ES3051687T3 - Antimicrobial platelet-like particles - Google Patents

Antimicrobial platelet-like particles

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ES3051687T3
ES3051687T3 ES19746617T ES19746617T ES3051687T3 ES 3051687 T3 ES3051687 T3 ES 3051687T3 ES 19746617 T ES19746617 T ES 19746617T ES 19746617 T ES19746617 T ES 19746617T ES 3051687 T3 ES3051687 T3 ES 3051687T3
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ultralow
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Ashley Brown
Erin Sproul
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North Carolina State University
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Abstract

Se describen aquí partículas plaquetarias que incorporan nanopartículas metálicas antimicrobianas. Estas partículas incluyen un microgel polimérico de reticulación ultrabaja y una fracción dirigida a la fibrina. Las nanopartículas metálicas antimicrobianas pueden incorporarse covalente o no covalentemente a las partículas plaquetarias. Estas partículas son útiles para detener hemorragias y promover la cicatrización de heridas, a la vez que suprimen las infecciones bacterianas que pueden acompañar al daño tisular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Partículas antimicrobianas similares a plaquetas
[0005] Referencia cruzada a solicitud relacionada
[0007] Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 62/625,020, presentada el 1 de febrero de 2018.
[0009] Campo de la invención
[0011] La invención se dirige a partículas similares a plaquetas que contienen nanopartículas metálicas antimicrobianas.
[0012] Antecedentes
[0014] La hemorragia traumática sigue siendo un problema clínico importante a pesar de décadas de investigación. De acuerdo con los CDC, las lesiones son la principal causa de muerte en hombres y mujeres entre las edades de 1 a 44, y muchas víctimas de traumatismos suelen desangrarse antes de llegar al hospital. Incluso en los pacientes en los que se consigue la hemostasia, la posterior reparación de la herida puede verse obstaculizada por varios factores de complicación, incluido un mayor riesgo de infección el cual puede ser mortal. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas terapias para tratar las heridas de las víctimas de traumatismos para prevenir la hemorragia y la infección subsiguiente. Los tratamientos clínicos actuales para las hemorragias son los agentes hemostáticos mecánicos, tales como las esponjas de colágeno y gelatina, los agentes hemostáticos activos, tales como la trombina, los agentes hemostáticos fluidos y los sellantes de fibrina. Aunque estos materiales son eficaces para tratar heridas más pequeñas, son limitados en el tratamiento de hemorragias masivas. Además, todos estos materiales se aplican tópicamente y no pueden utilizarse para tratar hemorragias internas. Estas limitaciones motivan la necesidad de desarrollar terapéuticos para tratar las hemorragias y dirigirse a las hemorragias internas.
[0016] En el organismo, la coagulación ocurre en respuesta a una lesión con el fin de detener el sangrado mediante la formación de coágulos de fibrina ricos en plaquetas. Inmediatamente después de la lesión, las plaquetas se activan, se agregan y aumentan la formación de fibrina. Las plaquetas se unen a las fibras de fibrina a través de las integrinas aiibp<3>. Estas interacciones reticulan y estabilizan el coágulo en desarrollo, aumentando así la rigidez de la matriz, lo cual es una clave central para orquestar los eventos de cicatrización de heridas. A continuación, las plaquetas se extienden dentro de la red de fibrina y modifican activamente las propiedades de la red con el paso del tiempo, retrayendo el coágulo y aumentando así la densidad de la fibrina. La formación de coágulos es un primer paso esencial para lograr el cese de la hemorragia e involucra la formación de un tapón de plaquetas incrustado dentro de una malla de fibrina. Con el tiempo, las plaquetas contraen el coágulo de fibrina, lo cual estabiliza la red y contribuye a mejorar los resultados de cicatrización de las heridas.
[0018] Recientemente ha habido interés en imitar las propiedades biológicas de las plaquetas con partículas sintéticas. Estas típicamente comprenden una plataforma de nanopartículas tal como glóbulos rojos (RBC por sus siglas en inglés), partículas de albúmina, liposomas, perlas de látex que están decoradas en su superficie con péptidos o ligandos. Estas partículas recrean características biológicas específicas de las plaquetas, incluyendo el direccionamiento de heridas y sitios de enfermedades y la facilitación de la agregación plaquetaria. Fueron encontrados ejemplos notables que incluyen las plaquetas sintéticas compuestas por un núcleo de PLGA-PLL con brazos de PEG terminados con restos de RGD para unir plaquetas y favorecen agregación de plaquetas. Además, se ha demostrado que los liposomas decorados con motivos de unión de vWF y colágeno imitan los mecanismos de adhesión de las plaquetas al sitio de la herida bajo flujo. Otros esfuerzos en el diseño de plaquetas sintéticas se han centrado en igualar la forma y la mecánica de las plaquetas para recrear la marginación. Otros han explorado partículas deformables con morfología discoidal similar a la de las plaquetas, por ejemplo, un hidrogel nanocompuesto que contiene gelatina y nanoplaquetas de silicato que ocluía el flujo sanguíneo en arterias y venas de ratones y cerdos. El documento US 2016/271292 A1 divulga microgeles de reticulación ultrabaja fabricados con un polímero de reticulación ultrabaja. Los microgeles, también denominados como Partículas Similares a las Plaquetas (PLP por sus siglas en inglés), tienen preferiblemente densidades de reticulación de <0,5 %. Uno o más de los polímeros se conjugan con un elemento o resto de unión a la fibrina, preferentemente H6. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen los microgeles de unión a fibrina, los cuales pueden ser utilizados para promover o inducir la hemostasia. Los dispositivos médicos, tales como los apósitos para heridas, pueden recubrirse con los microgeles de unión a fibrina.
[0020] Se ha evaluado previamente la eficacia de las partículas similares a las plaquetas en la coagulación. Se ha demostrado que las partículas similares a las plaquetas (PLP) desarrolladas recientemente recapitulan funciones clave de las plaquetas endógenas, incluyendo el aumento de la coagulación del plasma adultoin vitro,la reducción de los tiempos de sangradoin vivoen modelos de roedores con lesiones traumáticas, la localización específica de los sitios de lesión y la retracción del coágulo. La retracción del coágulo es una característica importante para la estabilidad del coágulo y la reparación de heridas. La característica de retracción del coágulo de los PLP es el resultado del alto grado de deformabilidad del microgel y la gran capacidad de unión a la fibrina conferido por un anticuerpo de unión a fibrina.
[0021] Sigue existiendo la necesidad de composiciones adicionales que puedan promover la cicatrización de heridas, así como suprimir las infecciones microbianas. Sigue existiendo la necesidad de composiciones biocompatibles que puedan ser utilizadas para tratar lesiones internas.
[0023] Breve descripción
[0025] En el presente documento se divulgan partículas similares a plaquetas que incorporan nanopartículas metálicas antimicrobianas. Las partículas similares a plaquetas incluyen un microgel polimérico de reticulación ultrabaja y un resto que se dirige a la fibrina. El polímero de reticulación ultrabaja comprende una poliacrilamida, un poli(ácido acrílico), un polietilenglicol, un alcohol polivinílico, un polisacárido, una polivinilpirrolidona o un copolímero de los mismos, y el polímero de reticulación ultrabaja tiene una densidad de reticulación no superior al 2,5 %. Las nanopartículas metálicas antimicrobianas pueden incorporarse de forma covalente o no covalente a las partículas similares a plaquetas. Las partículas son útiles para favorecer la coagulación y la posterior cicatrización de las heridas, mientras que al mismo tiempo suprimen las infecciones bacterianas que pueden acompañar al daño tisular. Los detalles de una o más realizaciones se exponen en las descripciones siguientes. Otras características, objetos y ventajas se desprenderán de la descripción y de las reivindicaciones.
