ES3048136T3 - Animal model for cancer study - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Modelo animal para estudio del cáncer

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a un modelo animal para estudiar células cancerosas, particularmente de tumores sólidos humanos, y más particularmente tumores cerebrales primarios y secundarios, tumores pulmonares y tumores mamarios.

[0005] Introducción

[0006] La modelización de cánceres humanos en animales de laboratorio es una cuestión central en los ensayos preclínicos que acompañan al desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Los principales criterios para los modelos animales desarrollados con este fin son la fiabilidad del modelo, la rapidez de ejecución y el coste.

[0007] Los modelos animales desarrollados para el estudio de tumores y utilizados actualmente son esencialmente modelos de ratón. Estos modelos requieren un tiempo relativamente largo de preparación y cuestan mucho dinero. Es más, ciertos tipos de células cancerosas son incapaces de implantarse en modelos animales murinos.

[0008] El embrión de gallinácea, en particular pollo o codorniz, es un modelo interesante para realizar experimentosex vivo,en particular para el estudio del desarrollo embrionario y para experimentos de xenotrasplante. Es barato, muy accesible y fácil de manejar. Es un modelo de elección para estudiar la proliferación, diferenciación y migración celular. Este modelo animal también puede utilizarse para estudiar tumores.

[0009] Un modelo clásico de estudio en el embrión de gallinácea es el injerto de células exógenas en los anexos del embrión, más concretamente en la membrana corioalantoidea (CAM). Las células tumorales se implantan en la membrana del embrión de pollo. Tras incubarse durante unos 2 días, se forma un tumor. Este tumor aprovecha la red vascular particularmente bien desarrollada de la membrana embrionaria para crecer. Dicho sistema ha permitido reproducirin vivotumores humanos, en particular glioblastoma, mostrando características celulares y moleculares similares a las observadas en tumoresin vivo.(Hagedornet al.,2005)

[0010] En particular, estos injertos de células cancerosas en la membrana corioalantoidea se han utilizado para determinar el potencial metastásico de las células cancerosas, considerándose que las células injertadas que atraviesan la membrana tienen más probabilidades de metastatizar (Documento US 6,228,345).

[0011] Este modelo de injerto de membrana corioalantoidea también se utiliza ampliamente para cribar moléculas terapéuticas, en particular moléculas diseñadas para inhibir la angiogénesis tumoral (véase, por ejemplo, el documento WO 2015/074050).

[0012] La solicitud de patente US 2013/0171680 describe el xenoinjerto de células hematopoyéticas humanas malignas en otros apéndices embrionarios: las células cancerosas se inyectan en el saco amniótico, el saco vitelino o los vasos sanguíneos de la membrana CAM.

[0013] Hasta la fecha, se ha trabajado poco en modelos de embriones de gallináceas injertados con células cancerosas dentro de los tejidos del embrión, y no en sus apéndices.

[0014] Carter et al. (Oncogénesis, 2012) inyectaron células de neuroblastoma humano en los vasos sanguíneos de un embrión de pollo en el estadio de desarrollo de 3 a 6 días. En contacto con el microambiente embrionario, las células se reprograman hacia un fenotipo más benigno, sobre todo cuando se adhieren al tejido neuronal.

[0015] Buschet al.(2013) describen la inyección de células de melanoma o de cáncer de mama en el embrión de pollo, y más concretamente: en el lumen del tubo neural; en la copa óptica; o en el ventrículo del rombencéfalo. Estas células se inyectan en el lumen de las vesículas del tubo neural, en lugar de injertarse en los tejidos del embrión. Las células inyectadas se agregan en grupos, pero no migran.

[0016] De forma similar, Cageet al.(2012) estudiaron la diseminación leptomeníngea de células de meduloblastoma inyectadas en los ventrículos cerebrales de embriones de pollo. Las células inyectadas se dispersan mezclándose con el líquido cefalorraquídeo, pero no migran dentro de los tejidos ni se reproducen.

[0017] Kulesa y colaboradores (PNAS, 2006) describieron el injerto de células de melanoma humano, a nivel de las crestas neurales, en embriones de pollo en un estadio de desarrollo indicado como "6-8 somitos" que corresponde a un estadio entre HH8,5 y HH9,5 según la nomenclatura de referencia. En esta etapa del desarrollo del embrión, las células trasplantadas no forman tumores, se reprograman en células benignas y se integran en los tejidos según el perfil de migración de los melanocitos.

[0018] En estos modelos, las células cancerosas implantadas no son capaces de reproducir tumores,a fortiorino son capaces de reproducir tumores en tejidos homólogos a aquellos de los que se originan dichos tumores.

[0019] Así, aunque el embrión de gallinácea es un modelo animal de elección para el estudioex vivode tumores humanos, los modelos desarrollados hasta la fecha no permiten el estudio de la migración de células cancerosas dentro de un organismo vivo, ni el estudio de tumores en un microambiente tisular homólogo al del tumorin vivo..

[0020] La presente invención se refiere al desarrollo de un modelo animal para el estudio de cánceres, en particular cánceres humanos, en el que células cancerosas injertadas dentro de un embrión de gallinácea migrarán y crearán focos cancerosos en tejidos del embrión correspondientes a los tejidos de los que proceden las células cancerosas (injertos ortotópicos), o en otros tejidos (injertos heterotópicos).

[0021] Sumario de la invención

[0022] La presente invención se refiere a un embrión de gallinácea, pollo o codorniz, en el que se han injertado, dentro de los tejidos del embrión, en sitios específicos distintos del lumen del tubo neural células cancerosas que no son ni neuroblastomas ni melanomas y que se reproducen y forman tumores en el embrión, en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto.

[0023] El injerto se caracteriza porque se realiza en un momento determinado del desarrollo del embrión, concretamente en un momento comprendido entre los estadios HH10 y HH25, y más concretamente entre los estadios HH13 y HH15. Tal embrión injertado es un modelo animal para estudiar cánceres, haciendo posible seguir la migración de células cancerosas y el desarrollo de tumores dentro de tejidos homólogos a los tejidos de los que se originan las células cancerosas, y/o donde estas células cancerosas tienden a crear focos cancerosos secundarios, es decir, a metastatizar.

[0024] Tal embrión injertado es también un modelo animal para estudiar cánceres que pueden implantarse y/o desarrollarse en diferentes tejidos del embrión, heterotópicamente.

[0025] Así, la presente invención se refiere a un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas dentro de los tejidos del embrión, no introduciéndose dichas células cancerosas en el lumen del tubo neural, caracterizado porque el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, y dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma, dichas células se reproducen y forman tumores dentro del embrión en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto, y dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz(Coturnix japónica).

[0026] En otras palabras, la presente invención se refiere a un embrión de gallinácea que comprende al menos un tumor compuesto por células cancerosas que han sido injertadas dentro de los tejidos del embrión, caracterizado porque el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma, dicho tumor se forma en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto, y dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz(Coturnix japónica).

[0027] La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas que luego han formado tumores dentro de dicho embrión, que comprende las siguientes etapas:

[0028] • injerto de células cancerosas dentro de los tejidos de dicho embrión, sin que dichas células cancerosas se introduzcan en el lumen del tubo neural, e

[0029] • incubación del embrión injertado durante al menos 24 horas, dichas células cancerosas se reproducen y forman tumores dentro del embrión, en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto; caracterizado porque:

[0030] dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz(Coturnix japonica),.

[0031] el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, y

[0032] dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma.

[0033] La presente invención también se refiere a un procedimiento para monitorizar a un paciente con un tumor, que comprende:

[0034] a) preparación de un primer embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T<1>, y evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este primer embrión,

[0035] b) preparación de un segundo embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T<2>, y evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este segundo embrión,

[0036] c) comparación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en el primer embrión injertado y en el segundo embrión injertado.

[0037] La presente invención también se refiere a un procedimiento de cribado de moléculas terapéuticas destinadas al tratamiento de un cáncer, que consiste en las siguientes etapas:

[0039] a) preparación de un embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente;

[0040] b) administración a este embrión injertado de una molécula terapéutica candidata;

[0041] c) evaluación de la malignidad de las células cancerosas presentes en este embrión injertado tras la administración de dicha molécula candidata.

