ES3048639T3 - A modified hla-b57 with increased expression levels - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un método para obtener una proteína de fusión HLA-B57, que comprende una variante del polipéptido HLA-B57 con al menos una o dos sustituciones de aminoácidos que le confieren mayor estabilidad y expresión. La invención también proporciona una proteína de fusión HLA-B57 aislada, un ácido nucleico o un vector que codifica dicha proteína de fusión HLA-B57, para su uso en el tratamiento de enfermedades como el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Un HLA-B57 modificado con niveles de expresión aumentados

[0005] La presente invención reivindica la prioridad de las solicitudes europeas EP21190004.8 y EP21190005.5 presentadas el 5 de agosto de 2021, y EP21207324.1 presentada el 9 de noviembre de 2021.

[0007] La presente invención se refiere a modificaciones a polipéptidos de HLA-B57 que confieren una expresión aumentada de líneas celulares de mamíferos, con el propósito de producir un medicamento.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] Las moléculas MHC-I clásicas (también conocidas como HLA-I en humanos) son estructuras diméricas o triméricas que comprenden una cadena pesada unida a la membrana con tres dominios extracelulares (a l, a2 y a3), unidas de manera no covalente a una cadena ligera de p2-microglobulina (p2m) y, opcionalmente, un péptido pequeño asociado a la hendidura de unión al péptido. Sin embargo, las moléculas MHC de clase I también pueden disociarse en cadenas pesadas libres que carecen de p2m (Arosa et al., Trends in Immunology, marzo de 2007; 28(3): 115-23).

[0013] Los inventores han identificado previamente la cadena pesada de HLA-B57 enlazada a ciertos correlatos inmunitarios en la infección por VIH, como un medicamento inmunomodulador prometedor (véase el documento WO 2017153438 A1). Por ejemplo, el síndrome de hipersensibilidad al abacavires una afección inflamatoria inducida por fármacos asociada con HLA-B*57:01, pero no con los portadores de HLA-B58:01 (Zhang et al., China Life Sci. (2012) 55:818-825). Para obtener moléculas de fusión de cadena pesada de HLA-B57 aisladas, la cadena pesada de HLA debe coexpresarse primero con p2m. Una vez purificada del sobrenadante, el complejo de cadena pesada de HLA/ p2m puede separarse, y las cadenas de HLA aisladas purificarse y someterse a replegamiento. Sin embargo, aunque el HLA-B57 no asociado a p2m tiene cualidades inmunomoduladoras deseables, la ampliación de escala de la fabricación a cantidades industriales ha revelado algunos desafíos. Las cadenas pesadas de HLA-B57 forman oligómeros y agregados en solución, lo que lleva a una viabilidad celular reducida y a bajos rendimientos tanto del complejo de cadena pesada de HLA / p2m como de la proteína de fusión pesada de HLA no asociada a p2m aislada derivada.

[0015] Basándose en el estado de la técnica mencionado anteriormente, el objetivo de la presente invención es proporcionar una cadena pesada de HLA-B57 farmacéuticamente activa susceptible de expresión de proteína recombinante de alto rendimiento y caracterizada por propiedades inmunomoduladoras deseables. Este objetivo se logra mediante el objeto de las reivindicaciones independientes de la presente memoria descriptiva, con otras realizaciones ventajosas descritas en las reivindicaciones dependientes, los ejemplos, las figuras y la descripción general de esta memoria descriptiva.

[0017] Resumen de la invención

[0019] Un primer aspecto de la invención se refiere a un método para obtener una proteína de fusión de HLA-B57 que comprende una variante del dominio extracelular de una cadena pesada de HLA-B57, caracterizada por cualidades favorables de fabricación e inmunomoduladoras. El método comprende introducir por lo menos una, o dos sustituciones de aminoácidos en el dominio extracelular de un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural. El polipéptido variante de HLA-B57 resultante se une a un polipéptido Fe de lg estabilizador, para obtener una proteína de fusión de HLA-B57 variante modificada que se expresa en gran medida en el cultivo celular. Los residuos de aminoácidos clave identificados en la secuencia del polipéptido de HLA-B57 de origen natural por la invención son el intercambio de una alanina (A) por un glutamato (E) en la posición 46, y/o una valina (V) o un triptófano (W) por una arginina (R) en la posición 97. Los números de posición para este y cualquier otro polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 mencionado en la presente se definen secuencialmente asignando el motivo de glicina (G), serina (S) e histidina (H) que inicia el dominio extracelular de la cadena pesada de HLA-B57 de longitud completa de origen natural a las posiciones 1, 2 y 3, respectivamente.

[0021] Otro aspecto de la invención es una proteína de fusión de HLA aislada, que comprende un polipéptido variante de HLA-B57 basado en el dominio extracelular de una secuencia de aminoácidos de HLA-B57 de origen natural como antes, pero a diferencia de la secuencia de origen natural, caracterizada por una E en la posición 46 y una R en la posición 97, y enlazada a una porción Fc de lgG.

[0023] Otros aspectos de la invención se refieren a una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de HLA aislada como se ha especificado anteriormente, o un ácido nucleico, o un vector de expresión de ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión de HLA, para su uso como medicamento con el propósito de tratar una enfermedad neoplásica maligna. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención comprenden por lo menos uno de los compuestos de la presente invención y por lo menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0024] Términos y definiciones

[0026] A los efectos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En caso de que alguna de las definiciones que se exponen a continuación entre en conflicto con cualquier documento al que se haga referencia en la presente, prevalecerá la definición expuesta.

[0028] Se pretende que los términos "que comprende", "que tiene", "que contiene" e "incluye", y otras formas similares, así como equivalentes gramaticales de los mismos, como se usan en la presente, tengan un significado equivalente y sean abiertos, en el sentido de que no se pretende que uno o varios elementos que sigan a cualquiera de estas palabras sea una lista exhaustiva de dichos elementos, ni se pretende que se limiten únicamente a los elementos enumerados. Por ejemplo, un artículo que "comprende" los componentes A, B y C puede consistir en (es decir, contener únicamente) los componentes A, B y C, o puede contener no solo los componentes A, B y C, sino también uno o más componentes adicionales. Por lo tanto, se pretende y se entiende que "comprende" y formas similares del mismo, y los equivalentes gramaticales del mismo, incluyen la divulgación de realizaciones de "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".

[0030] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está incluido en la divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado.

[0032] Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera de esos límites incluidos o ambos también se incluyen en la divulgación.

[0034] La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

[0036] Como se usa en la presente, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "o" y "el" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0038] "Y/o", cuando se usa en la presente, debe entenderse como una enumeración específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por lo tanto, se pretende que el término "y/o", como se usa en una frase como "A y/o B" en la presente, incluya "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). De igual manera, se pretende que el término "y/o" como se usa en una frase como "A, B y/o C" abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

[0040] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Para los métodos moleculares, genéticos y bioquímicos se usan técnicas estándar (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (2002) 5a ed., John Wiley & Sons, Inc.) y métodos químicos.

[0042] El término"polipéptido"en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula que consiste en 50 o más aminoácidos que forman una cadena lineal en donde los aminoácidos están conectados por enlaces peptídicos. La secuencia de aminoácidos de un polipéptido puede representar la secuencia de aminoácidos de una proteína completa (como se encuentra fisiológicamente) o fragmentos de la misma. En la presente los términos "polipéptidos" y "proteína" se usan indistintamente e incluyen proteínas y fragmentos de las mismas. Los polipéptidos se divulgan en la presente como secuencias de residuos de aminoácidos.

[0044] Las secuencias de residuos de aminoácidos se indican desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxilo. Las letras mayúsculas para las posiciones de la secuencia se refieren a los aminoácidos L en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3a ed. p. 2 l). Las letras minúsculas para las posiciones de la secuencia de aminoácidos se refieren a los aminoácidos D o (2R) correspondientes. Las secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección desde el extremo terminal amino hasta el extremo terminal carboxilo. De acuerdo con la nomenclatura estándar, las secuencias de residuos de aminoácidos se denominan mediante un código de tres letras o de una sola letra, como se indica a continuación: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Glutamina (Gln, Q), Ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V).

[0046] Los términos"expresión génica"o"expresión",o alternativamente el término"producto génico",pueden referirse a cualquiera, o a ambos, de los procesos, y los productos de los mismos, de generación de ácidos nucleicos (ARN) o la generación de un péptido o polipéptido, también denominados transcripción y traducción, respectivamente, o cualquiera de los procesos intermedios que regulan el procesamiento de la información genética para producir productos polipeptídicos. El término"expresión génica"también puede aplicarse a la transcripción y el procesamiento de un producto génico de ARN, por ejemplo, un ARN regulador o un ARN estructural (por ejemplo, ribosómico). Si un polinucleótido expresado se deriva del ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota. La expresión puede analizarse tanto a nivel de transcripción como de traducción, en otras palabras, ARNm y/o producto proteico.

[0048] El término"vector de expresión de ácido nucleico"en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a un plásmido, un genoma viral o un ARN, que se usa para transfectar (en el caso de un plásmido o un ARN) o transducir (en el caso de un genoma viral) una célula diana con un cierto gen de interés, o, en el caso de un constructo de ARN que se transfecta, para traducir la proteína de interés correspondiente a partir de un ARNm transfectado. En el caso de los vectores que actúan a nivel de la transcripción y la traducción posterior, el gen de interés está bajo el control de una secuencia promotora y la secuencia promotora es operativa dentro de la célula diana, por lo que el gen de interés se transcribe constitutivamente o en respuesta a un estímulo o en función del estado de la célula. En ciertas realizaciones, el genoma viral se empaqueta en una cápside para convertirse en un vector viral, que es capaz de transducir la célula diana.

[0050] En el contexto de la presente memoria descriptiva, los términos"identidad de secuencia"y"porcentaje de identidad de secuencia"se refieren a un único parámetro cuantitativo que representa el resultado de una comparación de secuencias determinada al comparar dos secuencias alineadas posición por posición. Los métodos para el alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento de secuencias para su comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch, J. Mal. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente, por ejemplo, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

[0052] Un ejemplo de comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que usa la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 3; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Costes de huecos: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: Ajuste condicional de la matriz de puntuación de composición. Un ejemplo de comparación de secuencias de ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN, que usa la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 28; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Puntuaciones de coincidencia/no coincidencia: 1.-2; Costes de huecos: lineales. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido usando el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., J. Mal. Biol. 215:403-410 (1990)) usando los parámetros predeterminados identificados anteriormente para la comparación de proteínas y ácidos nucleicos, respectivamente.

[0054] La referencia a secuencias idénticas sin especificar un valor porcentual implica secuencias un 100% idénticas (es decir, la misma secuencia).

[0056] Como se usa en la presente, el término"composición farmacéutica"se refiere a una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, junto con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se proporciona en una forma adecuada para la administración tópica, parenteral o inyectable.

[0058] Como se usa en la presente, el término"portador farmacéuticamente aceptable"incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, recubrimiento, surfactante, antioxidante, conservante (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, edulcorantes, aromatizantes, colorantes y similares, y combinaciones de los mismos, como conocerán los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Remington: the Science and Practice of Pharmacy, ISBN 0857110624).

[0060] Como se usa en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o el trastorno (por ejemplo, ralentizar, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o por lo menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar por lo menos un parámetro físico, incluyendo aquellos que pueden no ser perceptibles para el paciente. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma perceptible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos. En la técnica generalmente se conocen los métodos para evaluar el tratamiento y/o la prevención de enfermedades, a menos que se describan específicamente a continuación.

[0062] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"conector peptídico"o"conector deaminoácidos"

se refiere a un polipéptido de longitud variable que se usa para conectar dos polipéptidos con el fin de generar un polipéptido de cadena única. Las realizaciones ejemplares de conectores útiles para la puesta en práctica la invención especificada en la presente son cadenas de oligopéptidos que consisten en 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un conector de aminoácidos es el péptido flexible rico en glicina GGGGSGGGGS (SEQ ID NO 003) usado para enlazar un polipéptido variante de HLA-B57 con un péptido estabilizador para proporcionar una proteína de fusión de HLA en los ejemplos.

[0064] Los términos"antígeno leucocitario humano", "HLA", "cadena pesada de HLA"o"cadena alfa de HLA"en el contexto de la presente memoria descriptiva se refieren a la familia de proteínas codificadas por la familia de genes delantígeno de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase Ien el cromosoma 6. La cadena pesada de HLA puede ser un monómero o formar parte de estructuras diméricas que comprenden una cadena pesada con tres dominios extracelulares (a l, a2 y a3), unidos de manera no covalente a una cadena ligera de p2m, u opcionalmente, estructuras triméricas en las que un epítopo peptídico pequeño está asociado a la hendidura de unión al péptido.

[0066] El término"HLA-B57 de origen natural (HLA-B*57, B57, HLA-B57, polipéptido de HLA-B57)"se refiere específicamente a los productos de la subfamilia de genes MHC de clase I HLA-B57, que codifican numerosas proteínas similares. La familia HLA-B57 abarca actualmente 221 alelos conocidos con secuencias de ácido nucleico únicas y varias docenas de secuencias de proteínas únicas, numeradas de HLA-B*57:01 a HLA- B*57:141 (cuya secuencia se conoce y puede recuperarse, por ejemplo, introduciendo el término de búsqueda "B*57" en el formulario de consulta de alelos MGT/HLA proporcionado por la base de datos de polimorfismos inmunitarios del Instituto Europeo de Bioinformática, Robinson J. et al. 2013 Nucleic Acids Res. 41:D1234, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgUhla/allele.html). ElHLA-B57 de origen natural de longitud completacomprende un dominio extracelular que incluye un dominio a1, un dominio a2 y un dominio a3, una región peptídica de conexión, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. El término"variante",en el contexto de la presente memoria descriptiva en referencia a una secuencia de polipéptido de cadena pesada de HLA, se refiere a un polipéptido con por lo menos un residuo de aminoácido que difiere de una secuencia de polipéptido de HLA de origen natural. Por ejemplo, un polipéptido variante de cadena pesada de HLA en el que se han introducido una o varias sustituciones de aminoácidos, de tal manera que difiere de la secuencia de proteína humana original de origen natural de la que se deriva.