[0027] Breve descripción de las figuras
[0029] Figura 1: Se formaron microgeles que contenían oro mediante métodos no covalentes y covalentes para obtener compuestos de nano-oro (NGC por sus siglas en inglés). En el método de fabricación no covalente, A, los microgeles liofilizados se rehidratan con una solución que contiene nanoesferas de oro. B, Los NGC covalentes se forman en un proceso de 2 pasos para sembrar cloruro de oro (III) y luego hacer crecer el oro en nanopartículas de mayor tamaño. Figura 2: La microscopía electrónica de transmisión demostró la distribución homogénea de las nanopartículas de oro a través de los microgeles. Se muestran imágenes TEM representativas para microgeles ULC y microgeles compuestos de nano-oro covalentes (cNGC por sus siglas en inglés). También se determinó el número promedio de partículas nanométricas/microgel /- SD para al menos 10 microgeles/grupo.
[0030] Figura 3: La microscopía electrónica de transmisión demostró una distribución homogénea del oro a través de los microgeles. También se encontró que los ncNGC son muy estables durante el transcurso de múltiples meses. Se muestran imágenes TEM representativas de microgeles ULC y microgeles ncNGC tomadas inmediatamente después de su fabricación (A) y >2 meses después de su fabricación (B). También se determinó el número promedio de partículas nanométricas/microgel /- SD para al menos 10 microgeles/grupo.
[0031] Figura 4: Caracterización por AFM del tamaño y la dispersión de los NGC. El tamaño y la deformabilidad del microgel como una medida de la capacidad de dispersión sobre una superficie de vidrio se determinó con AFM utilizando un MFP-3D BIO AFM (Asylum Research, Santa Barbara, CA). Se generaron trazos de diámetro y altura con el software Asylum AFM para al menos 30 microgeles por condición a partir de al menos 3 imágenes diferentes. Se muestran imágenes representativas y trazos de altura. Las relaciones de aspecto (anchura: altura) se calcularon para al menos 30 microgeles basándose en las mediciones de los trazos de diámetro y altura. *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001. Las relaciones de aspecto del nanocompuesto de oro no covalente y del nanocompuesto de oro covalente siguieron siendo elevadas después de la incorporación del oro, por lo que se mantuvo la deformabilidad.
[0032] Figura 5: La morfología CryoSEM es similar a la de las plaquetas nativas. Las plaquetas circulantes nativas muestran una morfología ovoide, A, que tras la activación con 0,25 U/mL de trombina, forma proyecciones fusiformes ilustradas en B. La morfología del microgel se visualizó con un JEOL 7600F CryoSEM a un aumento de 50000X (barra de escala = 500 nm). Los microgeles sin carga (C) ilustran una morfología similar a la de las plaquetas nativas, la cual no se ve afectada por la incorporación de nanoesferas de oro de diferentes diámetros incluyendo 5 nm (D), 50 nm (E) y 100 nm (F). Los NGC covalentes también muestran una morfología fusiforme en diferentes formulaciones de síntesis: 1X (G), 2X (H), y 3X (I).
[0033] Figura 6: CryoSEM de la ultraestructura de la fibrina demuestra que la retracción del coágulo mediada por PLP no se ve afectada por la incorporación de oro. La fibrina formada en presencia de PLP, microgeles deformables conjugados con anticuerpos de unión a fibrina, mediaron el colapso del coágulo después de 24 horas (C) caracterizado por el aumento de la densidad del coágulo de fibrina y la disminución de la porosidad en comparación con la fibrina sola (A) y en la presencia de microgeles sin unión a fibrina (B). La incorporación no covalente de oro (D-F) no disminuyó el efecto de retracción. La incorporación de oro covalente (G-I) resultó en la retracción del coágulo, pero no en la misma medida que el oro no covalente.
[0034] Figura 7: Los NGC inhiben el crecimiento bacteriano. Se crearon películas delgadas de microgel sobre vidrio funcionalizado al depositar activamente microgeles de ULC y NGC suspendidos con centrifugación (3700 g x 10 min). Las películas se enjuagaron y se esterilizaron con UV antes de cultivarlas con 0,5 mL deE. coli(105 CFU/mL) durante 12 horas a 37 °C. A, Se realizó una tinción viva/muerta BacLight modificada en las películas lavadas para observar laE. coliadherida (n=4). Se observó una clara reducción del crecimiento deE. Colien las películas de NGC en comparación con las películas de microgel de ULC sin carga, como se demostró en C, que muestra la fluorescencia media corregida /- desviación estándar por un mínimo de 3 imágenes por película (n=4 películas/condición) cuantificada con ImageJ (Fluorescencia total corregida = Densidad integrada - (Área de selección rect. x Fluorescencia media de 2 selecciones de fondo por imagen). El análisis estadístico se realizó con un ANOVA de una vía y la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Tukey. *p<0,5.
[0035] Figura 8: Efecto de los microgeles compuestos de nanoplata (NSC) en las hemorragiasin vivo.La pérdida total de sangre en el modelo de ratón con laceración de hígado se reduce significativamente con el tratamiento con PLP y compuesto de PLP covalente de nanoplata en comparación con el control salino. *p<0,05.
[0037] Descripción detallada
[0039] Antes de divulgar y describir los presentes métodos y sistemas, debe entenderse que los métodos y sistemas no se limitan a métodos sintéticos específicos, componentes específicos o a composiciones particulares. Asimismo, debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene por objeto describir sólo realizaciones particulares y no pretende ser limitativa.
[0041] Tal como se utilizan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Los intervalos pueden expresarse en el presente documento como desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra realización incluye desde el un valor particular y/o hasta el otro valor particular. Del mismo modo, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final.
[0043] "Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito a continuación puede o no puede ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.
[0045] A lo largo de la descripción y reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprende" y variaciones de la palabra, tales como "que comprende" y "comprendiendo", significa "incluye, pero no se limita a", y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, enteros o pasos. "Ejemplar" significa "un ejemplo de" y no pretende transmitir una indicación de una realización preferida o ideal. "Tales como" no se utiliza en sentido restrictivo, sino con fines explicativos.
[0047] Se divulgan componentes que pueden ser utilizados para realizar los métodos y sistemas divulgados. Estos y otros componentes se divulgan en el presente documento, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos componentes, aunque no se divulgue explícitamente una referencia específica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de los mismos, cada una de ellas se contempla y describe específicamente en el presente documento, para todos los métodos y sistemas. Esto aplica a todos los aspectos de esta solicitud, incluidos, pero no limitados a, los pasos en los métodos divulgados. Por lo tanto, si hay una variedad de pasos adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada uno de estos pasos adicionales se puede realizar con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos divulgados.
[0049] En el presente documento se divulgan microgeles altamente deformables que funcionan como plaquetasin vivo.Los microgeles incluyen al menos un polímero de reticulación ultrabaja, un resto de unión a fibrina y una nanopartícula metálica antimicrobiana. Los polímeros de reticulación ultrabaja adecuados incluyen poliacrilamidas, poliacrilatos, poli(ácidos acrílicos), polietilenglicoles, alcoholes polivinílicos, polisacáridos, polivinilpirrolidonas y copolímeros de los mismos. Cuando el polímero de reticulación ultrabaja es un copolímero, puede ser un copolímero aleatorio o un copolímero en bloque. Los polímeros de reticulación ultrabaja se caracterizan por un bajo grado de reticulación en la red polimérica. La densidad de reticulación puede ser no superior al 2,5 %, no superior al 2,0 %, no superior al 1,5 %, no superior al 1,0 %, no superior al 0,75 %, no superior al 0,50 %, no superior al 0,25 %, no superior al 0,10 %, o no superior al 0,05 %.
