ES3047733T3 - Humanized anti-gpc-1 antibody - Google Patents

Humanized anti-gpc-1 antibody

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ES3047733T3
ES3047733T3 ES21823133T ES21823133T ES3047733T3 ES 3047733 T3 ES3047733 T3 ES 3047733T3 ES 21823133 T ES21823133 T ES 21823133T ES 21823133 T ES21823133 T ES 21823133T ES 3047733 T3 ES3047733 T3 ES 3047733T3
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cancer
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gpc1
humanized
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Tetsuji Naka
Satoshi Serada
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Iwate Medical University
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Abstract

La presente divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une específicamente a glipicano-1 (GPC-1) y una técnica, un método, un fármaco, etc., relacionados con el mismo. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado anti-GPC-1 con alta afinidad por GPC-1 y alta actividad de internalización en células GPC-1 positivas. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición para la prevención o el tratamiento del cáncer con glipicano-1 positivo, que comprende un complejo del anticuerpo monoclonal humanizado anti-GPC-1 con un fármaco con actividad citotóxica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpo anti-gpc-1 humanizado
[0003] Campo técnico
[0004] La presente descripción se refiere a un anticuerpo humanizado que se une específicamente a glipicano-1 (GPC-1), y también se refiere a tecnologías, métodos, medicamentos y similares relacionados con el anticuerpo humanizado.
[0005] Antecedentes de la técnica
[0006] Se encontró que las moléculas de glipicano-1 se expresan significativamente más en células de cáncer de esófago que en células normales y se pueden usar como un marcador tumoral (Bibliografía de Patente 1). Asimismo, se aisló un anticuerpo que se une significativamente a glipicano-1 (Bibliografía de Patente 1).
[0007] Lista de citas
[0008] Bibliografía de patentes
[0009] Bibliografía de Patente 1: WO 2015/098112
[0010] El documento WO 2018/199318 se refiere a un anticuerpo anti-glipicano-1 y a un método para usar el anticuerpo. El documento de Nishigaki y otros,British Journal of Cáncer(2020) 122:1333-1341 describe un conjugado anticuerpo anti-glipicano-1 -fármaco como terapia potencial contra el cáncer de páncreas.
[0011] El documento de Matsuzaki y otros,International Journal of Cáncer(2018) 142:1056-1066 informa que un conjugado anticuerpo anti-glipicano-1 -fármaco exhibe una potente actividad antitumoral preclínica contra el cáncer de cuello uterino positivo a Glipicano-1.
[0012] Compendio de la invención
[0013] Solución al problema
[0014] La presente descripción provee un anticuerpo monoclonal anti-GPC-1 humanizado que tiene alta afinidad por GPC-1 y tiene alta actividad de internalización en células positivas para GPC-1. Todavía no se había desarrollado un anticuerpo anti-GPC-1 humanizado y, además, no se predijo que un anticuerpo anti-GPC-1 humanizado tuviera una actividad alta. El anticuerpo de la presente descripción puede usarse en diversas aplicaciones terapéuticas. Por consiguiente, la presente descripción también provee una composición para su uso en un método para prevenir o tratar cáncer positivo a glipicano-1 que incluye un complejo de un anticuerpo monoclonal anti-GPC-1 humanizado y un medicamento que tiene actividad citotóxica.
[0015] Dicho anticuerpo o un fragmento del mismo es aplicable a un reactivo de diagnóstico complementario así como a un tratamiento dirigido, cuidado médico personalizado o similar que se combina con el reactivo de diagnóstico complementario.
[0016] Efectos ventajosos de la invención
[0017] Según la presente descripción, se provee un anticuerpo anti-Glipicano-1 humanizado aplicable a uso clínico. Dicho anticuerpo puede utilizarse como agente de detección utilizado para el diagnóstico y el tratamiento complementario del cáncer positivo a Glipicano-1 y, además, un complejo del anticuerpo y un fármaco es altamente eficaz en el tratamiento del cáncer positivo a Glipicano-1.
[0018] Breve descripción de los dibujos
[0019] La FIG. 1 muestra las constantes de disociación de equilibrio (K<d>) de veinte tipos de clones medidos usando Biacore (marca registrada).
[0020] La FIG. 2 muestra un diagrama esquemático que ilustra un ensayo de ADC del Ejemplo 2.
[0021] La FIG. 3 muestra los resultados de la actividad citotóxica (CI<50>) de veinte tipos de clones contra la línea celular TE14. La FIG. 4 muestra los resultados de un análisis de afinidad de antígeno de un anticuerpo quimérico anti-GPC-1 (01a033) y un clon T2 medidos usando un FACS.
[0022] La FIG. 5 muestra un diagrama esquemático que ilustra la estructura de un ADC a modo de ejemplo.
[0023] La FIG. 6 muestra un diagrama esquemático que ilustra los ajustes de una relación fármaco-anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés).
[0024] La FIG. 7 muestra los resultados de un análisis de afinidad de antígeno de un GPC1-ADC humanizado y un anticuerpo no marcado usando un FACS.
[0025] La FIG. 8 muestra los resultados de un ensayo de internalización celular de un anticuerpo anti-GPC-1 humanizado (clon T2) y un GPC1-ADC humanizado (MMAE). Verde indica tinción de GPC1, rojo indica tinción de CD107a y azul indica tinción de DAPI. La barra de escala indica 10 gm. En cada grupo mostrado en los gráficos, la barra izquierda indica el resultado obtenido a 4 °C, y la barra derecha indica el resultado obtenido a 37 °C.
[0026] La FIG. 9 muestra los resultados de un análisis de expresión de GPC1 de diversas líneas celulares medidas usando un FACS.
[0027] La FIG. 10 muestra los resultados de un ensayo de ADCin-vitrousando un GPC1-ADC humanizado (MMAE). La FIG. 11 muestra los resultados de un análisis de expresión de GPC1 y un ensayo de ADC de una línea celular HeLa, una línea celular Detroit562 y una línea celular FaDu.
[0028] La FIG. 12 muestra los resultados de un análisis de expresión de GPC1 y un ensayo de ADC de una línea celular Ho-1 -u-1, una línea celular KOSC2 cl3-43 y una línea celular KON.
[0029] La FIG. 13 muestra los resultados de una prueba de eficaciain-vivode un GPC1-ADC humanizado (MMAE) usando un PDX de cáncer de páncreas (PK565) en donde la expresión de GPC1 es heterogénea. En todos los grupos, los pesos corporales no cambiaron significativamente. El volumen tumoral casi no cambió en el caso de GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg), el volumen tumoral aumentó ligeramente en el caso de GPC1-ADC humanizado (3 mg/kg), los volúmenes tumorales aumentaron y fueron sustancialmente los mismos en los casos de GPC-ADC humanizado (1 mg/kg) y ADC de control (10 mg/kg), y el volumen tumoral aumentó y fue el mayor en el caso de control de vehículo. La FIG. 14 muestra los resultados de una prueba de eficaciain-vivode un GPC1-ADC humanizado (MMAE) usando un PDX de cáncer de páncreas (PK175) en donde GPC1 se expresa tanto en células cancerosas como en CAF. Los pesos corporales aumentaron ligeramente en los casos de GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg) y GPC1-ADC humanizado (3 mg/kg). Los pesos corporales no cambiaron significativamente en los casos de GPC-ADC humanizado (1 mg/kg) y control de vehículo. El volumen tumoral disminuyó y fue el más pequeño en el caso de GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg), el volumen tumoral aumentó ligeramente en el caso de GPC1-ADC humanizado (3 mg/kg), los volúmenes tumorales aumentaron gradualmente en los casos de GPC-ADC humanizado (1 mg/kg) y control de vehículo, y el volumen tumoral fue el más grande en el caso de control de vehículo.
[0030] La FIG. 15 muestra los resultados de una prueba de eficaciain-vivode un GPC1-ADC humanizado (MMAE) usando un PDX de cáncer de esófago (ESCC14) en donde GPC1 se expresa de manera altamente homogénea. En todos los grupos, los pesos corporales no cambiaron significativamente. Los volúmenes tumorales eran equivalentes entre sí y los más pequeños en los casos de GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg) y GPC1-ADC humanizado (3 mg/kg), el volumen tumoral casi no cambió en el caso de GPC-ADC humanizado (1 mg/kg), y el volumen tumoral aumentó gradualmente en el caso de control de vehículo.
[0031] La FIG. 16 muestra los resultados de un análisis de expresión de GPC1 y un ensayo de ADC de una línea celular de cáncer colorrectal de ratón forzada a expresar mGPC1 (mGPC1 -MC38).
[0032] La FIG. 17 muestra los resultados de la cuantificación de HMGB-1 en un sobrenadante de cultivo, obtenido a través de ELISA.
[0033] La FIG. 18 muestra los resultados de un análisis del efecto antitumoral llevado a cabo en ratones modelo de cáncer colorrectal singénico usando un GPC1-ADC humanizado (MMAE) y un anticuerpo anti-PD1 juntos. En todos los grupos, los pesos corporales no cambiaron significativamente. El volumen tumoral fue el más pequeño en el caso de GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg) anticuerpo anti-PD1 (3 mg/kg), y aumentó en el orden de anticuerpo anti-PD1 (3 mg/kg), GPC1-ADC humanizado (10 mg/kg) y control de vehículo.
[0034] La FIG. 19 muestra los resultados de la medición de un marcador del ciclo celular en fase G2/M (fosfohistona H3 (Ser10)) en un PDX de cáncer pancreático (PK565). La barra de escala indica 100 gm. "**" indica P<0,01 en ANOVA unidireccional después de la pruebapost hocde Dunnett.
[0035] La FIG. 20 muestra los resultados de un análisis de expresión de GPC1 de un tejido metastásico de cáncer pancreático distante, obtenido a través de tinción inmunohistoquímica. La barra de escala indica 100 gm.
[0036] La FIG. 21 muestra los esquemas de producción de un modelo de metástasis hepática de cáncer pancreático y una prueba de eficacia usando un GPC1 -ADC humanizado. El día 0, día 3, día 7 y día 10, se llevó a cabo la administración i.v. El día 0, día 7, día 14, día 21, día 28, día 35, día 42 y día 49, se llevó a cabo la medición de IVIS.
[0038] La FIG. 22 muestra los resultados de una prueba de eficacia de un GPC1 -ADC humanizado usando el modelo de metástasis hepática de cáncer pancreático. Grupo de administración de PBS: n=13, GPC1-ADC 10 mg/kg grupo de administración: n=10, *: p<0,05, **: p<0,01.
[0040] Descripción detallada
[0042] En lo sucesivo, se describirá la presente descripción. Debe entenderse que, a lo largo de esta memoria descriptiva, los sustantivos expresados en una forma singular también abarcan conceptos de los sustantivos en una forma plural a menos que se indique lo contrario. Por consiguiente, debe entenderse que los artículos (p. ej., "un", "una" y "el/la") usados con sustantivos en una forma singular también abarcan conceptos de los sustantivos en una forma plural a menos que se indique lo contrario. Asimismo, debe entenderse que los términos como se usan en la presente memoria se usan en los sentidos generales en la técnica a menos que se indique lo contrario. Por consiguiente, todos los términos técnicos y los términos científicos tal como se usan en la presente memoria se usan en el mismo sentido que el entendido por una persona con experiencia en la técnica a la que pertenece la presente descripción, a menos que se defina lo contrario. Si surge una contradicción, esta memoria descriptiva (incluidas las definiciones) tiene prioridad. El término "aproximadamente" significa ±10 % de un valor indicado.
[0043] Definiciones
[0045] En primer lugar, se describirán los términos y las tecnologías comunes como se usan en la presente memoria.
