el SBP y R<1>puede ser la etiqueta de masa. Por consiguiente, en algunas formas de realización de la presente divulgación, el método comprende la conjugación de una SBP con una etiqueta de masa mediante una reacción de química clic, donde dicha reacción consiste en una reacción de una azida con un alquino.

[0066] La reacción de un ciclooctino con una azida se caracteriza por una cinética de reacción relativamente lenta y requiere grandes cantidades de reactivos y largos tiempos de incubación. Por consiguiente, se pueden utilizar derivados de cicloalquino con mayor reactividad, sin comprometerla. Estos incluyen ciclooctino monofluorado (MOFO), difluorociclooctino (DIFO), dimetoxiazaciclooctino (DIMAC), dibenzociclooctino (DIBO), dibenzoazaciclooctino (DIBAC), biarilazaciclooctinona (BARAC), biciclononino (BCN), 2,3,6,7-tetrametoxi-DIBO (TMDIBO), DIBO sulfonilado (S-DIBO), carboximetilmonobenzociclooctino (COMBO), pirrolociclooctino (PYRROC). Se entiende comúnmente que la reactividad mejorada de los ciclooctinos (di)benzoanulados es causada por el aumento en la tensión del anillo impartida por los carbonos con hibridación sp2 múltiple. Se pueden utilizar muchos tipos de derivados de dibenzociclootina (DBCO) en la presente divulgación, tales como los derivatizados (directamente o a través de un enlazador) con ésteres de NHS, como para la conjugación con aminas en la SBP (por ejemplo, el grupo amina del extremo N, de los grupos amina de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (por ejemplo, anticuerpos y lectinas), conjugación con sondas de oligonucleótidos modificados con amino (como las disponibles comercialmente de IIDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.) entre otros), derivados de aminoazúcares, etc.). Como alternativa, el derivado de DBCO puede derivatizarse (directamente o mediante un enlazador) con una maleimida (p. ej., dibenzociclooctinomaleimida; número de catálogo de Sigma Aldrich 760668, o dibenzociclooctino-PEG4-maleimida; número de catálogo de Sigma Aldrich 760676). La funcionalidad maleimida puede usarse para acoplar el DBCO a un grupo sulfhidrilo de la etiqueta de masa.

[0068] Por consiguiente, en algunas formas de realización, el alquino es un alquino cíclico, por ejemplo, en donde el alquino cíclico es parte de un anillo de 8 miembros. El alquino cíclico puede estar tensado. A veces, el alquino cíclico es parte de una estructura multianillo que comprende 3 o más anillos, opcionalmente en donde la estructura multianillo comprende al menos dos anillos de benceno. En algunas formas de realización, el alquino cíclico es dibenzociclooctino (DBCO).

[0069] La azida puede asimismo ser acoplada al SBP (directamente o a través de un enlazador) con ésteres de NHS, tales como éster de azido-dPEG<8>-NHS, éster de azido-dPEG<12>-NHS, etc. (disponibles de Sigma Aldrich; números de cat. QBD10503 y QBD10505, respectivamente). A través del éster de NHS, la azida puede ser acoplada a aminas en el SBP (por ejemplo, el grupo amino del extremo N, de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (por ejemplo, anticuerpos y lectinas), conjugación a sondas de oligonucleótidos modificados con amino (como los disponibles comercialmente de IDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.) entre a!ia), derivados de aminoazúcares, etc.). Alternativamente, los oligonucleótidos/azúcares modificados con azida se pueden sintetizar directamente (es decir, sin necesidad de unir la funcionalidad azida mediante una reacción de éster NHS separada a un amino modificado). El componente azida también se puede acoplar a la etiqueta de masa. Por ejemplo, se pueden usar iniciadores azo de polimerización en reacciones de polimerización convencionales. El polimetacrilato terminado en azida también está disponible en Sigma Aldrich.

[0071] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir un SBP con etiqueta de masa, que comprenden conjugar la etiqueta de masa y el SBP mediante una reacción SPAAC. En algunas formas de realización, el método comprende las etapas de proporcionar un SBP funcionalizado con alquino y una etiqueta de masa funcionalizada con azida, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alquino con la etiqueta de masa funcionalizada con azida, como en donde el SBP funcionalizado con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo DBCO. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con azida y una etiqueta de masa funcionalizada con alquino, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con azida y la etiqueta de masa funcionalizada con alquino, por ejemplo, donde la etiqueta de masa funcionalizada con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. Como se indica más adelante, puede presentarse un espaciador entre el SBP y el alquino o la azida, y/o la etiqueta de masa y la azida o el alquino.

[0073] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un SBP con etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un alquino y una azida, como un cicloalquino deformado y una azida, por ejemplo, DBCO y una azida. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química clic sin metal, como una reacción química clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un SBP con etiqueta de masa, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende un triazol. El grupo triazol del enlazador puede formar parte de una estructura multianillo. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender 4 o más anillos. Por ejemplo, la estructura multianillo puede ser un anillo de 3 miembros, un anillo de 4 miembros, un anillo de 5 miembros, un anillo de 6 miembros, un anillo de 7 miembros, un anillo de 8 miembros, un anillo de 9 miembros, un anillo de 10 miembros, etc. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender dos o más anillos de benceno. Específicamente, la estructura multianillo puede comprender un grupo dibenzocicloocteno. El grupo triazol y el grupo dibenzocicloocteno pueden tener cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo triazol puede estar separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno (lo que significa que el grupo dibenzocicloocteno estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo triazol). Alternativamente, el grupo dibenzocicloocteno puede separarse del SBP por el grupo triazol (lo que significa que el grupo triazol estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo dibenzocicloocteno).

[0075] Como se explica a continuación, la etiqueta de masa comprende uno o más átomos marcadores, que permiten la identificación de la presencia del objetivo del SBP de manera sencilla en un detector de masas. Sin embargo, no es el caso de que el SBP se conjugará a una etiqueta de masa con los elementos de marcaje ya en la etiqueta. A veces, el SBP se conjugará a una fracción quelante de metal antes de que uno o más átomos marcadores de metal se carguen en la fracción quelante de metal para formar una etiqueta de masa. Como se explica a continuación con más detalle, la fracción quelante de metal puede ser un solo grupo quelante de metal o puede ser un polímero al que se ha unido un grupo quelante de metal a dos o más subunidades.

[0077] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, que comprenden la conjugación de la fracción quelante de metales y el SBP mediante una reacción SPAAC. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con alquino y una fracción quelante de metales funcionalizada con azida, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alquino con la fracción quelante de metales funcionalizada con azida, por ejemplo, donde el SBP funcionalizado con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con azida y una fracción quelante de metales funcionalizada con alquino, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con azida y la fracción quelante de metales funcionalizada con alquino, por ejemplo, donde el SBP funcionalizado con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. Como se indica a continuación, se puede presentar un espaciador entre el SBP y el alquino de azida y/o la fracción quelante de metales y la azida del alquino.

[0078] La reacción SPAAC puede realizarse en condiciones fisiológicas y es compatible con macrobiomoléculas como proteínas (incluyendo anticuerpos, ligandos, receptores, ácidos nucleicos, etc., como se describe más adelante en la sección sobre SBP en la página 40). Las condiciones fisiológicas pueden incluir una solución isotónica o un tampón biológico como solución salina, tampón fosfato salino (PBS), etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir, alternativa o adicionalmente, una temperatura de entre 1 ºC y 42 ºC, entre 4 ºC y 37 ºC, entre 4 ºC y 25 ºC, entre 10 ºC y 37 ºC, entre 25 ºC y 37 ºC, etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir un pH neutro, de 5,5 a 8,5, de 6 a 8, de 6,5 a 7,5, etc. Dado que la reacción entre el DBCO y la azida puede ser lenta, puede ser preferible un tiempo de incubación relativamente largo. Por ejemplo, la conjugación del paso b) puede llevarse a cabo durante 4 a 48 horas a 4 ºC, de 10 a 24 horas a 4 ºC, de 18 a 20 horas a 4 ºC, de 10 minutos a 10 horas a temperatura ambiente, de 30 minutos a 5 horas a temperatura ambiente, de 30 minutos a 3 horas a temperatura ambiente, de 5 minutos a 5 horas a 37 ºC, de 10 minutos a 2 horas a 37 ºC, etc.

[0079] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para la fabricación de un SBP con etiqueta de masa, que comprende la aplicación del método descrito en el párrafo anterior para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, y que además comprende la etapa de porción de metal en la fracción quelante de metales, por ejemplo, un polímero.

[0080] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales, en el que el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende el producto de reacción de un alquino y una azida, como un cicloalquino deformado y una azida, por ejemplo, DBCO y una azida. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química clic sin metal, como una reacción química clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales en el que el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende un triazol. El grupo triazol del enlazador puede formar parte de una estructura multianillo. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender 4 o más anillos. Por ejemplo, puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 miembros de anillo. En ciertos aspectos, la estructura de múltiples anillos puede comprender dos o más anillos de benceno. Específicamente, puede comprender un grupo dibenzocicloocteno. El grupo triazol y el grupo dibenzocicloocteno pueden tener cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo triazol puede estar separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno (lo que significa que el grupo dibenzocicloocteno estaría separado del grupo quelante de metales por el grupo triazol). Alternativamente, el grupo dibenzocicloocteno puede estar separado del SBP por el grupo triazol (lo que significa que el grupo triazol estaría separado del grupo quelante de metales por el grupo dibenzocicloocteno).

[0081] El SBP con etiqueta de masa que comprende un grupo triazol puede ser estable en solución. Por ejemplo, la etiqueta de masa del SBP puede ser estable en solución hasta por una semana, un mes, 6 meses, un año, 2 años, 5 años, etc. La etiqueta de masa del SBP puede ser estable en solución a -20 ºC (p. ej., donde la solución comprende glicerol), por debajo del punto de congelación, 4 ºC, 10 ºC o a temperatura ambiente. Cuando el SBP es un anticuerpo, la estabilidad puede medirse por afinidad del anticuerpo.

[0082] En algunos casos, la reacción química clic procede en ausencia de un catalizador metálico, en particular donde la reacción química clic procede en ausencia de cobre o hierro. En algunos casos, la reacción química clic se realiza en condiciones fisiológicas, opcionalmente donde la reacción química clic se realiza a un pH de 6 a 8, como donde la reacción química clic se realiza en un tampón, por ejemplo donde el tampón es isotónico.

[0083] Algunas veces, el alquino está unido al SBP y la azida está unida a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales. Algunas veces, la azida está unida al SBP y el alquino está unido a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales. Algunas veces, cuando el alquino está unido al SBP, está unido por un componente enlazador (opcionalmente a través de un espaciador). Algunas veces, cuando el alquino está unido a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales, está unido por un componente enlazador (opcionalmente a través de un espaciador). Algunas veces, cuando la azida está unida al SBP, está unida por un componente enlazador (opcionalmente a través de un espaciador). Algunas veces, cuando la azida está unida a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales, está unida por un componente enlazador (opcionalmente a través de un espaciador).

[0084] b. Reacción de alqueno con tetrazina

[0085] Un segundo ejemplo es la reacción entre un alqueno sometido a tensión y una tetrazina, como una cicloadición tetrazinaalqueno promovida por tensión entre un derivadotrans-cicloocteno y una tetrazina.

[0088]

[0089] Esquema de reacción (II)

[0091] Aquí, la reacción deltrans-cicloocteno y la tetrazina une covalentemente los grupos R<1>y R<2>. Dada la tensión del anillo alquino, la reacción de una tetrazina orgánica con un alqueno cíclico, típicamentetrans-cicloocteno, se produce mediante una cicloadición de Diels-Alder con demanda inversa de electrones (iEDDA). En ciertos aspectos de la presente divulgación, R<1>puede ser el SBP y R<2>puede ser la etiqueta de masa. Alternativamente, R<2>puede ser el SBP y R<1>puede ser la etiqueta de masa.

[0093] Entre tres posibles isómeros de tetrazina diferentes, se utiliza 1,2,4,5-tetrazina para la reacción de iEDDA. La finalización de la reacción libera gas N<2>como el único subproducto, lo que hace que la reacción de iEDDA sea irreversible y más adecuada para el biomarcaje que las reacciones reversibles convencionales de Diels-Alder.

[0095] Eltrans-cicloocteno(TCO) es actualmente uno de los alquenos cíclicos más reactivos conocidos como reactivo en esta reacción. Se pueden utilizar muchos tipos de derivados en ciertos aspectos de la presente divulgación, como los derivatizados (directamente o mediante un enlazador) con ésteres de NHS, como para la conjugación con aminas en el SBP (p. ej., lisina). Como alternativa, el derivado de TCO puede derivatizarse (directamente o a través de un enlazador) con una maleimida (p. ej. el grupo amina del extremo N, de los grupos amina de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (p. ej. anticuerpos y lectinas), conjugación con sondas de oligonucleótidos modificados con amino (disponibles comercialmente en IDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.) entre otros), derivados de amino azúcar, etc.). La funcionalidad maleimida puede usarse para acoplar el TCO a un grupo sulfhidrilo de la etiqueta de masa. También pueden usarse derivados detrans-biciclo[6.1.0]noneno, donde la sustitución se produce en el anillo de ciclopropilo. Aunque menos rápido que el TCO, el metilciclopropeno, el biciclo[6.1.0]nonino, el ciclooctino y el norborneno también pueden hacerse reaccionar con tetrazinas.

[0097] La tetrazina asimismo se puede acoplar al SBP (directamente o a través de un enlazador) con ésteres de NHS (tales como los disponibles de Sigma Aldrich). A través del éster de NHS, la tetrazina se puede acoplar a aminas en el SBP (por ejemplo, el grupo amina del extremo N, de los grupos amina de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (por ejemplo, anticuerpos y lectinas), conjugación a sondas de oligonucleótidos modificados con amino (como las disponibles comercialmente de IDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.) entre otros), derivados de amino azúcar, etc.). El componente de tetrazina también se puede acoplar a la etiqueta de masa, por ejemplo, donde el componente también comprende una funcionalidad maleimida. Hay dos tipos principales de tetrazinas que se aplican ampliamente: tetrazinas 6-metil-sustituidas y tetrazinas 6-hidrógeno-sustituidas. Las tetrazinas metilsustituidas presentan una alta estabilidad incluso disueltas en medios acuosos, ofreciendo una cinética de reacción más rápida con derivados de TCO que cualquier otro par de reacción bioortogonal (aprox.1000 M⁻¹ s⁻¹). Además, toleran una amplia gama de condiciones de reacción, lo que las convierte en la opción preferida para aplicaciones como el marcaje de proteínas. Por otro lado, las tetrazinas metil-sustituidas, al ser menos estables y tolerantes a condiciones de reacción adversas, ofrecen una cinética de reacción extremadamente rápida (hasta 30.000 M⁻¹ s⁻¹) para aplicaciones como la imagenología in vivo. La tetrazina puede ser 3-(bencilamino)-tetrazina.

[0099] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir un SBP con etiqueta de masa, que comprenden la conjugación de la etiqueta de masa y el SBP mediante una reacción de cicloadición inversa de Diels-Alder con electrones de demanda entre un alqueno deformado y una tetrazina (seguida de una reacción de retro-Diels-Alder con eliminación de N₂). En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con alqueno y una etiqueta de masa funcionalizada con tetrazina, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alqueno con la etiqueta de masa funcionalizada con tetrazina, por ejemplo, donde el SBP funcionalizado con alqueno se funcionaliza con un cicloalqueno deformado, por ejemplo, TCO. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con tetrazina y una etiqueta de masa funcionalizada con alqueno, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con tetrazina y la etiqueta de masa funcionalizada con alqueno, por ejemplo, donde la etiqueta de masa funcionalizada con alqueno se funcionaliza con un cicloalqueno deformado, por ejemplo, TCO. Como se indica más adelante, puede presentarse un espaciador entre el SBP y el alqueno o la tetrazina, y/o la etiqueta de masa y la tetrazina o el alqueno.

[0101] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un SBP con etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un alqueno y una tetrazina, como un cicloalqueno deformado y una tetrazina, por ejemplo, TCO y una tetrazina. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química clic sin metal, como una reacción química clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un SBP con etiqueta de masa, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende una piridazina. El grupo piridazina del enlazador puede formar parte de una estructura multianillo. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender dos o más anillos. Por ejemplo, la estructura multianillo puede ser un anillo de miembro de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender un anillo de 6 y 8 miembros. Específicamente, la estructura multianillo puede comprender un grupo ciclooctano. El grupo piridazina y el grupo ciclooctano pueden estar en cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo piridazina puede estar separado del SBP por el grupo ciclooctano (lo que significa que el grupo ciclooctano estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo piridazina). Alternativamente, el grupo ciclooctano puede estar separado del SBP por el grupo piridazina (lo que significa que el grupo piridazina estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo ciclooctano).

[0102] Como se explica a continuación, la etiqueta de masa comprende uno o más átomos marcadores, que permiten la identificación de la presencia del objetivo del SBP de una manera simple en un detector de masas. Sin embargo, no es el caso de que el SBP se conjugará a una etiqueta de masa con los elementos de marcaje ya en la etiqueta. A veces, el SBP se conjugará a una fracción quelante de metales antes de que uno o más átomos marcadores se carguen en la fracción quelante de metales. Como se explica con más detalle a continuación, la fracción quelante de metales puede ser un único grupo quelante de metales o un polímero al que se ha unido un grupo quelante de metales a dos o más subunidades.

[0104] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, que comprenden la conjugación de la fracción quelante de metales y el SBP mediante una reacción de cicloadición de Diels-Alder con demanda inversa de electrones (iEDDA) entre un alqueno deformado y una tetrazina (seguida de una reacción de retro-Diels-Alder con eliminación de N₂). En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con alqueno y una fracción quelante de metales funcionalizada con tetrazina, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alqueno con la fracción quelante de metales funcionalizada con tetrazina, como en el caso 1, donde el SBP funcionalizado con alqueno se funcionaliza con un cicloalqueno deformado, por ejemplo, TCO. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar una SBP funcionalizada con tetrazina y una fracción quelante de metales funcionalizada con alqueno, y hacer reaccionar la SBP funcionalizada con tetrazina y la fracción quelante de metales funcionalizada con alqueno, por ejemplo, donde la fracción quelante de metales funcionalizada con alqueno se funcionaliza con un cicloalqueno deformado, por ejemplo, TCO. Como se indica más adelante, se puede presentar un espaciador entre la SBP y el alqueno o la tetrazina, y/o entre la fracción quelante de metales y la tetrazina o el alqueno.

[0106] La reacción iEDDA puede realizarse en condiciones fisiológicas y es compatible con macrobiomoléculas como proteínas (incluyendo anticuerpos, ligandos, receptores, ácidos nucleicos, etc., como se describe más adelante en la sección sobre SBP en la página 40). Las condiciones fisiológicas pueden incluir una solución isotónica o un tampón biológico como solución salina, tampón salino con fosfato (PBS), etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir, alternativa o adicionalmente, una temperatura de entre 1 ºC y 42 ºC, de entre 4 ºC y 37 ºC, de entre 4 ºC y 25 ºC, de entre 10 ºC y 37 ºC, de entre 25 ºC y 37 ºC, etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir un pH neutro, de entre 5,5 y 8,5, de entre 6 y 8, de entre 6,5 y 7,5, etc. Dado que la reacción entre el TCO y la tetrazina es un proceso rápido, se pueden lograr tiempos de incubación ventajosamente cortos. Por ejemplo, la conjugación del paso b) puede realizarse durante 1 a 4 horas a 4 ºC, de 1 a 60 minutos a temperatura ambiente, de 1 a 10 minutos a 37 ºC, etc.

[0108] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para la fabricación de un SBP con etiqueta de masa, que comprende la aplicación de un método según el párrafo anterior para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, y que además comprende la etapa de unión del metal al polímero. Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales, en el que el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende el producto de reacción de un alqueno y una tetrazina, como un cicloalqueno deformado y una tetrazina, por ejemplo, TCO y una tetrazina. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química clic sin metal, como una reacción química clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales en el que el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende una piridazina. El grupo piridazina en el enlazador puede formar parte de una estructura multianillo. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender dos o más anillos. Por ejemplo, puede ser de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez miembros. En ciertos aspectos, puede comprender un anillo de seis y ocho miembros. Específicamente, puede comprender un grupo ciclooctano. El grupo piridazina y el grupo ciclooctano pueden tener cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo piridazina puede estar separado del SBP por el grupo ciclooctano (lo que significa que el grupo ciclooctano estaría separado del grupo quelante de metales por el grupo piridazina). Como alternativa, el grupo ciclooctano puede separarse del SBP mediante el grupo piridazina (lo que significa que el grupo piridazina se separaría del resto quelante de metales mediante el grupo ciclooctano).

[0110] El SBP con etiqueta de masa que comprende un grupo piridazina puede ser estable en solución. Por ejemplo, la etiqueta de masa del SBP puede ser estable en solución hasta una semana, un mes, seis meses, un año, dos años, cinco años, etc. En ciertos casos, la estabilidad puede aumentarse mediante liofilización. El SBP con etiqueta de masa puede ser estable en solución a -20 ºC (p. ej., si la solución contiene glicerol), bajo cero, 4 ºC, 10 ºC o temperatura ambiente. Si el SBP es un anticuerpo, la estabilidad puede medirse por afinidad del anticuerpo.

[0112] En algunos casos, la reacción de química clic se produce en ausencia de un catalizador metálico, en particular cuando la reacción de química clic se produce en ausencia de cobre o hierro. En algunos casos, la reacción de química clic se realiza en condiciones fisiológicas, opcionalmente a un pH de 6 a 8, como en un tampón isotónico.

[0114] En ocasiones, el alqueno se une al SBP y la tetrazina a la etiqueta de masa o al grupo quelante de metales. En ocasiones, la tetrazina se une al SBP y el alqueno se une a la etiqueta de masa o al grupo quelante de metales. En ocasiones, el alqueno se une al SBP mediante un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). En ocasiones, el alqueno se une a la etiqueta de masa o al grupo quelante de metales mediante un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). En ocasiones, la tetrazina se une al SBP mediante un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). A veces, cuando la tetrazina está unida a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metal, está unida mediante un componente enlazador (opcionalmente a través de un espaciador).

[0115] c. Reacción de alquino con nitrona

[0116] Un tercer ejemplo es la reacción entre un alquino tensado y una nitrona, como una cicloadición nitrona-alquino promovida por la tensión entre un derivado de ciclooctino y una nitrona.

[0119]

[0121] Esquema de reacción (III)

[0122] Aquí, la reacción del ciclooctino y la nitrona une covalentemente los grupos R<1>y R<2>-R<4>. Dada la tensión del anillo de alquino, la reacción de una nitrona orgánica con un alquino cíclico, típicamente ciclooctino, se conoce comúnmente como cicloadición alquino-nitrona promovida por tensión (SPANC). En ciertos aspectos de la presente divulgación, R<1>puede ser el SBP y uno de R<2>R<4>, típicamente R<2>, puede ser la etiqueta de masa. Alternativamente, uno de R<2>-R<1>, típicamente R<2>, puede ser el SBP y R<1>puede ser la etiqueta de masa.

[0123] Se entiende comúnmente que la reactividad mejorada de los ciclooctinos (di)benzoanulados es causada por el aumento de la tensión del anillo impartida por los carbonos con hibridación sp2 múltiple. En la presente divulgación se pueden utilizar diversos tipos de derivados de dibenzociclooctino (DBCO), como los derivatizados (directamente o mediante un enlazador) con ésteres de NHS, por ejemplo, para la conjugación con aminas en la SBP (p. ej., el grupo amino del extremo amino, de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (p. ej., anticuerpos y lectinas), la conjugación con sondas de oligonucleótidos aminomodificadas (disponibles comercialmente en IDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.), entre otros), derivados de aminoazúcares, etc.). Alternativamente, el derivado de DBCO puede derivatizarse (directamente o mediante un espaciador) con una maleimida (p. ej., dibenzociclooctino-maleimida; número de catálogo de Sigma Aldrich 760668, o dibenzociclooctino PEG4-maleimida; Sigma Aldrich (número de catálogo 760676). La funcionalidad maleimida se puede utilizar para acoplar el DBCO a un grupo sulfhidrilo de la etiqueta de masa.

[0124] La nitrona también se puede acoplar a la SBP (directamente o mediante un espaciador) con ésteres de NHS). A través del éster de NHS, la nitrona se puede acoplar a aminas en la SBP (p. ej., el grupo amino del extremo N, de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina en proteínas (p. ej., anticuerpos y lectinas), conjugación con sondas de oligonucleótidos modificados con amino (disponibles comercialmente de IDT (IL, EE. UU.), Sigma Aldrich (MO, EE. UU.), Bio-Synthesis, Inc. (TX, EE. UU.), entre otros), derivados de aminoazúcares, etc.). El componente nitrona también se puede acoplar a la etiqueta de masa.

[0125] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir una SBP con etiqueta de masa, que comprenden la conjugación de la etiqueta de masa y la SBP mediante una reacción SPANC. En algunas formas de realización, el método comprende proporcionar un SBP funcionalizado con alquino y una etiqueta de masa funcionalizada con nitrona, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alquino con dicha etiqueta, por ejemplo, donde el SBP funcionalizado con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. En algunas formas de realización, el método comprende proporcionar un SBP funcionalizado con nitrona y una etiqueta de masa funcionalizada con alquino, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con nitrona y dicha etiqueta, por ejemplo, donde la etiqueta de masa funcionalizada con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. Como se indica más adelante, puede presentarse un espaciador entre el SBP y el alquino o la nitrona, y/o entre la etiqueta de masa y el nitrona o el alquino.

[0126] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un SBP con etiqueta de masa, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un alquino y una nitrona, como un cicloalquino deformado y una nitrona, por ejemplo, DBCO y una nitrona. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química de clic sin metal, como una reacción química de clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un SBP con etiqueta de masa en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende un isoxazol. El grupo isoxazol en el enlazador puede formar parte de una estructura multianular. En ciertos aspectos, la estructura multianular puede comprender 4 o más anillos. Por ejemplo, la estructura multianular puede ser un anillo de 3 miembros, un anillo de 4 miembros, un anillo de 5 miembros, un anillo de 6 miembros, un anillo de 7 miembros, un anillo de 8 miembros, un anillo de 9 miembros, un anillo de 10 miembros, etc. En ciertos aspectos, la estructura multianillo puede comprender dos o más anillos de benceno. Específicamente, puede comprender un grupo dibenzocicloocteno. El grupo isoxazol y el grupo dibenzocicloocteno pueden tener cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo isoxazol puede estar separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno (lo que significa que el grupo dibenzocicloocteno estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo isoxazol). Alternativamente, el grupo dibenzocicloocteno puede estar separado del SBP por el grupo isoxazol (lo que significa que el grupo isoxazol estaría separado de la etiqueta de masa por el grupo dibenzocicloocteno).

[0128] Como se explica a continuación, la etiqueta de masa comprende uno o más átomos marcadores, lo que permite identificar la presencia del objetivo del SBP de forma sencilla en un detector de masas. Sin embargo, el SBP no se conjugará con una etiqueta de masa con los elementos de marcaje ya presentes en ella. En ocasiones, el SBP se conjuga con una fracción quelante de metales antes de que uno o más átomos marcadores se carguen en dicha fracción para formar una etiqueta de masa. Como se explica con más detalle a continuación, la fracción quelante de metales puede ser un único grupo quelante de metales o un polímero al que se ha unido un grupo quelante de metales a cada una de dos o más subunidades.

[0130] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una serie de métodos para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, que comprenden la conjugación de la fracción quelante de metales y el SBP mediante una reacción SPANC. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar un SBP funcionalizado con alquino y una fracción quelante de metales funcionalizada con nitrona, y hacer reaccionar el SBP funcionalizado con alquino con la fracción quelante de metales funcionalizada con nitrona, por ejemplo, donde el SBP funcionalizado con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. En algunas formas de realización, el método comprende los pasos de proporcionar una SBP funcionalizada con nitrona y una fracción quelante de metales funcionalizada con alquino, y hacer reaccionar la SBP funcionalizada con nitrona y la fracción quelante de metales funcionalizada con alquino, por ejemplo, donde la fracción quelante de metales funcionalizada con alquino se funcionaliza con un cicloalquino deformado, por ejemplo, DBCO. Como se indica más adelante, se puede presentar un espaciador entre la SBP y el alquino o la nitrona, y/o la fracción quelante de metales y la nitrona o el alquino.

[0131] La reacción SPAAC puede realizarse en condiciones fisiológicas y es compatible con macrobiomoléculas como proteínas (incluyendo anticuerpos, ligandos, receptores, ácidos nucleicos, etc., como se describe más adelante en la sección sobre SBP en la página 40). Las condiciones fisiológicas pueden incluir una solución isotónica o un tampón biológico como solución salina, tampón salino con fosfato (PBS), etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir, alternativa o adicionalmente, una temperatura de entre 1 ºC y 42 ºC, de 4 ºC a 37 ºC, de 4 ºC a 25 ºC, de 10 ºC a 37 ºC, de 25 ºC a 37 ºC, etc. Las condiciones fisiológicas pueden incluir un pH neutro, un pH de 5,5 a 8,5, un pH de 6 a 8, un pH de 6,5 a 7,5, etc. Dado que la reacción entre DBCO y nitrona puede ser un proceso lento, puede ser preferible un tiempo de incubación relativamente largo. Por ejemplo, la conjugación del paso b) puede realizarse durante 4 a 48 horas a 4 ºC, de 10 a 24 horas a 4 ºC, de 18 a 20 horas a 4 ºC, de 10 minutos a 10 horas a temperatura ambiente, de 30 minutos a 5 horas a temperatura ambiente, de 30 minutos a 3 horas a temperatura ambiente, de 5 minutos a 5 horas a 37 ºC, de 10 minutos a 2 horas a 37 ºC, etc.

[0133] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para fabricar un SBP con etiqueta de masa que comprende realizar un método según el párrafo anterior para producir un SBP conjugado con una fracción quelante de metales, y que comprende además la etapa de unión del metal al polímero.

[0135] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales, donde el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende el producto de reacción de un alquino y una nitrona, como un cicloalquino deformado y una nitrona, por ejemplo, DBCO y una nitrona. En algunos casos, el producto de reacción es el producto de una reacción química clic sin metales, como una reacción química clic sin cobre. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un conjugado de SBP con fracción quelante de metales donde el SBP y la fracción quelante de metales se unen mediante un enlazador que comprende un isoxazol. El grupo isoxazol del enlazador puede formar parte de una estructura multianular. En ciertos aspectos, la estructura multianular puede comprender 4 o más anillos. Por ejemplo, la estructura multianular puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 anillos miembros. En ciertos aspectos, la estructura multianular puede comprender dos o más anillos de benceno. Específicamente, la estructura multianular puede comprender un grupo dibenzocicloocteno. El grupo isoxazol y el grupo dibenzocicloocteno pueden tener cualquier orientación. Por ejemplo, el grupo isoxazol puede estar separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno (lo que significa que el grupo dibenzocicloocteno estaría separado del resto quelante de metales por el grupo isoxazol). Alternativamente, el grupo dibenzocicloocteno puede estar separado del SBP por el grupo isoxazol (lo que significa que el grupo isoxazol estaría separado del grupo quelante metálico por el grupo dibenzocicloocteno).

[0137] La SBP con etiqueta de masa que comprende un grupo isoxazol puede ser estable en solución. Por ejemplo, la etiqueta de masa de la SBP puede ser estable en solución hasta una semana, un mes, seis meses, un año, dos años, cinco años, etc. La etiqueta de masa de la SBP puede ser estable en solución a -20 ºC (p. ej., donde la solución comprende glicerol), bajo cero, 4 ºC, 10 ºC o a temperatura ambiente. Cuando la SBP es un anticuerpo, la estabilidad puede medirse por afinidad del anticuerpo.

[0138] En algunos casos, la reacción de química clic se lleva a cabo en ausencia de un catalizador metálico, en particular cuando la reacción de química clic se lleva a cabo en ausencia de cobre o hierro. En algunos casos, la reacción de química clic se realiza en condiciones fisiológicas, opcionalmente a un pH de 6 a 8, como cuando la reacción de química clic se realiza en un tampón, por ejemplo, donde el tampón es isotónico.

[0140] A veces, el alquino está unido a la SBP y la nitrona está unida a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales. A veces, la nitrona está unida a la SBP y el alquino está unido a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales. A veces, cuando el alquino está unido a la SBP, está unido por un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). A veces, cuando el alquino está unido a la etiqueta de masa o a la fracción quelante de metales, está unido por un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). A veces, cuando la nitrona está unida a la SBP, está unida por un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador). A veces, cuando la nitrona está unida a la SBP, está unida por un componente enlazador (opcionalmente mediante un espaciador).

[0142] Esquemas generales de reacción para la preparación de SBP con etiqueta de masa

[0144] Como será evidente, se pueden realizar diversos órdenes de los pasos del método para Síntesis de un SBP con etiqueta de masa. A continuación, se presentan varios procesos ejemplares:

[0146] (a) (i) Sintetizar una fracción quelante de metales con una funcionalidad reactiva de química clic; (ii) Cargar metales en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa; (iii) Reaccionar la etiqueta de masa con un primer componente enlazador con un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO, etc.); (iv) Reaccionar el SBP con un segundo componente enlazador con un grupo funcional de química clic complementario (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina, etc.); (v) Reaccionar el componente enlazador del SBP con el componente enlazador de la etiqueta de masa para formar un SBP con etiqueta de masa, donde la etiqueta de masa y el SBP están unidos covalentemente mediante un enlazador (formado a partir de los dos componentes enlazadores). Como comprenderá el experto, la idea principal de este método ejemplar es que los metales se cargan en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa antes de que esta reaccione con el enlazador. y luego el SBP. Temporalmente, es posible que el paso (iv), por ejemplo, preceda a los pasos (i), (ii) o (iii), siempre que (i) preceda a (ii), (ii), a (iii) y (i), (ii), (iii) y (iv) a (v). Asimismo, se apreciará que si el SBP o la fracción quelante de metales/etiqueta de masa ya contienen las funcionalidades adecuadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlazador.

[0148] (b) (i) Sintetizar una fracción quelante de metales que comprende una funcionalidad de reactivo de química clic; (ii) hacer reaccionar la fracción quelante de metales con un primer componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO; etc.); (iii) cargar metales en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa; (iv) hacer reaccionar el SBP con otro componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic complementario (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina; etc.); (v) Reaccionar el componente enlazador del SBP con el componente enlazador de la etiqueta de masa para formar un SBP con etiqueta de masa, donde la etiqueta de masa y el SBP se unen covalentemente mediante un enlazador (formado a partir de los dos componentes enlazadores). Como comprenderá el experto, la idea principal de este método ejemplar reside en que la fracción quelante de metales se une al componente enlazador, proporcionando el grupo funcional de química clic, antes de que los metales se carguen en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa antes de que esta reaccione con el SBP. Temporalmente, es posible que el paso (iv), por ejemplo, se presente antes de los pasos (i), (ii) o (iii), siempre que (i) se presente antes de (ii), (ii), antes de (iii) y (i), (ii), (iii) y (iv) antes de (v). Asimismo, se apreciará que si el SBP y/o la fracción quelante de metales/etiqueta de masa ya contienen las funcionalidades adecuadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlazador.

[0150] (c) (i) Sintetizar una fracción quelante de metales que comprende una funcionalidad de reactivo de química clic; (ii) hacer reaccionar la fracción quelante de metales con un primer componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO; etc.); (iii) hacer reaccionar SBP con otro componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic complementario (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina; etc.); (iv) hacer reaccionar el componente enlazador de SBP con el componente enlazador de la fracción quelante de metales para formar un conjugado de SBP y fracción quelante de metales, donde la etiqueta de masa y el SBP están unidos covalentemente por un enlazador (formado a partir de los dos componentes enlazadores); (v) cargar metales en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa. Como comprenderá el experto en la técnica, la idea principal de este método ejemplar es que los metales se cargan en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa después de que la fracción quelante de metales haya reaccionado con el SBP para formar El conjugado de la fracción quelante de metal-SBP. Asimismo, se apreciará que, si la fracción quelante de metal/etiqueta de masa ya contiene las funcionalidades adecuadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlazador.

[0152] (d) (i) Sintetizar una fracción quelante de metal que comprende una funcionalidad de reactivo de química clic; (ii) cargar metales en la fracción quelante de metal para formar una etiqueta de masa; (iii) hacer reaccionar la etiqueta de masa con un primer componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO; etc.); (iv) hacer reaccionar el componente enlazador de la etiqueta de masa con otro componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic complementario (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina; etc.) y un éster de NHS para formar una etiqueta de masa-enlazadora; (v) hacer reaccionar la etiqueta de masa-enlazadora con una SBP para formar una SBP con etiqueta de masa, donde la etiqueta de masa y la SBP están unidas covalentemente por un enlazador (formado a partir de los dos componentes enlazadores). Como se apreciará, si el SBP y/o la etiqueta de masa/fragmento quelante de metales ya contienen las funcionalidades apropiadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlazador. Asimismo, se apreciará que este método puede adaptarse fácilmente de modo que el SBP se enlace a un primer componente enlazador, y dicho componente enlazador SBP se enlace a un segundo componente enlazador para formar un enlazador SNP antes de la conjugación del enlazador SBP con la etiqueta de masa.

[0154] (e) (i) Sintetizar un fragmento quelante de metales que comprende una funcionalidad de reactivo de química clic; (ii) hacer reaccionar el fragmento quelante de metales con un primer componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO; etc.); (iii) cargar metales en el fragmento quelante de metales para formar una etiqueta de masa; (iv) hacer reaccionar el componente enlazador-fragmento de masa con otro componente enlazador que comprende un grupo funcional de química clic complementario (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina; etc.) y un éster de NHS para formar un enlace de etiqueta de masa; (v) hacer reaccionar el enlace de etiqueta de masa con un SBP para formar un conjugado de SBP con un grupo quelante de metales, donde el enlace de etiqueta de masa y el SBP se unen covalentemente mediante un enlace (formado a partir de los dos componentes del enlace). Como se apreciará, si el SBP o el grupo quelante de metales/el enlace de etiqueta de masa ya contienen las funcionalidades adecuadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlace.

[0156] (f) (i) Sintetizar un grupo quelante de metales que comprende una funcionalidad de reactivo de química clic; (ii) hacer reaccionar el grupo quelante de metales con un primer componente enlace que comprende un grupo funcional de química clic (p. ej., azida o DBCO; tetrazina o TCO; etc.); (iii) hacer reaccionar el grupo quelante de metales con otro componente enlace que comprende un grupo funcional complementario de química clic (p. ej., DBCO o azida; TCO o tetrazina; etc.) y un éster de NHS para formar una fracción enlazadora quelante de metales; (iv) hacer reaccionar el componente SBP con la fracción enlazadora quelante de metales para formar una SBP con etiqueta de masa, donde la etiqueta de masa y la SBP se unen covalentemente mediante un enlazador (formado a partir de los dos componentes enlazadores); (v) cargar metales en la fracción quelante de metales para formar una etiqueta de masa. Como se apreciará, si la SBP y/o la fracción quelante de metales/etiqueta de masa ya contienen las funcionalidades adecuadas, no será necesario añadir la funcionalidad mediante la reacción con un componente enlazador. Asimismo, se apreciará que este método puede adaptarse fácilmente de modo que la SBP se enlace a un primer componente enlazador, ese componente enlazador de SBP se enlace a un segundo componente enlazador para formar un enlazador de SNP antes de la conjugación del enlazador de SBP con la fracción quelante de metales y, finalmente, la porción de metales en la fracción quelante de metales.

[0158] En las diversas etapas de reacción de los métodos ejemplares descritos anteriormente en esta subsección, el exceso de componentes de reacción puede eliminarse mediante filtración centrífuga con un límite de peso molecular adecuado para el producto que se desea retener y el exceso de reactivo que se desea eliminar. Por ejemplo, al conjugar un componente enlazador con un anticuerpo IgG, se podría elegir un límite de peso molecular de 50 kiloDaltons (kDa), como 100 kDa o superior, ya que la IgG tiene un peso molecular superior, pero el enlazador normalmente tendría un peso molecular significativamente inferior. Dichos filtros de centrifugación pueden utilizarse para separar la SBP marcada de la etiqueta, si esta última tiene un peso molecular significativamente inferior al límite de corte (por ejemplo, etiquetas de masa de polímero con un rango de masas de uno a varias decenas de miles). En algunos casos, pueden ser necesarias varias rondas de filtración centrífuga seguidas de un reabastecimiento del volumen de la solución filtrada para eliminar la impureza. El número de rondas necesarias se puede evaluar detectando si aparece reactivo sin reaccionar en el flujo del proceso de filtración centrífuga, como es habitual en la técnica.

[0160] Las proteínas más pequeñas serán mucho más difíciles de separar de los componentes del marcador/enlazador mediante una filtración centrífuga relativamente sencilla, y en este caso puede ser necesario utilizar técnicas cromatográficas más complejas, como la cromatografía de exclusión por tamaño. Cuando la masa de la SBP y la masa de la SBP marcada por masa no difieren significativamente, la purificación de la SBP marcada de la no marcada al final de la reacción puede ser más difícil. Por consiguiente, es aquí donde se hace evidente una de las principales ventajas de las reacciones de química clic, como se describe aquí: los altos rendimientos y eficiencias de los pasos de química clic garantizan que la SBP sin reaccionar se mantenga al mínimo posible.

[0162] Como alternativa, los grupos funcionales no reaccionados del SBP (o del componente enlazador del SBP o del enlazador del SBP, como se explicó anteriormente) podrían hacerse reaccionar con otro enlazador bifuncional que comprende, por ejemplo, biotina como una de las funcionalidades. Por lo tanto, el SBP que no se ha unido a la etiqueta de masa puede extraerse de la solución mediante incubación con un soporte sólido recubierto con avidina (o un derivado de esta), como una perla recubierta de avidina.

[0164] La catálisis sin catalizador metálico se refiere únicamente a la presencia de metales que actúan como catalizadores en la etapa de la reacción, no a la ausencia de metal per se. Como se indicó en los párrafos anteriores, es posible cargar el componente de etiqueta de masa utilizado para formar los SBP con etiqueta de masa de ciertos aspectos de la divulgación antes de la reacción con el SBP, por lo que la mezcla de reacción puede contener átomos metálicos unidos al componente de etiqueta de masa (por ejemplo, quelados a grupos colgantes que se ramifican para formar una cadena principal de polímero). Al unirse a la etiqueta de masa, dichos metales no actuarían como catalizador, aunque podrían tener un efecto como ion libre; por lo tanto, la reacción seguiría sin catalizador metálico.

[0165] Por lo tanto, ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un SBP con etiqueta de masa, que comprende un SBP y una etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlace covalente, formado al menos en parte por un producto de reacción de química clic.

[0166] Etiquetas de masa

[0167] La etiqueta de masa utilizada en ciertos aspectos de la presente divulgación puede adoptar diversas formas. Normalmente, la etiqueta comprende al menos un átomo de marcado. Un átomo de marcado se describe a continuación. Por consiguiente, en su forma más simple, la etiqueta de masa puede comprender una fracción quelante de metales, que es un grupo quelante de metales con un átomo de marcado de metal coordinado en el ligando. En algunos casos, puede ser suficiente detectar un solo átomo de metal por etiqueta de masa. Sin embargo, en otros casos, puede ser deseable que cada etiqueta de masa contenga más de un átomo de marcado. Esto se puede lograr de diversas maneras, como se describe a continuación.

[0168] Un primer método para generar una etiqueta de masa que pueda contener más de un átomo marcador es el uso de un polímero que comprende ligandos quelantes de metales unidos a más de una subunidad del polímero. El número de grupos quelantes de metales capaces de unir al menos un átomo metálico en el polímero puede estar entre aproximadamente 1 y 10000, como 5-100, 10-250, 250-5000, 500-2500 o 500-1000. Al menos un átomo metálico puede estar unido a al menos uno de los grupos quelantes de metales. El polímero puede tener un grado de polimerización de entre aproximadamente 1 y 10000, como 5-100, 10-250, 250-5000, 500-2500 o 500-1000. Por consiguiente, una etiqueta de masa basada en polímero puede comprender aproximadamente entre 1 y 10000 átomos marcadores, como 5-100, 10-250, 250-5000, 500-2500 o 500-1000.

[0169] El polímero puede seleccionarse del grupo que consiste en polímeros lineales, copolímeros, polímeros ramificados, copolímeros de injerto, polímeros de bloque, polímeros en estrella y polímeros hiperramificados. La estructura principal del polímero puede derivar de poliacrilamida sustituida, polimetacrilato o polimetacrilamida y puede ser un derivado sustituido de un homopolímero o copolímero de acrilamidas, metacrilamidas, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ácido acrílico o ácido metacrílico. El polímero puede sintetizarse del grupo que consiste en polimerización por fragmentación por adición reversible (RAFT), polimerización radical por transferencia atómica (ATRP) y polimerización aniónica. La etapa de obtención del polímero puede comprender la síntesis del polímero a partir de compuestos seleccionados del grupo que consiste en N-alquilacrilamidas, N,N-dialquilacrilamidas, N-arilacrilamidas, N-alquilmetacrilamidas, N,N-dialquilmetacrilamidas, narilmetacrilamidas, ésteres de metacrilato, ésteres de acrilato y equivalentes funcionales de los mismos.