[0051] A menos que se indique lo contrario, el término "poliacrilamida" incluye el polímero de poliacrilamida no sustituido, así como poli(N-alquilacrilamidas) y poli(N,N-dialquilacrilamidas). La N-alquilacrilamida puede ser una N-alquilacrilamida de C<1>-C<4>, la N,N-dialquilacrilamida puede ser una N,N-di(C<1>-C<4>)alquilacrilamida. Los grupos alquilo en las N,N-dialquilacrilamidas pueden ser los mismos, o pueden ser diferentes. El polímero de reticulación ultrabaja puede derivarse de uno o más monómeros tales como metilacrilamida, etilacrilamida, n-propilacrilamida, iso-propilacrilamida, n-butilacrilamida, iso-butilacrilamida, sec-butilacrilamida, ter-butilacrilamida, dimetilacrilamida, dietilacrilamida, di-npropilacrilamida, di-iso-propilacrilamida, N-metil-N-etilacrilamida, N-metil-N-n-propilacrilamida, N-etil-N-npropilacrilamida, N-metil-N-iso-propilacrilamida y N-etil-N-iso-propilacrilamida. En algunos casos, el polímero de reticulación ultrabaja se deriva de monómeros que incluyen N-isopropilacrilamida, N-isopropilmetacrilamida, N,N-dietilacrilamida o un copolímero de los mismos.
[0053] En ciertas realizaciones, el polímero de reticulación ultrabaja puede ser un copolímero de una o más poliacrilamidas (como se ha definido anteriormente) y ácido acrílico. Generalmente, dichos copolímeros pueden prepararse a partir de una reacción de polimerización por precipitación de una mezcla de ácido acrílico y monómeros de acrilamida adecuados. El componente de ácido acrílico puede estar presente en una cantidad no superior al 40 %, no superior al 30 %, no superior al 20 %, no superior al 10 %, no superior al 9 %, no superior al 8 %, no superior al 7 %, no superior al 6 %, no superior al 5 %, no superior al 4 %, no superior al 3 %, no superior al 2 %, o no superior al 1 % en peso de la mezcla total de monómeros. La polimerización por precipitación puede llevarse a cabo utilizando un iniciador de radicales libres tal como el persulfato de amonio (APS por sus siglas en inglés) o el 2,2'azobis(amidinopropano)dihidrocloruro.
[0055] La reacción de precipitación puede llevarse a cabo en ausencia de cualquier agente reticulante exógeno. En dichos casos, la reticulación toma lugar por medio de mecanismos de transferencia de cadena. Dichos procesos se denominan reacciones de autoreticulación, que producen polímeros autoreticulados. En otro caso, la precipitación puede llevarse a cabo utilizando un agente reticulante exógeno, por ejemplo, acrilatos polifuncionales y acrilamidas polifuncionales tales como W,W-metilenbis(acrilamida), N,N-(1,2-dihidroxietileno)bisacrilamida, diacrilato de etilenglicol, diacrilato de di(etilenglicol), diacrilato de tetra(etilenglicol), dimetacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de di(etilenglicol) y dimetacrilato de tri(etilenglicol).
[0057] El polímero de reticulación ultrabaja puede tener un radio hidrodinámico, en el estado colapsado, de 0,05-20 pm, de 0,05-15 pm, de 0,05-10 pm, de 0,1-10 pm, de 0,2-10 pm, de 0,5-10 pm, de 1-10 pm, de 2-10 pm, de 5-10 pm, de 0,2­ 8 pm, de 0,2-6 pm, de 0,2-4 pm, de 0,2-2 pm, de 0,2-1 pm, de 0,5-8 pm, de 0,5-6 pm, de 0,5-4 pm, o de 0,5-2 pm.
[0058] Los microgeles divulgados en el presente documento pueden tener un volumen en estado hidratado que está entre 0,05-50 pm3, entre 0,05-25 pm3, entre 0,05-10 pm3, entre 0,05-5 pm3, entre 0,1-5 pm3, entre 0,1-2,5 pm3, entre 0,1-2 pm3, entre 0,1-1,5 pm3, entre 0,1-1 pm3, entre 0,25-1 pm3, o entre 0,25-0,75 pm3.
[0060] Los microgeles divulgados en el presente documento son altamente deformables. Por ejemplo, en el estado colapsado el microgel se deforma de tal manera que el diámetro de extensión del microgel es al menos 10x, al menos 15x, al menos 20x, al menos 25x, al menos 30x, al menos 40x, al menos 50x, al menos 100x, al menos 250x, al menos 500x, al menos 750x, o al menos 1.000x la altura del microgel. En algunas realizaciones, en el estado colapsado el microgel se deforma de tal manera que el diámetro de extensión del microgel es de 10x-1.000x, de 25x-1.000x, de 50x-1.000x, de 100x-1.000x, de 250x-1.000x, o de 500x-1.000x la altura del microgel.
[0062] Los microgeles deformables también incluyen al menos un resto de unión a fibrina, por ejemplo, anticuerpos IgG de unión a la fibrina, péptidos de unión a la fibrina (imitadores del nódulos de fibrina), anticuerpos de unión al fragmento D, así como otros fragmentos de anticuerpos que se unen a la fibrina. En la publicación estadounidense 2016/0271292, en [0050-0057], se divulgan restos de unión a fibrina ejemplares. Los restos de unión a fibrina pueden ser conjugados con el polímero de reticulación ultrabaja utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, utilizando la química EDC/NHS estándar.
[0064] Los microgeles divulgados en el presente documento incluyen nanopartículas metálicas antimicrobianas. Las nanopartículas metálicas antimicrobianas adecuadas incluyen nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de cobre, nanopartículas de aluminio, nanopartículas de zinc y mezclas de las mismas. Las nanopartículas metálicas antimicrobianas pueden tener un tamaño promedio de partícula no superior a 1.000 nm, no superior a 750 nm, no superior a 500 nm, no superior a 250 nm, no superior a 100 nm, no superior a 75 nm, no superior a 50 nm, no superior a 25 nm, no superior a 15 nm, no superior a 10 nm, no superior a 5 nm, no superior a 2,5 nm o no superior a 1,0 nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas metálicas antimicrobianas pueden tener un tamaño promedio de partícula de 1,0-1.000 nm, de 1,0-750 nm, de 1,0-500 nm, de 1,0-250 nm, de 1,0-100 nm, de 1,0-75 nm, de 1,0-50 nm, de 1,0-n 25 nm, de 1,0-15 nm, de 1,0-10 nm, de 1,0-5 nm, de 1,0-2,5 nm, de 5-200 nm, de 10-200 nm, de 15-200 nm, de 25-200 nm, de 50-200 nm, de 75-200 nm, o de 100-200 nm.
[0066] Los microgeles pueden incluir nanopartículas metálicas antimicrobianas en una variedad de cargas diferentes. En algunos casos, las nanopartículas metálicas antimicrobianas están presentes en una cantidad, por gramo de microgel, de al menos 5 ng, al menos 10 ng, al menos 20 ng, al menos 25 ng, al menos 50 ng, al menos 100 ng, al menos 250 ng, al menos 500 ng, al menos 750 ng, al menos 1.000 ng, al menos 2.500 ng, al menos 5.000 ng, al menos 7.500 ng, o al menos 10.000 ng. En algunas realizaciones, las nanopartículas metálicas antimicrobianas están presentes en una cantidad, por gramo de microgel, de 5-10.000 ng, de 5-5.000 nm, de 5-2.500 ng, de 5-1.000 ng, de 5-500 ng, de 5-250 ng, de 5-100 ng, de 5-50 ng, de 5-25 ng, de 100-2.500 ng, de 500-2.500 ng, de 1.000-2.500 ng, de 2.500-10.000 ng, o de 5.000-10.000 ng.
[0068] En ciertas realizaciones, la cantidad de nanopartículas (NP) metálicas antimicrobianas en el microgel puede caracterizarse por el número de nanopartículas por unidad de volumen de microgel. Por ejemplo, las nanopartículas metálicas antimicrobianas pueden estar presentes en una cantidad entre 1-1.000 nanopartículas por pm3 de microgel (es decir, 1-1.000 np/pm3), entre 25-1.000 np/pm3, entre 50-1.000 np/pm3, entre 75-1.000 np/pm3, entre 100-1.000 np/pm3, entre 250-1.000 np/pm3, entre 500-1.000 np/pm3, entre 750-1.000 np/pm3, entre 25-100 np/pm3, entre 100­ 250 np/pm3, entre 250-500 np/pm3, entre 500-750 np/pm3, entre 250-750 np/pm3, entre 1-100 np/pm3, entre 25-250 np/pm3, o entre 25-500 np/pm3.