[0046] En esta memoria descriptiva, los términos "Glipicano-1", "GPC-1", y "GPC1" se usan indistintamente, y se refieren a un proteoglicano de superficie celular de tipo anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) que tiene sulfato de heparano. Este proteoglicano se considera que está relacionado con la adhesión celular, migración, metabolismo de lipoproteínas, regulación de la actividad del factor de crecimiento e inhibición de la coagulación sanguínea. Se dice que el proteoglicano se une a varios tipos de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) como, por ejemplo, FGF-1, FGF-2 y FGF-7. Se considera que glipicano-1 sirve como chaperona extracelular de VEGF165 y ayuda a restaurar la capacidad de unión al receptor después de la oxidación. Actualmente, se conocen seis tipos de glipicanos, a saber, glipicano-1 a glipicano-6. Sin embargo, con respecto a la relación con el cáncer, todos los miembros pertenecientes a la familia del glipicano no se reconocen necesariamente como un marcador de cáncer, y los miembros parecen ser independientes entre sí. El glipicano-1 está registrado en UniProt (Acceso n.° P35052) (es preciso ver http://www.uniprot.org/uniprot/P35052). Además, glipicano-1 está registrado en NCBI (NP_002072.2 (secuencia de aminoácidos del precursor) y NM_002081.2 (ARNm)), EMBL (X54232.1 (ARNm)), GenBank (BC051279.1 (ARNm)) y DDBJ (AC110619.3 (genómico)). Toda esta información puede utilizarse en esta memoria descriptiva. Con respecto a glipicano-1, se puede hacer referencia a David G y otros,J Cell Biol.1990 dic; 111 (6 Pt 2): 3165-76; Haecker U y otros,Nat Rev Mol Cell Biol.2005 jul; 6(7): 530-41; Aikawa T y otros,J Clin Invest.2008 enero; 118(1): 89-99.; Matsuda K, y otros,Cáncer Res.2001 jul 15; 61(14): 5562-9, y similares. Un ejemplo representativo de la secuencia de ácido nucleico (longitud completa) de glipicano-1 humano es una secuencia expuesta en la ID de SEC n.°: 1, y un ejemplo representativo de la secuencia de aminoácidos de la misma es una secuencia expuesta en la ID de SEC n.°: 2. Asimismo, un ejemplo representativo de la secuencia de ácido nucleico (longitud completa) de glipicano-1 de ratón es una secuencia expuesta en la ID de SEC n.°: 3, y un ejemplo representativo de la secuencia de aminoácidos de la misma es una secuencia expuesta en la ID de SEC n.°: 4. En el caso donde se usa "Glipicano-1", "GPC-1" o "GPC1" con el objeto de esta memoria descriptiva, se entiende que no solo una proteína (o un ácido nucleico que codifica la proteína) que tiene una secuencia de aminoácidos de un número de ID de secuencia o número de acceso específico, sino también análogos o derivados funcionalmente activos de la misma, fragmentos funcionalmente activos de la misma, homólogos de la misma y variantes codificadas por ácidos nucleicos que hibridan con el ácido nucleico que codifica esta proteína en condiciones de alta rigurosidad o condiciones de baja rigurosidad también pueden usarse en la presente descripción siempre que se adapten al objeto específico de la presente descripción.
[0048] Los términos "derivado", "análogo" y "variante", como se usan en la presente memoria, abarcan preferiblemente moléculas que incluyen una región sustancialmente homóloga con una proteína de interés (p. ej., glipicano-1 y un anticuerpo), pero no se pretende que se limiten a los mismos. Tales moléculas pueden tener al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad cuando se comparan con una secuencia de aminoácidos que tiene el mismo tamaño o una secuencia alineada llevando a cabo el alineamiento con un programa de homología por ordenador conocido en la técnica. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas pueden hibridarse con la secuencia que codifica la proteína constituyente en condiciones (altamente) rigurosas, condiciones moderadamente rigurosas o condiciones no rigurosas. Esto significa que estas moléculas se producen modificando una proteína mediante sustitución, deleción y adición de un aminoácido, y los derivados producidos de este modo todavía presentan funciones biológicas de la proteína original, aunque no necesitan presentar necesariamente las funciones en la misma medida que la proteína original. Por ejemplo, también es posible examinar las funciones biológicas de dichas proteínas a través de ensayosin-vitroadecuados disponibles que se describen en la presente memoria o se conocen en la técnica. La expresión "funcionalmente activo" como se usa en la presente memoria se refiere a polipéptidos, concretamente fragmentos o derivados, que tienen funciones estructurales, funciones de control o funciones bioquímicas de una proteína como, por ejemplo, actividad biológica.
[0050] Aunque la presente descripción describe principalmente Glypicano-1 humano, se sabe que las proteínas Glypicano-1 se expresan en muchos tipos de especies animales distintas de los humanos como, por ejemplo, chimpancés (Pan troglodytes) (K7B6W5), monos rhesus (Macaca mulatta) (F6VPW9), ratones (Mus musculus) (Q9QZF2), ratas (Rattus norvegicus) (P35053) y pollos (Gallus gallus) (F1P150) y, por lo tanto, se entiende que estos animales, particularmente mamíferos, están dentro del alcance de la presente descripción. Es preferible que se conserven preferiblemente dominios funcionales de glipicano-1 como, por ejemplo, el dominio extracelular (constituido por aproximadamente 500 aminoácidos que incluyen 12 residuos de cisteína) y la región hidrófoba C-terminal (dominio de anclaje GPI).
[0052] Los términos "proteína", "polipéptido", "oligopéptido" y "péptido" como se usan en la presente memoria se usan indistintamente en esta memoria descriptiva, y se refieren a un polímero de aminoácidos que tiene cualquier longitud. Este polímero puede ser un polímero lineal, un polímero ramificado o un polímero cíclico. El aminoácido puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no natural, y puede ser un aminoácido modificado. Estos términos pueden abarcar un complejo obtenido ensamblando múltiples cadenas polipeptídicas. Estos términos también abarcan un polímero de aminoácidos modificado natural o artificialmente. Tales modificaciones abarcan, por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación y cualquier otra operación o modificación (p. ej., formación de un polímero unido a un componente marcador). Esta definición abarca, por ejemplo, polipéptidos que incluyen uno o dos o más análogos de aminoácidos (p. ej., polipéptidos que incluyen un aminoácido no natural o similares), compuestos similares a péptidos (p. ej., peptoides) y otras modificaciones conocidas en la técnica. El término "aminoácido", como se usa en la presente memoria, es un nombre genérico para compuestos orgánicos que tienen un grupo amino y un grupo carboxilo. Cuando un anticuerpo incluye una "secuencia de aminoácidos específica", cualquiera de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos puede modificarse químicamente. Asimismo, cualquiera de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos puede formar una sal o solvato. Además, cualquiera de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos puede ser un L-aminoácido o un D-aminoácido. Incluso en tales casos, se puede decir que una proteína puede incluir la "secuencia de aminoácidos específica" descrita anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones N-terminales (p. ej., acetilación y miristoilación), modificaciones C-terminales (p. ej., amidación y adición de glicosilfosfatidilinositol), modificaciones de cadena lateral (p. ej., fosforilación y glicosilación) se conocen como modificaciones químicas que experimenta un aminoácido incluido en una proteína en un organismo vivo. El aminoácido puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no natural siempre que se cumpla el objeto de la presente descripción.
[0054] Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" como se usan en la presente memoria se usan indistintamente en esta memoria descriptiva, y se refieren a un polímero de nucleótidos que tiene cualquier longitud. Estos términos también abarcan "derivados de oligonucleótidos" y "derivados de polinucleótidos". Los "derivados de oligonucleótidos" y los "derivados de polinucleótidos" se refieren a oligonucleótidos o polinucleótidos que incluyen un derivado de nucleótido o en los que un enlace entre nucleótidos es diferente de un enlace común, y se usan indistintamente. Ejemplos específicos de tales oligonucleótidos incluyen 2'-O-metil-ribonucleótido, un derivado de oligonucleótido obtenido convirtiendo un enlace fosfodiéster en un oligonucleótido en un enlace fosforotioato, un derivado de oligonucleótido obtenido convirtiendo un enlace fosfodiéster en un oligonucleótido en un enlace fosforamidato N3'-P5', un derivado de oligonucleótido obtenido convirtiendo una ribosa y un enlace fosfodiéster en un oligonucleótido en un enlace péptido de ácido nucleico, un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo un uracilo en un oligonucleótido con un propiniluracilo C-5, un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo un uracilo en un oligonucleótido con un tiazoluracilo C-5, un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo una citosina en un oligonucleótido con una propinilcitosina C-5, un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo una citosina en un oligonucleótido con una citosina modificada con fenoxazina, un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo una ribosa en ADN con 2'-O-propilrribosa, y un derivado de oligonucleótido obtenido sustituyendo una ribosa en un oligonucleótido con 2'-metoxietoxirribosa. A menos que se indique lo contrario, se pretende que una secuencia de ácido nucleico específica también abarque secuencias explícitamente mostradas así como secuencias modificadas (p. ej., secuencias de sustitución de codones degenerados) de las mismas obtenidas modificando conservativamente las secuencias y secuencias complementarias de las mismas. Específicamente, las secuencias de sustitución de codones degenerados pueden obtenerse produciendo una secuencia en la cual las terceras posiciones en uno o más codones seleccionados (o todos) están sustituidas con bases mixtas y/o restos de desoxiadenosina (Batzer y otros,Nucleic Acid Res.19: 5081 (1991); Ohtsuka y otros, J.Biol. Chem.260: 2605-2608 (1985); Rossolini y otros,Mol. Cell. Probes8: 91-98 (1994)). Asimismo, en esta memoria descriptiva, el "ácido nucleico" se usa indistintamente con un gen, un ADNc, un ARNm, un oligonucleótido y un polinucleótido. En esta memoria descriptiva, el "nucleótido" puede ser un nucleótido natural o un nucleótido no natural.
[0056] El término "gen", como se usa en la presente memoria, se refiere a un factor que determina un rasgo heredado, y el "gen" puede referirse a un "polinucleótido", un "oligonucleótido" y un "ácido nucleico".
[0057] El término "homología" genético, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al grado de identidad entre dos o más secuencias génicas, y "homólogo" significa comúnmente que el grado de identidad o similitud es elevado. Por consiguiente, cuanto mayor es la homología entre ciertos dos genes, mayor es la identidad o similitud entre sus secuencias. Si dos tipos de genes son homólogos o no entre sí puede examinarse comparando directamente sus secuencias, o sometiendo ácidos nucleicos a un método de hibridación en condiciones rigurosas. En el caso donde dos secuencias génicas se comparan directamente, los genes son homólogos cuando la identidad de secuencia de ADN entre las secuencias génicas es típicamente al menos 50 %, preferiblemente al menos 70 % y más preferiblemente al menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Por consiguiente, el término “homólogo” o “producto génico homólogo” como se usa en la presente memoria significa una proteína de otra especie, preferiblemente otro mamífero, que presenta las mismas funciones biológicas que las de una proteína constituyente de un complejo, que también se describirá en esta memoria descriptiva. Dicho homólogo también puede denominarse "producto génico ortólogo". Se entiende que tales homólogos, productos génicos homólogos, productos génicos ortólogos y similares también pueden usarse siempre que se cumpla el objeto de la presente descripción.
[0059] En esta memoria descriptiva, se puede hacer referencia a los aminoácidos usando los códigos de tres letras comúnmente conocidos o los códigos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. De manera similar, se puede hacer referencia a los nucleótidos usando los códigos de una letra comúnmente reconocidos. En esta memoria descriptiva, las comparaciones de similitud, identidad y homología entre secuencias de aminoácidos y aquellas entre secuencias de bases se calculan usando BLAST, que es una herramienta de análisis de secuencias, con parámetros por defecto. La búsqueda de identidad se puede llevar a cabo usando NCBI BLAST 2.2.28 (emitido el 2 de abril de 2013). Los valores de identidad en esta memoria descriptiva son generalmente valores obtenidos usando BLAST anterior para llevar a cabo la alineación en condiciones predeterminadas. Sin embargo, en el caso donde se obtiene un valor más alto cambiando los parámetros, el valor más alto se toma como el valor de identidad. En el caso donde la identidad se evalúa en múltiples regiones, el valor más alto entre los valores obtenidos se toma como el valor de identidad. La similitud es un valor numérico calculado teniendo en cuenta la identidad, así como aminoácidos similares.
[0061] En la presente descripción, "90 % o más" puede ser, por ejemplo, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, o 100 % o más, o puede estar dentro de un intervalo entre dos valores anteriores cualesquiera. La "homología" descrita anteriormente puede determinarse calculando la relación del número de aminoácidos homólogos entre dos o más secuencias de aminoácidos según un método conocido en la técnica. Antes de calcular la relación, se alinean las secuencias de aminoácidos que se van a comparar en el grupo de secuencias de aminoácidos, y se introduce un hueco en una porción de una secuencia de aminoácidos si esto es necesario para maximizar la relación de aminoácidos idénticos. El método de alineamiento, el método de cálculo de la relación, el método de comparación y los programas informáticos relacionados con los mismos son convencionalmente conocidos en la técnica (por ejemplo, BLAST, GENETYX y similares). En esta memoria descriptiva, la "homología" puede representarse por un valor medido usando NCBI BLAST a menos que se indique lo contrario. En BLAST, Blastp puede usarse con ajustes por defecto como un algoritmo para comparar secuencias de aminoácidos. Los resultados de la medición se convierten en valores numéricos como positivos o identidades.