[0170] El polímero puede ser soluble en agua. Esta fracción no está limitada por el contenido químico. Sin embargo, simplifica el análisis si el esqueleto tiene un tamaño relativamente reproducible (por ejemplo, longitud, número de átomos de etiqueta, carácter dendrímero reproducible, etc.). También se tienen en cuenta los requisitos de estabilidad, solubilidad y no toxicidad. Por lo tanto, la preparación y caracterización de un polímero funcional soluble en agua mediante una estrategia sintética que coloca numerosos grupos funcionales a lo largo de la cadena principal, además de un grupo reactivo diferente (el grupo de enlace), que puede utilizarse para unir el polímero a una molécula (por ejemplo, un SBP), mediante un enlazador y, opcionalmente, un espaciador. El tamaño del polímero se puede controlar mediante el control de la reacción de polimerización. Normalmente, el tamaño del polímero se seleccionará de forma que su radiación de giro sea lo más pequeña posible, por ejemplo, entre 2 y 11 nanómetros. La longitud de un anticuerpo IgG, una SBP ejemplar, es de aproximadamente 10 nanómetros; por lo tanto, una etiqueta de polímero excesivamente grande en relación con el tamaño de la SBP puede interferir estéricamente con la unión de la SBP a su objetivo.

[0171] El grupo quelante de metales capaz de unirse a al menos un átomo metálico puede comprender al menos cuatro grupos de ácido acético. Por ejemplo, el grupo quelante de metales puede ser un grupo dietilentriaminopentaacetato (DTPA) o un grupo ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Los grupos alternativos incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA).

[0172] El grupo quelante de metales puede unirse al polímero a través de un éster o a través de una amida. Los ejemplos de polímeros quelantes de metales adecuados incluyen los polímeros X8 y DM3 disponibles en Fluidigm Canada, Inc. El polímero puede ser soluble en agua. Debido a su estabilidad hidrolítica, se pueden usar N-alquil acrilamidas, N-alquil metacrilamidas y ésteres de metacrilato o equivalentes funcionales. Un grado de polimerización (GP) de aproximadamente 1 a 1000 (1 a 2000 átomos de la cadena principal) abarca la mayoría de los polímeros de interés. Polímeros más grandes están en el alcance de la presente divulgación con la misma funcionalidad y son posibles como lo entenderían los profesionales expertos en la técnica. Típicamente, el grado de polimerización estará entre 1 y 10.000, como 5-100, 10-250, 250-5.000, 500-2.500 o 500-1.000. Los polímeros pueden ser susceptibles de síntesis por una ruta que conduce a una polidispersidad relativamente estrecha. El polímero puede ser sintetizado por polimerización radical por transferencia atómica (ATRP) o polimerización por adición-fragmentación reversible (RAFT), que debería conducir a valores de Mw (peso molecular promedio en peso) / Mn (peso molecular promedio en número) en el rango de 1,1 a 1,2. Una estrategia alternativa que implica la polimerización aniónica, donde se obtienen polímeros con Mw/Mn de aproximadamente 1,02 a 1,05. Ambos métodos permiten el control sobre los grupos terminales, a través de una elección de agentes iniciadores o terminadores. Esto permite sintetizar polímeros a los que se puede unir el enlazador. Se puede adoptar una estrategia para preparar polímeros que contienen grupos colgantes funcionales en la unidad repetitiva a la que se puede unir la unidad de metal de transición ligada (por ejemplo, una unidad Ln) en un paso posterior. Esta forma de realización presenta varias ventajas. Evita las complicaciones que podrían surgir al realizar polimerizaciones de monómeros que contienen ligando.

[0173] Para minimizar la repulsión de porción entre los grupos colgantes, los ligandos objetivo para (M<3+>) deben conferir una porción neta de -1 al quelato.

[0174] Los polímeros que se pueden utilizar en ciertos aspectos de la presente divulgación incluyen:

[0175] - copolímero aleatorio poli(DMA-co-NAS): la síntesis de un copolímero aleatorio de relación molar 75/25 de N-acriloxisuccinimida (NAS) con N,N-dimetil acrilamida (OMA) mediante RAFT con alta conversión, excelente control de masa molar en el rango de 5000 a 130.000 y con Mw/Mn ≈ 1,1 se describe en Relógio et al. (2004) (Polymer, 45, 8639-49). El éster NHS activo reacciona con un grupo quelante de metales que porta un grupo amino reactivo para obtener el copolímero quelante de metales sintetizado mediante polimerización RAFT.

[0176] - poli(NMAS): el NMAS puede polimerizarse mediante ATRP, obteniendo polímeros con una masa molar media de entre 12 y 40 kDa, con una relación Mw/Mn de aproximadamente 1,1 (véase, por ejemplo, Godwin et al., 2001; Angew. Chem.Int.Ed, 40: 594-97).

[0177] - poli(MAA): El ácido polimetacrílico (PMAA) puede prepararse mediante polimerización aniónica de su éster de t-butilo o trimetilsililo (TMS).

[0178] - poli(DMAEMA): el poli(metacrilato de dimetilaminoetilo) (PDMAEMA) se puede preparar mediante ATRP (véase Wang et al., 2004, J.Am.Chem.Soc, 126, 7784-85). Este polímero es bien conocido y se prepara fácilmente con valores medios de Mn de 2 a 35 kDa, con una relación Mw/Mn de aproximadamente 1,2. Este polímero también se puede sintetizar mediante polimerización aniónica con una distribución de tamaño más estrecha.

[0179] - poliacrilamida o polimetacrilamida.

[0180] Los grupos quelantes de metales se pueden unir al polímero mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica; por ejemplo, el grupo colgante se puede unir mediante un éster o una amida. Por ejemplo, en un polímero basado en metilacrilato, el grupo quelante de metales se puede unir a la cadena principal del polímero primero mediante la reacción del polímero con etilendiamina en metanol, seguida de la reacción posterior de anhídrido de DTPA en condiciones alcalinas en un tampón de carbonato.

[0181] Un segundo método consiste en generar nanopartículas que actúen como marcadores de masa. Una primera vía para generar dichos marcadores de masa es el uso de nanopartículas metálicas recubiertas de un polímero. En este caso, el metal queda secuestrado y protegido del entorno por el polímero, y no reacciona cuando la capa de polímero puede reaccionar, por ejemplo, mediante grupos funcionales incorporados a la capa de polímero. Los grupos funcionales se pueden hacer reaccionar con componentes enlazadores (que opcionalmente incorporan un espaciador) para unir reactivos de química clic, lo que permite que este tipo de marcador de masa se integre en las estrategias sintéticas descritas anteriormente de forma sencilla y modular.

[0182] El injerto a y el injerto desde son los dos mecanismos principales para generar cepillos de polímero alrededor de una nanopartícula. En el injerto, los polímeros se sintetizan por separado, por lo que la síntesis no se ve limitada por la necesidad de mantener la nanopartícula coloidalmente estable. En este caso, la síntesis por transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT) ha sobresalido debido a la gran variedad de monómeros y la fácil funcionalización. El agente de transferencia de cadena (CTA) puede utilizarse fácilmente como grupo funcional, un CTA funcionalizado o las cadenas poliméricas pueden posfuncionalizarse. Se utiliza una reacción química o fisisorción para unir los polímeros a la nanopartícula. Una desventaja del injerto es la densidad de injerto, generalmente menor, debido a la repulsión estérica de las cadenas poliméricas enrolladas durante la unión a la superficie de la partícula. Todos los métodos de injerto presentan el inconveniente de que se requiere un tratamiento riguroso para eliminar el exceso de ligando libre de la partícula nanocompuesta funcionalizada. Esto se logra típicamente mediante precipitación selectiva y centrifugación. En el enfoque de injerto, las moléculas, como los iniciadores para la polimerización radical por transferencia atómica (ATRP) o los CTA para las polimerizaciones (RAFT), se inmovilizan en la superficie de la partícula. Las desventajas de este método son el desarrollo de nuevas reacciones de acoplamiento del iniciador. Además, a diferencia del injerto, las partículas deben ser coloidalmente estables bajo las condiciones de polimerización.

[0183] Un medio adicional para generar una etiqueta de masa es mediante el uso de perlas dopadas. Los iones de lantánido quelados (u otros metales) se pueden emplear en la polimerización en nanoemulsión para crear partículas poliméricas con los iones de lantánido quelados incrustados en el polímero. Los grupos quelantes se seleccionan, como es sabido por los expertos en la técnica, de tal manera que el quelato metálico tenga una solubilidad insignificante en agua, pero una solubilidad razonable en el monómero para la polimerización en nanoemulsión. Los monómeros típicos que se pueden emplear son estireno, metilestireno, diversos acrilatos y metacrilatos, entre otros, como es conocido por los expertos en la técnica. Para robustez mecánica, las partículas marcadas con metal tienen una temperatura de transición vítrea (Tg) superior a la temperatura ambiente. En algunos casos, se utilizan partículas de núcleo-capa, en las que las partículas que contienen metal preparadas por polimerización en nanoemulsión se utilizan como partículas semilla para una polimerización en emulsión sembrada para controlar la naturaleza de la funcionalidad de la superficie. La funcionalidad de la superficie se puede introducir a través de la elección de monómeros apropiados para esta polimerización de segunda etapa. Además, los polímeros de acrilato (y posiblemente metacrilato) son ventajosos sobre las partículas de poliestireno porque los grupos éster pueden unirse o estabilizar los sitios de ligando insatisfechos en los complejos de lantánidos. Un método ejemplar para hacer tales perlas dopadas es: (a) combinar al menos un complejo que contiene un átomo de marcado en una mezcla de disolventes que comprende al menos un monómero orgánico (tal como estireno y/o metacrilato de metilo en una forma de realización) en el que el al menos un complejo que contiene un átomo de marcado es soluble y al menos un disolvente diferente en el que dicho monómero orgánico y dicho al menos un complejo que contiene un átomo de marcado son menos solubles, (b) emulsionar la mezcla del paso (a) durante un período de tiempo suficiente para proporcionar una emulsión uniforme; (c) iniciar la polimerización y continuar la reacción hasta que una porción sustancial del monómero se convierte en polímero; y (d) incubar el producto del paso (c) durante un período de tiempo suficiente para obtener una suspensión de látex de partículas poliméricas con el al menos un complejo que contiene un átomo de marcado incorporado en o sobre las partículas en la misma, en donde dicho al menos un complejo que contiene un átomo de marcado se selecciona de tal manera que al interrogar la etiqueta de masa polimérica, se obtiene una señal de masa distintiva de dicho al menos un átomo de marcado. Mediante el uso de dos o más complejos con diferentes átomos marcadores, se pueden fabricar perlas dopadas con dos o más átomos marcadores diferentes. Además, el control de la proporción de los complejos con diferentes átomos marcadores permite la producción de perlas dopadas con diferentes proporciones de átomos marcadores. El uso de múltiples átomos marcadores en diferentes proporciones aumenta el número de marcadores de masa claramente identificables. En nanoesferas con núcleo-capa, esto puede lograrse incorporando un primer complejo que contiene un átomo marcador en el núcleo y un segundo complejo que contiene un átomo marcador en la capa.

[0185] Otro método consiste en generar un polímero que incluya el átomo marcador en su estructura principal, en lugar de como un ligando metálico coordinado. Por ejemplo, Carerra y Seferos (Macromolecules 2015, 48, 297-308) describen la inclusión de telurio en la estructura principal de un polímero. Otros polímeros que incorporan átomos capaces de funcionar como átomos marcadores son los polímeros que incorporan estaño, antimonio y bismuto. Dichas moléculas se analizan, entre otros, en Priegert et al., 2016 (Chem. Soc. Rev., 45, 922-953).

[0187] Por lo tanto, la etiqueta de masa puede comprender al menos dos componentes: los átomos marcadores y un polímero que forma quelato, contiene o está dopado con el átomo marcador. Además, la etiqueta de masa comprende un grupo de unión (cuando no está conjugado con la SBP), que forma parte del enlace químico entre la etiqueta de masa y la SBP después de la reacción de los dos componentes, en una reacción de química clic en línea con la discusión anterior.

[0188] Proteínas y péptidos de unión a metales

[0190] Los sistemas biológicos (bacterias y células eucariotas) expresan proteínas y péptidos de unión a metales, que están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos importantes. En consecuencia, dichas proteínas y péptidos se pueden usar como etiquetas de masa como se analiza en este documento, ya que los metales en estas moléculas se pueden detectar mediante un detector de masas (el metal que contienen se usa como un átomo de marcado como se analiza en este documento). La proteína o el péptido que contiene metal se puede unir a la SBP a través de las mismas técnicas que otras etiquetas de masa descritas en este documento, utilizando grupos reactivos naturales en la proteína o el péptido o siguiendo la funcionalización apropiada de la proteína o el péptido de unión a metales si se desea. Cuando tanto la SBP como la etiqueta de masa son proteínas, entonces típicamente la SBP se hará reaccionar con un reactivo basado en éster de NHS, reactivo con funcionalidades de amina y que proporciona la mitad de los grupos reactivos en una reacción de química clic (p. ej., tetrazina). La proteína o péptido de unión a metal reaccionaría entonces con un segundo reactivo basado en NHS, reactivo con funcionalidades de amina y que proporciona la otra mitad de los grupos reactivos en una reacción de química clic (p. ej., cicloocteno deformado). A continuación, se establece un rango ejemplar de dichas proteínas y péptidos de unión a metal. Por consiguiente, en algunas formas de realización descritas en este documento, la etiqueta de masa es una proteína o péptido de unión a metal.

[0192] Antecedentes de las proteínas y péptidos de unión a metal

[0194] Los iones metálicos pueden ser esenciales para la estructura terciaria correcta de una proteína o péptido de unión a metal. Algunas proteínas o péptidos de unión a metal son enzimas. Los iones metálicos pueden estar unidos al sitio activo de una enzima y ser esenciales para una actividad enzimática correcta. Algunas proteínas y péptidos que se unen a metales se unen a iones metálicos individuales, mientras que otros se unen a grupos de iones metálicos. Las proteínas o péptidos que se unen a metales son responsables de catalizar procesos como la fotosíntesis y la respiración. También participan en procesos como el secuestro, la acumulación y la reducción de la toxicidad de metales pesados.

[0196] Los sitios de unión a metales en las proteínas y péptidos que se unen a metales varían en sus números de coordinación y geometrías, sus preferencias metálicas y sus ligandos. A pesar de la variación en proteínas y péptidos que se unen a metales, se han identificado algunas características comunes; por ejemplo, los sitios de unión a metales generalmente se centran en regiones de hidrofobicidad (PNAS, 1990, vol. 87, págs. 5648-5652). Típicamente, los iones metálicos están coordinados por grupos donantes. Ejemplos de grupos donantes incluyen centros de nitrógeno, oxígeno o azufre en los aminoácidos de la proteína o péptido. Los grupos donantes pueden estar en la cadena lateral de residuos de aminoácidos o en la estructura principal de la proteína o péptido.

[0198] Una variedad de diferentes metales están presentes en las proteínas en la naturaleza, por ejemplo, el zinc está presente en una serie de factores de transcripción y la anhidrasa carbónica. El molibdeno está presente en la nitrogenasa (que fija el nitrógeno atmosférico). El cobre está presente en varias proteínas, al igual que el calcio, particularmente en proteínas asociadas con la señalización.

[0200] Proteínas y péptidos de unión a metales ejemplares de uso

[0202] Dado el rango de diferentes funciones en las que participan las proteínas de unión a metales, los metales en las proteínas de unión a metales son comunes en las muestras biológicas. En consecuencia, cuando las proteínas y los péptidos de unión a metales se utilizan como etiquetas de masa de acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación, como lo entiende la persona experta, se deberá realizar una evaluación para determinar los metales naturales prevalentes en el tejido/célula que se analizará (por ejemplo, el tejido y las células derivadas del hígado serán ricos en hierro). Por lo tanto, se debe elegir una proteína o péptido de unión a metales como etiqueta de masa que comprenda un metal que sea distinguible sobre los metales naturales (por ejemplo, un elemento o isótopo diferente).

[0204] Cuando la proteína de unión a metales utilizada como etiqueta de masa es una enzima, normalmente no se desea su actividad enzimática. Por consiguiente, la SBP con etiqueta de masa que comprende la proteína de unión a metales se utilizará en condiciones que impidan o limiten la actividad enzimática. Alternativamente, la proteína de unión a metales puede ser una versión mutada de una enzima natural, mutada de forma que aún se une al metal, pero no es catalíticamente activa.

[0206] Las proteínas de unión a metales con mayor rango de uso serán aquellas capaces de unirse a metales que no se encuentran típicamente en los tejidos, por ejemplo, las proteínas que normalmente se unen a metales pesados en caso de intoxicación por metales, que pueden cargarse con estos metales antes o después de la conjugación de una proteína o péptido de unión a metales (como etiqueta de masa) a una SBP. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la proteína o péptido de unión a metales se une a un metal pesado.

[0208] Las metalotioneínas son una familia de proteínas ricas en sulfhidrilo y de bajo peso molecular, ubicuas en los tejidos animales. Las metalotioneínas se caracterizan por su contenido inusualmente alto de cisteína (normalmente 30 %) y la ausencia de aminoácidos aromáticos. Sin embargo, existe poca homología estructural entre ellas. Las metalotioneínas desempeñan funciones importantes en el crecimiento y la diferenciación celular, así como un papel importante como antioxidantes (World J. Gastroenterol., 2007, 13(7): 993-996). Se unen a una amplia gama de metales, como cadmio, cinc, cobre, cobalto, plata y mercurio. También se ha demostrado que se unen in vitro a otros metales, como Ag(I), Au(I), Bi(III), Co(II), Fc(II), Hg(II), Ni(II) y Pt(II). En particular, las metalotioneínas presentan una fuerte afinidad por el cadmio (J. Biol. Chem, 1985, 260(9): 5342-5350). Por lo tanto, las metalotioneínas son particularmente útiles como etiquetas de masa debido a la amplia gama de diferentes átomos marcadores de metales que pueden unirse, lo que el experto entendería que es seleccionable para que el átomo de marcado en una etiqueta de masa de metalotioneína pueda detectarse contra el fondo de los metales presentes de forma natural en la muestra particular que se va a analizar. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la proteína o péptido de unión a metal es una metalotioneína.

[0210] Las fitoquelatinas se encuentran en las plantas. Las fitoquelatinas son una familia de proteínas que consisten en los aminoácidos Glu, Cys y Gly. Los residuos de Glu y Cys están unidos a través de un enlace gamma carboxilamida. La familia de las fitoquelatinas está formada por polímeros con diferentes repeticiones del dipéptido Glu-Cys, aunque existen algunas variantes estructurales. Las fitoquelatinas están estructuralmente relacionadas con el glutatión. Las fitoquelatinas son quelantes de iones metálicos y desempeñan un papel importante en la desintoxicación de metales pesados (Plant Physiol., 2000, 123(3):825-32). Por consiguiente, en algunas formas de realización, la proteína o péptido de unión a metales es una fitoquelatina.

[0212] El vanadio metálico se une únicamente a unas pocas especies proteicas, como las proteínas vanabina de las células sanguíneas de ascidias y tunicados. Por consiguiente, puede utilizarse para marcar, por ejemplo, células de mamíferos debido a su ausencia en dichas células en cantidades significativas. Como se mencionó anteriormente, la especificidad de las proteínas y péptidos de unión a metales naturales por iones metálicos varía considerablemente. Algunas proteínas y péptidos de unión a metales se unen a iones metálicos de forma inespecífica, mientras que otros solo se unen a iones metálicos específicos. Se han desarrollado péptidos sintéticos cortos de unión a metales que solo se unen a un tipo de metal pesado, por ejemplo, mercurio (Biopolymers, 2002, 64(4):187-97). Por consiguiente, en algunas formas de realización, el péptido de unión a metales es un péptido artificial. En algunas formas de realización, múltiples péptidos de unión a metales con especificidades particulares pueden unirse en una sola cadena polipeptídica. De esta manera, múltiples elementos/isótopos diferentes pueden unirse a un solo polipéptido, lo que permite la generación de marcadores combinatorios, aumentando así el número de marcadores únicos que pueden producirse utilizando péptidos de unión a metales. Otros reactivos de este tipo pueden derivarse de proteínas que comprenden grupos de diferentes metales.

[0213] En ciertas formas de realización, el/los metal(es) unido(s) por una o más proteínas o péptidos de unión a metales tiene(n) más de 80 uma, más de 90 uma o más de 100 uma. En particular, el uso de proteínas o péptidos de unión a metales con una unión a metales superior a 80 uma se utiliza cuando la muestra se analiza mediante un aparato que utiliza un ICP mantenido en gas argón como medio para ionizar el material de muestra para su detección. En algunas formas de realización, la proteína o péptido de unión a metal comprende un metal con una masa superior a 80 uma que no es un lantánido.

[0215] Una proteína de unión a metal puede estar unida a metales de un isótopo específico. Por lo tanto, la misma proteína de unión a metal unida a diferentes isótopos de su metal puede usarse para marcar diferentes SBP (p. ej., diferentes anticuerpos).

[0217] Los kits, según ciertos aspectos de la presente divulgación, como se define en la página 61, pueden incluir varias proteínas de unión a metal, cada una unida a (o funcionalizada para unirse a) un SBP, como un anticuerpo específico. Algunos kits pueden tener la misma proteína de unión a metal unida a diferentes SBP, donde cada proteína de unión a metal unida a un SBP diferente está unida a un isótopo diferente del mismo metal (p. ej., con una pureza isotópica de al menos el 80 %, 90 %, 95 % o 99 %). El kit puede comprender además proteínas de unión a metales unidas a diferentes metales (o isótopos de estos), cada una unida (o funcionalizada para unirse) a una SBP, como un anticuerpo específico.

[0219] Un kit que comprende al menos una proteína de unión a metales unida (o funcionalizada para unirse) a una SBP puede comprender además al menos un polímero (p. ej., lineal o ramificado) que comprende metal en grupos de unión colgantes (p. ej., átomos metálicos unidos a grupos quelantes DTPA o DOTA) o que comprende metal en la estructura principal del polímero. De forma similar, el polímero puede estar unido (o funcionalizado para unirse) a una SBP, como un anticuerpo. En ciertos aspectos, el polímero puede comprender uno o más lantánidos, mientras que la proteína de unión a metales puede unirse a un metal distinto de un lantánido. En ciertos aspectos, tanto la proteína de unión a metales como el polímero se unen (o funcionalizan para unirse) a una SBP mediante la misma química de conjugación (como una de las reacciones de química clic descritas en este documento).

[0221] Las formas de realización de la presente divulgación incluyen métodos para teñir una muestra biológica con varias SBP marcadas con proteínas de unión a metales, además de poner la muestra en contacto con uno o más reactivos adicionales. Estos reactivos pueden incluir un metalofármaco, un colorante histoquímico que contiene metal o SBP marcadas con polímero que no contiene metal proteico, como se describe en este documento. Cada reactivo adicional puede comprender un metal con diferente masa isotópica entre sí y con respecto a las SBP marcadas con proteínas de unión a metales. Algunos aspectos de la presente divulgación también proporcionan muestras teñidas con una SBP conjugada con una proteína de unión a metales.

[0223] Por lo tanto, la divulgación también se refiere a nuevos usos de proteínas o péptidos de unión a metales. Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan el uso de una proteína o péptido de unión a metales en el marcaje de una muestra para citometría de masas, incluyendo la citometría de masas por imagen. Algunos aspectos de la presente divulgación también proporcionan el uso de una SBP marcada con masa que comprende una proteína o péptido de unión a metales en el marcaje de una muestra para citometría de masas, incluyendo la citometría de masas por imagen. Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan el uso de una proteína o péptido de unión a metales en la producción de una SBP con etiqueta de masa que comprende una proteína o péptido de unión a metales. En la página 24 se describen ejemplos específicos de métodos de fabricación de dichas SBP con etiqueta de masa que comprenden una proteína o péptido de unión a metales mediante química clic.

[0225] Átomo marcador

[0227] Los átomos marcadores que se pueden utilizar con la divulgación incluyen cualquier especie detectable por espectrometría de masas (EM) o espectrometría de emisión óptica (EEO) y que esté sustancialmente ausente en la muestra de tejido no marcado. Así, por ejemplo, los átomos de<12>C no serían adecuados como átomos marcadores debido a su abundancia natural, mientras que el<11>C podría, en teoría, utilizarse para la EM debido a su isótopo artificial que no se encuentra en la naturaleza. A menudo, el átomo de marcaje es un metal. Sin embargo, en formas de realización preferidas, los átomos marcadores son metales de transición, como las tierras raras (los 15 lantánidos, además del escandio y el itrio). Estos 17 elementos (que pueden distinguirse mediante EEO y EM) proporcionan numerosos isótopos diferentes que pueden distinguirse fácilmente (mediante EM). Una amplia variedad de estos elementos está disponible en forma de isótopos enriquecidos; por ejemplo, el samario tiene 6 isótopos estables y el neodimio, 7, todos ellos disponibles en forma enriquecida. Los 15 elementos lantánidos proporcionan al menos 37 isótopos con masas únicas no redundantes. Ejemplos de elementos que son adecuados para su uso como átomos marcadores incluyen Lantano (La), Cerio (Ce), Praseodimio (Pr), Neodimio (Nd), Prometio (Pm), Samario (Sm), Europio (Eu), Gadolinio, (Gd), Terbio (Tb), Disprosio (Dy), Holmio (Ho), Erbio (Er), Tulio (Tm), Iterbio (Yb), Lutecio (Lu), Escandio (Sc) e Itrio (Y). Además de los metales de tierras raras, otros átomos de metal son adecuados para la detección, p. ej. oro (Au), platino (Pt), iridio (Ir), rodio (Rh), bismuto (Bi), etc. El uso de isótopos radiactivos no es preferido ya que son menos cómodos de manejar y son inestables, p. ej. Pm no es un átomo de marcaje preferido entre los lantánidos.

[0229] Para facilitar el análisis del tiempo de vuelo (TOF) (como se explica en este documento), resulta útil utilizar átomos marcadores con una masa atómica en el rango de 80 a 250, por ejemplo, en el rango de 80 a 210, o en el rango de 100 a 200. Este rango incluye todos los lantánidos, pero excluye Sc e Y. El rango de 100 a 200 permite un análisis teórico de 101-plex utilizando diferentes átomos marcadores, aprovechando al mismo tiempo la alta velocidad de barrido espectral de TOF MS. Como se mencionó anteriormente, al elegir átomos marcadores cuyas masas se encuentren en una ventana por encima de las observadas en una muestra no marcada (por ejemplo, en el rango de 100 a 200), la detección TOF se puede utilizar para proporcionar imágenes rápidas a niveles biológicamente significativos.

[0231] Se pueden unir varios números de átomos marcadores a un solo miembro de SBP dependiendo de la etiqueta de masa utilizada (y por lo tanto el número de átomos marcadores por etiqueta de masa) y el número de etiquetas de masa que están unidas a cada SBP) Se puede lograr una mayor sensibilidad cuando se unen más átomos marcadores a cualquier miembro de SBP. Por ejemplo, se pueden unir más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 átomos marcadores a un miembro de SBP, como hasta 10.000, por ejemplo 5-100, 10-250, 250-5.000, 500-2.500 o 500-1.000 átomos marcadores. Como se mencionó anteriormente, se pueden usar polímeros monodispersos que contienen múltiples unidades monoméricas, cada una con un quelante como el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o DOTA. El DTPA, por ejemplo, se une a 3+ iones lantánidos con una constante de disociación de aproximadamente 10<-6>M. Estos polímeros pueden terminar en un tiol que puede utilizarse para unirse a una SBP mediante la reacción de esta con una maleimida para obtener una reactividad química clic similar a la descrita anteriormente. También se pueden utilizar otros grupos funcionales para la conjugación de estos polímeros, por ejemplo, grupos reactivos con aminas, como los ésteres de N-hidroxisuccinimida, o grupos reactivos contra carboxilos o contra la glicosilación de un anticuerpo. Cualquier número de polímeros puede unirse a cada SBP. Ejemplos específicos de polímeros que pueden utilizarse incluyen polímeros de cadena lineal ("X8") o polímeros dendríticos de tercera generación ("DN3"), ambos disponibles como reactivos MaxPa<TM>. El uso de nanopartículas metálicas también puede utilizarse para aumentar el número de átomos en una etiqueta, como se explicó anteriormente.

[0233] En algunas formas de realización, todos los átomos marcadores en una etiqueta de masa tienen la misma masa atómica. Alternativamente, una etiqueta de masa puede comprender átomos marcadores con diferente masa atómica. Por consiguiente, en algunos casos, una muestra marcada puede marcarse con una serie de SBP con etiqueta de masa, cada una de las cuales comprende un solo tipo de átomo de marcado (donde cada SBP se une a su objetivo cognado y, por lo tanto, cada tipo de etiqueta de masa se localiza en la muestra en un antígeno específico, por ejemplo). Alternativamente, en algunos casos, una muestra marcada puede marcarse con una serie de SBP con etiqueta de masa, cada una de las cuales comprende una mezcla de átomos de marcado. En algunos casos, las SBP con etiqueta de masa utilizadas para marcar la muestra pueden comprender una mezcla de aquellos con etiquetas de masa de un solo átomo de etiquetado y mezclas de átomos de etiquetado en sus etiquetas de masa.

[0235] Espaciador

[0237] Como se mencionó anteriormente, en algunos casos, el SBP se conjuga con una etiqueta de masa a través de un enlazador que comprende un espaciador. Puede haber un espaciador entre el SBP y el reactivo de química clic (por ejemplo, entre el SBP y el cicloalquino (o azida) deformado; cicloalqueno (o tetrazina) deformado; etc.). Puede haber un espaciador entre la etiqueta de masa y el reactivo de química clic (por ejemplo, entre la etiqueta de masa y la azida (o cicloalquino) deformado; tetrazina (o cicloalqueno) deformado; etc.). En algunos casos, puede haber un espaciador tanto entre el SNP y el reactivo de química clic, como entre el reactivo de química clic y la etiqueta de masa.

[0239] El espaciador puede ser un espaciador de polietilenglicol (PEG), un espaciador de poli(N-vinilpirrolido) (PVP), un espaciador de poliglicerol (PG), un espaciador de poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida), una polioxazolina (POZ, como polimetiloxazolina, polietiloxazolina o polipropiloxazolina) o un espaciador de alquilo no cíclico C5-C20. Por ejemplo, el espaciador puede ser un espaciador de PEG con 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 15 o más, o 20 o más unidades de EG (etilenglicol). El enlazador de PEG puede tener de 3 a 12 unidades de EG, de 4 a 10, o 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de EG. El enlazador puede incluir cistamina o derivados de la misma, uno o más grupos disulfuro o cualquier otro enlazador adecuado conocido por un experto en la técnica.

[0241] Los espaciadores pueden ser beneficiosos para minimizar el efecto estérico de la etiqueta de masa en la SBP a la que se conjuga. Los espaciadores hidrófilos, como los basados en PEG, también pueden actuar para mejorar la solubilidad de la SBP con etiqueta de masa y actuar para prevenir la agregación.

[0243] SBP

[0245] La citometría de masas, incluida la citometría de masas por imagen, se basa en el principio de la unión específica entre los miembros de pares de unión específicos. La etiqueta de masa está vinculada a un miembro del par de unión específico, y esto localiza la etiqueta de masa en la objetivo/analito, que es el otro miembro del par. Sin embargo, la unión específica no requiere la unión a una sola especie molecular con exclusión de otras. Más bien, define que la unión no es inespecífica, es decir, no es una interacción aleatoria. Un ejemplo de una SBP que se une a múltiples objetivos sería, por lo tanto, un anticuerpo que reconoce un epítopo común entre varias proteínas diferentes. En este caso, la unión sería específica y estaría mediada por las CDR del anticuerpo, pero el anticuerpo detectaría múltiples proteínas diferentes. Los epítopos comunes pueden ser de origen natural o el epítopo común podría ser una etiqueta artificial, como una etiqueta FLAG. De forma similar, en el caso de los ácidos nucleicos, un ácido nucleico de secuencia definida puede no unirse exclusivamente a una secuencia totalmente complementaria, pero se pueden introducir diferentes tolerancias de desajuste mediante el uso de condiciones de hibridación con diferentes rigurosidades, como apreciaría un experto en la técnica. No obstante, esta hibridación no es inespecífica, ya que está mediada por la homología entre el ácido nucleico de la SBP y el analito objetivo. De forma similar, los ligandos pueden unirse específicamente a múltiples receptores; un ejemplo sencillo es el TNFα, que se une tanto a TNFR1 como a TNFR2.

[0247] La SBP puede comprender cualquiera de los siguientes elementos: un dúplex de ácido nucleico; un complejo anticuerpo/antígeno; un par receptor/ligando; o un par aptámero/objetivo. Así, un átomo marcador puede unirse a una sonda de ácido nucleico que, a continuación, se pone en contacto con una muestra de tejido para que la sonda pueda hibridar con ácidos nucleicos complementarios en ella, por ejemplo, para formar un dúplex ADN/ADN, un dúplex ADN/ARN o un dúplex ARN/ARN. De forma similar, un átomo marcador puede unirse a un anticuerpo que, a continuación, se pone en contacto con una muestra de tejido para que pueda unirse a su antígeno. Un átomo marcador puede unirse a un ligando que, a continuación, se pone en contacto con una muestra de tejido para que pueda unirse a su receptor. Un átomo marcador puede unirse a un ligando de aptámero que, a continuación, se pone en contacto con una muestra de tejido para que pueda unirse a su objetivo. Por lo tanto, los miembros de SBP marcados pueden utilizarse para detectar diversas objetivos en una muestra, incluyendo secuencias de ADN, secuencias de ARN, proteínas, azúcares, lípidos o metabolitos.

[0249] Por lo tanto, la SBP marcada por masa puede ser una proteína o un péptido, o un polinucleótido u oligonucleótido.

[0250] Entre los ejemplos de SBP proteicos se incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, una proteína de fusión de anticuerpos, un scFv, un mimético de anticuerpos, avidina, estreptavidina, neutravidina, biotina o una combinación de estos. Opcionalmente, el mimético de anticuerpos comprende un nanocuerpo, un aficuerpo, una afilia, un afímero, una afitina, un alfacuerpo, una anticalina, un avímero, una DARPin, un finómero, un péptido de dominio Kunitz, un monocuerpo o cualquier combinación de estos; un receptor, como una fusión receptor-Fc; un ligando, como una fusión ligando-Fc; una lectina, por ejemplo, una aglutinina, como la aglutinina de germen de trigo.

[0252] El péptido puede ser lineal o cíclico, como un péptido bicíclico. Un ejemplo de péptido que se puede utilizar es la faloidina.

[0253] Un polinucleótido u oligonucleótido generalmente se refiere a un polímero monocatenario o bicatenario de nucleótidos que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster 3'-5', así como análogos de polinucleótidos. Una molécula de ácido nucleico incluye, entre otros, ADN, ARN y ADNc. Un análogo de polinucleótido puede poseer una estructura principal distinta del enlace fosfodiéster estándar presente en los polinucleótidos naturales y, opcionalmente, una o más fracciones de azúcar modificadas, distintas de la ribosa o la desoxirribosa. Los análogos de polinucleótidos contienen bases capaces de formar enlaces de hidrógeno mediante apareamiento de bases de Watson-Crick con bases de polinucleótidos estándar, donde la estructura principal del análogo presenta las bases de forma que permite dichos enlaces de hidrógeno de forma específica para la secuencia entre la molécula del análogo de oligonucleótido y las bases de un polinucleótido estándar. Entre los ejemplos de análogos de polinucleótidos se incluyen, entre otros, los ácidos xenonucleicos (XNA), los ácidos nucleicos con puente (BNA), los ácidos nucleicos con glicol (GNA), los ácidos nucleicos peptídicos (PNA), los yPNA, los polinucleótidos de morfolino, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA), el ácido nucleico de treosa (TNA), los polinucleótidos 2’-0-metil, los polinucleótidos sustituidos con 2’-0-alquil ribosilo, los polinucleótidos de fosforotioato y los polinucleótidos de boronofosfato. Un análogo de polinucleótido puede poseer análogos de purina o pirimidina, incluyendo, por ejemplo, análogos de 7-deaza purina, análogos de 8-halopurina, análogos de 5-halopirimidina o análogos de bases universales que pueden aparearse con cualquier base, incluyendo hipoxantina, nitroazoles, análogos de isocarboestirilo, carboxamidas de azol y análogos de triazol aromático, o análogos de bases con funcionalidad adicional, como una fracción de biotina para la unión por afinidad.

[0255] Miembros de la SBP de anticuerpos

[0257] En una forma de realización típica, el miembro de la SBP marcado es un anticuerpo. El marcaje del anticuerpo puede lograrse mediante la conjugación de una o más moléculas de unión al átomo de marcaje al anticuerpo, mediante la unión de una etiqueta de masa utilizando la química de clic descrita en este documento. Los anticuerpos que reconocen proteínas celulares útiles para la obtención de imágenes ya están ampliamente disponibles para su uso en IHQ, y al utilizar átomos marcadores en lugar de las técnicas de marcaje actuales (p. ej., fluorescencia), estos anticuerpos conocidos pueden adaptarse fácilmente para su uso en los métodos descritos en este documento, pero con el beneficio de aumentar la capacidad de multiplexación. Los anticuerpos pueden reconocer objetivos en la superficie celular o objetivos dentro de una célula. Los anticuerpos pueden reconocer una variedad de objetivos; por ejemplo, pueden reconocer específicamente proteínas individuales, o pueden reconocer múltiples proteínas relacionadas que comparten epítopos comunes, o pueden reconocer modificaciones postraduccionales específicas en proteínas (p. ej., para distinguir entre tirosina y fosfortirosina en una proteína de interés, para distinguir entre lisina y acetillisina, para detectar la ubiquitinación, etc.). Tras la unión a su objetivo, se pueden detectar los átomos marcadores conjugados con un anticuerpo para revelar la ubicación de dicha objetivo en la muestra.

[0259] El miembro de SBP marcado suele interactuar directamente con un miembro de SBP objetivo en la muestra. Sin embargo, en algunas formas de realización, es posible que el miembro de SBP marcado interactúe indirectamente con un miembro de SBP objetivo; por ejemplo, un anticuerpo primario puede unirse al miembro de SBP objetivo y un anticuerpo secundario marcado puede unirse a él, mediante un ensayo sándwich. No obstante, el método suele basarse en interacciones directas, ya que esto se logra con mayor facilidad y permite una mayor multiplexación. En ambos casos, se pone en contacto una muestra con un miembro de SBP que puede unirse a un miembro de SBP objetivo en la muestra y, posteriormente, se detecta la marca unida al miembro de SBP objetivo.

[0260] SBP de ácidos nucleicos y modificaciones de la metodología de marcaje

[0261] El ARN es otra molécula biológica que los métodos y aparatos descritos en este documento pueden detectar de forma específica, sensible y, si se desea, cuantitativa. De la misma manera que se describió anteriormente para el análisis de proteínas, los ARN pueden detectarse mediante el uso de un miembro de SBP marcado con una etiqueta elemental que se une específicamente al ARN (p. ej., un polinucleótido u oligonucleótido de secuencia complementaria como se discutió anteriormente, incluyendo una molécula de ácido nucleico bloqueado (LNA) de secuencia complementaria, una molécula de ácido nucleico peptídico (PNA) de secuencia complementaria, un ADN plasmídico de secuencia complementaria, un ADN amplificado de secuencia complementaria, un fragmento de ARN de secuencia complementaria y un fragmento de ADN genómico de secuencia complementaria). Los ARN incluyen no solo el ARNm maduro, sino también los intermediarios de procesamiento del ARN y las transcripciones de pre-ARNm nacientes.

[0262] En ciertas formas de realización, tanto el ARN como la proteína se detectan utilizando los métodos de la divulgación. Para detectar el ARN, las células en muestras biológicas como se describe en este documento pueden prepararse para el análisis del contenido de ARN y proteína utilizando los métodos y aparatos descritos en este documento. En ciertos aspectos, las células se fijan y permeabilizan antes del paso de hibridación. Las células pueden proporcionarse como fijadas y/o permeabilizadas. Las células pueden fijarse con un fijador de reticulación, como formaldehído o glutaraldehído. Alternativamente, o además, pueden fijarse con un fijador precipitante, como etanol, metanol o acetona. Las células pueden permeabilizarse con un detergente, como polietilenglicol (p. ej., Triton X-100), monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán (Tween-20), saponina (un grupo de glucósidos anfipáticos) o sustancias químicas como metanol o acetona. En ciertos casos, la fijación y la permeabilización pueden realizarse con el mismo reactivo o conjunto de reactivos. Jamur et al. describen las técnicas de fijación y permeabilización en "Permeabilization of Cell Membranes" (Methods Mol. Biol., 2010).

[0263] La detección de ácidos nucleicos objetivo en la célula, o "hibridación in situ" (ISH), se ha realizado previamente utilizando sondas de oligonucleótidos marcadas con fluoróforos. Como se describe en este documento, los oligonucleótidos marcados con masa, junto con la ionización y la espectrometría de masas, pueden utilizarse para detectar ácidos nucleicos objetivo en la célula. Los métodos de hibridación in situ son conocidos en la técnica (véase Zenobi et al. "Single-Cell Metabolomics: Analytical and Biological Perspectives", Science vol. 342, n.º 6163, 2013). Los protocolos de hibridación también se describen en las patentes de EE. UU. n.º 5.225.326 y las publicación de EE. UU. n.º 2010/0092972 y 2013/0164750.

[0264] Antes de la hibridación, las células presentes en suspensión o inmovilizadas en un soporte sólido pueden fijarse y permeabilizarse, como se explicó anteriormente. La permeabilización permite que una célula retenga los ácidos nucleicos objetivo, a la vez que permite la entrada en la célula de nucleótidos de hibridación, oligonucleótidos de amplificación y/o oligonucleótidos marcados con masa. La célula puede lavarse después de cualquier paso de hibridación, por ejemplo, después de la hibridación de oligonucleótidos de hibridación objetivo con objetivos de ácidos nucleicos, después de la hibridación de oligonucleótidos de amplificación y/o después de la hibridación de oligonucleótidos marcados con masa. Las células pueden estar en suspensión durante todos o la mayoría de los pasos del método, para facilitar su manejo. Sin embargo, los métodos también son aplicables a células en muestras de tejido sólido (p. ej., secciones de tejido) y/o células inmovilizadas en un soporte sólido (p. ej., un portaobjetos u otra superficie). Por lo tanto, a veces, las células pueden estar en suspensión en la muestra y durante los pasos de hibridación. Otras veces, las células se inmovilizan en un soporte sólido durante la hibridación.

[0265] Los ácidos nucleicos objetivo incluyen cualquier ácido nucleico de interés y de abundancia suficiente en la célula para ser detectados por los métodos objeto. Los ácidos nucleicos objetivo pueden ser ARN, de los cuales existe una pluralidad de copias dentro de la célula. Por ejemplo, pueden estar presentes en la célula 10 o más, 20 o más, 50 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, o 1000 o más copias del ARN objetivo. Un ARN objetivo puede ser un ARN mensajero (ARNm), un ARN ribosómico (ARNr), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN pequeño nuclear (ARNpn), un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un ARN no codificante largo (ARNlnc) o cualquier otro tipo de ARN conocido en la técnica. El ARN objetivo puede tener 20 nucleótidos o más, 20 nucleótidos o más, 20 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 200 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos o más, entre 20 y 1000 nucleótidos, entre 20 y 500 nucleótidos de longitud, entre 40 y 200 nucleótidos de longitud, y así sucesivamente.

[0266] En ciertas formas de realización, un oligonucleótido marcado con masa puede hibridarse directamente con la secuencia de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, la hibridación de oligonucleótidos adicionales puede permitir una mejor especificidad y/o amplificación de la señal.

[0267] En ciertas formas de realización, dos o más oligonucleótidos de hibridación objetivo pueden hibridarse con regiones proximales en el ácido nucleico objetivo y juntos pueden proporcionar un sitio para la hibridación de oligonucleótidos adicionales en el esquema de hibridación.

[0269] En ciertas formas de realización, el oligonucleótido con etiqueta de masa puede hibridarse directamente con los dos o más oligonucleótidos de hibridación objetivo. En otras formas de realización, se pueden añadir uno o más oligonucleótidos de amplificación, simultáneamente o en sucesión, para hibridar los dos o más oligonucleótidos de hibridación objetivo y proporcionar múltiples sitios de hibridación a los que pueda unirse el oligonucleótido con etiqueta de masa. El o los oligonucleótidos de amplificación, con o sin el oligonucleótido marcado con masa, pueden proporcionarse como un multímero capaz de hibridar con los dos o más oligonucleótidos de hibridación objetivo.