[0068] El término"dominio extracelulat",como se aplica a un polipéptido de HLA-B57 o a un polipéptido variante de HLA-B57 en el contexto de la memoria descriptiva, se refiere a la parte extracelular de la proteína de cadena pesada de HLA-B57, que comprende por lo menos un dominio a1, un dominio a2 y un dominio a3.

[0070] En el contexto de la presente memoria descriptiva, los términos"proteína de fusión de HLA"o"proteína de fusión de HLA-B57'se refieren a un polipéptido que comprende, o consiste esencialmente en, un polipéptido de dominio extracelular de HLA-B57 de tipo salvaje o variante, unido a un dominio polipéptido Fc estabilizador, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En ocasiones, una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, que comprende el polipéptido variante de HLA-B57 como se especifica en la presente descripción, se denomina en los ejemplos de la presentes como HLA-B57(A46E,V97RJ). El término abarca tanto unaproteína de fusión de HLAformando complejo con un polipéptido de p2-microglobulina secretado por un cultivo celular, como la proteína de fusión de HLA purificada que se ha separado de la p2-microglobulina. El término"proteína de fusión de HLA"abarca tanto una forma monomérica, que comprende un único polipéptido de HLA-B57 unido a un dominio Fc de inmunoglobulina (lg) estabilizador, como un dímero formado por la asociación de un primer monómero de proteína de fusión de HLA y un segundo monómero de proteína de fusión de HLA, por ejemplo, mediante la asociación de dominios Fc de lg.

[0072] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"proteína p2-microglobulina (proteína p2m, ¡52m, B2m, B2M, cadena ligera de HLA)"se refiere a la cadena beta (p), también conocida como cadena ligera, del heterodímero de MHC de clase I. El término"proteína ¡52-microglobuliná'abarca, en primer lugar, unaproteína ¡52-microglobulina de preprocesamientoque comprende una señal de secreción, por ejemplo, la secuencia de Uniprot P61769 o la secuencia SEQ ID NO 014, y, en segundo lugar, la forma postsecreción de la proteína, en la que se ha eliminado una parte de la señal de secreción de la proteína mediante escisión a medida que los polipéptidos se exportan de la célula.

[0074] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término cadena pesada de HLA"no asociada a p2m"se refiere a una molécula de cadena pesada de HLA, en particular una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, que carece de asociación con una molécula de p2m. Para obtener una cadena pesada de HLAno asociada a ¡52mde proteína de fusión de HLA mediante los procesos de fabricación de proteínas recombinantes usados en la presente, una molécula que comprende un polipéptido de cadena pesada de HLA se expresa junto con una proteína p2m en una célula de mamífero, y el complejo HlA: p2m resultante. La presencia de p2m se indica a veces mediante el sufijo ".p2m" después de un compuesto. A continuación, la p2m se separa en condiciones ácidas, tras lo cual la proteína de fusión de HLA libre de p2m se purifica por exclusión por tamaño. En el contexto de la presente memoria descriptiva, los términos"HLA-B57.no p2m"oHLA-B57(A46E V97R).no ¡52mse refieren a proteínas de fusión HLA que comprenden el polipéptido de cadena pesada de HLA no variante y variante enlazado a un polipéptido Fc de lgG respectivamente (en el que(A46E■ V97R)denota la presencia del polipéptido de HLA variante de acuerdo con la invención), que ha sido separado de la proteína p2m.

[0076] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"señal de secreción", "péptido señal de secreción" o "secuencia señal"se refiere a una secuencia líder N-terminal que inicia el marco de lectura abierto (ORF) de un polipéptido, habitualmente aproximadamente de entre 6 y 30 aminoácidos de longitud. En casos excepcionales, la señal de secreción se sitúa en el extremo C-terminal de un polipéptido. Las señales secretoras se denominan a veces señales de direccionamiento, señales de localización, péptidos de tránsito, secuencias líderes o péptidos líderes. Las señales secretoras que permiten la secreción eficiente de un polipéptido desde una célula son bien conocidas en la técnica y pueden incluirse en el ORF de una proteína recombinante con el fin de facilitar la exportación de un polipéptido al sobrenadante en un sistema de fabricación de polipéptidos a base de células, permitiendo la purificación de un polipéptido a partir del sobrenadante celular. Tras la traducción del ARNm que codifica la señal de secreción, esta es reconocida por una proteína citosólica que media la transferencia del complejo ARNm-ribosoma a una proteína de canal en el retículo endoplásmico (ER). El polipéptido recién sintetizado que comprende el péptido de señal de secreción se traslada a la luz del ER a través de la proteína de canal, introduciéndose en la vía de secreción celular. Las secuencias de señal de uso particular de acuerdo con la invención son aquellas que se escinden del producto polipeptídico final tras la traducción, como las usadas en los ejemplos como la SEQ ID NO 019, o las comprendidas en la SEQ ID NO 020.

[0078] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"anticuerpo"se refiere a anticuerpos completos, que incluyen, pero no se limitan a, los de tipo inmunoglobulina G (lgG), tipo A (lgA), tipo D (lgD), tipo E (lgE) o tipo M (lgM), cualquier fragmento de unión a antígenos o cadenas sencillas de los mismos y constructos relacionados o derivados. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (V<h>) y una región constante de cadena pesada (C<h>). La región constante de la cadena pesada de la lgG está compuesta por tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como V<l>) y una región constante de cadena ligera (C<l>). La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, C<l>. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico. De manera similar, el término abarca los denominados nanocuerpos o anticuerpos de dominio único, un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico.

[0080] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"región del fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Fc)"o"Fc de Ig"se refiere a una fracción de un anticuerpo, o inmunoglobulina (lg), compuesta por un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3. Fc de Ig abarca tanto un monómero como un dímero compuesto por dos Fc de Ig, enlazados covalentemente por enlaces disulfuro. En el contexto de la proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, los enlaces disulfuro pueden unir dos moléculas de proteína de fusión de HLA, cada una de las cuales comprende dominios Fc de Ig. La presencia de Fc de Ig en la proteína de fusión de HLA facilita una mayor solubilidad, estabilidad, avidez, vida media y, desde un punto de vista tecnológico, una producción y purificación rentables en sistemas mamíferos (purificación con proteína A o G).

[0082] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término"agente inhibidor de puntos de control"abarca un anticuerpo capaz de alterar una cascada de señales inhibitorias que limita la activación de las células inmunitarias, al unirse específicamente a CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7) o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o menos.

[0084] En la presente los términos"cáncer"y"enfermedad neoplásica maligna"se usan como sinónimos. Las alternativas particulares de cualquiera de los aspectos y realizaciones divulgados en la presente se dirigen al uso de las combinaciones de la invención en el tratamiento de tumores sólidos. Otras alternativas de cualquiera de los aspectos y realizaciones divulgados en la presente se dirigen al uso de las combinaciones de la invención en el tratamiento de cánceres líquidos, como la leucemia mielógena o granulocítica, en particular la LMA, la leucemia linfática, linfocítica o linfoblástica y el linfoma, la policitemia vera o la eritremia.

[0086] Descripción detallada de la invención

[0088] Métodos mejorados para producir una oroteína de fusión de HLA-B57

[0090] Un primer aspecto de la invención se refiere aun método para producir una proteína de fusión de HLA-B57con propiedades de expresión mejoradas en el sistema de células mamíferas, dicha proteína de fusión de HLA-B57 comprendiendo un polipéptido variante de HLA-B57, unido a un polipéptido estabilizador. El método comprende alterar aminoácidos específicos en el dominio extracelular de un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural, para proporcionar una variante que conserve las cualidades inmunomoduladoras deseables, pero que sea más fácil de fabricar como resultado de una estabilidad mejorada, una menor propensión a formar agregados en solución y títulos de expresión más altos.

[0092] En algunas realizaciones, el método de acuerdo con este aspecto de la invención comprende introducir en una célula una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una variante del dominio extracelular de una cadena pesada de HLA-B57 de origen natural, fusionada a un polipéptido estabilizador, en donde elpolipéptido variante de la cadena pesada de HLA-B57(pero no el polipéptido de cadena pesada de HLA-B57de origen naturaldel que se deriva) se caracteriza por unglutamato (E) en la posición 46. La numeración de las posiciones de los aminoácidos de acuerdo con la invención se define secuencialmente asignando el motivo inicial de glicina (G), serina (S) e histidina (H) del dominio extracelular de una cadena pesada de HLA-B57 de origen natural a las posiciones 1, 2 y 3, respectivamente. En otras palabras, el péptido señal secretor no se incluye en la numeración.

[0094] En algunas realizaciones, el método de acuerdo con este aspecto de la invención comprende introducir en una célula una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA que comprende una variante del dominio extracelular de una cadena pesada de HLA-B57 de origen natural fusionada con un polipéptido estabilizador. De acuerdo con esta realización, elpolipéptido variante de la cadena pesada de HLA-B57(pero no el polipéptido de la cadena pesada de HLA-B57de origen naturaldel que se deriva) se caracteriza poruna arginina (R) en la posición 97.

[0096] En ciertas realizaciones del método de acuerdo con la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA codifica un polipéptido variante de HLA-B57 que es idéntico a la porción extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de H<l>A-B57 de origen natural que:

[0098] - comprende un dominio extracelular de longitud completa, y

[0099] - no se caracteriza por una E en la posición 46 y/o una R en la posición 97.

[0101] Otro aspecto de la invención es un método para producir una proteína de fusión de HLA que comprende, como primer paso, introducir sustituciones de aminoácidos en el dominio extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de longitud completa de origen natural, para proporcionar un polipéptido variante de HLA-B57 caracterizado por unaE en la posición 46 y una R en la posición 97. Dependiendo de la secuencia HLA-B57, esto puede implicar la introducción de una sustitución de aminoácidos que codifica una E en la posición 46 (A46E) y/o la introducción de una sustitución de aminoácidos que codifica una R en la posición 97 (V97R o W97R). El método de acuerdo con este aspecto de la invención comprende un segundo paso, que comprende introducir en una célula una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA que comprende dicho polipéptido variante de HLA-B57 unido a un polipéptido estabilizador.

[0103] El método para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención comprende la introducción en la misma célula de un ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido de p2m, para aumentar el nivel de expresión y la secreción de la proteína de fusión de HLA en forma de un complejo de cadena pesada de HLA / p2m, también denominado HLA.2m. HLA.2m puede disociarse aún más para proporcionar moléculas HLA aisladas que carezcan de p2m. Los ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión de HLA y el polipéptido de p2m, de acuerdo con estos aspectos de la invención, están bajo el control de una secuencia promotora operativa en dicha célula. A continuación, la célula se cultiva en condiciones en las que se expresan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican HLA-B57 y p2m, para proporcionar el complejo HLA.2m. En realizaciones particulares del método de acuerdo con la invención, la proteína de fusión de HLA se asocia con una molécula de p2m en una proporción molar de entre 3:5 y 7:5, más particularmente entre 4:5 y 6:5. En otras palabras, la proteína de fusión de HLA y el polipéptido de p2m están presentes en una proporción de o cercana a 1 a 1.

[0105] El polipéptido estabilizador unido al polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención es un polipéptido Fc de Ig. En realizaciones particulares, el péptido estabilizador es un polipéptido Fc de lgG. En realizaciones todavía más particulares, el péptido estabilizador es un polipéptido Fc de IgG4. En realizaciones todavía más particulares, el péptido estabilizador es un polipéptido Fc de IgG4 con la secuencia SEQ ID NO 004.

[0107] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de cadena pesada de HLA de acuerdo con la invención, la proteína de fusión de HLA obtenida comprende, desde el extremo N' terminal al extremo C' terminal de la proteína de fusión:

[0109] i. un polipéptido variante de HLA-B57,

[0110] ii. un conector peptídico de entre 5 y 20 aminoácidos de longitud, más particularmente un conector peptídico con la secuencia SEQ ID NO 003, y

[0111] iii. un polipéptido Fc de Ig estabilizador.

[0113] En ciertas realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de cadena pesada de HLA de acuerdo con la invención, la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLA y la secuencia de ácido nucleico de p2m están presentes en una única molécula de vector de ácido nucleico (por ejemplo, en un único plásmido). En realizaciones particulares, la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLAy la secuencia de ácido nucleico de p2m están presentes en diferentes moléculas de vector de ácido nucleico (por ejemplo, se expresan a partir de dos plásmidos diferentes). En tales realizaciones, la proporción óptima del vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLA con respecto al vector de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de p2m es >1 y <2, en particular, la proporción molar es >1 y <2, como se demuestra en la Fig. 3 de los ejemplos.

[0115] En algunas realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención como se ha especificado anteriormente, el método comprende los siguientes pasos adicionales:

[0117] a. un paso de purificación, en el que se purifica una proteína de fusión de HLA asociada con la proteína p2m, en otras palabras, un complejo de proteína de fusión de HLA / p2m, a partir del sobrenadante de la célula; y/o b. un paso de disociación, en el que el complejo de proteína de fusión de HLA / p2m purificado se disocia en condiciones tales que una proteína de fusión de HLA aislada se separa de una proteína p2m aislada.

[0119] El paso a. proporcionará una proteína de fusión de HLA asociada con la proteína p2m, y el paso b. una proteína de fusión de h La disociada de la proteína p2m, el polipéptido libre de p2m que ha demostrado que antagoniza el crecimiento tumoral cuando se administra in vivo en la Fig. 12. Los datos proporcionados en los ejemplos muestran un ejemplo del paso de purificación de acuerdo con este aspecto de la invención, en el que se usa Proteína G Sepharose para capturar la proteína de fusión de HLA que comprende un polipéptido de lgG4 a partir de sobrenadantes celulares, después de una primera elución con un tampón de elución de lgG de pH 2,8 para aislar una variante de la proteína de fusión de HLA-B57 asociada a la proteína p2m (también denominada HLA:p2m o complejo de proteína de fusión de HLA: proteína p2m).