[0062] El término "equivalente funcional", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia que tiene la misma función de interés que la entidad objetivo original pero tiene una estructura diferente. Por consiguiente, se entiende que el equivalente funcional de "Glipicano-1" o un anticuerpo Glipicano-1 abarca una sustancia que no es Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1 sino una variante o producto alterado (con una secuencia de aminoácidos modificada o similar, por ejemplo) de Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1 que retiene efectos biológicos de Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1, y una sustancia que puede cambiar a Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1, o una variante o producto alterado de Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1 (incluido un ácido nucleico que codifica Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1, o una variante o producto alterado de Glipicano-1 o un anticuerpo Glipicano-1, un vector y células que incluyen el ácido nucleico anterior, y similares) cuando deben mostrarse tales efectos. Se entiende que, en la presente descripción, el equivalente funcional de Glipicano-1 o un anticuerpo de Glipicano-1 se puede usar de la misma manera que Glipicano-1 o un anticuerpo de Glipicano-1 sin hacer referencias especiales. El equivalente funcional puede encontrarse buscando en una base de datos y similares. El término "búsqueda", como se usa en la presente memoria, significa que se usa una determinada secuencia de ácido nucleico en un método electrónico o biológico o en otros métodos para encontrar otra secuencia de ácido nucleico que tenga una determinada función y/o característica. Ejemplos de búsqueda electrónica incluyen, pero no se limitan a, BLAST (Altschul y otros,J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990)<f>A<s>TA (Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci.,EE. UU. 85: 2444-2448 (1988)), el método de Smith y Waterman (Smith y Waterman,J. Mol. Biol.147: 195-197 (1981)), y el método de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch,J. Mol. Biol.48: 443-453 (1970)). Ejemplos de búsqueda biológica incluyen, pero no se limitan a, hibridación restrictiva, ensayo de micromatrices usando una micromatriz obtenida uniendo ADN genómico a una membrana de nailon o similar o una micromatriz obtenida uniendo ADN genómico en una placa de vidrio, PCR e hibridaciónin-situ.En esta memoria descriptiva, se pretende que los genes usados en la presente descripción incluyan genes correspondientes identificados a través de tal búsqueda electrónica o búsqueda biológica.
[0064] El equivalente funcional de la presente descripción puede obtenerse llevando a cabo la inserción, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos o adición de uno o más aminoácidos a uno 0 ambos extremos de una secuencia de aminoácidos. En esta memoria descriptiva, la expresión "llevar a cabo inserción, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos o adición de uno o más aminoácidos a uno o ambos extremos de una secuencia de aminoácidos" significa que una secuencia de aminoácidos se modifica a través de una técnica conocida como, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutación natural, de modo que múltiples aminoácidos se sustituyen, por ejemplo, en un grado tal que puede producirse de manera natural. La secuencia de aminoácidos modificada puede obtenerse llevando a cabo la inserción, sustitución o deleción, o adición a uno o ambos extremos, de, por ejemplo, 1 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 1 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 1 a 9 aminoácidos, incluso más preferiblemente de 1 a 5 aminoácidos, y particularmente preferiblemente de 1 o 2 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos modificada puede ser la secuencia de aminoácidos de Glipicano-1 que incluye preferiblemente una o más (preferiblemente una o varias, o una, dos, tres, o cuatro) sustituciones conservadoras. Aquí, la "sustitución conservadora" significa que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos con otros residuos de aminoácidos químicamente similares de manera que las funciones de la proteína no están sustancialmente modificadas. Ejemplos de los mismos incluyen la sustitución de un determinado residuo hidrófobo con otro residuo hidrófobo, y la sustitución de un determinado residuo polar con otro residuo polar que tiene la misma carga eléctrica. Para cada aminoácido, se conoce en la técnica un aminoácido funcionalmente similar que puede usarse para llevar a cabo tal sustitución. Ejemplos específicos de los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina. Ejemplos específicos de los aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina y cisteína. Ejemplos específicos de los aminoácidos que tienen una carga eléctrica positiva (aminoácidos básicos) incluyen arginina, histidina y lisina. Ejemplos específicos de los aminoácidos que tienen una carga eléctrica negativa (aminoácidos ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
[0066] Un "anticuerpo anti-Glipicano-1" incluye un anticuerpo que tiene una capacidad de unión a Glipicano-1. Aunque no hay limitación particular sobre un método para producir este anticuerpo anti-Glipicano-1, este anticuerpo puede producirse, por ejemplo, inmunizando un mamífero o ave con Glipicano-1. El "fragmento de unión a antígeno" del anticuerpo anti-Glipicano-1 se refiere a un fragmento de un anticuerpo que tiene una capacidad de unión a Glipicano-1. Ejemplos de este fragmento de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo monocatenario, un scFv, un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2 .
[0068] Aunque no hay limitación particular sobre la clase de anticuerpo del anticuerpo anti-glipicano-1 según la presente descripción, puede ser, por ejemplo, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE o IgY.
[0070] El anticuerpo anti-glipicano-1 puede ser un fragmento de anticuerpo (que también puede denominarse "fragmento de unión a antígeno" en lo sucesivo en la presente memoria) que tiene una actividad de unión a antígeno. En este caso, se obtienen un efecto de aumento de la estabilidad, un efecto de aumento de la eficacia de producción de anticuerpos y similares.
[0072] El anticuerpo anti-glipicano-1 puede ser una proteína de fusión. Esta proteína de fusión puede obtenerse uniendo un polipéptido o un oligopéptido al extremo N o C del anticuerpo anti-glipicano-1. Aquí, el oligopéptido puede ser una etiqueta His.
[0074] El anticuerpo anti-Glipicano-1 puede ser, por ejemplo, un anticuerpo obtenido a través de una etapa de inmunización de un organismo vivo con Glipicano-1 purificado, células que expresan Glipicano-1, o una membrana lipídica que contiene Glipicano-1. Es preferible usar células que expresan Glipicano-1 para la inmunización desde el punto de vista de mejorar el efecto de tratamiento del cáncer positivo a Glipicano-1.
[0076] El anticuerpo anti-Glipicano-1 puede ser un anticuerpo que tiene un conjunto de CDR de un anticuerpo obtenido a través de una etapa de inmunización de un organismo vivo con Glipicano-1 purificado, células que expresan Glipicano-1, o una membrana lipídica que contiene Glipicano-1. Es preferible usar células que expresan Glipicano-1 para la inmunización desde el punto de vista de mejora de un efecto de tratamiento del cáncer positivo a Glipicano-1. El conjunto de CDR incluye CDR 1,2 y 3 de cadena pesada y CDR 1,2 y 3 de cadena ligera.
[0078] Las "células que expresan Glipicano-1" se pueden obtener, por ejemplo, introduciendo un polinucleótido que codifica Glipicano-1 en células y después permitiendo que las células expresen Glipicano-1. Aquí, Glipicano-1 incluye un fragmento de Glipicano-1. Asimismo, la "membrana lipídica que contiene glipicano-1" puede obtenerse, por ejemplo, mezclando glipicano-1 y una membrana bicapa lipídica. Aquí, Glipicano-1 incluye un fragmento de Glipicano-1. Asimismo, el anticuerpo anti-Glipicano-1 es preferiblemente un anticuerpo obtenido a través de una etapa de inmunización de un pollo con un antígeno, o un anticuerpo que tiene el conjunto de CDR del anticuerpo obtenido de este modo, desde el punto de vista de mejorar un efecto de tratamiento de cáncer positivo para Glipicano-1.
[0080] El anticuerpo anti-glipicano-1 puede tener cualquier fuerza de unión siempre que se logre el objeto. El anticuerpo anti-glipicano-1 puede tener actividad de internalización y/o actividad ADC. Es preferible que este anticuerpo tenga una fuerza de unión fuerte en el caso donde se usa para la aplicación al diagnóstico o un agente complementario. Por ejemplo, el valor de KD (kd/ka) puede ser 1,0x10-8 (M) o menos, 1,0x10-9 (M) o menos, o 1,0x10-10 (M) o menos.
[0081] Cuando el anticuerpo anti-glipicano-1 se usa para la aplicación al diagnóstico o un agente complementario, la fuerza de unión del mismo expresada como el valor de KD (kd/ka) es preferiblemente 1,0x10-8 (M) o menos.
[0082] El anticuerpo anti-Glipicano-1 puede unirse a Glipicano-1 de tipo silvestre o Glipicano-1 mutante. El término "mutante" abarca mutaciones provocadas por una diferencia en la secuencia de ADN entre anticuerpos individuales. La homología de la secuencia de aminoácidos de Glipicano-1 de tipo silvestre o Glipicano-1 mutante con la secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 2 es preferiblemente 80 % o más, más preferiblemente 90 % o más, incluso más preferiblemente 95 % o más, y particularmente preferiblemente 98 % o más.
[0084] En esta memoria descriptiva, el "anticuerpo" abarca moléculas o poblaciones de las mismas que pueden unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo puede estar presente en diversas formas, y una o más formas pueden seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa (anticuerpo que tiene una región Fab y una región Fc), un anticuerpo Fv, un anticuerpo Fab, un anticuerpo F(ab')2, un anticuerpo Fab', un diacuerpo, un anticuerpo monocatenario (monocatenario) (p. ej., scFv), un sc(Fv)2 (monocatenario (Fv)2), un scFv-Fc, un dsFv, un anticuerpo multiespecífico (p. ej., anticuerpo oligoespecífico o anticuerpo biespecífico), un diacuerpo, un péptido o polipéptido que tiene una capacidad de unión a antígeno, un anticuerpo quimérico (p. ej., anticuerpo quimérico ratón-humano o anticuerpo quimérico pollo-humano), un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de pollo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y sustancias iguales a los mismos (o equivalentes). Asimismo, el anticuerpo abarca anticuerpos modificados y anticuerpos no modificados. Los anticuerpos modificados pueden formarse uniendo diversas moléculas como, por ejemplo, polietilenglicol a anticuerpos. Los anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente un anticuerpo usando un método conocido. Además, tales anticuerpos pueden fusionarse a una enzima como, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano o a-galactosidasa a través de un enlace covalente o a través de recombinación. El anticuerpo se une específicamente a una proteína Glipicano-1. Asimismo, el anticuerpo abarca anticuerpos modificados y anticuerpos no modificados. Los anticuerpos modificados pueden formarse uniendo diversas moléculas como, por ejemplo, polietilenglicol a anticuerpos. Los anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente un anticuerpo usando un método conocido.
[0086] El término "anticuerpo monoclonal" puede abarcar el caso donde los anticuerpos individuales incluidos en la población, con exclusión de algunos anticuerpos que tienen mutaciones que pueden producirse de manera natural, corresponden sustancialmente a un único epítopo. Alternativamente, también puede abarcar el caso donde los anticuerpos individuales incluidos en la población, con exclusión de algunos anticuerpos que tienen mutaciones que pueden producirse de manera natural, pueden ser sustancialmente iguales. Un anticuerpo monoclonal es altamente específico, y es diferente de un anticuerpo policlonal común que incluye típicamente diferentes anticuerpos correspondientes a diferentes epítopos. El anticuerpo monoclonal es útil debido a su especificidad, así como al hecho de que puede sintetizarse a través de un cultivo de hibridoma que no está contaminado con otras inmunoglobulinas. La expresión "monoclonal" puede indicar la característica de que el anticuerpo se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, pero no significa que el anticuerpo tenga que producirse usando algún método específico. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede producirse usando un método que es similar al método del hibridoma como se describe en "Kohler G. Milstein C.,Nature.7 de agosto de 1975; 256(5517): 495-497". Alternativamente, el anticuerpo monoclonal puede producirse usando un método que es similar al método de recombinación como se describe en la Patente de EE. UU. n.° 4816567. El anticuerpo monoclonal puede aislarse de una biblioteca de anticuerpos en fagos usando un método que es similar a la técnica descrita en "Clacksonet y otros,Nature.15 de agosto de 1991; 352(6336): 624-628" o "Marks y otros,J Mol Biol.