[0271] Si bien el uso de dos o más oligonucleótidos de hibridación objetivo mejora la especificidad, el uso de oligonucleótidos de amplificación aumenta la señal. Dos oligonucleótidos de hibridación objetivo se hibridan con un ARN objetivo en la célula. Juntos, los dos oligonucleótidos de hibridación objetivo proporcionan un sitio de hibridación al que puede unirse un oligonucleótido de amplificación. La hibridación y/o el lavado posterior del oligonucleótido de amplificación pueden realizarse a una temperatura que permita la hibridación con dos oligonucleótidos de hibridación objetivo proximales, pero que sea superior a la temperatura de fusión de la hibridación del oligonucleótido de amplificación con un solo oligonucleótido de hibridación objetivo. El primer oligonucleótido de amplificación proporciona múltiples sitios de hibridación, a los que pueden unirse los segundos oligonucleótidos de amplificación, formando un patrón ramificado. Los oligonucleótidos marcados con masa se unen a múltiples sitios de hibridación proporcionados por los segundos nucleótidos de amplificación. En conjunto, estos oligonucleótidos de amplificación (con o sin oligonucleótidos marcados con masa) se denominan en este documento "multímeros". Por lo tanto, el término "oligonucleótido de amplificación" incluye oligonucleótidos que proporcionan múltiples copias del mismo sitio de unión al que pueden anexarse otros oligonucleótidos. Al aumentar el número de sitios de unión de otros oligonucleótidos, aumenta el número final de marcadores que se pueden encontrar en una objetivo. De este modo, múltiples oligonucleótidos marcados se hibridan, indirectamente, con un único ARN objetivo. Esto permite la detección de ARN con un bajo número de copias, al aumentar el número de átomos detectables del elemento utilizado por ARN.

[0273] Un método particular para realizar esta amplificación consiste en utilizar el método RNAscope® de Advanced Cell Diagnostics, como se describe con más detalle a continuación. Otra alternativa es utilizar un método que adapta el método QuantiGene® FlowRNA (Affymetrix | eBioscience). El ensayo se basa en el diseño de sondas de pares de oligonucleótidos con amplificación de la señal de ADN ramificado (ADNb). Hay más de 4000 sondas en el catálogo o se pueden solicitar conjuntos personalizados sin coste adicional. De acuerdo con el párrafo anterior, el método funciona mediante la hibridación de los oligonucleótidos de hibridación objetivo con el objetivo, seguida de la formación de una estructura ramificada que comprende los primeros oligonucleótidos de amplificación (denominados oligonucleótidos de preamplificación en el método QuantiGene®) para formar un tallo al que pueden annealizarse múltiples segundos oligonucleótidos de amplificación (denominados simplemente oligonucleótidos de amplificación en el método QuantiGene®). Posteriormente, se pueden unir múltiples oligonucleótidos marcados con masa.

[0275] Otro método de amplificación de la señal de ARN se basa en el método de amplificación por círculo rodante (RCA). Existen varios métodos por los cuales este sistema de amplificación puede introducirse en el proceso de amplificación. En primer lugar, se utiliza un primer ácido nucleico como ácido nucleico de hibridación, siendo el primer ácido nucleico circular. El primer ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Comprende una secuencia complementaria a la del ARN objetivo. Tras la hibridación del primer ácido nucleico con el ARN objetivo, se hibrida un cebador complementario al primer ácido nucleico con este y se utiliza para la extensión del cebador mediante una polimerasa y ácidos nucleicos, generalmente añadidos exógenamente a la muestra. Sin embargo, en algunos casos, al añadir el primer ácido nucleico a la muestra, este puede tener ya hibridado el cebador para la extensión. Dado que el primer ácido nucleico es circular, una vez que la extensión del cebador ha completado una ronda completa de replicación, la polimerasa puede desplazarlo y la extensión continúa (es decir, sin actividad de la exonuclasa 5' ➔ 3'), produciendo copias encadenadas adicionales del complemento del primer ácido nucleico, amplificando así dicha secuencia. Por lo tanto, los oligonucleótidos que comprenden una etiqueta elemental (ARN o ADN, o LNA o PNA, entre otros), como se mencionó anteriormente, pueden hibridarse con las copias encadenadas del complemento del primer ácido nucleico. El grado de amplificación de la señal de ARN puede, por lo tanto, controlarse mediante el tiempo asignado a la etapa de amplificación del ácido nucleico circular.

[0276] En otra aplicación de la RCA, en lugar de que el primer oligonucleótido que hibrida con el ARN objetivo sea circular, este puede ser lineal y comprender una primera porción con una secuencia complementaria a su objetivo y una segunda porción seleccionada por el usuario. Una plantilla de RCA circular con una secuencia homóloga a esta segunda porción puede hibridarse con este primer oligonucleótido, y la amplificación de RCA se lleva a cabo como se indicó anteriormente. El uso de un primer oligonucleótido con una porción específica de la objetivo y una porción seleccionada por el usuario permite que la porción seleccionada por el usuario sea común a diversas sondas. Esto es eficiente en el uso de reactivos, ya que los mismos reactivos de amplificación posteriores pueden utilizarse en una serie de reacciones que detectan diferentes objetivos. Sin embargo, como comprenderá el experto en la técnica, al emplear esta estrategia, para la detección individual de ARN específicos en una reacción multiplexada, cada primer ácido nucleico que hibrida con el ARN objetivo deberá tener una segunda secuencia única y, a su vez, cada ácido nucleico circular debe contener una secuencia única que pueda hibridar con el oligonucleótido marcado. De esta manera, la señal de cada ARN objetivo puede ser específicamente amplificada y detectada.

[0277] Otras configuraciones para lograr el análisis RCA serán conocidas por la persona experta, como se establece, por ejemplo, en. En algunos casos, para evitar que el primer, p. ej., oligonucleótido se disocie de la objetivo durante los siguientes pasos de amplificación e hibridación, el primer, p. ej., oligonucleótido puede ser fijado después de la hibridación (tal como por formaldehído).

[0279] Además, la reacción en cadena de hibridación (HCR) puede usarse para amplificar la señal de ARN (ver, p. ej., Choi et al., 2010, Nat. Biotech, 28:1208-1210). Choi explica que un amplificador de HCR consiste en dos especies de horquilla de ácido nucleico que no polimerizan en ausencia de un iniciador. Cada horquilla de HCR consiste en un dominio de entrada con un punto de apoyo monocatenario expuesto y un dominio de salida con un punto de apoyo monocatenario oculto en la horquilla plegada. La hibridación del iniciador con el dominio de entrada de una de las dos horquillas abre la horquilla y expone su dominio de salida. La hibridación de este dominio de salida (previamente oculto) con el dominio de entrada de la segunda horquilla abre dicha horquilla y expone un dominio de salida idéntico en secuencia al iniciador. La regeneración de la secuencia del iniciador proporciona la base para una reacción en cadena que alterna los pasos de polimerización de la primera y la segunda horquilla, lo que conduce a la formación de un polímero bicatenario mellado. Tanto la primera como la segunda horquilla, o ambas, pueden marcarse con una etiqueta elemental mediante la aplicación de los métodos y aparatos descritos en este documento. Dado que el procedimiento de amplificación se basa en dominios de salida de secuencia específica, se pueden realizar varias reacciones de amplificación discretas utilizando conjuntos separados de horquillas de forma independiente en el mismo proceso. Por lo tanto, esta amplificación también permite la amplificación en análisis multiplex de numerosas especies de ARN. Como señala Choi, la HCR es un proceso de autoensamblaje isotérmico activado. Por lo tanto, las horquillas deben penetrar la muestra antes de someterse al autoensamblaje activado in situ, lo que sugiere el potencial de una penetración profunda en la muestra y altas relaciones señal-fondo.

[0281] La hibridación puede incluir el contacto de las células con uno o más oligonucleótidos, como oligonucleótidos de hibridación objetivo, oligonucleótidos de amplificación y oligonucleótidos marcados con masa, y proporcionar las condiciones bajo las cuales pueda ocurrir la hibridación. La hibridación se puede realizar en una solución tamponada, como tampón de citrato de sodio salino (SCC), solución salina tamponada con fosfato (PBS), tampón de fosfato de sodio salino-EDTA (SSPE), tampón TNT (que tenga Tris-HCl, cloruro de sodio y Tween 20) o cualquier otro tampón adecuado. La hibridación se puede realizar a una temperatura cercana o inferior a la temperatura de fusión de la hibridación de uno o más oligonucleótidos.

[0283] La especificidad se puede mejorar realizando uno o más lavados después de la hibridación, para eliminar el oligonucleótido no unido. Una mayor rigurosidad del lavado puede mejorar la especificidad, pero disminuir la señal general. La rigurosidad de un lavado puede aumentarse aumentando o disminuyendo la concentración del tampón de lavado, aumentando la temperatura o aumentando la duración del lavado. Se puede utilizar un inhibidor de ARNasa en cualquiera o todas las incubaciones de hibridación y los lavados posteriores.

[0285] Se puede utilizar un primer conjunto de sondas de hibridación, que incluye uno o más oligonucleótidos de hibridación objetivo, oligonucleótidos de amplificación u oligonucleótidos marcados con masa, para marcar un primer ácido nucleico objetivo. Se pueden utilizar conjuntos adicionales de sondas de hibridación para marcar ácidos nucleicos objetivo adicionales. Cada conjunto de sondas de hibridación puede ser específico para un ácido nucleico objetivo diferente.

[0286] Los conjuntos adicionales de sondas de hibridación pueden diseñarse, hibridarse y lavarse para reducir o prevenir la hibridación entre oligonucleótidos de diferentes conjuntos. Además, el oligonucleótido marcado con masa de cada conjunto puede proporcionar una señal única. Como tal, se pueden utilizar múltiples conjuntos de oligonucleótidos para detectar 2, 3, 5, 10, 15, 20 o más objetivos de ácidos nucleicos distintas.

[0288] A veces, los diferentes ácidos nucleicos detectados son variantes de empalme de un solo gen. El oligonucleótido marcado con masa se puede diseñar para hibridar (directa o indirectamente a través de otros oligonucleótidos como se explica a continuación) dentro de la secuencia del exón, para detectar todas las transcripciones que contienen ese exón, o puede diseñarse para unir las uniones de empalme para detectar variantes específicas (por ejemplo, si un gen tenía tres exones y dos variantes de empalme, exones 1-2-3 y exones 1-3, entonces los dos podrían distinguirse: la variante 1-2-3 podría detectarse específicamente hibridando con el exón 2, y la variante 1-3 podría detectarse específicamente hibridando a través de la unión del exón 1-3.

[0290] Composiciones de SBP

[0292] Como se estableció anteriormente, las SBP de ciertos aspectos de la divulgación se producen a través de una reacción de química clic. Las reacciones de química clic promovidas por cepas no involucran catalizadores metálicos. Por lo tanto, la química clic promovida por cepas proporciona ventajas particulares en la conjugación de etiquetas de masa y SBP. Esto se debe a que muchas reacciones de química clic dependen de la presencia de un catalizador metálico. Por ejemplo, se han informado reacciones de química clic que son catalizadas por cobre o hierro. Dichos metales pueden incorporarse a los componentes que reaccionan juntos (p. ej., en los grupos ligadores de metal de la etiqueta de masa). Esto es indeseable, al menos porque la ocupación de los grupos ligadores de metal de la etiqueta de masa por el catalizador metálico impide que el átomo o los átomos marcadores deseados ocupen dichos grupos. En consecuencia, se pierde sensibilidad en el canal de masa deseado. Además, el fondo podría aumentar si el metal que cataliza la reacción fuera el átomo de marcaje en otra SBP con etiqueta de masa utilizada en una reacción multiplex. Además, los metales catalíticos como el cobre son tóxicos para las células vivas, por lo que si algo de cobre no quelado permaneciera en la composición de la SBP conjugada con etiqueta de masa, esto podría interferir con los procedimientos experimentales posteriores, si estos procedimientos involucraran material vivo.

[0293] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan una composición que comprende una SBP con etiqueta de masa de la presente divulgación, donde la composición está libre de al menos uno de cobre y hierro. En algunos casos, la composición está libre de cobre.

[0294] Tinciones histoquímicas

[0295] Los reactivos de tinción histoquímica con uno o más átomos metálicos intrínsecos y los métodos de uso descritos en este documento pueden combinarse con otros reactivos y métodos de uso, como se describe en este documento. Por ejemplo, las tinciones histoquímicas pueden colocalizarse (p. ej., con resolución celular o subcelular) con fármacos que contienen metales, anticuerpos marcados con metales o metales pesados acumulados. En ciertos aspectos, una o más tinciones histoquímicas pueden usarse en concentraciones más bajas (p. ej., menos de la mitad, un cuarto, un décimo, etc.) que las utilizadas para otros métodos de obtención de imágenes (p. ej., microscopía de fluorescencia, microscopía óptica o microscopía electrónica).

[0296] Para visualizar e identificar estructuras, existe una amplia gama de tinciones e indicadores histológicos, bien caracterizados. Las tinciones que contienen metales tienen el potencial de influir en la aceptación de la citometría de masas por parte de los patólogos. Ciertas tinciones que contienen metales son conocidas por revelar componentes celulares y son adecuadas para su uso en la presente divulgación. Además, las tinciones bien definidas pueden usarse en el análisis de imágenes digitales, proporcionando contraste para algoritmos de reconocimiento de características. Estas características son estratégicamente importantes para el desarrollo de la citometría de masas por imagen.

[0297] A menudo, la estructura morfológica de una sección de tejido puede contrastarse utilizando productos de afinidad como anticuerpos. Estos son costosos y requieren un procedimiento de marcaje adicional con marcadores metálicos, en comparación con las tinciones histoquímicas. Este enfoque se empleó en trabajos pioneros sobre citometría de masas por imagen utilizando anticuerpos marcados con isótopos de lantánidos disponibles, lo que reduce las etiquetas de masa (por ejemplo, metálicas) para que los anticuerpos funcionales respondan a una pregunta biológica.

[0298] La presente divulgación amplía el catálogo de isótopos disponibles, incluyendo elementos como Ag, Au, Ru, W, Mo, Hf y Zr. La divulgación se refiere a compuestos como el rojo de rutenio, utilizado para identificar el estroma mucinoso; la tinción tricrómica para la identificación de fibras de colágeno; y el 2-tetróxido de osmio como contratinción celular. La tinción con plata se utiliza en el cariotipo. El nitrato de plata tiñe la proteína asociada a la región de organización nucleolar (NOR), produciendo una región oscura donde se deposita la plata, lo que indica la actividad de los genes de ARNr dentro de la NOR. La adaptación a IMQ puede requerir que los protocolos (p. ej., oxidación con permanganato de potasio y una concentración de plata del 1%) se modifiquen para usar concentraciones más bajas de solución de plata, p. ej., menos del 0,5%, 0,01% o 0,05%.

[0299] Las técnicas de amplificación autometalográfica se han convertido en una herramienta importante en histoquímica. Varios metales pesados endógenos y tóxicos forman nanocristales de sulfuro o seleniuro que pueden amplificarse autocatalíticamente mediante la reacción con iones de Ag. El nanogrupo de Ag más grande puede entonces visualizarse fácilmente mediante IMQ. Actualmente, se han establecido protocolos robustos para la detección amplificada con plata de nanocristales de Zn-S/Se, así como para la detección de selenio mediante la formación de nanocristales de plataselenio. Además, los puntos cuánticos disponibles comercialmente (detección de Cd) también son autocatalíticamente activos y pueden usarse como marcadores histoquímicos.

[0300] Los aspectos de la divulgación objeto pueden incluir tinciones histoquímicas y su uso en la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas elemental. Cualquier tinción histoquímica resoluble mediante espectrometría de masas elemental puede utilizarse en la presente divulgación. En ciertos aspectos, la tinción histoquímica incluye uno o más átomos con una masa superior al valor de corte del espectrómetro de masas elemental utilizado para obtener la imagen de la muestra, como superior a 60 uma, 80 uma, 100 uma o 120 uma. Por ejemplo, la tinción histoquímica puede incluir una etiqueta metálica (p. ej., un átomo metálico) como se describe en el presente documento. El átomo metálico puede estar quelado con la tinción histoquímica o unido covalentemente a su estructura química. En ciertos aspectos, la tinción histoquímica puede ser una molécula orgánica. Las tinciones histoquímicas pueden ser polares, hidrófobas (p. ej., lipófilas), iónicas o comprender grupos con diferentes propiedades. En ciertos aspectos, una tinción histoquímica puede comprender más de una sustancia química.

[0301] Las tinciones histoquímicas incluyen moléculas pequeñas de menos de 2000, 1500, 1000, 800, 600, 400 o 200 uma. Las tinciones histoquímicas pueden unirse a la muestra mediante interacciones covalentes o no covalentes (p. ej., iónicas o hidrófobas). Las tinciones histoquímicas pueden proporcionar contraste para resolver la morfología de la muestra biológica, por ejemplo, para ayudar a identificar células individuales, estructuras intracelulares y/o estructuras extracelulares. Las estructuras intracelulares que pueden resolverse mediante tinciones histoquímicas incluyen la membrana celular, el citoplasma, el núcleo, el aparato de Golgi, el RE, las mitocondrias y otros orgánulos celulares. Las tinciones histoquímicas pueden tener afinidad por un tipo de molécula biológica, como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, fosfolípidos o carbohidratos. En ciertos aspectos, una tinción histoquímica puede unirse a una molécula distinta del ADN. Las tinciones histoquímicas adecuadas también incluyen tinciones que se unen a estructuras extracelulares (p. ej., estructuras de la matriz extracelular), incluyendo estroma (p. ej., estroma de la mucosa), membrana basal, estroma intersticial, proteínas como colágeno o elastina, proteoglicanos, polisacáridos no proteoglicanos, vesículas extracelulares, fibronectina, laminina, etc.

[0302] En ciertos aspectos, las tinciones histoquímicas y/o sondas metabólicas pueden indicar un estado de una célula o tejido. Por ejemplo, las tinciones histoquímicas pueden incluir tinciones vitales como cisplatino, eosina y yoduro de propidio. Otras tinciones histoquímicas pueden teñir para hipoxia, p. ej., solo pueden unirse o depositarse en condiciones hipóxicas. Sondas como la yododesoxiuridina (ldU) o un derivado de la misma, pueden teñir para la proliferación celular. En ciertos aspectos, la tinción histoquímica puede no indicar el estado de la célula o tejido. Las sondas que detectan el estado celular (p. ej., viabilidad, hipoxia o proliferación celular) pero que se administran in vivo (p. ej., a un animal vivo o a un cultivo celular) se pueden utilizar en cualquiera de los métodos en cuestión, pero no se consideran tinciones histoquímicas. Las tinciones histoquímicas pueden tener afinidad por un tipo de molécula biológica, como ácidos nucleicos (p. ej., ADN o ARN), proteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos (p. ej., azúcares como monosacáridos, disacáridos o polioles; oligosacáridos; o polisacáridos como almidón o glucógeno), glucoproteínas o glucolípidos. En ciertos aspectos, la tinción histoquímica puede ser una contratinción.

[0303] Los siguientes son ejemplos de tinciones histoquímicas específicas y su uso en los métodos del sujeto:

[0304] La tinción de Rojo de Rutenio como una tinción que contiene metal para la detección del estroma mucinoso puede usarse de la siguiente manera: el tejido inmunoteñido (p. ej., FFPE desparafinado o criosección) puede tratarse con 0,0001-0,5 %, 0,001-0,05 %, menos del 0,1 %, menos del 0,05 % o alrededor del 0,0025 % de Rojo de Rutenio (p. ej., durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos o alrededor de 30 min a 4-42 ºC, o alrededor de temperatura ambiente). La muestra biológica puede enjuagarse, por ejemplo, con agua o una solución tamponada. A continuación, el tejido puede secarse antes de la obtención de imágenes por espectrometría de masas elemental.

[0305] Un kit que incluye rojo de rutenio puede contener una solución concentrada de tinción filtrada para diluirla antes de aplicarla a una sección de tejido, o puede contener rojo de rutenio en cualquiera de las concentraciones descritas anteriormente.

[0306] El ácido fosfotúngstico (p. ej., como tinción tricrómica) puede usarse como tinción que contiene metal para fibras de colágeno. Las secciones de tejido en portaobjetos (FFPE desparafinado o criosección) pueden fijarse en líquido de Bouin (p. ej., durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos o alrededor de 30 minutos a 4-42 ºC o alrededor de temperatura ambiente). A continuación, las secciones pueden tratarse con ácido fosfotúngstico al 0,0001 %-0,01 %, al 0,0005 %-0,005 % o alrededor del 0,001 % durante (p. ej., durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos o alrededor de 15 minutos a 4-42 ºC o alrededor de temperatura ambiente). La muestra puede entonces enjuagarse con agua y/o solución tamponada, y opcionalmente secarse, antes de la obtención de imágenes por espectrometría de masas elemental. La tinción tricrómica puede usarse en una dilución (p. ej., 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o gran dilución) en comparación con las concentraciones utilizadas para la obtención de imágenes por microscopía óptica (p. ej., fluorescencia).

[0307] Un kit que contiene ácido fosfotúngstico (tricrómico) puede contener una solución concentrada de tinción filtrada para diluirla antes de su aplicación a la sección de tejido, o puede contener ácido fototúngstico en cualquiera de las concentraciones descritas anteriormente.

[0308] En algunas formas de realización, la tinción histoquímica es una molécula orgánica. En algunas formas de realización, el segundo metal está unido covalentemente. En algunas formas de realización, el segundo metal está quelado. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica se une específicamente a la membrana celular. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica es tetróxido de osmio. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica es lipofílica. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica se une específicamente a una estructura extracelular. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica se une específicamente al colágeno extracelular. En algunas formas de realización, la tinción histoquímica es una tinción tricrómica que comprende ácido fosfotúngstico/fosfomolíbdico. En algunas formas de realización, la tinción tricrómica se utiliza después de poner en contacto la muestra con el anticuerpo, por ejemplo, a una concentración menor que la que se utilizaría para la obtención de imágenes ópticas, por ejemplo, cuando la concentración es una dilución de 50 veces la tinción tricrómica o mayor.

[0309] En algunas formas de realización, la tinción histoquímica se une específicamente al estroma, por ejemplo, cuando la tinción histoquímica se une específicamente al estroma mucinoso, por ejemplo, cuando la tinción histoquímica es rojo de rutenio o un derivado del mismo.

[0310] Fármacos que contienen metales

[0311] Los metales en medicina constituyen un campo nuevo y emocionante en la farmacología. Se sabe poco sobre las estructuras celulares que participan en el almacenamiento transitorio de iones metálicos antes de su incorporación a metaloproteínas, complejos metálicos de ácidos nucleicos o fármacos que contienen metales, así como sobre el destino de los iones metálicos tras la degradación de proteínas o fármacos. Un primer paso importante para desentrañar los mecanismos reguladores implicados en el transporte, almacenamiento y distribución de metales traza consiste en la identificación y cuantificación de los metales, idealmente en el contexto de su entorno fisiológico nativo en tejidos, células o incluso a nivel de orgánulos individuales y compartimentos subcelulares. Los estudios histológicos se realizan habitualmente en secciones delgadas de tejido o con células cultivadas.

[0313] Diversos fármacos que contienen metales se utilizan para el tratamiento de diversas enfermedades; sin embargo, se desconoce su mecanismo de acción o biodistribución: cisplatino, imidazol de rutenio, agentes anticancerígenos basados en metaloceno con Mo, tungstenocenos con complejos de W, B-dicetonato con Hf o Zr, auranofina con Au y fármacos de polioxomolibdato. Muchos complejos metálicos se utilizan como agentes de contraste para resonancia magnética (quelatos de Gd(III)). La caracterización de la captación y biodistribución de fármacos anticancerígenos a base de metales es crucial para comprender y minimizar la toxicidad subyacente.

[0315] Las masas atómicas de ciertos metales presentes en fármacos se encuentran dentro del rango de la citometría de masas. Específicamente, el cisplatino y otros con complejos de platino (iproplatino, lobplatino) se utilizan ampliamente como fármacos quimioterapéuticos para el tratamiento de una amplia gama de cánceres. La nefrotoxicidad y mielotoxicidad de los fármacos anticancerígenos a base de platino es bien conocida. Con los métodos y reactivos descritos en este documento, ahora se puede examinar su localización subcelular en secciones de tejido y su colocalización con anticuerpos marcados con masa (p. ej., con metales) y/o tinciones histoquímicas. Los fármacos quimioterapéuticos pueden ser tóxicos para ciertas células, como las células en proliferación, debido al daño directo al ADN, la inhibición de las vías de reparación del daño al ADN, la radiactividad, etc. En ciertos aspectos, los fármacos quimioterapéuticos pueden dirigirse al tumor mediante un anticuerpo intermediario.

[0317] En ciertos aspectos, el fármaco que contiene metal es un fármaco quimioterapéutico. Los métodos objeto pueden incluir la administración del fármaco que contiene metal a un animal vivo, como un modelo animal de investigación o un paciente humano, como se describió previamente, antes de obtener la muestra biológica. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una biopsia de tejido canceroso o células primarias. Alternativamente, el fármaco que contiene metal puede añadirse directamente a la muestra biológica, que puede ser una línea celular inmortalizada o células primarias. Cuando el animal es un paciente humano, los métodos objeto pueden incluir el ajuste de un régimen de tratamiento que incluya el fármaco que contiene metal, basándose en la detección de la distribución del fármaco que contiene metal.

[0319] El paso del método para detectar el fármaco que contiene metal puede incluir la obtención de imágenes subcelulares del fármaco mediante espectrometría de masas elemental y la detección de la retención del fármaco en una estructura intracelular (como membrana, citoplasma, núcleo, aparato de Golgi, RE, mitocondrias y otros orgánulos celulares) o extracelular (como estroma, estroma mucoso, membrana basal, estroma intersticial, proteínas como colágeno o elastina, proteoglicanos, polisacáridos no proteoglicanos, vesículas extracelulares, fibronectina, laminina, etc.).

[0321] Un anticuerpo histoquímico marcado con estatina o masa (p. ej., metal) que se une a una o más de las estructuras anteriores puede colocarse con el fárma

[0322] extracelulares específicas. Por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico como el cisplatino puede colocarse con una estructura como el colágeno. Alternativamente o adicionalmente, la localización del fármaco puede estar relacionada con la presencia de un marcador de viabilidad celular, proliferación celular, hipoxia, respuesta al daño del ADN o respuesta inmunitaria.

[0324] En algunas formas de realización, el fármaco que contiene un metal comprende un metal no endógeno, como platino, paladio, cerio, cadmio, plata u oro. En ciertos aspectos, el fármaco que contiene un metal puede ser cisplatino, imidazol de rutenio, agentes anticancerígenos basados en metaloceno con Mo, tungstenocenos con complejos de W, B-dicetonato con Hf o Zr, auranofina con Au, fármacos de polioxomolibdato, inhibidor de la N-miristoiltransferasa-1 (tris(dibencilidenoacetona) dipaladio) con Pd, o un derivado del mismo. Por ejemplo, el fármaco puede contener Pt y puede ser, por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, iproplatino, lobaplatino o un derivado del mismo. El fármaco que contiene metal puede incluir un metal no endógeno, como platino (Pt), rutenio (Ru), molibdeno (Mo), tungsteno (W), hafnio (Ht), circonio (Zr), oro (Au), gadolinio (Gd), paladio (Pd) o un isótopo del mismo. Los compuestos de oro (Auranofin, por ejemplo) y los bioconjugados de nanopartículas de oro para la terapia fototérmica contra el cáncer se pueden identificar en secciones de tejido.

[0326] Metales pesados acumulados

[0328] La exposición a metales pesados puede ocurrir a través de la inyección de alimentos o agua, contacto a través de la piel o ingesta de aerosoles. Los metales pesados pueden acumularse en los tejidos blandos del cuerpo, de modo que la exposición prolongada tiene efectos graves para la salud. En cierto aspecto, el metal pesado puede acumularse in vivo, ya sea a través de la exposición controlada en un modelo de investigación animal o a través de la exposición ambiental en un paciente humano. El metal pesado puede ser un metal pesado tóxico, como arsénico (As), plomo (Pb), antimonio (Sb), bismuto (Bi), cadmio (Cd), osmio (Os), talio (Tl) o mercurio (Hg).

[0329] Los métodos objeto pueden usarse para diagnosticar y/o caracterizar la intoxicación por metales pesados en un paciente humano, determinar un régimen de tratamiento para un paciente humano o caracterizar la acumulación y/o el tratamiento de metales pesados en un modelo de investigación animal.

[0330] Por ejemplo, la detección de la intoxicación por metales pesados en un paciente humano mediante los métodos objeto puede usarse para determinar un tratamiento para eliminar el metal pesado, como por succión del estómago, hemodiálisis, tratamiento con un agente quelante o tratamiento con un diurético. Los métodos objeto pueden usarse para monitorear la eliminación del metal pesado acumulado en un paciente humano.

[0331] En ciertos aspectos, los métodos pueden incluir la caracterización de la acumulación de metales pesados en un modelo de investigación animal, como un roedor expuesto al metal pesado en condiciones controladas (p. ej., medibles). El efecto de los tratamientos sobre la eliminación o distribución del metal pesado puede detectarse mediante los métodos objeto de estudio. Por lo tanto, los métodos incluyen la identificación del efecto de la exposición o las condiciones de tratamiento sobre la cantidad o la localización subcelular del metal pesado acumulado.

[0332] Para evaluar el efecto tóxico del mercurio en la médula espinal del sistema nervioso central de ratas expuestas a formas inorgánicas, orgánicas y vaporosas de mercurio, se puede utilizar la obtención de imágenes mediante espectrometría de masas elemental.

[0333] Muestras

[0334] Ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un método para analizar una muestra biológica, como la obtención de imágenes de la misma. Dichas muestras pueden comprender varias células, y varias de estas células pueden someterse a citometría de masas, como la citometría de masas por imágenes (IMQ), para obtener una imagen de estas células en la muestra. En general, ciertos aspectos de la presente divulgación pueden utilizarse para analizar muestras de tejido que actualmente se estudian mediante técnicas de FACS o inmunohistoquímica (IHQ), pero con el uso de átomos marcadores adecuados para la detección mediante espectrometría de masas (EM) o espectrometría de emisión óptica (EEO).

[0335] Cualquier muestra de tejido adecuada puede usarse en los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, el tejido puede incluir tejido de uno o más de los siguientes: epitelio, músculo, nervio, piel, intestino, páncreas, riñón, cerebro, hígado, sangre, médula ósea, frotis bucales, frotis cervicales o cualquier otro tejido. Otros fluidos corporales también pueden ser una muestra, como ascitis, líquido pulmonar, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, líquido extracelular, exudado, heces, orina. Los lisados celulares también pueden analizarse como sobrenadantes de cultivos celulares, cultivos bacterianos y/o lisados, cultivos virales y/o sobrenadantes de cultivos. La muestra biológica puede ser una línea celular inmortalizada o células primarias obtenidas de un sujeto vivo. Para fines de diagnóstico, pronóstico o experimentales (p. ej., desarrollo de fármacos), el tejido puede ser de un tumor. En algunas formas de realización, una muestra puede ser de un tejido conocido, pero podría desconocerse si la muestra contiene células tumorales. Las imágenes pueden revelar la presencia de objetivos que indican la presencia de un tumor, facilitando así el diagnóstico. El tejido de un tumor puede contener células inmunitarias que también se caracterizan mediante los métodos en cuestión y que pueden proporcionar información sobre la biología del tumor. La muestra de tejido puede consistir en tejido fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE). Los tejidos pueden obtenerse de cualquier organismo multicelular vivo, como un mamífero, un modelo animal de investigación (p. ej., de una enfermedad específica, como un roedor inmunodeficiente con un xenoinjerto tumoral humano) o un paciente humano.

[0336] La muestra de tejido puede ser una sección, por ejemplo, con un grosor de entre 2 y 10 µm, como un grosor de entre 4 y 6 µm. Las técnicas para preparar dichas secciones son bien conocidas en el campo de la inmunohistoquímica (IHQ), por ejemplo, utilizando micrótomos, que incluyen etapas de deshidratación, fijación, inclusión, permeabilización, seccionamiento, etc. Por lo tanto, un tejido puede fijarse químicamente y luego pueden prepararse secciones en el plano deseado. La criosección o la microdisección por captura láser también pueden utilizarse para preparar muestras de tejido. Las muestras pueden permeabilizarse, por ejemplo, para permitir el uso de reactivos para el marcaje de objetivos intracelulares (véase más arriba).

[0337] El tamaño de la muestra de tejido a analizar será similar al de los métodos actuales de IHQ, aunque el tamaño máximo dependerá del aparato de ablación láser y, en particular, del tamaño de la muestra que quepa en su cámara. Un tamaño de hasta 5 mm x 5 mm es típico, pero también son útiles muestras más pequeñas (p. ej., 1 mm x 1 mm) (estas dimensiones se refieren al tamaño de la sección, no a su grosor).

[0338] Además de ser útil para la obtención de imágenes de muestras de tejido, la presente divulgación puede utilizarse para la obtención de imágenes de muestras celulares, como monocapas de células adherentes o de células inmovilizadas sobre una superficie sólida (como en la inmunocitoquímica convencional). Estas formas de realización son particularmente útiles para el análisis de células adherentes que no se disuelven fácilmente en la citometría de masas de suspensión celular. Por lo tanto, además de ser útil para mejorar el análisis inmunohistoquímico actual, la presente divulgación puede utilizarse para mejorar la inmunocitoquímica. Los anticuerpos y/o las tinciones histoquímicas, como se describió anteriormente, pueden permitir la monitorización del estado tisular, como la proliferación celular (p. ej., utilizando la objetivo Ki-67 o el marcador ldU), la respuesta al daño del ADN (p. ej., utilizando un marcador como γH2AX) y la hipoxia (p. ej., utilizando el trazador EF5, ya sea como un derivado que contiene metal o acoplado a un anticuerpo específico para EF5 marcado con metal). Como se describe a continuación, el estado tisular puede correlacionarse con la presencia y/o distribución de fármacos que contienen metal o metales pesados acumulados.

[0339] Al detectar fármacos que contienen metales o metales pesados acumulados, como se describe a continuación, la muestra biológica puede obtenerse de un animal. Específicamente, el animal puede ser un mamífero (p. ej., un roedor o un ser humano), como un modelo de investigación animal o un paciente humano.

[0340] Los modelos de investigación animal incluyen cualquier animal modificado genéticamente o sometido a condiciones (p. ej., xenoinjerto de un tumor humano, exposición a un carcinógeno o exposición a un metal pesado tóxico) para inducir una enfermedad, como cáncer o intoxicación por metales pesados. En otras formas de realización, la muestra biológica se obtiene de un paciente humano, como una persona que padece cáncer o se somete a una prueba de exposición tóxica a un metal pesado. En cualquier caso, el animal puede estar expuesto a un fármaco quimioterapéutico o a un metal pesado antes de obtener la muestra biológica.

[0341] La detección multiplexada de marcadores metálicos, como se describe en este documento, puede utilizarse en experimentos de tipo pulso-persecución. Específicamente, la exposición de un animal vivo o una muestra biológica a fármacos que contienen metales o metales pesados tóxicos que comprenden diferentes isótopos metálicos del mismo elemento en diferentes puntos temporales puede usarse para monitorear la progresión de la retención y/o depuración del metal. En ciertos aspectos, un tratamiento o cambio en la exposición puede coincidir con uno o más puntos temporales.

[0342] Marcaje de la muestra de tejido

[0343] La divulgación produce muestras que han sido marcadas con átomos marcadores, por ejemplo, una pluralidad de átomos marcadores diferentes, donde los átomos marcadores son detectados por un aparato capaz de muestrear áreas específicas, preferiblemente subcelulares, de una muestra (los átomos marcadores, por lo tanto, representan una etiqueta elemental). La referencia a una pluralidad de átomos diferentes significa que se usa más de una especie atómica para marcar la muestra. Estas especies atómicas pueden distinguirse usando un detector de masas (p. ej., tienen diferentes relaciones m/Q), de modo que la presencia de dos átomos marcadores diferentes dentro de una columna da lugar a dos señales de EM diferentes. Las especies atómicas también se pueden distinguir utilizando un espectrómetro óptico (p. ej., átomos diferentes tienen espectros de emisión diferentes), de modo que la presencia de dos átomos marcadores diferentes dentro de una columna da lugar a dos señales espectrales de emisión diferentes.

[0344] Los métodos aquí descritos son adecuados para la detección simultánea de muchos más de dos átomos marcadores diferentes, lo que permite la detección de marcas multiplex, p. ej., al menos 3, 4, 5, 10, 20, 30, 32, 40, 50 o 5, incluso 100 átomos marcadores diferentes. Los átomos marcadores también se pueden utilizar de forma combinatoria para aumentar aún más el número de marcas distinguibles. Giesen et al.2014 demuestra el uso de 32 átomos marcadores diferentes en un método de obtención de imágenes, pero la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente por ablación láser (LA-ICP-EM) es intrínsecamente adecuada para la detección paralela de un mayor número de átomos diferentes, p. ej., incluso más de 100 especies atómicas diferentes, al igual que las otras técnicas aquí descritas. Al marcar diferentes objetivos con diferentes átomos marcadores, es posible determinar la ubicación celular de múltiples objetivos en una sola imagen.

[0345] El marcado de la muestra de tejido generalmente requiere que los átomos marcadores estén unidos a un miembro de un par de unión específico (SBP). Este SBP marcado se pone en contacto con una muestra de tejido de modo que pueda interactuar con el otro miembro del SBP (el miembro del SBP objetivo) si está presente, localizando así el átomo de marcaje en una ubicación específica en la muestra. El método de la divulgación detecta entonces la presencia del átomo de marcaje en esta ubicación específica y traduce esta información a una imagen en la que el miembro del SBP objetivo está presente en esa ubicación. Los metales de tierras raras y otros átomos marcadores pueden conjugarse con miembros del SBP mediante técnicas conocidas, por ejemplo, Brückner et al. (2013; Anal. Chem. 86:585-91) describe la unión de átomos de lantánidos a sondas de oligonucleótidos para la detección mediante ICP-EM. Gao y Yu (2007; Biosensor Bioelectronics 22:933-40) describen el uso de rutenio para marcar oligonucleótidos. Fluidigm Canada comercializa los kits de marcaje de metales MaxPar™, que permiten conjugar más de 30 átomos marcadores diferentes con proteínas (p. ej., anticuerpos, incluidos sus fragmentos).

[0346] Como se mencionó anteriormente, una etiqueta de masa que comprende uno o más átomos marcadores se une a un miembro de SBP, y este miembro de SBP, marcado con masa, se pone en contacto con la muestra de tejido, donde puede encontrar el miembro de SBP objetivo (si está presente), formando así un SBP objetivo marcado (también conocido como analito marcado). El miembro objetivo puede comprender cualquier estructura química adecuada para unirse a un átomo de marcaje y, posteriormente, para la obtención de imágenes, según la divulgación.

[0347] En términos generales, los métodos de la divulgación pueden basarse en cualquier SBP ya conocido para su uso en la determinación de la ubicación de moléculas objetivo en muestras de tejido (p. ej., como se usa en IHQ o hibridación in situ con fluorescencia, FISH), pero el miembro de la SBP que entra en contacto con la muestra portará un átomo marcador que es detectable por un sistema detector como se describió anteriormente. Por lo tanto, la divulgación puede implementarse fácilmente utilizando reactivos de IHQ y FISH disponibles, simplemente modificando los marcadores que se han utilizado previamente, p. ej., para modificar una sonda de FISH para que lleve un marcador que pueda detectarse.

[0348] La estructura común de las SBP con etiqueta de masa resultante de la similitud de las químicas de reacción utilizadas para conjugar las SBP y las etiquetas de masa también puede tener ventajas en términos de asegurar que las etiquetas de masa se ionicen de forma comparable para generar iones elementales cuando diferentes SBP con etiqueta de masa se despliegan juntos en una reacción multiplexada. El uso de una química de conjugación común beneficia el análisis altamente multiplexado que ofrece la citometría de masas por imágenes, ya que diferentes átomos marcadores se pueden unir con mayor facilidad a distintos tipos de SBP, lo que permite un diseño de ensayo más personalizable y flexible. Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación permiten la producción de muestras marcadas en las que dos o más reactivos de SBP con marca de masa presentan la misma vinculación entre la marca de masa y los componentes de SBP del reactivo. Algunas veces, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 100 de las SBP marcadas con masa utilizadas para teñir la muestra teñida tienen el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen proteínas, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y proteínas, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen anticuerpos y lectinas, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen péptidos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen péptidos, anticuerpos y lectinas, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen péptidos, ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. El mismo enlace puede comprender un 1,2,3-triazol, una piridazina o un isoxazol. En algunas formas de realización de lo anterior, la muestra también se ha teñido con una tinción histoquímica.

[0350] Como se mencionó anteriormente, la muestra ya puede contener átomos que se pueden detectar en el proceso de citometría de masas (incluido el proceso de citometría de masas por imágenes), es decir, que no son átomos marcadores, por ejemplo, cuando la muestra proviene de un sujeto al que se le ha administrado un fármaco que contiene metal o ha estado expuesto ambientalmente al metal.

[0352] Ciertos aspectos de la presente divulgación también proporcionan un método para producir una muestra marcada de la divulgación, que comprende: proporcionar una muestra; e

[0353] incubar la muestra con más de una SBP con etiqueta de masa, donde al menos dos de las SBP con etiqueta de masa se han formado mediante la conjugación de la SBP y la etiqueta de masa mediante la misma reacción de química clic, en condiciones adecuadas para permitir que la SBP forme un complejo con su miembro de SBP objetivo.

[0355] En algunas formas de realización, al menos dos de las SBP con etiqueta de masa tienen un componente de SBP y un componente de etiqueta de masa unidos por un enlazador que comprende un 1,2,3-triazol. En algunas formas de realización, al menos dos de las SBP con etiqueta de masa tienen SBP y etiquetas de masa unidos por un enlazador que comprende una piridazina. En algunas formas de realización, al menos dos de las SBP con etiqueta de masa tienen SBP y etiquetas de masa unidas por un enlazador que comprende un isoxazol. En algunas formas de realización, al menos dos de las SBP con etiqueta de masa tienen SBP y etiquetas de masa unidas por un enlazador que comprende un 1,2,3-triazol, y al menos dos de las SBP con etiqueta de masa tienen SBP y etiquetas de masa unidas por un enlazador que comprende una piridazina. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen proteínas que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen ácidos nucleicos que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen ácidos nucleicos y proteínas que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen anticuerpos que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen ácidos nucleicos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen anticuerpos y lectinas, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen ácidos nucleicos y péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen péptidos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen péptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunas formas de realización del método, las SBP incluyen péptidos, ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En ocasiones, la muestra marcada en el método puede contener átomos que pueden detectarse en el proceso de citometría de masas (incluido el proceso de citometría de masas por imagen), es decir, que no son átomos marcadores, por ejemplo, cuando la muestra proviene de un sujeto al que se le ha administrado un fármaco que contiene metal o que ha estado expuesto ambientalmente a dicho metal.

[0357] Kits

[0359] Los kits de la presente divulgación incluyen reactivos que pueden utilizarse para realizar uno o más de los pasos del método descritos en este documento. Algunos aspectos de la divulgación incluyen un kit para su uso en cualquiera de los métodos descritos en este documento.

[0361] Por consiguiente, ciertos aspectos de la presente divulgación proporcionan un kit que comprende dos o más SBP con etiqueta de masa de la divulgación, que presentan la misma vinculación entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP del reactivo. En ocasiones, el kit comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o al menos 100 SBP con etiqueta de masa que presentan la misma vinculación entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen proteínas que presentan la misma vinculación entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos que presentan la misma vinculación entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y proteínas que presentan la misma vinculación entre la etiqueta de masa y los componentes de SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen anticuerpos y lectinas, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen ácidos nucleicos y péptidos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen péptidos y anticuerpos, que presentan la misma unión entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En algunos casos, los SBP incluyen péptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes SBP de los reactivos. En algunos casos, las SBP incluyen péptidos, anticuerpos y lectinas, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. En otros casos, las SBP incluyen péptidos, ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos, que comprenden el mismo enlace entre la etiqueta de masa y los componentes de la SBP de los reactivos. El mismo enlace puede comprender un 1,2,3-triazol, una piridazina o un isoxazol. En algunos casos, el kit también puede incluir una tinción histoquímica. En algunas formas de realización, el kit también puede incluir un intercalador de ADN no específico con etiqueta de masa. En algunas formas de realización, el kit también puede contener un fármaco que contiene metal.