[0121] En algunas realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención, se lleva a cabo un paso de disociación adicional para proporcionar un conformador no asociado a p2m. Esto puede lograrse, por ejemplo, por exposición del complejo de proteína de fusión de HLA: proteína p2m a condiciones ácidas, en particular a un pH aproximado de 3, permitiendo la separación de la proteína de fusión de HLA conformadora no asociada a p2m de la proteína p2m mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones de los métodos, el método puede comprender además un paso de desalinización, en el que, tras la disociación de p2m del complejo de proteína de fusión de HLA / proteína p2m, las proteínas de fusión de HLA purificadas se llevan a un pH fisiológico, permitiendo el plegamiento correcto de la proteína.

[0123] En ciertas realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con cualquiera del primer o el segundo aspecto de la invención, el dominio extracelular de origen natural de un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 que forma la secuencia base para el polipéptido variante de HLA-B57 se caracteriza por una A en la posición 46. Esta realización abarca el uso de cualquier cadena pesada de HLA-B57 como punto de partida para crear el polipéptido variante de cadena pesada de HLA, excepto aquellos en los que la posición 46 ya es E (por ejemplo, HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA-B57:51 o HLA-B57:69). En otras palabras, para obtener la secuencia variante a partir de la secuencia de origen natural, se introducen por lo menos una (A46E) y posiblemente dos sustituciones de aminoácidos (tanto A46E como cualquiera de V97R o W97R) en los sitios indicados del dominio extracelular de HLA-B57 de origen natural.

[0125] En realizaciones alternativas de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención, el dominio extracelular de la cadena pesada de HLA-B57 de origen natural se caracteriza por una V en la posición 97. Esto abarca cualquier cadena pesada de HLA-B57 excepto aquellas en las que la posición 97 ya es R (por ejemplo, HLA-B57:05, HLA-B57:82, HLA-B57:83, HLA-B57:118 o HLA-B57:131), o en las que la posición 97 es una W(HLA-B57:11). En estas realizaciones, para obtener la secuencia variante a partir de la secuencia de origen natural, en los sitios indicados se introducen por lo menos una (V97R) y posiblemente dos sustituciones de aminoácidos (tanto V97R como A46E).

[0127] En otras realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con el primer o segundo aspecto de la invención, el dominio extracelular de la cadena pesada de HLA-B57 de origen natural se caracteriza por una A en la posición 46 y una V o una W en la posición 97. En otras palabras, el haplotipo de HLA-B57 de origen natural puede ser cualquier cadena pesada de HLA-B57 excepto aquellas en las que la posición 46 ya es una E (por ejemplo, HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA-B57:51, HLA- 857:69) o la posición 97 ya es una R (por ejemplo, HLA-B57:05, HLA- HLA-B57:82, HLA-B57:83, HLA-B57:118 o HLA-B57:131). En estas realizaciones, para obtener la secuencia variante a partir de la secuencia de origen natural, se introducen dos sustituciones de aminoácidos, un A46E y una de cualquiera de V97R o W97R, en los sitios indicados para proporcionar la secuencia variante.

[0129] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, en una secuencia de polipéptido natural de cualquier dominio extracelular HLA-B57 que se caracterice tanto por una A en la posición 46 como por una V en la posición 97 se introducen dos sustituciones de aminoácidos, A46E y V97R. Esta realización abarca el uso de cualquier haplotipo de HLA-B57 como punto de partida para obtener el dominio polipeptídico de HLA variante de la proteína de fusión, excepto en los que la posición 46 ya es una E (por ejemplo, HLA-B57:16, HLA-B57:45, HLA- 857:51 o HLA-B57:69), o en los que la posición 97 ya es R (HLA-B57:05, HLA-B57:82, HLA-857:83, HLA-B57:118, HLA-B57:131), o en los que la posición 97 es una W (HLA-B57:11).

[0131] En otras realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención, la porción de polipéptido variante de HLA-B57 de la proteína de fusión de HLA comprende la secuencia SEQ ID NO 002. En otras palabras, el método para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con esta realización implica introducir en una célula un ácido nucleico que codifica la proteína p2m, y un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA (que comprende un polipéptido variante de cadena pesada de HLA unido a una molécula Fc de lgG4), donde el polipéptido variante de HLA-B57 es idéntico a la secuencia HLA-B57:01 de origen natural SEQ ID NO 001, salvo por las sustituciones de aminoácidos que codifican una E en la posición 46 y una R en la posición 97. A continuación, esta célula se cultiva en condiciones propicias para la expresión de ambas proteínas, con el fin de proporcionar un complejo de proteína de fusión de HLA / proteína p2m.

[0133] En realizaciones particulares de los métodos para obtener una proteína de fusión de HLA de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA codifica una secuencia de polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO 015, la proteína de fusión como se encuentra tras la secreción de células de mamíferos, que carece de señal de secreción. En realizaciones más particulares de los métodos para obtener una proteína de fusión de HLA, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de polipéptido de proteína de fusión de HLA que comprende la secuencia SEQ ID NO 005 o SEQ ID NO 020, donde la secuencia de polipéptido de fusión HLA está precedida por una de dos señales secretoras que los inventores descubrieron que facilitan la secreción eficiente de la proteína de fusión de HLA de la célula. En realizaciones todavía más particulares del método, el ácido nucleico codifica un polipéptido de HLA que consiste esencialmente en la SEQ ID NO 005.

[0135] En algunas realizaciones de los métodos para obtener una proteína de fusión de HLA, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA comprende la secuencia SEQ ID NO 016, preferiblemente asociada con un ácido nucleico adicional que codifica una secuencia de señal de secreción.

[0137] En realizaciones particulares adicionales de los métodos para producir una proteína de fusión de cadena pesada de HLA, la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLA codifica una señal de secreción. En realizaciones todavía más particulares, codifica una señal de secreción de 16 a 30 aminoácidos de longitud, situada en el extremo N-terminal de la secuencia de polipéptido variante de HLA-B57 codificada. En realizaciones todavía más particulares, la señal de secreción codificada por la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLA tiene la secuencia SEQ ID NO 019.

[0139] En realizaciones particulares de los métodos para obtener una proteína de fusión de HLA, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA comprende la secuencia SEQ ID NO 006, que codifica una señal de secreción útil que precede a la proteína de fusión de HLA. En realizaciones más particulares de los métodos para obtener una proteína de fusión de HLA, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA consiste esencialmente en la secuencia SEQ ID NO 006. La señal de secreción codificada por la secuencia de ácido nucleico de la proteína de fusión de HLA se elimina por escisión durante el proceso de secreción de la célula.

[0141] En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos del método para obtener una proteína de fusión de HLA especificados anteriormente, la célula que produce la proteína de fusión de HLA es una célula eucariota. En realizaciones particulares, la célula es una célula de mamífero. En realizaciones más particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, como se demuestra en los ejemplos, se usa una célula de ovario de hámster chino (CHO) para expresar el producto de la proteína de fusión recombinante, aunque los inventores predicen que otros tipos de células, como las células de insectos, o en particular otros tipos de células de mamíferos, pueden producir de manera viable una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención.

[0143] Proteína de fusión de HLA-B57 de alto rendimiento mejorada

[0145] Otro aspecto de la invención es unaproteína de fusión de HLA aisladaque comprende, en primer lugar, unpolipéptido variante de HLA-B57que difiere en por lo menos 1 o 2 aminoácidos del dominio extracelular (según se especifica de acuerdo con la definición del término "polipéptido variante de HLA-B57" de un polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural. Dichopolipéptido variante de HLA-B57 se caracteriza por una E en la posición 46 y una R en la posición 97, en donde los residuos de aminoácidos se numeran a partir del motivo G,S,H situado en la región N-terminal del dominio alfa 1 extracelular (usando la numeración de aminoácidos especificada en la definición del término "polipéptido variante de HLA-B57"). En segundo lugar, la proteína de fusión de HLA aislada comprende un polipéptido estabilizador Fc de Ig. En realizaciones particulares, el polipéptidoestabilizadores un Fc de lgG. En realizaciones todavía más particulares, el péptido estabilizador es unFc de lgG4. En realizaciones todavía más particulares, el péptido estabilizador es unFc de IgG4con cualidades farmacéuticas deseables, con la secuencia de polipéptido designada SEQ ID NO 004.

[0147] En algunas realizaciones de una proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, comprende un polipéptido variante de HLA-B57 obtenido mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el método de acuerdo con cualquiera de los aspectos o realizaciones especificados en la secciónMétodos mejorados para la producción de una proteína de fusión de HLA-B57,en la parte extracelular de un polipéptido de HLA-B57 de origen natural, de tal manera que se caracteriza por una E en la posición 46 y una R en la posición 97.

[0149] En realizaciones particulares, la proteína de fusión de HLA aislada de la invención comprende un polipéptido variante de HLA-B57 que comprende la secuencia SEQ ID NO 002. En realizaciones más particulares, la proteína de fusión de HLA aislada de la invención comprende un polipéptido variante de HLA-B57 que consiste esencialmente en la secuencia designada SEQ ID NO 002.

[0151] En realizaciones particulares adicionales de la proteína de fusión de HLA-B57 aislada de acuerdo con la invención, consiste esencialmente en un polipéptido variante de HLA-B57 y un polipéptido estabilizador unidos por un conector peptídico. En realizaciones particulares, el conector peptídico tiene una longitud de entre 5 y 20 aminoácidos. En realizaciones más particulares, este conector peptídico de unión tiene la secuencia SEQ ID NO 003.

[0153] En otras realizaciones particulares adicionales, la proteína de fusión de HLA aislada comprende la secuencia designada SEQ ID NO 015. En realizaciones todavía más particulares, la proteína de fusión de HLA aislada consiste esencialmente en un polipéptido con la secuencia designada SEQ ID NO 015.

[0155] En ciertas realizaciones de la proteína de fusión de HLA aislada, está asociada con una molécula de p2m en una proporción molar de entre 3:5 y 7:5, más particularmente entre 4:5 y 6:5. En otras palabras, la proteína de fusión de HLA y el polipéptido de p2m están presentes en una proporción de, o cercana a, 1 a 1.

[0157] Polipéptidos variantes de HLA-B57

[0159] Todas las cadenas pesadas de HLA-B57 de origen natural que comprenden un dominio extracelular completo se caracterizan por una alanina (A) en la posición 46 y/o una valina (V) o triptófano (W) en la posición 97. Las secuencias de la familia de proteínas HLA-B57 pueden recuperarse introduciendo el término de búsqueda "B*57" en el recurso Alelos de la Base de Datos de Polimorfismos Inmunitarios (IBD, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgUhla/allele.html, Robinson J. et al. 2013 Nucleic Acids Res. 41:D1234). La mayoría se caracterizan por una A en la posición 46 y una V o W en la posición 97. Por lo tanto, el método de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención puede comprender introducir una o dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia proteica original para proporcionar un polipéptido variante de HLA-B57. En las figuras presentadas en los ejemplos, la fabricación de dicha proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, primero como un complejo de un polipéptido variante de HLA-B57 fusionado a un Fc de IgG4 formando complejo con la proteína p2m, y como una proteína de fusión de Fc de IgG4 de polipéptido variante de HLA-B57 conformador no asociado a p2m disociada de la proteína p2m, se mejora mediante sustituciones de aminoácidos en las posiciones E46 y R97, en comparación con estructuras por lo demás idénticas con una secuencia HLA-B*57:01 no modificada.

[0161] De acuerdo con cualquiera de los aspectos de la presente invención, están ausentes de la proteína de fusión de HLA ciertos dominios de la cadena pesada de HLA-B57 de origen natural que no son necesarios para las interacciones con ligandos afines, el dominio intracelular y el dominio transmembrana. En realizaciones particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de HLA-B57 comprende la estructura central de la porción extracelular de la secuencia de la proteína de cadena pesada de HLA de origen natural, que comprende los dominios alfa 1, 2 y 3, ya que esta porción confiere a la proteína de fusión la capacidad de interactuar con moléculas de superficie en células diana.

[0163] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de HLA-B57 comprendido en la proteína de fusión de HLA incluye los dominios alfa 1, 2 y 3 de la proteína de cadena pesada de HLA de origen natural, regiones que son esenciales para las interacciones receptor-ligando que median los efectos inmunomoduladores de una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención.

[0165] En realizaciones más particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, la proteína de polipéptido variante de HLA-B57 es la proteína de los dominios alfa 1, 2 y 3 de la proteína de cadena pesada de HLA de origen natural, excepto el dipéptido isoleucinavalina C-terminal, precedido por los residuos treonina-valina-prolina del dominio extracelular, dentro de la región HLA-B57 que precede al dominio transmembrana, a veces anotado o denominado "péptido de conexión".

[0167] Los datos estructurales sugieren que HLA-B57 interactúa con ligandos como los receptores similares a la inmunoglobulina de asesinas (KIR) y los receptores similares a la inmunoglobulina de leucocitos (LILR) a través de regiones distantes de la región transmembrana. Los aminoácidos cercanos a la membrana generalmente no interactúan con los receptores. Además, los inventores suponen que el alto contenido de aminoácidos hidrófobos dentro de los 5 aminoácidos C-terminales del dominio extracelular de las secuencias de cadena pesada de HLA de origen natural especificadas en el párrafo anterior probablemente introduzca propiedades indeseables en las proteínas de fusión recombinantes, como una tendencia a la agregación de proteínas, lo que puede afectar a la producción, purificación, estabilidad y toxicidad en los procesos de producción en sentido descendente.

[0169] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de la cadena pesada de HLA-B57 se deriva de un polipéptido del dominio extracelular de cualquier cadena pesada de HLA-B57 de HLA-B*57:01 a HLA-B*57:141 (con la excepción de los alelos truncados que carecen de la secuencia completa del dominio extracelular). Las sustituciones de aminoácidos en el polipéptido de origen natural, que resultan en la posición 46 (contando desde el motivo G,S,H) del dominio extracelular como una E, y el aminoácido en la posición 97 como una R, proporcionan un polipéptido variante de cadena pesada de HLA, o proteína de fusión de acuerdo con la invención. Además de la SEQ ID NO 001, secuencias adecuadas de proteínas de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural que comprenden los dominios alfa 1, 2 y 3 de la porción extracelular del polipéptido, como se especifica en la definición del término "polipéptido variante de HLA-B57", que pueden servir como punto de partida para construir el polipéptido variante de HLA-B57 o la proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención, pueden encontrarse en repositorios de secuencias públicos. Estas incluyen secuencias seleccionadas entre, pero no limitadas a, las cadenas pesadas de HLA-B57 de la primera columna de la siguiente tabla, que pueden recuperarse de la base de datos IPD del laboratorio EMBL-EBI (como se cita en la definición del término HLA-B57 en la secciónTérminos y definiciones):

[0172]

[0173] (continuación)

[0174]

[0175] (continuación)

[0178]

[0181] En otras realizaciones de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de HLA-B57 es idéntico al dominio extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural que comprenda un dominio extracelular de longitud completa, truncado antes de la región del "péptido de conexión", la región de la cadena pesada de HLA-B57 que sigue al dominio extracelular y precede al dominio transmembrana, aparte de estar caracterizado por una E en la posición 46 y una R en la posición 97.