[0043] La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de tumores compuestos de células cancerosas, que comprende las siguientes etapas:

[0045] i. preparación de un embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente;

[0046] ii. extirpación de dichos tumores formados en el embrión.

[0048] Estos tumores producidos en el embrión pueden ser reutilizados de la misma manera que lo sería una muestra tumoral inicial, por ejemplo para producir cultivos celulares, para la implantación en otro modelo animal de cáncer, o para análisis bioquímicos y/o de biología molecular de dichos tumores.

[0050] Leyendas de las figuras

[0052] Figura 1.Representación de los primeros estadios de desarrollo del embrión de pollo, desde HH12 (14 somitos) hasta HH25 (52-54 somitos).

[0053] Figura 2.Tabla de correspondencias de los primeros estadios de desarrollo de los embriones de codorniz(codorniz japonesa)y pollo(pollito)en función del tiempo transcurrido desde la fecundación.

[0054] Figura 3.Sección longitudinal de un embrión de pollo en el estadio 28 somitos, es decir, estadio HH16. A la derecha de la figura se muestra la gama de lugares de injerto preferidos, para cada tipo de célula cancerosa.

[0055] Figura 4.Sección transversal del embrión injertado.

[0056] Localización de los focos cancerosos 48 horas después del injerto de células de melanoma humano: las células injertadas en el techo dorsal del tubo neural, entre los somitos 18 a 24, forman grupos tumorales en la capa subcutánea y en el mesénquima que bordea el tubo neural (círculos punteados).

[0057] Figura 5.Sección longitudinal del embrión injertado.

[0058] Localización de focos cancerosos 48 horas después de injertar células humanas de glioma o meduloblastoma en una zona que se extiende desde la cresta neural cervical (frente a los somitos 1 a 4) hasta los tejidos que bordean los ventrículos cerebrales de los distintos territorios cerebrales: las células injertadas forman agrupaciones tumorales en los tejidos cerebrales.

[0059] Figura 6.Sección transversal del embrión injertado.

[0060] Localización de los focos cancerosos 48 horas después del injerto de células humanas tumorales de pulmón: las células injertadas en el mesénquima lateral opuesto a las crestas neurales vagales y troncales (somitos 4 a 24) forman grupos tumorales en el cuerno ventral del tubo neural y en el mesénquima lateral. (Círculos de puntos).

[0061] Figura 7.Sección longitudinal del embrión injertado tras el injerto de células humanas de cáncer de pulmón.

[0062] A.Localización cerebral de los focos de cáncer 48 horas después del injerto de células humanas de cáncer de pulmón en una zona que se extiende desde la cresta neural cervical (frente a los somitos 1 a 4) hasta los tejidos que bordean los ventrículos cerebrales de los distintos territorios cerebrales: las células injertadas forman agrupaciones tumorales en los tejidos cerebrales, similares a las metástasis pulmonares cerebrales en seres humanos.

[0063] B.Localización extracerebral de focos de cáncer 48h después del injerto de células humanas de cáncer de pulmón en áreas que cubren los principales sitios presuntivos de metástasis de cánceres humanos de pulmón (tejido periorbital, primer arco branquial, boceto hepático, contorno de las extremidades -esclerotoma/dermamiotoma): las células injertadas forman grupos tumorales en el cartílago y los huesos de la cara (injertos periorbitarios y del primer arco branquial), en el hígado embrionario (injerto del boceto hepático) y en los tejidos derivados de los somitos, como el hueso (injerto del esclerotomo/dermamiotomo).

[0065] Figura 8.Sección longitudinal del embrión injertado tras el injerto de células humanas de cáncer de mama.

[0066] A.Localización cerebral de los focos de cáncer 48 h después del injerto de células humanas de cáncer de mama en una zona que se extiende desde la cresta neural cervical (somitos opuestos 1 a 4) hasta los tejidos que bordean los ventrículos cerebrales de los distintos territorios cerebrales: las células injertadas forman agrupaciones tumorales en los tejidos cerebrales.

[0067] B.Localización extracerebral de focos de cáncer 48h después del injerto de células humanas de cáncer de mama en áreas que cubren los principales sitios presuntivos de metástasis de cánceres humanos de mama (tejido periorbitario, primer arco branquial, boceto hepático, contorno de las extremidades -esclerotoma/dermamiotoma): las células injertadas forman grupos tumorales en el cartílago y los huesos de la cara (injertos periorbitarios y del primer arco branquial), en el hígado embrionario (injerto del boceto hepático) y en tejidos derivados del somito, como el hueso (injerto del esclerotoma/dermamyotome).

[0069] Descripción detallada de la invención

[0070] Los siguientes términos se definen para una mejor comprensión de la invención.

[0071] El término "gallinácea" se refiere a un ave del orden Galliformes (o Gallináceas), que incluye pollos, codornices, pavos, faisanes, pavos reales, pintadas y otros animales de corral. En la presente invención, el embrión se deriva de un pollo(gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),dos especies utilizadas frecuentemente en el laboratorio.

[0072] El término "embrión de gallinácea" se refiere a un huevo de gallinácea fecundado en el que un embrión se está desarrollando normalmente, en condiciones adecuadas, incluyendo ser colocado en una incubadora calentada entre 37°C y 39°C. El tiempo de incubación necesario para que el huevo eclosione es de 21 días.

[0073] En el contexto de la presente invención, el embrión "receptor" o "receptor" se refiere a un embrión de gallinácea antes de la etapa de injerto.

[0074] En el contexto de la presente invención, el embrión "injertado" o "en el que se han injertado células cancerosas" se refiere a un embrión de gallinácea después de la etapa de injerto, y más particularmente se refiere al embrión injertado después de al menos 24 horas de incubación, en el que se ha desarrollado al menos un tumor compuesto de células cancerosas injertadas. Este embrión injertado, objeto de la invención, es un modelo animal para estudiar el cáncer. Por "cáncer" se entiende la patología caracterizada por la presencia en un organismo de células malignas formadas a partir de la transformación, por mutaciones o inestabilidad genética, de células inicialmente normales del organismo afectado por dicha patología.

[0075] El término "embrión injertado" o "embrión en el que se han injertado células cancerosas" se refiere en el sentido de la invención a un "embrión quimérico", es decir, un embrión que posee células derivadas de al menos dos organismos diferentes: células gallináceas, y células cancerosas de otro organismo, que se convierten en parte integrante del embrión tras su aceptación como injerto, y continúan su desarrollo formando uno o más tumores sólidos y/o continuando su desarrollo de forma no regulada por los controles normales de la división celular, dentro de los tejidos del embrión de gallinácea receptor.

[0076] Se entiende que el embrión injertado es un embrión quimérico ya que comprende dos tipos celulares de dos organismos diferentes; sin embargo, no es una "quimera" en el sentido literal, ya que no se pretende que el embrión se desarrolle lo suficiente como para crear un organismo adulto, sino que simplemente sirve como portador de células cancerosas durante un corto periodo de tiempo. En cualquier caso, se entiende que este embrión de gallinácea no dará lugar a un organismo vivo quimérico, sino que será destruido en cuanto concluya el estudio del destino de las células cancerosas injertadas.

[0077] En el sentido de la invención, el término "injerto" o "trasplante" se refiere a la introducción de células exógenas en un organismo receptor, dentro de tejidos embrionarios.

[0078] En particular, este término no se refiere a una introducción de células exógenas en anexos del embrión, como la membrana corioalantoidea, el saco vitelino o el saco amniótico. Además, este término no se refiere a una inyección de células en el torrente sanguíneo del embrión.

[0079] La presente solicitud se refiere en particular a los xenoinjertos, refiriéndose este término al hecho de que las células introducidas en el embrión receptor proceden de un organismo de una especie diferente a la del embrión receptor. El injerto de células cancerosas se realiza en condiciones adecuadas que permitan que dichas células se reproduzcan, migren y formen tumores dentro del embrión receptor, en los sitios de implantación pertinentes, ya sea de acuerdo con su tejido de origen o en tejidos diferentes de los habitualmente colonizados por este tipo de células cancerosas, siendo dicho sitio de implantación distinto del sitio de injerto.