[0363] En ciertos aspectos, un kit comprende SBP seleccionados entre al menos dos, al menos tres o los cuatro péptidos, ácidos nucleicos, lectinas y anticuerpos. Cada SBP puede conjugarse mediante la misma reacción de química clic con una etiqueta de masa que comprende un elemento o isótopo diferente.

[0365] Por ejemplo, un kit puede incluir un fármaco que incluye un primer metal, una tinción histoquímica que se une específicamente a una estructura extracelular o intracelular distinta del ADN (donde la tinción histoquímica incluye un segundo metal) y un anticuerpo que se une específicamente a una proteína expresada por las células de la muestra biológica (donde el anticuerpo está marcado con un tercer metal; representando una SBP marcada por masa como se describe en el presente documento, como una SBP marcada por masa de la divulgación). Por ejemplo, el kit puede incluir una tinción histoquímica y un anticuerpo marcado por masa (p. ej., metal); un fármaco que contiene metal y un anticuerpo marcado por masa (p. ej., metal); un fármaco que contiene metal y una tinción histoquímica; una tinción histoquímica con un metal pesado tóxico (para su uso en un modelo de investigación animal); un metal pesado tóxico y un anticuerpo marcado por masa (p. ej., metal); o un metal pesado tóxico, una tinción histoquímica y un anticuerpo marcado por masa (p. ej., metal). Los metales pueden distinguirse entre sí mediante citometría de masas elemental.

[0367] Los kits de la divulgación objeto también pueden incluir desechables para recoger la muestra de un sujeto vivo, reactivos de preparación de muestras como se describe en el presente documento, tampones para suspender reactivos secos y/o lavar la muestra, y/o portaobjetos en los que obtener imágenes de la muestra biológica.

[0369] Elementos objetivo y detección de la distribución de etiquetas de masa (p. ej., metálicas)

[0370] Los métodos pueden incluir la detección de la distribución de etiquetas de masa (p. ej., metálicas) como se describe en el presente documento. En ciertos aspectos, la detección puede incluir la construcción de una imagen (como se describe más adelante en el presente documento) que represente la distribución espacial de las etiquetas de masa (p. ej., metálicas).

[0372] Ciertos métodos, kits y/o muestras biológicas pueden incluir una pluralidad de etiquetas de masa (p. ej., metálicas), como 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, o 50 o más etiquetas metálicas.

[0374] En resumen de lo anterior en la espectrometría de masas por imágenes, la distribución de uno o más elementos objetivo (es decir, elementos o isótopos elementales) puede ser de interés. En ciertos aspectos, los elementos objetivo son átomos marcadores, como se describe en este documento. En otros casos, el elemento objetivo puede ser un átomo presente de forma natural en la muestra; por ejemplo, un metal coordinado de forma natural en el sitio activo de ciertas enzimas. Un átomo de marcaje puede añadirse directamente a la muestra, solo o unido covalentemente a una molécula biológicamente activa. En ciertas formas de realización, los átomos marcadores (por ejemplo, marcadores metálicos) pueden conjugarse con un miembro de un par de unión específico (SBP), como un anticuerpo (que se une a su antígeno cognado), un aptámero o un oligonucleótido para hibridar con una objetivo de ADN o ARN, como se describe en este documento. Los átomos marcadores pueden unirse a un SBP mediante cualquier método conocido en la técnica, incluido el método de la presente divulgación. En ciertos aspectos, los átomos marcadores son un elemento metálico, como un lantánido o un elemento de transición, u otro marcador metálico, como se describe en este documento. El elemento metálico puede tener una masa mayor que 60 uma, mayor que 80 uma, mayor que 100 uma, o mayor que 120 uma. Los espectrómetros de masas descritos en este documento pueden agotar los iones elementales por debajo de las masas de los elementos metálicos, de modo que los elementos más ligeros y abundantes no creen efectos de porción espacial y/o saturen el detector de masas.

[0376] Análisis multiplexado

[0378] Una característica de la divulgación es su capacidad para detectar múltiples (p. ej.10 o más, e incluso hasta 100 o más) miembros SBP objetivo diferentes en una muestra, p. ej. para detectar múltiples proteínas diferentes y/o múltiples secuencias de ácidos nucleicos diferentes. Para permitir la detección diferencial de estos miembros SBP objetivo, sus respectivos miembros SBP deben llevar diferentes átomos marcadores de modo que se puedan distinguir sus señales. Por ejemplo, cuando se detectan diez proteínas diferentes, se pueden utilizar diez anticuerpos diferentes (cada uno específico para una proteína objetivo diferente), cada uno de los cuales lleva una marca única, de modo que se puedan distinguir las señales de los diferentes anticuerpos. En algunas formas de realización, es deseable usar múltiples anticuerpos diferentes contra una sola objetivo, por ejemplo, que reconocen diferentes epítopos en la misma proteína. Por lo tanto, un método puede usar más anticuerpos que objetivos debido a la redundancia de este tipo. Sin embargo, en general, la divulgación usará una pluralidad de átomos marcadores diferentes para detectar una pluralidad de objetivos diferentes.

[0380] Si se usa más de un anticuerpo marcado con la divulgación, es preferible que los anticuerpos tengan afinidades similares por sus respectivos antígenos, ya que esto ayuda a asegurar que la relación entre la cantidad de átomos marcadores detectados y la abundancia del antígeno objetivo en la muestra de tejido sea más consistente en diferentes SBP (particularmente a altas frecuencias de escaneo). De manera similar, es preferible que el marcaje de los diversos anticuerpos tenga la misma eficiencia, de modo que cada anticuerpo lleve una cantidad comparable del átomo de marcaje.

[0381] En algunos casos, la SBP puede llevar una etiqueta fluorescente, así como una etiqueta elemental. La fluorescencia de la muestra puede utilizarse para determinar regiones de la muestra, por ejemplo, una sección de tejido, que comprenden material de interés, el cual puede muestrearse para la detección de átomos marcadores. Por ejemplo, un marcador fluorescente puede conjugarse con un anticuerpo que se une a un antígeno abundante en las células cancerosas, y cualquier célula fluorescente puede entonces ser objetivo para determinar la expresión de otras proteínas celulares que se encuentran alrededor mediante SBP conjugadas con átomos marcadores. Cuando un SBP lleva una etiqueta fluorescente además de una etiqueta de masa, las etiquetas fluorescente y de masa pueden conjugarse con el SBP mediante diferentes químicas. Por ejemplo, la etiqueta de masa puede conjugarse mediante una reacción química de clic de la divulgación; y la etiqueta fluorescente puede conjugarse mediante la química de maleimida de la técnica anterior para conjugar la etiqueta fluorescente con un sulfhidrilo en el SBP. Como alternativa, tanto las etiquetas fluorescentes como las de masa pueden conjugarse con la SBP mediante química clic. Si un miembro de la SBP objetivo se encuentra intracelularmente, normalmente será necesario permeabilizar las membranas celulares antes o durante el contacto de la muestra con las etiquetas. Por ejemplo, cuando la objetivo es una secuencia de ADN, pero el miembro de la SBP marcado no puede penetrar las membranas de las células vivas, las células de la muestra de tejido pueden fijarse y permeabilizarse. El miembro de la SBP marcado puede entonces entrar en la célula y formar una SBP con el miembro de la SBP objetivo. En este sentido, se pueden utilizar protocolos conocidos para su uso con IHQ y FISH.

[0383] Se puede utilizar un método para detectar al menos una objetivo intracelular y al menos una objetivo de la superficie celular. Sin embargo, en algunas formas de realización, la divulgación puede utilizarse para detectar varias objetivos de la superficie celular, ignorando las objetivos intracelulares. En general, la elección de las objetivos estará determinada por la información que se desea obtener del método, ya que la divulgación proporcionará una imagen de la ubicación de las objetivos elegidas en la muestra.

[0384] Como se describe más adelante en este documento, se pueden usar parejas de unión específicas (es decir, reactivos de afinidad) que comprenden átomos marcadores para teñir (poner en contacto) una muestra biológica. Las parejas de unión específicas adecuadas incluyen anticuerpos (incluidos fragmentos de anticuerpos). Los átomos marcadores pueden distinguirse por espectrometría de masas (es decir, pueden tener diferentes masas). Los átomos marcadores pueden denominarse en este documento etiquetas de masa (p. ej., metálicas) cuando incluyen uno o más átomos metálicos. Las etiquetas de masa (p. ej., metálicas) pueden incluir un polímero con una cadena principal de carbono y una pluralidad de grupos colgantes que se unen cada uno a un átomo metálico (p. ej., grupos quelantes de metales cargados con un átomo metálico). Alternativamente, o además, las etiquetas metálicas pueden incluir una nanopartícula metálica. Los anticuerpos pueden marcarse con una etiqueta de masa (p. ej., metálica) mediante una interacción covalente o no covalente.

[0385] Las tinciones de anticuerpos pueden usarse para obtener imágenes de proteínas con resolución celular o subcelular. Los aspectos de la divulgación incluyen poner en contacto la muestra con uno o más anticuerpos que se unen específicamente a una proteína expresada por las células de la muestra biológica, donde el anticuerpo está marcado con una primera etiqueta de masa (p. ej., metálica). Por ejemplo, la muestra puede ponerse en contacto con 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más anticuerpos, cada uno con una etiqueta de masa (p. ej., metálica) distinguible. La muestra puede además ponerse en contacto con una o más tinciones histoquímicas antes, durante (p. ej., para facilitar el flujo de trabajo) o después (p. ej., para evitar alterar las objetivos antigénicas de los anticuerpos) de teñir la muestra con anticuerpos. La muestra puede comprender además uno o más fármacos que contienen metales y/o metales pesados acumulados como se describe en el presente documento.

[0386] Los anticuerpos marcados con masa (p. ej., metálica) para su uso en las divulgaciones objeto pueden unirse específicamente a una sonda metabólica que no comprende un metal (p. ej., EF5). Otros anticuerpos marcados con masa (p. ej., metal) pueden unirse específicamente a una objetivo (p. ej., tejido epitelial, tejido estromal, núcleo, etc.) de tinciones tradicionales utilizadas en fluorescencia y microscopía óptica. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos anti-cadherina, anti-colágeno, anti-queratina, anti-EFS, anti-histona H3 y varios otros anticuerpos conocidos en la técnica.

[0387] Alternativamente o además, detectar la distribución de etiquetas de masa (p. ej., metal) puede incluir medir el grado de colocalización de dos o más etiquetas de masa (p. ej., metal) (p. ej., asignar un valor al grado en que las etiquetas de masa (p. ej., metal) ocupan la misma ubicación o una similar). Dicho análisis puede ser útil para identificar estructuras subcelulares en las que se acumulan las etiquetas de masa (p. ej., metal), lo que puede informar sobre la comprensión de la biología de la exposición a las etiquetas de masa (p. ej., metal) (o sustancias químicas que contienen las etiquetas de masa (p. ej., metal)). En ciertos aspectos, la detección de la distribución espacial de las etiquetas de masa (p. ej., metal) puede ser a resolución subcelular. En ciertos aspectos, algunas o todas las etiquetas de masa (p. ej., metálicas) pueden no ser endógenas a la muestra biológica.

[0388] Análisis de células individuales

[0389] Los métodos de la presente divulgación incluyen la ablación láser de múltiples células en una muestra, por lo que se analizan las columnas de múltiples células y su contenido se mapea a ubicaciones específicas en la muestra para obtener una imagen. En la mayoría de los casos, el usuario del método necesitará localizar las señales en células específicas dentro de la muestra, en lugar de en la muestra en su conjunto. Para lograr esto, se pueden demarcar los dos límites celulares (p. ej., la membrana plasmática o, en algunos casos, la pared celular) en la muestra.

[0390] La demarcación de los límites celulares se puede lograr de diversas maneras. Por ejemplo, una muestra se puede estudiar utilizando técnicas convencionales que permiten demarcar los límites celulares, como la microscopía, como se mencionó anteriormente. Por lo tanto, al aplicar estos métodos, un sistema de análisis con una cámara, como se mencionó anteriormente, resulta particularmente útil. Se puede preparar una imagen de esta muestra utilizando un método de la presente divulgación, y esta imagen se puede superponer a los resultados anteriores, lo que permite localizar las señales detectadas en células específicas. De hecho, como se mencionó anteriormente, en algunos casos la ablación láser puede dirigirse únicamente a un subconjunto de células de la muestra, determinado como de interés mediante técnicas microscópicas.

[0391] Sin embargo, para evitar el uso de múltiples técnicas, es posible delimitar los límites celulares como parte del método de obtención de imágenes de la presente divulgación. Dichas estrategias de delimitación de límites son comunes en la IHQ y la inmunocitoquímica, y pueden adaptarse mediante el uso de marcadores detectables. Por ejemplo, el método puede implicar el marcado de moléculas objetivo que se sabe que se encuentran en los límites celulares, y la señal de estos marcadores puede utilizarse para la delimitación de los límites. Las moléculas objetivo adecuadas incluyen marcadores abundantes o universales de los límites celulares, como los miembros de complejos de adhesión (p. ej., β-catenina o E-cadherina). Algunas formas de realización pueden marcar más de una proteína de membrana para mejorar la delimitación. Además de delimitar los límites celulares mediante la inclusión de marcadores adecuados, también es posible delimitar orgánulos específicos de esta manera. Por ejemplo, antígenos como las histonas (p. ej., H3) se pueden usar para identificar el núcleo, y también es posible etiquetar antígenos específicos de las mitocondrias, antígenos específicos del citoesqueleto, antígenos específicos del aparato de Golgi, antígenos específicos del ribosoma, etc., lo que permite analizar la ultraestructura celular mediante los métodos de la divulgación.

[0392] Las señales que demarcan el límite de una célula (o un orgánulo) se pueden evaluar a simple vista o se pueden analizar por computadora mediante procesamiento de imágenes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica para otras técnicas de imagen, p. ej., Arce et al. (2013; Scientific Reports 3, artículo 2266) describe un esquema de segmentación que utiliza filtrado espacial para determinar los límites celulares a partir de imágenes de fluorescencia, referencia Ali et al. (2011; Mach Vis Appl 23:607-21) divulga un algoritmo que determina los límites a partir de imágenes de microscopía de campo claro, referencia Pound et al. (2012; The Plant Ce// 24:1353-61) divulga el método CellSeT para extraer la geometría celular de imágenes de microscopio confocal y hace referencia a Hodneland et al. (2013; Source Code for Biology and Medicine 8:16) divulga la caja de herramientas CellSegm MATLAB para imágenes de microscopio de fluorescencia. Un método útil con la divulgación utiliza la transformación de cuencas hidrográficas y el desenfoque gaussiano. Estas técnicas de procesamiento de imágenes pueden usarse por sí solas o pueden usarse y luego verificarse visualmente.

[0393] Una vez que se han demarcado los límites celulares, es posible asignar la señal de moléculas objetivo específicas a células individuales. También puede ser posible cuantificar la cantidad de un analito objetivo en una célula individual, por ejemplo, calibrando los métodos contra estándares cuantitativos.

[0394] Portamuestras

[0395] En ciertas formas de realización, la muestra puede inmovilizarse en un soporte sólido (es decir, un portamuestras), para posicionarla para la espectrometría de masas de imágenes. El portamuestras puede ser ópticamente transparente, por ejemplo, hecho de vidrio o plástico. Cuando el portamuestras es ópticamente transparente, permite la ablación del material de muestra a través del soporte. Por ejemplo, el soporte sólido puede incluir un portaobjetos de tejido. Alternativamente, o además, el soporte sólido puede incluir una platina de muestra (tal como una platina móvil, también llamada platina de traslación) como se describe más adelante en este documento. Algunas veces, el portamuestras comprenderá características que actúan como puntos de referencia para su uso con el aparato y los métodos descritos en este documento, por ejemplo, para permitir el cálculo de la posición relativa de las características/regiones de interés que se van a ablacionar o desorber y analizar.

[0396] Partículas de referencia

[0397] Como se describe en este documento, se pueden agregar partículas de referencia de composición elemental o isotópica conocida a la muestra (o al soporte de muestra) para su uso como referencia durante la detección de iones elementales objetivo en la muestra. En ciertas formas de realización, las partículas de referencia comprenden elementos metálicos o isótopos, tales como metales de transición o lantánidos. Por ejemplo, las partículas de referencia pueden comprender elementos o isótopos con una masa mayor de 60 uma, mayor de 80 uma, mayor de 100 uma o mayor de 120 uma. Los elementos objetivo, como los átomos marcadores, pueden normalizarse en una serie de muestras basándose en los iones elementales detectados a partir de partículas de referencia individuales. Por ejemplo, los métodos objeto pueden incluir la alternancia entre la detección de iones elementales a partir de partículas de referencia individuales y la detección únicamente de iones elementales objetivo.

[0398] APARATOS Y TÉCNICAS DE USO

[0399] En términos generales, el aparato analizador descrito en el presente documento comprende dos sistemas ampliamente caracterizados para realizar espectrometría de masas elemental por imágenes.

[0400] El primero es un sistema de muestreo e ionización. Este sistema contiene una cámara de muestra, que es el componente en el que se coloca la muestra cuando se somete a análisis. La cámara de muestra consta de una platina, que contiene la muestra (normalmente la muestra está en un portamuestras, como un portaobjetos de microscopio, p. ej. una sección de tejido, una monocapa de células o células individuales, como cuando se ha depositado una suspensión celular sobre el portaobjetos de microscopio y el portaobjetos se coloca en la platina). El sistema de muestreo e ionización actúa para eliminar material de la muestra en la cámara de muestra (el material eliminado se denomina aquí material de muestra) que se convierte en iones, ya sea como parte del proceso que causa la eliminación del material de la muestra o a través de un sistema de ionización separado, aguas abajo del sistema de muestreo.

[0401] El material ionizado es entonces analizado por el segundo sistema que es el sistema detector. El sistema detector puede adoptar diferentes formas dependiendo de la característica particular del material de muestra ionizado que se está determinando, por ejemplo, un detector de masas o un detector de emisión óptica en aparatos analizadores basados en espectrometría de masas y espectrómetros ópticos, respectivamente.

[0402] Por lo tanto, en funcionamiento, la muestra se lleva al aparato, se muestrea para generar material ionizado (el muestreo puede generar material vaporoso/particular, que posteriormente es ionizado por el sistema de ionización), y los iones del material de muestra pasan al sistema detector. Aunque el sistema detector puede detectar muchos iones, la mayoría de estos serán iones de los átomos que componen naturalmente la muestra. En algunas aplicaciones, por ejemplo, el análisis de minerales, como en aplicaciones geológicas o arqueológicas, esto puede ser suficiente.

[0403] En algunos casos, por ejemplo, al analizar muestras biológicas, la composición de elementos nativos de la muestra puede no ser adecuadamente informativa. Esto se debe a que, típicamente, todas las proteínas y ácidos nucleicos están compuestos por los mismos átomos constituyentes principales, y por lo tanto, si bien es posible distinguir las regiones que contienen proteína/ácido nucleico de las que no contienen dicho material proteínico o de ácido nucleico, no es posible diferenciar una proteína en particular de todas las demás proteínas. Sin embargo, al marcar la muestra con átomos que no están presentes en el material analizado en condiciones normales, o al menos que no están presentes en cantidades significativas (por ejemplo, ciertos átomos de metales de transición, como las tierras raras; véase la sección sobre marcado más adelante para más detalles), se pueden determinar las características específicas de la muestra. Al igual que con la IHQ y la FISH, los marcadores detectables pueden unirse a objetivos específicos en la muestra (como células fijadas o una muestra de tejido en un portaobjetos), entre otras cosas mediante el uso de SBP, como anticuerpos o ácidos nucleicos, dirigidos a moléculas en la muestra. Para detectar el marcador ionizado, se utiliza el sistema detector, como se haría para detectar iones de átomos presentes de forma natural en la muestra. Al vincular las señales detectadas con las posiciones conocidas del muestreo que las generó, es posible generar una imagen de los átomos presentes en cada posición, tanto de la composición elemental nativa como de los átomos marcadores. En los casos en que la composición elemental nativa de la muestra se agote antes de la detección, la imagen solo podrá ser de los átomos marcadores. La técnica permite el análisis de muchas etiquetas en paralelo (también denominada multiplexación), lo que supone una gran ventaja en el análisis de muestras biológicas.

[0404] Por lo tanto, se pueden utilizar varios tipos de aparatos analizadores para poner en práctica la divulgación, varios de los cuales se analizan en detalle a continuación.

[0405] Aparato analizador basado en detección de masas

[0406] 1. Sistemas de muestreo e ionización

[0407] a. Sistema de muestreo e ionización por ablación láser

[0408] Un analizador basado en ablación láser normalmente consta de tres componentes. El primero es un sistema de muestreo por ablación láser para la generación de columnas de material vaporoso y particulado a partir de la muestra para su análisis. Antes de que los átomos de las columnas de material de muestra ablacionado (incluido cualquier átomo de marcado detectable, como se analiza a continuación) puedan detectarse en el sistema detector, un componente de espectrómetro de masas (componente EM; el tercer componente), la muestra puede ionizarse (y atomizarse). Por consiguiente, el aparato comprende un segundo componente que es un sistema de ionización que ioniza los átomos para formar iones elementales para permitir su detección por el componente EM basado en la relación masa/porción (alguna ionización del material de muestra puede ocurrir en el punto de ablación, pero los efectos de porción espacial resultan en la neutralización casi inmediata de las porciones). El sistema de muestreo por ablación láser está conectado al sistema de ionización por un conducto de transferencia.

[0409] Sistema de muestreo por ablación láser

[0410] En breve resumen, los componentes de un sistema de muestreo por ablación láser incluyen una fuente láser que emite un haz de radiación láser que se dirige sobre una muestra. La muestra se coloca en una platina dentro de una cámara en el sistema de muestreo por ablación láser (la cámara de muestra). La platina suele ser una platina de traslación, de modo que la muestra se puede mover en relación con el haz de radiación láser mediante el cual se pueden muestrear diferentes ubicaciones en la muestra para su análisis. Como se explica con más detalle más adelante, el gas fluye a través de la cámara de muestra y este flujo arrastra las columnas de material aerosolizado generadas cuando la fuente láser ablaciona la muestra, para su análisis y construcción de una imagen de la muestra basada en su composición elemental (incluyendo el marcado de átomos, como el marcado de átomos a partir de marcadores elementales). Como se explica más adelante, en un modo de acción alternativo, el sistema láser del sistema de muestreo por ablación láser también puede utilizarse para desorber material de la muestra.

[0411] En el caso particular de las muestras biológicas (células, secciones de tejido, etc.), la muestra suele ser heterogénea (aunque se conocen muestras heterogéneas en otros campos de aplicación de la divulgación, es decir, muestras de naturaleza no biológica). Una muestra heterogénea es una muestra que contiene regiones compuestas por diferentes materiales, por lo que algunas regiones de la muestra pueden ablacionarse con un umbral de fluencia más bajo a una longitud de onda dada que otras. Los factores que afectan los umbrales de ablación son el coeficiente de absorbancia del material y su resistencia mecánica. En el caso de los tejidos biológicos, el coeficiente de absorbancia tendrá un efecto dominante, ya que puede variar con la longitud de onda de la radiación láser en varios órdenes de magnitud. Por ejemplo, en una muestra biológica, al utilizar pulsos láser de nanosegundos, una región que contiene material proteínico absorberá con mayor facilidad en el rango de longitud de onda de 200-230 nm, mientras que una región que contiene predominantemente ADN absorberá con mayor facilidad en el rango de longitud de onda de 260-280 nm.

[0412] Es posible realizar la ablación láser con una fluencia cercana al umbral de ablación del material de muestra. Esta ablación suele mejorar la formación de aerosoles, lo que a su vez puede ayudar a mejorar la calidad de los datos tras el análisis. A menudo, para obtener el cráter más pequeño y maximizar la resolución de la imagen resultante, se emplea un haz gaussiano. Una sección transversal a través de un haz gaussiano registra un perfil de densidad de energía con una distribución gaussiana. En ese caso, la fluencia del haz cambia con la distancia desde el centro. Como resultado, el diámetro del punto de ablación depende de dos parámetros: (i) la cintura gaussiana del haz (1/e²) y (ii) la relación entre la fluencia aplicada y la fluencia umbral.

[0414] Por lo tanto, para garantizar la eliminación consistente de una cantidad reproducible de material con cada pulso láser ablativo y, por lo tanto, maximizar la calidad de los datos de imagen, es útil mantener un diámetro de ablación constante, lo que implica ajustar la relación entre la energía suministrada por el pulso láser al objetivo y la energía umbral de ablación del material a ablacionar. Este requisito representa un problema al ablacionar una muestra heterogénea, donde la energía umbral de ablación varía a lo largo de la muestra, como en un tejido biológico, donde la relación entre el ADN y el material proteico varía, o en una muestra geológica, donde varía con la composición particular del mineral en la región de la muestra. Para solucionar esto, se puede enfocar más de una longitud de onda de radiación láser en la misma ubicación de ablación, para ablacionar la muestra de forma más efectiva según su composición en esa ubicación.

[0416] Sistema láser del sistema de muestreo por ablación láser

[0418] El sistema láser puede configurarse para producir una o más longitudes de onda de radiación láser. Normalmente, las longitudes de onda de la radiación láser mencionadas se refieren a la longitud de onda de mayor intensidad (la longitud de onda "pico"). Si el sistema produce diferentes longitudes de onda, estas pueden utilizarse para distintos fines; por ejemplo, para la focalización de diferentes materiales en una muestra (en este caso, la focalización implica que la longitud de onda elegida sea una que sea bien absorbida por el material).

[0420] Cuando se utilizan múltiples longitudes de onda, al menos dos de las dos o más longitudes de onda de la radiación láser pueden ser discretas. Por lo tanto, cuando una primera fuente láser emite una primera longitud de onda de radiación discreta de una segunda longitud de onda de radiación, significa que la primera fuente láser no produce radiación de la segunda longitud de onda, o la produce en un nivel muy bajo, en un pulso de la primera longitud de onda; por ejemplo, menos del 10 % de la intensidad de la primera longitud de onda, como menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %. Normalmente, cuando se producen diferentes longitudes de onda de radiación láser mediante la generación de armónicos u otros procesos de conversión de frecuencia no lineal, al referirse aquí a una longitud de onda específica, el experto en la técnica entenderá que habrá cierto grado de variación con respecto a la longitud de onda especificada en el espectro producido por el láser. Por ejemplo, una referencia a X nm abarca un láser que produce un espectro en el rango de X ± 10 nm, como X ± 5 nm, por ejemplo, X ± 3 nm.

[0422] Láseres

[0424] Generalmente, la elección de la longitud de onda y la potencia del láser utilizado para la ablación de la muestra puede seguir el uso normal en el análisis celular. El láser puede tener suficiente fluencia para provocar la ablación a la profundidad deseada, sin ablacionar sustancialmente el portador de la muestra. Una fluencia láser de entre 0,1 y 5 J/cm² suele ser adecuada, por ejemplo, de 3 a 4 J/cm² o aproximadamente 3,5 J/cm², y el láser idealmente podrá generar un pulso con esta fluencia a una frecuencia de 200 Hz o superior. En algunos casos, un solo pulso láser de dicho láser debería ser suficiente para la ablación de material celular para su análisis, de modo que la frecuencia del pulso láser coincida con la frecuencia con la que se generan las columnas de ablación. En general, para que un láser sea útil para la obtención de imágenes de muestras biológicas, debe producir un pulso con una duración inferior a 100 ns (preferiblemente inferior a 1 ns) que pueda enfocarse, por ejemplo, a los tamaños de punto específicos que se describen a continuación.

[0425] En algunos aparatos y métodos basados en LA, el láser utilizado es de estado sólido. Los láseres de estado sólido tienen la ventaja de ser compactos, ya que la luz láser se emite mediante un material cristalino dopado con un elemento, típicamente una tierra rara o un metal de transición. De particular utilidad es un láser basado en un cristal de granate de itrio y aluminio (YAG) Y<3>Al<5>O<12>. Un cristal alternativo es el fluoruro de itrio y litio (YLF) LiYF<4>. El cristal de un láser de estado sólido suele estar dopado con neodimio, iterbio, erbio, tulio, holmio o cromo. En ocasiones, el láser es un láser dopado con neodimio. En otras ocasiones, es un láser YAG de neodimio, que emite una λ de 213 nm.

[0427] Normalmente, el haz láser utilizado para la ablación en los sistemas láser aquí descritos tiene un tamaño de punto (es decir, en el punto de muestreo) de 100 µm o menos, como 50 µm o menos, 25 µm o menos, 20 µm o menos, 15 µm o menos, o 10 µm o menos, como aproximadamente 3 µm o menos, aproximadamente 2 µm o menos, aproximadamente 1 µm o menos, aproximadamente 500 nm o menos, aproximadamente 250 nm o menos. La distancia denominada tamaño del punto corresponde a la dimensión interna más larga del haz; por ejemplo, para un haz circular, es el diámetro del haz; para un haz cuadrado, corresponde a la longitud de la diagonal entre las esquinas opuestas; para un cuadrilátero, es la longitud de la diagonal más larga, etc. (como se mencionó anteriormente, el diámetro de un haz circular con una distribución gaussiana se define como la distancia entre los puntos en los que la fluencia ha disminuido a 1/e<2>veces la fluencia pico). Como alternativa al haz gaussiano, se puede emplear la conformación y el enmascaramiento del haz para proporcionar el punto de ablación deseado. Por ejemplo, en algunas aplicaciones, puede ser útil un punto de ablación cuadrado con una distribución de energía tipo sombrero de copa (es decir, un haz con una fluencia casi uniforme en lugar de una distribución de energía gaussiana). Esta disposición reduce la dependencia del tamaño del punto de ablación de la relación entre la fluencia en el pico de la distribución de energía gaussiana y la fluencia umbral. La ablación cerca de la fluencia umbral proporciona una generación de cráteres de ablación más fiable y controla la generación de escombros. Por consiguiente, el sistema láser puede incluir componentes de enmascaramiento y/o conformación del haz, como un elemento óptico difractivo, dispuestos en un haz gaussiano para reestructurar el haz y producir un punto focal láser con una fluencia uniforme o casi uniforme, como una fluencia que varía a lo largo del haz en menos de ±25%, por ejemplo, menos de ±20%, ±15%, ±10% o menos de ±5%. En ocasiones, el haz láser tiene una sección transversal cuadrada. En otras, presenta una distribución de energía en forma de sombrero de copa.

[0429] Cuando se utiliza para el análisis de muestras biológicas, para analizar células individuales, el tamaño del punto láser utilizado dependerá del tamaño y la separación entre ellas. Por ejemplo, cuando las células están muy juntas (como en una sección de tejido), una o más fuentes láser del sistema láser pueden tener un tamaño de punto no mayor que el de estas células. Este tamaño dependerá de las células particulares en una muestra, pero en general el punto láser tendrá un diámetro de menos de 4 µm, por ejemplo, dentro del rango de 0,1-4 µm, 0,25-3 µm o 0,4-2 µm. Por lo tanto, un punto láser puede tener un diámetro de aproximadamente 3 µm o menos, aproximadamente 2 µm o menos, aproximadamente 1 µm o menos, aproximadamente 0,5 µm o menos de 0,5 µm, como aproximadamente 400 nm o menos, aproximadamente 300 nm o menos, entre 250 nm y 2 µm, o entre 300 nm y 1 µm. Para analizar células dadas en una resolución subcelular, el sistema utiliza un tamaño de punto láser que no es mayor que estas células, y más específicamente utiliza un tamaño de punto láser que puede ablacionar material con una resolución subcelular. En ocasiones, el análisis de células individuales puede realizarse utilizando un tamaño de punto mayor que el tamaño de la célula, por ejemplo, cuando las células se distribuyen en el portaobjetos, con espacio entre ellas. En este caso, se puede utilizar un tamaño de punto mayor y lograr la caracterización de células individuales, ya que el área adicional ablacionada alrededor de la célula de interés no incluye células adicionales. Por lo tanto, el tamaño de punto específico utilizado puede seleccionarse adecuadamente en función del tamaño de las células analizadas. En muestras biológicas, las células rara vez serán todas del mismo tamaño, y por lo tanto, si se desea obtener imágenes con resolución subcelular, el tamaño del punto de ablación debe ser menor que la célula más pequeña, si se mantiene un tamaño de punto constante durante todo el procedimiento de ablación. Se pueden lograr puntos de tamaño pequeño utilizando el enfoque de haces de láser. Un diámetro de punto láser de 1 µm corresponde a un punto de enfoque láser (es decir, el diámetro del haz láser en el punto focal del haz) de 1 µm, pero el punto de enfoque láser puede variar en un 20% o más debido a la distribución espacial de energía en el objetivo (por ejemplo, forma del haz gaussiano) y la variación en la energía láser total con respecto a la energía del umbral de ablación. Los objetivos adecuados para enfocar un haz láser incluyen un objetivo reflectante, como un objetivo de un diseño Schwarzschild Cassegrain (Cassegrain inverso). También se pueden utilizar objetivos refractores, así como objetivos combinados reflectores-refractores. También se puede utilizar una sola lente asférica para lograr el enfoque requerido. También se puede utilizar una lente de inmersión sólida o una óptica difractiva para enfocar el haz láser. Otro medio para controlar el tamaño del punto del láser, que se puede utilizar solo o en combinación con los objetivos anteriores, es pasar el haz a través de una abertura, antes de enfocar. Se pueden lograr diferentes diámetros de haz al pasar el haz a través de aberturas de diferente diámetro de una matriz de diámetros. En algunos casos, hay una única abertura de tamaño variable, por ejemplo, cuando la abertura es una abertura de diafragma. A veces, la abertura de diafragma es un diafragma de iris. La variación del tamaño del punto también se puede lograr a través del dithering de la óptica. Una o más lentes y una o más aberturas de 5 se colocan entre el láser y la platina de muestra.

[0431] Para un análisis rápido de una muestra, se necesita una alta frecuencia de ablación, por ejemplo, más de 20 Hz (es decir, más de 20 ablaciones por segundo, lo que da más de 20 penachos por segundo). Comúnmente, la frecuencia de ablación del sistema láser es de al menos 40 Hz, como al menos 50 Hz, o al menos 100 Hz. Por ejemplo, la frecuencia de ablación del sistema láser está dentro del rango de 40-2000 Hz, dentro del rango de 40-1500 Hz, dentro del rango de 40-500 Hz, dentro del rango de 40-200 Hz, dentro del rango de 40-150 Hz, o dentro del rango de 75-150 Hz. Una frecuencia de ablación de más de 40 Hz permite obtener imágenes de muestras típicas en un tiempo razonable. La frecuencia con la que los pulsos láser pueden dirigirse a un punto en la muestra (suponiendo una ablación completa del material en ese punto) y aún así tener resolución individual determina la rapidez con la que se pueden obtener los píxeles de la imagen. Por consiguiente, si la duración del pulso láser necesaria para la ablación del material en un punto implica que solo se pueden dirigir menos de 5 pulsos por segundo a una muestra, el tiempo necesario para estudiar un área de 1 mm x 1 mm con ablación a un tamaño de punto de 1 µm sería de más de dos días. Con una frecuencia de 40 Hz, esto sería de aproximadamente 6-7 horas, con reducciones adicionales en el tiempo de análisis para aumentos adicionales en la frecuencia de los pulsos. A estas frecuencias, la instrumentación debe ser capaz de analizar el material ablacionado con la suficiente rapidez para evitar un solapamiento sustancial de señales entre ablaciones consecutivas, si se desea resolver cada columna ablada individualmente. Se prefiere que el solapamiento entre las señales originadas en columnas consecutivas sea <10% en intensidad, más preferiblemente <5%, e idealmente <2%. El tiempo necesario para el análisis de una columna dependerá del tiempo de lavado de la cámara de muestra (véase la sección sobre la cámara de muestra a continuación), el tiempo de tránsito del aerosol de la columna hacia y a través del sistema de ionización láser, y el tiempo necesario para analizar el material ionizado. Cada pulso láser puede correlacionarse con un píxel en la imagen de la muestra que se construye posteriormente, como se explica con más detalle a continuación.

[0433] El láser puede ser de femtosegundo, picosegundo o nanosegundo.

[0435] Para mayor claridad, los láseres estándar para LA con resolución subcelular, conocidos en la técnica, son los láseres excimer o exciplex. Se pueden obtener resultados adecuados utilizando un láser de fluoruro de argón (λ = 193 nm). Con estos láseres, las duraciones de pulso de 10-15 ns permiten lograr una ablación adecuada.

[0437] En general, la frecuencia e intensidad del pulso láser se seleccionan en combinación con las características de respuesta del detector EM para permitir la detección precisa de cada pluma de ablación láser. Gracias al uso de un punto láser pequeño y una cámara de muestra con un tiempo de lavado corto, ahora es posible obtener imágenes rápidas y de alta resolución.

[0438] Si el sistema láser emite radiación láser de dos o más longitudes de onda, esto puede lograrse mediante el uso de dos o más fuentes láser, donde cada fuente láser está adaptada para emitir radiación láser a una longitud de onda diferente de la longitud de onda de la radiación láser emitida por las otras fuentes láser del sistema.

[0439] Por lo tanto, el sistema láser puede comprender una primera fuente láser que emite radiación láser a una longitud de onda de 213 nm y una segunda fuente láser que emite radiación láser a 266 nm (de modo que la primera fuente láser ablaciona principalmente material proteico y la segunda ablaciona principalmente material de ADN). Si se desea la ablación a una tercera longitud de onda de radiación láser, se utiliza una tercera fuente láser en el sistema láser, y así sucesivamente. En ocasiones, el sistema láser para emitir múltiples longitudes de onda de radiación láser comprende una única fuente láser adaptada para emitir múltiples longitudes de onda de radiación láser (es decir, un láser emite múltiples longitudes de onda de radiación láser; el sistema láser puede incluir otras fuentes láser). Algunas fuentes láser emiten radiación láser a una longitud de onda deseada utilizando métodos de conversión de longitud de onda tales como armónicos o generación de suma de frecuencias, por generación de supercontinuo, por un amplificador paramétrico óptico u oscilador (OPA/OPO) o por una combinación de varias técnicas, como estándar en la técnica. Por ejemplo, un láser Nd-YAG genera radiación láser a una longitud de onda de 1064 nm, que se denomina su frecuencia fundamental. Esta longitud de onda se puede convertir en longitudes de onda más cortas (cuando sea necesario) mediante el método de generación de armónicos. El 4.º armónico de esa radiación láser estaría a 266 nm (1064 nm 4) y el 5.º armónico estaría a 213 nm. Por lo tanto, el 4.º armónico puede apuntar a la banda óptica de alta absorción para material de ADN, mientras que el 5.º armónico apuntaría a la banda de alta absorción para proteínas. En muchas disposiciones láser, la generación del 5.º armónico se basa en la generación del 4.º armónico. Por lo tanto, el 4.º armónico ya estará presente en el láser que genera la salida del 5.º armónico, aunque a menudo los armónicos más bajos (con longitud de onda más larga) se filtran en el láser. La eliminación de los filtros apropiados permite así la emisión de múltiples longitudes de onda de radiación láser. Ejemplos de tales láseres están disponibles comercialmente de Coherent, Inc, RP Photonics, Lee Laser, etc.

[0440] Otro par útil de frecuencias armónicas son los armónicos 4.º y 3.º de un láser con una longitud de onda fundamental de alrededor de 800 nm. Los armónicos 4.º y el 3.º aquí tendrían longitudes de onda de 200 nm y 266 nm respectivamente. Ejemplos de tales láseres están disponibles comercialmente (Coherent, Inc., Spectra Physics).

[0441] En algunas situaciones, donde la primera longitud de onda de la radiación láser y la segunda longitud de onda de la radiación láser son producidas por la misma fuente láser, las longitudes de onda no se producen a través de armónicos, sino de un láser con un amplio espectro de emisión. El espectro de emisión del láser puede ser de al menos 10 nm, como al menos 30 nm, al menos 50 nm o al menos 100 nm. Un láser de luz blanca o un láser supercontinuo producen múltiples longitudes de onda de luz.

[0442] Sincronización de los pulsos láser de diferente longitud de onda

[0443] En sistemas láser que emplean múltiples longitudes de onda, si ambas longitudes de onda son emitidas por la misma fuente láser, la sincronización entre los pulsos de cada longitud de onda ocurre automáticamente. En sistemas que emplean múltiples fuentes láser en el sistema de muestreo de ablación láser, los pulsos láser pueden sincronizarse, si esto se desea.

[0444] Cuando una sola fuente láser emite múltiples longitudes de onda de radiación láser y/o cuando se utilizan dos o más fuentes láser para emitir radiación láser de múltiples longitudes de onda, puede ser deseable un retardo de tiempo entre los pulsos de diferente longitud de onda. Cuando hay dos o más fuentes láser, se puede lograr un retardo disparando las fuentes láser en diferentes puntos de tiempo. Por consiguiente, si el sistema láser comprende dos o más fuentes láser, puede incluir además un controlador de temporización de pulsos láser, adaptado para generar pulsos asíncronos a partir de al menos dos de ellas. En ocasiones, los pulsos asíncronos se consiguen mediante un generador de retardo que introduce un retardo en los pulsos de disparo eléctrico que provocan la emisión de los pulsos de radiación láser por las fuentes.

[0445] Cuando la misma fuente láser emite pulsos láser de diferentes longitudes de onda (es decir, un solo pulso de la fuente láser comprende múltiples longitudes de onda de luz), la asincronía de los pulsos de diferentes longitudes de onda puede lograrse mediante diversas técnicas (por ejemplo, líneas de retardo óptico). Cuando se utilizan pulsos asíncronos de diferentes longitudes de onda de radiación láser, la columna resultante de cada pulso individual puede analizarse por separado. Alternativamente, los dos pulsos, aunque asíncronos, pueden estar lo suficientemente próximos en el tiempo como para producir una sola columna, lo que significa que el material de ambos pulsos se analiza como un solo evento en el espectrómetro de masas del aparato.

[0446] Una técnica para introducir un retardo en los pulsos de diferentes longitudes de onda emitidos por la misma fuente láser consiste en dirigirlos por trayectorias ópticas diferentes. La longitud de onda, dirigida por la trayectoria óptica más larga, tardará más en alcanzar la muestra y, por lo tanto, se retrasará con respecto al pulso de la longitud de onda con la trayectoria óptica más corta. La trayectoria óptica de la longitud de onda puede alargarse mediante un sistema de reflectores. Si el sistema de reflectores es ajustable, de modo que se pueda variar la distancia entre ellos, esto a su vez varía la longitud de la trayectoria que debe recorrer el pulso láser antes de incidir en la muestra, lo que permite controlar el retardo entre los pulsos de la longitud de onda dirigidos por la trayectoria óptica más corta y los de la trayectoria más larga. La separación de una longitud de onda de una o más longitudes de onda diferentes se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de un reflector selectivamente reflectante (p. ej., un filtro dicroico) o mediante el uso de otros divisores de haz como prismas, etc.

[0448] Otra técnica es colocar una línea de retardo óptico, como una línea de retardo óptico variable, entre la fuente láser y la platina que contiene la muestra que se va a ablacionar. Las líneas de retardo óptico están disponibles comercialmente en Oz Optics, Thorlabs, Newport, RF Optic, etc. Al introducir un retardo en una de las longitudes de onda de la radiación láser con respecto a la otra, se logra la entrega asincrónica de las diferentes longitudes de onda a partir de un pulso originalmente síncrono (es decir, se introduce un retardo de tiempo controlado en el pulso de una longitud de onda con respecto al pulso de la otra longitud de onda). La adaptación adecuada de las líneas de retardo se puede utilizar para controlar la longitud del retardo.

[0450] Punto focal de ablación láser

[0452] Para maximizar la eficiencia de un láser para la ablación de material de una muestra, esta debe estar en una posición adecuada con respecto al punto focal del láser, por ejemplo, en el punto focal, ya que el punto focal es donde el haz láser tendrá el diámetro más pequeño y, por lo tanto, la energía más concentrada. Esto se puede lograr de varias maneras. Una primera forma es mover la muestra en el eje de la luz láser dirigida sobre ella (es decir, arriba y abajo de la trayectoria de la luz láser/acercándose y alejándose de la fuente láser) hasta el punto deseado en el que la luz tenga la intensidad suficiente para efectuar la ablación deseada. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden usar lentes para mover el punto focal de la luz láser y, por lo tanto, su capacidad efectiva para ablacionar material en la ubicación de la muestra, por ejemplo, mediante demagnificación. Una o más lentes se colocan entre el láser y la platina de la muestra. Una tercera forma, que se puede usar sola o en combinación con una o ambas de las dos formas anteriores, es alterar la posición del láser.

[0454] Para ayudar al usuario del sistema a colocar la muestra en el lugar más adecuado para la ablación del material, se puede dirigir una cámara hacia la platina que la contiene (descrito con más detalle más adelante). Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un sistema de muestreo por ablación láser que comprende una cámara dirigida hacia la platina de la muestra. La imagen detectada por la cámara se puede enfocar al mismo punto en el que se enfoca el láser. Esto se logra utilizando el mismo objetivo tanto para la ablación láser como para la imagen óptica. Al coordinar el punto focal de ambos, el usuario puede garantizar que la ablación láser será más efectiva cuando la imagen óptica esté enfocada. El movimiento preciso de la platina para enfocar la muestra se puede lograr mediante el uso de activadores piezoeléctricos, disponibles en Physik Instrumente, Cedrat-Technologies, Thorlabs y otros proveedores.