[0183] En ciertas realizaciones, los polipéptidos variantes de HLA-B57 o las proteínas de fusión variantes de HLA-B57 de acuerdo con la invención pueden comprender además una señal de secreción, por ejemplo, los 24 aminoácidos iniciales presentes en la mayoría de los polipéptidos de HLA-B57 de origen natural anotados como péptido señal, o una señal de secreción alternativa diseñada para la secreción eficiente de la proteína de fusión de HLA, como la SEQ ID NO 019.

[0184] Además, en ciertas realizaciones de los polipéptidos variantes de HLA-B57 o proteínas de fusión variantes de HLA-B57 de acuerdo con la invención, en el extremo C-terminal de los dominios alfa 1, alfa 2 y alfa 3 del dominio extracelular de la secuencia de la proteína de HLA-B57 de origen natural, pueden estar presentes los 6 residuos iniciales de la región del "péptido de conexión" de HLA-B57 que une el dominio alfa 3 con el dominio transmembrana, que se encuentran en la mayoría de las variantes de longitud completa de origen natural del polipéptido de HLA-B57.

[0185] Un polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con la invención puede obtenerse introduciendo modificaciones de aminoácidos en el dominio extracelular de una secuencia de polipéptido de HLA-B57 de origen natural como se ha especificado anteriormente. Dicho polipéptido variante de HLA-B57, en la terminología usada en la presente memoria descriptiva, consiste en, o comprende, una variante de la parte del dominio extracelular de una secuencia de polipéptido de HLA-B57 de origen natural necesaria para la interacción con los ligandos HLA-B57, que comprende en particular por lo menos los dominios alfa 1, alfa 2 y alfa 3 de una secuencia de proteína HLA-B57 de origen natural.

[0186] Un polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con la invención se caracteriza además por:

[0187] - un glutamato (E) en la posición 46 del residuo de aminoácido y

[0188] - una arginina (R) en la posición 97 del residuo de aminoácido.

[0189] La numeración de aminoácidos para HLA-B57 usada en la presente se define secuencialmente asignando el motivo inicial G, S, H de un dominio extracelular de la variante, o la cadena pesada de HLA-B57 de origen natural con la secuencia SEQ ID NO 001 a las posiciones 1, 2 y 3, respectivamente.

[0190] En ciertas realizaciones, el polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con la invención comprende además opcionalmente:

[0191] - una señal de secreción, por ejemplo, los 24 aminoácidos iniciales presentes en la mayoría de los polipéptidos HLA-B57 de origen natural anotados como péptido señal, o una señal de secreción alternativa diseñada para la secreción eficiente de la proteína de fusión de HLA, como SEQ ID NO 019, y/o

[0192] - C-terminal a los dominios alfa 1, alfa 2 y alfa 3 del dominio extracelular variante de una secuencia de proteína de HLA-B57 de origen natural, los 6 residuos iniciales de la región del "péptido de conexión" de HLA-B57 que une el dominio alfa 3 con el dominio transmembrana, y presente en polipéptidos de HLA-B57 de origen natural de longitud completa.

[0193] Un polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con la invención carece, o su secuencia de ácido nucleico no codifica:

[0194] - el dominio transmembrana, y

[0195] - el dominio intracelular de una secuencia de proteína de HLA-B57 de origen natural.

[0196] En realizaciones particulares, el polipéptido variante de HLA-B57 carece, o su secuencia de ácido nucleico no codifica, los últimos de 3 a 11 residuos, en particular los últimos 5 residuos de la región del "péptido de conexión" del dominio extracelular presente en la mayoría de las secuencias de proteína de HLA-B57 de origen natural de longitud completa que unen el dominio alfa 3 y el dominio transmembrana.

[0197] En realizaciones particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de HLA-B57 es idéntico al dominio extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural que comprenda un dominio extracelular de longitud completa, truncado antes de los últimos 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoácidos de la región del "péptido de conexión", además de caracterizarse por una E en la posición 46 y una R en la posición 97.

[0198] En realizaciones más particulares de los métodos para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de cadena pesada de HLA-B57 es idéntico al dominio extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural que comprenda un dominio extracelular de longitud completa, pero carezca de los 5 residuos de aminoácidos C-terminales de la región del "péptido de conexión", además de caracterizarse por una E en la posición 46 y una R en la posición 97.

[0199] En realizaciones particulares, el polipéptido variante de HLA-B57 es idéntico a los primeros 280 aminoácidos que codifican la porción extracelular de cualquier polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 de origen natural, contando desde el motivo GSH del dominio alfa 1 del dominio extracelular, además de caracterizarse por una E en la posición 46 y una R en la posición 97.

[0200] En realizaciones alternativas de la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, el polipéptido variante de HLA-B57 comprende una secuencia idéntica al dominio extracelular de una variante de un polipéptido de HLA-B57 de origen natural caracterizado por una E en la posición 46 y una R en la posición 97, por ejemplo, SEQ ID NO 002, salvo por un único residuo de aminoácido diferente (en donde el único residuo de aminoácido diferente no se encuentra en la posición 46 ni en la 97). En otras palabras, además de la sustitución de un aminoácido, o en algunos casos de dos aminoácidos, en las posiciones 46 y/o 97, el polipéptido variante de HLA-B57 de acuerdo con esta realización incluye por lo menos una sustitución de aminoácido adicional en comparación con la molécula de HLA-B57 de origen natural de la que se deriva. De acuerdo con esta realización, la proteína de fusión de HLA resultante tiene por lo menos una función biológica similar o mejorada con respecto a todas las realizaciones anteriores de la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención. Específicamente, la función de la proteína de fusión de HLA puede caracterizarse mediante los medios y métodos demostrados en los ejemplos de la presente, es decir, en comparación con un constructo similar que carezca de las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 46 y 97 (caracterizada por una A46 y una V97/W97). La proteína de fusión de HLA se caracteriza por un aumento de por lo menos dos veces en el título de proteína de fusión de HLA recombinante medido en el sobrenadante de una célula de mamífero (como se resume en la figura 7), en comparación con una proteína de fusión de HLA de control equivalente, es decir, un título aumentado en comparación con una proteína de fusión que comprende un polipéptido de cadena pesada de HLA caracterizado por una A46 y una V97/W97, y que carece de cualquier otra modificación variante. De manera importante, las variantes que comprenden mutaciones adicionales al polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 distintas de las posiciones 46 y 97 también deben conservar sus cualidades inmunogénicas favorables de una cadena pesada de HLA soluble que comprende la secuencia de HLA-B57 de tipo salvaje. Esto puede confirmarse midiendo la unión de un constructo variante de HLA-Fc que carece de p2m a LILRB2 y confirmando que la unión se caracteriza por un EC50 igual o menos de (<) a aproximadamente 21 nM, como se demuestra para una proteína de fusión basada en HLA-B57 de tipo salvaje en la Fig. 8 de los ejemplos.

[0202] Los datos en la Fig. 2 y la Fig. 7 presentados en los ejemplos muestran que diversas estructuras de cadena pesada de HLA que portan un A46E y un V97R se correlacionan con mayores rendimientos de expresión de cadena pesada de HLA por líneas celulares en comparación con el polipéptido de HLA-B57 de origen natural. Las Figs. 3 a 7 demuestran que el cambio de dos aminoácidos (A46E y V97R) en la porción extracelular del polipéptido de cadena pesada de h LA-B57:01 natural (SEQ ID NO 001) mejora considerablemente el rendimiento y reduce la agregación de una p2m en complejo con una proteína de fusión Fc de Ig de HLA (HLA-B57(A46EV97R).p2m), así como el conformador no asociado a p2m de (HLA-B57(A46E V97R) que carece de nop2m (HLA-B57(A46EV97R).nop2m). Las sustituciones de aminoácidos aumentan la viabilidad celular y el título de producción, y disminuyen las especies de alto y bajo peso molecular, como lo indica el predominio de un solo pico en el análisis HLPC de las proteínas de fusión HLA que comprenden el polipéptido variante de HLA-B57. De manera importante, estas sustituciones de aminoácidos no comprometen la unión a LILRB2 de un conformador no asociado a p2m de HLA (HLA-B57(A46EV97R).nop2m) (Fig. 8), ni la capacidad de HLA-B57(A46EV97R).nop2m de aumentar el potencial destructor de las células T CD8 o la polarización o la capacidad de fagocitosis de los macrófagos M1 (Fig. 9 a 11). Esto confirma que las posiciones 46 y 97 no comprometen las propiedades inmunomoduladoras de la proteína de fusión de HLA resultante. Además, la proteína HLA-B57(A46EV97R).nop2m disociada de p2m tiene un potente efecto inmunomodulador y eficacia terapéutica contra el cáncer, como se ha demostrado in vivo usando un modelo de ratón con cáncer de colon (Fig. 12).

[0204] En realizaciones particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, o el HLA aislado de acuerdo con la invención, un conformador no asociado a p2m derivado de la proteína de fusión de HLA variante tiene una unión mejorada a LILRB2 (UniProt Q8N423) en comparación con un compuesto equivalente que comprende el péptido de cadena pesada de HLA de origen natural del que se deriva. En otras palabras, la saturación de unión a LILRB2 con una proteína de fusión de HLA-B57(A46EV97R) puede lograrse a una concentración menor en comparación con un constructo equivalente que comprende el péptido de cadena pesada de HLA de origen natural del que se deriva. La saturación de unión a LILRB2 de acuerdo con la invención se refiere particularmente a mediciones que usan un inmunoensayo ligado a enzimas, en el que la proteína de fusión de HLA se titula sobre LILRB2 biotinilado inmovilizado y se detecta con un anticuerpo secundario anti-lg. En otras realizaciones particulares, dicha cadena pesada de<h>L<a>variante incorporada en una proteína de fusión de HLA conformadora no asociada de p2m se une al receptor LILRB2 con una EC50 igual o menor de (<) aproximadamente 21 nM, en particular < aproximadamente 15 nM, más particularmente < aproximadamente 10 nM, lo que indica un aumento de más de dos veces en la saturación de unión a LILRB2.

[0206] Péptidos estabilizadores y de enlace

[0208] La proteína de fusión de HLA de acuerdo con cualquier aspecto de los métodos, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención especificada anteriormente, comprende un polipéptido adicional de fragmento cristalizable de inmunoglobulina (Fc de Ig) que confiere estabilidad durante la expresión y purificación a la porción HLA-B57 de la proteína de fusión. La presencia de la porción estabilizadora de la proteína de fusión de HLA aumenta el rendimiento y la solubilidad al reducir la degradación y la oligomerización de la proteína de fusión de HLA, así como al aumentar la viabilidad de la célula que expresa la proteína de fusión.

[0209] En realizaciones particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada, el polipéptido estabilizador de la proteína de fusión de HLA es un polipéptido de Fc de Ig humano. En realizaciones particulares, el péptido estabilizador de la proteína de fusión de HLA es un isotipo de Fc de lgG. Un dominio peptídico estabilizador de Fc de lgG proporciona una ventaja adicional durante la purificación de la proteína de fusión de HLA, al permitir la absorción a una superficie recubierta de proteína A o G. La porción de Fc también puede prolongar la vida media in vivo de una molécula in vivo.

[0210] En realizaciones particulares del método para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, la proteína de fusión de HLA comprende un polipéptido de lgG4. En realizaciones más particulares, la proteína de fusión de HLA comprende una molécula S228P.dk de lgG4 alterada con la secuencia SEQ ID NO 004. Esta se caracteriza por una mutación en la región bisagra de la lgG4, donde la Prolina (P) sustituye a la serina (S) en la posición 228 del anticuerpo lgG4 original, y dK indica una deleción del último aminoácido lisina (K) en la secuencia de lgG4 original. Estos cambios confieren estabilidad al formato de lgG4 y menor heterogeneidad. Ambos cambios están bien establecidos y se usan comúnmente en diversos constructos de Fc.

[0211] En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de HLA aislada es un dímero que comprende un primer monómero y un segundo monómero, y cada monómero, independientemente del otro monómero, comprende un polipéptido de cadena pesada de HLA fusionado a una porción de Fc de Ig, la cual puede asociarse a través de enlaces disulfuro.

[0212] En ciertas realizaciones del método para producir una proteína de fusión de HLA, el polipéptido variante de HLA-B57 se une al polipéptido de lgG como parte de una sola cadena polipeptídica mediante un conector peptídico, una secuencia corta de aminoácidos de 5, 10, 15 o 20, o incluso 50 residuos de longitud. En realizaciones particulares, el conector peptídico es una secuencia no inmunogénica rica en residuos de serina y glicina. En realizaciones más particulares, el conector peptídico tiene la secuencia SEQ ID NO 003.

[0213] Las moléculas de HLA naturales expresadas en el retículo endoplásmico de las células humanas se asocian con epítopos peptídicos antes de ser transportadas y mostradas en la superficie celular. En realizaciones particulares de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, el polipéptido de HLA no está asociado con un epítopo peptídico. En otras palabras, la ranura de unión al antígeno, o hendidura de unión al antígeno formada por los dominios alfa 1 y alfa 2 del polipéptido de HLA, no se une a un péptido antigénico pequeño. Se piensa que la unión del péptido a las moléculas de clase HLA cambia su conformación, lo que puede afectar a las interacciones con moléculas de unión como LILRB1 y LILRB2. La afinidad de unión y los efectos inmunomoduladores de un polipéptido de HLA-B57 asociado con el polipéptido B2m de acuerdo con la invención, sin asociación adicional con un epítopo peptídico, se demuestran, por ejemplo, en la Fig. 12.