[0070] Los microgeles divulgados en el presente documento pueden ser obtenidos al incorporar nanopartículas metálicas antimicrobianas a un polímero de reticulación ultrabaja, y conjugando un resto de unión a fibrina al polímero de reticulación ultrabaja. En algunos casos, las nanopartículas metálicas antimicrobianas se incorporan antes de la conjugación del resto de unión a fibrina, mientras que, en otros, las nanopartículas metálicas antimicrobianas se incorporan después de la conjugación del resto de unión a fibrina.
[0071] La incorporación de las nanopartículas metálicas antimicrobianas puede lograrse por medios covalentes o no covalentes. Para obtener una incorporación no covalente, un microgel de reticulación ultrabaja secado (el cual puede o no estar conjugado a un resto de unión a fibrina) puede hincharse en una composición acuosa que incluya nanopartículas metálicas antimicrobianas. La composición acuosa incluye las nanopartículas metálicas antimicrobianas en una concentración de al menos 0,01 mg/mL, al menos 0,02 mg/mL, al menos 0,03 mg/mL, al menos 0,04 mg/mL, al menos 0,05 mg/mL, al menos 0,06 mg/mL, al menos 0,7 mg/mL, al menos 0,08 mg/mL, al menos 0,09 mg/mL, al menos 0,1 mg/mL, al menos 0,25 mg/mL, al menos 0,50 mg/mL, al menos 0,75 mg/mL, o al menos 1,0 mg/mL. En algunas realizaciones, la composición acuosa incluye las nanopartículas metálicas antimicrobianas en una concentración de 0,01-1 mg/mL, de 0,02-1 mg/mL, de 0,05-1 mg/mL, de 0,1-1 mg/mL, de 0,25-1 mg/mL, de 0,5-1 mg/mL, de 0,75-1 mg/mL, de 0,02-0,25 mg/mL, de 0,02-0,1 mg/mL, de 0,1-0,5 mg/mL, o de 0,1-0,25 mg/mL.
[0073] La incorporación covalente de nanopartículas metálicas antimicrobianas puede lograrse mediante la reducción de una sal metálica apropiada en presencia de un polímero de reticulación ultrabaja seco (el cual puede o puede no ser conjugado a un resto de unión a fibrina). Las sales metálicas adecuadas incluyen las sales de Au1+, Au3+, Ag1+, Cu1+, Cu2+, Cu3+, Zn2+, y A13+. Pueden utilizarse mezclas de dos o más sales metálicas diferentes, lo cual puede dar lugar a nanopartículas metálicas mixtas, por ejemplo, Zn/Ag.
[0075] En un primer aspecto de la invención se proporciona un microgel para usarse en un método de promoción de la cicatrización de heridas en un sujeto que comprende administrar al sujeto los microgeles divulgados en el presente documento.
[0077] La herida a ser curada puede estar presente en cualquier órgano o tejido, incluyendo órganos o tejidos internos o tejidos externos, tal como la piel. La herida puede ser el resultado de una lesión, mordedura o quemadura. El órgano o tejido puede ser cualquiera o varios de piel, músculo, hígado, riñones, pulmones, corazón, páncreas, bazo, estómago, intestinos vejiga, ovarios, testículos, útero, cartílago, tendón, ligamento, hueso y similares. En determinadas realizaciones, la herida se encuentra en la piel y/o en el músculo.
[0079] En algunas realizaciones, el microgel se administra poco después de que se produzca la herida. En otras realizaciones, la herida es una herida crónica que no se ha curado en días, semanas, meses o años. En otras realizaciones, la herida es una herida existente la cual no se ha curado a un ritmo normal o que no ha respondido a otras terapias.
[0081] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "herida" se refiere a la interrupción física de la continuidad o integridad de la estructura tisular. Las heridas pueden ser agudas o crónicas e incluyen cortes y laceraciones, incisiones o heridas quirúrgicas, pinchazos, rozaduras, arañazos, heridas por compresión, abrasiones, heridas por fricción, úlceras por decúbito (p. ej., úlceras por presión o de decúbito); heridas por efecto térmico (quemaduras por frío y por golpes), heridas químicas (por ejemplo, quemaduras por ácido o alcalinos) o infecciones patógenas (por ejemplo, víricas, bacterianas o fúngicas), incluidos forúnculos abiertos o intactos, erupciones cutáneas, manchas y acné, úlceras, heridas crónicas. (incluidas las heridas asociadas a la diabetes, tales como las úlceras de la parte inferior de la pierna y del pie, las úlceras venosas de la pierna y las úlceras por presión), los sitios donantes y receptores de injertos/trasplantes de piel, las afecciones de respuesta inmunitaria, la psoriasis eg y el eccema, las úlceras estomacales o intestinales, las heridas orales, incluidas las úlceras de la boca, los cartílagos o huesos dañados, las heridas de amputación y las lesiones de la córnea.
[0083] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "herida crónica" se refiere a una herida que no ha cicatrizado dentro de un periodo de tiempo normal para la cicatrización en un sujeto por lo demás sano. Las heridas crónicas pueden ser aquellas que no cicatrizan debido a la salud del sujeto, por ejemplo, cuando el sujeto tiene mala circulación o una enfermedad tal como la diabetes, o cuando el sujeto toma una medicación que inhibe el proceso normal de cicatrización. La cicatrización también puede verse afectada por la presencia de una infección, tal como una infección bacteriana, fúngica o parasitaria. En algunos casos, una herida crónica puede permanecer sin cicatrizar durante semanas, meses o incluso años. Ejemplos de heridas crónicas incluyen, pero no se limitan a, úlceras diabéticas, úlceras por presión y úlceras tropicales (es decir, jungle rot).
[0085] Los microgeles de la invención también pueden aplicarse a una herida la cual esté cicatrizando o que haya cicatrizado con una cicatrización excesiva. Ejemplos de dichas heridas son las que están produciendo o han producido cicatrices queloides o cicatrices hipertróficas.
[0087] En algunas realizaciones, la herida está infectada con una infección bacteriana. La infección bacteriana puede estar causada por una bacteria Gram positiva o Gram negativa, especialmente una bacteria Gram positiva. Ejemplos no limitantes de bacterias que son controladas por los microgeles de la invención incluyen bacterias del GéneroBacillus,tales comoB. subtilis, B. anthracis, B. cereus. B. firmis. B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. coagulans, B. pantothenticus, B. alvei, B. brevis, B. circubins, B. laterosporus, B. macerans, B. polymyxa, B. stearothermophilus, B. thuringiensisyB. sphaericus: Staphylococcustal como S.aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus; Streptococcus,por ejemplo, S.pyrogenes, S. pneumoniae, S. alagactiae, S. dysgalactiae. S. equisinilis, S. equi, S. zooepidemicus, S. anginosus, S. salwarius. S. milleri, S. sanguis, S. mitior, S. mutans, S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus. S. uberusy S.avium; Aerococcusspp.,Gemellaspp.,Corynebacteriumspp.,Listeriaspp.,Kurthiaspp.,Lactobacillusspp.,Erysipelothrixspp.,Arachniaspp.,Actinomycesspp.,Propionibacteriumspp.,Rothiaspp.,Bifidobacteriumspp.,Clostridiumspp.,Eubacteriumspp.,Serratiaspp.,Klebsiellaspp..Proteusspp.,Enterococcusspp.,Pseudomonasspp..Nocardiaspp. yMycobacteriumspp.
[0088] En algunas realizaciones, la herida está infectada con una infección fúngica. La infección fúngica puede estar causada por hongos filamentosos o levaduras. Ejemplos no limitantes de hongos que son controlados por el microgel incluyen hongos del Género tales comoAspergillusspp.,Mucor spp., Trichtophytonspp.,Cladosporiumspp.,Ulocladiumspp.,Curvulariaspp.,Aureobasidiumspp.,Candida albicans. Candidaspp.,Cryptococcusspp.,Malessezia pachydermatis, Malesseziaspp. yTrichosporonspp.