[0080] Estas "condiciones apropiadas" permiten reproducir, dentro de un modelo animal, ciertos aspectos de la enfermedad conocida como 'cáncer', y en particular la formación de tumores.

[0081] Estas "condiciones apropiadas" se basan en la etapa de desarrollo del embrión receptor en el momento en que se realiza el injerto, y en el lugar del injerto.

[0082] En particular, la elección del lugar del injerto permite determinar la migración de las células cancerosas y su implantación en diferentes tejidos, para formar focos cancerosos. Estos focos cancerosos son preferentemente tumores sólidos.

[0083] Así, según la invención, las células cancerosas injertadas en un tejido (sitio de injerto) migrarán al embrión injertado en función de este sitio de injerto y se implantarán en un segundo tejido distinto del sitio de injerto, en lo sucesivo denominado "tejido de implantación" o "sitio de implantación", para formar al menos un tumor. En algunas zonas, las células migrarán muy localmente y se establecerán cerca de la zona del injerto.

[0084] Hay varios casos a considerar:

[0085] • puede ser conveniente realizar los denominados injertos "ortópticos" correspondientes al establecimiento de focos cancerosos en tejidos homólogos a aquellos en los que las células cancerosas en cuestión forman focos cancerosos primarios en el organismo del que proceden. Estos focos cancerosos pueden ser el resultado de un injerto directo en la zona objetivo o de un injerto en una vía de migración que conduce a las células a esta zona. La elección de determinados lugares específicos de injerto permite dirigir dicho direccionamiento de las células cancerosas a los tejidos de implantación, como se ejemplifica en la presente solicitud;

[0086] • También puede ser deseable reproducir los denominados focos cancerosos secundarios en tejidos en los que las células cancerosas tienen tendencia a metastatizar; también en este caso, estos focos cancerosos secundarios pueden obtenerse mediante injerto directo en el territorio objetivo o mediante injerto en una vía de migración que conduzca a las células a este territorio, el lugar de implantación;

[0087] • por último, puede simplemente desearse crear focos cancerosos que se implanten y desarrollen en tipos de tejido distintos de aquellos de los que proceden las células cancerosas. Estos injertos denominados "heterotópicos" consisten en implantar un foco canceroso en un tejido distinto del que alberga las células cancerosas en el organismo del que proceden, ya sea de un tumor primario o de un tumor secundario (de una metástasis).

[0089] Por lo tanto, un modelo animal de este tipo permite estudiar tanto la migración de células cancerosas como su implantación dentro de tejidos específicos, o estudiar focos de cáncer formados dentro de tejidos heterólogos.

[0091] Las principales ventajas de este modelo animal son, además de la especificidad de los lugares de implantación de los focos cancerosos, su bajo coste y su rápida preparación.

[0093] Además, este modelo animal permite iniciar el desarrollo de ciertos tumores que pueden cosecharse y luego trasplantarse a otro modelo animal, como un ratón, o reimplantarse en el embrión aviar, o utilizarse para producir cultivos y modelosex vivo3D, o para realizar análisis bioquímicos y moleculares.

[0095] Estadio de desarrollo del embrión receptor

[0097] Se han definido varios estadios de desarrollo del embrión de gallinácea que se muestran en las figuras 1 y 2. Estos estadios se definieron en función del tiempo de incubación posterior a la fecundación y se determinaron según los criterios definidos por Hamburger y Hamilton (1951, J Morphol.). Como los somitos aparecen a medida que avanza el desarrollo, cada estadio se caracteriza también por el número de somitos presentes.

[0099] Se entiende que el desarrollo embrionario sólo comienza cuando el embrión se incuba en las condiciones adecuadas, en particular a una temperatura comprendida entre 37°C y 39°C. Así, un estadio de desarrollo "entre 48 y 55 horas" significa que el huevo se ha mantenido durante este tiempo en las condiciones óptimas para su desarrollo. Un óvulo fecundado puede conservarse a 14°C antes de colocarlo en condiciones óptimas para su desarrollo; este periodo de espera a 14°C no cuenta para el tiempo indicado a continuación.

[0101] Según la invención, en el momento del injerto, el embrión de pollo o codorniz se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25.

[0103] El estadio HH10 se observa aproximadamente a las 33 a 38 horas de incubación, y se caracteriza por la presencia de 10 somitos.

[0105] El estadio HH25 se observa entre las 102 y 108 horas de incubación, y se caracteriza por la presencia de 52 a 54 somitos (véase la Figura 1).

[0107] Entre estas dos etapas, un acontecimiento importante es la curvatura del embrión. De hecho, a partir de la aparición del somito decimonoveno (estadio HH13), aproximadamente tras 48 horas de incubación post-fertilización, la cabeza del embrión inicia un movimiento de torsión levógiro que se propaga durante la organogénesis hasta el extremo posterior del embrión. La progresión de este movimiento es claramente perceptible entre las 55 y las 68 horas de incubación.

[0109] Preferentemente, en el momento del injerto, el embrión de pollo o codorniz se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH12 y el estadio HH25, es decir, en uno de los estadios que se muestran en la figura 1.

[0111] Esta fase del desarrollo embrionario, que tiene lugar entre las 40h y los 4,5 días después de la fecundación, se caracteriza por muchos acontecimientos clave en la embriogénesis, como la aparición de somitos, la subdivisión de los principales territorios cerebrales, las curvaturas de los diferentes dominios del embrión y la formación de numerosos órganos.

[0113] Según otro aspecto preferido, en el momento del injerto, el embrión de pollo o codorniz se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH18, entre el estadio HH10 y el estadio HH15 o entre el estadio HH12 y el estadio HH16.

[0114] Preferentemente, el injerto de células cancerosas se realiza en un embrión de gallinácea receptor en una etapa de desarrollo comprendida entre los estadios HH13 y HH15, es decir, entre 48 y 55 horas después de la fecundación, y preferentemente entre 50 y 53 horas después de la fecundación (estadio HH14).

[0115] En este estadio de desarrollo HH13-HH15, el embrión de pollo o codorniz comprende entre 19 y 27 somitos.

[0116] Células cancerosas

[0117] En el sentido de la invención, el término "células cancerosas" se refiere a células malignas, es decir, células capaces de dividirse sin estar sujetas a los controles normales que regulan la división celular, no siendo dichas células cancerosas ni células de neuroblastoma ni células de melanoma. La mayoría de las células cancerosas presentan características anormales conocidas como "características citológicas de malignidad".

[0118] Estas células pueden formar una excrecencia o excrecencias denominadas en la presente solicitud indistintamente "tumores", "neotumores", "focos tumorales", "focos de cáncer", "agrupaciones tumorales" o "masas tumorales", que se desarrollan dentro de uno o más tejidos.

[0119] Por "tumor' se entiende una proliferación celular excesiva que da lugar a una masa tisular, con tendencia a persistir y crecer, atestiguando su autonomía biológica. La presente invención se refiere más particularmente a los tumores malignos. Los tumores malignos suelen crecer rápidamente y tienden a reaparecer tras su erradicación local. Los tumores malignos están mal definidos, no están encapsulados y tienen contornos irregulares.

[0120] En el caso de células cancerosas circulantes, en particular células sanguíneas, estas células se caracterizan por una capacidad incontrolada de crecimiento y división anárquicos.

[0121] A un organismo vivo con tales células cancerosas se le diagnostica cáncer.

[0122] En el sentido de la invención, las células cancerosas destinadas a ser injertadas en los tejidos de un embrión receptor se derivan de un tumor maligno sólido o son células hematopoyéticas cancerosas.

[0123] Según un aspecto preferido de la invención, se trata de células cancerosas derivadas de tumores malignos sólidos. Se entiende que, en el sentido de la invención, se trata de todas las células cancerosas, con excepción de las células de neuroblastoma y las células de melanoma.

[0124] Según un aspecto preferido de la invención, las células cancerosas injertadas se derivan de tumores sólidos no pediátricos.

[0125] Según un aspecto de la invención, las células cancerosas injertadas se derivan de tumores malignos humanos que se desarrollan en individuos adultos.