[0456] En otro modo de funcionamiento, la ablación láser se dirige a la muestra a través del portamuestras. En este caso, el soporte de la muestra debe elegirse de forma que sea transparente (al menos parcialmente) a la frecuencia de la radiación láser empleada para la ablación. La ablación a través de la muestra puede ofrecer ventajas en situaciones particulares, ya que este modo de ablación puede impartir energía cinética adicional a la columna de material extraído, alejándolo de la superficie de la muestra y facilitando así su transporte para su análisis en el detector. Asimismo, los métodos basados en la desorción que eliminan residuos de material de muestra también pueden mediarse mediante la radiación láser que atraviesa el portador. La energía cinética adicional proporcionada al residuo de material que se desorbe puede ayudar a catapultarlo fuera del portamuestras, facilitando así su arrastre en el gas portador que fluye a través de la cámara de muestra.

[0458] Para obtener imágenes 3D de la muestra, esta, o una zona definida de la misma, puede ablacionarse hasta una primera profundidad que no la atraviesa completamente. A continuación, se puede volver a ablacionar la misma área a una segunda profundidad, y así sucesivamente a una tercera, cuarta, etc. De esta manera, se puede construir una imagen 3D de la muestra. En algunos casos, puede ser preferible ablacionar toda el área para la ablación a una primera profundidad antes de proceder a la ablación en la segunda profundidad. Como alternativa, se puede realizar la ablación repetida en el mismo punto para ablacionar a través de diferentes profundidades antes de proceder a la siguiente ubicación en el área para la ablación. En ambos casos, el software de imágenes puede realizar la deconvolución de las señales resultantes en el EM a las ubicaciones y profundidades de la muestra.

[0460] Óptica del sistema láser para múltiples modos de operación

[0462] Como una cuestión de disposición rutinaria, se pueden utilizar componentes ópticos para dirigir la radiación láser, opcionalmente de diferentes longitudes de onda, a diferentes ubicaciones relativas. Los componentes ópticos también se pueden disponer para dirigir la radiación láser, opcionalmente de diferentes longitudes de onda, sobre la muestra desde diferentes direcciones. Por ejemplo, se pueden dirigir una o más longitudes de onda sobre la muestra desde arriba, y una o más longitudes de onda de radiación láser (opcionalmente de diferentes longitudes de onda) desde abajo (es decir, a través del sustrato, como un portaobjetos, que contiene la muestra, también denominado portamuestras), o incluso la misma longitud de onda se puede dirigir desde arriba y/o desde abajo. Esto permite múltiples modos de funcionamiento para el mismo aparato. Por consiguiente, el sistema láser puede incluir una disposición de componentes ópticos, dispuestos para dirigir la radiación láser, opcionalmente de diferentes longitudes de onda, sobre la muestra desde diferentes direcciones. Por lo tanto, los componentes ópticos pueden disponerse de forma que la disposición dirija la radiación láser, opcionalmente de diferentes longitudes de onda, sobre la muestra desde direcciones opuestas. En este contexto, las direcciones "opuestas" no se limitan a la radiación láser dirigida perpendicularmente sobre la muestra desde arriba y desde abajo (lo que sería un ángulo opuesto de 180°), sino que incluyen disposiciones que dirigen la radiación láser sobre la muestra en ángulos distintos a la perpendicular a la muestra. No es necesario que la radiación láser dirigida sobre la muestra desde diferentes direcciones sea paralela. En ocasiones, cuando la muestra se encuentra sobre un portamuestras, la disposición del reflector puede configurarse para dirigir la radiación láser de una primera longitud de onda directamente sobre la muestra y para dirigir la radiación láser de una segunda longitud de onda hacia la muestra a través del portamuestras.

[0464] Dirigir la radiación láser a través del portamuestras hacia la muestra puede utilizarse para la ablación de la muestra. En algunos sistemas, sin embargo, dirigir la radiación láser a través del portador puede utilizarse para modos de operación "LIFTing", como se explica más adelante con más detalle en relación con los sistemas de muestreo basados en desorción (aunque, como comprenderá un experto en la técnica, la ablación y el LIFTing pueden realizarse con el mismo aparato, por lo que lo que aquí se denomina un sistema de muestreo por ablación láser también puede actuar como un sistema de muestreo basado en desorción). La apertura numérica (AN) de la lente utilizada para enfocar la radiación láser sobre la muestra desde la primera dirección puede ser diferente de la AN de la lente utilizada para enfocar la radiación láser (opcionalmente a una longitud de onda diferente) sobre la muestra desde la segunda dirección. La operación de elevación (por ejemplo, cuando la radiación láser se dirige a través del portamuestras) suele emplear un tamaño de punto de mayor diámetro que durante la ablación.

[0466] Cámara de muestra del sistema de muestreo por ablación láser

[0468] La muestra se coloca en la cámara de muestra cuando se somete a la ablación láser. La cámara de muestra consta de una platina que contiene la muestra (normalmente, la muestra se encuentra en un portamuestras). Durante la ablación, el material de la muestra forma columnas, y el flujo de gas que pasa a través de la cámara de muestra, desde una entrada a una salida, arrastra las columnas de material aerosolizado, incluyendo cualquier átomo marcador presente en el punto de ablación. El gas transporta el material al sistema de ionización, que lo ioniza para permitir su detección por el detector. El detector puede distinguir los átomos de la muestra, incluyendo los marcadores, y su detección revela la presencia o ausencia de múltiples objetivos en una columna, lo que permite determinar qué objetivos estaban presentes en el punto de ablación de la muestra. Por consiguiente, la cámara de muestra desempeña una doble función: alberga la muestra sólida que se analiza y es el punto de partida de la transferencia de material aerosolizado a los sistemas de ionización y detección. Esto significa que el flujo de gas a través de la cámara puede afectar la dispersión de la columna de material ablacionada a medida que pasa por el sistema. Una medida de la dispersión de la columna ablacionada es el tiempo de lavado de la cámara de muestra. Esta cifra mide el tiempo que tarda el material extraído de la muestra en ser extraído de la cámara de muestra por el gas que fluye a través de ella.

[0470] La resolución espacial de las señales generadas por la ablación láser (es decir, cuando la ablación se utiliza para la obtención de imágenes en lugar de exclusivamente para la limpieza, como se explica más adelante) depende de factores como: (i) el tamaño del punto del láser, ya que la señal se integra sobre el área total extraída; y la velocidad con la que se generan las columnas en función del movimiento de la muestra con respecto al láser; y (ii) la velocidad a la que se puede analizar una columna, en relación con la velocidad a la que se generan las columnas, para evitar la superposición de señales de columnas consecutivas, como se mencionó anteriormente. Por consiguiente, poder analizar una columna en el menor tiempo posible minimiza la probabilidad de superposición de columnas (y, por lo tanto, permite que se generen columnas con mayor frecuencia), si se desea un análisis individual de columnas.

[0472] Por consiguiente, una cámara de muestra con un tiempo de lavado corto (p. ej., 100 ms o menos) es ventajosa para su uso con el aparato y los métodos descritos en este documento. Una cámara de muestra con un tiempo de lavado largo limitará la velocidad a la que se puede generar una imagen o dará lugar a una superposición entre las señales que se originan en puntos de muestra consecutivos (p. ej., Kindness et al. (2003; C!in Chem 49:1916-23), que tenía una duración de señal de más de 10 segundos). Por lo tanto, el tiempo de lavado del aerosol es un factor limitante clave para lograr una alta resolución sin aumentar el tiempo de escaneo total. Se conocen en la técnica cámaras de muestra con tiempos de lavado de <100 ms. Por ejemplo, Gurevich y Hergenröder (2007; J. Anal. At. Spectrom., 22:1043-1050) describen una cámara de muestra con un tiempo de lavado inferior a 100 ms. Una cámara de muestra se describió en Wang et al. (2013; Anal. Chem.85:10107-16) (véase también WO 2014/146724) con un tiempo de lavado de 30 ms o menos, lo que permite una alta frecuencia de ablación (p. ej., superior a 20 Hz) y, por consiguiente, un análisis rápido. Otra cámara de muestra similar se describe en WO 2014/127034. La cámara de muestra de WO 2014/127034 comprende una célula de captura de muestra configurada para disponerse operativamente cerca del objetivo. Dicha célula de captura de muestra incluye: una cavidad de captura con una abertura formada en una superficie de la célula de captura, donde la cavidad de captura está configurada para recibir, a través de la abertura, el material objetivo expulsado o generado desde el sitio de ablación láser, y una pared guía expuesta dentro de la cavidad de captura, configurada para dirigir un flujo de gas portador dentro de la cavidad de captura desde una entrada hasta una salida, de modo que al menos una parte del material objetivo recibido dentro de la cavidad de captura pueda transferirse a la salida como muestra. El volumen de la cavidad de captura en la cámara de muestra del documento WO 2014/127034 es inferior a 1 cm³ y puede ser inferior a 0,005 cm³. En ocasiones, la cámara de muestra tiene un tiempo de lavado de 25 ms o menos, como 20 ms, 10 ms o menos, 5 ms o menos, 2 ms o menos, 1 ms o menos, o 500 µs o menos, 200 µs o menos, 100 µs o menos, 50 µs o menos, o 25 µs o menos. Por ejemplo, la cámara de muestra puede tener un tiempo de lavado de 10 µs o más. Normalmente, el tiempo de lavado de la cámara de muestra es de 5 ms o menos.

[0474] Para completar, a veces las columnas de la muestra se pueden generar con mayor frecuencia que el tiempo de lavado de la cámara de muestra, y las imágenes resultantes se difuminan en consecuencia (p. ej., si la resolución más alta posible no se considera necesaria para el análisis particular que se está realizando).

[0476] La cámara de muestra generalmente comprende una platina de traslación que sostiene la muestra (y el portamuestras) y mueve la muestra en relación con los haces de radiación láser. Cuando se utiliza un modo de operación que requiere la dirección de la radiación láser a través del portamuestras hasta la muestra, p. ej., como en los métodos de elevación discutidos aquí, la platina que sostiene el portamuestras también debe ser transparente a la radiación láser utilizada.

[0477] Por lo tanto, la muestra puede colocarse en el lado del portamuestras (p. ej., portaobjetos de vidrio) orientado hacia la radiación láser a medida que se dirige sobre la muestra, de modo que las columnas de ablación se liberan y capturan desde el mismo lado desde el que se dirige la radiación láser sobre la muestra. Como alternativa, la muestra puede colocarse en el lado del portamuestras opuesto a la radiación láser, ya que esta se dirige sobre ella (es decir, la radiación láser atraviesa el portamuestras antes de alcanzarla), y las columnas de ablación se liberan y capturan en el lado opuesto.

[0478] Una característica de la cámara de muestra, especialmente útil para la ablación de porciones específicas en diversas áreas discretas de la muestra, es su amplio rango de movimiento, que permite mover la muestra en los ejes x e y (horizontales) con respecto al láser (donde el haz láser se dirige sobre la muestra en el eje z), siendo los ejes x e y perpendiculares entre sí. Se consiguen posiciones relativas más fiables y precisas moviendo la platina dentro de la cámara de muestra y manteniendo fija la posición del láser en el sistema de muestreo de ablación láser del aparato. Cuanto mayor sea el rango de movimiento, mayor será la distancia entre las áreas ablacionadas. La muestra se mueve con respecto al láser moviendo la platina sobre la que se coloca. Por consiguiente, la platina de muestra puede tener un rango de movimiento dentro de la cámara de muestra de al menos 10 mm en los ejes x e y, como por ejemplo, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm o 75 mm. En ocasiones, el rango de movimiento permite analizar toda la superficie de un portaobjetos estándar de 25 x 75 mm dentro de la cámara. Para lograr la ablación subcelular, además de un amplio rango de movimiento, este debe ser preciso. Por consiguiente, la platina puede configurarse para mover la muestra en los ejes x e y en incrementos inferiores a 10 µm, como menos de 5 µm, menos de 4 µm, menos de 3 µm, menos de 2 µm, 1 µm, o menos de 1 µm, como menos de 500 nm, menos de 200 nm, menos de 100 nm. Por ejemplo, la platina puede configurarse para mover la muestra en incrementos de al menos 50 nm. Los movimientos precisos de la platina pueden ser en incrementos de aproximadamente 1 µm, como 1 µm ± 0,1 µm. Se pueden utilizar platinas de microscopio disponibles comercialmente, por ejemplo, las de Thorlabs, Prior Scientific y Applied Scientific Instrumentation. Alternativamente, la platina motorizada puede construirse a partir de componentes, basados en posicionadores que proporcionan el rango de movimiento deseado y un movimiento de precisión adecuadamente fino, como los posicionadores SLC-24 de Smaract.

[0480] Naturalmente, cuando una platina de muestra en una cámara presenta un amplio rango de movimiento, la muestra debe tener el tamaño adecuado para adaptarse a los movimientos de la platina. Por lo tanto, el tamaño de la cámara de muestra depende del tamaño de la muestra, lo que a su vez determina el tamaño de la platina móvil. Ejemplos de tamaños de cámara de muestra son: una cámara interna de 10 x 10 cm, 15 x 15 cm o 20 x 20 cm. La profundidad de la cámara puede ser de 3 cm, 4 cm o 5 cm. El experto en la técnica podrá seleccionar las dimensiones adecuadas siguiendo las instrucciones aquí presentadas. Las dimensiones internas de la cámara de muestra para analizar muestras biológicas utilizando un muestreador de ablación láser deben ser mayores que el rango de movimiento de la platina de muestra, por ejemplo al menos 5 mm, como al menos 10 mm Esto se debe a que si las paredes de la cámara están demasiado cerca del borde de la platina, el flujo del gas portador que pasa a través de la cámara que lleva las columnas de material ablacionadas lejos de la muestra y hacia el sistema de ionización puede volverse turbulento. El flujo turbulento perturba las columnas ablacionadas y, por lo tanto, en lugar de permanecer como una nube compacta de material ablacionado, la columna de material comienza a extenderse después de haber sido ablacionada y llevada al sistema de ionización del aparato. Un pico más amplio del material ablacionado tiene efectos negativos en los datos producidos por los sistemas de ionización y detección porque conduce a interferencias debido a la superposición de picos y, por lo tanto, en última instancia, datos con menor resolución espacial, a menos que la velocidad de ablación se reduzca a tal velocidad que ya no sea de interés experimental.

[0482] Como se mencionó anteriormente, la cámara de muestra comprende una entrada de gas y una salida de gas que lleva material al sistema de ionización. Sin embargo, puede contener puertos adicionales que actúan como entradas o salidas para dirigir el flujo de gas en la cámara y/o proporcionar una mezcla de gases a la cámara, según lo determine el artesano experto para el proceso ablativo particular que se esté llevando a cabo.

[0484] Cámara

[0486] Además de identificar el posicionamiento más efectivo de la muestra para la ablación láser, la inclusión de una cámara (como una cámara basada en un sensor de imagen de dispositivo de porción acoplada (CCD) o una cámara basada en un sensor de píxeles activos), o cualquier otro medio de detección de luz en un sistema de muestreo de ablación láser permite varios análisis y técnicas adicionales. Un CCD es un medio para detectar luz y convertirla en información digital que permite generar una imagen. Un sensor de imagen CCD cuenta con una serie de condensadores que detectan la luz, cada uno de los cuales representa un píxel en la imagen determinada. Estos condensadores permiten la conversión de los fotones entrantes en porciones eléctricas. El CCD se utiliza para leer estas porciones, y las porciones registradas se pueden convertir en una imagen. Un sensor de píxeles activos (APS) es un sensor de imagen que consta de un circuito integrado que contiene una matriz de sensores de píxeles, cada uno de los cuales contiene un fotodetector y un amplificador activo, por ejemplo, un sensor CMOS.

[0488] Se puede incorporar una cámara a cualquier sistema de muestreo por ablación láser descrito en este documento, o a un sistema de espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) o de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), como se describe en este documento. La cámara se puede utilizar para escanear la muestra e identificar células o regiones de interés particular (por ejemplo, células con una morfología específica), o para sondas fluorescentes específicas para un antígeno o una estructura intracelular. En ciertas formas de realización, las sondas fluorescentes son tinciones histoquímicas o anticuerpos que también comprenden una etiqueta de masa detectable. Una vez identificadas dichas células, se pueden dirigir pulsos láser a estas células específicas para extirpar material para su análisis, por ejemplo, mediante un proceso automatizado (donde el sistema identifica y extirpa las características/regiones, como las células de interés) o semiautomatizado (donde el usuario del sistema, por ejemplo, un patólogo clínico, identifica las características/regiones de interés, que el sistema extirpa de forma automatizada). Esto permite un aumento significativo en la velocidad de los análisis, ya que, en lugar de tener que extirpar toda la muestra para analizar células específicas, se pueden extirpar específicamente las células de interés. Esto optimiza los métodos de análisis de muestras biológicas en términos del tiempo necesario para realizar la extirpación, pero en particular en el tiempo necesario para interpretar los datos de la extirpación y construir imágenes a partir de ellos. La construcción de imágenes a partir de los datos es una de las partes más laboriosas del procedimiento de obtención de imágenes y, por lo tanto, al minimizar los datos recopilados a los datos de las partes relevantes de la muestra, se aumenta la velocidad general del análisis.

[0490] La cámara puede registrar la imagen desde un microscopio confocal. La microscopía confocal es una forma de microscopía óptica que ofrece varias ventajas, incluida la capacidad de reducir la interferencia de la información de fondo (luz) alejada del plano focal. Esto sucede mediante la eliminación de la luz desenfocada o el deslumbramiento. La microscopía confocal se puede utilizar para evaluar muestras no teñidas en cuanto a la morfología de las células, o si una célula es una célula discreta o parte de un grupo de células. A menudo, la muestra se marca específicamente con marcadores fluorescentes (como anticuerpos marcados o ácidos nucleicos marcados). Estos marcadores fluorescentes se pueden utilizar para teñir poblaciones celulares específicas (p. ej., que expresan ciertos genes o proteínas) o características morfológicas específicas de las células (como el núcleo o las mitocondrias) y, cuando se iluminan con una longitud de onda de luz adecuada, estas regiones de la muestra son específicamente identificables. Por lo tanto, algunos sistemas descritos en este documento pueden comprender un láser para excitar fluoróforos en las etiquetas utilizadas para marcar la muestra. Alternativamente, se puede utilizar una fuente de luz LED para excitar los fluoróforos. La microscopía de fluorescencia no confocal (p. ej., de campo amplio) también se puede utilizar para identificar ciertas regiones de la muestra biológica, pero con una resolución menor que la microscopía confocal.

[0492] Una técnica de obtención de imágenes alternativa es la microscopía de excitación de dos fotones (también denominada microscopía no lineal o multifotónica). La técnica comúnmente emplea luz cercana al IR para excitar fluoróforos. Se absorben dos fotones de luz IR por cada evento de excitación. La dispersión en el tejido se minimiza mediante IR. Además, debido a la absorción multifotónica, la señal de fondo se suprime fuertemente. Los fluoróforos más comúnmente utilizados tienen espectros de excitación en el rango de 400 a 500 nm, mientras que el láser utilizado para excitar la fluorescencia de dos fotones se encuentra en el rango cercano al IR. Si el fluoróforo absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá suficiente energía para elevarse al estado excitado. El fluoróforo emitirá entonces un solo fotón con una longitud de onda que depende del tipo de fluoróforo utilizado, que luego puede detectarse.

[0494] Cuando se utiliza un láser para excitar fluoróforos para microscopía de fluorescencia, a veces este láser es el mismo que genera la luz láser utilizada para la ablación de material de la muestra biológica, pero se utiliza a una potencia que no es suficiente para causar la ablación de material de la muestra. En ocasiones, los fluoróforos se excitan mediante la longitud de onda de la luz con la que el láser realiza la ablación de la muestra. En otras ocasiones, se puede utilizar una longitud de onda diferente, por ejemplo, generando diferentes armónicos del láser para obtener luz de diferentes longitudes de onda, o aprovechando los diferentes armónicos generados en un sistema de generación de armónicos, como se mencionó anteriormente, además de los armónicos utilizados para la ablación de la muestra. Por ejemplo, si se utilizan el cuarto y/o quinto armónico de un láser Nd:YAG, el armónico fundamental, o los armónicos segundo a tercero, podrían emplearse para la microscopía de fluorescencia.

[0496] Como ejemplo de una técnica que combina fluorescencia y ablación láser, es posible marcar los núcleos de las células de la muestra biológica con un anticuerpo o ácido nucleico conjugado con una fracción fluorescente. Por consiguiente, al excitar el marcador fluorescente y observar y registrar las posiciones de la fluorescencia con una cámara, es posible dirigir el láser de ablación específicamente a los núcleos o a áreas que no incluyan material nuclear. La división de la muestra en núcleos y regiones citoplasmáticas tendrá una aplicación particular en el campo de la citoquímica. Mediante un sensor de imagen (como un detector CCD o un sensor de píxeles activos, por ejemplo, un sensor CMOS), es posible automatizar por completo el proceso de identificación de características/regiones de interés y su posterior ablación. Para ello, se utiliza un módulo de control (como una computadora o un chip programado) que correlaciona la ubicación de la fluorescencia con las coordenadas x,y de la muestra y dirige el láser de ablación a dicha ubicación. Como parte de este proceso, la primera imagen tomada por el sensor de imagen puede tener un objetivo de bajo aumento (baja apertura numérica), lo que permite examinar una amplia área de la muestra. Posteriormente, se puede cambiar a un objetivo de mayor aumento para identificar las características de interés que se han determinado como fluorescentes mediante imágenes ópticas de mayor aumento. Estas características registradas como fluorescentes pueden ser ablacionadas mediante un láser. El uso inicial de una lente de menor apertura numérica ofrece la ventaja adicional de aumentar la profundidad de campo, lo que significa que las características ocultas en la muestra pueden detectarse con mayor sensibilidad que con una lente de mayor apertura numérica desde el principio.

[0498] En métodos y sistemas que utilizan imágenes fluorescentes, la trayectoria de emisión de la luz fluorescente desde la muestra hasta la cámara puede incluir una o más lentes o uno o más filtros ópticos. Al incluir un filtro óptico adaptado para dejar pasar un ancho de banda espectral seleccionado de una o más de las etiquetas fluorescentes, el sistema está adaptado para gestionar las aberraciones cromáticas asociadas con las emisiones de las etiquetas fluorescentes. Las aberraciones cromáticas se producen cuando las lentes no enfocan la luz de diferentes longitudes de onda en el mismo punto focal. Por consiguiente, al incluir un filtro óptico, se reduce el fondo del sistema óptico y la imagen óptica resultante tiene una mayor resolución. Otra forma de minimizar la cantidad de luz emitida de longitudes de onda no deseadas que llega a la cámara es aprovechar deliberadamente la aberración cromática de las lentes mediante el uso de una serie de lentes diseñadas para la transmisión y el enfoque de la luz en la longitud de onda transmitida por el filtro óptico, similar al sistema descrito en el documento WO 2005/121864.

[0500] Una imagen óptica de mayor resolución resulta ventajosa en esta combinación de técnicas ópticas y muestreo por ablación láser, ya que la precisión de la imagen óptica determina la precisión con la que se puede dirigir el láser de ablación para extirpar la muestra.

[0502] Por consiguiente, en algunas formas de realización descritas en este documento, el aparato de ciertos aspectos de la presente divulgación comprende una cámara. Esta cámara puede usarse en línea para identificar características/áreas de la muestra, por ejemplo, células específicas, que luego pueden ablacionarse (o desorberse mediante LIFTing, véase más abajo).

[0504] En otro modo de funcionamiento que combina el análisis de fluorescencia y el muestreo por ablación láser, en lugar de analizar todo el portaobjetos en busca de fluorescencia antes de dirigir la ablación láser a esas ubicaciones, es posible disparar un pulso del láser a un punto de la muestra (a baja energía para solo excitar las fracciones fluorescentes de la muestra en lugar de ablacionar la muestra) y, si se detecta una emisión fluorescente de la longitud de onda esperada, entonces la muestra en el punto puede ablacionarse disparando el láser a ese punto a máxima energía, y la columna resultante puede analizarse mediante un detector como se describe más abajo. Esto tiene la ventaja de que se mantiene el modo de análisis rasterizado, pero se aumenta la velocidad, porque es posible pulsar y probar la fluorescencia y obtener resultados inmediatamente de la fluorescencia (en lugar del tiempo que toma analizar e interpretar los datos de iones del detector para determinar si la región era de interés), lo que nuevamente permite que solo los loci de importancia sean seleccionados para el análisis. En consecuencia, al aplicar esta estrategia en la formación de imágenes de una muestra biológica que comprende una pluralidad de células, se pueden realizar los siguientes pasos: (i) marcar una pluralidad de diferentes moléculas objetivo en la muestra con uno o más átomos marcadores diferentes y una o más marcas fluorescentes, para proporcionar una muestra marcada; (ii) iluminar una ubicación conocida de la muestra con luz para excitar una o más marcas fluorescentes; (iii) observar y registrar si hay fluorescencia en la ubicación; (iv) si hay fluorescencia, dirigir la ablación láser a la ubicación, para formar una columna; (v) someter la columna a espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, y (vi) repetir los pasos (ii) a (v) para una o más ubicaciones conocidas de la muestra, lo que permite la detección de átomos marcadores en las columnas para construir una imagen de la muestra de las áreas ablacionadas.

[0506] En algunos casos, la muestra o el portamuestras puede modificarse para contener fracciones ópticamente detectables (por ejemplo, mediante microscopía óptica o de fluorescencia) en ubicaciones específicas. Las ubicaciones fluorescentes pueden utilizarse para orientar la muestra en el aparato. El uso de estas ubicaciones de marcador resulta útil, por ejemplo, cuando la muestra se ha examinado visualmente fuera de línea, como en un aparato distinto al descrito en la presente divulgación. Dicha imagen óptica puede marcarse con características o regiones de interés, correspondientes a células específicas, por ejemplo, por un médico, antes de transferir la imagen óptica con las características o regiones de interés resaltadas y la muestra a un aparato de acuerdo con la presente divulgación. Aquí, mediante la referencia a las ubicaciones de los marcadores en la imagen óptica anotada, el aparato de la presente divulgación puede identificar las posiciones fluorescentes correspondientes mediante el uso de la cámara y calcular un plan ablativo y/o desorbtivo (LIFTing) para las posiciones de los pulsos láser en consecuencia. Por consiguiente, algunos aspectos de la presente divulgación comprenden un módulo controlador de orientación capaz de realizar los pasos anteriores.

[0508] En algunos casos, la selección de las características/regiones de interés puede realizarse utilizando el aparato de la presente divulgación, basándose en una imagen de la muestra tomada por la cámara del aparato de la presente divulgación.

[0510] Conducto de transferencia

[0511] El conducto de transferencia forma un enlace entre el sistema de muestreo por ablación láser y el sistema de ionización, y permite el transporte de columnas de material de muestra, generadas por la ablación láser de la muestra, desde el sistema de muestreo por ablación láser hasta el sistema de ionización. Parte (o la totalidad) del conducto de transferencia puede formarse, por ejemplo, perforando un material adecuado para producir un lumen (por ejemplo, un lumen con una sección transversal circular, rectangular u otra) para el tránsito de la columna. El conducto de transferencia a veces tiene un diámetro interior en el rango de 0,2 mm a 3 mm. A veces, el diámetro interior del conducto de transferencia puede variarse a lo largo de su longitud. Por ejemplo, el conducto de transferencia puede ser cónico en un extremo. Un conducto de transferencia a veces tiene una longitud en el rango de 1 centímetro a 100 centímetros. A veces la longitud no es más de 10 centímetros (p. ej., 1-10 centímetros), no más de 5 centímetros (p. ej., 1-5 centímetros) o no más de 3 cm (p. ej., 0,1-3 centímetros). A veces, el lumen del conducto de transferencia es recto a lo largo de toda la distancia, o casi toda la distancia, desde el sistema de ablación hasta el sistema de ionización. Otras veces, el lumen del conducto de transferencia no es recto en toda la distancia y cambia de orientación. Por ejemplo, el conducto de transferencia puede hacer un giro gradual de 90 grados. Esta configuración permite que la columna generada por la ablación de una muestra en el sistema de muestreo por ablación láser se mueva inicialmente en un plano vertical mientras que el eje en la entrada del conducto de transferencia apuntará hacia arriba y se moverá horizontalmente a medida que se aproxima al sistema de ionización (p. ej., una antorcha ICP que comúnmente está orientada horizontalmente para aprovechar el enfriamiento por convección). El conducto de transferencia puede ser recto por una distancia de al menos 0,1 centímetros, al menos 0,5 centímetros o al menos 1 centímetro desde la abertura de entrada a través de la cual ingresa o se forma la columna. En términos generales, típicamente, el conducto de transferencia está adaptado para minimizar el tiempo que toma transferir material desde el sistema de muestreo por ablación láser al sistema de ionización.

[0513] Entrada del conducto de transferencia, incluido el cono de muestra

[0515] El conducto de transferencia comprende una entrada en el sistema de muestreo por ablación láser (en particular dentro de la cámara de muestra del sistema de ablación láser; por lo tanto, también representa la salida principal de gas de la cámara de muestra). La entrada del conducto de transferencia recibe material de muestra extraído de una muestra en el sistema de ablación láser y lo transfiere al sistema de ionización. En algunos casos, la entrada del sistema de muestreo por ablación láser es la fuente de todo el flujo de gas a lo largo del conducto de transferencia hacia el sistema de ionización. En algunos casos, la entrada del sistema de muestreo por ablación láser que recibe material del sistema es una abertura en la pared de un conducto por el que fluye un segundo gas de "transferencia" (como se describe, por ejemplo, en los documentos WO2014146724 y WO2014147260) desde una entrada de flujo de transferencia separada. En este caso, el gas de transferencia constituye una proporción significativa, y en muchos casos la mayor parte, del flujo de gas hacia el sistema de ionización. La cámara de muestra del sistema de muestreo por ablación láser contiene una entrada de gas. El flujo de gas hacia la cámara a través de esta entrada crea un flujo de gas que sale de la cámara a través de la entrada del conducto de transferencia. Este flujo de gas captura columnas de material ablacionado y las arrastra hacia el conducto de transferencia (normalmente, la entrada del sistema de muestreo por ablación láser). El conducto tiene forma de cono (denominado en este documento "cono de muestra") y sale de la cámara de muestra hacia el conducto que pasa por encima de la cámara. Este conducto también recibe gas desde la entrada de flujo de transferencia independiente (lado izquierdo de la figura, indicado por la flecha de flujo de transferencia). El componente que comprende la entrada de flujo de transferencia, la entrada del sistema de muestreo por ablación láser y que inicia el conducto de transferencia que transporta el material de muestra ablacionado hacia el sistema de ionización también puede denominarse célula de flujo (como se indica en los documentos WO2014146724 y WO2014147260).

[0517] El flujo de transferencia cumple al menos tres funciones: limpia la columna que entra en el conducto de transferencia en dirección al sistema de ionización e impide que el material entre en contacto con las paredes laterales del conducto de transferencia; forma una "zona de protección" sobre la superficie de la muestra y garantiza que la ablación se realice en atmósfera controlada; y aumenta la velocidad del flujo en el conducto de transferencia. Normalmente, la viscosidad del gas de captura es menor. que la viscosidad del gas de transferencia primario. Esto ayuda a confinar la columna de muestra en el gas de captura en el centro del conducto de transferencia y a minimizar su difusión aguas abajo del sistema de muestreo por ablación láser (ya que en el centro del flujo, la velocidad de transporte es más constante y prácticamente plana). El/los gas(es) puede(n) ser, por ejemplo, argón, xenón, helio, nitrógeno o mezclas de estos. Un gas de transferencia común es el argón. El argón es especialmente adecuado para detener la difusión de la columna antes de que alcance las paredes del conducto de transferencia (y también contribuye a mejorar la sensibilidad instrumental en aparatos cuyo sistema de ionización es un ICP basado en gas argón). El gas de captura es preferiblemente helio. Sin embargo, este gas puede ser reemplazado por otros gases, como hidrógeno, nitrógeno o vapor de agua, o contenerlos. A 25 ºC, el argón tiene una viscosidad de 22,6 µPas, mientras que el helio tiene una viscosidad de 19,8 µPas. En ocasiones, el gas de captura es helio y el gas de transferencia es argón.

[0519] Como se describe en el documento WO2014169394, el uso de un cono de muestra minimiza la distancia entre el objetivo y la entrada del conducto de transferencia del sistema de ablación láser. Debido a la menor distancia entre la muestra y el punto del cono por donde puede fluir el gas de captura, se mejora la captura del material de muestra con menos turbulencia y, por lo tanto, se reduce la dispersión de las columnas de material de muestra ablacionado. La entrada del conducto de transferencia es, por lo tanto, la abertura en la punta del cono de muestra. El cono se proyecta hacia la cámara de muestra.

[0520] Una modificación opcional del cono de muestra es hacerlo asimétrico. Cuando el cono es simétrico, justo en el centro se neutraliza el flujo de gas desde todas las direcciones, por lo que el flujo total de gas es cero a lo largo de la superficie de la muestra en el eje del cono de muestra. Al hacer el cono asimétrico, se crea una velocidad distinta de cero a lo largo de la superficie de la muestra, lo que facilita la Lavado de materiales de la pluma de la cámara de muestra del sistema de ablación láser.

[0521] En la práctica, se puede emplear cualquier modificación del cono de muestra que provoque un flujo de gas vectorial distinto de cero a lo largo de la superficie de la muestra en el eje del cono. Por ejemplo, el cono asimétrico puede comprender una o varias muescas, adaptadas para generar un flujo de gas vectorial distinto de cero a lo largo de la superficie de la muestra en el eje del cono. El cono asimétrico puede comprender un orificio en el lateral del cono, adaptado para generar un flujo de gas vectorial distinto de cero a lo largo de la superficie de la muestra en el eje del cono. Este orificio desequilibrará los flujos de gas alrededor del cono, generando así un flujo de gas vectorial distinto de cero a lo largo de la superficie de la muestra en el eje del cono en el objetivo. El lateral del cono puede comprender más de un orificio e incluir una o más muescas y uno o más orificios. Los bordes de las muescas y/o los orificios suelen estar alisados, redondeados o biselados para prevenir o minimizar la turbulencia.

[0522] Diferentes orientaciones de la asimetría del cono serán apropiadas para diferentes situaciones, dependiendo de la elección del gas de captura y transferencia y sus caudales. El experto en la técnica podrá identificar adecuadamente las combinaciones de gas y caudal para cada orientación.

[0523] Todas las adaptaciones anteriores pueden estar presentes en un único cono de muestra asimétrico, como se utiliza en la presente divulgación. Por ejemplo, el cono puede estar truncado asimétricamente y formado por dos mitades elípticas diferentes, puede estar truncado asimétricamente y comprender uno o más orificios, etc.

[0524] Por lo tanto, el cono de muestra está adaptado para capturar una columna de material extraído de una muestra en el sistema de ablación láser. Durante su uso, el cono de muestra se coloca operativamente cerca de la muestra, por ejemplo, moviéndola dentro del sistema de muestreo por ablación láser sobre una bandeja portamuestras móvil, como se describió anteriormente. Como se mencionó anteriormente, las columnas de material de muestra extirpado entran al conducto de transferencia a través de una abertura en el extremo estrecho del cono de muestra. El diámetro de la abertura puede ser a) ajustable; b) dimensionado para evitar perturbaciones en la columna extirpada al pasar por el conducto de transferencia; y/o c) aproximadamente igual al diámetro de la sección transversal de la columna extirpada.

[0525] Conductos cónicos

[0526] En tubos con un diámetro interno menor, el mismo caudal de gas se mueve a mayor velocidad. Por consiguiente, al usar un tubo con un diámetro interno menor, una columna de material de muestra extirpado transportada en el flujo de gas puede transportarse a través de una distancia definida con mayor rapidez a un caudal dado (por ejemplo, desde el sistema de muestreo por ablación láser hasta el sistema de ionización en el conducto de transferencia). Uno de los factores clave para la rapidez con la que se puede analizar una columna individual es su grado de difusión durante el tiempo transcurrido desde su generación por ablación hasta el momento en que se detectan los iones que la componen en el espectrómetro de masas del aparato (el tiempo de transitoriedad en el detector). En consecuencia, al utilizar un conducto de transferencia estrecho, se reduce el tiempo entre la ablación y la detección, lo que implica una disminución de la difusión al reducirse el tiempo de ocurrencia. Esto resulta en una reducción del tiempo de transitoriedad de cada pluma de ablación en el detector. Estos tiempos de transitoriedad más bajos permiten generar y analizar más plumas por unidad de tiempo, lo que produce imágenes de mayor calidad y/o mayor velocidad.

[0527] El cono puede comprender un cambio gradual en el diámetro interno del conducto de transferencia a lo largo de dicha porción de la longitud del conducto de transferencia (es decir, el diámetro interno del tubo donde se toma una sección transversal a través de él disminuye a lo largo de la porción desde el extremo de la porción hacia la entrada (en el extremo del sistema de muestreo por ablación láser) hasta la salida (en el extremo del sistema de ionización). Por lo general, la región del conducto cerca de donde se produce la ablación tiene un diámetro interno relativamente amplio. El mayor volumen del conducto antes del cono facilita el confinamiento de los materiales generados por la ablación. Cuando las partículas ablacionadas salen despedidas del punto ablacionado, viajan a altas velocidades. La fricción en el gas ralentiza estas partículas, pero la columna aún puede extenderse en una escala submilimétrica a milimétrica. Permitir distancias suficientes a las paredes ayuda con la contención de la columna cerca del centro del flujo.

[0528] Debido a que la sección de diámetro interno ancho es solo corta (del orden de 1-2 mm), no contribuye significativamente al tiempo de transitoriedad se reduce si la columna pasa más tiempo en la sección más larga del conducto de transferencia, que tiene un diámetro interno más estrecho. Por lo tanto, se utiliza una sección de mayor diámetro interno para capturar el producto de la ablación y un conducto de menor diámetro interno para transportar estas partículas rápidamente al sistema de ionización.

[0529] El diámetro de la sección de diámetro interno estrecho está limitado por el diámetro correspondiente al inicio de la turbulencia. Se puede calcular un número de Reynolds para un tubo redondo y un flujo conocido. En general, un número de Reynolds superior a 4000 indica un flujo turbulento y, por lo tanto, debe evitarse. Un número de Reynolds superior a 2000 indica un flujo de transición (entre flujo no turbulento y turbulento), por lo que también puede ser deseable evitarlo.

[0530] Para un caudal másico de gas dado, el número de Reynolds es inversamente proporcional al diámetro del conducto. El diámetro interno de la sección de diámetro interno estrecho del conducto de transferencia suele ser inferior a 2 mm, por ejemplo, inferior a 1,5 mm, inferior a 1,25 mm, menor que 1 mm, pero mayor que el diámetro en el que un flujo de helio a 4 litros por minuto en el conducto tiene un número de Reynolds superior a 4000.

[0531] Los bordes rugosos o incluso angulares en las transiciones entre las porciones de diámetro constante del conducto de transferencia y el cono pueden causar turbulencia en el flujo de gas, y generalmente se evitan.

[0532] Flujo de sacrificio

[0533] Con flujos más altos, el riesgo de turbulencia en el conducto aumenta. Esto ocurre particularmente cuando el conducto de transferencia tiene un diámetro interno pequeño (p. ej., 1 mm). Sin embargo, es posible lograr una transferencia a alta velocidad (hasta 300 m/s o más) en conductos de transferencia con un diámetro interno pequeño si se utiliza un gas ligero, como helio o hidrógeno, en lugar de argón, que se utiliza tradicionalmente como flujo de transferencia de gas.

[0534] La transferencia a alta velocidad presenta problemas, ya que puede hacer que las columnas de material de muestra ablacionado pasen a través del sistema de ionización sin que se produzca un nivel aceptable de ionización. El nivel de ionización puede disminuir debido a que el aumento del flujo de gas frío reduce la temperatura del plasma al final de la antorcha. Si una columna de muestra no se ioniza a un nivel adecuado, se pierde información de la muestra extraída, ya que sus componentes (incluidos los átomos marcadores o las etiquetas elementales) no pueden ser detectados por el espectrómetro de masas. Por ejemplo, la muestra puede pasar tan rápido a través del plasma al final de la antorcha en un sistema de ionización ICP que los iones del plasma no tienen tiempo suficiente para actuar sobre la muestra y ionizarla. Este problema, causado por la transferencia de alto flujo y alta velocidad en conductos de transferencia de diámetro interno estrecho, se puede solucionar mediante la introducción de un sistema de sacrificio de flujo en la salida del conducto de transferencia. Este sistema de sacrificio de flujo está adaptado para recibir el flujo de gas del conducto de transferencia y pasar solo una parte de ese flujo (la parte central, que comprende las columnas de muestra extraída) hacia el inyector que conduce al sistema de ionización. Para facilitar la dispersión de gas desde el conducto de transferencia en el sistema de sacrificio de flujo, la salida del conducto de transferencia puede ensancharse.

[0535] El sistema de sacrificio de flujo se ubica cerca del sistema de ionización, de modo que la longitud del tubo (p. ej., el inyector) que va del sistema de sacrificio de flujo al sistema de ionización es corta (p. ej., aproximadamente ~1 cm de largo; en comparación con la longitud del conducto de transferencia, que suele ser del orden de decenas de cm, como aproximadamente ~50 cm). Por lo tanto, la menor velocidad del gas dentro del tubo que va del sistema de sacrificio de flujo al sistema de ionización no afecta significativamente el tiempo total de transferencia, ya que la parte relativamente más lenta del sistema de transporte general es mucho más corta.

[0536] En la mayoría de los sistemas, no es deseable, o en algunos casos posible, aumentar significativamente el diámetro del tubo (p. ej., el inyector) que pasa del sistema de sacrificio de flujo al sistema de ionización para reducir la velocidad del gas a un caudal volumétrico. Por ejemplo, cuando el sistema de ionización es un ICP, el conducto del sistema de sacrificio de flujo forma el tubo inyector en el centro de la antorcha ICP. Cuando se utiliza un inyector de mayor diámetro interno, se reduce la calidad de la señal, ya que las columnas de material de muestra extirpado no pueden inyectarse con tanta precisión en el centro del plasma (que es la parte más caliente y, por lo tanto, la más eficiente en la ionización). Se prefieren inyectores de 1 mm de diámetro interno o incluso más estrechos (por ejemplo, un diámetro interno de 800 µm o menos, como 600 µm o menos, 500 µm o menos o 400 µm o menos). Otras técnicas de ionización dependen de que el material se ionice dentro de un volumen relativamente pequeño en el espacio tridimensional (ya que la densidad energética necesaria para la ionización solo se puede alcanzar en un volumen pequeño). Por lo tanto, un conducto con un diámetro interno más amplio significa que gran parte del material de muestra que pasa por él queda fuera de la zona donde la densidad energética es suficiente para ionizarlo. Por lo tanto, los tubos de diámetro estrecho del sistema de sacrificio de flujo en el sistema de ionización también se emplea en aparatos con sistemas de ionización sin LCP. Como se mencionó anteriormente, si una columna de material de muestra no se ioniza a un nivel adecuado, se pierde información del material de muestra extirpado, ya que sus componentes (incluidos los átomos marcadores o las etiquetas elementales) no pueden ser detectados por el espectrómetro de masas.

[0537] Se puede utilizar el bombeo para asegurar la relación de división deseada entre el flujo de sacrificio y el flujo que pasa a la entrada del sistema de ionización. Por consiguiente, a veces, el sistema de sacrificio de flujo comprende una bomba conectada a la salida del flujo de sacrificio. Se puede añadir un limitador controlado a la bomba para controlar el flujo de sacrificio. En ocasiones, el sistema de sacrificio de flujo también comprende un controlador de flujo másico, adaptado para controlar el limitador.

[0538] Cuando se utilizan gases costosos, el gas bombeado fuera de la salida del flujo de sacrificio puede limpiarse y reciclarse de nuevo en el mismo sistema mediante métodos conocidos de purificación de gases. El helio es particularmente adecuado como gas de transporte, como se mencionó anteriormente, pero es costoso; por lo tanto, Es ventajoso reducir la pérdida de helio en el sistema (es decir, cuando pasa al sistema de ionización y se ioniza). Por consiguiente, a veces se conecta un sistema de purificación de gas a la salida de flujo de sacrificio del sistema de sacrificio de flujo.

[0539] Sistema de ionización

[0540] Para generar iones elementales, es necesario utilizar una técnica de ionización fuerte capaz de vaporizar, atomizar e ionizar la muestra atomizada.