[0089] En algunas realizaciones, la herida está infectada tanto por infecciones tanto bacterianas como fúngicas. incluyendo en biopelículas.
[0090] Los microgeles pueden utilizarse ventajosamente en una amplia variedad de contextos de cicatrización de heridas, utilizando una variedad de composiciones diferentes para su aplicación en el sitio de la herida. Por ejemplo, los microgeles pueden utilizarse con un apósito para heridas el cual puede entrar en contacto directamente con una herida. Los microgeles pueden ser impregnados en un apósito para heridas o recubierto en el apósito para heridas usando técnicas convencionales. El apósito de la herida puede estar hecho de un gel de fibrina. El apósito de la herida también puede estar hecho de materiales absorbentes tales como algodón o vellón. El apósito de la herida también puede estar hecho de fibras sintéticas, por ejemplo, fibras de poliamida. En ciertas realizaciones, el apósito de la herida puede tener múltiples capas, incluyendo una capa adhesiva, una capa absorbente y una capa reguladora de la humedad. En otras realizaciones, el microgel puede dispersarse en una solución inyectable, ya sea intravenosa, intraperitoneal o directamente inyectada en el área de la herida. En realizaciones adicionales, el microgel puede liofilizarse y mezclarse con uno o más portadores farmacéuticos, y formularse en pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos.
[0091] Los microgeles divulgados pueden utilizarse como sellador o adhesivo tisular para sellar roturas o heridas abiertas al promover la coagulación de la sangre. Los microgeles pueden formularse como polvo seco o suspensión acuosa y envasarse en paquetes o unidades discretas para formar un kit. Los agentes hemostáticos y sellantes quirúrgicos, incluidos los microgeles divulgados, pueden utilizarse como ayuda para detener la hemorragia durante la cirugía, ya sea mecánicamente o al aumentar la respuesta del organismo a la coagulación.
[0092] Aunque los microgeles pueden administrarse puros, puede ser más conveniente administrar los microgeles en forma de composición farmacéutica junto con un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0093] La forma de dosificación y las tasas para el uso farmacéutico y las composiciones son fácilmente determinables por una persona experta en la materia.
[0094] Las formas de dosificación incluyen tabletas, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, troqueles, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdérmicos, apósitos impregnados (oclusivos), cremas, geles y similares. Estas formas de dosificación también pueden incluir dispositivos de inyección o implantación diseñados específicamente para, o modificados para, la liberación controlada del microgel. La liberación controlada del microgel puede efectuarse recubriendo el mismo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos, incluyendo resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos poliáctico y poliglicólico y ciertos derivados de la celulosa, tales como la hidroxipropilmetilcelulosa. Además, la liberación controlada puede verse afectada por el uso de otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.
[0095] También pueden ser incorporados a las composiciones de esta invención portadores farmacéuticamente aceptables y portadores aceptables para administración sistémica.
[0096] De manera adecuada, la composición farmacéutica incluye al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable o un excipiente aceptable. Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" se entiende una sustancia sólida o líquida de relleno, diluyente o encapsulante que puede ser utilizada con seguridad. Dependiendo de la vía de administración particular, pueden ser utilizados diversos portadores, bien conocidos en la técnica. Estos portadores o excipientes pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina u otros agentes gelificantes, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, alcoholes y/o polioles, ácido algínico, soluciones amortiguadas con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua libre de pirógenos.
[0097] Puede emplearse cualquier vía de administración adecuada para proporcionar la composición farmacéutica a un paciente humano o no humano. Por ejemplo, puede emplearse por vía oral, tópica, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intraarticular, intramuscular, intradérmica, subcutánea, inhalatoria, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmica y similares.
[0098] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración pueden presentarse en unidades discretas tales como jeringas, viales, tubos, cápsulas, sobres o tabletas que contienen cada uno una cantidad predeterminada de microgel, como un polvo o gránulos o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso, una solución de ciclodextrina, un líquido no acuoso, una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite o como una solución o suspensión en una crema o gel o como una suspensión de microgel, incluidas, pero no limitadas a, micro o nanopartículas de sílice o polilactida. Dichas composiciones pueden prepararse por cualquiera de los métodos de farmacia, pero todos los métodos incluyen el paso de poner en asociación uno o más microgeles con el portador el cual constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente el microgel con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto en la presentación deseada.
[0099] En los polvos, el portador es un sólido finamente dividido el cual está en una mezcla con el microgel.
[0100] En las tabletas, el microgel se mezcla con el portador que tiene la capacidad de unión necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados.
[0101] Los portadores adecuados para polvos y tabletas incluyen carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de baja fusión, manteca de cacao y similares. El término "preparación" pretende incluir la formulación del microgel con material encapsulante como portador proporcionando una cápsula en la cual el microgel, con o sin portador, está rodeado por un portador, el cual está así en asociación con él. Del mismo modo, se incluyen las obleas y las pastillas para chupar. Las tabletas, polvos, cápsulas, píldoras, obleas y pastillas para chupar pueden utilizarse como formas sólidas adecuadas para la administración oral.
[0102] Para preparar supositorios, primero se funde una cera de baja fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y el microgel se dispersa homogéneamente en ella, por agitación. A continuación, la mezcla homogénea fundida se vierte en moldes de tamaño adecuado, se deja enfriar y se solidifica.
[0103] Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aerosoles que contienen, además del microgel, dichos portadores que son conocidos en la técnica por ser apropiados.
[0104] Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, soluciones de agua o de agua-propilenglicol. Por ejemplo, las preparaciones líquidas para inyección parenteral pueden formularse como soluciones en 1,2-propanediol acuoso, dimetilsulfóxido (DMSO), soluciones acuosas de gamma ciclodextrina o 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, solución salina o solución de polietilenglicol, con o sin amortiguador.
[0105] Así pues, los microgeles de acuerdo con la presente invención pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en contenedores multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el microgel puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de sólido estéril o por liofilización a partir de una solución, para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
[0106] Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral pueden prepararse disolviendo el microgel en agua y añadiendo colorantes, aromas y agentes estabilizantes y espesantes adecuados, según se desee.
[0107] Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral pueden hacerse dispersando el microgel en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio u otros agentes de suspensión bien conocidos.
[0108] También se incluyen preparaciones en forma sólida las cuales están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del microgel, colorantes, aromas, estabilizantes, amortiguadores, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares. Para la administración tópica a la epidermis u otro órgano, los microgeles pueden formularse como geles, pomadas, emulsiones, pastas, cremas o lociones, como un parche transdérmico o como mezclas con geles de fibrina. Los geles pueden prepararse utilizando agentes espesantes adecuados y añadiéndolos a composiciones acuosas/alcohólicas de microgel. Los agentes espesantes o gelificantes adecuados son conocidos en la técnica, tal como el polímero polivinil carboxi, Carbomer 940. Las pomadas y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y, en general, también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes suspensores, agentes espesantes o agentes colorantes.
[0109] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica también incluyen soluciones o suspensiones que pueden administrarse tópicamente en forma de una solución para baño o remojo o un aerosol. Estas formulaciones pueden aplicarse adecuadamente para combatir irritaciones cutáneas, picaduras de insectos y heridas en los pies.
[0110] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas para chupar que comprenden el microgel en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el microgel en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el microgel en un portador líquido adecuado.
[0112] Las soluciones o suspensiones se aplican directamente en la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo, con un gotero, una pipeta o un atomizador. Las formulaciones pueden proporcionarse en forma monodosis o multidosis. En el último caso de un cuentagotas o pipeta, esto puede lograrse mediante la administración por parte del paciente de un volumen apropiado y predeterminado de la solución o suspensión. En el caso de un atomizador, esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante una bomba de pulverización de atomización dosificadora. Para mejorar la administración y retención nasal, el microgel de acuerdo con la invención puede encapsularse con ciclodextrinas, o formularse con sus agentes esperados para mejorar la administración y retención en la mucosa nasal.