[0087] 1991 dic 5; 222(3): 581-597". El anticuerpo monoclonal puede producirse usando un método descrito en"Protein Experiments Handbook,Yodosha Co., Ltd. (2003): 92-96".
[0089] Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para la producción en masa de anticuerpos y, por ejemplo, lo siguiente es un ejemplo típico de construcción de un sistema de producción en masa de anticuerpos y producción de anticuerpos. Es decir, un vector de expresión de anticuerpo de cadena H y un vector de expresión de anticuerpo de cadena L se transfectan en células CHO, las células se cultivan con G418 y Zeocina, que son reactivos selectivos, y la clonación se lleva a cabo usando un método de dilución limitante. Después de la clonación, se selecciona un clon que expresa de manera estable el anticuerpo usando un método ELISA. Las células CHO seleccionadas se someten a cultivo de expansión, y se recoge un sobrenadante de cultivo que contiene el anticuerpo. El anticuerpo puede purificarse del sobrenadante del cultivo recogido mediante purificación de proteína A o purificación de proteína G. Con respecto al anticuerpo humanizado de la presente descripción, puede obtenerse un anticuerpo policlonal humano completo inmunizando un ratón productor de anticuerpo humano con un antígeno de interés, y puede usarse un anticuerpo monoclonal obtenido a partir del mismo en la presente descripción.
[0090] El "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que tiene CDR derivadas de una especie no humana, una región marco (FR, por sus siglas en inglés) derivada de inmunoglobulina humana, y una región constante derivada de inmunoglobulina humana, y se une a un antígeno deseado. Un anticuerpo puede humanizarse usando diversos métodos conocidos en la técnica (Almagro y otros,Front Biosci.1 de enero de 2008; 13: 1619-1633). Ejemplos de los mismos incluyen injerto de CDR (Ozaki y otros,Blood.1 de jun de 1999; 93(11): 3922-3930),Re-surfacing(Roguska y otros,Proc Natl Acad SciEE. u U. 1 de feb de 1994; 91 (3): 969-973), yFr shuffling(Damschroder y otros,Mol Immunol.abril de 2007; 44(11): 3049-3060. Epub 22 de enero de 2007). Con el fin de modificar (preferiblemente, mejorar) la unión al antígeno, los residuos de aminoácidos en la región FR humana pueden sustituirse con los residuos correspondientes de un anticuerpo donador de CDR. Esta sustitución de FR se puede llevar a cabo usando un método conocido en la técnica (Riechmann y otros,Nature.24 de marzo de 1988; 332(6162): 323-327). Por ejemplo, un residuo de FR que es importante para la unión al antígeno puede identificarse modelando la interacción entre la CDR y los residuos de FR. Alternativamente, un residuo de FR anormal en una posición específica puede identificarse a través de comparación de secuencias. En la humanización, un aminoácido en la CDR puede o no cambiarse. Además de la descripción anterior, también se puede producir un anticuerpo humanizado como se describe en "Ejemplo de producción" de la presente descripción. Específicamente, puede llevarse a cabo la selección de una biblioteca de Vken la cual una CDR de un anticuerpo derivado de una especie no humana se injerta en un marco de cadena pesada humana y la cadena pesada se fija. En este método de humanización, la CDR de cadena pesada no se cambia, pero la CDR de cadena ligera puede cambiarse.
[0091] La "cadena pesada" es típicamente un elemento constituyente principal de un anticuerpo de longitud completa. En general, la cadena pesada se une a una cadena ligera a través de un enlace disulfuro y un enlace no covalente. Una región denominada región variable (VH) está presente en el dominio N-terminal de la cadena pesada, y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables varían incluso en anticuerpos del mismo tipo y la misma clase. Se sabe comúnmente que la VH contribuye significativamente a la especificidad y afinidad por un antígeno. Por ejemplo, "Reiter y otros,J Mol Biol.16 de julio de 1999; 290(3): 685-98" indica que una molécula constituida por solo una VH se une específicamente a un antígeno con alta afinidad. Además, "Wolfson W,Chem Biol.2006 diciembre; 13(12): 1243-1244" establece que algunos anticuerpos de camello tienen solo una cadena pesada y ninguna cadena ligera.
[0093] La "CDR (región determinante de la complementariedad, CDR, por sus siglas en inglés)" es una región en un anticuerpo que realmente entra en contacto con un antígeno para formar un sitio de unión. En general, la CDR se localiza en la Fv (región variable: incluidas una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL)) de un anticuerpo. Asimismo, en general, la CDR incluye CDR1, CDR2 y CDR3, cada una de las cuales está constituida por aproximadamente de 5 a 30 residuos de aminoácidos. Se sabe que particularmente la CDR de la cadena pesada contribuye a la unión de un anticuerpo a un antígeno. También se sabe que la contribución de la CDR3 a la unión de un anticuerpo a un antígeno es la mayor entre las CDR. Por ejemplo, "Willy y otros,Biochemical and Biophysical Research CommunicationsVolumen 356, Número 1,27 de abril de 2007, páginas 124­ 128" indica que la capacidad de unión de un anticuerpo se aumenta modificando la CDR3 de la cadena pesada. Una porción de la región Fv distinta de la CDR se denomina región marco (FR), y la región marco incluye FR1, FR2, FR3 y FR4 y está relativamente altamente conservada entre los anticuerpos (Kabat y otros,"Sequence of Proteins of Immunological Interest',Departamento de Saludos y Servicios Humanos de los Estados Unidos, 1983). Es decir, el factor que caracteriza la reactividad de un anticuerpo es la CDR, particularmente la CDR de cadena pesada.
[0095] Se han descrito múltiples definiciones de la CDR y múltiples métodos para determinar la posición de la CDR. Por ejemplo, la definición de Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) o la definición de Chothia (Chothia y otros,J. Mol. Biol.,1987; 196: 901-917) puede emplearse. La definición de Kabat puede usarse como un ejemplo preferido, pero el ejemplo preferido no se limita necesariamente a ello. En algunos casos, la CDR puede determinarse teniendo en cuenta tanto la definición de Kabat como la definición de Chothia. Por ejemplo, una porción en la cual una CDR según la definición de Kabat y una CDR según la definición de Chothia se solapan entre sí, o una porción que incluye tanto una CDR según la definición de Kabat como una CDR según la definición de Chothia, puede tomarse como la CDR. Un ejemplo específico de dicho método es el método de Martin y otros(Proc. Natl. Acad. Sci.EE. UU, 1989; 86: 9268-9272) en el cual se usa el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular, siendo el método una solución intermedia entre la definición de Kabat y la definición de Chothia. Tal información sobre la CDR puede usarse para producir una variante que puede usarse en la presente descripción. Tal variante de un anticuerpo puede producirse de manera que el marco del anticuerpo original incluya una o varias (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) sustituciones, adiciones o deleciones, pero la CDR no incluye mutación.
[0097] El término "antígeno", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustrato al que una molécula de anticuerpo puede unirse específicamente. El término "inmunógeno", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un antígeno que puede iniciar la activación de linfocitos que provoca una respuesta inmunitaria específica de antígeno. El término "epítopo" o "determinante antigénico", como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción en una molécula de antígeno a la que se une un anticuerpo o un receptor de linfocitos. Un método para determinar un epítopo es conocido en la técnica, y una persona con experiencia en la técnica puede determinar dicho epítopo usando dicha técnica común conocida cuando se provee una secuencia de ácido nucleico primaria o una secuencia de aminoácidos primaria. Se entiende que incluso un anticuerpo con una secuencia diferente de la secuencia del anticuerpo de la presente descripción también se puede usar de la misma manera que el anticuerpo de la presente descripción siempre que los epítopos para estos anticuerpos sean los mismos.
[0098] Se entiende que un anticuerpo usado en esta memoria descriptiva puede tener cualquier especificidad siempre que se reduzca un falso positivo.
[0100] "Cáncer", según la presente descripción, incluye uno o más seleccionados del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer suprarrenal, cáncer del tracto biliar, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer del intestino delgado, cáncer ovárico, cáncer del conducto biliar, cáncer uterino, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer ureteral, cáncer de pelvis renal, cáncer de pene, cáncer testicular, tumor cerebral, cáncer del sistema nervioso central, cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer de cabeza y cuello, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de piel, melanoma, cáncer de tiroides, cáncer de glándula salival, linfoma maligno, carcinoma, sarcoma, leucemia y tumor maligno hematológico. El término "cáncer" se usa indistintamente con los términos "carcinoma" y "tumor". Aquí, el cáncer de ovario incluye, por ejemplo, adenocarcinoma seroso de ovario y adenocarcinoma de células claras de ovario. El cáncer uterino incluye, por ejemplo, cáncer endometrial y cáncer de cuello uterino. El cáncer de cabeza y cuello incluye, por ejemplo, cáncer oral, cáncer de faringe, cáncer de laringe, cáncer de cavidad nasal, cáncer de seno nasal, cáncer de glándula salival y cáncer de tiroides. El cáncer de pulmón incluye, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas. El tumor maligno puede ser un tumor positivo para PD-L1. El término "cáncer de esófago" como se usa en la presente memoria recibe su significado ordinario, y se usa en un sentido amplio que abarca el cáncer que aparece en el esófago. El cáncer de esófago abarca, pero no se limita a, cáncer de células escamosas, así como adenocarcinoma, cáncer metastásico de ganglios linfáticos y similares. Se sabe que el cáncer de esófago aparece cerca del centro del esófago en el pecho en aproximadamente la mitad de los pacientes japoneses, mientras que aparece en una porción inferior del esófago en un cuarto de los pacientes japoneses, y se entiende que la presente descripción cubre ambos casos. Sin desear estar limitada por la teoría, se espera que la presente descripción pueda usarse como un indicador para todos los tipos de cáncer de esófago, incluidos cáncer de células escamosas, así como adenocarcinoma y cáncer metastásico de ganglios linfáticos. El término "cáncer de páncreas" como se usa en la presente memoria se refiere a tumor maligno que aparece en el páncreas, pero este término se refiere generalmente al cáncer del conducto pancreático. En esta memoria descriptiva, también se incluyen tumores que aparecen en otras porciones del páncreas.
[0101] El término "cáncer de cuello uterino", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un tipo de cáncer de útero. El cáncer uterino incluye cáncer de cuello uterino y cáncer del cuerpo uterino. El cáncer de cuello uterino aparece en una porción en la entrada del útero, que se denomina cuello uterino.
[0102] El término "cáncer de pulmón", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor maligno que aparece a partir de células epiteliales del pulmón, e incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas y similares. El cáncer de pulmón de células no pequeñas incluye adenocarcinoma, cáncer de células escamosas y cáncer de células grandes.
[0103] El término "cáncer de cabeza y cuello", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor en la región de cabeza y cuello, y específicamente se refiere a un tumor que aparece en una porción que varía desde la cara hasta el cuello como, por ejemplo, la nariz, la boca, la garganta, la mandíbula superior, la mandíbula inferior o la oreja. El término "cáncer de mama", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor que aparece en la mama, e incluye cáncer ductal de mama, cáncer lobular, y similares.
[0104] El término "leiomiosarcoma uterino", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un tipo de sarcoma uterino que aparece en el músculo liso uterino. El leiomiosarcoma uterino puede diagnosticarse histológicamente basándose en la densidad celular, el número de división celular, el atipismo celular y si se produce o no necrosis de coagulación de células tumorales.
[0105] El término "cáncer de próstata", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor que aparece en la próstata. El término "cáncer oral de células escamosas", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor que es un tipo de cáncer oral y aparece en el epitelio de la membrana mucosa oral.
[0106] El término "cáncer de conducto biliar", como se usa en la presente memoria, se refiere a un tumor que aparece en el conducto biliar. El "cáncer de conducto biliar" se clasifica en cáncer de conducto biliar intrahepático, que aparece en el conducto biliar en el hígado, cáncer de conducto biliar perihiliar, que aparece en la región porta hepática fuera del hígado, y cáncer de conducto biliar distal, que aparece en la porción distal fuera del hígado.