[0214] En realizaciones alternativas del método para producir una proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la invención, la proteína de fusión de HLA comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

[0215] Ácidos nucleicos

[0216] Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de los aspectos o realizaciones de la invención mencionados anteriormente, donde la porción del polipéptido variante de HLA-B57 codificada de la proteína de fusión de HLA se caracteriza por un E46 y un R97. En realizaciones particulares, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA comprende la secuencia SEQ ID NO 016. En realizaciones particulares, el ácido nucleico también codifica una señal de secreción que permite la secreción de la célula para permitir la purificación eficiente de la proteína de fusión de HLA. En otras realizaciones particulares, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión aislada comprende la secuencia designada SEQ ID NO 006, que codifica además una señal de secreción. En realizaciones más particulares, consiste esencialmente en la SEQ ID NO 006.

[0217] Aspectos adicionales de la invención incluyen un vector de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico como se ha especificado anteriormente y una secuencia promotora operativa en una célula. En realizaciones particulares, el promotor es adecuado para la expresión en una célula eucariota. En realizaciones más particulares, se usa un promotor para una célula de mamífero.

[0218] Un aspecto adicional de la invención es una célula aislada que comprende la proteína de fusión de HLA, o un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores de la invención. Estos aspectos de la invención abarcan sistemas de administración a base de ADN o ARN para proteínas de fusión HLA, o la transferencia de células que expresan la proteína de fusión de HLA.

[0219] Composiciones farmacéuticas y administración

[0220] Los datos presentados en los ejemplos muestran que una proteína de fusión de HLA variante de acuerdo con la invención, en la que el A46 y el V97 de los dominios extracelulares del polipéptido de HLA-B*57:01 han sido sustituidos por un E46 y un R97 mediante sustituciones de aminoácidos dirigidas, se une a LILRB2, aumenta la capacidad de destrucción de las células T CD8 y provoca respuestas inmunitarias antitumorales in vivo. Las sustituciones de aminoácidos en el polipéptido variante de HLA-B57 proporcionado por la invención son ventajosas porque aumentan el rendimiento de la proteína de fusión de HLA resultante que comprende dicho polipéptido variante de HLA-B57, a la vez que mantienen los efectos inmunomoduladores de la molécula, incluyendo la destrucción de células T, la activación de macrófagos y la fagocitosis, y la eficacia terapéutica in vivo (Fig. 9 a 12).

[0222] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende por lo menos una de las proteínas de fusión de HLA, o el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA como se especifica en la presente, y por lo menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende por lo menos dos portadores farmacéuticamente aceptables, como los descritos en la presente.

[0224] En realizaciones particulares, la enfermedad neoplásica maligna en la que se usa la formulación farmacéutica de proteína de fusión de HLA es un cáncer sólido. En realizaciones más particulares, el cáncer sólido es cáncer de pulmón o cáncer de pulmón metastásico. En otras realizaciones particulares, el cáncer es una forma de cáncer colorrectal o cáncer de colon metastásico.

[0226] En otras realizaciones particulares, la formulación farmacéutica de proteína de fusión de HLA se usa para tratar un cáncer derivado de células sanguíneas. En realizaciones más particulares, se usa para tratar la leucemia de células T.

[0228] En ciertas realizaciones de la invención, la proteína de fusión de HLA de la presente invención se formula típicamente en formas de dosificación farmacéutica para proporcionar una dosificación fácilmente controlable del fármaco y para dar al paciente un producto elegante y fácil de manejar.

[0230] El régimen de dosificación de la proteína de fusión de HLA de la presente invención variará dependiendo de factores conocidos, como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la especie, la edad, el sexo, la salud, el estado médico y el peso del receptor; la naturaleza y el alcance de los síntomas; el tipo de tratamiento concomitante; la frecuencia del tratamiento; la vía de administración, la función renal y hepática del paciente y el efecto deseado. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión de HLA de la invención puede administrarse en una sola dosis diaria, o la dosificación diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.

[0232] En la técnica se conocen muchos procedimientos y métodos para preparar composiciones farmacéuticas, véase, por ejemplo, L. Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 4a ed., 2013 (ISBN 8123922892).

[0234] Medicamentos combinados

[0236] Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA variante de acuerdo con la invención, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión de HLA, formulada para su administración en combinación con un agente inhibidor de puntos de control. Los inventores han descubierto previamente que los compuestos de proteína de fusión de lgG4 de HLA-B57 potencian el efecto de los inhibidores de puntos de control, y consideran que moléculas similares basadas en la variante del polipéptido de cadena pesada de HLA-B57 proporcionarán un efecto similar cuando se administren en combinación, ya que la molécula muestra una acción inmunomoduladora similar en los ensayos in vitro probados en los ejemplos.

[0238] Otro aspecto de la invención es un inhibidor de puntos de control para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna, formulado para su administración en combinación con una proteína de fusión de HLA, o un ácido nucleico, o un vector que codifica la proteína de fusión de acuerdo con la invención.

[0240] El agente inhibidor de puntos de control de acuerdo con la invención es capaz de alterar la cascada de señales inhibidoras que limita la activación de las células inmunitarias, y en particular la activación de las células T. De acuerdo con todos los aspectos de la invención enumerados en la presente, el agente inhibidor de puntos de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1 o PD-L2 con una constante de disociación de 10-7 mol/L o menor (afinidad más alta).

[0242] En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término "constante de disociación" (K<d>) se usa en su significado conocido en el ámbito de la química y la física; se refiere a una constante de equilibrio que mide la propensión de un complejo compuesto por [principalmente dos] componentes diferentes a disociarse reversiblemente en sus componentes constituyentes. El complejo puede ser, por ejemplo, un complejo anticuerpo-antígeno AbAg compuesto por el anticuerpo Ab y el antígeno Ag. Kd se expresa en concentración molar [mol/L] y corresponde a la concentración de [Ab] a la que se ocupan la mitad de los sitios de unión de [Ag], en otras palabras, la concentración de [Ab] no unido es igual a la concentración del complejo [AbAg]. La constante de disociación puede calcularse de acuerdo con la siguiente fórmula:

[0244] „ [Ab] * [Ag]

[0245] D [AbAg]

[0247] [Ab]: concentración de anticuerpo; [Ag]: concentración de antígeno; [AbAg]: concentración del complejo anticuerpoantígeno

[0249] En particular, el agente inhibidor del punto de control es un ligando de CTLA-4 no agonista, un ligando de PD-1 no agonista, un ligando PD-L1 no agonista o un ligando PD-L2 no agonista, que no lleva a una actividad atenuada de las células T cuando se une a CTLA-4, PD-1, PD-L1 o PD-L2, respectivamente, en la superficie de una célula T. En ciertas realizaciones, los ligandos de CTLA-4 no agonistas usados en la presente invención son capaces, cuando se unen a CTLA-4, de bloquear estéricamente la interacción de CTLA-4 con sus moléculas de unión CD80 y/o CD86, y los ligandos de PD-1 no agonistas usados en la presente invención son capaces, cuando se unen a PD-1, de bloquear estéricamente la interacción de PD-1 con sus moléculas de unión PD-L1 y/o PD-L2.

[0251] En ciertas realizaciones, el agente inhibidor del punto de control altera las cascadas de señalización inhibidoras a través de una capacidad para unirse a CTLA-4 con una constante de disociación de, para marcar la menor afinidad expresada en valor K<d>, 10'7 mol/L, particularmente de 10'8 mol/L o incluso 10'9 mol/L y que inhibe la actividad biológica de su diana respectiva. Un ligando de PD-1 no agonista o un ligando PD-L1 (PD-L2) no agonista en el sentido de la invención se refiere a una molécula que es capaz de unirse a PD-1 (PD-L1, PD-L2) con una constante de disociación de por lo menos 10'7 mol/L, en particular 10'8 mol/L o incluso 10'9 mol/L o menor, y que inhibe la actividad biológica de su diana respectiva. En realizaciones particulares, el agente inhibidor del punto de control es un anticuerpo, más particularmente un anticuerpo específico para PD-1, que inhibe las interacciones con PD-L1 para mejorar las respuestas de las células T.

[0253] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica para el tratamiento combinado, el agente inhibidor del puntos de control es un anticuerpo inhibidor del puntos de control seleccionado entre los fármacos de anticuerpos clínicamente disponibles ipilimumab (Bristol-Myers Squibb; N° CAS 477202-00-9), tremelimumab (N° CAS 745013-59-6), nivolumab (Bristol-Myers Squibb; N° CAS 946414-94-4), pembrolizumab (Merck Inc.; N° CAS 1374853­ 91-4), pidilizumab (N° CAS 1036730-42-3), atezolizumab (Roche AG; N° CAS 1380723-44-3), avelumab (Merck KGaA; N° CAS 1537032-82-8), durvalumab (Astra Zeneca, N° CAS 1428935-60-7) y cemiplimab (Sanofi Aventis; N° CAS 1801342-60-8).

[0255] Las divulgaciones previas de los inventores en el documento WO 2017153438 A1 muestran que los péptidos solubles de cadena pesada de HLA reducen la carga tumoral en múltiples modelos tumorales, solos o cuando se emparejan con agentes inhibidores de puntos de control caracterizados por su unión específica a PD-1, PD-L1 y 4-1 BB.

[0257] En ciertas realizaciones, la terapia combinada comprende dos formas de dosificación distintas, por ejemplo, dicha proteína de fusión de HLA se proporciona como una forma de dosificación para la administración intratumoral, o la administración local en las cercanías del tumor, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o inyección intratumoral en un tumor sólido, y dicho agente inhibidor de puntos de control se proporciona como una forma de dosificación para la administración sistémica, en particular mediante inyección intravenosa. Sin embargo, dicho agente inhibidor de puntos de control y dicha proteína de fusión de HLA también pueden administrarse en dos formas de dosificación similares.

[0259] La administración en combinación abarca tanto la administración simultánea del agente inhibidor de puntos de control como la proteína de fusión de HLA juntos, o en formulaciones separadas, como la administración de una sustancia inmediatamente antes, por ejemplo, en la semana anterior, o inmediatamente después, por ejemplo, en la semana posterior, a la administración de una segunda sustancia. En algunas realizaciones, la administración de los dos agentes en combinación se refiere a la administración de un agente antes, en particular en el mes anterior al segundo agente. En otras realizaciones, se administra un segundo agente después, en particular en las semanas o el mes posteriores al primer agente. En otras realizaciones particulares, el inhibidor de puntos de control y la proteína de fusión de HLA se administran en regímenes de administración superpuestos.

[0261] La invención abarca además una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA de acuerdo con la invención y un agente inhibidor de puntos de control.

[0263] La invención abarca además una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA para su uso en el tratamiento de un paciente al que se le ha administrado recientemente, o está programado que reciba, un agente inhibidor de puntos de control.

[0265] La invención abarca además una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de puntos de control para su uso en el tratamiento de un paciente al que se le ha administrado recientemente, o está programado que reciba, una proteína de fusión de HLA.

[0267] Tratamiento médico. Formas de dosificación

[0269] En realizaciones particulares de la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA, se proporciona para su uso en el tratamiento de un tipo de cáncer líquido o de la sangre. Los inventores consideran que la característica de agotamiento de las células T y la accesibilidad de las células cancerosas circulantes en la sangre a las células T, así como la activación de los macrófagos inducida por las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, significan que es probable que esta combinación sea eficaz. En tales realizaciones particulares, la composición farmacéutica se proporciona para su uso en un paciente al que se le ha diagnosticado leucemia de células T, como se modela en la presente con células Jurkat. En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica se proporciona para su uso en un paciente al que se le ha diagnosticado mieloma múltiple, como se modela con la línea celular de LMA THP-1.

[0271] En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA se proporciona para su uso en un paciente al que se le ha diagnosticado un cáncer sólido o una metástasis de un cáncer sólido. En algunas realizaciones particulares, la composición farmacéutica es para su uso en un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer de pulmón. En realizaciones particulares, el cáncer de pulmón es una forma de cáncer de pulmón de células no pequeñas. En otras realizaciones particulares, el cáncer de pulmón es una forma de cáncer de pulmón de células pequeñas o carcinoma. En otras realizaciones particulares, la composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de HLA o el inhibidor del punto de control inmunitario es para su uso en un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer de colon. En realizaciones particulares, cáncer de colon metastásico.

[0273] En algunas realizaciones de aspectos de la invención relacionados con la administración de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, además de un agente inhibidor de puntos de control, se proporciona para su uso en una forma de enfermedad maligna, o cáncer, en la que está aprobada la terapia de inhibición de puntos de control para monoterapia o terapia combinada. En realizaciones particulares, el tratamiento combinado es para su uso en un paciente con cáncer de colon, en particular cáncer de colon metastásico. En otras realizaciones particulares, el cáncer es melanoma. En realizaciones particulares adicionales, el cáncer es cáncer de páncreas. En más realizaciones particulares adicionales, el cáncer es cáncer de mama.

[0275] Las formas de dosificación pueden ser para administración parenteral, como formas de inyección subcutánea, intravenosa, intrahepática o intramuscular. Opcionalmente, puede haber un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0277] Siempre que en la presente se expongan alternativas para características separables únicas como "realizaciones", se entenderá que tales alternativas pueden combinarse libremente para formar formulaciones discretas de la invención divulgada en la presente.

[0279] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los que pueden extraerse realizaciones y ventajas adicionales. Se pretende que estos ejemplos ilustren la invención, pero no que limiten su alcance.

[0281] Descripción de las Figuras

[0283] La Fig. 1 muestra la estructura topológica de HLA-B57:01 sin la molécula de unión de p2m. Los residuos mutados A46E y V97R se resaltan como esferas. Los tres dominios alfa (a l, a2 y a3) del dominio extracelular están codificados por colores en los diferentes tonos de gris indicados.

[0285] La Fig. 2 muestra que los aminoácidos ácido glutámico (E) y arginina (R) presentes en los dominios extracelulares de diversas moléculas de HLA (HLA-B57:01: SEQ ID NO 001; HLA-827:05: SEQ ID NO 007; HLA-827:06: SEQ ID NO 008; HLA-B58:01: SEQ ID NO 009; HLA-CW08: SEQ ID NO 01O; HLA-CW14: SEQ ID NO 011) se correlacionan con un aumento de la expresión usando transfección transitoria en sistemas CHO. Se resaltan las sustituciones de aminoácidos A46E y V97R en HLA-B57.