[0126] La invención se refiere preferentemente a un modelo animal para estudiar tumores humanos, las células son por lo tanto preferentemente células cancerosas humanas. No obstante, es posible utilizar el modelo animal de la invención para estudiar tumores de animales no humanos, en particular para estudiar tumores que se desarrollan en mamíferos distintos de los humanos.

[0127] Según un aspecto de la invención, las células cancerosas injertadas se seleccionan del grupo que consiste en: células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama.

[0128] También puede tratarse de células cancerosas seleccionadas entre células de tumor de mama HER2+/ER+, células de cáncer de próstata, células de sarcoma, células de glioma pediátrico y células de cáncer de pulmón "EGFR mutado". Según la invención, las células cancerosas injertadas no son células de melanoma.

[0129] Según otro aspecto más de la invención, las células cancerosas injertadas se seleccionan del grupo que consiste en: células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama. Para la preparación del embrión de gallinácea injertado, pueden injertarse células cancerosas en forma de:

[0130] • células en suspensión, inyectadas en los tejidos diana;

[0131] • pieza sólida (bloque) de tejido tumoral;

[0132] • agregados/homogeneizados de células cancerosas aisladas.

[0133] En el resto de esta descripción, "injerto" significa una colección de células cancerosas introducidas en forma agrupada en el embrión receptor.

[0134] El injerto de las células cancerosas en el embrión de gallinácea receptor se realiza según procedimientos bien conocidos por el experto. El embrión de gallinácea es fácilmente accesible, una vez que se ha practicado una pequeña abertura en la cáscara del huevo. En concreto, las células cancerosas se injertan utilizando un microinyector presurizado (Picopump PV830, World Precisión Instruments). En la técnica anterior se han descrito otras técnicas para trasplantar células en el embrión de gallinácea, por ejemplo por Kulesa et al.. (PNAS, 2006) o por Boulland et al.. (JVE, 2010).

[0135] Según una realización preferente de la invención, las células cancerosas se injertan en una cantidad de al menos aproximadamente 1000 células por injerto.

[0136] Alternativamente, el injerto comprende una cantidad de al menos 5000, 10000 o 15000 células cancerosas por injerto. Según otra alternativa, el injerto comprenderá una cantidad de células cancerosas que oscila entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 75000 células por injerto, entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 75000 células por injerto, o entre aproximadamente 15000 células y aproximadamente 75000 células por injerto.

[0137] En particular, el injerto comprenderá aproximadamente 15000, aproximadamente 20000, aproximadamente 25000, aproximadamente 30000, aproximadamente 35000, aproximadamente 40000, aproximadamente 45000, aproximadamente 50000, aproximadamente 55000, aproximadamente 60000, aproximadamente 65000, aproximadamente 70000 o aproximadamente 75000 células cancerosas.

[0138] El procedimiento para contar células es bien conocido por el experto. En particular, el número de células injertadas con el microinyector se determina antes del injerto contando el número de células expulsadas del capilar, durante un tiempo y a una presión determinados, utilizando una célula de recuento de Malassez.

[0139] Según un modo de realización particular de la invención, se trasplantan varios injertos que comprenden cada uno al menos 1000 células cancerosas en un único embrión receptor. En concreto, se trasplantan al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis injertos en un único embrión receptor en los lugares adecuados.

[0140] Según un modo de realización preferido de la invención las células cancerosas injertadas son células cancerosas humanas.

[0141] Según un modo de realización particular de la invención, las células cancerosas injertadas son células humanas derivadas de un tumor de paciente, es decir, de un individuo humano que padece cáncer.

[0142] Las células cancerosas se cosecharon mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como biopsia y microcirugía.

[0143] Para distinguir las células cancerosas injertadas dentro del embrión de gallinácea, y en particular para controlar su dispersión y su capacidad de multiplicación, las células injertadas se etiquetan ventajosamente con un colorante o expresan una proteína marcadora.

[0144] Dicho marcado puede lograrse utilizando colorantes. En concreto, las células pueden marcarse utilizando colorantes vitales como los carbocianuros, que tienen afinidad por las membranas celulares y se incorporan a ellas, confiriendo a las células una fluorescencia roja. También pueden utilizarse colorantes de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), que emiten fluorescencia verde cuando reaccionan con proteínas intracelulares.

[0145] Según un aspecto particular de la invención, las células cancerosas injertadas expresan una proteína marcadora. Una proteína marcadora se refiere a una proteína codificada por un gen exógeno introducido en la célula por procedimientos convencionales de ingeniería genética, estando la expresión de dicho gen bajo el control de un promotor activo en dicha célula, y siendo dicha proteína visible, o siendo capaz de reaccionar con un reactivo químico para hacerse visible. Se conocen varias proteínas marcadoras, como la proteína verde fluorescente (GFP).

[0146] Incubación del embrión injertado

[0147] Tras el injerto, el embrión de gallinácea se incuba durante al menos 24 horas utilizando una técnica estándar en una incubadora saturada de humedad a una temperatura de entre 37°C y 39°C, y preferiblemente a unos 38,5°C.

[0148] Ya a las 24 horas de incubación, se observaron los primeros tumores compuestos por células cancerosas injertadas dentro del embrión injertado.

[0149] Según un aspecto particular de la invención, el embrión se incuba después del injerto de células cancerosas durante al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, y hasta 20 días en el caso del estudio de células cancerosas que migran lentamente y/o que tienen una cinética más larga para la formación de tumores, dentro del embrión injertado. Según un aspecto preferido de la invención, el embrión se incuba durante unas 48 a 52 horas después del injerto, preferentemente a una temperatura de entre 37 C y 39 C.

[0150] Lugar del injerto

[0151] Según un aspecto preferido de la invención, las células cancerosas se injertan en el embrión receptor a nivel del tubo neural, entre los somitos 1 a 24, y/o en el tejido cerebral.

[0152] El tubo neural comprende el sistema nervioso primitivo de los embriones. Los somitos son estructuras embrionarias situadas a ambos lados del tubo neural y de la cuerda, y están formados por unidades repetidas a lo largo del eje anteroposterior del embrión. En la etapa de desarrollo comprendida entre 48 y 55 horas después de la fecundación, es decir, entre los estadios HH13 y HH15, el embrión de gallinácea consta de 19 a 27 somitos. En la figura 1 se muestra una representación del embrión de pollo en diferentes etapas de desarrollo, de 14 a 54 somitos.

[0153] En el sentido de la invención, las expresiones "en el tubo neural" o "a nivel del tubo neural" son sinónimas y significan que las células cancerosas se introducen dentro de los tejidos que constituyen el tubo neural, y no en el lumen del tubo neural (que comprende los ventrículos cerebrales y el canal central de la médula espinal, en el que circula el líquido cefalorraquídeo).

[0154] Según un primer aspecto de la invención, las células cancerosas se injertan dentro de los tejidos que constituyen el tubo neural, entre los somitos 1 a 24.

[0155] Según un segundo aspecto de la invención, se injertan células cancerosas en tejido cerebral. Por "tejido cerebral" se entienden las capas de tejido compuestas por neuronas, las zonas limítrofes de los ventrículos en las que nacen las neuronas, los plexos coroideos y las membranas externas que aíslan el cerebro del exterior, como la piamadre y la aracnoides.

[0156] Los tejidos cerebrales se refieren a los diferentes territorios del cerebro como: telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo, mesénquima cerebral y tronco cerebral.

[0157] Según un tercer aspecto de la invención, las células cancerosas se injertan en el embrión receptor dentro de los tejidos que constituyen el tubo neural, entre los somitos 1 a 24, y también se injertan en los tejidos cerebrales.

[0158] Según la presente invención, el modelo animal consistente en un embrión de gallinácea injertado con células cancerosas es adecuado para el estudio de cualquier tipo de células cancerosas. Sin embargo, el modelo animal está destinado principalmente al estudio de tumores malignos sólidos humanos.

[0159] Se recuerda que dentro del significado de la invención, el término "células cancerosas" se refiere a cualquier tipo de células cancerosas con la excepción de células de neuroblastoma y células de melanoma, e incluye células hematopoyéticas cancerosas.