[0107] El término "fibroblastos asociados al cáncer (CAF, por sus siglas en inglés)", como se usa en la presente memoria, se refiere a fibroblastos que constituyen el estroma del cáncer. Los CAF producen una gran cantidad de matriz extracelular como, por ejemplo, colágeno, que endurece considerablemente el estroma del cáncer. Como resultado, se produce la compresión (colapso) de los vasos sanguíneos y similares y, por lo tanto, se evita la infiltración eficiente de un agente anticanceroso. La compresión de los vasos sanguíneos también induce el estado hipóxico de un tejido canceroso, y además aumenta la malignidad de las células cancerosas. Un aumento en la dureza del propio estroma es uno de los factores que mejoran la proliferación y la capacidad invasiva (capacidad para extenderse sobre el tejido circundante) de las células cancerosas. Además, los CAF producen una gran cantidad de factores de crecimiento, y los factores de crecimiento actúan sobre las células cancerosas para promover la proliferación e invasión de las mismas, y suprimir la respuesta inmunitaria antitumoral.
[0109] El término "estroma" de cáncer se refiere a un tejido que rodea las células cancerosas en un tejido canceroso, incluye CAF como componente constituyente principal, e incluye, como otros componentes constituyentes, células inmunitarias, células derivadas de médula ósea, vasos tumorales, vasos linfáticos, matriz extracelular producida por CAF y similares.
[0111] El término "sujeto (sujeto humano)", como se usa en la presente memoria, se refiere a una diana (p. ej., un organismo vivo como, por ejemplo, un ser humano, o células, sangre, suero o similares eliminados de un organismo vivo) que se somete a diagnóstico o detección, o tratamiento, etc., de la presente descripción.
[0113] El término "muestra", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia obtenida de un sujeto o similar, e incluye, por ejemplo, suero y similares. Una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar una muestra preferida según sea apropiado basándose en la descripción en esta memoria descriptiva.
[0115] Los términos "medicamento", "agente" y "factor", como se usan en la presente memoria, se usan indistintamente en un sentido amplio, y pueden referirse a cualquier sustancia u otro elemento (p. ej., energía como, por ejemplo, luz, radiación, calor y electricidad) siempre que se pueda lograr el objeto previsto. Ejemplos de dicha sustancia incluyen, pero no se limitan a, una proteína, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido, un polinucleótido, un oligonucleótido, un nucleótido, un ácido nucleico (incluidos ADN como, por ejemplo, ADNc y ADN genómico, y ARN como, por ejemplo, ARNm, por ejemplo), un polisacárido, un oligosacárido, un lípido, una molécula orgánica de bajo peso molecular (p. ej., una hormona, un ligando, un mensajero, una molécula orgánica de bajo peso molecular, una molécula sintetizada a través de química combinatoria, o una molécula de bajo peso molecular que puede usarse como un fármaco farmacéutico (p. ej., ligando de bajo peso molecular)), y una molécula compleja de los mismos. Las sustancias que se unen al glipicano-1 también pueden incluirse en dichos medicamentos. Ejemplos típicos de un factor específico para un polinucleótido incluyen, pero no se limitan a, un polinucleótido complementario que tiene una cierta homología de secuencia (p. ej., 70 % o más de identidad de secuencia) con la secuencia del polinucleótido, y un polipéptido como, por ejemplo, un factor de transcripción que se une a una región promotora. Ejemplos típicos de un factor específico para un polipéptido incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo dirigido específicamente al polipéptido, o un derivado del mismo o un análogo del mismo (p. ej., anticuerpo monocatenario), un ligando o receptor específico (en el caso donde el polipéptido es un receptor o ligando), y un sustrato (en el caso donde el polipéptido es una enzima).
[0117] El término "diagnóstico", como se usa en la presente memoria, significa que se identifican diversos parámetros relacionados con una enfermedad, trastorno, afección (p. ej., cáncer de esófago) o similares en un sujeto para determinar el estado actual y el futuro de dicha enfermedad, trastorno o afección. El método, aparato o sistema de la presente descripción se puede usar para comprobar la afección en el cuerpo, y la información así obtenida se puede usar para seleccionar diversos parámetros para una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, tratamiento a administrar o una formulación o método para prevención. El término "diagnóstico", como se usa en la presente memoria, se refiere al diagnóstico del estado actual en un sentido estrecho, y engloba "diagnóstico temprano", "diagnóstico predictivo", "diagnóstico preliminar" y similares en un sentido amplio. En principio, una sustancia recogida del cuerpo puede usarse en un método de diagnóstico de la presente descripción y, por tanto, este método es industrialmente útil porque puede llevarse a cabo por una persona distinta de un trabajador sanitario como, por ejemplo, un médico. Para aclarar que el método puede ser llevado a cabo por una persona distinta de un trabajador sanitario como, por ejemplo, un médico, la expresión de que "diagnóstico predictivo, diagnóstico preliminar o diagnóstico" está "soportado" se emplea en algunas partes de esta memoria descriptiva.
[0119] El término "reactivo (agente) de detección" o "reactivo (agente) de ensayo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier medicamento que puede usarse para detectar o ensayar una diana de interés en un sentido amplio.
[0120] El término "reactivo (agente) de diagnóstico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier medicamento que puede usarse para diagnosticar una afección de interés (p. ej., una enfermedad como, por ejemplo, cáncer de esófago) en un sentido amplio.
[0122] El término "tratamiento", como se usa en la presente memoria, se refiere a prevenir la exacerbación de una determinada enfermedad o trastorno (p. ej., cáncer de esófago) que se desarrolla, preferiblemente manteniendo un nivel actual de la enfermedad o trastorno, más preferiblemente aliviando la enfermedad o trastorno, e incluso más preferiblemente curando la enfermedad o trastorno completamente, y abarca ser capaz de exhibir un efecto de mejorar o prevenir una enfermedad de un paciente o uno o más síntomas de la enfermedad. Dar un tratamiento apropiado basado en el diagnóstico preliminar se denomina "tratamiento complementario", y un reactivo de diagnóstico para el tratamiento complementario se puede denominar "reactivo de diagnóstico complementario".
[0123] El término "reactivo (agente) terapéutico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier medicamento que puede usarse para tratar una afección de interés (p. ej., una enfermedad como, por ejemplo, cáncer de esófago) en un sentido amplio. El "reactivo terapéutico" puede ser una composición farmacéutica que incluye un principio activo y uno o más vehículos farmacológicamente aceptables. La composición farmacéutica puede producirse, por ejemplo, mezclando un principio activo y el vehículo descrito anteriormente y llevando a cabo cualquier método conocido en la técnica de formulación. El reactivo terapéutico puede usarse en cualquier forma siempre que se use para el tratamiento, y solo puede usarse un principio activo o puede usarse una mezcla de un principio activo y cualquier componente. Asimismo, no hay limitación particular sobre la forma del vehículo descrito anteriormente, y el vehículo puede estar en, por ejemplo, una forma sólida o forma líquida (p. ej., solución tampón). Es preciso observar que un reactivo terapéutico para el cáncer de esófago incluye un fármaco usado para prevenir el cáncer de esófago (reactivo preventivo), o un inhibidor del crecimiento celular del cáncer de esófago.
[0125] El término "prevención", como se usa en la presente memoria, se refiere a un intento de prevenir el desarrollo de una determinada enfermedad o trastorno (p. ej., cáncer de esófago) antes del inicio de la enfermedad o trastorno. La medicina de la presente descripción puede usarse para el diagnóstico. La medicina de la presente descripción puede usarse según sea necesario para prevenir el cáncer de esófago o tomar medidas para la prevención.
[0126] El término "reactivo (agente) preventivo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier medicamento que puede usarse para prevenir una afección de interés (p. ej., una enfermedad como, por ejemplo, cáncer de esófago) en un sentido amplio.
[0128] El término "interacción", como se usa en la presente memoria, significa que cada una de dos sustancias ejerce una fuerza (p. ej., fuerza intermolecular (fuerza de van der Waals), enlace de hidrógeno o interacción hidrófoba) entre sí. En general, dos sustancias interactuantes están asociadas o unidas entre sí. La detección, prueba y diagnóstico de la presente descripción se pueden llevar a cabo utilizando dicha interacción.
[0130] En esta memoria descriptiva, la "detección" o "cuantificación" de la expresión de un polinucleótido o polipéptido puede lograrse, por ejemplo, usando un método apropiado que incluye un método de medición de ARNm y un método de medición inmunológica que utilizan la unión a o la interacción con un agente de detección, agente de prueba o agente de diagnóstico (incluida la aplicación como reactivo complementario). Ejemplos de un método de medición de biología molecular incluyen hibridación Northern, transferencia puntual y una técnica de PCR. Ejemplos del método de medición inmunológica incluyen ELISA en donde se usa una placa de microtitulación, RIA, una técnica de anticuerpos fluorescentes, inmunoensayo de luminiscencia (LIA, por sus siglas en inglés), una técnica de precipitación inmunitaria (IP, por sus siglas en inglés), una técnica de inmunodifusión (SRID), inmunoensayo turbidimétrico (TIA, por sus siglas en inglés), transferencia Western y tinción inmunohistológica. Ejemplos del método de cuantificación incluyen ELISA y RIA. La cuantificación también se puede llevar a cabo usando un método de análisis génico en el cual se usa una matriz (p. ej., matriz de ADN o matriz de proteínas). Se da un amplio esquema de la matriz de ADN en un problema adicional deCell Engineering "DNA Microarray and Latest PCR Technique",editado por Shujunsha Co., Ltd. Los detalles de la matriz de proteínas se describen enNat Genet.2002 diciembre; 32 Suppl: 526-532. Ejemplos del método para analizar la expresión génica incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR, una técnica RACE, una técnica SSCP, una técnica de precipitación inmunitaria, un sistema de dos híbridos y una traducciónin-vitroademás de los métodos descritos anteriormente. Dichos métodos de análisis adicionales se describen, por ejemplo, en"Genomics Experiments - Yusuke Nakamura Laboratory Manual',editado por Yusuke Nakamura, Yodosha Co., Ltd. (2002), etc.
[0132] El término "reducción" o "supresión" o sinónimos de los mismos como se usa en la presente memoria para la actividad y productos de expresión (p. ej., proteínas y transcritos (como, por ejemplo, ARN)) se refieren a una reducción de la cantidad, calidad o efecto de una actividad, transcrito o proteína específicos, o actividad para reducir la cantidad, calidad o efecto de una actividad, transcrito o proteína específicos. Si la actividad, los productos de expresión y similares se reducen hasta que son indetectables, es decir, se reducen para que caigan por debajo de los límites de detección, puede usarse particularmente el término "desaparición". En esta memoria descriptiva, "desaparición" está incluida en "reducción" y "supresión".
[0134] El término "marcador", como se usa en la presente memoria, se refiere a una entidad (p. ej., sustancia, energía u onda electromagnética) para distinguir una molécula o sustancia de interés de otras. Ejemplos de dicho método de marcaje incluyen un método RI (radioisótopo), un método de fluorescencia, un método de biotina y un método de quimioluminiscencia. Cuando múltiples marcadores de la presente descripción, o factores o medidas para capturar los marcadores, se marcan mediante el método de fluorescencia, se usan sustancias fluorescentes que difieren entre sí en la longitud de onda máxima de emisión fluorescente. Una diferencia en las longitudes de onda máximas de emisión de fluorescencia es preferiblemente de 10 nm o más. Cuando un ligando está marcado, se puede usar cualquier sustancia fluorescente siempre que no tenga influencia sobre las funciones del ligando, pero una sustancia fluorescente deseable es Alexa (marca comercial) Fluor. Alexa (marca comercial) Fluor es un colorante fluorescente soluble en agua obtenido modificando cumarina, rodamina, fluoresceína, cianina, o similares, y una serie de los mismos corresponde a un amplio intervalo de longitudes de onda de fluorescencia, y es muy estable, produce fluorescencia brillante, y tiene una sensibilidad al pH menor que otros colorantes fluorescentes para longitudes de onda correspondientes. Ejemplos de una combinación de colorantes fluorescentes cuyas longitudes de onda máximas de emisión fluorescente difieren entre sí en 10 nm o más incluyen una combinación de Alexa (marca comercial) 555 y Alexa (marca comercial) 633, y una combinación de Alexa (marca comercial) 488 y Alexa (marca comercial) 555. Cuando un ácido nucleico está marcado, se puede usar cualquier marcador siempre que se pueda unir a la fracción de base del ácido nucleico, pero es preferible usar un colorante de cianina (p. ej., Cy3 y Cy5 de la serie CyDye (marca comercial)), un reactivo de rodamina 6G, 2-acetilaminofluoreno (AAF) y AAIF (derivado de yodo de AAF). Ejemplos de una combinación de sustancias fluorescentes cuyas longitudes de onda máximas de emisión fluorescente difieren entre sí en 10 nm o más incluyen una combinación de Cy5 y el reactivo de rodamina 6G, una combinación de Cy3 y fluoresceína, y una combinación del reactivo de rodamina 6G y fluoresceína. Dicho marcador puede usarse para alterar una diana de interés de manera que un medio de detección pueda usarse para detectar la diana. Tal alteración es conocida en la técnica, y una persona con experiencia en la técnica puede llevar a cabo dicho método según sea apropiado según un marcador y una diana de interés.