[0541] Antorcha de plasma acoplada inductivamente

[0542] Comúnmente, se utiliza un plasma acoplado inductivamente para ionizar el material a analizar antes de pasarlo al detector de masas para su análisis. Se trata de una fuente de plasma cuya energía se suministra mediante corrientes eléctricas producidas por inducción electromagnética. El plasma acoplado inductivamente se mantiene en una antorcha que consta de tres tubos concéntricos, siendo el tubo más interno el inyector.

[0543] La bobina de inducción, que proporciona la energía electromagnética que mantiene el plasma, se encuentra alrededor del extremo de salida de la antorcha. El campo electromagnético alterno invierte la polaridad millones de veces por segundo. Se suministra gas argón entre los dos tubos concéntricos más externos. Los electrones libres se introducen mediante una descarga eléctrica y se aceleran en el campo electromagnético alterno, donde colisionan con los átomos de argón y los ionizan. En estado estacionario, el plasma se compone principalmente de átomos de argón con una pequeña fracción de electrones libres e iones de argón.

[0544] El ICP puede retenerse en la antorcha porque el flujo de gas entre los dos tubos más externos mantiene el plasma alejado de las paredes de la antorcha. Un segundo flujo de argón introducido entre el inyector (el tubo central) y el tubo intermedio mantiene el plasma alejado del inyector. Un tercer flujo de gas se introduce en el inyector, ubicado en el centro de la antorcha. Las muestras a analizar se introducen a través del inyector en el plasma.

[0545] El ICP puede constar de un inyector con un diámetro interno inferior a 2 mm y superior a 250 µm para introducir material de la muestra en el plasma. El diámetro del inyector se refiere al diámetro interno del inyector en el extremo proximal al plasma. Extendiéndose alejándose del plasma, el inyector puede tener un diámetro diferente, por ejemplo, un diámetro mayor, donde la diferencia de diámetro se logra mediante un aumento escalonado del diámetro o porque el inyector es cónico a lo largo de su longitud. Por ejemplo, el diámetro interno del inyector puede estar entre 1,75 mm y 250 µm, como entre 1,5 mm y 300 µm de diámetro, entre 1,25 mm y 300 µm de diámetro, entre 1 mm y 300 µm de diámetro, entre 900 µm y 300 µm de diámetro, entre 900 µm y 400 µm de diámetro, por ejemplo alrededor de 850 µm de diámetro. El uso de un inyector con un diámetro interno inferior a 2 mm ofrece ventajas significativas sobre los inyectores con un diámetro mayor. Una ventaja de esta característica es que la transitoriedad de la señal detectada en el detector de masas cuando se introduce una columna de material de muestra en el plasma se reduce con un inyector más estrecho (la columna de material de muestra es la nube de material particular y vaporoso extraído de la muestra por el sistema de muestreo por ablación láser). En consecuencia, se reduce el tiempo necesario para analizar una columna de material de muestra desde su introducción en el ICP para su ionización hasta la detección de los iones resultantes en el detector de masas. Esta disminución en el tiempo de análisis de una columna de material de muestra permite detectar más columnas de material de muestra en un período de tiempo determinado. Además, un inyector con un diámetro interno menor resulta en una introducción más precisa del material de muestra en el centro del plasma acoplado por inducción, donde se produce una ionización más eficiente (a diferencia de un inyector de mayor diámetro que podría introducir el material de muestra más hacia la periferia del plasma, donde la ionización no es tan eficiente).

[0546] Se encuentran disponibles antorchas ICP (Agilent, Varian, Nu Instruments, Spectra, Leeman Labs, PerkinElmer, Thermo Fisher, etc.) e inyectores (por ejemplo, de Elemental Scientific y Meinhard).

[0547] Otras técnicas de ionización

[0548] Ionización electrónica

[0549] La ionización electrónica implica el bombardeo de una muestra en fase gaseosa con un haz de electrones. Una cámara de ionización de electrones incluye una fuente de electrones y una trampa de electrones. Una fuente típica del haz de electrones es un alambre de renio o tungsteno, generalmente operado a 70 electronvoltios de energía. Markes International ofrece fuentes de haz de electrones para ionización de electrones. El haz de electrones se dirige hacia la trampa de electrones y un campo magnético aplicado en paralelo a la dirección de viaje de los electrones hace que estos viajen en una trayectoria helicoidal. La muestra en fase gaseosa se dirige a través de la cámara de ionización de electrones e interactúa con el haz de electrones para formar iones. La ionización de electrones se considera un método difícil de ionización, ya que el proceso generalmente causa la fragmentación de las moléculas de la muestra. Ejemplos de sistemas de ionización de electrones disponibles comercialmente incluyen la Cámara de Ionización de Electrones Avanzada de Markus.

[0550] Componentes adicionales opcionales del sistema de muestreo e ionización basado en ablación láserDeflector de iones

[0551] Los espectrómetros de masas detectan iones cuando impactan una superficie de su detector. La colisión de un ion con el detector causa la liberación de electrones de la superficie del detector. Estos electrones se multiplican al pasar por el detector (el primer electrón liberado elimina más electrones en el detector, estos electrones luego golpean las placas secundarias que amplifican aún más el número de electrones). El número de electrones que golpean el ánodo del detector genera una corriente. El número de electrones que golpean el ánodo se puede controlar alterando el voltaje aplicado a las placas secundarias. La corriente es una señal analógica que luego se puede convertir en un recuento de los iones que golpean el detector mediante un convertidor analógico-digital. Cuando el detector está operando en su rango lineal, la corriente se puede correlacionar directamente con el número de iones. La cantidad de iones que se pueden detectar a la vez tiene un límite (que se puede expresar como el número de iones detectables por segundo). Por encima de este punto, el número de electrones liberados por los iones que inciden en el detector deja de estar correlacionado con el número de iones. Esto, por lo tanto, impone un límite superior a las capacidades cuantitativas del detector.

[0553] Cuando los iones inciden en el detector, su superficie se daña por contaminación. Con el tiempo, este daño irreversible por contaminación provoca que la superficie del detector libere menos electrones cuando un ion incide en él, lo que finalmente obliga a reemplazarlo. Esto se denomina "envejecimiento del detector" y es un fenómeno bien conocido en la EM.

[0555] Por lo tanto, la vida útil del detector puede prolongarse evitando la introducción de cantidades excesivas de iones en el EM. Como se mencionó anteriormente, cuando el número total de iones que inciden en el detector EM supera el límite superior de detección, la señal no es tan informativa como cuando el número de iones es inferior a dicho límite, ya que deja de ser cuantitativa. Por lo tanto, es deseable evitar superar el límite superior de detección, ya que esto acelera el envejecimiento del detector sin generar datos útiles.

[0557] El análisis de grandes paquetes de iones mediante espectrometría de masas presenta una serie de desafíos particulares que no se encuentran en la espectrometría de masas normal. En particular, las técnicas típicas de EM implican la introducción de un nivel bajo y constante de material en el detector, que no debe acercarse al límite superior de detección ni causar un envejecimiento acelerado del detector. Por otro lado, las técnicas basadas en ablación y desorción láser analizan una cantidad relativamente grande de material en una ventana de tiempo muy corta en el EM: p. ej., los iones de un parche del tamaño de una célula de una muestra de tejido que es mucho más grande que los pequeños paquetes de iones que se analizan típicamente en EM. En efecto, es una casi sobrecarga deliberada del detector con paquetes analizados de iones resultantes de la ablación o el levantamiento. Entre los eventos de análisis, la señal está en la línea base (una señal que es cercana a cero porque no entran deliberadamente iones de átomos marcadores en el EM desde el sistema de muestreo e ionización; inevitablemente se detectarán algunos iones porque el EM no es un vacío completo).

[0558] Por lo tanto, en el aparato descrito en este documento, existe un riesgo elevado de envejecimiento acelerado del detector, porque los iones de los paquetes de material de muestra ionizado marcados con una gran cantidad de átomos detectables pueden superar el límite superior de detección y dañar el detector sin proporcionar datos útiles.

[0560] Para abordar estos problemas, el aparato puede comprender un deflector de iones colocado entre el sistema de muestreo e ionización y el sistema detector (un espectrómetro de masas), operable para controlar la entrada de iones en el espectrómetro de masas. En una disposición, cuando el deflector de iones está activado, los iones recibidos del sistema de muestreo e ionización se desvían (es decir, la trayectoria de los iones cambia y, por lo tanto, no alcanzan el detector), pero cuando el deflector está desactivado, los iones no se desvían y alcanzan el detector. La forma en que se despliega el deflector de iones dependerá de la disposición del sistema de muestreo e ionización y de la EM del aparato. Por ejemplo, si el portal por el que los iones entran al EM no coincide con la trayectoria de los iones que salen del sistema de muestreo e ionización, el deflector de iones, debidamente configurado, se activará por defecto para dirigir los iones desde el sistema de muestreo e ionización hacia el EM. Cuando se detecta un evento resultante de la ionización (un paquete de muestra ionizada que pueda sobrecargar el EM) (véase más adelante), el deflector de iones se desactiva para que el resto del material ionizado no se desvíe hacia el EM y pueda impactar contra una superficie interna del sistema, preservando así la vida útil del detector. El deflector de iones vuelve a su estado original una vez que se ha impedido la entrada de los iones del evento dañino al EM, lo que permite que los iones de los paquetes de muestra ionizada subsiguientes entren en el EM y sean detectados.

[0562] Como alternativa, en configuraciones donde (en condiciones normales de operación) no hay cambio en la dirección de los iones que emergen del sistema de muestreo e ionización antes de que entren al EM, el deflector de iones estará desactivado y los iones del sistema de muestreo e ionización pasarán a través de él para ser analizados en el EM. Para evitar daños cuando se detecta una posible sobrecarga del detector, en esta configuración el deflector de iones se activa, desviando así los iones para que no entren en el detector y así evitar daños en este.

[0564] Los iones que entran al EM desde la ionización del material de muestra (como una columna de material generada por ablación o desorción láser) no entran al EM todos al mismo tiempo, sino que entran como un pico con una frecuencia que sigue una curva de distribución de probabilidad alrededor de una frecuencia máxima: desde la línea base, al principio entra un pequeño número de iones al EM y se detectan, y luego la frecuencia de iones aumenta hasta un máximo antes de que el número disminuya de nuevo y se desvanezca hasta la línea base. Un evento que probablemente dañe el detector se puede identificar porque, en lugar de un aumento lento en la frecuencia de iones en el borde delantero del pico, hay un aumento muy rápido en el conteo de iones que impactan en el detector.

[0565] El flujo de iones que impacta en el detector de un TOF MS, un tipo particular de detector como se describe más adelante, no es continuo durante el análisis de los iones en un paquete de material de muestra ionizado.

[0566] El TOF consta de un pulsador que libera los iones periódicamente en la cámara de vuelo del TOF MS en grupos pulsados. Al liberar todos los iones al mismo tiempo conocido, se permite la determinación de la masa del tiempo de vuelo. El tiempo entre las liberaciones de pulsos de iones para la determinación de la masa del tiempo de vuelo se conoce como extracción o empuje del TOF MS. El empuje es del orden de microsegundos. Por lo tanto, la señal de uno o más paquetes de iones del sistema de muestreo e ionización cubre un número de empujes.

[0567] Por consiguiente, cuando la lectura del conteo de iones salta de la línea base a un conteo muy alto dentro de un empuje (es decir, la primera porción de los iones de un paquete particular de material de muestra ionizado), entonces se puede predecir que el cuerpo principal de iones resultantes de la ionización del paquete de material de muestra será incluso mayor, y así excederá el límite superior de detección. Es en este punto que un deflector de iones puede ser operado para asegurar que la mayor parte dañina de los iones se dirige lejos del detector (al ser activado o desactivado, dependiendo de la disposición del sistema, como se discutió anteriormente).

[0568] Los deflectores de iones adecuados basados en cuadrupolos están disponibles en la técnica (por ejemplo, de Colutron Research Corporation y Dreebit GmbH).

[0569] b. Sistema de muestreo e ionización basado en desorción

[0570] Un analizador basado en desorción típicamente consta de tres componentes. El primero es un sistema de desorción para la generación de slugs de material de muestra de la muestra para análisis. Antes de que los átomos en la porción del material de muestra desorbido (incluyendo cualquier átomo de marcado detectable como se discute más adelante) puedan ser detectados, la muestra debe ser ionizada (y atomizada). Por consiguiente, el aparato comprende un segundo componente que es un sistema de ionización que ioniza los átomos para formar iones elementales para permitir su detección por el componente detector EM (tercer componente) basado en la relación masa/porción. El sistema de muestreo basado en desorción y el sistema de ionización están conectados por un conducto de transferencia. En muchos casos, el sistema de muestreo basado en desorción también es un sistema de muestreo basado en ablación láser.Sistema de muestreo por desorción

[0571] En algunos casos, en lugar de utilizar la ablación láser para generar una columna de material de muestra particulado y/o vaporizado, una masa de material de muestra se desorbe del portamuestras en el que se encuentra sin desintegración sustancial de la muestra y su conversión en pequeñas partículas y/o vaporización (ver p. ej. Figura 8 de WO2016109825, y la descripción adjunta). Aquí, el término slug se utiliza para referirse a este material desorbido (una forma particular de un paquete de material de muestra discutido aquí). La porción puede tener dimensiones de 10 nm a 10 µm, de 100 nm a 10 µm, y en ciertos casos de 1 µm a 100 µm. Este proceso puede denominarse catapultado de muestra. Comúnmente, la porción representa una sola célula (en cuyo caso el proceso puede denominarse catapultado celular).

[0572] La porción de material de muestra liberado de la muestra puede ser una porción de la muestra que se ha cortado en porciones individuales para la desorción antes del paso de desorción, opcionalmente en un proceso previo a la inserción de la muestra en el aparato. Una muestra dividida en porciones discretas antes del análisis se denomina muestra estructurada. Por lo tanto, cada uno de estos slugs individuales representa una porción discreta de la muestra que puede desorberse, ionizarse y analizarse en el aparato. Mediante el análisis de los slugs de los sitios discretos, se puede construir una imagen donde cada porción representa un píxel de la imagen, de la misma manera que cada ubicación de una muestra extirpada mediante el sistema de muestreo por ablación láser descrito anteriormente.

[0573] Una muestra estructurada puede prepararse mediante diversos métodos. Por ejemplo, se puede utilizar un portamuestras con características topográficas configurado para cortar una muestra biológica. En este caso, se aplica una muestra biológica sobre la superficie del portamuestras, lo que provoca que las características topográficas corten y seccionen la muestra, lo que a su vez provoca que las secciones de material biológico queden retenidas por los sitios discretos entre las características para obtener una muestra biológica estructurada. Alternativamente, el portamuestras puede no incluir dichas características topográficas (en efecto, una superficie plana como un portaobjetos de microscopio, opcionalmente funcionalizada como se describe más adelante), en cuyo caso la muestra puede aplicarse al portamuestras y seccionarse para definir slugs de muestra que puedan desorberse para su ionización y análisis. El seccionamiento de la muestra puede realizarse con herramientas mecánicas como cuchillas o sellos, si se trata de una sección de tejido. Alternativamente, el material alrededor de las secciones de la muestra a desorber puede eliminarse mediante ablación láser en la misma configuración de preparación de muestras o en una configuración independiente. En ciertas técnicas, el material puede eliminarse mediante una configuración que emplea un haz de electrones o iones enfocado. Este haz puede producir cortes particularmente estrechos (posiblemente en la escala de 10 nm) entre subsecciones, lo que resulta en un tamaño de píxel del orden de 1 µm o, en ciertos casos, de 100 nm.

[0574] Las porciones de material de muestra pueden liberarse del portador y cada porción discreta de material de muestra puede introducirse secuencialmente en el detector para su análisis como un evento discreto (generando un píxel de una imagen mediante las técnicas que se describen a continuación). Las ventajas de la introducción secuencial de material discreto, en comparación con la introducción aleatoria de muestras biológicas, como en la citometría de masas o la espectrometría de masas convencionales, incluyen una mayor velocidad de procesamiento de muestras. Esto se debe a que la porción se transporta desde la cámara de muestra hasta el sistema de ionización como preferiblemente una sola pieza de materia, y por lo tanto no puede extenderse como lo haría una columna de material ablacionado en un flujo de gas (en particular, un flujo de gas en el que hay algo de turbulencia).

[0575] Desorción para muestreo

[0576] El material de muestra se puede desorber de la muestra mediante energía térmica, energía mecánica, energía cinética y una combinación de cualquiera de las anteriores. Este tipo de muestreo es útil en particular al analizar muestras biológicas. En ciertos casos, el material de muestra se puede liberar de la muestra mediante mecanismos térmicos. Por ejemplo, la superficie del portamuestras se calienta lo suficiente como para desorber una porción de material de muestra. El portamuestras se puede recubrir para facilitar el proceso de desorción en masa, por ejemplo, con polímero de naftalato de polietileno (PEN) o película de polímero de PMMA. El calor puede ser proporcionado por una fuente radiactiva como un láser (como el láser de un sistema de muestreo por ablación láser discutido anteriormente). La energía aplicada a la superficie debe ser suficiente para desorber el material biológico, preferiblemente sin alterar la muestra si esta proviene de una muestra biológica. Se puede utilizar cualquier longitud de onda de radiación adecuada, lo cual depende en parte de las propiedades de absorción del soporte de muestra. Una superficie o capa del soporte de muestra puede estar recubierta con un absorbente que absorba la radiación láser para convertirla en calor. La radiación puede aplicarse a una superficie del soporte distinta a la que contiene la muestra, o a la superficie que la contiene, por ejemplo, a través del espesor del soporte. La superficie calentada puede ser una capa superficial o una capa interna de una estructura multicapa del soporte de muestra. Un ejemplo del uso de la energía de radiación láser es una técnica llamada elevación (transferencia hacia adelante inducida por láser; véase, por ejemplo, Doraiswamy et al., 2006, Applied Surface Science, 52: 4743-4747; Fernández-Pradas, 2004, Thin Solid Films 453-454: 27-30; Kyrkis et al., en Recent Advances in Laser Processing of Materials, Eds. Perriere et al., 2006, Elsivier), en la que el portamuestras puede comprender una capa de película de desorción. La película de desorción puede absorber la radiación para provocar la liberación de la película de desorción y/o la muestra biológica (por ejemplo, en algunos casos la película de muestra se desorbe del portamuestras junto con la muestra biológica, en otros casos, la película permanece unida al portamuestras y la muestra biológica se desorbe de la película de desorción).

[0577] La desorción por calentamiento puede tener lugar en una escala de tiempo de nanosegundos, picosegundos o femtosegundos, dependiendo del láser utilizado para la desorción.

[0578] La muestra puede desorberse mediante la acción de una capa de un conductor eléctrico que se calienta al aplicar una corriente. De esta manera, los sitios desde los que se desorbe el material de la muestra están conectados eléctricamente a electrodos y los sitios son direccionables individualmente.

[0579] Una muestra puede unirse al portamuestras mediante una fracción fotorreactiva escindible. Al irradiar la fracción fotorreactiva escindible con radiación (p. ej., de un láser en el sistema láser del sistema de muestreo por ablación láser), la fracción fotorreactiva puede escindirse para liberar el material de muestra. El portamuestras puede comprender (i) una fracción fotorreactiva escindible que acopla la muestra al portamuestras y (ii) una película de desorción como se mencionó anteriormente. En esta situación, se puede utilizar un primer pulso de radiación láser para provocar la escisión de la fracción fotorreactiva y un segundo pulso de radiación láser para dirigir la película de desorción y separar la muestra del portamuestras mediante elevación (o se puede utilizar un pulso de energía térmica introducido por otros medios para calentar la película de desorción y así separar la muestra del portamuestras). El primer y el segundo pulso pueden tener longitudes de onda diferentes. Por lo tanto, en algunos métodos (por ejemplo, que comprenden tanto ablación como desorción), la separación de la muestra del portamuestras puede implicar múltiples pulsos láser de diferentes longitudes de onda. En algunos casos, la escisión de la fracción fotorreactiva y la elevación pueden lograrse mediante el mismo pulso láser.

[0580] El portamuestras puede incluir un recubrimiento o capa de una especie químicamente reactiva que imparte energía cinética a la muestra para liberarla de la superficie. Por ejemplo, una especie químicamente reactiva puede liberar un gas como, por ejemplo, H<2>, CO<2>, N<2>o hidroclorofluorocarbonos. Ejemplos de estos compuestos incluyen agentes de soplado y espuma, que liberan gas al calentarse. La generación de gas puede utilizarse para impartir energía cinética al material de muestra en desorción, lo que mejora la reproducibilidad y la dirección de liberación del material.

[0581] Un portamuestras puede contener reactivos químicos fotoiniciados que experimentan una reacción exotérmica para generar calor y desorber el material de muestra. El recubrimiento del portador, o incluso los enlaces químicos específicos en dicho portador, descritos en los párrafos anteriores (irradiados por el láser para liberar la muestra del portador), es un ejemplo de material que puede ser objetivo de una longitud de onda de radiación láser.

[0582] Los puntos del portamuestras desde los que se desorberán las muestras pueden montarse o acoplarse a dispositivos MEMS configurados para facilitar la liberación de material biológico desde los puntos discretos del portador.

[0583] Una porción de muestra puede liberarse o desorberse desde un punto discreto mediante nanocalentadores, chorros de burbujas, tecnología piezoeléctrica, ultrasonidos, electrostática o una combinación de los anteriores.

[0585] Cada una, o una combinación, de estas técnicas permite el desprendimiento ordenado de una porción de material de muestra del portamuestras. Sin embargo, a menudo, la ubicación en la muestra que es de interés no representa una entidad discreta, como una célula solitaria, en un sitio discreto que puede desorberse fácilmente de forma aislada. En cambio, la célula de interés puede estar rodeada de otras células o material, cuyo análisis no se requiere ni se desea. Intentar realizar la desorción (p. ej., levantamiento) de la característica/región de interés puede, por lo tanto, desorber tanto la célula de interés como el material circundante juntos. Los átomos, como los átomos marcadores que se utilizan en las etiquetas elementales (véase la discusión a continuación), del área circundante de la muestra (p. ej., de otras células que han sido etiquetadas) que se transportan en una porción desorbida de material además de la característica/región específica (p. ej., célula) de interés podrían, por lo tanto, contaminar la lectura de la ubicación de interés.

[0587] Las técnicas de ablación y desorción (como por levantamiento) se pueden combinar en un solo método. Por ejemplo, para realizar una desorción precisa de una característica/región (p. ej., una célula) de interés en una muestra biológica, como una muestra de sección de tejido o una dispersión de suspensión celular, sobre el soporte de muestra, se puede utilizar la ablación láser para eliminar el área circundante de la célula de interés y eliminar cualquier otro material. Tras eliminar el área circundante mediante la ablación, la característica/región de interés se desorbe del soporte de muestra y, posteriormente, se ioniza y analiza mediante espectrometría de masas, según los procedimientos estándar de citometría de masas o espectrometría de masas. De acuerdo con lo anterior, se pueden utilizar técnicas térmicas, fotolíticas, químicas o físicas para desorber material de una característica/región de interés, opcionalmente tras la ablación para eliminar el área circundante a la ubicación que se desorberá. A menudo, se emplea la elevación para separar el material del soporte de muestra (p. ej., un soporte de muestra recubierto con una película de desorción para facilitar el procedimiento de elevación, como se explicó anteriormente con respecto a la desorción de muestras discretas).

[0589] La característica/región de interés puede identificarse mediante otra técnica antes de realizar la ablación y desorción láser (p. ej., mediante levantamiento). La inclusión de una cámara (como una cámara basada en un sensor de imagen de dispositivo acoplado cargado (CCD), o una cámara CMOS o una cámara basada en un sensor de píxeles activos), o cualquier otro medio de detección de luz como el descrito en las secciones anteriores, es una forma de habilitar estas técnicas, tanto para análisis en línea como fuera de línea. La cámara puede usarse para escanear la muestra e identificar células de particular interés o características/regiones de particular interés (por ejemplo, células de una morfología particular). Una vez identificadas dichas ubicaciones, estas pueden levantarse después de que se hayan dirigido pulsos láser al área alrededor de la característica/región de interés para limpiar otro material mediante ablación antes de que se levante la ubicación (p. ej., la célula). Este proceso puede ser automatizado (donde el sistema identifica, extirpa y levanta las características/regiones de interés) o un proceso semiautomatizado (donde el usuario del sistema, por ejemplo un patólogo clínico, identifica las características/regiones de interés, después de lo cual el sistema realiza la extirpación y el levantamiento de manera automatizada). Esto permite un aumento significativo en la velocidad a la que se pueden realizar los análisis, porque en lugar de tener que extirpar toda la muestra para analizar células particulares, las células de interés pueden extirparse específicamente.

[0591] La cámara puede registrar la imagen de un microscopio (por ejemplo, un microscopio confocal). La identificación puede ser por microscopía óptica, por ejemplo, examinando la morfología celular o el tamaño celular, o si la célula es una célula individual discreta (en contraste con un miembro de un grupo de células). Algunas veces, la muestra puede etiquetarse específicamente para identificar las características (por ejemplo, célula(s)) de interés. A menudo, se utilizan marcadores fluorescentes para teñir específicamente las células de interés (por ejemplo, mediante anticuerpos o ácidos nucleicos marcados), como se explicó anteriormente en relación con los métodos de ablación de características/regiones de interés identificadas visualmente. Esta sección no se repite aquí en su totalidad por razones de brevedad, pero un experto en la técnica comprenderá de inmediato que las características de estos métodos pueden aplicarse a los métodos basados en la desorción, y que esto se incluye en la enseñanza técnica de este documento. Una imagen óptica de alta resolución resulta ventajosa en esta combinación de técnicas ópticas y lifting, ya que la precisión de la imagen óptica determina la precisión con la que se puede dirigir la fuente láser de ablación para ablacionar el área que rodea la célula de interés, la cual posteriormente puede ser ablacionada.

[0593] En ocasiones, no se registran datos de la ablación realizada para limpiar el área alrededor de la ubicación que se va a desorber (por ejemplo, la célula de interés). En ocasiones, se registran datos de la ablación del área circundante. La información útil que se puede obtener del área circundante incluye qué moléculas objetivo, como proteínas y transcripciones de ARN, están presentes en las células circundantes y el medio intercelular. Esto puede ser de particular interés al obtener imágenes de muestras de tejido sólido, donde las interacciones directas entre células son comunes, y qué proteínas, etc. se expresan en las células circundantes pueden ser informativas sobre el estado de la célula de interés.

[0594] Cámara

[0595] La cámara utilizada en el sistema de muestreo basado en desorción puede ser como se describió anteriormente para el sistema de muestreo basado en ablación láser, y la discusión para la cámara del sistema de muestreo basado en ablación láser debe leerse aquí.

[0596] Cámara de muestra

[0597] La cámara de muestra utilizada en el sistema de muestreo basado en desorción puede ser como se describió anteriormente para el sistema de muestreo basado en ablación láser. En los casos en que se realizan muestreos de grandes cantidades de material de muestra, el profesional experto apreciará que puede ser necesario aumentar los volúmenes de flujo de gas para garantizar que la cantidad de material sea arrastrada en el flujo de gas y llevada al conducto de transferencia para su transporte al sistema de ionización.

[0598] Conducto de transferencia

[0599] La cámara de muestra utilizada en el sistema de muestreo basado en desorción puede ser como se describió anteriormente para el sistema de muestreo basado en ablación láser. En los casos en que se realiza el muestreo de grandes porciones de material de muestra, el profesional experto apreciará que el diámetro del lumen del conducto deberá tener el tamaño adecuado para acomodar cualquier porción sin que la porción entre en contacto con el lado del lumen (porque cualquier contacto puede provocar la fragmentación de la porción y la superposición de señales, donde los átomos de la porción resultante del n-ésimo evento de desorción se extienden hacia la ventana de detección para el n+1 o subsiguientes porciones).

[0600] Sistema de ionización del sistema basado en desorción

[0601] En muchos casos, las técnicas de elevación analizadas anteriormente implican la eliminación de porciones relativamente grandes de material de muestra (10 nm a 10 µm, de 100 nm a 10 µm y, en ciertos casos, de 1 µm a 100 µm) que no se han convertido en material particulado y vaporoso. Por consiguiente, se requiere una técnica de ionización que sea capaz de vaporizar y atomizar esta cantidad relativamente grande de material.

[0602] Antorcha de plasma acoplada inductivamente

[0603] Un sistema de ionización adecuado es un plasma acoplado inductivamente, como ya se discutió anteriormente en la sección que comienza en la página 95 en relación con los sistemas de muestreo e ionización basados en ablación láser.

[0604] Componentes adicionales opcionales del sistema de muestreo e ionización basado en desorción

[0605] Deflector de iones

[0606] El deflector de iones utilizado en el sistema de muestreo basado en desorción puede ser como se describió anteriormente para el sistema de muestreo basado en ablación láser. Dado el potencial del muestreo basado en desorción para eliminar grandes cantidades intactas de material de muestra, los deflectores de iones pueden ser particularmente útiles en este tipo de sistema para proteger el detector.

[0607] c. Sistemas de generación de iones secundarios

[0608] Un analizador basado en iones secundarios generalmente consta de dos componentes. El primero es un sistema para la generación de iones de la muestra para análisis. En este aparato, esto se logra dirigiendo un primer haz de iones primarios enfocado sobre la muestra para generar iones secundarios expulsados; en este documento se denomina sistema de generación de iones secundarios. Estos iones expulsados (incluyendo cualquier ion detectable de los átomos marcadores como se explica más adelante) pueden detectarse mediante un sistema detector (el segundo componente), por ejemplo, un espectrómetro de masas (los detectores se explican con más detalle más adelante). Esta técnica se conoce como espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS).

[0609] El sistema de generación de iones secundarios comprende: una fuente de iones primarios para producir iones primarios; una columna de iones primarios para pasar los iones primarios a la muestra en una cámara de muestra; una cámara de muestra; y un microscopio iónico para recolectar los iones secundarios.

[0610] En funcionamiento, los iones primarios producidos por la fuente de iones primarios bombardean la superficie de una muestra en la cámara de muestra, transfiriendo energía a los átomos de la muestra. Este bombardeo genera una serie de colisiones entre átomos dentro de la muestra. Algunos átomos cerca de la superficie de la muestra retroceden con suficiente energía para escapar de la superficie de la muestra (pulverización catódica). Algunas partículas emitidas están en estado ionizado: estos son los iones secundarios, que pueden detectarse posteriormente.

[0611] Fuente de iones primarios

[0612] Los iones primarios pueden ser cualquier ion adecuado para generar pulverización catódica a partir de la muestra que se va a analizar. Ejemplos de fuentes de iones primarios son: el Duoplasmatrón, que genera iones primarios de oxígeno (<16>O-,<16>O<2>+

,<16>O<2>-), argón (<40>Ar<+>), xenón (Xe<+>), SF<5>+

o C<60>+

; una fuente de ionización superficial que genera iones primarios de<133>Cs<+>; y cañones de iones metálicos líquidos (LMIG) que generan iones primarios de Ga<+>. Otros iones primarios incluyen iones de clúster como Au<n>+

(n=1-5), Bi<n>q+

(n=1-7, q=1 y 12), sondas C<60>q+

(q=1-3) y grandes clústeres de Ar (Muramoto, Brison y Castner, 2012).

[0614] La elección de la fuente de iones depende del tipo de SIMS que se utilice (es decir, estático o dinámico) y de la muestra que se va a analizar. El SIMS estático implica el uso de una corriente de haz de iones primarios baja (1 nA/cm<2>), normalmente un haz de iones pulsado. Debido a la baja corriente, cada ion impacta una nueva sección de la superficie de la muestra, eliminando solo una monocapa de partículas (2 nm). Por lo tanto, la SIMS estática es adecuada para la obtención de imágenes y el análisis de superficies (Gamble y Anderton, 2016). La SIMS dinámica implica el uso de una alta corriente de haz de iones primarios (10 mA/cm²), generalmente un haz de iones primarios continuo, lo que resulta en la rápida eliminación de partículas superficiales. Como resultado, es posible utilizar la SIMS dinámica para el perfilado de profundidad. Además, dado que se elimina más material de la superficie de la muestra, la SIMS dinámica ofrece un mejor límite de detección que la SIMS estática. La SIMS dinámica suele producir una alta resolución de imagen (menos de 100 nm) (Vickerman y Briggs, 2013).

[0616] Los iones primarios de oxígeno mejoran la ionización de elementos electropositivos (Malherbe, Penen, Isaure y Frank, 2016) y se utilizan en el Cameca IMS 1280-RH disponible comercialmente, mientras que los iones primarios de cesio se utilizan para investigar elementos electronegativos (Kiss, 2012) y se utilizan en el Cameca NanoSIMS 50, disponible comercialmente.

[0618] Las pistolas de iones de metal líquido pueden producir un haz muy enfocado, por lo que se utilizan comúnmente en SIMS estático. Un ejemplo de un instrumento SIMS que utiliza una pistola de iones de metal líquido es el SurfaceSeer-I de KORE Technology.

[0620] Para un análisis rápido de una muestra, se requiere una alta frecuencia de ablación, por ejemplo, más de 20 Hz (es decir, más de 20 ablaciones por segundo, lo que produce más de 20 columnas por segundo). Comúnmente, la frecuencia de generación de pulsos de iones primarios por la fuente de iones primarios es de al menos 40 Hz, como al menos 50 Hz, o al menos 100 Hz. Por ejemplo, la frecuencia de los pulsos de iones está dentro del rango de 40-2000 Hz, dentro del rango de 40-1500 Hz, dentro del rango de 40-500 Hz, dentro del rango de 40-200 Hz, dentro del rango de 40-150 Hz, o dentro del rango 75-150 Hz. Una frecuencia de más de 40 Hz permite obtener imágenes de muestras típicas en un tiempo razonable. La frecuencia con la que los pulsos de iones pueden dirigirse a un punto de la muestra y aún así resolverse individualmente determina la rapidez con la que se pueden obtener los píxeles de la imagen.

[0622] Columna de iones primarios

[0624] La columna de iones primarios dirige los iones primarios a la muestra. La columna de iones primarios comprende: un filtro de masas para filtrar las impurezas en el haz de iones primarios; lentes y aberturas según corresponda para controlar la intensidad y la forma del haz de iones primarios; y placas de deflexión para dar forma al haz de iones primarios y, opcionalmente, rasterizarlo a través de la superficie de la muestra (Villacob, 2016). Las lentes de iones y otros componentes para construir la columna de iones primarios están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Agilent.

[0625] Normalmente, el haz de iones utilizado para la generación de iones secundarios aquí tiene un tamaño de punto (es decir, el tamaño del haz de iones primarios cuando incide en la muestra) de 100 µm o menos, como 50 µm o menos, 25 µm o menos, 20 µm o menos, 15 µm o menos, o 10 µm o menos. La distancia denominada tamaño del punto corresponde a la dimensión interna más larga del haz de iones; por ejemplo, para un haz circular, es un haz de 2 µm de diámetro; para un haz cuadrado, corresponde a la longitud de la diagonal entre vértices opuestos; para un haz cuadrilátero, es la longitud de la diagonal más larga, etc. Se puede emplear la conformación y el enmascaramiento del haz para obtener la forma y el tamaño del punto.

[0627] Cuando se utiliza para el análisis de muestras biológicas, para analizar células individuales, el tamaño del punto del haz de iones utilizado dependerá del tamaño y la separación de las células. Por ejemplo, cuando las células están muy juntas (como en una sección de tejido), el haz de iones puede tener un tamaño de punto que no sea mayor que estas células si se va a realizar un análisis de células individuales. Este tamaño dependerá de las células específicas de la muestra, pero en general, el punto del haz de iones tendrá un diámetro inferior a 4 µm, por ejemplo, dentro del rango de 0,1-4 µm, 0,25-3 µm o 0,4-2 µm. Por lo tanto, un punto de haz de iones primarios puede tener un diámetro de aproximadamente 3 µm o menos, aproximadamente 2 µm o menos, aproximadamente 1 µm o menos, aproximadamente 0,5 µm o menos, como aproximadamente 400 nm o menos, aproximadamente 300 nm o menos, entre 250 nm y 2 µm, o entre 300 nm y 1 µm. Para analizar células con una resolución subcelular, el sistema utiliza un tamaño de punto de haz de iones primarios que no es mayor que estas células, y más específicamente, utiliza un tamaño de punto de haz de iones primarios que puede ablacionar material con una resolución subcelular. En ocasiones, el análisis de células individuales se puede realizar utilizando un tamaño de punto mayor que el tamaño de la célula, por ejemplo, cuando las células se extienden en el portaobjetos, con espacio entre ellas. Por lo tanto, el tamaño del punto particular utilizado puede seleccionarse adecuadamente en función del tamaño de las células analizadas. En muestras biológicas, es raro que todas las células tengan el mismo tamaño, por lo que, si se desea obtener imágenes con resolución subcelular, el tamaño del punto del haz de iones debe ser menor que el de la célula más pequeña, siempre que se mantenga constante durante todo el procedimiento de generación de iones secundarios.

[0628] Cámara de muestra

[0629] La cámara de muestra del sistema de generación de iones secundarios comparte muchas características con la cámara de muestra de los sistemas de muestreo basados en ablación láser y lifting, mencionados anteriormente. Consta de una platina para sujetar la muestra. La platina puede ser una platina de traslación, móvil en los ejes x-y o x-y-z. La cámara de muestra también incluirá una salida, a través de la cual se puede dirigir el material retirado de la muestra por el haz de iones primarios. La salida está conectada al detector, lo que permite el análisis de los iones secundarios.

[0630] La principal diferencia entre la cámara de muestra del sistema de generación de iones secundarios y las cámaras de muestra de los sistemas de muestreo basados en ablación láser y por elevación es que la cámara se mantiene al vacío para evitar colisiones entre los iones secundarios y otras partículas dentro de la cámara, lo que podría resultar en la pérdida de porción de los iones secundarios, de manera similar a lo contrario de las cámaras de muestra basadas en ablación láser y desorción. La pérdida de iones secundarios resultaría en una reducción de la sensibilidad del aparato.

[0631] Microscopio iónico

[0632] Los haces de iones secundarios se capturan de la muestra a través de una lente electrostática colocada cerca de la muestra, conocida en la técnica como lente de inmersión (o lente de extracción). La lente de inmersión elimina los iones secundarios inmediatamente de la ubicación de la muestra. Esto se logra típicamente mediante una gran diferencia de potencial de voltaje entre la muestra y la lente. Dependiendo de la polaridad de la muestra con respecto a la lente de inmersión, esta captura iones secundarios positivos o negativos. La polaridad de los iones secundarios capturados por la lente de inmersión es independiente de la polaridad de los iones del haz de iones primarios.

[0633] Los iones secundarios se transfieren al detector mediante una o más lentes electrostáticas (conocidas como lentes de transferencia). La(s) lente(s) de transferencia enfocan el haz de iones secundarios en el detector. Típicamente, en sistemas con múltiples lentes de transferencia, solo una se utiliza en un análisis dado. Cada lente puede proporcionar una ampliación diferente de la superficie de la muestra. Comúnmente, existen otros componentes de manipulación de iones entre la lente de inmersión y el detector, por ejemplo, una o más aperturas, filtros de masa o conjuntos de placas deflectoras. Juntos, la lente de inmersión, la lente de transferencia y cualquier otro componente, forman el microscopio iónico. Los componentes para la producción de un microscopio iónico están disponibles de proveedores comerciales, p. ej. Agilent.

[0634] Cámara

[0635] El sistema de generación de iones secundarios también puede comprender una cámara. Los sistemas de cámara se discutieron anteriormente en relación con los sistemas de muestreo por ablación láser, y las características de la cámara anterior también pueden estar presentes en el sistema de generación de iones secundarios, excepto cuando sean incompatibles (p. ej., se puede conectar a un microscopio óptico, como un microscopio confocal, pero no es posible enfocar un haz de iones primarios a través de la misma óptica que la luz que se dirige a la cámara, porque un haz son iones y el otro fotones).

[0636] Post ionización

[0637] La ionización secundaria de partículas de masa eyectadas neutras se puede lograr mediante una variedad de técnicas, por ejemplo, ionización láser (p. ej., mediante un láser de femtosegundo) e ionización mediante un haz de electrones. Los iones generados en la espectrometría de masas neutra secundaria (SNMS) pueden entonces ser capturados por la lente de inmersión y transferidos al detector como se describió anteriormente para los iones secundarios generados directamente a partir del bombardeo de iones primarios.

[0638] 2. Sistema detector de masas

[0639] Ejemplos de sistemas detectores de masas incluyen espectrómetros de masas de cuadrupolo, de tiempo de vuelo (TOF), de sector magnético, de alta resolución, de colector único o múltiple.

[0640] El tiempo necesario para analizar el material ionizado dependerá del tipo de analizador de masas utilizado para la detección de iones. Por ejemplo, los instrumentos que utilizan copas de Faraday suelen ser demasiado lentos para analizar señales rápidas. En general, la velocidad de imagen, la resolución y el grado de multiplexación deseados determinarán el tipo de analizador de masas que se debe utilizar (o, a la inversa, la elección del analizador de masas determinará la velocidad, la resolución y la multiplexación que se pueden lograr).

[0641] Los instrumentos de espectrometría de masas que detectan iones con una sola relación masa-porción (m/Q, comúnmente conocida como m/z en EM) a la vez, por ejemplo, utilizando un detector de iones puntual, arrojarán resultados deficientes en la detección de imágenes. En primer lugar, el tiempo necesario para cambiar entre relaciones masa-porción limita la velocidad a la que se pueden determinar múltiples señales; en segundo lugar, si los iones son poco abundantes, las señales pueden pasarse por alto cuando el instrumento se centra en otras relaciones masa-porción. Por lo tanto, se prefiere utilizar una técnica que ofrezca una detección prácticamente simultánea de iones con diferentes valores de m/Q.

[0642] Tipos de detector

[0643] Detector cuadrupolo

[0644] Los analizadores de masas cuadrupolo constan de cuatro barras paralelas con un detector en un extremo. Se aplica un potencial de RF alterno y un potencial de compensación de CC fijo entre un par de barras y el otro, de modo que un par de barras (cada una de las barras opuestas entre sí) tenga un potencial alternativo opuesto al otro par de barras. La muestra ionizada pasa por el centro de las barras, en una dirección paralela a ellas y hacia el detector. Los potenciales aplicados afectan la trayectoria de los iones, de modo que solo los iones con una determinada relación masa-porción tendrán una trayectoria estable y, por lo tanto, llegarán al detector. Los iones con otras relaciones masa-porción colisionarán con las barras.

[0645] Detector de sector magnético

[0646] En la espectrometría de masas de sector magnético, la muestra ionizada se pasa a través de un tubo de vuelo curvo hacia un detector de iones. Un campo magnético aplicado a través del tubo de vuelo hace que los iones se desvíen de su trayectoria. La cantidad de desviación de cada ion se basa en la relación masa-porción de cada ion, por lo que solo algunos iones colisionarán con el detector; los otros iones se desviarán. En los instrumentos de campo de sector multicolector, se utiliza una matriz de detectores para detectar iones de diferentes masas. En algunos instrumentos, como el ThermoScientific Neptune Plus y el Nu Plasma II, el sector magnético se combina con un sector electrostático para proporcionar un instrumento de sector magnético de doble enfoque que analiza los iones por energía cinética, además de la relación masa-porción. En particular, se pueden utilizar aquellos multidetectores que tienen una geometría Mattauch-Herzog (por ejemplo, el SPECTRO MS, que puede registrar simultáneamente todos los elementos, desde litio hasta uranio, en una sola medición utilizando un detector de porción directa de semiconductores). Estos instrumentos pueden medir múltiples señales m/Q prácticamente de forma simultánea. Su sensibilidad se puede aumentar incluyendo multiplicadores de electrones en los detectores. Sin embargo, los instrumentos de sector de matriz siempre son aplicables, ya que, si bien son útiles para detectar señales crecientes, son menos útiles cuando los niveles de señal disminuyen, por lo que no son adecuados en situaciones donde las marcas están presentes en concentraciones particularmente muy variables.

[0647] Detector de tiempo de vuelo (TOF)

[0648] Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo consta de una entrada de muestra, una cámara de aceleración con un fuerte campo eléctrico aplicado a través de ella y un detector de iones. Una columna de moléculas de muestra ionizada se introduce a través de la entrada de muestra y en la cámara de aceleración. Inicialmente, cada una de las moléculas de muestra ionizada tiene la misma energía cinética, pero a medida que las moléculas de muestra ionizada se aceleran a través de la cámara de aceleración, se separan por sus masas, con las moléculas de muestra ionizada más ligeras viajando más rápido que los iones más pesados. El detector detecta entonces todos los iones a medida que llegan. El tiempo que tarda cada partícula en llegar al detector depende de la relación masa-porción de la partícula.