[0160] Según otro aspecto más de la invención, las células cancerosas se seleccionan del grupo que consiste en: células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama.

[0161] Para cada tipo de célula cancerosa, el experto es capaz de determinar el sitio óptimo de injerto, con el fin de dirigir la migración de las células cancerosas hacia un sitio de desarrollo tumoral, ya sea en adecuación con el tipo de célula en cuestión, o con el fin de obtener un neotumor heterotópico, desarrollándose en tejidos diferentes de los de origen de las células cancerosas.

[0162] En particular, las células cancerosas pueden injertarse en ciertos sitios bien definidos, para ser "dirigidas" específicamente en ciertos tejidos del embrión, donde se implantarán y formarán tumores en tejidos equivalentes a los tejidos de los que proceden, o en tejidos en los que tienden a aparecer tumores metastásicos secundarios. Según la invención, las células cancerosas se injertan en un primer tejido distinto del tejido de implantación donde se forma el tumor o tumores, dirigiéndose el injerto en el primer tejido a las células cancerosas injertadas en el tejido de implantación donde forman el tumor o tumores, es decir, donde se establecen los tumores.

[0163] Se injertaron varios tipos celulares en un embrión receptor de gallinácea, según el procedimiento descrito en la presente solicitud, y en particular células cancerosas seleccionadas del grupo que consiste en: células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama.

[0164] Ejemplo fuera de la invención:

[0165] Se injertaron células de melanoma en el techo dorsal del tubo neural o en su proximidad lateral, entre los somitos 18 a 24.

[0166] Como se representa en la Figura 4, esta localización específica del injerto permite obtener, tras al menos 24 horas de incubación, un embrión injertado en el que los tumores compuestos por células trasplantadas migran y luego crecen específicamente bajo la piel, reproduciendo así el entorno tisular de las células de melanoma cuando se encuentran en su organismo inicial.

[0167] De este modo, las células cancerosas injertadas migran dentro del embrión receptor para formar neotumores en tejidos equivalentes a los tejidos humanos de los que se derivaron.

[0168] Ejemplos según la invención:

[0169] 1) Las células cancerosas de tumores cerebrales primarios o secundarios se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 4, y/o en el tejido cerebral.

[0170] En esta realización particular, las células cancerosas derivadas de tumores cerebrales primarios o secundarios se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 4, o a nivel del tejido cerebral, en el espesor del tejido cerebral o en el borde de los ventrículos cerebrales.

[0171] "Tejido cerebral" se refiere a las capas de tejido compuestas por las neuronas, las zonas limítrofes de los ventrículos en las que nacen las neuronas, los plexos coroideos y las membranas externas que aíslan el cerebro del exterior, como la piamadre y la aracnoides.

[0172] En una realización particular, se injertan al menos dos injertos de células cancerosas procedentes de tumores cerebrales primarios o secundarios, uno en el tubo neural entre los somitos 1 a 4, y el otro en el tejido cerebral. El término "tumores cerebrales primarios" se refiere en particular a tumores como los que se observan en el glioma, el glioblastoma o el meduloblastoma.

[0173] "Tumor cerebral secundario" se refiere a un tumor formado en el cerebro, tras la diseminación de células cancerosas metastásicas de un tumor denominado "primario". Este tumor primario puede encontrarse en varios órganos. Los cánceres que con más frecuencia se extienden al cerebro son los siguientes: pulmón, mama, melanoma, riñón, testículos, colorrectal, bronquial, linfoma (especialmente el linfoma no Hodgkin) y leucemia.

[0174] Como se representa en la Figura 5, estas dos localizaciones específicas del injerto permiten obtener, tras al menos 24 horas de incubación, un embrión injertado en el que los tumores compuestos por células trasplantadas se desarrollan específicamente en el tejido cerebral, reproduciendo así el entorno tisular de las células de glioma, glioblastoma o meduloblastoma, cuando éstas se encuentran en su organismo inicial.

[0175] 2) Las células cancerosas derivadas de tumores pulmonares se injertan en el tubo neural entre los somitos 4 a 24. Como se muestra en las Figuras 6 y 7A, esta localización específica del injerto da lugar a un embrión injertado tras al menos 24 horas de incubación en el que los tumores compuestos por células trasplantadas se desarrollan específicamente en el cuerno ventral del tubo neural y el mesénquima adyacente. Este lugar de formación, que corresponde a una región del sistema nervioso central, es una alternativa al lugar de formación de las metástasis cerebrales. Por lo tanto, es representativa de la implantación de un tumor canceroso secundario en el sistema nervioso.

[0176] 3) Células cancerosas procedentes de tumores mamarios (de cáncer de mama) se injertan en el tubo neural entre los somitos 4 a 24.

[0177] Como se muestra en la Figura 7B, esta localización específica del injerto da lugar, tras al menos 24 horas de incubación, a un embrión injertado en el que los tumores compuestos por células trasplantadas crecen específicamente en el tejido cerebral, en particular cerca de la capa cutánea.

[0178] Procedimientos

[0179] La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas que luego han formado tumores dentro de dicho embrión, que comprende las siguientes etapas:

[0180] • injerto de células cancerosas en los tejidos de un embrión de gallinácea, sin que dichas células cancerosas se introduzcan en el lumen del tubo neural; y

[0181] • incubación del embrión injertado durante al menos 24 horas, dichas células cancerosas se reproducen y forman tumores dentro del embrión, en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto; caracterizado porque dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz(Coturnix japónica),el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, y dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma.

[0182] Ventajosamente, el injerto se realiza en el tubo neural entre los somitos 1 a 24 y/o en tejido cerebral.

[0183] Ventajosamente, el embrión injertado se incuba durante aproximadamente 48 a 52 horas después del injerto, a una temperatura de entre 37°C y 39°C.

[0184] Ventajosamente, las células cancerosas se derivan de un tumor tomado de un paciente, y se injertan en una cantidad de al menos 1000 células/injerto.

[0185] Ventajosamente, el injerto se realiza según las condiciones particulares detalladas anteriormente.

[0186] La presente invención también se refiere a un procedimiento de monitorización de un paciente con cáncer, que comprende:

[0188] a) preparación de un primer embrión injertado según el procedimiento anteriormente descrito, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T<1>, y evaluación del índice de malignidad de las células cancerosas que se desarrollan en este primer embrión,

[0189] b) preparación de un segundo embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T<2>, y evaluación del índice de malignidad de las células cancerosas que se desarrollan en este segundo embrión,

[0190] c) la comparación entre el índice de malignidad de las células cancerosas que se desarrollan en el primer embrión y en el segundo embrión.

[0192] La "Evaluación del índice de malignidad" se lleva a cabo utilizando varios enfoques complementarios; después de extraer las células cancerosas que se desarrollan en el embrión injertado, se someten a diversos análisis:

[0194] • estudios bioquímicos y transcriptómicos, y

[0195] • estudiosin vitromediante su recultivo.

[0197] En particular, estos diversos análisis permiten determinar el índice de malignidad en relación con los siguientes factores:

[0199] • Determinación del índice proliferativo de las células cancerosas mediante la detección del marcador Ki67;

[0200] • Determinación del índice de muerte celular mediante la detección de eventos de muerte celular (fragmentación del ADN, necrosis, liberación de citocromo c, activación de proteasas proapoptóticas). • Análisis del transcriptoma y el proteoma de las células;

[0201] • Estudio del comportamiento celular tras el recultivo.

[0203] El análisis combinado de todos estos factores, bien conocidos por los expertos en la materia, permite determinar un "índice de malignidad" que cuantifica la gravedad y agresividad del cáncer. En conjunto, estos parámetros permiten evaluar el grado de diferenciación de las células cancerosas, así como su capacidad para proliferar y diseminarse por el organismo. Estos parámetros forman parte integrante de la clasificación anatomopatológica de las células cancerosas y son utilizados por los médicos para orientar el tratamiento.