[0135] El término"in vivo",como se usa en la presente memoria, se refiere al interior de un organismo vivo. En un contexto específico, la expresión "dentro de un organismo vivo" se refiere a una posición en la cual se va a disponer una sustancia de interés.
[0137] El término"in vitro",como se usa en la presente memoria, se refiere a un estado en el cual una parte de un organismo vivo se extrae o aísla "del organismo vivo" (p ej., en un tubo de ensayo) para diversos fines de investigación. Este término se usa en contraste con el término "in vivo".
[0139] El término"ex vivo",como se usa en la presente memoria, se refiere a una serie de operaciones en un determinado procedimiento cuando se pretende llevar a cabo el procedimiento fuera del cuerpo primero y luego de vuelta dentro del cuerpo. Las células obtenidas del interior de un organismo vivo pueden tratarse con la medicina de la presente descripción y luego se devuelven a un paciente de nuevo.
[0141] El término "kit", como se usa en la presente memoria, se refiere a una unidad cuyas partes (p. ej., un reactivo de prueba, un reactivo de diagnóstico, un reactivo terapéutico, un anticuerpo, un marcador y un manual de operación) que se van a proveer se dividen generalmente en dos o más componentes y se proveen de esa manera. Esta forma de kit es preferible con el fin de proveer una composición que no debe proveerse como una mezcla teniendo en cuenta su estabilidad y similares y se prepara preferiblemente como una mezcla justo antes de su uso. Es ventajoso que dicho kit incluya un manual de instrucciones u operaciones que describa preferiblemente cómo usar las partes (p. ej., un reactivo de ensayo, un reactivo de diagnóstico y un reactivo terapéutico) que van a proveerse, o cómo tratar el reactivo. Cuando el kit se usa como kit de reactivos en esta memoria descriptiva, el kit incluye generalmente una instrucción o similar que describe cómo usar un reactivo de ensayo, un reactivo de diagnóstico, un reactivo terapéutico, un anticuerpo y similares.
[0143] En esta memoria descriptiva, la "instrucción" describe una manera de usar la presente descripción para médicos u otros usuarios. Esta instrucción describe el método de detección de la presente descripción, una manera de usar un reactivo de diagnóstico e instrucciones escritas para administrar un fármaco farmacéutico. Asimismo, la instrucción puede describir instrucciones escritas sobre sitios de administración como, por ejemplo, la administración oral y la administración intraesofágica (por inyección o similares, por ejemplo). Esta instrucción se prepara según la forma prescrita por la autoridad competente (p. ej., el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar en Japón, y la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) en los Estados Unidos) en un país donde se implementa la presente descripción, y establece claramente que la presente descripción está aprobada por la autoridad competente. La instrucción es lo que se denomina un prospecto y se provee generalmente como un medio de impresión, pero no hay limitación a esto. Por ejemplo, la instrucción también puede proveerse en forma de un medio electrónico (p. ej., un sitio web provisto en Internet o un correo electrónico) o similar.
[0145] El término "entrada celular (internalizar/internalización)", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno en el cual una célula toma una sustancia que se une a un antígeno en la superficie de la célula a través de endocitosis o fagocitosis, que están mediadas por la sustancia que se une al antígeno. Una sustancia (p. ej., anticuerpo anti-Glipicano-1) que tiene tal actividad y se une a Glipicano-1 puede transferir un principio activo de interés a una célula que expresa Glipicano-1 sobre la superficie celular, y hacer que el principio activo de interés exhiba un efecto deseado en la célula que expresa Glipicano-1. Ejemplos del principio activo de interés incluyen, pero no se limitan a, un medicamento que tiene actividad citotóxica, un agente anticanceroso, un medio de contraste, un ARNip, un ácido nucleico antisentido y ribozima.
[0147] El término "complejo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier construcción que incluya dos o más fracciones. Por ejemplo, si una fracción es un polipéptido, la otra fracción puede ser un polipéptido u otra sustancia (p. ej., sacárido, lípido, ácido nucleico, otro hidrocarburo y compuesto de bajo peso molecular). En esta memoria descriptiva, las dos o más fracciones incluidas en el complejo pueden estar unidas entre sí a través de enlaces covalentes u otros enlaces (p. ej., enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacción hidrófoba y fuerza de van der Waals). Por consiguiente, en esta memoria descriptiva, el "complejo" abarca moléculas formadas por múltiples tipos de moléculas como, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, un lípido, un sacárido y un compuesto de bajo peso molecular que se unen entre sí.
[0149] El término "ligador", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que acopla al menos dos elementos constituyentes mientras los separa espacialmente. Ejemplos del ligador incluyen, pero no se limitan a, un ligador escindible enzimáticamente, un ligador lábil a ácido y ligador disulfuro. El término "ligador escindible enzimáticamente" se refiere a un ligador que se escinde por una enzima presente dentro de una célula. La expresión "ligador lábil a ácido" se refiere a un ligador que puede escindirse en condiciones ácidas de endosomas o lisosomas dentro de una célula. El término "ligador disulfuro" se refiere a un ligador que puede escindirse en condiciones reducidas dentro de una célula.
[0151] El término "complejo antígeno-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés)", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo que está unido químicamente a uno o más principios activos de interés. Un ADC puede estar unido operativamente a través de un ligador. La expresión "unido operativamente", como se usa en la presente memoria, se refiere a un estado en el cual los elementos constituyentes están unidos entre sí de manera que cada uno de ellos puede mostrar sus funciones. Ejemplos del principio activo de interés que se puede incluir en el ADC incluyen, pero no se limitan a, un medicamento que tiene actividad citotóxica, un agente anticanceroso, un medio de contraste, un ARNip, un ácido nucleico antisentido y ribozima. Se puede usar un ligador escindible o un ligador no escindible como el ligador. Ejemplos del ligador escindible incluyen, pero no se limitan a, un ligador que tiene una secuencia que se escinde por una proteasa, un ligador lábil a ácido y un ligador disulfuro. Un ejemplo del ligador no escindible es un ligador de MCC, pero no hay limitación a esto.
[0153] El término "actividad citotóxica", como se usa en la presente memoria, se refiere a la actividad para provocar la muerte celular a través del bloqueo directo o indirecto de las funciones celulares causado no solo por un cambio patológico provocado a una célula y una lesión externa directa a una célula, sino también daño a cualquier estructura celular y función celular de una célula como, por ejemplo, escisión de ADN, formación de un dímero de base, escisión de un cromosoma, daño al sistema de división celular y disminuciones en diversas actividades enzimáticas. Por consiguiente, ejemplos del "medicamento que tiene actividad citotóxica" incluyen, pero no se limitan a, un agente alquilante, un inhibidor del factor de necrosis tumoral, un intercalador, un inhibidor de microtúbulos, un inhibidor de quinasa, un inhibidor de proteasoma y un inhibidor de topoisomerasa.
[0155] La expresión "concentración inhibidora del 50 % (CI<50>)", como se usa en la presente memoria, se refiere a una concentración de un compuesto requerida para matar el 50 % de las células. En esta memoria descriptiva, IC<50>se mide usando un método descrito en el Ejemplo 7.
[0157] El término "afinidad", como se usa en la presente memoria, se refiere a una constante de equilibrio de un enlace reversible entre dos sustancias (p. ej., un anticuerpo y un antígeno), y se expresa como una constante de disociación de equilibrio (valor K<d>). La constante de disociación de equilibrio se puede medir a través de una técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) usando, por ejemplo, Biacore (marca comercial registrada). Además, también se pueden usar MP-SPR Navi (marca comercial) (BioNavis), OpenPlex (Horiba) y Smart SPR (RIBM) para medir la constante de disociación de equilibrio. Los valores K<d>mostrados en la presente descripción se miden a través de la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) a menos que se especifique lo contrario.
[0159] Anticuerpo
[0161] La presente descripción provee un anticuerpo anti-GPC-1 humanizado basado en un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 5 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 6, o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo anti-GPC-1 humanizado. Los inventores de la presente invención humanizaron un anticuerpo monoclonal de ratón anti-GPC-1 01a033 (que incluye una región variable de cadena pesada representada por la ID de SEC n.°: 5 y una región variable de cadena ligera representada por la ID de SEC n.°: 6) que tiene alta afinidad por GPC-1, que se describe en el documento WO 2018/199318 y, por lo tanto, sorprendentemente, logró obtener un anticuerpo humanizado que tenía una afinidad mayor que la de 01a033. Por consiguiente, el anticuerpo humanizado de la presente descripción tiene una afinidad más alta por GPC-1 que la de un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 5 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 6.
[0163] El anticuerpo de la presente invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 7.
[0165] El anticuerpo de la presente invención o el fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos expuestas en las ID de SEC n.°: 8, 10, 11, 12, 14, 16 y 17.
[0167] El anticuerpo de la presente descripción puede ser de cualquier clase, y puede ser, por ejemplo, IgM, IgD, IgG, IgA, IgE o IgY. El anticuerpo puede ser IgG. El anticuerpo puede ser de una subclase seleccionada del grupo que consiste en IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana, y es preferiblemente IgG4 humana.
[0168] Se sabe que se produce una reacción de intercambio de cadena H de IgG4 humana (intercambio de brazo Fab) entre una IgG4 humana y otra IgG4 humana (https://www.nature.com/articles/nrneph.2015.95/figures/2). Para evitar esta reacción, se puede introducir la mutación S228P (JBiol Chem.2015 feb 27; 290(9): 5462-9). Por ejemplo, en OPDIVOR (nivolumab) y KEYTRUDAR (pembrolizumab), se introduce la mutación S228P, y en dupilumab, el residuo de aminoácido en la posición 233 de la cadena H se sustituye con Pro. En las clases distintas de IgG4 humana, no se produce el intercambio de brazo Fab y, por tanto, no es necesario introducir la mutación de aminoácidos.
[0170] El anticuerpo puede incluir una región constante de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 91, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 90 % de identidad, al menos aproximadamente 95 % de identidad, al menos aproximadamente 96 % de identidad, al menos aproximadamente 97 % de identidad, al menos aproximadamente 98 % de identidad, o al menos aproximadamente 99 % de identidad con la misma. El anticuerpo puede incluir una región constante de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 92, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 90 % de identidad, al menos aproximadamente 95 % de identidad, al menos aproximadamente 96 % de identidad, al menos aproximadamente 97 % de identidad, al menos aproximadamente 98 % de identidad, o al menos aproximadamente 99 % de identidad con la misma.
[0172] Las CDR 1 a 3 de la región variable de cadena pesada tienen secuencias de aminoácidos expuestas en las ID de SEC n.°: 28 a 30, respectivamente.
[0174] Las CDR 1 a 3 de la región variable de cadena ligera pueden tener secuencias de aminoácidos expuestas en las ID de SEC n.°: 31 a 33, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 37 a 39, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 40 a 42, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 43 a 45, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 49 a 51, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 55 a 57, respectivamente, o las ID de SEC n.°: 58 a 60, respectivamente.
[0176] El epítopo del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo incluye las posiciones 339 a 358 y/o 388 a 421 de ID de SEC n.°: 2 (secuencia de longitud completa de GPC-1 humano).
[0178] El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse a Glipicano-1 con afinidad (valor K<d>) de<aproximadamente 5x10>-9<M, aproximadamente 6x10>-9<M, aproximadamente 7x10>-9<M, aproximadamente 8x10>-9<M, aproximadamente 9x10>-9<M, o aproximadamente 10>-8<M o menos. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede unirse a Glipicano-1 con afinidad (valor Kd) de aproximadamente 1,02x10>-8<M.>
[0180] La presente descripción provee una composición farmacéutica para transferir un principio activo a una célula, incluyendo la composición el anticuerpo humanizado de la presente descripción o el fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo de la presente descripción tiene inesperadamente una actividad de entrada celular (internalización) mayor que o igual a la de 01 a033.