[0114] La administración al tracto respiratorio también puede lograrse mediante una formulación en aerosol en la cual el microgel se proporciona en un paquete presurizado con un propulsor adecuado, tal como un clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol también puede contener convenientemente un tensioactivo tal como la lecitina. La dosis de microgel puede controlarse mediante la provisión de una válvula dosificadora.
[0116] Alternativamente, el microgel puede proporcionarse en forma de polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del microgel en una base en polvo adecuada tal como lactosa, almidón, derivados del almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP).
[0118] Convenientemente, el portador en polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o empaques de blíster a partir de los cuales el polvo puede administrarse mediante un inhalador.
[0120] Ejemplos
[0122] Los siguientes ejemplos tienen únicamente por objeto ilustrar la invención y no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la presente invención.
[0124] Ejemplo 1: Síntesis de microgel de reticulación ultrabaja (ULC por sus siglas en inglés)
[0126] La N-Isopropilacrilamida (NIPAm) (Sigma) se recristalizó con hexanos calentados a 60 °C durante 1 h y se filtró a 0,22 |jm después de enfriar. El NIPAm (95 % de una solución de monómero 140 mM en peso) se disolvió completamente con agitación (1 h) y luego se filtró en agua ultrapura en un recipiente de reacción de 3 cuellos calentado en aceite de silicona, agitado a 450 rpm y en flujo a 70 °C. En el cuello central se colocó un condensador con agua fría corriente, a través de un cuello lateral se hizo burbujear nitrógeno a través de la solución de monómero, y en el 3er cuello se colocó una sonda de temperatura conectada a una placa caliente a través de un bucle de realimentación. El NIPAm se hizo fluir 50 minutos antes de añadir el co-monomero de ácido acrílico (AAc por sus siglas en inglés) (Sigma) (5 % en peso) para fluir 10 minutos adicionales antes de la iniciación. Se retiró el nitrógeno para añadir 1mM de persulfato de amonio (APS por sus siglas en inglés) para iniciar la reacción y, a continuación, el nitrógeno se sopló suavemente sobre la superficie de la solución. La reacción prosiguió durante 6 horas, mientras se agitaba, con flujo de agua a través del condensador. Se retiró el recipiente de reacción del aceite y se agitó para enfriar durante la noche. Los microgeles se purificaron mediante filtración sobre lana de vidrio para eliminar los agregados grandes y mediante diálisis para eliminar el exceso de monómeros en tubos de diálisis de éster de celulosa de 1000 kDa MWCO (spectrum) contra agua ultrapura (volumen 40X con 2 cambios de agua durante 48 h).
[0128] Ejemplo 2: Fabricación de compuestos de nano-oro (NGC)
[0130] Se realizaron dos métodos de incorporación de oro para crear compuestos de microgel-oro; el primero comprendía un método no covalente y el segundo comprendía un método de síntesis covalente. El método de síntesis no covalente NGC incorpora nanoesferas de oro a microgeles mediante hinchamiento no covalente. Los microgeles se liofilizaron y luego se rehidrataron a una concentración de microgel de 10 mg/mL con una suspensión acuosa de nanoesferas de oro (de 5, 50 o 100 nm de diámetro) a una concentración de oro de 0,05 mg/mL en citrato sódico 2 mM (nanoComposix, San Diego, CA) con agitación a temperatura ambiente durante toda la noche.
[0132] El segundo método de fabricación de NGC implicaba un método de fabricación de un compuesto covalente de nanooro. En este método, se sintetizaron compuestos de microgel-oro en un procedimiento de dos pasos. En este método, se utilizó la reducción mediada por THPC de HAuCk3H2O para formar pequeñas NP de Au (tamaño <3 nm), las cuales luego se hicieron crecer en tamaño (~150 nm) utilizando hidroxilamina y solución de Au3+. El segundo paso del proceso de producción de partículas compuestas involucra el crecimiento sembrado de partículas de oro con el fin de unirlas covalentemente dentro de la red de reticulación del microgel. Se hizo una suspensión acuosa de microgeles agitando 5 mg de microgeles purificados a 450 rpm en 4,21 mL de agua ultrapura durante al menos 20 minutos. Para las pruebas experimentales de las propiedades de las partículas, se incorporaron 3 cantidades diferentes de oro en la partícula. Se añadieron la solución de hidrato de cloruro de oro (III) (20 mM, 150 j L - 450 j L) y la solución de NaOH 1 M (50 -150<j>L) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir una distribución adecuada de los componentes de la reacción. Para reducir los iones de oro y unirlos covalentemente dentro de la red de partículas de microgel, se añadieron 2,45 j L - 7,35 j L de cloruro de tetra(hidroximetil) fosfonio (THPC por sus siglas en inglés). Una vez finalizada esta parte de la reacción, se centrifugó a 21.100 g durante 20 minutos y se extrajo el sobrenadante resultante de la solución para eliminar cualquier partícula de oro que se hubiera creado pero que no se hubiera incorporado a una partícula de microgel. A continuación, la solución de microgel-oro restante se resuspendió en 10 mL de agua ultrapura antes de proceder con el paso de crecimiento del oro de la reacción para aumentar el tamaño de las nanopartículas de oro sembradas. Se añadieron 50 j L -150 j L de hidroxilamina 80 mM inmediatamente antes de 60<j>L - 180<j>L de solución de hidrato de cloruro de oro (III) 100 mM con el fin de aumentar el tamaño de las nanopartículas de oro dentro de los microgeles. Las partículas se purificaron mediante centrifugación a 21.100 g durante 20 minutos, se eliminaron del sobrenadante, se lavaron con agua ultrapura y se centrifugaron nuevamente antes de resuspender el pellet en agua ultrapura hasta alcanzar la concentración deseada. El producto final de esta síntesis es un compuesto de nano-oro formado por microgeles de pNIPAm/AAc con nanopartículas de oro covalentemente unidas y dispersas.
[0134] Ejemplo 3: Producción de NCG específicos de fibrina
[0136] Se crearon partículas similares a plaquetas de compuesto de nano-oro no covalentes (ncNGC PLP) añadiendo un anticuerpo de unión a fibrina a microgeles e hinchándolos posteriormente con una solución de nanoesferas de oro. Primero se conjugó un anticuerpo IgG de unión a fibrina (Sheep anti-human Fibrin fragment E, Affinity Biologicals, Ancaster, ON) con los residuos de ácido acrílico de los microgeles mediante acoplamiento EDC/NHS para crear PLP deformables de unión a fibrina. La purificación de los PLP se realizó ya sea mediante diálisis con agua ultrapura a 200X volúmenes durante 48 horas con 3 cambios de diluyente, o mediante centrifugación a 10.000 rpm x 30 min y 3 lavados con agua ultrapura a 30X volúmenes. Los PLP se liofilizaron y se cargaron con oro mediante rehidratación, como se ha descrito anteriormente. Los compuestos de nano-oro covalentes se modificaron para que se unieran a la fibrina mediante una química EDC/NHS similar, pero después de la incorporación covalente de oro. Los cNGC PLP se purificaron de forma similar mediante diálisis o centrifugación y lavado.