[0205] La presente invención también se refiere a un procedimiento de monitorización de un paciente con un tumor, en particular un tumor sólido maligno, que comprende:

[0207] a) la preparación de un primer embrión injertado según el procedimiento anteriormente descrito, con células cancerosas de dicho paciente en un momento Ti, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este primer embrión,

[0208] b) la preparación de un segundo embrión injertado según el procedimiento anteriormente descrito, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T<2>, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este segundo embrión,

[0209] c) la comparación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en el primer embrión y en el segundo embrión.

[0211] "Paciente con un tumor" significa un ser humano con cáncer que tiene un tumor sólido en un órgano determinado.

[0212] La "Evaluación de la tumororigénesis" se lleva a cabo utilizando varios enfoques complementarios; después de que los tumores que han aparecido en el embrión injertado se hayan eliminado mediante microdisección, se someten a diversos análisis:

[0214] • estudios bioquímicos y transcriptómicos, y

[0215] • estudiosin vitromediante su recultivo.

[0216] En particular, estos diversos análisis permiten determinar los siguientes "factores de tumorigénesis":

[0218] • Localización de focos tumorales mediante análisis histológico;

[0219] • Medición del volumen tumoral mediante imágenes reconstruidas en 3D;

[0220] • Determinación del índice proliferativo dentro de los focos tumorales mediante la detección del marcador Ki67;

[0221] • Determinación del índice de vascularización de los focos tumorales mediante la detección de marcadores de angiogénesis;

[0222] • Determinación del índice de muerte celular dentro de los focos tumorales mediante la detección de eventos de muerte celular (fragmentación del ADN, necrosis, liberación de citocromo c, activación de proteasas proapoptóticas).

[0223] • Análisis del transcriptoma y proteoma de tumores extraídosin situ;

[0224] •Estudio del comportamiento celular tras el recultivo.

[0225] El análisis combinado de todos estos factores, bien conocidos por los expertos en la materia, permite determinar un "índice de tumorigénesis" que permite cuantificar la gravedad y la agresividad del tumor. En conjunto, estos parámetros permiten evaluar el grado de diferenciación de las células cancerosas, así como su capacidad para proliferar y diseminarse por el organismo. Estos parámetros forman parte integrante de la clasificación anatomopatológica de los tumores y son utilizados por los clínicos para orientar el tratamiento terapéutico.

[0226] Así, es posible distinguir:

[0227] • tumores que se desarrollan tras el injerto, en un embrión de gallinácea, de células cancerosas procedentes de un paciente en el momento T1, y

[0228] • tumores que se desarrollan tras el injerto en un embrión de gallinácea de células cancerosas procedentes de un paciente en el momento T2.

[0229] Dicho procedimiento permite monitorizarex vivoel desarrollo del tumor sólido de un paciente, y en particular el índice de tumorigénesis de sus células cancerosas en un momento To (por ejemplo, antes del inicio del tratamiento) y en un momento T1, T2, T3 (por ejemplo, unos meses después del inicio del tratamiento del paciente).

[0230] El procedimiento puede, por supuesto, repetirse tantas veces como sea necesario para seguir la evolución del tumor en un paciente determinado.

[0231] La presente invención también se refiere a un procedimiento de cribado de moléculas terapéuticas destinadas al tratamiento de un cáncer, que consiste en las siguientes etapas:

[0232] a) Preparación de un embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente;

[0233] b) administración a este embrión de una molécula terapéutica candidata;

[0234] c) evaluación de la malignidad de las células cancerosas presentes en este embrión tras la administración de dicha molécula candidata.

[0235] "Molécula candidata terapéutica" significa una molécula química o biológica potencialmente eficaz para tratar el cáncer pertinente.

[0236] La etapa b) puede realizarse de varias maneras: la molécula puede administrarse al embrión antes o después de que se haya realizado el injerto de células cancerosas. En concreto, la molécula terapéutica puede inyectarse en la red vascular del embrión, puede incorporarse al saco vitelino o puede utilizarse en el injerto antes o en el momento de realizarlo.

[0237] Según este aspecto de la invención, las células cancerosas destinadas a injertarse en el embrión receptor se incuban con una molécula terapéutica antes/durante el injerto en el embrión receptor.

[0238] La evaluación de la malignidad de las células cancerosas se realiza mediante los enfoques descritos anteriormente, tras la eliminación de las células cancerosas que se desarrollan en el embrión injertado. La comparación de la malignidad de las células cancerosas en el momento T0 y de las células cancerosas después de al menos 24 horas, y en particular después de 1 (T1), 2 (T2) o 3 (T3) días de administración de la molécula ensayada, permite determinar el efecto de la molécula terapéutica administrada.

[0239] Naturalmente, la administración de esta molécula puede llevarse a cabo durante varias duraciones, en particular durante al menos 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, y hasta 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, es decir, hasta la eclosión del huevo, siempre que los tumores sigan presentes en el embrión de gallinácea.

[0240] Se entiende que tras la realización de las distintas pruebas, el embrión es sacrificado de acuerdo con las normas éticas vigentes.

[0241] La presente invención también se refiere al uso de un embrión de gallinácea según la invención, para permitir el desarrollo de tumores compuestos por células cancerosas.

[0242] En particular, es posible obtener el desarrolloin vivode tumores compuestos de células cancerosas en el embrión de gallinácea según la invención, mientras que estas células cancerosas tienen dificultades para implantarse y formar tumores en modelos animales de mamíferos, como por ejemplo en ratones.

[0243] En particular, se ha observado que las siguientes células cancerosas se implantan con dificultad, tras el injerto en tejidos animales de mamíferos: células de cáncer de hígado, células de cáncer de próstata y células de cánceres poco proliferativos tales como células de tumores de mama HER2+/ER+, células de sarcoma y células de tumores cerebrales pediátricos.

[0244] El presente modelo animal permite ventajosamente el desarrollo de tumores compuestos de células cancerosas, dichas células cancerosas generalmente tienen dificultad para implantarse después de ser injertadas en un modelo animal mamífero.

[0245] La presente invención se refiere, por tanto, a un procedimiento de preparación de tumores compuestos por células cancerosas, que comprende las siguientes etapas:

[0247] • preparación de un embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente;

[0248] y

[0249] • extirpación de dichos tumores formados dentro del embrión.

[0251] Los tumores recogidos de este modo pueden utilizarse a continuación del mismo modo que una muestra tumoral inicial, por ejemplo para producir cultivos celulares, para ser implantados en otro modelo animal, o para realizar análisis bioquímicos y/o de biología molecular de dichos tumores.

[0253] Según la invención, las células cancerosas injertadas no son células de neuroblastoma ni células de melanoma.

[0254] Según otra realización más del procedimiento de la invención, las células cancerosas injertadas se seleccionan del grupo que consiste en: células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama.

[0256] Según otra realización más del procedimiento de la invención, las células cancerosas injertadas se seleccionan de entre: células tumorales de mama HER2+/ER+, células de cáncer de próstata, células de sarcoma, células de glioma pediátrico, y células de cáncer de pulmón "EGFR mutado".

[0258] Como se ha indicado anteriormente, se entiende que tras la realización de los diversos procedimientos según la invención, el embrión de gallinácea se sacrifica de acuerdo con las normas éticas vigentes.

[0260] Esta descripción también incluye los siguientes objetos:

[0262] ° Un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas dentro de los tejidos del embrión, caracterizado porque el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, dichas células cancerosas no son células de neuroblastoma, y dichas células forman tumores dentro del embrión.

[0263] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre los estadios HH13 y HH15 en el momento del injerto.

[0264] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque el embrión se incuba durante al menos 24 horas después del injerto.

[0265] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas se injertan en una cantidad de al menos 1000 células por injerto.

[0266] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas injertadas son células humanas derivadas del tumor de un paciente.

[0267] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas injertadas están marcadas con un colorante o expresan una proteína marcadora.

[0268] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas se injertan en un primer tejido distinto del tejido de implantación donde se forman los tumores, dirigiéndose el injerto en el primer tejido a las células cancerosas injertadas en el tejido de implantación donde se establecen los tumores.

[0269] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 24 y/o en el tejido cerebral.

[0270] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas se injertan en tejido cerebral.

[0271] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas injertadas se seleccionan del grupo que consiste en: células de melanoma, células de tumores cerebrales primarios o secundarios, células de cáncer de pulmón y células de cáncer de mama.