[0182] Complejo
[0184] La presente descripción también provee un complejo del anticuerpo humanizado de la presente descripción o el fragmento de unión a antígeno del mismo y un medicamento que tiene actividad citotóxica. El medicamento que tiene actividad citotóxica puede estar unido operativamente al anticuerpo humanizado o al fragmento de unión a antígeno del mismo a través de un ligador.
[0186] Ejemplos del medicamento que tiene actividad citotóxica incluyen, pero no se limitan a, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), DM1, DM4, caliqueamicina, duocarmicina, pirrolobenzodiazepina (PBD) e inhibidores de topoisomerasa. El medicamento que tiene actividad citotóxica tiene preferiblemente un efecto espectador, que no pretende ser limitante. El "efecto espectador" se refiere a un fenómeno en el cual un medicamento liberado dentro de una célula cancerosa pasa a través de la membrana celular y también tiene un efecto sobre las células cancerosas circundantes. Por consiguiente, el medicamento que tiene actividad citotóxica puede tener permeabilidad celular. Ejemplos de la medicina que tiene actividad citotóxica y un efecto espectador incluyen, pero no se limitan a, MMAE, p Bd , eribulina, SN-38, Dxd y DM4.
[0188] Puede ser suficiente que el ligador se escinda en una célula cancerosa, y ejemplos de ello incluyen un ligador escindible enzimáticamente, un ligador lábil a ácido y un ligador disulfuro. El ligador puede ser un ligador escindible que se escinde por catepsina (p. ej., catepsina B) como, por ejemplo, maleimidacaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo.
[0190] El complejo puede mostrar un CI<50>de aproximadamente 0,04 nM o menos, aproximadamente 0,05 nM o menos, aproximadamente 0,06 nM o menos, aproximadamente 0,07 nM o menos, aproximadamente 0,08 nM o menos, aproximadamente 0,09 nM o menos, aproximadamente 0,1 nM o menos, aproximadamente 0,11 nM o menos, aproximadamente 0,12 nM o menos, aproximadamente 0,13 nM o menos, aproximadamente 0,14 nM o menos, o aproximadamente 0,15 nM o menos en una célula positiva para glipicano-1. CI<50>puede ser un valor medido a través del ensayo ADC del Ejemplo 2. En realizaciones preferidas, el complejo puede mostrar un CI<50>de aproximadamente 0,1 nM o menos en una célula positiva a Glipicano-1.
[0191] El ligador usado en el complejo puede ser un ligador lábil a ácido. Dado que se utiliza una condición de pH ácido dentro de un endosoma o lisosoma después de la transferencia a una célula, se puede usar un ligador sensible al pH que es lábil en condiciones ácidas. Un ejemplo de dicho ligador es hidrazona.
[0193] El ligador usado en el complejo puede ser un ligador disulfuro, y los ejemplos de dicho ligador incluyen 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB) y 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP).
[0195] El ligador usado en el complejo puede ser un ligador no escindible. Un ejemplo del ligador no escindible es ácido maleimidometilciclohexano-1-carboxílico (ligador de MCC), pero no hay limitación a esto.
[0197] Composición farmacéutica
[0199] La presente descripción también provee una composición para su uso en un método para prevenir o tratar cáncer positivo a Glipicano-1, incluyendo la composición el complejo de la presente descripción. El cáncer positivo para glipicano-1 puede seleccionarse de cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de conducto biliar, cáncer de cuello uterino, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, leiomiosarcoma uterino, cáncer de próstata, cáncer de células escamosas orales, y cualquier combinación de los mismos. El cáncer positivo a Glipicano-1 puede ser cáncer de esófago o cáncer de páncreas.
[0201] Composición para tratar el cáncer metastásico
[0203] La presente descripción también provee una composición para su uso en un método para prevenir o tratar el cáncer metastásico de cáncer positivo a glipicano-1, incluyendo la composición el complejo de la presente descripción. Los inventores de la presente invención encontraron que el cáncer metastásico de cáncer positivo a Glipicano-1 expresa Glipicano-1, y el complejo de la presente descripción puede usarse para tratar cáncer metastásico de cáncer positivo a Glipicano-1. El mismo antígeno que un antígeno expresado en un sitio de cáncer primario no siempre se expresa en un cáncer metastásico. Por lo tanto, es necesario confirmar si un antígeno de cáncer que se ha demostrado que se expresa en el sitio de cáncer primario se expresa o no en cáncer metastásico. Se ha demostrado que GPC1 se expresa en un tejido tumoral metastásico como, por ejemplo, metástasis de ganglios linfáticos de cáncer de páncreas, metástasis hepática de cáncer de páncreas y metástasis de ganglios linfáticos de cáncer de esófago, y que GPC1 es eficaz como diana de tratamiento.
[0205] En algunas realizaciones, el cáncer positivo para glipicano-1 puede seleccionarse de cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer del conducto biliar, cáncer de cuello uterino, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, leiomiosarcoma uterino, cáncer de próstata, cáncer de células escamosas orales y cualquier combinación de los mismos. El cáncer positivo a Glipicano-1 puede ser cáncer de páncreas.
[0207] El cáncer metastásico puede ser cáncer metastásico que ha metastatizado al hígado, esófago, conducto biliar, cuello uterino, pulmón, región de cabeza y cuello, mama, músculo liso uterino, próstata, epitelio escamoso oral, cerebro, hueso, peritoneo o suprarrenal.
[0209] El cáncer puede incluir fibroblastos asociados al cáncer (CAF).
[0211] El complejo de la presente descripción puede administrarse junto con un inhibidor del punto de control inmunitario. Ejemplos del inhibidor del punto de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-VISTA.
[0213] Producción de variante
[0215] Una persona con experiencia en la técnica puede producir una variante que tiene afinidad por GPC-1 superior o igual a la de 01a033 o el anticuerpo de la presente descripción basándose en la secuencia del anticuerpo de la presente descripción según un método conocido en la técnica. Por ejemplo, una persona con experiencia en la técnica puede analizar anticuerpos cuyas CDR tienen secuencias ligeramente diferentes usando una técnica de presentación en fagos y seleccionar anticuerpos que tienen una afinidad mayor que o igual a la de un anticuerpo de interés. Otros ejemplos del método para producir una variante incluyen un método de recorrido de CDR y un método de mutagénesis aleatoria. La variante puede producirse llevando a cabo la sustitución, deleción y/o adición de tres o menos aminoácidos, preferiblemente sustitución, deleción y/o adición de dos o menos aminoácidos, y más preferiblemente sustitución, deleción y/o adición de uno o menos aminoácidos, en las CDR del anticuerpo de la presente descripción o el fragmento de unión a antígeno del mismo. La afinidad de estas variantes por GPC-1 puede ser mayor que o igual a la de 01a033 o el anticuerpo de la presente descripción.
[0217] En esta memoria descriptiva, el término "o" se usa cuando se puede emplear "al menos uno" de los elementos enumerados en el texto. Lo mismo se aplica a todos los casos en los que se usa "o". En esta memoria descriptiva, cuando se indica claramente la expresión "dentro de un intervalo entre dos valores", este intervalo también incluye estos dos valores.
[0218] En lo sucesivo, la presente descripción se describirá con referencia a los ejemplos. Sin embargo, las descripciones anteriores y los ejemplos siguientes se proveen solo a modo de ejemplo, y no se proveen para limitar la presente invención. Por consiguiente, el alcance de la presente invención no está limitado por la descripción y los ejemplos que se describen específicamente en la presente memoria, y está limitado solo por las reivindicaciones anexas.
[0219] Ejemplos
[0220] En lo sucesivo en la presente memoria, se describirán ejemplos. Cuando fue necesario, los animales utilizados en los ejemplos siguientes fueron tratados según la Declaración de Helsinki cumpliendo al mismo tiempo con las normas definidas por el Instituto Nacional de Innovación Biomédica. Con respecto a los reactivos, se usaron los productos que se describen específicamente en los ejemplos, pero en su lugar se pueden usar equivalentes disponibles de otros fabricantes (p. ej., Sigma-Aldrich, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Nacalai Tesque Inc., R&D Systems, y USCN Life Science Inc).
[0221] Los objetos de los ejemplos son los siguientes: el anticuerpo monoclonal anti-GPC1 (clon 01a033) descubierto como un anticuerpo que tiene alta actividad de internalización celular está humanizado, actividad de internalización celular superior a la anterior a la humanización se criba, GPC1-ADC humanizado se produce uniendo un agente anticanceroso al anticuerpo monoclonal anti-GPC1 humanizado a través de un ligador, y el efecto antitumoral del GPC1-ADC humanizado se demuestrain vitroein vivo.Además, la carga útil de MMAE tiene la propiedad de inducir la muerte celular inmunogénica y, por lo tanto, otro objeto es confirmar que el uso del GPC1-ADC humanizado y un inhibidor del punto de control inmunitario proveen, juntos, un efecto antitumoral sinérgico. Ejemplo de producción: producción de anticuerpo humanizado
[0222] La producción del anticuerpo humanizado de la presente descripción fue ordenada por HD Biosciences (China) Co., Ltd.
[0223] En resumen, la humanización se llevó a cabo simplemente mediante la construcción de una biblioteca, paneo y cribado de antígenos, ELISA de unión y determinación de la afinidad. Se construyó una biblioteca de Vkhumana usando CDR de anticuerpos de ratón y cadenas pesadas fijadas de marcos humanos, y después se llevaron a cabo el paneo y cribado de antígenos. Se encontraron treinta anticuerpos anti-glipicano-1 humanizados en total a través de la selección de la biblioteca Vk, y se comprobaron a través de ELISA de fagos. Se seleccionaron veinte anticuerpos de los mismos para la expresión y purificación de anticuerpos, y después se determinó la afinidad usando Biacore (marca comercial registrada) 8K.
[0224] Materiales y métodos
[0225] Construcción de la biblioteca de anticuerpos
[0226] Producción de la región VH de la cadena H humanizada a través del injerto de CDR del anticuerpo de ratón (01 a033)
[0227] Se buscaron alelos que tenían alta homología con la VH de 01a033 usando la base de datos abYsis, y se seleccionó el marco de la secuencia de la línea de células germinales humanas VH1-46 para producir un gen correspondiente a una secuencia de aminoácidos obtenida injertando la secuencia de CDR de la VH de 01 a033. En cuanto a la región VL, se usó la biblioteca del conjunto de genes de VL humanos (Biblioteca LC: diversidad de biblioteca 4,53x105/Tamaño de biblioteca 1,06x1013). Un gen de la biblioteca de VL, el gen de Ck, el gen de VH humanizado descrito anteriormente y CH1 se insertaron en este orden en el lado del terminal N de un antígeno de fago GIII.
[0228] Se produjo una biblioteca de fagos constituida por cadenas L humanas aleatorias (k) y la cadena H humanizada (VH+CH1) que tiene la secuencia CDR de 01 a033 (biblioteca de anticuerpos humanizados).
[0229] Paneo
[0230] El paneo se llevó a cabo para seleccionar fagos que expresan un anticuerpo que realmente se une a GPC-1, de la biblioteca de anticuerpos humanizados.
[0231] El antígeno GPC-1 se unió a una fase sólida (tubo de ensayo, partículas), y se añadió a la misma una población de fagos. Después, la fase sólida se lavó y se recogieron los fagos unidos.
[0232] Aislamiento del clon de fago mediante elevación del filtro y verificación de la capacidad de unión a antígeno Se permitió que los fagos que se unieron al antígeno durante el paneo y después se eluyeron se infectaran con E. coli sembrada en una placa. Después, las placas generadas se transfirieron a un filtro y los fagos se clonaron.
[0233] Los clones de fago obtenidos se amplificaron, y se comprobó la capacidad de unión de cada clon en ELISA (se inmovilizó el antígeno GPC-1 humano). Se seleccionaron clones que proporcionaron una señal de unión mayor que o igual a un cierto valor.