[0649] Por lo tanto, un detector TOF puede registrar casi simultáneamente múltiples masas en una sola muestra. En teoría, las técnicas TOF no son ideales para las fuentes de iones ICP debido a sus características de porción espacial, pero los instrumentos TOF pueden analizar un aerosol de iones ICP con la rapidez y sensibilidad suficientes para permitir la obtención de imágenes unicelulares. Mientras que los analizadores de masas TOF suelen ser poco populares para el análisis atómico debido a las limitaciones que requiere gestionar los efectos de la porción espacial en el acelerador TOF y el tubo de vuelo, la obtención de imágenes de tejidos mediante la invención puede ser eficaz al detectar únicamente los átomos marcadores, eliminando así otros átomos (por ejemplo, aquellos con una masa atómica inferior a 100). Esto da como resultado un haz de iones menos denso, enriquecido en masas en (por ejemplo) la región de 100-250 daltons, que puede manipularse y enfocarse con mayor eficiencia, facilitando así la detección TOF y aprovechando la alta velocidad de barrido espectral del TOF. Por lo tanto, la obtención de imágenes rápidas se puede lograr combinando la detección TOF con la selección de átomos marcadores poco comunes en la muestra y que idealmente tengan masas superiores a las masas observadas en una muestra no marcada, p. ej., utilizando elementos de transición de masa más alta. El uso de una ventana más estrecha de masas de marcaje significa que la detección TOF se utilizará para obtener imágenes eficientes.

[0650] Los instrumentos TOF adecuados están disponibles en Tofwerk, GBC Scientific Equipment (p. ej., el Optimass 9500 ICP-TOFMS) y Fluidigm Canada (p. ej., los instrumentos CyTOF<TM>y CyTOF<TM>2). Estos instrumentos CyTOF<TM>tienen mayor sensibilidad que los instrumentos Tofwerk y GBC y son conocidos por su uso en citometría de masas porque pueden detectar de forma rápida y sensible iones en el rango de masas de metales de tierras raras (particularmente en el rango m/Q de 100-200; véase Bandura et al. (2009; Anal. Chem., 81:6813-22)). Por lo tanto, estos son los instrumentos preferidos para su uso con la divulgación, y se pueden usar para la obtención de imágenes con las configuraciones de instrumentos ya conocidas en la técnica, p. ej., Bendall et al. (2011; Science 332, 687-696) y Bodenmiller et al. (2012; Nat. Biotechnol. 30:858-867). Sus analizadores de masas pueden detectar una gran cantidad de marcadores casi simultáneamente a una alta frecuencia de adquisición de espectro de masas en la escala de tiempo de la ablación láser de alta frecuencia o la desorción de la muestra. Pueden medir la abundancia de átomos marcadores con un límite de detección de aproximadamente 100 por célula, lo que permite la construcción sensible de una imagen de la muestra de tejido. Debido a estas características, la citometría de masas ahora se puede utilizar para satisfacer las necesidades de sensibilidad y multiplexación para la obtención de imágenes de tejidos con resolución subcelular. Al combinar el instrumento de citometría de masas con un sistema de muestreo por ablación láser de alta resolución y una cámara de muestra de tránsito rápido y baja dispersión, se ha logrado la construcción de una imagen de la muestra de tejido con alta multiplexación en un plazo práctico.

[0652] El TOF puede acoplarse con un corrector de asignación de masa. La gran mayoría de los eventos de ionización generan iones M<+>, donde un solo electrón ha sido eliminado del átomo. Debido al modo de funcionamiento del TOF MS, a veces se produce cierta filtración (o diafonía) de los iones de una masa (M) hacia los canales de masas vecinas (M±1), en particular cuando una gran cantidad de iones de masa M entran en el detector (es decir, recuentos de iones altos, pero no tan altos como para que un deflector de iones colocado entre el sistema de ionización de muestreo y el EM impida su entrada en el EM, si el aparato incluyera dicho deflector). Como el tiempo de llegada de cada ion M<+>al detector sigue una distribución de probabilidad en torno a una media (que se conoce para cada M), cuando el número de iones de masa M<+>es alto, algunos llegarán en momentos que normalmente se asociarían con los iones M-1<+>o M+1<+>. Sin embargo, como cada ion tiene una curva de distribución conocida al entrar en el TOF MS, con base en el pico en el canal de masa M, es posible determinar la superposición de iones de masa M en los canales M±1 (por comparación con la forma del pico conocida). El cálculo es particularmente aplicable para TOF MS, porque el pico de iones detectado en un TOF MS es asimétrico. Por consiguiente, es posible corregir las lecturas de los canales M-1, M y M+1 para asignar adecuadamente todos los iones detectados al canal M. Tales correcciones tienen un uso particular en la corrección de datos de imágenes debido a la naturaleza de los grandes paquetes de iones producidos por sistemas de muestreo e ionización tales como los descritos en este documento que involucran ablación láser (o desorción como se discute más adelante) como las técnicas para remover material de la muestra. Los programas y métodos para mejorar la calidad de los datos mediante la deconvolución de los datos de TOF MS se discuten en WO2011/098834, patente de EE. UU.8723108 y WO2014/091243.

[0654] Corrector de tiempo muerto

[0656] Como se mencionó anteriormente, las señales en el EM se detectan sobre la base de colisiones entre iones y el detector, y la liberación de electrones de la superficie del detector golpeada por los iones. Cuando un conteo alto de iones es detectado por el EM resultando en la liberación de una gran cantidad de electrones, el detector del EM puede fatigarse temporalmente, con el resultado de que la salida de señal analógica del detector se deprime temporalmente para uno o más de los paquetes subsiguientes de iones. En otras palabras, un recuento particularmente alto de iones en un paquete de muestra ionizada provoca la liberación de una gran cantidad de electrones de la superficie del detector y del multiplicador secundario durante la detección de los iones de dicho paquete. Esto significa que hay menos electrones disponibles para ser liberados cuando los iones de los paquetes subsiguientes inciden en el detector, hasta que se reponen los electrones en la superficie del detector y el amplificador secundario.

[0658] A partir de la caracterización del comportamiento del detector, es posible compensar este fenómeno de tiempo muerto. Un primer paso consiste en analizar el pico iónico en la señal analógica resultante de la detección del enésimo paquete de muestra ionizada por el detector. La magnitud del pico puede determinarse por su altura, su área o una combinación de ambas.

[0660] A continuación, se compara la magnitud del pico para determinar si supera un umbral predeterminado. Si la magnitud es inferior a este umbral, no es necesaria ninguna corrección. Si la magnitud es superior al umbral, se realizará la corrección de la señal digital de al menos un paquete posterior de material de muestra ionizada (al menos el (n+1)º paquete de material de muestra ionizada, pero posiblemente paquetes adicionales de material de muestra ionizada, como el (n+2)º, el (n+3)º, el (n+4)º, etc.) para compensar la depresión temporal de la señal analógica de estos paquetes de material de muestra ionizada resultante de la fatiga del detector causada por el enésimo paquete de material de muestra ionizada. Cuanto mayor sea la magnitud del pico del enésimo paquete de material de muestra ionizada, más picos de los paquetes posteriores de material de muestra ionizada deberán corregirse y la magnitud de la corrección deberá ser mayor. Los métodos para corregir tales fenómenos se detallan en Stephan et al. (1994; Vac. Sci. Technol.12:405), Tyler y Peterson (2013; Surf Interface Anal. 45:475-478), Tyler (2014; Surf Interface Anal. 46:581-590), WO2006/090138 y patente de EE. UU.6229142, y estos métodos pueden ser aplicados por el corrector de tiempo muerto a los datos, como se describe en este documento.

[0662] Aparato analizador basado en la detección de espectros de emisión óptica

[0664] 1. Sistemas de muestreo e ionización

[0666] a. Sistema de muestreo e ionización basado en ablación láser

[0667] El sistema de muestreo por ablación láser descrito anteriormente en relación con los analizadores basados en masas puede emplearse en un sistema basado en detector EEO. Para la detección de espectros de emisión atómica, lo más preferible es utilizar un ICP para ionizar el material de muestra eliminado de la muestra, pero puede utilizarse cualquier técnica de ionización dura que pueda producir iones elementales.

[0668] Como comprenderá un experto en la técnica, ciertos componentes adicionales opcionales del sistema de muestreo e ionización basado en ablación láser, descritos anteriormente para evitar la sobrecarga del detector basado en masa, podrían no ser aplicables a todos los sistemas basados en detectores EEO y, si no fuera apropiado, no serían incorporados por el experto en la técnica. Además, el experto en la técnica comprenderá que, si bien el EEO puede detectar elementos, no puede distinguir entre isótopos del elemento. Por consiguiente, cuando se deben analizar de forma específica los SBP/analitos objetivo, la EEO debe realizarse con reactivos marcados con diferentes elementos, en lugar de isótopos del mismo elemento.

[0669] b. Sistema de muestreo e ionización basado en desorción

[0670] El sistema de muestreo basado en desorción descrito anteriormente en relación con los analizadores basados en masas puede emplearse en un sistema basado en detector EEO. Para la detección de espectros de emisión atómica, preferiblemente se utiliza un ICP para ionizar el material de muestra extraído de la muestra, pero se puede utilizar cualquier técnica de ionización fuerte que pueda producir iones elementales.

[0671] Como apreciará un experto en la técnica, ciertos componentes adicionales opcionales del sistema de muestreo e ionización basado en desorción, descritos anteriormente para evitar la sobrecarga del detector basado en masas, pueden no ser aplicables a todos los sistemas basados en detectores EEO y no serían incorporados, si no fuera apropiado, por el experto en la técnica.

[0672] 2. Fotodetectores

[0673] Entre los tipos de fotodetectores ejemplares se incluyen los fotomultiplicadores y los dispositivos de porción acoplada (CCD). Los fotodetectores pueden utilizarse para obtener imágenes de la muestra o identificar una región de interés antes de obtenerlas mediante espectrometría de masas elemental.

[0674] Los fotomultiplicadores constan de una cámara de vacío con un fotocátodo, varios dínodos y un ánodo. Un fotón que incide en el fotocátodo provoca la emisión de un electrón por este efecto fotoeléctrico. El electrón es multiplicado por los dínodos mediante el proceso de emisión secundaria (descrito con más detalle en SIMS) para producir una corriente de electrones multiplicada, que posteriormente es detectada por el ánodo para proporcionar una medida de detección de la radiación electromagnética incidente en el fotocátodo. Los fotomultiplicadores están disponibles, por ejemplo, en Thorlabs. Un CCD consta de un chip de silicio que contiene una matriz de píxeles fotosensibles. Durante la exposición a la luz, cada píxel genera una porción eléctrica proporcional a la intensidad de la luz que incide sobre él. Tras la exposición, un circuito de control provoca una secuencia de transferencias de porción eléctrica para producir una secuencia de voltajes. Estos voltajes pueden analizarse para generar una imagen. Existen CCD adecuados disponibles, por ejemplo, en Cell Biosciences.

[0675] Construcción de una imagen

[0676] El aparato mencionado puede proporcionar señales para múltiples átomos en paquetes de material de muestra ionizado extraído de la muestra (ya sea por ablación, bombardeo iónico o cualquier otra técnica). La detección de un átomo en un paquete de muestra revela su presencia en la posición de ablación, ya sea porque el átomo está presente de forma natural en la muestra o porque ha sido localizado en esa ubicación mediante un reactivo de marcaje. Al generar una serie de paquetes de material de muestra ionizado a partir de ubicaciones espaciales conocidas en la superficie de la muestra, las señales del detector revelan la ubicación de los átomos en la muestra, lo que permite construir una imagen de la muestra. Al marcar múltiples objetivos con etiquetas distinguibles, es posible asociar la ubicación de los átomos marcadores con la ubicación de objetivos afines, de modo que el método puede generar imágenes complejas, alcanzando niveles de multiplexación que superan con creces los que se pueden lograr con las técnicas existentes. Las imágenes generadas por estos métodos pueden reproducir los patrones de tinción y la proporción de células que expresan un marcador determinado, según lo determinado por IFM, lo que confirma la idoneidad del método para la obtención de imágenes. El ensamblaje de señales en una imagen requiere una computadora y puede lograrse mediante técnicas y paquetes de software conocidos. Por ejemplo, se puede utilizar el paquete GRAPHIS de Kylebank Software, u otros paquetes como TERAPLOT. La obtención de imágenes utilizando datos de EM de técnicas como MALDI-MSI es conocida en la técnica; por ejemplo, Robichaud et al. (2013; J Am Soc Mass Spectrom 24 5:718-21) divulga la interfaz «MSiReader» para visualizar y analizar archivos de imágenes de EM en una plataforma Matlab, y Klinkert et al. (2014; Int J Mass Spectrom http://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012) describe dos instrumentos de software para la exploración y visualización rápida de conjuntos de datos MSI 2D y 3D con resolución espacial y espectral completa, por ejemplo, el programa «Datacube Explorer».

[0677] Las imágenes obtenidas mediante los métodos descritos en este documento pueden analizarse con mayor profundidad, por ejemplo, de la misma manera que se analizan los resultados de IHQ. Por ejemplo, las imágenes pueden utilizarse para delimitar subpoblaciones celulares dentro de una muestra y proporcionar información útil para el diagnóstico clínico. De igual forma, el análisis SPADE puede utilizarse para extraer una jerarquía celular a partir de los datos de citometría de alta dimensión que proporcionan los métodos de la divulgación (Qiu et al. (2011; Nat. Biotectmol.29:886-91)).

[0678] Aparato que comprende la muestra de la presente divulgación

[0679] También se proporciona en la presente un aparato como el descrito anteriormente que comprende una muestra de la presente divulgación (p. ej., una muestra teñida con reactivos de ciertos aspectos de la presente divulgación). En algunos casos, el aparato es un citómetro de masas de imágenes.

[0680] Control informático de los métodos divulgados en la presente

[0681] Los métodos divulgados en la presente también pueden proporcionarse como un producto de programa informático que incluye un medio no transitorio legible por máquina que tiene almacenadas instrucciones que pueden usarse para programar una computadora (u otro dispositivo electrónico) para realizar los procesos descritos en la presente. El medio legible por máquina puede incluir, entre otros, discos duros, disquetes, discos ópticos, CD-ROM, DVD-ROM, ROM, RAM, EPROM, EEPROM, tarjetas magnéticas u ópticas, dispositivos de memoria de estado sólido u otros tipos de medios/medios legibles por computadora adecuados para almacenar instrucciones electrónicas. En consecuencia, la divulgación también proporciona un medio legible por máquina que comprende instrucciones para realizar un método como el descrito en este documento.

[0682] Definiciones

[0683] El término "que comprende" abarca "incluyendo" así como "que consiste". Por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%. El término "sustancialmente" no excluye "completamente". Por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, el término "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la divulgación.

[0684] Los pesos moleculares (M<n>) y los índices de polidispersidad (PDI = M<w>/M<n>) se obtuvieron mediante cromatografía de permeación en gel acuoso (GPC), realizada a temperatura ambiente, con NaNO₃ 0,2 M como eluyente. Los pesos moleculares se refieren a estándares de polietilenglicol (PEG).

[0685] EJEMPLOS

[0686] Ejemplo 1 – Formación de imágenes de tinciones histoquímicas

[0687] En histología e histopatología, el tejido se prepara para su visualización bajo un microscopio utilizando fijación química o secciones congeladas. Para obtener una imagen del tejido empleando la citometría de masas de imágenes, las secciones se tiñen con una o más moléculas de afinidad marcadas con metal, como anticuerpos u oligonucleótidos complementarios. En esta divulgación, en combinación con inmunohistoquímica utilizando anticuerpos marcados con metal, las tinciones que contienen metal se utilizan para identificar estructuras celulares particulares.

[0688] La presente divulgación describe reactivos, métodos y kits para la citometría de masas de imágenes. Ciertos aspectos de la presente divulgación se relacionan con compuestos como el rojo de rutenio utilizado para identificar el estroma mucinoso, la tinción tricrómica para la identificación de fibras de colágeno, el tetróxido de osmio como tinción para los compartimentos de la membrana celular.

[0689] Fig. 1 muestra la tinción con rojo de rutenio del estroma de la mucosa. Sección FFPE de tejido de xenoinjerto de adenocarcinoma pancreático. Se inyectó al ratón nitroimidazol EFS y se detectaron regiones hipóxicas con anticuerpos anti-EFS marcados con metal. La tinción nuclear se logró utilizando un anticuerpo anti-histona H3 marcado con metal. Fig. 2A muestra una sección FFPE de intestino de ratón que se tiñó con tinción tricrómica, que contiene ácidos fosfotúngstico y fosfomolibdénico, para la identificación de fibras de colágeno (se muestra la detección de 184 W en verde) y anticuerpos marcados con metal (anti-E-cadherina en rojo y anti-histona H3 en verde).

[0690] Fig. 2B muestra la tinción con yododesoxiuridina (5-yodo-2'-desoxiuridina, ldU), un análogo sintético de nucleósido de timidina. ldU se utiliza para permitir la detección de células en crecimiento o proliferación en tejidos vivos. Durante la fase S de la división celular, ocurre la replicación del ADN, y ldU puede incorporarse al ADN recién sintetizado sustituyendo a la timidina natural. La inmunohistoquímica convencional utiliza anticuerpos contra ldU para visualizar las células en crecimiento. La IMQ no requiere el uso de anticuerpos contra este análogo de nucleótido. La ilustración muestra el mismo intestino de ratón, con el canal del citómetro de masas configurado para 1271 (rojo). El ratón fue inyectado con ldU antes de la cosecha de tejido.

[0691] Fig. 3 muestra que la posfijación de Os04 se utiliza ampliamente como agente de contraste para micrografías de microscopía electrónica. Aquí se da un ejemplo de una ablación de tejido intestinal de ratón incrustado en resina epoxi para microscopía electrónica. La sección de tejido tiene 1 um de espesor.

[0692] Ejemplo 2 - Imágenes de fármacos que contienen metal

[0693] La citometría de masas por imágenes se utilizó para la visualización directa de la localización del platino en secciones de tejido de tejidos tumorales y normales de ratones tratados con cisplatino que portaban xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de páncreas. Esta tecnología recientemente desarrollada permitió la detección simultánea de múltiples marcadores para definir el linaje celular, la respuesta al daño del ADN, la proliferación celular y el estado funcional, proporcionando una visión muy detallada de la incorporación de fármacos en tejidos tumorales y normales a nivel celular. Un hallazgo sorprendente e inesperado fue la extensa unión del platino a las fibras de colágeno en tejidos tumorales y normales de ratones. Los experimentos de evolución temporal indicaron la liberación lenta del platino unido al estroma, aunque actualmente no está claro si el platino liberado conserva su actividad biológica. La citometría de masas por imagen ofrece una ventana única a los efectos in vivo de los compuestos de platino, y es probable que esto pueda extenderse a la práctica clínica para optimizar el uso de esta importante clase de agentes.

[0694] Los fármacos que contienen platino se utilizan ampliamente en el tratamiento de tumores sólidos. El cisplatino y los compuestos relacionados, carboplatino y oxaliplatino, forman aductos estables con el ADN, lo que conduce a la formación de roturas letales de la cadena. A diferencia de otros agentes que dañan el ADN, los tejidos normales de rápida proliferación, incluida la médula ósea y la mucosa intestinal, son relativamente resistentes al cisplatino, y el daño al túbulo renal es la toxicidad limitante en humanos.

[0695] Los cánceres de páncreas que se desarrollan en individuos con mutaciones de la línea germinal en los genes relacionados con el cáncer de mama BRCA1 y BRCA2 son inusualmente sensibles al cisplatino. Por lo tanto, la asignación de tratamiento hacia regímenes que contienen platino en pacientes con cáncer de páncreas positivos por BRCA es un paso importante hacia el tratamiento individualizado para estos cánceres altamente letales. Sin embargo, el beneficio clínico es limitado debido al desarrollo de resistencia a los fármacos. La resistencia al cisplatino es multifactorial e incluye alteraciones en la captación, eflujo y desintoxicación del fármaco que limitan la unión inicial al ADN; mayor capacidad para escindir aductos de ADN; y supresión de las vías efectoras de muerte.

[0696] Estudios previos han utilizado ensayos masivos para medir la cantidad de Pt en tejidos obtenidos de pacientes tras tratamiento con cisplatino, con escasa información disponible sobre la localización del 5-cisplatino en el microambiente tumoral y en tejidos normales. La citometría de masas permite detectar elementos en el rango de masas 75-209, y se describió previamente su uso para medir la captación de fármacos a base de platino en suspensiones celulares de xenoinjertos tumorales humanos. En este estudio, se utilizó la IMQ para estudiar la distribución tisular y la cuantificación del cisplatino junto con múltiples biomarcadores en xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de páncreas. Estos estudios revelaron una extensa unión del cisplatino a las fibras de colágeno en el estroma tumoral, así como en tejidos normales, como riñón, intestino y piel.

[0697] Como se muestra en la Fig.4, ratones inmunodeficientes recibieron un trasplante ortotópico de tejido tumoral pancreático humano. Una vez establecidos los tumores, se inyectó a los ratones 40 mg/kg de solución salina de cisplatino. Los tumores extirpados se fijaron con formalina e incluyeron en parafina, se cortaron secciones de tejido a 5 micras de espesor y se procesaron para inmunotinción e imágenes por IMQ. La imagen muestra la localización del cisplatino (medido por Pt195) en azul, los leucocitos murinos en rojo (marcador CD43) y las células de carcinoma pancreático en verde (marcador de panqueratina).

[0698] Diseño experimental para las figuras 5-16:

[0699] El estudio se diseñó para evaluar el potencial de la citometría de masas por imágenes para proporcionar nuevos conocimientos sobre las acciones del cisplatino en xenoinjertos de cáncer pancreático derivados de pacientes, seleccionados según la presencia o ausencia de mutaciones germinales en BRCA. El plan de investigación aprovecha la capacidad única de IMQ para la medición combinada de Pt en células individuales con paneles de anticuerpos contra determinantes del linaje celular, la respuesta al tratamiento y el microambiente tumoral, así como la medición directa de la incorporación de 1271-ldU para evaluar la síntesis de ADN.

[0700] Los experimentos con animales se llevaron a cabo utilizando protocolos aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Red de Salud Universitaria. Las muestras frescas de pancreatectomía que eran superfluas para las necesidades diagnósticas se obtuvieron del University Health Network Tumor Tissue Bank (Toronto, Canadá) de acuerdo con un protocolo aprobado por el University Health Network Research Ethics Board. Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) se establecieron en el sitio ortotópico de ratones con inmunodeficiencia combinada grave de 4 a 5 semanas de edad, como se describió previamente. Para estos experimentos se utilizaron ratones sin tumores y dos modelos, denominados OCIP23 y OCIP28. Estos modelos se seleccionaron de nuestro amplio recurso de PDX pancreático sobre la base de características de crecimiento similares y una sensibilidad significativamente diferente al cisplatino, siendo el modelo OCIP28 con mutación BRCA2 altamente sensible, mientras que el OCIP23 de tipo salvaje BRCA es resistente20.

[0701] El cisplatino se obtuvo de la farmacia del Princess Margaret Hospital (Toronto, Canadá). Ratones duplicados en cada grupo fueron tratados con una dosis intraperitoneal única de 0,4 mg/kg o 40 mg/kg de cisplatino durante 24 h, o a 4 mg/kg y sacrificados después de 4 h, 24 h, 48 h o 7 días para ratones sin tumores. La sonda de hipoxia de 2-nitroimidazol EF519 (obtenida del Dr. Cameron J. Koch, Universidad de Pensilvania) a una dosis de 30 mg/kg, y el análogo de timidina ldU (ThermoFisher, EE. UU.) a 60 mg/kg, se administraron 4 h por vía intravenosa y 30 min por vía intraperitoneal antes del sacrificio, respectivamente. Los tumores y los tejidos normales (riñón, hígado, intestino delgado, colon y piel) fueron extirpados, fijados y procesados para inclusión en parafina.

[0703] Además, se obtuvo cisplatino monoisotópico preparado a partir de los isótopos estables 194Pt y 196Pt de Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA, catálogo n.° 201194 y 1s 201196), se esterilizó por filtración y se inyectó intraperitonealmente en ratones con tumores a una dosis de 4 mg/kg. La primera dosis consistió en 194Pt-cisplatino y se administró una segunda dosis de 196Pt-cisplatino 4 días después. Se sacrificaron pares de ratones 24 h después de la dosis de 196Pt-cisplatino.

[0705] Las secciones FFPE se desparafinaron y rehidrataron de forma rutinaria. La recuperación del epítopo inducida por calor se realizó en un baño de agua a 95 ºC en tampón de recuperación de antígenos (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) durante 10 min. Tras un enfriamiento inmediato, las secciones se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 45 min. Las muestras se incubaron durante la noche a 4 ºC con una concentración final de 5-10 µg/mL de cócteles de anticuerpos conjugados con metal diluidos en PBS/BSA al 0,5 % (Tabla 1). A continuación, las muestras se lavaron con 2x PBS/Triton X-100 al 0,1 % y 2x PBS y se expusieron a 25 µM de intercalador lr (Fluidigm) durante 30 min a temperatura ambiente para la tinción de los núcleos. Las muestras se enjuagaron dos veces con agua destilada y se secaron al aire antes del análisis IMQ.

[0707] Las muestras inmunoteñidas y secas se insertan en una novedosa cámara de ablación láser (desarrollada a partir de la descrita por Giensen et al.) donde el tejido se escanea con un láser UV pulsado profundo enfocado a un tamaño de punto de 1 micrómetro de diámetro. El tejido de un punto de ablación se vaporiza totalmente en cada disparo láser y la columna se transporta con alta fidelidad temporal a la fuente de iones de plasma acoplada inductivamente para su análisis simultáneo por el citorretador de masas (HeliosTM, Fluidigm). Los isótopos metálicos asociados a cada punto se miden simultáneamente y se indexan con respecto a la ubicación de cada punto. La contaminación cruzada entre puntos es inferior al 2%, lo que produce imágenes de contraste nítido. El tejido se escanea punto por punto a lo largo de una línea de escaneo raster, y las líneas de escaneo secuenciales finalmente producen un mapa de intensidad de las proteínas objetivo en todo el tejido o la región de interés.

[0709] El procesamiento de datos se realizó utilizando algoritmos Wolfram Mathematica® (V10.3) desarrollados internamente. Los datos de la señal transitoria se exportaron desde el citómetro de masas en formato de texto. El archivo consta de números de inserción (es decir, tiempo) en filas y canales de masa en columnas, y los valores medidos se dan como recuentos de iones. Las imágenes de cada canal de masa se reconstruyeron trazando las señales de disparo del láser en el mismo orden en que se registraron, escaneo de línea por escaneo de línea. Se superpusieron imágenes RGB multidimensionales para las combinaciones de canales deseadas. La segmentación celular de tejido completa se realizó utilizando la plataforma Definiens® Developer XO para patología digital (Definiens AG; Múnich, Alemania). La plataforma Definiens Developer se utiliza para generar segmentación de imágenes específica de tejido utilizando conjuntos de reglas entrenados por patólogos. Los conjuntos de reglas contienen algoritmos de aprendizaje automático que se aplican para extraer características que distinguen el tipo de célula individual, como el estroma y el epitelio, entre otros. La evaluación morfológica tanto del tejido tumoral como del no tumoral fue realizada por un patólogo experto (IS). Las regiones de células epiteliales y estromales se seleccionaron con base en la morfología, p. ej. forma de la célula, tamaño de la célula, características nucleares y citoplasmáticas, ubicación de las células, etc. Posteriormente, se utilizaron anticuerpos específicos para confirmar el marcaje apropiado para células epiteliales y estromales, es decir, anticuerpos de colágeno I y αSMA para estromales, y anticuerpos de Pan-queratina y E-cadherina para regiones epiteliales (Fig.18 suplementaria). La Tabla 1 contiene los parámetros utilizados para el algoritmo de segmentación. Después de una identificación supervisada de células y tejidos, una cuantificación de alto rendimiento de la intensidad de tinción celular proporciona una cuantificación de datos de múltiples canales al mismo tiempo en un área de tejido en particular.

[0711] El ion 134Xe+, que siempre está presente debido a las impurezas en la fuente de plasma de argón en cantidades naturales, se monitoreó y se utilizó para normalizar los valores medios de todos los canales informados para las fluctuaciones de sensibilidad. La señal 134Xe+ se distribuye uniformemente en todas las imágenes, y su variabilidad de una imagen a otra refleja un estado dado del ajuste del instrumento. El algoritmo de normalización incluye la construcción de histogramas de intensidad de la señal 134Xe+ por imagen y el siguiente ajuste con una función gaussiana que refleja las estadísticas de conteo. Los valores medios de la señal 134Xe+ se usaron como valores de normalización. Se eligió arbitrariamente una imagen como imagen de referencia (es decir, factor de normalización = 1), y los factores de normalización se definieron como la relación de los valores de normalización de una imagen en particular y la imagen de referencia. La normalización real de todos los canales se realizó después del procedimiento de segmentación.

[0713] La desviación estándar de los valores normalizados tiene en cuenta la desviación estándar de los valores medidos y la desviación estándar de la señal iónica 134Xe. Las medias informadas en los gráficos de barras son un promedio de múltiples imágenes. Las desviaciones estándar presentadas con estas medias dan cuenta de errores adicionales en la medición de la señal iónica que surgen de la variación entre a. diferentes áreas de la misma muestra, y b. entre diferentes muestras (es decir, diferentes ratones). Ambos errores provienen de fuentes distinguibles, y las barras de error representan su propagación. Se utilizaron ANOVA unidireccional y la prueba t de Student para determinar la significancia estadística. Todo el análisis estadístico se realizó con el software GraphPadTM Prism® (La Jolla, CA).

[0715] Caracterización de los xenoinjertos derivados de pacientes:

[0717] Se utilizaron imágenes en escala de grises de secciones de tejido generadas a partir de la corriente iónica total (TIC) en el detector por píxel como proxy de una imagen óptica. La TIC, como imagen generada por computadora, mostró características morfológicas similares a las secciones teñidas con hematoxilina/eosina (H&E) del mismo bloque de tejido. Si bien se espera que la mejor analogía se logre con el mayor número de canales detectados, la selección racional de marcadores de núcleo, membrana y estroma resulta útil. Como se ilustra en la Fig. 5 y la Fig. 10 suplementaria, los modelos PDX OCIP28 y OCIP23 presentan características típicas del adenocarcinoma ductal pancreático, con el epitelio maligno dispuesto en estructuras glandulares incrustadas en un estroma fibroso. Para fines ilustrativos, las combinaciones de imágenes generadas a partir de los marcadores IMQ individuales se colorearon y superpusieron para mostrar sus correlaciones espaciales. Por ejemplo, como se observa en la Fig.5b, las células que incorporan ldU también expresan el marcador de proliferación Ki-67, y están ausentes en las regiones de hipoxia marcadas por el trazador EF5, como se observó previamente mediante imágenes de fluorescencia.

[0719] La expresión del marcador de daño del ADN γH2AX se limita sustancialmente al tejido necrótico adyacente a las regiones de hipoxia. También se observan abundantes células que expresan el marcador mesenquimal aSMA, intercaladas entre las células epiteliales que expresan citoqueratina y E-cadherina. Tras el tratamiento con 4 mg/kg de cisplatino, que corresponde aproximadamente a la intensidad de dosis utilizada en humanos, los tumores OCIP28 con mutación BRCA mostraron pérdida de la incorporación de ldU y un notable aumento de la expresión de γH2AX, mientras que estos efectos fueron mucho menos evidentes en el OCIP23 con mutación BRCA, resistente al cisplatino20. Incluso al aumentar la dosis de cisplatino a 40 mg/kg, los efectos sobre la captación de ldU y γH2AX en OCIP23 fueron menores que en el modelo con mutación BRCA a la dosis más baja (Fig.5c y Fig.10 suplementaria). Se prepararon suspensiones celulares siguiendo protocolos publicados a partir de fragmentos tumorales frescos tras el tratamiento con cisplatino, y se realizaron análisis de células completas mediante citometría de masas (CyTOF® 2). Los valores de átomos de Pt/célula e incorporación de ldU (yodo-127l/célula/minuto) se muestran en la Fig.11 suplementaria y son muy similares a los obtenidos previamente con xenoinjertos derivados de líneas celulares.

[0721] Distribución de cisplatino en tejido tumoral:

[0723] Las imágenes de cada uno de los principales isótopos de platino se capturaron fácilmente mediante IMQ: la forma más abundante, 195Pt, se utiliza para la ilustración. Las secciones de tejido preparadas mediante fijación con formalina e inclusión en parafina se someten a un lavado exhaustivo y tratamiento con disolventes, lo que podría eliminar el cisplatino débilmente unido. Por lo tanto, primero se examinaron secciones incluidas en parafina y criostato cortadas de muestras congeladas rápidamente preparadas del mismo tumor. Se encontró que las intensidades y los patrones de distribución del marcaje con platino fueron muy similares, sin pérdida apreciable de señal en las secciones de parafina, lo que indica que el Pt restante 24 horas después del tratamiento con cisplatino está, muy probablemente, unido al tejido (Fig. 12 suplementaria). Por lo tanto, la mayor parte del trabajo se realizó utilizando secciones FFPE. A 4 mg/kg de cisplatino, se detectó Pt por encima del fondo en los tumores OCIP28, pero no en OCIP23 donde, sin embargo, se detectó fácilmente a la dosis más alta.

[0725] Inesperadamente, la intensidad de 195Pt fue considerablemente mayor en el componente estromal que en el tejido epitelial del tumor. La tinción adicional para el colágeno I mostró co-localización con 195Pt, y estaba íntimamente asociado con el marcador mesenquimal aSMA, como se esperaba (Fig. 5d). Se observó una fuerte unión de colágeno de Pt en ambos modelos de PDX probados, y la intensidad fue altamente significativa cuando se comparó con el tejido tumoral epitelial (Fig.5e).

[0727] Distribución de cisplatino en el intestino normal: El intestino delgado y el colon se recolectaron de ratones que recibieron 4 mg/kg de cisplatino, con ldU administrada 30 min antes del sacrificio. Se realizaron cortes de parafina para la tinción IMQ utilizando el mismo cóctel de anticuerpos que para el tejido tumoral (Tabla 1). Como se muestra en la Fig. 6, se observó una intensa captación de ldU por las células de las criptas basales de los ratones control no tratados, mientras que el marcaje de la mucosa colónica fue menor (Fig.13 suplementaria). La síntesis de ADN se vio fuertemente inhibida tras el tratamiento con cisplatino, acompañada de un aumento del marcaje de γH2AX. Al igual que en el tejido tumoral, se observó una extensa unión del platino al colágeno en la lámina propia y la pared externa del intestino delgado, así como en las células epiteliales vellosas apicales, y se observó un patrón similar en el colon (Fig. 13 suplementaria). Curiosamente, 48 horas después del tratamiento con cisplatino, la captación de ldU por las células de las criptas basales se recuperó, a pesar de la persistencia de la unión del platino al colágeno en la membrana basal subyacente (Fig.6c).

[0728] Distribución del cisplatino en la piel: Las secciones cortadas a través del espesor de la pared abdominal ilustran las características histológicas de varios tejidos distintos, según se observan mediante IMQ (Fig. 7). De forma similar a la pared intestinal y al tejido tumoral, la unión del platino al colágeno dérmico fue sorprendente. Se tomaron muestras de piel de ratones a las 4, 24, 48 y siete días después del tratamiento con cisplatino para determinar la tasa de pérdida del platino unido al colágeno. Como se ilustra en la Fig.14a suplementaria, el platino dérmico disminuyó con el tiempo tras una dosis única de 4 mg/kg de cisplatino (Fig.14b suplementaria).

[0730] Cisplatino en riñones e hígado normales:

[0732] El riñón y el hígado son los principales órganos implicados en el metabolismo y la excreción de fármacos, aunque el hígado desempeña un papel menor en el caso del cisplatino, que se elimina principalmente por la orina21. El daño tubular renal es el efecto tóxico más grave del cisplatino en humanos7. El examen renal mediante IMQ 24 horas después de la administración de 4 mg/kg de cisplatino mostró un patrón llamativo, con grandes cantidades de platino en los túbulos corticales y escasa acumulación en los glomérulos o la médula renal (Fig.8a). Además, se mantuvieron altos niveles de platino hasta siete días después del tratamiento, lo que concuerda con la nefrotoxicidad de este agente (Fig. 15 suplementaria). Por el contrario, se detectó muy poco platino en el hígado después del cisplatino (Fig.8b). Sin embargo, se observó un patrón distintivo de acumulación de platino, que demostró una distribución sinusoidal y perivenular en la zona 3 que no se correlaciona con el colágeno (Fig.8b, recuadro).

[0734] Discusión:

[0736] En los presentes experimentos, se aprovechó el potencial único de IMQ para visualizar el contenido celular de platino en ratones portadores de xenoinjertos de cáncer de páncreas derivados de pacientes, con mutaciones BRCA y de tipo salvaje, tratados con cisplatino, y en tejidos huésped normales clave. En combinación con la incorporación de 1271-ldU y el trazador de hipoxia 2-nitroimidazol EF5, la expresión del marcador de respuesta al daño del ADN γH2AX y biomarcadores específicos del linaje celular, se obtuvieron varias observaciones novedosas y de importancia clínica.

[0737] El platino se detectó fácilmente en cortes de tejido tras el tratamiento con 4 mg/kg de cisplatino, lo que proporciona una exposición al fármaco similar a la obtenida en pacientes. Si bien el fármaco libre se elimina rápidamente por los riñones, se une ampliamente a las proteínas plasmáticas, lo que concuerda con nuestra observación de que los niveles de Pt en tejido fijado con formalina e incluido en parafina son comparables a los de los cortes congelados. En el modelo PDX OCIP28 con mutación BRCA2, se observó una pérdida pronunciada de la incorporación de ldU y un aumento del marcaje de γH2AX tras el tratamiento con 4 mg/kg de cisplatino, lo cual coincide con nuestra observación previa de que este modelo presenta una alta respuesta al cisplatino, lo que se explica por una reparación homóloga (RH) deficiente en 5 como consecuencia de la pérdida de BRCA2. Por el contrario, el modelo OCIP23, competente en RH, mostró poca respuesta a 4 mg/kg de cisplatino, y efectos relativamente modestos sobre ldU y γH2AX cuando la dosis se incrementó a 40 mg/kg. Aunque estos hallazgos son consistentes con la observación clínica de que los cánceres de páncreas que se desarrollan en individuos con mutaciones germinales en BRCA1/2 pueden ser muy sensibles a los fármacos con platino9, observamos que los niveles de Pt en el compartimento epitelial de OCIP28 fueron significativamente mayores que los de OCIP23 tras la dosis clínicamente relevante de 4 mg/kg. La resistencia al cisplatino es multifactorial e incluye vías de transporte y desintoxicación del fármaco que limitan su acumulación celular. Es posible que estos mecanismos se expresen con mayor intensidad en OCIP23 y expliquen en parte las diferencias en la sensibilidad al cisplatino. Esto podría estudiarse con mayor profundidad aprovechando la capacidad única del IMQ para medir los niveles de Pt en combinación con múltiples anticuerpos dirigidos contra proteínas relacionadas con la resistencia al cisplatino, incluyendo la bomba de eflujo MRP2 y enzimas implicadas en el metabolismo del glutatión, y ampliarse para incluir modelos adicionales de PDX. Los nuevos conocimientos obtenidos mediante este estudio podrían tener una utilidad clínica significativa, dada la importancia de los fármacos con platino en el tratamiento del cáncer.

[0739] Mediante el IMQ, obtuvimos imágenes de diversos tejidos normales con una resolución comparable a la de la microscopía óptica. El cisplatino es más activo contra las células proliferantes, pero parece tener poco efecto perjudicial sobre la mucosa intestinal de pacientes con cáncer. Por lo tanto, nos interesaba comparar la acumulación de cisplatino y sus efectos farmacológicos en las células de las criptas basales del intestino delgado con los de la PDX. Como se muestra en la Fig.6, la captación de ldU por las células de las criptas se redujo considerablemente 24 h después de la administración de cisplatino, acompañada de un aumento de γH2AX. Esto indica que el cisplatino tiene un efecto agudo significativo en la mucosa del intestino delgado, pero después de 48 h la incorporación de ldU se reanudó, lo que sugiere que estas células son capaces de reparar el daño inducido por el fármaco durante un breve período de detención del ciclo celular y luego reanudar su crecimiento normal.

[0741] El daño a los túbulos renales es el efecto secundario más importante del cisplatino en humanos y solo se previene parcialmente con regímenes de hidratación intensivos7. En consecuencia, observamos una intensa captación de Pt por las células tubulares de la corteza renal que persistió en el tiempo, en comparación con los glomérulos y la médula renal, donde el Pt estuvo prácticamente ausente. Esto contrasta con un estudio previo de autopsias de pacientes con cáncer que recibieron cisplatino, donde los niveles de Pt en la corteza y la médula fueron similares24. Esto podría explicarse por las diferencias entre las especies o por la mayor duración del tratamiento en los pacientes. La capacidad de obtener imágenes de platino con resolución subcelular mediante IMQ ofrece un enfoque novedoso para el estudio de la nefrotoxicidad inducida por platino y permite explorar nuevos enfoques para mitigar lo que sigue siendo un problema significativo en oncología clínica.

[0743] La hepatotoxicidad de los fármacos a base de platino se ha descrito previamente y es bien conocida25. Nuestra observación de que el cisplatino se acumula en el hígado, revelando una distribución sinusoidal y perivenular en la zona 3, resulta de interés, ya que se cree que el mecanismo de lesión es el daño a las células endoteliales sinusoidales del hígado, seguido de fibrosis subsinusoidal, obstrucción y congestión, lo que conduce a la enfermedad venooclusiva/síndrome de obstrucción sinusoidal.

[0745] Un hallazgo sorprendente e inesperado fue el grado de unión del platino al colágeno, que fue considerablemente mayor que el del platino en las células epiteliales, tanto en el tejido tumoral como en el intestino sano. La intensa unión del platino al colágeno dérmico, un sitio fácilmente accesible para la biopsia por punción, permite un estudio similar en pacientes que reciben cisplatino. Un estudio de evolución temporal reveló que el platino unido al colágeno dérmico se libera lentamente, pero no está claro si conserva su actividad farmacológica. Sin embargo, es interesante que el platino pueda detectarse en el plasma de los pacientes durante varios años después del tratamiento con cisplatino, y que sus niveles se correlacionen con neurotoxicidad y ototoxicidad a largo plazo.

[0747] Además, los ultrafiltrados del plasma de los pacientes pudieron formar aductos de ADN, lo que indica la retención de la actividad biológica. La fuente de platino plasmático en estos pacientes sigue siendo incierta, aunque se cree que está unido al tejido. Estudios tempranos sugirieron que el cisplatino se inactiva después de la unión a proteínas29, pero hay informes de beneficio del tratamiento intralesional con geles de cisplatino/colágeno, con datos farmacocinéticos consistentes con la liberación lenta del fármaco en pacientes con cáncer. Con base en el hallazgo de IMQ de que el cisplatino se une ampliamente al colágeno, podría sugerirse que tiene un efecto significativo dentro del microambiente tumoral debido a la liberación lenta25 del fármaco en cantidades suficientes para afectar el crecimiento tumoral. Se ha informado que la exposición continua a quimioterapia metronómica de baja dosis mejora el índice terapéutico de algunos agentes citotóxicos.

[0749] El nuevo hallazgo más significativo utilizando IMQ es la extensa unión del cisplatino al colágeno dentro del estroma tumoral y en tejidos normales. Las principales limitaciones del presente estudio son: 1) no establece si el cisplatino unido al colágeno permanece activo; 2) no se incluyeron los otros fármacos de platino clínicamente importantes, carboplatino y oxaliplatino; 3) no se establece si estos efectos también ocurren en pacientes con cáncer. Para abordar esto, se utilizaron las formas monoisotópicas de cisplatino 194Pt y 196Pt para pulso/persecución in vivo, para examinar si el cisplatino unido al colágeno se redistribuye con el tiempo. Algunos datos preliminares se muestran en la Fig.9. En este experimento, los ratones con tumores fueron tratados con 4 mg/kg de 194Pt-cisplatino el día 1, 4 mg/kg de 196Pt-cisplatino el día 5 y sacrificados el día 6. Como se muestra en la Fig. 9, los dos isótopos mostraron un patrón de distribución similar, con el cisplatino permaneciendo sustancialmente unido al colágeno. Sin embargo, se observó una pérdida de 194Pt en comparación con 196Pt, lo que indica su lenta disociación del colágeno.

[0751] Además, se han descrito anticuerpos monoclonales contra aductos de Pt-ADN, y los inventores probarán si estos pueden usarse con éxito para permitir la medición dual de la biodistribución de Pt y el daño al ADN inducido por fármacos usando IMQ. De ser así, esto podría usarse para probar si el cisplatino monoisotópico, liberado con el tiempo desde el estroma tumoral, produce daño al ADN en células cancerosas adyacentes. Aunque la IMQ aún no se ha aplicado a tumores tratados con carboplatino u oxaliplatino, los inventores han demostrado previamente que Pt se detecta fácilmente en células tumorales tratadas con oxaliplatino usando el CyTOF, lo que sugiere que la IMQ será igualmente útil estudiando estos agentes en modelos animales y también en muestras de pacientes.