[0272] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas injertadas son células de melanoma, y se injertan en el techo dorsal del tubo neural o en su proximidad lateral, entre los somitos 18 a 24.

[0273] ° Un embrión de gallinácea como el descrito anteriormente, caracterizado porque las células cancerosas injertadas derivan de tumores cerebrales primarios o secundarios, y se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 4, y/o en tejido cerebral.

[0274] ° Procedimiento de preparación de un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas que posteriormente han formado tumores dentro de dicho embrión, que comprende las siguientes etapas:

[0276] • injertar células cancerosas en los tejidos de un embrión de gallinácea, e

[0277] • incubación del embrión injertado durante al menos 24 horas, caracterizada porque el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, y dichas células cancerosas no son células de neuroblastoma.

[0279] ° Procedimiento de monitorización de un paciente con un tumor, que comprende:

[0280] • la preparación de un primer embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T1, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este primer embrión,

[0281] • la preparación de un segundo embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente, con células cancerosas de dicho paciente en un momento T2, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este segundo embrión,

[0282] • comparación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en el primer embrión injertado y en el segundo embrión injertado.

[0283] ° Procedimiento de cribado de moléculas terapéuticas destinadas al tratamiento de un cáncer, que consiste en las siguientes etapas:

[0284] • preparación de un embrión injertado según el procedimiento descrito anteriormente;

[0285] • administración de una molécula terapéutica candidata a este embrión injertado;

[0286] • evaluación de la malignidad de las células cancerosas presentes en este embrión injertado tras la administración de dicha molécula candidata.

[0287] ° Procedimiento de preparación de tumores compuestos por células cancerosas, que comprende las siguientes etapas:

[0288] • injerto de células cancerosas en los tejidos de un embrión de gallinácea en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, no siendo dichas células cancerosas células de neuroblastoma,

[0289] • incubación del embrión injertado durante al menos 24 horas, e

[0290] • extirpación de dichos tumores formados dentro del embrión.

[0291] Ejemplos

[0292] Los ejemplos que se exponen a continuación están destinados únicamente a ilustrar la invención, y no limitan en modo alguno la invención a las realizaciones particulares que se describen a continuación.

[0293] Materiales y procedimientos

[0294] Líneas celulares humanas cancerosas

[0295] Las células cancerosas humanas de pulmón (línea A549), melanoma (línea A375P), glioblastoma (línea U251) meduloblastoma (línea DEV) y cáncer de mama (línea MDA MB 436) se manipularon genéticamente para expresar de forma estable la proteína fluorescente GFP

[0296] Embriones de pollo

[0297] Los huevos de gallina fecundados(Gallus gallus)se compraron a un proveedor (EARL Morizeau, Peligros, Francia) y se mantuvieron a 14°C hasta su uso. Los huevos se incubaron a 38,5°C durante 52 horas en una incubadora de humedad saturada para obtener embriones en el estadio de desarrollo HH14.

[0298] Injertos de líneas cancerosas humanas en embriones de pollo

[0299] Se cosecharon 5x106 células cancerosas y se volvieron a suspender en 30 pl de medio.

[0300] Tras 52 horas de incubación a 38,5 C, se cortó una ventana en la cáscara para poder visualizar y acceder al embrión. Se cortó la membrana vitelina a nivel del tubo neural y se hizo una herida a nivel del techo del tubo neural, frente a los somitos 20 y 21.

[0301] La suspensión celular se introdujo en un microcapilar de vidrio y las células se depositaron utilizando un microinyector presurizado en cada embrión (Picopump PV830, World Precision Instruments).

[0302] A continuación, los huevos se devolvieron a la incubadora a 38,5 C durante 48 horas.

[0303] Otras condiciones

[0304] Se probaron varias cantidades de células cancerosas injertadas en un embrión para lograr el injerto: 1000 células, 3000 células, 10.000 (104) células y 5.106 células.

[0305] También se probaron diferentes estadios de desarrollo del embrión receptor para el momento del injerto: estadios HH10 (10 somitos), HH11 (13 somitos) y HH14 (22 somitos).

[0306] Secciones de embriones de pollo

[0307] Se cosecharon embriones y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 C. Dependiendo del tipo de análisis deseado, se cortaron embriones para secciones longitudinales transversales y sagitales. Las secciones se conservaron en PBS a 4 C protegidas de la luz hasta su utilización. La localización de los tumores se estudió mediante diversas marcas y/o la detección por fluorescencia de células cancerosas previamente transformadas para expresar GFP (proteína verde fluorescente).

[0308] El etiquetado consiste en incubar las células en un colorante fluorescente vital, CFSE, antes del injerto. Se probaron varias concentraciones de este colorante vital para optimizar la detección de las masas tumorales formadas en el embrión tras el injerto.

[0309] Muestreo y análisis de tumoresin situ.

[0310] Los tumores se extraen mediante microdisección y se someten a diversos análisis:

[0311] • estudios bioquímicos y transcriptómicos (caracterización y búsqueda de marcadores moleculares conocidos o nuevos), y

[0312] • estudiosin vitromediante su recultivo.

[0313] Toma y procesamiento de imágenes

[0314] Las secciones se analizaron utilizando un microscopio confocal (Olympus IX81). La imagen completa de la sección se reconstruyó con el programa XuvTools.

[0315] La tumorigénesis se evaluó mediante diversos ensayos:

[0316] • Determinación de la localización de los focos tumorales mediante análisis histológico;

[0317] • Medición del volumen tumoral a partir de imágenes reconstruidas en 3D;

[0318] • Determinación del índice proliferativo dentro de los focos tumorales mediante la detección del marcador Ki67;

[0319] • Determinación del índice de vascularización de los focos tumorales mediante la detección de marcadores de angiogénesis;

[0320] • Determinación del índice de muerte celular dentro de los focos tumorales mediante la detección de eventos de muerte celular (fragmentación del ADN, necrosis, liberación de citocromo c, activación de proteasas proapoptóticas);

[0321] • Análisis del transcriptoma y el proteoma de tumores extraídos insitu;.

[0322] •Estudio del comportamiento celular tras el recultivo.

[0323] Los embriones también se analizaron utilizando un ultramicroscopio LaVision Biotec. Se escanearon los embriones y se reconstruyó el tumor en 3D, lo que permitió analizar el volumen y la localización anatómica.

[0324] Resultados

[0325] Según el protocolo experimental descrito anteriormente, se injertaron células cancerosas humanas de pulmón (línea A549), melanoma (línea A375P), glioblastoma (línea U251), meduloblastoma (línea DEV) y cáncer de mama (línea MDA MB 436), que expresaban GFP o estaban marcadas con un colorante vital, en un embrión de pollo en el estadio HH14. Se realizaron experimentos adicionales en fases más tempranas, HH10, HH11 y HH13.

[0326] Ejemplo fuera de la invención:

[0327] Las células de melanoma se injertaron en el techo dorsal del tubo neural, entre los somitos 18 a 24.

[0328] 48 horas después del injerto, las células de melanoma forman agrupaciones tumorales subcutáneas, así como en el mesénquima que recubre el tubo neural. (Figura 4)

[0329] Ejemplos según la invención:

[0330] Las células de glioblastoma y meduloblastoma se injertaron en un área que se extiende desde la cresta neural cervical (somitos opuestos 1 a 4), hasta el tejido cerebral que bordea los ventrículos cerebrales de los diferentes territorios cerebrales.

[0331] 48 horas después del injerto, las células de glioblastoma y meduloblastoma forman grupos tumorales en el cerebro, así como en el tejido que recubre los ventrículos cerebrales. Estos tumores se establecen en el cerebro, de forma similar a los tumores observados en los pacientes. (Figura 5). Las células cancerosas migran al cerebro para establecer nuevos focos.

[0332] Las células de cáncer de pulmón se injertaron en el cerebro en diferentes lugares de los territorios cerebrales. Estas células también se injertaron en el mesénquima lateral opuesto a las crestas neurales vagales y troncales (somitos 4 a 24).