[0287] La Fig. 3 muestra la selección de clones celulares de expresión para HLA 857.p2m (DGC8-T39, DGC8-T64 y DGC8-73) y HLA-B57<A46EV97R).p2m (DGC8-T54, DGC8-T75 y DGC8-91) sobre la base de la viabilidad celular (A) y los títulos de proteína expresada (B). Los resultados demuestran que la viabilidad celular y los títulos de HLA-B57.p2m no variante son significativamente menores que los de HLA-B57(A46E V97R).p2m para todos los clones.

[0289] La Fig. 4 muestra los perfiles de ARN de (A) HLA-B57 y HLA-B57(A46EV97R), y (B) p2m de clones que coexpresan ambas moléculas.

[0290] La Fig. 5 muestra los geles de rendimiento proteico de HLA-B57.p2m purificado (marcado como iosHvl), HLA-B57(A46EV97R).p2m (marcado como iosHv2) y un resumen de la carga del gel.

[0292] La Fig. 6 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de los constructos de HLA-B57 y HLA-B57(A46EV97R) purificados en tres pasos. A partir del sobrenadante de CHO (A), la purificación por afinidad (8) diverge en dos métodos. La purificación del conformador no asociado a p2m se realiza con un paso adicional para la eliminación de p2m, seguido de SEC (C), y la purificación del HLA-B57 asociado a p2m se realiza mediante SEC directo (D). Los resultados demuestran que los conformadores no asociados a p2m de HLA-B57 pueden purificarse a partir de ambos constructos. HLA-B57.p2m tiene una gran cantidad de especies de alto peso molecular (HMW) y también de especies de bajo peso molecular (LMW), con un contenido reducido de monómeros, mientras que HLA-B57(A46EV97R) tiene un contenido significativamente reducido de HMW, LWM y alto contenido de monómeros.

[0294] La Fig. 7 muestra una tabla que resume los rendimientos asociados de las proteínas indicadas en la Fig. 6 en cada paso del proceso de fabricación como en la Fig. 6.

[0296] La Fig. 8 muestra que las sustituciones de aminoácidos de HLA-B57 aumentan la unión a LILRB2. Estimación cuantitativa de las afinidades de unión de LILRB2 con HLA-B57.no p2m, HLA-B57(A46EV97R).no p2m mediante el método ELISA. Donde HLA-B57.no p2m tiene una EC50 de 21 nM, y HLA-B57(A46EV97R>.no p2m una EC50 de 8,3 nM.

[0298] La Fig. 9 muestra que HLA-B57.no p2m y HLA-B57(A46EV97R).no p2m aumentan el potencial destructor de las células T. Las células T se incubaron con células THP-1 de LMA de manera de contacto celular en una relación de E:T (células efectoras: células T) de 1:1, tratadas con compuestos. (A) Sedimentos celulares representativos fotografiados el día 7 después de la siembra en placas. (B) Número de células cancerosas obtenidas de cocultivos el día 5 después de la estimulación con HLA-B57.no p2m o LA-B57(A46EV97R).no p2m titulados y con controles, medido usando citometría de flujo. *P<0,05, **P<0,01 y ****P<0,0001 (An Ov A unidireccional con corrección de comparaciones múltiples).

[0300] La Fig. 10 muestra que HLA-B57.no p2m y HLA-B57(A46EV97R).no p2m inducen la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M1 asociado con una fagocitosis mejorada. Se aislaron monocitos primarios humanos y se incubaron con compuestos de HLA-B57.no p2m o HLA-B57(A46EV97R).no p2m o controles, y se evaluaron los marcadores de los macrófagos M1 y M2 después de 6-7 días mediante citometría de flujo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****p < 0,0001 (ANOVA unidireccional con corrección de comparaciones múltiples).

[0302] Fig. 11 HLA-B57.no p2m y HLA-B57(A46EV97R).no p2m inducen la fagocitosis de las células cancerosas por los macrófagos. Se incubaron múltiples líneas celulares cancerosas (leucemia de células T Jurkat, cáncer de pulmón A549 y cáncer de colon HCT-116) con macrófagos que habían sido pretratados durante 6-7 días con compuestos y se evaluó la fagocitosis usando citometría de flujo después de 16 horas de cocultivo. (A) Transferencias representativas de citometría de flujo que muestran la fagocitosis de las células cancerosas después del tratamiento con HLA-B57.no p2m o HLA-B57(A46EV97R).no p2m en comparación con los controles. (B) Porcentaje de fagocitosis. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****p < 0,0001 (ANOVA unidireccional con corrección de comparaciones múltiples).

[0304] La Fig. 12 muestra que la monoterapia con proteínas de fusión HLA-B57(A46EV97R) no asociadas a p2m reduce el tamaño de los tumores en el modelo murino singénico de carcinoma de colon C38. Volumen tumoral (en mm3) de los grupos tratados (n = 8) en forma de gráficos de araña que muestran los animales individuales y la respuesta al tratamiento con (A) lgG4 o (8) proteína de fusión de IgG4 de HLA-B57(A46EV97R) no asociado a p2m. Los promedios de los volúmenes tumorales se analizaron mediante ANOVA bidireccional seguido de un análisis post hoc de Bonferroni, ****p<0,001.

[0306] La Fig. 13 muestra los rendimientos de proteína recombinante de las fusiones de Fc de lgG de las estructuras indicadas HLA-A30, B57, B58 y COB de tipo salvaje y variantes con las sustituciones de aminoácidos indicadas en las posiciones 46 y 97. Las células CHO se transfectaron transitoriamente con 2 constructos vectoriales de: a) moléculas HLAde fusión Fcy b) p2m humana, en una proporción 1:1. Los títulos de proteína expresada se cuantificaron usando el sistema Octet Red96 (Sartorius) con biosensores de proteína A.

[0307] Ejemplos

[0309] Material y métodos

[0311] Generación de grupos de clones

[0313] Los ADNC que codifican HLA-B57-Fc (SEQ ID NO 012) y HLA-B57<A46E V97R)-Fc (SEQ ID NO 006) precedidos por señales secretoras líderes se clonaron por separado en vectores de expresión (Probiogen). Los constructos vectoriales que expresan HLA-B57-Fc y HLA-B57(A46EV97R)-Fc se cotransfectaron con un plásmido que comprendía un ácido nucleico (<s>E<q>ID NO 013) que codificaba la proteína p2m (SEQ ID NO 014) mediante microporación (MP) usando el kit de transfección NEON (Life Technologies N°MPKl0096). Usando el mismo proceso, se crearon vectores de expresión de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de lgG4 de cadenas pesadas HLA de clase I inmunogénicas alternativas que comprenden el dominio extracelular de HLA-A30:01 (SEQ ID NO 021), HLA-B58:01 (SEQ ID NO 022) o HLA-Cw08:02 (SEQ ID NO 023), o dominios extracelulares variantes caracterizados por sustituciones de aminoácidos simples o dobles en las posiciones 46 y 97 del polipéptido de la cadena pesada de HLA. Se crearon constructos modificados introduciendo sustituciones de aminoácidos para medir el impacto, añadiendo o eliminando un residuo de aminoácido E46 o un residuo R97 en la porción del dominio extracelular de la cadena pesada de HLA de cada proteína de fusión de HLA-Fc, como se indica a continuación: HLA-A30E46A(SEQ ID NO 024), HLA-A30I97R (SEQ ID NO 025), HLA-A30E46A/I97R(SEQ ID NO 026), HLA-B57A46E(SEQ ID NO 027), HLA-B57V97R(SEQ ID NO 028), HLA-B57A46E/V97R (SEQ ID NO 015), HLA-B58E46A (SEQ ID NO 029), HLA-B58R97V(SEQ ID NO 030), HLA-B58E46A/R97V(SEQ ID NO 031), HLA-C08E46A(SEQ ID NO 032), HLA-C08R97V(SEQ ID NO 033), HLA-C08E46A/R97V(SEQ ID NO 034).

[0315] Las células iniciadoras CHO-DG44 setransfectaron en diferentes relaciones entre HLA-Fc y plásmido de p2m (4:1, 2:1, 1:1, 1:2). Los grupos de clones seleccionados se cultivaron en matraces agitadores estandarizados y con una densidad de siembra celular definida de 4E5 vc/ml en 125 ml de medio suplementado con PBG-CD-C4 que incluía puromicina y metotrexato. Después de ajustar la presión de selección con antibióticos, se seleccionaron grupos de clones individuales para su análisis. La medición de la viabilidad y la densidad de células viables se realizó usando el sistema Vi-CELL XR y el método de exclusión celular con azul de tripano. Las cuantificaciones de títulos se midieron en diferentes puntos temporales (días) usando una máquina Octect RED (ForteBio, una división de Pall) con biosensores de proteína A.

[0317] Purificación de HLA-B57.p2m, HLA-B57(A46E V97R).p2m y procedimiento de eliminación de p2m

[0319] Para la purificación en columna de afinidad se usaron los sobrenadantes filtrados que contenían las HLA-B57.p2m, HLA-B57(A46EV97R).p2m secretadas. La purificación de proteínas y la eliminación de p2m en condiciones ácidas se llevó a cabo mediante un protocolo de purificación en dos pasos. Como primer paso, se usaron perlas de proteína G Sepharose [(4 Fast Flow) Sigma, N° GE-17-0618-01)] para capturar HLA-B57 p2m y HLA-B57(A46EV97R) p2m de los sobrenadantes. Después de una incubación durante la noche a 4 grados en un agitador oscilante, las perlas recuperadas se lavaron en PBS y, posteriormente, se eluyeron las proteínas usando un tampón de elución IgG estándar (pH 2,8) (Tampón de elución de IgG Pierce™, Thermo Fischer N° 21004). Se realizó un segundo paso de purificación basado en cromatografía de exclusión por tamaño para separar HLA-B57 y HLA-B57(A46EV97R) de p2m en condiciones ácidas. Para la separación se usó una columna de filtración en gel Superdex 10/300, preequilibrada en citrato de sodio (100 mM, pH 3,0). Se aplicó una inyección de 0,5 ml de la proteína a una concentración de 2,0 mg/ml, y los picos de proteína HLA-B57 (SEQ ID NO 018) y HLA-B57(A46EV97R> (SEQ ID NO 015) no asociadas a p2m se eluyeron a 12,7 ml y el pico de p2m se eluyó a 22,0 ml. Estos resultados demuestran que la separación de p2m y la purificación de HLA-B57 y HLA-B57(A46EV97R) no asociadas a p2m es factible en condiciones ácidas.

[0321] Cuantificación de la interacción de LILRB2 con HLA-B57 y HLA-B57(A46E V97R) no asociadas a p2m

[0323] La cuantificación de la afinidad de interacción de LILRB2 con HLA-B57 y HLA-B57(A46EV97R) no asociadas a p2m se llevó a cabo usando el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se usaron placas de 96 pocillos con fondo plano recubiertas de estreptavidina Pierce™ de alta capacidad de unión (Pierce N° 15500) y se inmovilizaron 50 pI de moléculas de antígeno biotiniladas C-terminalmente (LILRB2, BPS Bioscience N° 100335) a una concentración final de 5 pg/ml en tampón PBS. Como controles negativos se usaron PBS e isotipo de lgG. Se aplicó (50 pI) una dilución en serie de HLA-B57 o HLA-B57(A46EV97R) no asociada a p2m (ocho puntos de concentración: 10, 2,5, 1, 0,25, 0,1,0,025, 0,01,0,0025 pg/ml) por duplicado. Para la detección se usó un anticuerpo anti-IgG-humana de cabra conjugado con APC (Jackson lmmuno Research N°109- 135-098) con una dilución de 1:100 en TBS (50 pI). Por último, se añadieron 50 pI de TBS en cada pocillo y se realizó un escaneo de fluorescencia con longitudes de onda de excitación y emisión de APC de 650 nm y 660 nm, respectivamente. Usando Graphpad Prism v9.1.2, se usó un modelo logarítmico (agonista) frente a respuesta basado en tres parámetros para determinar la EC50 de la interacción.

[0325] Tinción de anticuerpos

[0327] Se realizó citometría de flujo en un analizador LSR Fortessa (BD Biosciences). Los marcadores de superficie de las células T CD3, CD4 y CD8 se evaluaron mediante tinción con anticuerpos (Bio Legend) a una dilución de 1:100. La expresión de HLA-DR en los macrófagos se evaluó mediante tinción con anticuerpos (BioLegend) a una dilución de 1:100. El panel de polarización de macrófagos se realizó usando anticuerpos contra CD80, CD86, CD68, CD163, CD206 y CD209 (Biolegend) a una dilución de 1:100. Todas las tinciones se realizaron en hielo durante 20 minutos, luego se lavaron y se volvieron a suspender de acuerdo con la práctica estándar.

[0328] Ensayo de destrucción de células T

[0330] Para el ensayo de cocultivo, se aislaron células T humanas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos, se estimularon con activador de CD3/CD28 (ThermoFisher N° 11131D) y se cultivaron en presencia de 50 U/ml de rhlL-2 durante 48 horas. A continuación, las células T se lavaron con el activador de CD3/CD28 y se mezclaron con las células de leucemia humana indicadas en una placa de 96 pocillos con fondo en U en pocillos duplicados. A cada pocillo se añadieron compuestos a las concentraciones indicadas. Las células de leucemia se tiñeron antes del cocultivo con el marcador de proliferación celular CellTrace™ violeta (ThermoFisher N° C34557) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizó la cantidad de células sembradas, la relación E:T y la duración de los cocultivos para diferentes líneas celulares leucémicas, y se indica en la figura asociada. Los cocultivos se fotografiaron usando un microscopio invertido, y las células T se tiñeron con anticuerpos contra CD3, CD4 y CD8 y se analizaron con el analizador LSR Fortessa. Las células cancerosas vivas dieron positivo en el marcador de proliferación celular violeta y negativo en la tinción de células muertas con Sytox rojo (ThermoFisher N° S34859). El recuento absoluto tanto de las células T como de las células cancerosas positivas para la tinción violeta se midió usando perlas de recuento Bright (ThermoFisher N° C36590).