[0138] El tamaño del NGC y la distribución de las nanoesferas de oro dentro de los microgeles se caracterizó mediante imágenes realizadas en un TEM JEOL JEM-2000FX a 200 kV. Las imágenes TEM revelan una distribución homogénea del oro a lo largo de los microgeles para los NGC creados ya sea mediante incorporación de oro no covalente o covalente(Figura 2 y 3).El contenido en nano-oro de los ncNGc es el siguiente: Los compuestos de 5 nm de ncNGC contienen 87±29 partículas de nano-oro por microgel, los compuestos de 50 nm de ncNGC contienen 39±18 partículas de nano-oro por microgel y los compuestos de 100 nm de ncNGC contienen 1,5±0,8 partículas por microgel. Para los cNGC, el contenido de nano-oro es el siguiente: 1x cNGC contienen 44±14 partículas por microgel, 2x cNGC contienen 380±139 partículas por microgel, y 3x cNGC contienen 677±253 partículas por microgel. Además, también analizamos el contenido en nano-oro para las ncNGC >2 meses después de su fabricación. Las imágenes de TEM de los ncNGC muestran que se observaron pequeñas diferencias en la estructura de los ncNGC o en el contenido de nano-oro a lo largo de periodos de almacenamiento más prolongados(Figuras 2 y 3), lo que indica que los ncNGC son relativamente estables a lo largo del tiempo. El contenido en nano-oro de los ncNGC tras >2 meses después de su fabricación es el siguiente: Los compuestos de 5 nm de ncNGC contienen 89±30 partículas de nano-oro por microgel, los compuestos de 50 nm de ncNGC contienen 34±9 partículas de nano-oro por microgel y los compuestos de 100 nm de ncNGC contienen 1,6±0,6 partículas por microgel.
[0140] La deformabilidad del microgel como medida de la capacidad de extenderse sobre una superficie de vidrio, se determinó con AFM utilizando un MFP-3D BIO AFM (Asylum Research, Santa Barbara, CA). Para preparar las muestras para la obtención de imágenes, se limpiaron los cubreobjetos de vidrio colocándolos en un portaobjetos y sumergiéndolos en una serie de soluciones en un baño ultrasónico durante 10 minutos cada una: detergente alconox, agua, acetona, etanol absoluto y alcohol isopropílico. Se cubrieron los cubreobjetos y se secaron. Las suspensiones de microgel se diluyeron en agua ultrapura, se pipetearon sobre un cubreobjetos y se dejaron secar toda la noche. Las imágenes de AFM se realizaron en modo de punteo con una frecuencia de punta de 95,4 kHz, una amplitud de accionamiento de 316 mV, un punto de ajuste de 500 mV y una velocidad de barrido de 05 Hz con sondas de silicio (ARROW-NCR, NanoAndMore, Watsonville, CA). El diámetro y la altura se determinaron promediando >30 microgeles en el software de análisis de imágenes ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Md ).
[0142] La morfología del microgel se caracterizóin situusando cryoSEM con un JEOL 7600F. Los microgeles suspendidos en agua se diluyeron hasta aproximadamente 10 jg/mL y luego se prepararon para la obtención de imágenes mediante congelación instantánea en nitrógeno líquido al vacío. A continuación, las muestras se fracturaron con un pequeño cuchillo y se grabaron calentándolas a -95 °C durante aproximadamente 5-10 minutos. Después del grabado, la muestra se enfría a -120 °C y se recubre con oro por pulverización catódica durante 2 minutos. Las obtención de imágenes se realizó con un aumento de 50.000X. Como comparación con las plaquetas nativas, se adquirió sangre del New York Blood Center (Nueva York, NY) y se aislaron las plaquetas por centrifugación a 150 g durante 15 min sin desaceleración para eliminar los glóbulos rojos y la capa leucocitaria. Una centrifugación adicional del plasma rico en plaquetas a 900 g durante 5 minutos concentró las plaquetas en un pellet que fue posteriormente lavado y se resuspendió en amortiguador de albúmina de Tyrode que contenía 0,35%de albúmina sérica humana (Fisher Scientific, Hampton, NH). Las plaquetas se activaron mediante la adición de 0,25 U/mL de a-trombina humana (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN) inmediatamente antes de la obtención de imágenes.
[0144] Caracterización de AFM (Figura 4)El tamaño y la deformabilidad del microgel como medida de la capacidad de extenderse sobre una superficie de vidrio se determinó con AFM utilizando un MFP-3D BIO AFM (Asylum Research, Santa Barbara, CA). Los microgeles de ULC sin modificar tenían un diámetro promedio de 1,6+0,2 pm y alturas de 8,5±2,7 nm. Después de la carga de oro mediante el método no covalente con ya sea nanoesferas de 5, 50 o 100 nm, se encontró que los ncNGC tenían diámetros medios de 1,3±0,1 pm, 1,7+0,2 pm, o 1,7±0,1 pm y alturas medias de 25,0±3,5 nm, 13,7±2,5 nm, o 13,3±1,6, respectivamente. Después de la carga de oro mediante el método covalente con ya sea 1X, 2X o 3X de oro, se encontró que los cNGC tenían diámetros medios de 2,3+0,3 pm, 2,2±0,2 pm o 2,0±0,2 pm y alturas medias de 12,3±1,9 nm, 13,1+2,7 nm o 16,0+2,2 nm, respectivamente. Las relaciones de aspecto (ancho: alto) para las nanoesferas ncNGC de 5, 50 y 100 nm se encontró que eran de 52,7±34,0, 120,0±73,5 y 130,4±56,1, respectivamente, mientras que las relaciones de aspecto para 1X, 2X y 3X de cNGC se encontró que eran de 188,8±131,0, 168,3±90,8 y 123,8±69,7, respectivamente.
[0146] La morfología de CryoSEM es similar a la de las plaquetas nativas. (Figura 5)Las plaquetas circulantes nativas presentan una morfología ovoide que, después de su activación, forma proyecciones fusiformes. CryoSEM demuestra el cambio de morfología de una plaqueta nativa(A)y una plaqueta activada con 0,25 U/mL de trombina enB.Se obtuvieron las imágenes de la morfología del microgel con un JEOL 7600F CryoSEM a un aumento de 50000X (barra de escala = 500 nm). Los microgeles sin carga(C)ilustran una morfología similar a la de las plaquetas nativas, la cual no se ve afectada por la incorporación de nanoesferas de oro de diferentes diámetros: 5 nm(D),50 nm(E)y 100 nm(F).Los NGC covalentes también muestran una morfología fusiforme en diferentes formulaciones de síntesis: 1X(G),2X(H),y 3X(I).
[0148] En conjunto, la caracterización AFM y CryoSEM demuestra la deformabilidad retenida para partículas similares a plaquetas que tienen nanopartículas metálicas incorporadas.
[0150] El efecto de los NGC de unión a fibrina en la estructura del coágulo se analizó utilizando CryoSEM. Los coágulos de fibrina se prepararon con una concentración final de fibrinógeno (FIB 3, Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN) de 2 mg/mL en amortiguador HEPES (HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, CaCh 5 mM). El coágulo se polimerizó añadiendo 0,1 U/mL de concentración final de a-trombina humana (10 % en volumen) en presencia o ausencia de compuestos de nano-oro de unión a fibrina (1 mg/mL de PLP). Los coágulos de fibrina se fracturaron, se grabaron y se obtuvieron imágenes mediante Cryo-SEM como se ha descrito anteriormente a 5.000X.
[0152] Las PLP de compuestos de nano-oro deformables inducen la retracción del coágulo. CryoSEM demostró que cuando ambos NGC covalentes y no covalentes se conjugaban con anticuerpos de unión a fibrina y se polimerizaban en un coágulo de fibrina, los NGC aumentaban la densidad de la red de fibrina y disminuían la porosidad en comparación con la fibrina sola o los NGC de fibrina no covalentes. Este colapso del coágulo de fibrina puede observarse a las 24 horas en la imagen de ultraestructura de un coágulo de fibrina a 5000X (Figura 6). Estos resultados fueron similares a los observados en presencia de PLP no modificadas, vistas en laFigura 6C.Dado que la inclusión de las nanopartículas de oro en la mayoría de los microgeles NGC no influyó en gran medida en la deformabilidad, y dado que la deformabilidad de las partículas es una característica importante necesaria para la inducción de la retracción del coágulo mediante microgeles de unión a fibrina, no es sorprendente que no se observaran diferencias importantes entre estos grupos.