[0333] 48 horas después del injerto, las células cancerosas de pulmón injertadas en el somito forman grupos tumorales en el cuerno ventral del tubo neural y su territorio lateral adyacente. (Figura 6 y Figura 7A). Las células cancerosas injertadas en el tejido cerebral establecen masas tumorales en el cerebro, a partir de las cuales se desarrollan metástasis que colonizan nuevas zonas del cerebro, así como territorios más rostrales del embrión.

[0334] La Figura 7B ilustra el injerto de células tumorales de pulmón en áreas que cubren los principales sitios presuntivos de metástasis de cánceres humanos de pulmón:

[0335] • tejido periorbital,

[0336] • primer arco branquial,

[0337] • boceto hepático, y

[0338] • contorno de las extremidades - esclerotomo/dermamicotomo.

[0339] Las células injertadas de este modo forman agrupaciones tumorales en el cartílago y los huesos de la cara (injertos periorbitarios y en el primer arco branquial), en el hígado embrionario (injerto en el boceto hepático) y en tejidos derivados de los somitos como el tejido óseo (injerto en el esclerotoma/dermamilotoma). Estos injertos se denominan "heterotópicos" porque los tumores se forman en tejidos distintos de los que los originan.

[0340] Se injertaron células de cáncer de mama en el cerebro en diferentes sitios. 48 horas después del injerto, se forman grupos de tumores en el tejido cerebral. Un segundo sitio de migración, más rostral que los sitios de injerto, está presente en la superficie del cerebro, cerca de la capa cutánea (Figura 8A).

[0341] Se injertaron células de cáncer de mama en el cerebro de embriones en diferentes estadios de desarrollo: HH10, HH13 y HH14. Se observaron focos tumorales en el tejido cerebral de cada uno de los embriones injertados alrededor de 48 horas después del injerto.

[0342] La Figura 8B ilustra el injerto de células tumorales de mama en áreas que cubren los principales sitios presuntivos de metástasis de cánceres humanos de mama:

[0343] • tejido periorbital,

[0344] • primer arco branquial,

[0345] • boceto hepático,

[0346] • contorno de las extremidades - esclerotomo/dermamicotomo.

[0347] Las células injertadas forman agrupaciones tumorales en el cartílago y los huesos de la cara (injertos periorbitarios y en el primer arco branquial), en el hígado embrionario (injerto en el boceto hepático) y en tejidos derivados de los somitos como el tejido óseo (injerto en el esclerotoma/dermamilotoma). Estos injertos se denominan "heterotópicos" porque los tumores se forman en tejidos distintos de los que los originan.

[0348] Para cada tipo de célula cancerosa, se ensayaron varias cantidades de células cancerosas injertadas, incluyendo cantidades de 1.000 células, 3.000 células y 10.000 células por injerto. Se observó la formación de tumores en cada una de estas concentraciones, tras 24 y 48 horas de desarrollo del embrión injertado en el huevo después del injerto.

[0349] Referencias bibliográficas

[0350] Documento US 6.228.345

[0351] Documento WO 2015/074050

[0352] Documento US 2013/0171680

[0353] Hamburger V., Hamilton H.L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. Enero de 1951;88(1):49-92.

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[0355] Carter R, Mullassery D, See V, Theocharatos S, Pizer B, Losty PD, Jesudason E, Moss DJ. Exploitation of chick embryo environments to reprogram MYCN-amplified neuroblastoma cells to a benign phenotype, lacking detectable MYCN expression. Oncogenesis. 27 agosto de 2012;1:e24.

[0356] Busch C, Krochmann J, Drews U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PLoS One.

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[0358] Cage TA, Louie JD, Liu SR, Alvarez-Buylla A, Gupta N, Hyer J. Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system. Clin Exp Metastasis. Abril de 2012;29(4):371-80.

[0359] Kulesa PM, Kasemeier-Kulesa JC, Teddy JM, Margaryan NV, Seftor EA, Seftor RE, Hendrix MJ. Reprogramming metastatic melanoma cells to assume a neural crest cell-like phenotype in an embryonic microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 7;103(10):3752-7. Epub 27 de febrero de 2006.

[0361] Boulland JL, Halasi G, Kasumacic N, Glover JC. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J Vis Exp. 11 de julio de 2010;(41).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas dentro de los tejidos del embrión,caracterizado porque:

- el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto,

- dichas células cancerosas no se introducen en el lumen del tubo neural,

- dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma,

- dichas células se reproducen y forman tumores dentro del embrión, en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto, y

- dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz (Coturnix japónica).

2. Embrión de gallinácea según la reivindicación 1,caracterizado porqueel embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre los estadios HH10 y HH18 en el momento del injerto, o entre los estadios HH12 y HH16 en el momento del injerto, o entre los estadios h H13 y HH15 en el momento del injerto.

3. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 2,caracterizado porqueel embrión se incuba durante al menos 24 horas después del injerto.

4. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizado porquelas células cancerosas se injertan en una cantidad de al menos 1000 células por injerto.

5. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizado porquelas células cancerosas injertadas son células humanas derivadas del tumor de un paciente.

6. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 5,caracterizado porquelas células cancerosas injertadas están marcadas con un colorante o expresan una proteína marcadora.

7. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 6,caracterizado porquelas células cancerosas se injertan en un primer tejido distinto del tejido de implantación donde se forman los tumores, dirigiéndose el injerto en el primer tejido a las células cancerosas injertadas en el tejido de implantación donde se establecen los tumores.

8. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 7,caracterizado porquelas células cancerosas se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 24 y/o en el tejido cerebral.

9. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 8,caracterizado porquelas células cancerosas se injertan en tejido cerebral.

10. Embrión de gallinácea según una de las reivindicaciones 1 a 9,caracterizado porquelas células cancerosas injertadas se seleccionan del grupo que consiste en células derivadas de tumores cerebrales primarios o secundarios, células cancerosas de pulmón y células cancerosas de mama.

11. Embrión de gallinácea según la reivindicación 8,caracterizado porquelas células cancerosas injertadas derivan de tumores cerebrales primarios o secundarios, y se injertan en el tubo neural entre los somitos 1 a 4, y/o en tejido cerebral.

12. Procedimiento de preparación de un embrión de gallinácea en el que se han injertado células cancerosas que posteriormente han formado tumores dentro de dicho embrión, que comprende las siguientes etapas:

- injerto de células cancerosas en los tejidos de un embrión de gallinácea, sin que dichas células cancerosas se introduzcan en el lumen del tubo neural; e

- incubación del embrión injertado durante al menos 24 horas, dichas células cancerosas se reproducen y forman tumores dentro del embrión, en un lugar de implantación distinto del lugar del injerto;

caracterizado porque:

dicha gallinácea es un pollo(gallus gallus)o una codorniz(Coturnix japónica),

el embrión se encuentra en una etapa de desarrollo comprendida entre el estadio HH10 y el estadio HH25 en el momento del injerto, y

dichas células cancerosas no son ni células de neuroblastoma ni células de melanoma.

13. Procedimiento de monitorización de un paciente con un tumor, que comprende:

a) preparación de un primer embrión injertado según el procedimiento de la reivindicación 12, con células cancerosas derivadas de dicho paciente en un momento T<1>, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este primer embrión,

b) preparación de un segundo embrión injertado según el procedimiento de la reivindicación 12, con células cancerosas derivadas de dicho paciente en un momento T<2>, y la evaluación de la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en este segundo embrión,

c) comparación entre la tumorigénesis de los tumores que se desarrollan en el primer embrión injertado y en el segundo embrión injertado.

14. Procedimiento de cribado de moléculas terapéuticas destinadas al tratamiento del cáncer, consistente en las siguientes etapas:

a) preparación de un embrión injertado según el procedimiento de la reivindicación 12;

b) administración a este embrión injertado de una molécula terapéutica candidata;

c) evaluación de la malignidad de las células cancerosas presentes en este embrión injertado tras la administración de dicha molécula candidata.

15. Procedimiento de preparación de tumores compuestos por células cancerosas, que comprende las siguientes etapas:

- preparación de un embrión injertado según el procedimiento de la reivindicación 12;

- extirpación de dichos tumores formados dentro del embrión.