[0332] Fagocitosis de macrófagos Ensayo basado en citometría de flujo

[0334] Se aislaron monocitos primarios derivados de donantes humanos a partir de PBMC de un donante sano y se diferenciaron en macrófagos mediante de 5 a 7 días de cultivo en medio lmmunoCult (StemCell Technologies N° 10961) 50 ug/ml de rhMCSF (StemCell N° 78057.1). El día 1 después del sembrado en placas, se añadieron compuestos a los pocillos a una concentración de 20 pg/ml. Entre el día 5 y el 7 después de la siembra en placas, se volvieron a añadir compuestos a los macrófagos y se realizaron dos experimentos posteriores: 1) polarización de los macrófagos: para los estudios de polarización, se analizaron los macrófagos cultivados mediante citometría de flujo para determinar la expresión de CD80, CD86, CD68, CD163, CD206 y CD209 (Biolegend) un día después del segundo tratamiento con compuestos. 2) Fagocitosis: Las células diana se sembraron en placas en macrófagos en una relación de 0,5x106 a 1x106 macrófagos en placas de 12 pocillos y se analizaron para determinar la fagocitosis 16 horas después de la siembra en placas. Las células diana se tiñeron con el marcador de proliferación celular violeta CellTrace™ antes del cocultivo, lo que permitió diferenciarlas de los macrófagos, que se tiñeron con HLA-DR mediante citometría de flujo. La fagocitosis se evaluó como el porcentaje de células diana positivas para la tinción violeta de los macrófagos positivos para HLA-DR, según se analizaron usando FlowJo v.10.6.1 (Tree Star). Cada reacción de fagocitosis se realizó en duplicados técnicos. Todas las réplicas biológicas indican donantes independientes de macrófagos humanos.

[0336] Tratamientos in vivo

[0338] Se inyectaron fragmentos tumorales de C38 por vía subcutánea en el costado derecho de ratones C578L/6 hembra singénicos. Una vez que el tumor alcanzó ± 50 mm3 en el colon, los animales se distribuyeron de acuerdo con el tamaño individual del volumen tumoral y se dividieron en grupos que no presentaban diferencias estadísticas entre ellos. Los diámetros tumorales se midieron usando un calibre y el volumen se calculó de acuerdo con la fórmulaD/2xd2,dondeDydson el diámetro más largo y el más corto del tumor en mm, respectivamente. El diseño experimental de los puntos temporales de inyección de las células y la inyección de sustancias se estableció de la siguiente manera: isotipo lgG4 (10mg/Kg) bisemanal x 3; HLA-B57(A46EV97R) no asociada a p2m (10 mg/Kg) bisemanal x 3.

[0340] Ejemplo 1: Correlación de las secuencias de HLA con el nivel de expresión

[0342] Para optimizar el perfil de expresión de las proteínas de fusión Fc de Ig de cadena pesada de HLA no asociadas a p2m para uso médico, se alinearon las secuencias de proteínas de un intervalo de secuencias de cadena pesada de HLA para identificar los residuos potencialmente asociados con un mayor rendimiento en un sistema de transfección transitoria usando células de ovario de hámster chino (CHO). Esta comparación mostró que los residuos de aminoácidos ácido glutámico (E) y arginina (R) específicos presentes en diversas moléculas HLA, se correlacionaban con un aumento de la expresión, según se mide por la concentración de proteína recombinante en el sobrenadante, lo que sugiere que estos cambios de sustitución de aminoácidos pueden conferir a un HLA-B57(A46EV97R) variante unos niveles de expresión superiores de las proteínas de HLA relacionadas cuando se expresan en células de mamíferos (Fig. 1 y 2).

[0344] El haplotipo de HLA-B57 se caracteriza por su vinculación genética con fenotipos inmunitarios y se une a receptores innatos, que incluyen el miembro 2 de la subfamilia B de receptores similares a la inmunoglobulina (LILRB2), lo que convierte a la secuencia de proteína de HLA-B57 en un componente de cadena pesada de HLA especialmente deseable para su uso en una proteína de fusión de HLA. Se introdujeron mutaciones de sustitución en la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de HLA-Fc de IgG4 basada en los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA-B57 de la proteína HLA-B57:01 de origen natural (SEQ ID NO 001), intercambiando una A en la posición 46 por una E, y una V en la posición 97 por una R (Fig. 1). A continuación, se sintetizó el ADN que codifica las dos proteínas de fusión de HLA, que comprende un polipéptido lgG4 enlazado por una secuencia puente de aminoácidos corta a una de las dos opciones diferentes de polipéptido de cadena pesada de HLA: el polipéptido extracelular de HLA-B57 de tipo salvaje (SEQ ID NO 012, HLA-B57 -Fc) o el polipéptido mutante de HLA-B57(A46E V97R) (SEQ ID NO 006, HLA-B57<a46e,v97r)-Fc). Cada constructo se clonó por separado en vectores de expresión. Los constructos vectoriales que expresaban HLA-B57-Fc y HLA-B57(A46EV97R)-Fc se cotransfectaron en células CHO en combinación con un intervalo de relaciones de un segundo plásmido que codificaba la proteína humana p2m.

[0346] Ejemplo 2: Expresión mejorada de HLA-B57(A46E V97R).B2m

[0348] Para probar si los residuos de aminoácidos sustitutos afectaban a la expresión o al rendimiento de las proteínas de fusión de lgG4 de cadena pesada de HLA recombinantes, se aislaron y subclonaron clones de células CHO que expresaban el constructo HLA-B57(A46EV97R)-Fc y HLA-B57-Fc, y se evaluó la concentración de los complejos resultantes que comprendían p2m junto con proteínas de fusión de HLA-B57 de tipo salvaje (HLA-B57.p2m) o mutante (HLA-B57(A46EV97R).p2m) mediante biosensores de proteína A (sistema Octet Red96, Sartorius). Los clones productores de HLA-B57(A46EV97R).p2m mostraron un aumento de las células y produjeron un título significativamente más alto de proteína de fusión de HLA en el sobrenadante en comparación con las células de control que expresaban HLA-B57(A46EV97R).p2m (Fig. 3). Una estructura que comprendía una señal de secreción alternativa además de las dos mutaciones (SEQ ID NO 020) produjo un rendimiento en sobrenadante similar de proteína de fusión recombinante. Los niveles de ARN de HLA-B57.p2m, HLA-B57(A46EV97R).p2m y p2m fueron iguales entre los clones celulares, lo que demuestra que la expresión de alto título de HLA-B57(A46EV97R).p2m no está correlacionada con un mayor número de copias de ADN, sino más bien asociada a un plegamiento, solubilidad y estabilidad intrínsecos eficientes del nuevo constructo (Fig. 4). El análisis por HPLC de las proteínas purificadas mostró que el sobrenadante de los clones que expresaban el constructo mutante HLA-B57(A46EV97R) proporcionaron una mayor proporción de dímeros de cadena pesada de HLA / p2m de bajo peso molecular, en comparación con el aumento de oligómeros de alto peso molecular en el sobrenadante del constructo de HLA-B57 original (Fig. 5). El aumento del rendimiento del constructo de HLA-B57(A46E V97R) también fue evidente después de la purificación y el replegamiento de los monómeros que comprenden HLA sin asociación con la cadena ligera de p2m (Fig. 6, resumido en la Fig. 7).

[0350] Ejemplo 3: Características inmunomoduladoras de HLA-B57(A46E V97R)

[0352] Se comparó la actividad de HLA-B57(A46EV97R) con la estructura original de HLA-B57(A46EV97R) en varios ensayos para confirmar que la actividad biológica del dominio de HLA de una proteína de fusión de Fc de IgG4 de HLA no se veía comprometida por la adición de los dos cambios de aminoácidos. El análisis ELISA de compuestos no asociados a p2m- basado en la secuencia de cadena pesada de HLA-B57 no variante o variante demostró que las dos sustituciones de aminoácidos no redujeron la unión a LILRB2 y, de hecho la proteína de fusión de HLA variante mostró un valor de EC50 mejorado y más bajo de saturación de unión a LILRB2 (Fig. 8). El efecto inmunomodulador de los conformadores de HLA-B57(A46EV97R) no asociados a p2m fue comparable al de los controles que carecían de las sustituciones de aminoácidos en los ensayos que medían la capacidad de aumentar el potencial de destrucción de las células T (Fig. 9), y la polarización (medida por marcadores fenotípicos de superficie representativos) y la capacidad de fagocitosis de los macrófagos M1 cultivados con una variedad de líneas celulares tumorales (Fig. 10 y 1l). Por último, cuando se administró por vía intraperitoneal la molécula HLA-B57(A46EV97R)-Fc no asociada a p2m demostró una acción inmunoestimuladora terapéutica in vivo, inhibiendo el crecimiento de un modelo murino de cáncer de colon (Fig. 12).

[0354] Ejemplo 4: expresión de la cadena pesada de HLA de clase I mejorada asociada a E6E y 97R

[0356] Para confirmar la importancia de los residuos 46E y 97R para la expresión recombinante óptima de varias cadenas pesadas de HLA de clase I asociadas con diferentes fenotipos inmunitarios en la población humana, los inventores midieron el impacto de estas sustituciones de aminoácidos en constructos adicionales de proteínas de fusión de Fc de lgG que comprenden secuencias polipeptídicas adicionales de cadenas pesadas HLA de clase I asociadas con diferentes efectos inmunogénicos en la población humana, HLA-A30, HLA-B58 y HLA-C08 (Fig. 13). Se crearon vectores de expresión de ácido nucleico que codificaban proteínas de fusión de lgG4 de HLA de tipo salvaje que comprendían los dominios extracelulares de las secuencias de proteínas de cadena pesada de HLA proporcionadas por la función de informe de alelos de datos en línea IPD-IMGT/HLA para los alelos de HLA: LA-A30, A*30:01:01:01 (SEQ ID NO 021), HLA-B57 B*57:01:01:01 (SEQ ID NO 018), HLA-B58, B*58:01:01:01 (SEQ ID NO 022), y HLA-C08, C*08:02:01:01 (SEQ ID NO 023). A continuación, se crearon constructos modificados introduciendo sustituciones de aminoácidos para medir el impacto, añadiendo o eliminando un residuo de aminoácido E46 o un residuo R97 en la porción del dominio extracelular de la cadena pesada de HLA de cada proteína de fusión de HLA-Fc, como se indica a continuación: HLA-A30E46A, HLA-A30I97R, HLA-A30E46A/I97R, HLA-B57A46E, HLA-B57V97R, HLA-B57A46E/V97R, HLA-B58E46A, HLA-B58R97V, HLA-B58E46A/R97V, HLA-C08E46A, HLA-C08R97V, HLA-C08E46A/R97V. A continuación, se evaluó el rendimiento de producción de constructos de HLA asociados a p2m por células CHO transfectadas transitoriamente con vectores de expresión de ácido nucleico que codificaban proteínas de fusión de lgG4 de cadenas pesadas HLA de tipo salvaje y variante, y p2m en el sobrenadante de las células CHO usando biosensores de proteína A (sistema Octet Red96, Sartorius).

[0358] Estos resultados confirmaron que, en todas las moléculas probadas, las cadenas pesadas de HLA caracterizadas por los residuos de aminoácidos 46E y 97R se asociaban con rendimientos óptimos de proteína recombinante, y que la introducción tanto de una sustitución A46E como V97R en la secuencia de cadena pesada de HLA-B57 lograba el rendimiento más alto entre todos los constructos. Por el contrario, la introducción de tanto 46A como 97V presentes en HLA-B57 de tipo salvaje en HLA-A30, HLA-B58 o HLA-C08 redujo significativamente los rendimientos de productividad, lo que confirma que los aminoácidos 46E y 97R son clave para la estabilización y la producción de títulos óptimos de cadenas pesadas de HLA, incluyendo las moléculas de HLA-Fc.

[0360] Secuencias:

[0362] SEQ ID NO 001 dominio extracelular de HLA-B57:01 de origen natural GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPL TLRWEPSSQS

[0363] SEQ ID NO 002 dominio extracelular de cadena pesada de HLA-B57 variante (A46E/V97R) GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS

[0364] SEQ ID NO 003 conector

[0365] GGGGSGGGGS

[0366] SEQ ID NO 004 polipéptido de Fc de IgG4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

[0367] SEQ ID NO 005 Proteína de fusión de HLAB57 recombinante (A46E/V97R) con señal de secreción AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQCGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAAS PRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGP DGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWL RRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE TRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESK YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

[0368] SEQ ID NO 006 ADN de la proteína de fusión de HLAB57 (A46E/V97R) gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtggatcccactctatgagatacttctac accgcaatgtctcgtcctggtcgcggggaacctagatttattgctgtgggatatgttgatgatactcaatttgtgcgttttgactccgacgcag cctcaccacggatggagcctagagcaccctggatagaacaagaagggcctgaatactgggatggtgaaacgcgaaacatgaaagc atcagctcaaacctatcgggagaacctgcgtatcgcactgagatactacaaccaatctgaggctggaagtcacattatccaacgtatgt atggttgtgacgtcggtcccgacggtcgcctgctccgtggtcatgaccaatcggcctatgacggaaaggattacatcgccttaaacgagg acctgagctcgtggactgccgcagatactgccgctcaaattacccaacggaagtgggaagcggcgcgcgtcgccgaacaactgcga gcctacctggagggcctgtgcgtcgagtggttgagacgctacctggagaacgggaaagagacgctgcaaagggccgatccccccaa gacccatgtcacacatcacccgatctcggatcacgaagcaactctgcgatgctgggctcttgggttctaccccgctgagattacactgact tggcaaagggacggcgaagatcaaacacaagacaccgaacttgtggagactaggccagctggagatagaaccttccaaaagtgg gctgccgtcgtcgtccctagtggagaggaacaacgatatacttgccacgtccaacacgaaggtttgccaaagcccctcactcttcgctgg gaacctagctcgcaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaatacggtccaccctgcccaccttgcccg gcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacct gcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggcgtcgaggtgcataatgccaagaccaa gcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagta caagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccag gtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctacccctccgacat tgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctg tactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccact atacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga

[0370] SEQ ID NO 007 dominio extracelular de HLA-B27:05

[0371] GSHSMRYFHTSVSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRE TQICKAKAQTDREDLRTLLRYYNQSEAGSHTLQNMYGCDVGPDGRLLRGYHQDAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGECVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS

[0372] SEQ ID NO 008 dominio extracelular de HLA-B27:06 GSHSMRYFHTSVSRPGRGEPRFITVGYVDDTLFVRFDSDAASPREEPRAPWIEQEGPEYWDRE TQICKAKAQTDRESLRTLLRYYNQSEAGSHTLQNMYGCDVGPDGRLLRGYDQYAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQLRAYLEGECVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPGEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS

[0373] SEQ ID NO 009 dominio extracelular de HLA-B58:01 GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS

[0374] SEQ ID NO 010 dominio extracelular de HLA-CW08 CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAARTAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQS

[0375] SEQ ID NO 011 dominio extracelular de HLA-CW14 CSHSMRYFSTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMFGCDLGPDGRLLRGYDQSAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADTAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQWDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVV PSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWEPSSQP

[0376] SEQ ID NO 012 ADNc que codifica HLA-B57-Fc gcggccgccatgaactttggcctgcggctgatcttectggtgctgaccctgaagggcgtgcagtgcggateccactecatgcggtacttct acaccgccatgtcccggcctggacggggagagcctagattcattgccgtgggctacgtggacgacacccagttcgtcagattcgactcc gacgccgcctctcctcggatggctcctagagccccttggatcgagcaggaaggccccgagtactgggacggcgagacacggaacat gaaggcctccgcccagacctacagagagaacctgagaatcgccctgcggtactacaaccagtccgaggccggctcccacatcatcc aagtgatgtacggctgcgacgtgggccccgatggcagactgctgagaggccacgatcagtccgcctacgacggcaaggactatatcg ccctgaacgaggacctgtcctcctggaccgctgccgataccgccgctcagatcactcagcggaagtgggaggccgccagagtggctg aacagctgagagcctacctggaaggcctgtgcgtggaatggctgcggagatacctggaaaacggcaaagagacactgcagcgggc cgacccccctaagacccacgtgacccaccaccctatctccgaccacgaggccaccctgagatgttgggccctgggcttttaccccgcc gagatcaccctgacctggcagagagatggcgaggaccagacccaggacaccgagctggtggaaaccagacctgccggcgaccg gaccttccagaaatgggctgctgtggtggtgccctccggcgaggaacagagatacacctgtcacgtgcagcacgagggcctgcccaa gcccctgactctgagatgggagccttccagccaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaatacggtcc accctgcccaccttgcccggcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctgatgatctccc ggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggcgtcgaggt gcataatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactg gctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggccaagggcc agccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaaa ggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggac tccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcacg aggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga

[0378] SEQ ID NO 013 Ácido nucleico que codifica la proteína p2m gcggccgccatgtcccggagcgttgcgctggctgtgttggccctgctctctctctccgggctggaagcaattcaacgtacacccaagattc aggtctatagtcgccaccccgctgagaatggaaagtctaattttctgaactgctatgtgtccggctttcatccctccgatattgaggttgactt actcaagaacggagagcgcatagaaaaggttgaacactctgacctcagttttagcaaggactggagtttctacttactgtactacactga attcacccctaccgaaaaggacgaatacgcttgtcgtgtgaatcacgttactctgtctcaacccaaaattgtcaagtgggatcgggatatg tgataag

[0380] SEQ ID NO 014 Proteína P2m AAAMSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNG ERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM

[0381] SEQ ID NO 015 proteína de fusión de Fc de IgG4 de HLA-B57 variante (A46E/V97R) GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQS GGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0382] SEQ ID NO 016 ADN de la proteína de fusión mutante de HLA857 (A46E/V97R) ggatcccactctatgagatacttctacaccgcaatgtctcgtcctggtcgcggggaacctagatttattgctgtgggatatgttgatgatact caatttgtgcgttttgactccgacgcagcctcaccacggatggagcctagagcaccctggatagaacaagaagggcctgaatactggga tggtgaaacgcgaaacatgaaagcatcagctcaaacctatcgggagaacctgcgtatcgcactgagatactacaaccaatctgaggc tggaagtcacattatccaacgtatgtatggttgtgacgtcggtcccgacggtcgcctgctccgtggtcatgaccaatcggcctatgacgga aaggattacatcgccttaaacgaggacctgagctcgtggactgccgcagatactgccgctcaaattacccaacggaagtgggaagcg gcgcgcgtcgccgaacaactgcgagcctacctggagggcctgtgcgtcgagtggttgagacgctacctggagaacgggaaagaga cgctgcaaagggccgatccccccaagacccatgtcacacatcacccgatctcggatcacgaagcaactctgcgatgctgggctcttgg gttctaccccgctgagattacactgacttggcaaagggacggcgaagatcaaacacaagacaccgaacttgtggagactaggccag ctggagatagaaccttccaaaagtgggctgccgtcgtcgtccctagtggagaggaacaacgatatacttgccacgtccaacacgaag gtttgccaaagcccctcactcttcgctgggaacctagctcgcaatcaggaggcggaggctcgggaggcggaggcagcgaaagcaaa tacggtccaccctgcccaccttgcccggcgcctgaatttctgggcggaccttccgtgtttctgttccccccgaagcccaaggacaccctga tgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagaccccgaagtccaatttaattggtatgtcgacggc gtcgaggtgcataatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcac caggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctcgtcaattgaaaagaccatctccaaggc caagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgt ctggtgaaaggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccct gtgctggactccgacggctccttcttcctgtactctcggctgacagtggataagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgcagcg tgatgcacgaggccctgcacaaccactatacccagaagtccctgtccctgagcctgggctgatga

[0384] SEQ ID NO 017 Proteína de fusión de HLA-B57 y señal de secreción AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQCGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAAS PRMAPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGP DGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWL RRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE TRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESK YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

[0385] SEQ ID NO 018 Proteína de fusión HLA-B57 GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0386] SEQ ID NO 019 señal de secreción

[0387] AAAMNFGLRLIFLVLTLKGVQC

[0388] SEQ ID NO 020 Proteína de fusión recombinante de HLA-B57 variante (A46E/V97R) y señal de secreción MASPAQLLFLLLLWLPDGVHAGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAAS PRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGP DGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWL RRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVE TRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESK YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

[0390] SEQ ID NO 021 Proteína de fusión de Fc de IgG4 de HLA-A30 GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQERPEYWDQ ETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIA LNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKT HMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLG

[0392] Dominio extracelular de HLA-A*30:01, conector peptídico, Fc de IgG4

[0394] SEQ ID NO 022 Proteína de fusión de Fc de IgG4 de HLA-B58 GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0396] Dominio extracelular de HLA-B*58:01, conector peptídico, Fc de IgG4

[0398] SEQ ID NO 023 Proteína de fusión de Fc de IgG4 de HLA-C08 CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGS ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG

[0400] Dominio extracelular de HLA-Cw0802, conector peptídico, Fc de IgG4

[0402] SEQ ID NO 024 HLA-A*30:01 E46A GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMAPRAPWIEQERPEYWDQ ETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQIMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIA LNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKT HMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLG

[0403] SEQ ID NO 025 HLA-A*30:01 I97R GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQERPEYWDQ ETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQRMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIA LNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKT HMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLG

[0404] SEQ ID NO 026 HLA-A*30:01 E46A/ I97R

[0405] GSHSMRYFSTSVSRPGSGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMAPRAPWIEQERPEYWDQ ETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTIQRMYGCDVGSDGRFLRGYEQHAYDGKDYIA LNEDLRSWTAADMAAQITQRKWEAARWAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKT HMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLG

[0406] SEQ ID NO 027 HLA-B*5701 A46E GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0407] SEQ ID NO 028 HLA-B*5701 V97R GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRMAPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDVGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0408] SEQ ID NO 029 HLA-8*58:01 E46A GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTAPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0409] SEQ ID NO 030 HLA-8*58:01 R97V GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0410] SEQ ID NO 031 HLA-8*58:01 E46A, R97V GSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTAPRAPWIEQEGPEYWDG ETRNMKASAQTYRENLRIALRYYNQSEAGSHIIQVMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIAL NEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHV THHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSG EEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPSSQSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLG

[0411] SEQ ID NO 032 HLA-Cw0802 E46A CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGAPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQRMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG

[0412] SEQ ID NO 033 HLA-Cw0802 R97V CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGEPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQVMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG

[0413] SEQ ID NO 034 HLA-Cw0802 E46A, R97V CSHSMRYFYTAVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVQFDSDAASPRGAPRAPWVEQEGPEYWDR ETQKYKRQAQTDRVSLRNLRGYYNQSEAGSHTLQVMYGCDLGPDGRLLRGYNQFAYDGKDYI ALNEDLRSWTAADKAAQITQRKWEAAREAEQRRAYLEGTCVEWLRRYLENGKKTLQRAEHPKT HVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVP SGEEQRYTCHVQHEGLPEPLTLRWGPSSQPGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLG

[0415] Publicaciones citadas:

[0416] Arosa et al. Trends in Immunology, marzo de 2007; 28(3): 115-23

[0417] WO 2017153438 A1

[0418] Zhang et al., China Life Sci. (2012) 55:818-825

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una proteína de fusión del antígeno leucocitario humano (HLA) obtenida mediante la introducción de una o dos sustituciones de aminoácidos en un polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57 de origen natural, en donde el método comprende introducir en una célula

a. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de HLA, dicha proteína de fusión de HLA comprendiendo:

i. un polipéptido variante de HLA-B57, en donde el polipéptido variante de HLA-B57 es un polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57caracterizado porglutamato (E) en la posición 46 y una arginina (R) en la posición 97; y

ii. un polipéptido de la región cristalizable (Fc) del fragmento de inmunoglobulina (lg), en particular un Fc de isotipo G de lg (lgG), más particularmente un Fc de isotipo 4 de lgG (lgG4); y

b. una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína p2-microglobulina (p2m);

en donde cada secuencia de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia promotora operativa en dicha célula, cultivar a continuación la célula en condiciones en las que se expresan la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de HLA y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína p2m, para proporcionar un complejo de proteína de fusión de HLA y proteína p2m.

2. Un método para producir una proteína de fusión de HLA que comprende los siguientes pasos:

a. en un paso de sustitución de aminoácidos, sustituir en un polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57 de origen natural, el aminoácido en la posición 46 por una E, y/o sustituir el aminoácido en la posición 97 por una R, para proporcionar un polipéptido variante de HLA-B57; y

b. en un paso de expresión, introducir en una célula secuencias de ácido nucleico que codifican:

i. una proteína de fusión de HLA que comprende dicho polipéptido variante de HLA-B57 y un polipéptido de Fc de lgG, y

ii. una proteína p2m,

en donde ambas secuencias de ácido nucleico están bajo el control de una secuencia promotora operativa en dicha célula, para proporcionar un complejo de proteína de fusión de HLA y proteína p2m.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57 de origen naturalse caracteriza por:

i. una A en la posición 46, y

ii. una V en la posición 97.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión de HLA comprende:

a. un polipéptido variante de HLA-B57 como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

b. un polipéptido de Fc de lgG;

c. un conector peptídico que conecta el polipéptido variante de HLA-B57 con el polipéptido de Fc de lgG;

y en donde, opcionalmente, la proteína de fusión de HLA comprende además:

d. una señal de secreción.

5. Una proteína de fusión de HLA aislada que comprende:

a. un polipéptido variante de HLA-B57,

- en donde el polipéptido variante de HLA-B57 es una variante de un polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57 de origen natural;

- y en donde el polipéptido variante de HLA-B57se caracteriza poruna E en la posición 46 y una R en la posición 97; y

b. un polipéptido de Fc de Ig.

6. La proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la reivindicación 5,

- en donde el polipéptido variante de HLA-B57 comprende, o consiste esencialmente en, la secuencia SEQ ID NO 002; y/o

- en donde el polipéptido de Fc de Ig comprende, o consiste esencialmente en, la secuencia SEQ ID NO 004, - y en donde, opcionalmente, el polipéptido variante de HLA-B57 y el polipéptido de Fc de Ig están unidos por un conector peptídico.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde la proteína de fusión de HLA, o la proteína de fusión de HLA aislada, comprende o consiste esencialmente en la secuencia designada SEQ ID NO 015.

8. El HLA aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el HLA aislado se presenta en forma de un dímero que comprende un primer monómero y un segundo monómero;

- y en donde dicho primer monómero comprende, o consiste esencialmente en, una primera proteína de fusión de HLA obtenida mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7;

- y en donde dicho segundo monómero comprende, o consiste esencialmente en, una primera proteína de fusión de HLA obtenida mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. El método para producir una proteína de fusión de HLA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o 7, o la proteína de fusión de h La aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicha proteína de fusión de HLA tiene una unión mejorada a LILRB2 en comparación con una proteína de fusión de HLA equivalente que comprende dicho polipéptido del dominio extracelular de HLA-B57 de origen natural.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7 o 9, o la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde la proteína de fusión de HLA no está asociada con un epítopo peptídico.

11. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

12. Un vector de expresión de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, bajo el control de una secuencia promotora operativa en una célula.

13. Una célula que comprende la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, o el ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 11, o el vector de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna, que comprende una proteína de fusión de HLA obtenida a partir de un método como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7, 9 o 10, la proteína de fusión de HLAaislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, o el vector de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12.

15. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14,

- en donde la composición farmacéutica se administra antes, en combinación con o después de un agente inhibidor de puntos de control,

- y en donde el agente inhibidor de puntos de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1 o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o menos (afinidad más alta).

16. Un agente inhibidor de puntos de control para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica maligna, en donde el agente inhibidor de puntos de control se administra en combinación con una proteína de fusión de HLA obtenida mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7, 9 o 10, la proteína de fusión de HLA aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, o el vector de expresión de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 12, o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15,

- en donde el agente inhibidor de puntos de control es un anticuerpo capaz de unirse a uno de CTLA-4, PD-1, PD-L1 o PD-L2 con una constante de disociación de 10'7 mol/L o menos (afinidad superior).