[0154] Se realizaron pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para evaluar el potencial de los compuestos de nano-oro como agente antimicrobiano. Se fabricaron películas finas de microgel a partir de ULC, cNGC y ncNGC para evaluar la actividad antimicrobiana. Se crearon películas delgadas sobre cubreobjetos de vidrio limpios de 12 nm de diámetro que se funcionalizaron con (3-aminopropil)trimetoxisilano (APTMS) antes de depositar activamente microgeles (1 mL de 0,5 mg/mL). Las películas se enjuagaron con agua y se dejaron secar toda la noche antes de la esterilización con UV. Se superpuso Escherichia coli gramnegativa(E. co li) en cada película (105 CFU/mL x 0,5 mL/pocillo en una placa de 24 pocillos) y se cultivó en una incubadora humidificada a 37 °C.E. colicultivada en vidrio no modificado o en películas delgadas de microgel ULC en presencia de 100 ug/mL de ampicilina sirvió como control. Después de 12 horas, los pocillos se enjuagaron y luego se sometieron a cualquiera de un ensayo de vivo/muerto. Las películas se incubaron con una tinción verde fluorescente de ácido nucleico, 10 pM de colorante SYTO 9 (Thermo Fisher Scientific) y 60 pM de yoduro de propidio (0,5 mL/pocillo) x 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Las películas se lavaron 2X con agua y se montaron en aceite de montajeBacLightsobre portaobjetos de vidrio y se obtuvieron imágenes en un EVOS FL Auto Imaging System con un objetivo 40X. La cuantificación de la fluorescencia total corregida se calculó para cada imagen con ImageJ; (Fluorescencia total corregida = Densidad integrada - (Área de selección rect. x Fluorescencia media de 2 selecciones de fondo por imagen). Los valores corregidos de intensidad de fluorescencia mostrados en la Figura 7B representan la fluorescencia verde. Se analizaron al menos 4 películas por condición y se obtuvieron imágenes de un mínimo de 3 regiones diferentes por película. Los ensayos antimicrobianos demuestran que todas las formulaciones de NGC inhiben el crecimiento y la adhesión bacterianos cuando se fabrican en láminas delgadas. Un ensayo BacLight Vivo/Muerto modificado demostró una adhesión y crecimiento de E.colisignificativamente reducidos en las películas delgadas de NGC en comparación con las películas de microgel de ULC que no contenían oro(Figura 7).
[0156] Evaluación de la coagulación in vivo en modelos de traumatismos en roedores en presencia de microgeles compuestos de nanoplata (NSC):La coagulaciónin vivose evaluó mediante la valoración de la hemorragia después de un traumatismo en un modelo de ratón. Se utilizaron ratones c57bl/6 machos de 8 semanas con un modelo de lesión por laceración del hígado para determinar la pérdida total de sangre por animal. Los animales fueron anestesiados con isoflurano al 5 % y los tratamientos con partículas se inyectaron a través de la vena yugular. Los tratamientos se inyectaron con una concentración final de 10 mg de partículas/kg de animal en 100 pL de solución salina estéril y se dejaron circular en el sistema del animal durante 5 minutos antes de la laceración hepática. Después de la laceración del hígado, se monitoreó la pérdida de sangre durante 10 minutos con la recolección de sangre por medio de una gasa en los siguientes puntos de tiempo: intervalos de 10 segundos durante los primeros 30 segundos, intervalos de 30 segundos de 1 minuto a 3 minutos, e intervalos de 1 minuto después de 3 minutos hasta 10 minutos. La cantidad de sangre perdida se cuantificó por la diferencia de peso de la gasa antes y después de la recolección de sangre adyacente al sitio de la herida en cada punto de tiempo. Se recogieron tejidos del corazón, pulmones, riñones, hígado, bazo y heridas para su posterior análisis histológico. Los tratamientos incluyeron ULC, p Lp, PLP de compuestos de nanoplata covalentes (Ag-PLP) y un control salino. Observamos una disminución significativa en la pérdida de sangre para los grupos de tratamiento con PLP y Ag-PLP en comparación con el control salino(Figura 8).No se observaron diferencias entre el grupo PLP y Ag-PLP, lo que indica que la modificación con nanoplata no afectó a la capacidad hemostática de los microgeles.
[0158] Las composiciones y métodos de las reivindicaciones anexas no están limitadas en su alcance por las composiciones y métodos específicos descritos en el presente documento, los cuales pretenden ser ilustraciones de algunos aspectos de las reivindicaciones. El término "que comprende" y sus variaciones, tal como se utiliza en el presente documento, es sinónimo del término "que incluye" y sus variaciones, y son términos abiertos y no limitativos. Aunque los términos "que comprende" y "que incluye" se han utilizado en el presente documento para describir diversas realizaciones, los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" se pueden utilizar en lugar de "que comprende" y "que incluye" para proporcionar realizaciones más específicas de la invención y también se divulgan. Salvo en los ejemplos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc. utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones deben entenderse como mínimo, y no como un intento de limitar la solicitud de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, deben interpretarse a la luz del número de cifras significativas y de los enfoques de redondeo ordinarios.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un microgel altamente deformable que comprende al menos un polímero de reticulación ultrabaja, un resto de unión a fibrina y una nanopartícula metálica antimicrobiana, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende una poliacrilamida, un poli(ácido acrílico), un polietilenglicol, un alcohol polivinílico, un polisacárido, una polivinilpirrolidona o un copolímero de los mismos, y donde el polímero de reticulación ultrabaja tiene una densidad de reticulación no superior al 2,5 %.
2. El microgel de conformidad con la reivindicación 1, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende un copolímero de poli(acrilamida/ácido acrílico).
3. El microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende un copolímero de poli(acrilamida/ácido acrílico) preparado por polimerización por precipitación de una mezcla de monómeros de acrilamida y ácido acrílico, en la cual la mezcla inicial comprende no más del 20 % en peso, de monómeros de ácido acrílico.
4. El microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende un copolímero de poli(N-isopropilacrilamida/ácido acrílico).
5. El microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende un copolímero de poli(acrilamida/ácido acrílico) preparado por polimerización por precipitación de una mezcla de monómeros de acrilamida y ácido acrílico, en la cual la mezcla no contiene ningún agente de reticulación polifuncional.
6. El gel de microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el polímero de reticulación ultrabaja comprende un copolímero de poli(acrilamida/ácido acrílico) preparado por polimerización por precipitación de una mezcla de monómeros de acrilamida y ácido acrílico, en la cual la mezcla comprende además un agente de reticulación polifuncional.
7. El microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el resto de unión a fibrina comprende al menos un anticuerpo IgG de unión a fibrina, un péptido de unión a fibrina, preferiblemente un imitador de nódulo de fibrina, un anticuerpo de unión al fragmento D; o fragmentos de anticuerpos, preferiblemente sdFvs, que se unen a fibrina.
8. El microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde las nanopartículas metálicas antimicrobianas comprenden nanopartículas de oro, nanopartículas de plata, nanopartículas de cobre, nanopartículas de aluminio, nanopartículas de zinc o una combinación de las mismas.
9. Un método de preparación del microgel de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende incorporar nanopartículas metálicas antimicrobianas en un polímero de reticulación ultrabaja, y conjugar un resto de unión a fibrina al polímero de reticulación ultrabaja.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, donde las nanopartículas metálicas antimicrobianas se incorporan hinchando un polímero de reticulación ultrabaja en una composición acuosa que comprende nanopartículas metálicas antimicrobianas.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9 o 10, donde las nanopartículas metálicas antimicrobianas tienen un tamaño de partícula promedio no superior a 1.000 nm.
12. Una composición farmacéutica que comprende un microgel altamente deformable de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 12 para usarse en promover la cicatrización de heridas.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde la composición acuosa comprende nanopartículas metálicas antimicrobianas en una concentración de al menos 0,01 mg/mL.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, donde las nanopartículas se incorporan al reducir una sal metálica en presencia del polímero de reticulación ultrabaja para incorporar nanopartículas metálicas antimicrobianas.
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