[0753] Nuestros planes para la traducción clínica involucran dos líneas de investigación. Una es un estudio clínico de la unión del colágeno por cisplatino y oxaliplatino, basado en el análisis de IMQ de biopsias de piel secuenciales obtenidas durante el tratamiento, en comparación con el platino ultrafiltrable y unido a proteínas plasmáticas correspondiente. Si el platino unido al colágeno es la principal fuente de Pt plasmático tras el tratamiento, se espera que ambos valores se correlacionen. En un grupo independiente de pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante basada en platino, se determinará hasta qué punto la unión del Pt al colágeno tumoral coincide con la de la piel del paciente y si el Pt tumoral se correlaciona con la respuesta al tratamiento. Nuestra otra línea de investigación, y la motivación original de este trabajo, es investigar los mecanismos de sensibilidad y resistencia al platino en los cánceres de páncreas. Este estudio aprovecha la capacidad única de la IMQ para la medición de Pt en células individuales, en combinación con amplios paneles de anticuerpos dirigidos a los determinantes conocidos de la respuesta al tratamiento, incluyendo proteínas implicadas en el transporte y la desintoxicación de fármacos, así como el daño inicial del ADN y las respuestas al daño.

[0755] En resumen, los hallazgos presentados en este artículo confirman que la citometría de masas por imagen representa una nueva y potente plataforma para el estudio de procesos biológicos complejos en tejido intacto. Si bien se espera que el principal impacto se dé en el área de la patología oncológica, nuestros resultados apuntan a aplicaciones aún poco exploradas para el estudio de tejidos normales y patología no maligna.

[0757] Fig.5 muestra los efectos del cisplatino sobre la proliferación tumoral, el daño al ADN y la distribución de cisplatino en el tumor. (A) Imagen representativa de la corriente iónica total (izquierda) y tinción H&E (derecha) del control OCIP28. Barra de escala = 100 µm. (B) Imágenes representativas de panqueratina, Ki-67, ADN, EF5, ldU, Histona H3, E-cadherina, γH2AX y o SMA de tumores de ratones control y tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). Barra de escala = 100 µm. (C) Gráfico de barras del porcentaje de ldU positivo (arriba) e γH2AX (abajo) de los xenoinjertos OCIP28 y OCIP23. Los resultados cuantitativos se obtuvieron en todas las figuras utilizando el algoritmo de segmentación de Definiens Developer. (D) Imágenes representativas de panqueratina, EF5, colágeno I, 195Pt e Histona H3 en ratones OCIP28 tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). Barra de escala: 100 µm. (E) Distribución de platino en el área de tejido tumoral viable con y sin colágeno en xenoinjertos OCIP28 y OCIP23.

[0758] Fig.6 muestra los efectos y la distribución del cisplatino en el intestino delgado. (A) Imágenes representativas de corriente iónica total, panqueratina, ldU, ADN, E-cadherina, y H2AX y o SMA, colágeno I, 195Pt e Histona H3 en el intestino delgado de ratones OCIP28 PDX control y tratados con cisplatino (4 mg/kg durante 24 h). Barra de escala: 100 µm. (B) Porcentaje de ldU positivo en el gráfico de barras (izquierda) y distribución de platino en el área de tejido epitelial colágeno y no colágeno del intestino delgado. (C) Imágenes representativas de ldU, 195Pt e Histona H3 de intestino delgado control tratado con cisplatino (4 mg/kg durante 24 h y 48 h). Barra de escala = 100 µm.

[0759] Fig. 7 muestra las características histológicas de la piel identificadas por IMQ y la distribución de platino después del tratamiento con cisplatino. Imágenes representativas de colágeno I, E-cadherina, Histona H3, ldU y una SMA de piel de ratón control (arriba) y tratada con cisplatino (4 mg/kg durante 24 h, abajo). Barra de escala = 100 µm.

[0760] Fig.8 muestra la distribución de cisplatino en riñón e hígado. (a) Imágenes representativas de colágeno I, 195Pt e Histona H3 de riñón de ratón tratado con cisplatino (4 mg/kg durante 4 h). Barra de escala = 100 µm. (b) Imagen representativa de corriente iónica total (izquierda) e imagen de colágeno I, 195Pt e Histona H3 (derecha) de hígado de ratón tratado con cisplatino (4 mg/kg durante 24 h).

[0761] La Fig.9 muestra la cinética de la distribución de cisplatino medida utilizando cisplatino monoisotópico. Los ratones con tumores fueron tratados con 194Pt-cisplatino el día 1, 196Pt-cisplatino el día 5 y sacrificados el día 6. Las imágenes son de una sola sección de tejido que muestra la distribución relativa y la abundancia de los dos isótopos (arriba; escala de grises), panqueratina, colágeno I e Histona H3 frente a Pt (paneles inferiores). El panel inferior muestra los dos isótopos, con la intensidad del color indicando la preponderancia de 196Pt en este punto de tiempo Barra de escala = 100 µm. Fig.10 muestra los efectos del cisplatino en la proliferación tumoral, daño del ADN y distribución de<195>Pt en OCIP23. (A) Imagen representativa de corriente iónica total (izquierda) y tinción H&E (derecha) de OCIP23 control. Barra de escala = 100 µm. (B) Imágenes representativas de pan-queratina, Ki-67, ADN, EF5, ldU, Histona H3, E-cadherina, γH2AX y aSMA de OCIP23, control y ratones tratados con cisplatino 40 mg/kg durante 24 h. Barra de escala = 100 µm. (C) Imágenes representativas de panqueratina, EF5, colágeno I,<195>Pt e Histona H3 en ratones con tumores OCIP23 tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). Barra de escala: 100 µm.

[0762] Fig.11 muestra los efectos del cisplatino en la proliferación celular y la captación de platino, determinadas por citometría de masas. (A) Gráficos representativos de 127l frente a 195Pt en ratones control y con tumores OCIP28 tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). (B) Captación total de platino en tumores OCIP28 control y tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). (C) Datos de átomos de yodo por célula tras un pulso de ldU de 30 min para la identificación de células en fase S tras una dosis única de cisplatino.

[0763] Fig. 12 muestra la distribución del platino en secciones criostáticas y FFPE. Imágenes representativas de 195Pt, Panqueratina, Ki-67 e γH2AX de OCIP28 tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h) en criostato (arriba) y secciones tumorales FFPE (abajo). Barra de escala = 100 µm.

[0764] Fig.13 muestra la distribución de platino en el intestino grueso. Imágenes representativas de corriente iónica total, Panqueratina, ldU, ADN, E-cadherina, γH2AX, aSMA, colágeno I, 195Pt e Histona H3 en el intestino grueso de ratones OCIP23 control (arriba) y tratados con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h, abajo). Barra de escala = 100 µm.

[0765] Fig.14 muestra la distribución de platino en piel de ratón sin tumor. (A) Imágenes representativas de 195Pt (gris, arriba) y de colágeno I, 195Pt e Histona H3 (abajo) de piel de ratón control y tratada con cisplatino (4 mg/kg durante 4 h, 24 h, 48 h y 7 días). Barra de escala = 100 µm. (B) Evolución temporal de la distribución del platino en el colágeno dérmico. Fig.15 muestra la distribución del platino en riñón de ratón sin tumor. Imágenes representativas de 195Pt (gris, arriba) y de colágeno I, 195Pt e Histona H3 (abajo) de riñón de ratón control y tratado con cisplatino (4 mg/kg durante 4 h, 24 h, 48 h y 7 días). Barra de escala = 100 µm.

[0766] Fig. 16 muestra el análisis de imágenes con el Definiens Developer. (A) Imagen representativa de un tumor OCIP28 tratado con cisplatino (40 mg/kg durante 24 h). Arriba a la izquierda: E-cadherina (roja), γH2AX (verde), ADN (azul) y colágeno I (cian). Arriba a la derecha: la capa de epitelio (roja) se identifica con base en E-cadherina y Pan-queratina. La capa de estroma (verde) se identifica con base en aSMA y colágeno I. El lumen está en negro. Abajo a la izquierda: Las células epiteliales (rojas) y las células del estroma (cian) se identifican con base en ADN y se cultivan con base en las proporciones de tinción presente. Abajo a la derecha: La capa de colágeno (cian) se identifica a partir de la capa de estroma (azul). (B) La capa de colágeno (cian) se identifica a partir de la capa de estroma (azul) en intestino grueso de ratón. (C) La capa de colágeno (cian) se identifica a partir de la capa de estroma (azul) en piel de ratón.

[0767] Ejemplo 3 - Reactivos utilizados en los Ejemplos 4-12 y técnicas de caracterización.

[0768] Azido-PEG3-maleimida y TCO-PEG3-maleimida se adquirieron en Click Chemistry Tools (Scottsdale, AZ). El ácido 1,4,7,10-tetraazacilcododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) se adquirió en Macrocylics Inc. El 2-aminoetilcarbamato de terc-butilo y el ácido trifluoroacético se adquirieron en Sigma Aldrich, Canadá. Las unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra-15 se adquirieron en Millipore, Canadá. DBCO-PEG5-NHS y TCO-PEG5-NHS se adquirieron en Click Chemistry Tools (Scottsdale, AZ). Alexa FluorTM 594 C5 Maleimida fue suministrada por Sigma Aldrich, Canadá (Oakville, Ontario). Todos los anticuerpos se adquirieron en Biolegends (San Diego, CA), a menos que se indique lo contrario. La faloidina amina (peso molecular = ~902 Da) se adquirió de AAT Bioquest (Sunny Vale, CA) y la lectina de Triticum vulgaris (WGA, peso molecular = ~38 kDa) se adquirió de Sigma Aldrich Canada (Oakville, Ontario).

[0770] Las líneas celulares de leucemia humana se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Todas las células se mantuvieron diariamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 2 mM de L-glutamina y 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor a 37 ºC con 5 % de CO<2>. Las células se subcultivaron cada 2-3 días para mantener la subconfluencia. Las células mononucleares de sangre periférica criopreservadas (PBMC, número de catálogo: CTL-UP1) y el suplemento de lavado antiagregante 20x (número de catálogo: CTL-AA-001) se adquirieron de Cellular Technology (Shaker Heights, OH). En todos los experimentos de citometría de masas, la viabilidad celular fue típicamente >90%.

[0772] 170Er- CD3 (UCHTl) 3170001B Fluidigm<154>Sm- CD45 (HBO) 3154001B Fluidigm 1"'0c_ r(:i- ("- D 14 (l\. 1f'-i E. _1,"L), 3160001B Fluidigm<147>Sm- CD20 (2H7) 3147001B Fluidigm<145>Nd- CD4 (RJ)A-T4) 3145001B Fluidigm 146Nd- CD8a(RPA-T8) 3146001B Fluidigm<148>Nd- CD16 (3G8) 3148004B Fluidigm 166Er- CD34 (581) 3166012B Fluidigm 172Yb- C D57 (HCD57) 3172009B Fluidigm 151Eu- CD107a (H4A3) 3151002B Anticuerpos Fluidigm para conjugación de clic LEAFTM CD3 (UCHT1) 300414 Biolegend LEAFTM CD14 (M5E2) 3018Biolegend LEAF™ CD16 (3G8) 302014 Biolegend LEAFTM CD4 (RPA-T4) 300516 Biolegend LEAFTM CD57 (HCD57) 3223Biolegend CD3(UCHT1) 300443 Biolegend Identificación celular Fluidigm Intercalador-Rh (1°3Rh) 201103A Fluidigm Intercalador-Ir (191lrl91/ 193Ir) 201192A Fluidigm.

[0775]

[0778] Los pesos moleculares nominales (M<n>) y las polidispersidades (M<w>/M<n>) de todas las muestras aniónicas hidrosolubles se midieron con un cromatógrafo de permeación en gel (GPC) Viscotek equipado con un detector de índice de refracción Viscotek VE3580 y columnas Polyanalytik AquaGel PAA-203 y PAA-204 (mantenidas a temperatura ambiente). El caudal se mantuvo a 0,7 mL/min utilizando un sistema de suministro de disolventes Viscotek VE1122 y un desgasificador GPC VE7510. Se utilizó un eluyente de KNO₃ 0,2 M, 200 ppm de NaN<3>. El sistema se calibró con estándares de poli(etilenglicol).

[0779] RMN<1>H. Los espectros de RMN<1>H (400 MHz) se registraron en un Varian Hg 400 o un Varian Vnmr S. Espectrómetro 400 con un ancho de pulso de 45° y una temperatura de 25 ºC. Todos los polímeros hidrosolubles se disolvieron en D₂O, con desplazamientos químicos referenciados al pico de HDO a 4,77 ppm. Los polímeros se analizaron con 512 transitorios y un tiempo de retardo de 10 s.

[0780] El número de moléculas de DBCO por proteína se determinó midiendo la absorbancia a 309 y 280 nm con el espectrofotómetro NanoDrop™ 2000/2000c (Thermofisher Scientific, Waltham, MA). Los valores de absorbancia obtenidos y los respectivos coeficientes de extinción molar se utilizaron para calcular las concentraciones molares y el grado de marcaje de DBCO para cada conjugado.

[0782] El análisis ICP-EM empleó un instrumento ELAN 9000 para determinar la eficiencia de conjugación de las etiquetas de masa con las biomoléculas. Los conjugados marcados con metal se diluyeron con HNO₃ al 2 % vol. hasta obtener concentraciones de ppb. Se prepararon soluciones estándar de lantánidos. Mediante una serie de diluciones de 10 múltiplos de una solución madre (1000 mg/L, HNO₃ al 2 %, PerkinElmer) que contenía los elementos lantánidos deseados.

[0784] Ejemplo 4: Preparación de poli(acrilato de metilo) sustituido con ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) con terminación azida.

[0786] Se disolvieron 50 mg de poli(acrilato de metilo) con terminación azida (peso molecular medio (M<n>) = 2000-3000 gmol⁻¹, índice de polidispersidad (PDI) < 1,30); Sigma Aldrich (número de producto: 699764)) en 1 mL de metanol a temperatura ambiente, al que se añadieron 2 mL (1,8 g, 29,6 mmol) de etilendiamina (Sigma Aldrich). Los pesos moleculares (M<n>) y los índices de polidispersidad (PDI = M<w>/M<n>) se obtuvieron mediante cromatografía de permeación en gel acuoso (GPC), realizada a temperatura ambiente, con NaNO₃ 0,2 M como eluyente. Los pesos moleculares se refieren a estándares de polietilenglicol (PEG). La solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, el polímero se precipitó gota a gota en 50 mL de éter dietílico. El polímero sólido se aisló y se lavó dos veces con éter dietílico.

[0788] El polímero aislado se disolvió en 5 mL de un tampón de carbonato (pH 9,4), al que se añadieron 3,0 g (8,4 mmol) de dianhídrido de ácido dietilentriaminopentaacético (Sigma Aldrich), y la solución se agitó. El pH de la solución se controló con un pH-metro. El pH de la solución se incrementó a 8,0 mediante la adición de una solución 5 M de NaOH. Se añadieron 2,0 g (5,6 mmol) adicionales de dianhídrido de DTPA y el pH se incrementó de nuevo a 8,0 mediante la adición de una solución 5M de NaOH. A continuación, la solución se agitó a TA durante 2 h.

[0790] La solución de reacción se transfirió a cuatro unidades de filtración centrífuga Millipore con un límite de peso molecular de 3000 g mol<-1>. La solución se centrifugó y la solución de polímero se lavó con agua destilada y se centrifugó cinco veces más. La solución de polímero se recogió y se liofilizó durante la noche para obtener la poliacrilamida sustituida con DTPA y terminada en azida con un rendimiento de 95 mg. El análisis por cromatografía de gases (GPC) indicó que el polímero aislado era de bajo peso molecular (M<n>= 5000 g mol⁻¹) y tenía un PDI estrecho (Mw/Mn= 1,20).

[0792] Ejemplo 5: Preparación de poliacrilamida sustituida con ácido 1,4,7,10-tetraazacilcododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) y terminada en trans-ciclooctil (TCO) mediante la química clic de tiol-eno.

[0794] El polímero que contiene DOTA con extremo tiol se preparó mediante polimerización por transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT) según Majonis et al. al. (Analytical Chemistry, 2010.82:8961- 8969). Primero se sintetizó un copolímero aleatorio de N,N-dimetilarilamida y N-acriloxisuccinimida mediante polimerización RAFT. Este copolímero se hizo reaccionar con 2-aminoetilcarbamato de terc-butilo, seguido de una desprotección con ácido trifluoroacético, generando un polímero con amino-1. Este polímero se hizo reaccionar posteriormente con DOTA activado utilizando un procedimiento publicado para generar un polímero con DOTA con extremo tiol.

[0796] La poliacrilamida sustituida con ácido 1,4,7,10-tetraazacilcododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) con terminación tiol se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La poliacrilamida sustituida con ácido 1,4,7,10-tetraazacilcododecano-1,4,7,10-tetraacético con terminación tiol se puede preparar utilizando métodos conocidos en la técnica, como los descritos en Lou et al., 2007, Angew. Chem. Int. Ed., 46:6111. A esta solución, se añadió TCO-PEG3-maleimida (Click chemistry tools, Scotsdale, AZ) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El polímero se purificó mediante lavado a través de unidades de filtro centrífugas Millipore Amicon Ultra-15 con un límite de peso molecular de 3000 para eliminar impurezas de bajo peso molecular. El análisis por cromatografía de gases (GPC) del polímero aislado indicó que este tiene un peso molecular moderado (M<n>= 11000 g/mol<-1>) y un PDI estrecho (M<w>/M<n>= 1,20) (GPC acuoso). El pico en δ = 0,9 ppm en la Figura 17 puede asignarse a los protones del grupo terminal terc-butilo. El pico ancho en δ = 1,2-2,2 ppm puede asignarse a los protones de los grupos metileno en la cadena principal del copolímero. Los picos anchos en δ = 5,5 - 6,1 ppm se deben a los protones del grupo terminal TCO.

[0798] Ejemplo 6: Preparación de poliacrilamida sustituida con ácido 1,4,7,10-tetraazacilo-cododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) con terminación azida mediante química clic de tiol-eno

[0800] La etiqueta de masa del extremo azida se preparó mediante la reacción del polímero que contiene DOTA con terminación tiol, preparado como se describió en los ejemplos anteriores, con azido-PEG3-maleimida a temperatura ambiente en tampón PBS durante 2 horas. El polímero se purificó mediante lavado a través de unidades de filtro centrífugas Millipore Amicon Ultra-15 con un límite de peso molecular de 3000 para eliminar impurezas de bajo peso molecular.

[0802] Ejemplo 7 - Preparación de sustratos con etiqueta de masa mediante química clic sin cobre

[0803] La preparación de sustratos funcionalizados con DBCO o tetrazina (p. ej., lectina de WGA, anticuerpos (Abs), faloidina), a través de la reacción de aminas primarias (p. ej., de la cadena lateral de una fracción de lisina en el WGA) con DBCO-PEG4-NHS (Sigma Aldrich) o tetrazina-PEG5-NHS (Sigma Aldrich), se puede realizar a pH suave (6-8) utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica.

[0804] La metodología para la complejación de metales pesados en fracciones quelantes de metales, como DTPA y poliacrilamida sustituida con DOTA, para formar una etiqueta de masa es bien conocida en la técnica.

[0805] Las moléculas de enlace bifuncionales DBCO-PEG5-NHS o Tetrazina-PEG5-NHS se utilizaron para activar biomoléculas con el número deseado de grupos DBCO o Tetrazina, luego reaccionaron las biomoléculas activadas con polímero activado con azida o TCO sin Cu(I) en condiciones acuosas para formar una fracción estable de DBCO o triazol. En resumen, se incubaron 100 µg de proteína con DBCO-PEG5-NHS al equivalente molar de 10 en tampón PBS durante 120 min a temperatura ambiente. A continuación, para biomoléculas con mayor peso molecular (es decir, Abs y lectinas), el DBCO-PEG5-NHS sin reaccionar se eliminó utilizando el filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 NMWL 10 kDa (EMO Millipore, Billerica, MA), mientras que para la conjugación de moléculas pequeñas (por ejemplo, faloidina) se procedió directamente al procedimiento de etiquetado de masa. Se siguió un procedimiento similar para la activación de biomoléculas con la fracción de tetrazina. Tras la activación, las biomoléculas purificadas de DBCO o funcionalizadas con tetrazina se hicieron reaccionar con polímeros quelantes de metales modificados con azida o TCO. La reacción de clic se llevó a cabo a 37 ºC durante 60-90 min. Los polímeros no reaccionados se eliminaron utilizando el filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 NMWL de 100 kDa (EMO Millipore, Billerica, MA).

[0806] Para la preparación del reactivo de doble marcado, el anti-CD3(UCHT1) purificado, sin proteína transportadora, se marcó primero con Alexa Fluor™ 594 a equivalentes molares de 1:10, 1:20 y 1:30, utilizando la química de tiol maleimida, según las instrucciones del fabricante. A continuación, los mAb anti-CD3 marcados con Alexa Fluor™ 594 purificados se conjugaron con marcadores de masa mediante la química de ligación de tetrazina-TCO. El grado de marcaje y las concentraciones de los conjugados de Ab se determinaron fotométricamente a 280 nm y 594 nm utilizando el espectrofotómetro NanoDrop<TM>2000/2000c (Thermofisher Scientific, Waltham, MA). A continuación, los conjugados se ajustaron a concentraciones de 0,25 mg/mL utilizando un estabilizador de Ab basado en PBS (Candor Bioscience, Wangen, Alemania).

[0807] Ejemplo 8: Tinción de células con sustratos marcados con marcadores de masa

[0808] La tinción de células para citometría de masas por imágenes (IMQ) se puede realizar mediante procedimientos estándar en la técnica.

[0809] Tinción de Ab de superficie de células en suspensión

[0810] Se recogieron células vivas (2 x 10<6>por tubo) del medio de crecimiento mediante centrifugación y se resuspendieron en el tampón de tinción celular Maxpar® (Fluidigm, CA, EE. UU.). Las células se tiñeron inicialmente con un intercalador de<103>Rh hasta una concentración final de 1 µM. Tras la incubación, se lavaron con el tampón de tinción celular Maxpar®) y se tiñeron con cócteles de anticuerpos marcados con masa diluidos en el tampón de tinción celular Maxpar® durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces en el tampón de tinción celular Maxpar® y se tiñeron con Cell-ID<TM>lntercalator-lr diluido en Maxpar® Fix & Perm Buffer según lo recomendado por el fabricante (Fluidigm, CA, EE. UU.). Para la tinción de WGA, las células se incubaron con 1 μg/ml de<174>Yb-WGA a temperatura ambiente durante 30 min después de la tinción de Abs de superficie.

[0811] Procedimiento de tinción para células adherentes

[0812] La línea celular de tumor de cuello uterino humano HeLa se sembró en un portaobjetos de 4 cámaras (Nunc<TM>Lab-Tek<TM>II CC2<TM>) a 0,25/ml en 1 ml de medio de crecimiento por cámara. Las células se asientan y crecen como una monocapa en DMEM, suplementado con 10 % FBS (Sigma Aldrich) durante 3 días a 37 ºC, 5 % de CO2. El medio se aspiró y las células se enjuagaron en PBS, luego se tiñeron con una mezcla de Abs marcados con masa de superficie a título 1:100 en 250 µl por cámara en tampón de tinción celular Maxpar® durante 90 min a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpos marcados con masa se lavó en la superficie celular con PBS y, a continuación, las células se fijaron durante 15 min en 400 µl de formaldehído al 1,6 %/PBS por cámara. Tras la fijación, las células se permeabilizaron y bloquearon con 400 µl de tampón Perm-S a temperatura ambiente durante 30 min y BSA al 1 %/PBS durante 60 min a 37 ºC, respectivamente. Las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con metales para marcadores intracelulares (1:50 en 250 µl) en tampón de tinción celular Maxpar® y faloidina-<165>Ho durante la noche a 4 ºC. Finalmente, las células se incubaron con el Cell-ID™ Intercalator-lr a 25 μM (Fluidigm, Cat. N.º 201192A) durante 30 min a temperatura ambiente para la tinción de núcleos. Las muestras se enjuagaron dos veces en ddH<2>O y se secaron al aire antes del análisis IMQ.Tinción de secciones de tejido

[0813] La tinción inmunohistoquímica (IHQ) de secciones de tejido de tejidos congelados y fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE) con anticuerpos marcados con masa para el análisis IMQ se realizó de acuerdo con el protocolo publicado previamente (Chang, et al., 2016. Scientific Reports, 6:36641). Brevemente, se adquirieron secciones de tejido congeladas rápidamente de amígdala humana de amsbio LLC (Cambridge, MA). Cada portaobjetos que contenía dos secciones (núcleos) se fijó con paraformaldehído al 4%, se lavó con DPBS, se bloqueó con BSA al 3% y, a continuación, el núcleo uno se tiñó con una mezcla de anticuerpos metaconjugados y el núcleo dos se tiñó con anticuerpos de doble etiqueta (metal y fluoróforo) durante la noche. Los portaobjetos se lavaron con Triton-X al 0,1% en DPBS y DPBS. El núcleo uno se tiñó con Intercalador 191lr/1931r. El segundo núcleo se tiñó con solución DAPI. El primer núcleo se lavó con ddH<2>O, se secó al aire y se ablacionó mediante IMQ. El segundo núcleo se lavó con DPBS, se cubrió con medio de montaje y cubreobjetos y se tomó una imagen con un microscopio de inmunofluorescencia.

[0815] Para las secciones de tejido FFPE, antes de incubarlas con Abs conjugados con metal, se desparafinaron, deshidrataron y se sometieron a un paso de recuperación de antígeno inducida por calor en una solución alcalina. Tras la incubación con Abs marcados con masa, las secciones de tejido se tiñeron con conjugados WGA-<174>Yb a 1 µg/ml y Faloidina-<165>Ho a 75 ng/ml en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se expusieron al Cell-ID™ Intercalator-lr a 25 μM (Fluidigm, Cat. N.º 201192A) durante 30 min a temperatura ambiente para la tinción de núcleos. Las muestras se enjuagaron dos veces con agua destilada y se secaron al aire antes del análisis IMQ.

[0817] Ejemplo 9: Intensidades de señal medias detectadas durante la IMQ de células teñidas con sustratos marcados preparados mediante química clic Maxpar o Azida-DBCO.

[0819] Para determinar la unión exitosa de las etiquetas de masa a la molécula de Ab, se utilizó ICP-EM para medir el número de etiquetas de masa unidas por Ab. Además, se optimizó el grado de marcaje utilizando un número variable de equivalentes molares de DBCO-PEG5-NHS; a continuación, se monitoreó el número de etiquetas de masa por Ab después de la reacción y se evaluó la reactividad inmunitaria del Ab marcado con masa resultante. Se encontró que el equivalente molar óptimo para DBCO-PEG5-NHS a Ab era 10 (~6 DBCO por Ab), lo que resultó en 3-4 etiquetas de masa o 150-200 átomos de metal por Ab. Se utilizó un Ab secundario policlonal de cabra anti-IgG Fc de ratón (GAM) como molécula de Ab modelo. Para la optimización del protocolo. Se acopló con marcadores de masa cargados con<169>Tm mediante la reacción DBCO-Azida. El resultado de la prueba de funcionalidad se realizó en células Ramos humanas y células KG1a humanas teñidas con anti-CD20 (2H7) primario (5 µg/mL), seguido de GAM marcado con<169>Tm (1,25 µg/mL). A partir del resultado del análisis CyTOF, se determinó que el<169>Tm-GAM conjugado mediante química clic mostró alta sensibilidad y bajo fondo en comparación con el<169>Tm-GAM marcado con Maxpar<TM>. Posteriormente, varios anticuerpos monoclonales con isotipos IgG e IgM también se conjugaron con marcadores de masa mediante química clic y se analizó su funcionalidad en un ensayo de citometría de masas. En la Figura 18, se muestran los resultados de PBMC humanas teñidas con el kit Maxpar<TM>Human PBMC Basic II Phenotyping Panel (Cat. N.º 201315) y anti-CD57 humano. Se muestran los anticuerpos (HCD57)-<172>Yb. Los anticuerpos CD4-<145>Nd, CD14-<160>Gd y CD16-<165>Ho conjugados mediante química clic a 1-2 µg/mL y CD57(HC57)-<172>Yb (clase IgM) se reemplazaron en el panel de fenotipado básico para evaluar el efecto de la conjugación mediante química clic en un formato de ensayo multiplex. El resultado del análisis CyTOF reveló que los nuevos conjugados mostraron una capacidad de fenotipado similar (Figuras 18A y 18B), una sensibilidad superior (incremento de la señal media de dos a tres veces) y una menor intensidad de fondo (Figuras 18C-E) en comparación con el kit de fenotipado de PBMC disponible comercialmente. La mayor sensibilidad de los anticuerpos conjugados mediante química clic se atribuye principalmente al número de átomos metálicos unidos a cada anticuerpo, que es mayor que el de los conjugados Maxpar™. En general, la conjugación mediante química clic mostró potencial para su uso. Como sustituto de los anticuerpos marcados con Maxpar<TM>de baja sensibilidad y para generar nuevos reactivos de afinidad basados en anticuerpos para el sondeo de marcadores tenues.

[0821] Ejemplo 10: Conjugados de WGA con etiqueta de masa preparados mediante la conjugación química de clic sin cobre de etiquetas de masa basadas en polímeros con terminación en azida y biomoléculas activadas con DBCO

[0822] Otra área de aplicación identificada para la química de clic es la generación de reactivos de afinidad con etiqueta de masa para aplicaciones en glicobiología. Se utilizó una lectina de Triticum vulgaris (aglutinina de germen de trigo [WGA]) como molécula modelo para la conjugación directa de etiquetas de masa mediante el método de química de clic. La WGA es una lectina que puede unirse a oligosacáridos que contienen N-acetilglucosamina terminal o quitobiosa, estructuras comunes a muchas glicoproteínas séricas y de membrana. Los azúcares receptores de la WGA son residuos de ácido siálico y N-acetilglucosamina, presentes en la membrana plasmática celular. Los conjugados WGA-<174>Yb se analizaron en formato de ensayo en suspensión para teñir las membranas plasmáticas de células humanas Ramos, KG1a y CCRF-CEM. Las células Ramos, CCRF-CEM y KG1a se tiñeron con anticuerpos CD20-<147>Sm, CD34-<148>Nd y CD4-<145>Nd en tubos separados. Posteriormente, las células se tiñeron con WGA-<174>Yb. Para evaluar la especificidad de la tinción con WGA en la membrana celular, las células Ramos se tiñeron con WGA-<174>Yb, bloqueando la molécula de azúcar N-acetilglucosamina (NAG) como control negativo. Parte de las células teñidas se utilizó para el análisis CyTOF y las células teñidas restantes se adhirieron al portaobjetos para visualizar la tinción de la membrana mediante WGA. La Figura 19A muestra una imagen representativa de superposición de pseudocolor IMQ de células Ramos humanas teñidas con intercalador de ADN WGA-<174>Yb, CD45-<154>Sm y<191>/<193>Ir. La imagen muestra las tinciones de WGA (verde) alrededor de la periferia de la membrana celular. Las figuras 19B y 19C muestran la intensidad de tinción de células mixtas Ramos, CCRF-CEM y KG1a analizadas por IMQ. El resultado muestra la especificidad de WGA para NAG en la membrana plasmática de la célula. El análisis CyTOF® también confirmó la observación del resultado de IMQ, como se esperaba, y se observó un aumento de la intensidad media relacionado con el tamaño celular.

[0823] También se tiñeron poblaciones de sangre completa humana utilizando 29 anticuerpos en panel contra marcadores de superficie para identificar los principales tipos de células inmunitarias, y luego las células se tiñeron con<174>Yb-WGA. La figura 20A muestra una representación bidimensional viSNE de poblaciones de células de sangre completa humana que muestra la ubicación de las principales poblaciones celulares, y la figura 20B muestra la distribución de la intensidad de WGA entre los subtipos de células inmunitarias. De acuerdo con informes anteriores, los resultados mostraron que la intensidad relativa de tinción de WGA dentro de subconjuntos específicos de células inmunitarias fue consistente, pero varió entre individuos. Las intensidades medias de WGA marcadas con masa de las poblaciones celulares seleccionadas en sangre humana se cuantificaron adicionalmente para la discriminación por tamaño, y el resultado observado (Figura 20C) muestra una correlación entre el tamaño celular y los valores de intensidad media de la tinción con WGA para cada subconjunto de células inmunitarias, lo cual concuerda con la observación de otros datos publicados.

[0825] Las imágenes de IMQ se adquirieron según el procedimiento descrito en Lou et al., 2007, Angew. Chem. Int. Ed., 46:6111. Brevemente, los portaobjetos teñidos y secados al aire se insertaron en la cámara de ablación del sistema de imágenes Hyperion™ (Fluidigm), donde se enfoca un láser pulsado de 200 Hz en un punto de 1 µm y se aplica sobre un área definida por el usuario, ablacionando los puntos adyacentes en pasos de 1 µm a medida que el portaobjetos se mueve bajo el haz láser. Las columnas de material vaporizado se introducen mediante gas inerte con alta fidelidad temporal en la fuente de iones de plasma acoplada inductivamente para su análisis mediante el citómetro de masas. El procesamiento y la visualización de los datos se realizaron mediante Algoritmos Wolfram Mathematica® (V10.3) desarrollados internamente (Chang, et al., 2016. Scientific Reports, 6:36641). Las imágenes de cada canal de masa se reconstruyeron trazando las señales de disparo láser en el orden en que se registraron, escaneo de línea a escaneo de línea. Se superpusieron imágenes RGB para obtener las combinaciones de canales deseadas.

[0827] Para el análisis de citometría de masas, las células se dispersaron en 100 µL de agua desionizada y se añadió una alícuota (10-20 µl) de la solución madre de microesferas de referencia estándar (microesferas EQ-4). Posteriormente, se filtró en tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml con un filtro de células de 30 µm para eliminar posibles agrupaciones o agregados celulares. Se utilizó el instrumento Helios® de Fluidigm Canada (Markham, ON) para la adquisición de datos en formato FCS3.0. Los datos adquiridos se procesaron con el software FlowJo.

[0829] Se adquirieron cinco imágenes fluorescentes con un microscopio Zeiss Axiolmager M2 equipado con objetivos EC Plan-Neofluar de 10x y 20x (AN 0,3 y 0,5, respectivamente) y juegos de filtros Zeiss. Las imágenes se capturaron con una cámara digital monocromática Zeiss Axiocam 506 mediante el software Zen Pro.

[0831] Ejemplo 11: Conjugados peptídicos con marcadores de masa preparados mediante conjugación química de clic sin cobre de marcadores de masa basados en polímeros con terminación en azida y biomoléculas activadas con DBCO

[0833] También se empleó una estrategia de conjugación basada en química de clic para acoplar pequeñas moléculas peptídicas con marcadores de masa. La faloidina se utilizó como molécula peptídica modelo para la citometría de masas. La faloidina es un péptido bicíclico altamente selectivo que se utiliza para la tinción de filamentos de actina (también conocidos como F-actina) en células y secciones de tejido. El desarrollo de un reactivo de faloidina con etiqueta de masa resulta atractivo para visualizar o cuantificar filamentos de actina en secciones de tejido y células fijadas con formaldehído y permeabilizadas. Este reactivo se ha optimizado para transportar una etiqueta de masa por molécula de faloidina, lo que resultó en una tinción brillante de filamentos de actina en imágenes IMQ de células Hela y secciones de colon de ratón FFPE, teñidas con faloidina-<165>Ho y otros anticuerpos con etiqueta de masa (Figura 21).

[0835] Ejemplo 12: Conjugados de anticuerpos con etiqueta de masa preparados mediante conjugación química de clic sin cobre de un anticuerpo terminado en tetrazina y etiquetas de masa basadas en polímeros activados con TCO

[0836] Se utilizaron 25 polímeros con un grupo terminal TCO y un anticuerpo monoclonal anti-CD3(UCHT1) como sistema modelo. El anticuerpo se modificó primero con una fracción de tetrazina y luego se acopló con la etiqueta de masa TCO para generar anticuerpos marcados con masa. Para evaluar la eficiencia de esta estrategia de conjugación, se etiquetaron anticuerpos anti-CD3 azida y libre de carrera (LEAF) con el metal<170>Er utilizando los métodos de conjugación Maxpar, SPAAC y TCO-Tetrazina. El resultado de la prueba de funcionalidad de estos tres conjugados en células humanas Jurkat y Ramos mostró una sensibilidad comparable y una baja señal de fondo entre las tres químicas de conjugación (Figura 22A).

[0838] Dado que la azida sódica es el conservante más común utilizado para el almacenamiento de biomoléculas, es importante desarrollar una estrategia de conjugación que pueda realizarse sin la interferencia de la molécula de azida. Una ventaja de la ligación TCO-Tetrazina sobre el método de conjugación SPAAC es su capacidad para utilizarla para realizar la conjugación en presencia de la molécula de azida. Se utilizó Ab anti-CD3 humano purificado por cromatografía de afinidad que contenía 0,09% de azida sódica y EDTA para conjugar con la estrategia de marcaje TCO-Tetrazina y Maxpar. A partir del experimento de conjugación, no se observó interferencia de la molécula de azida durante el proceso de acoplamiento. El número de marcadores de masa por Ab fue similar (3-4 marcadores por Ab) a conjugaciones previas. La prueba de funcionalidad en células humanas Jurkat y Ramos también mostró resultados reproducibles, alta intensidad media positiva y bajo fondo (Figura 22B).

[0839] El desarrollo de conjugados Ab de doble marcaje para la comparación entre plataformas entre sistemas basados en fluorescencia y citometría de masas se ha convertido en un gran interés para varios investigadores recientemente. Sin embargo, la reproducibilidad de estos enfoques para diferentes objetivos Ab aún podría ser un desafío. En este ejemplo, se generaron con éxito conjugados de doble marcado mediante la reacción controlada para el marcado de fluoróforos y Ab, utilizando la estrategia convencional de conjugación de tiol-maleimida, seguida de la química de ligación de TCO-tetrazina para el marcado de fluoróforos y masa, respectivamente. Uno de los desafíos comunes durante la preparación del reactivo de doble marcado fue la capacidad de controlar el equilibrio entre el brillo del fluoróforo y la etiqueta de masa cuando se utiliza en plataformas basadas en fluorescencia y citometría de masas. Se probaron tres equivalentes molares diferentes (10, 20, 30) del colorante AlexaFluor594 por la cantidad de Ab, y cada uno produjo 4, 5 y 7 colorantes por molécula de Ab. La conjugación química de clic también produjo aproximadamente 3,5 etiquetas (~175 átomos/Ab) por Ab. Para probar la funcionalidad de los conjugados, se tiñeron células humanas Jurkat y Ramos con los tres conjugados. El resultado reveló que todos los conjugados de química clic mostraron una alta intensidad media positiva y una baja señal de fondo en comparación con el control Maxpar 25 (Figura 22C). Una posible aplicación prevista para los conjugados de doble marcado es su uso potencial para sistemas de IMQ e inmunofluorescencia, ya sea para la comparación de plataformas o el preescaneo de secciones de tejido que deben adquirirse por citometría de masas. Las Figuras 22D y 22E muestran imágenes representativas de IMQ (Fig. 22D) e IF (Fig. 22E) de secciones de tejido amigdalino humano congelado marcadas con el mAb CD3-170Er-AlexaFluor594 de doble marcado preparado mediante un método de conjugación de dos pasos (conjugación con tiol-maleimida para el marcado con fluoróforo y química clic para el marcado de masas). El resultado muestra que la distribución de células T positivas por CD3 en la imagen de IMQ fue consistente con lo observado para IF. Este resultado demuestra el potencial de los anticuerpos de doble etiqueta para aplicaciones que requieren una comparación entre plataformas basadas en fluorescencia y citometría de masas, así como un enriquecimiento previo o un escaneo rápido mediante microscopía de fluorescencia y un perfil profundo mediante IMQ.

[0840] Ejemplo 13: Conjugados de anticuerpos con etiqueta de masa, donde la etiqueta de masa es una proteína de unión a metal

[0841] Metalotioneína-1 de hígado de conejo (Enzo Life Sciences; ALX-202-072-M001), disuelta en un tampón de porción, se porción con una cantidad apropiada de ión metálico (Cd o Pt) a 50 mM y se lava varias veces en una columna de centrifugación de corte 3K con tampón a pH 7,5.

[0842] La metalotioneína-1 cargada con metal se hace reaccionar con tetrazina-PEG5-éster NHS.

[0843] El anticuerpo (p. ej., anticuerpo anti-CD20) se resuspende en un tampón a pH 7,5 y se hace reaccionar con transcicloocteno-PEG4-éster NHS.

[0844] El conjugado metálico CD20-metalotioneína-1-Cd se utiliza para teñir células vivas que expresan el marcador CD20 (Ramos) y células que no expresan CD20 (Jurkat). Las células se tiñen con CD45 e intercalador y se analizan mediante Helios.

[0845] Protocolo de conjugación:

[0846] 1. Se añaden 1,25 µL de tetrazina-PEG5-NHS a 100 µg de Ab en PBS hasta un equivalente molar de 10, seguido de una buena mezcla y una incubación a TA durante 2 h.

[0847] 2. Se añaden 2,5 µL de TCO-PEG4-NHS a 100 µg de proteína de unión a metal en PBS hasta un equivalente molar de 20, seguido de una buena mezcla y una incubación a TA durante 1 h.

[0848] 3. Ab y proteína de unión a metal se lavan en filtros de centrifugación; se resuspenden en PBS y se combinan en un filtro nuevo, seguido de una incubación a 37 ºC durante 1 h.

[0849] 4. La proteína de unión a metal Ab conjugada se lava posteriormente.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

1. Un miembro de par de unión específico (SBP) con etiqueta de masa, en el que comprende un SBP y una etiqueta de masa, donde el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador covalente, donde el enlazador está formado al menos en parte por un producto de reacción química de clic promovido por la deformación, y donde la etiqueta de masa comprende un polímero con una pluralidad de grupos quelantes de metales cargados con átomos marcadores del mismo isótopo metálico.

2. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 1, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un cicloalquino deformado y una azida, por ejemplo, DBCO y una azida.

3. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 2, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende un triazol, opcionalmente donde el grupo triazol del enlazador forma parte de una estructura multianular.

4. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 3, en el que la estructura multianular comprende un grupo dibenzocicloocteno, opcionalmente donde:

(i) el grupo triazol está separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno; o

(ii) el grupo dibenzocicloocteno está separado del SBP por el grupo triazol.

5. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 1, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un cicloalqueno deformado y una tetrazina, por ejemplo, TCO y una tetrazina.

6. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 5, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende una piridazina, donde opcionalmente el grupo piridazina del enlazador forma parte de una estructura multianular.

7. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 6, en el que la estructura multianular comprende un grupo ciclooctano, donde opcionalmente:

(i) el grupo piridazina está separado del SBP por el grupo ciclooctano; o

(ii) el grupo ciclooctano está separado del SBP por el grupo piridazina.

8. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 1, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende el producto de reacción de un cicloalquino deformado y una nitrona, por ejemplo, DBCO y una nitrona.

9. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 8, en el que el SBP y la etiqueta de masa están unidos por un enlazador que comprende un isoxazol, donde opcionalmente el grupo isoxazol del enlazador forma parte de una estructura multianular.

10. El SBP con etiqueta de masa de la reivindicación 3, en el que la estructura multianular comprende un grupo dibenzocicloocteno, donde opcionalmente:

(i) el grupo isoxazol está separado del SBP por el grupo dibenzocicloocteno; o

(ii) el grupo dibenzocicloocteno está separado del SBP por el grupo isoxazol.

11. El SBP con etiqueta de masa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el componente enlazador comprende al menos un espaciador, opcionalmente de polietilenglicol (PEG), poli(N-vinilpirrolido) (PVP), poliglicerol (PG), poli(N-(2-hidroxipropil)metacrilamida), polioxazolina (POZ, como polimetiloxazolina, polietiloxazolina o polipropiloxazolina) o un espaciador de alquilo no cíclico C5-C20, opcionalmente de PEG con entre 3 y 12 unidades de etilenglicol.

12. Un kit que comprende dos o más SBP con etiqueta de masa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, opcionalmente donde el kit comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o al menos 100 de los SBP con etiqueta de masa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y donde cada etiqueta de masa comprende un isótopo diferente.

13. Un método para fabricar el SBP con etiqueta de masa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende los pasos de:

(i) proporcionar el SBP y una etiqueta de masa que comprende un polímero que comprende una pluralidad de grupos quelantes de metales cargados con átomos marcadores del mismo isótopo metálico; y

(ii) conjugar el SBP con dicha etiqueta de masa, en donde al menos un paso en la conjugación comprende una reacción de química de clic promovida por tensión.