[0234] Expresión y purificación de IgG derivada del clon de anticuerpo
[0235] Los anticuerpos en forma de IgG derivados de los genes de los veinte clones de fagos seleccionados se expresaron en células HEK293 (vector: pFUSE2ss-CLIg-hkpFUSE2ss-CLIg-hk (cadena ligera, Invivogen, catálogo n.°: pfuse2ss-hclk) y pFUSEss-CHIg-hG1 (cadena pesada, Invivogen, catálogo n.°: pfuses-hchgl); línea celular: FreeStyle (marca comercial) células 293F (Invitrogen, catálogo n.°: R790-07)). El día 4 después de la transfección, los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo, y se sometieron a cuantificación y análisis de SDS-PAGE. Todos los veinte clones se sometieron a análisis sobre la producción de anticuerpos (presencia de la cadena H y la cadena L, y pesos moleculares de las mismas).
[0236] Medición de la afinidad de unión a antígeno de clones a través de la técnica de resonancia de plasmón superficial La afinidad de unión a antígeno de cada uno de los veinte anticuerpos de clones obtenidos se midió a través de la técnica de resonancia de plasmón superficial (Biacore (marca comercial registrada) 8K). Se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG humana en un chip, y se hizo fluir cada anticuerpo sobre el mismo y se dejó que se uniera al mismo. Después del lavado, se hizo fluir el antígeno GPC-1 humano sobre el mismo, y se midieron la constante de unión (Ka) y la constante de disociación (Kd). Siete clones tenían una afinidad mayor que la del anticuerpo de ratón.
[0237] Medición de la afinidad de unión a antígeno del anticuerpo de ratón (01 a033) a través de la técnica de resonancia de plasmón superficial
[0238] La afinidad de unión del anticuerpo de ratón a GPC-1 humano se midió a través de la técnica de resonancia de plasmón superficial (Biacore (marca comercial registrada) 8K). Se inmovilizó un anticuerpo anti-Fc de ratón en un chip, y se hizo fluir el anticuerpo de ratón (01 a033) sobre el mismo y se dejó que se uniera al mismo. Después del lavado, se hizo fluir sobre el mismo el GPC-1 humano, y se midieron la constante de unión (Ka) y la constante de disociación (Kd).
[0239] Producción de anticuerpo quimérico anti-GPC-1 de ratón
[0240] Se produjo un gen quimérico de anticuerpo humano uniendo el gen VH/VL de 01 a033 al gen Ck/CH humano. Este gen quimérico se expresó en células HEK293F.
[0241] Ejemplo 1: análisis de la afinidad de anticuerpos monoclonales anti-GPC1 humanizados
[0242] Materiales y métodos
[0243] El anticuerpo monoclonal anti-GPC1 humano de ratón se humanizó (subclase: IgG4), y se prepararon los veinte clones obtenidos (T1, T2, T3, T7, T8, T10, T11, T22, T26, T28, T29, T31, T32, T33, T34, T36, T43, T56, T57, T59). Se inmovilizó una IgG antihumana (Fc) en un chip sensor de sCM5 (GE Healthcare) usando el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare), y se midió la afinidad de cada uno de estos clones por una proteína GPC1 humana recombinante (R&D Systems) usando Biacore (marca comercial registrada) 8K (GE Healthcare).
[0244] Resultados
[0245] El anticuerpo monoclonal anti-Glipicano-1 (GPC-1) (01a033) se humanizó independientemente y, como resultado, se obtuvieron veinte clones candidatos. La constante de disociación de equilibrio (K<d>) de cada uno de estos veinte clones se midió usando Biacore (marca comercial registrada) (FIG. 1). Como resultado, se encontró que siete clones (clones T1, T2, T3, T8, T10, T36, T56) tenían una afinidad mayor que la del anticuerpo quimérico de ratón (01a033), que todavía no se sometió a humanización (FIG. 1).
[0246] Ejemplo 2: ensayo ADC usando anticuerpo anti-GPC-1 humanizado y anticuerpo secundario unido a MMAF en combinación
[0247] Materiales y métodos
[0248] Verificación de la sensibilidad de la célula TE14 al agente anticanceroso
[0249] Se añadieron 80 gl de una solución que contenía 2.000 células TE14 a una placa de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. Al día siguiente, se añadieron 10 gl de una solución que contenía cada clon de anticuerpo anti-GPC1 humanizado a una concentración de 10 veces tan alta como la concentración final del mismo por pocillo como un anticuerpo primario. Posteriormente, 10 gl de una solución que contenía un anticuerpo anti-IgG humana (Fab) al que se unió un agente anticanceroso (MMAF) a través de un ligador (MORADEC, catálogo n.° AH-202AF-50) se añadieron por pocillo como anticuerpo secundario hasta un volumen final de 100 pl. Las células se cultivaron durante 6 días en una incubadora a 37 °C y CO2 al 5 %, y la viabilidad celular se midió detectando la cantidad de ATP usando un reactivo de ensayo de viabilidad celular luminiscente Cell Titer-Glo. Se usó RPMI1640 complementado con FBS al 10 % y PS al 1 % como medio de cultivo.
[0250] ADC usado en el ensayo
[0252] La FIG. 2 muestra un diagrama esquemático que ilustra un ADC utilizado en el ensayo. Los clones que tenían una alta actividad de internalización celular se cribaron a partir de los veinte clones según el método mostrado en la FIG. 2. En este procedimiento, se usó un sistema de ensayo en el cual el anticuerpo anti-GPC1 humanizado derivado del clon obtenido en el Ejemplo de producción anterior se añadió como anticuerpo primario a la línea celular TE14, que es una línea celular de cáncer de esófago que expresa GPC1, se añadió un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con agente anticanceroso (MMAF) como anticuerpo secundario al mismo, y por tanto las células cancerosas tomaron el agente anticanceroso como un complejo del anticuerpo primario y el anticuerpo secundario, induciendo de este modo la muerte celular debido a los efectos del agente anticanceroso.
[0254] Resultados
[0256] Se encontró que diez clones (clones T2, T7, T8, T1, T36, T57, T10, T34, T56, T3) tenían una actividad de internalización celular mayor que la del anticuerpo quimérico de ratón (01 a033) (FIG. 3).
[0258] Ejemplo 3: análisis de afinidad por antígeno usando FACS
[0260] Dado que se encontró a partir de los resultados del Ejemplo 2 que el clon T2 tenía la actividad más alta, el clon T2 se seleccionó como un anticuerpo anti-GPC1 humanizado que tenía una alta actividad de internalización celular, y se sometió a análisis.
[0262] Materiales y métodos
[0264] En el análisis FACS usando el anticuerpo, se usaron células de la línea celular de cáncer de esófago humano (TE8) como células positivas para GPC1, y se usaron células TE8-GPC1 KO en las cuales GPC1 se inactivó usando una técnica CRISPR-Cas9 como células negativas para GPC1. La medición se llevó a cabo con FACS CantoII (BD) usando el anticuerpo anti-GPC1 quimérico humano/ratón (clon 01a033) y el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) como anticuerpos primarios y anti-IgG humana-FITC marcado con FITC (Jackson Immuno Research, catálogo n.° 109-095-098) como anticuerpo secundario, y los datos de medición se analizaron usando el software BD FACS Diva (BD).
[0266] Materiales y métodos
[0268] La medición se llevó a cabo con FACS CantoII (BD) usando el anticuerpo anti-GPC1 quimérico humano/ratón (clon 01a033) y el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) como anticuerpos primarios a diversas concentraciones y anti-IgG humana-FITC marcado con FITC (Jackson Immuno Research, catálogo n.° 109-095-098) como anticuerpo secundario, y los datos de medición se analizaron usando el software BD FACS Diva (BD).
[0270] Resultados
[0272] Como resultado de llevar a cabo, en el TE8, que es la línea celular de cáncer de esófago positivo para GPC1, y las células TE8-GPC1-KO en las cuales GPC1 se inactivó usando el sistema CRISPR/Cas9, el análisis FACS usando el anticuerpo de ratón quimérico (01a033) y el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2), el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2) no tenía reactividad con las células TE8-GPC1-KO, pero tenía reactividad con solo las células TE8, y se encontró así que el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2) tenía capacidad de unión específica para GPC1 (FIG. 4). Con respecto a la reactividad con GPC1 también sobre la superficie de la célula TE8, se reveló que el anticuerpo humanizado anti-GPC1 (T2) tenía una afinidad mayor que la del anticuerpo quimérico de ratón (01 a033) (Fig. 4).
[0274] Ejemplo 4: producción de ADC
[0276] En este ejemplo, se produjo un ADC como sigue.
[0278] El anticuerpo anti-GPC1 humanizado con mAb (clon T2) se conjugó con maleimidacaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo-monometil auristatina E (MC-vc-PAB-MMAE). El conjugado se formó usando un método basado en maleimida-cisteína en donde los enlaces disulfuro entre las cadenas del mAb se reducen usando TCEP a 37 °C primero, y después la fracción de maleimida del fármaco se une a la cisteína reducida. El ADC se desaló usando Amicon Ultra - filtros centrífugos de 0,5 mL - 30K (Millipore) y se eliminaron las toxinas sin reaccionar. Después, el tampón se intercambió con un tampón de formulación de ADC (histidina 20 mM, sacarosa al 7 %, PS80 al 0,02 % (p/v), pH 5,5). La distribución de la relación fármaco-anticuerpo (DAR) se analizó mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés) y el grado de coagulación se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). Las condiciones de conjugación se establecieron de manera que la relación fármaco-anticuerpo (DAR) fuera 4.
[0280] Resultados
[0282] La FIG. 5 muestra un diagrama esquemático que ilustra la estructura de un ADC a modo de ejemplo. Como se muestra en la FIG. 5, MMAE, que es una carga útil que tiene un efecto espectador, se conjugó con un residuo de cisteína del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) a través de un ligador escindible que puede escindirse por catepsina B. El GPC1 -ADC humanizado tenía una DAR de 4,0 (FIG. 6).
[0284] Ejemplo 5: análisis de afinidad de antígeno con FACS usando GPC1-ADC humanizado y anticuerpo no marcado
[0285] Materiales y métodos
[0287] En el análisis FACS que usa el anticuerpo, se usaron células de la línea celular de cáncer de páncreas humano (BxPC-3) como células positivas para GPC1. La medición se llevó a cabo con FACS CantoII (BD) usando el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y el GPC1-ADC humanizado (MMAE) como anticuerpos primarios a diversas concentraciones y anti-IgG humana-FITC marcado con FITC (Jackson Immuno Research, catálogo n.° 109-095-098) como anticuerpo secundario, y los datos de medición se analizaron usando el software BD FACS Diva (BD).
[0289] Resultados
[0291] La influencia de la conjugación de una carga útil con el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2) sobre la afinidad antigénica se evaluó analizando la capacidad de unión dependiente de la concentración de anticuerpo con FACS usando células BxPC3 positivas para la expresión de GPC1. Como resultado, el valor K<d>del anti-GPC1-ADC humanizado fue el mismo que el del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2), y se encontró por tanto que la conjugación de la carga útil no redujo significativamente la afinidad por el antígeno (FIG. 7).
[0293] Ejemplo 6: ensayo de internalización celular del anticuerpo anti-GPC-1 humanizado (clon T2) y GPC1-ADC humanizado (MMAE)
[0295] En este ejemplo, la actividad de internalización (entrada celular) del GPC1 -ADC humanizado (MMAE) se investigó con un FACS usando la línea celular BxPC-3 positiva para GPC1.
[0297] Materiales y métodos
[0299] Las células tratadas con el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y el GPC1-ADC humanizado (MMAE) se detectaron usando un mAB anti-GPC1 (02b006 marcado con biotina) y una estreptavidina marcada con PE.
[0300] La línea celular BxPC-3 se retiró de una placa de 10 cm usando EDTA al 0,02 % y se recogió. Las células se suspendieron en RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina de manera que 0,9 ml de la suspensión que contenía células de 2,0x106 se obtuvo en un tubo de 1,5 ml. La suspensión se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora para reducir la actividad de internalización. Una solución de 1 mg/ml del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y una solución de 1 mg/ml del GPC1-ADC humanizado (MMAE) se diluyeron usando RPMI 1640 enfriado con hielo complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina hasta una concentración final de 24 pg/ml (160 nM). Se añadieron 100 pl de cada solución de anticuerpo a la suspensión celular y se suspendieron y se dejaron reposar en hielo durante 30 minutos para teñir el antígeno en la superficie celular. Después de 30 minutos, la suspensión celular se dispensó en seis alícuotas de 100 pl. La suspensión celular se dividió en un grupo de incubación a 4 °C y un grupo de incubación a 37 °C y, por lo tanto, se prepararon 12 alícuotas en total. El tiempo de incubación se estableció en 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h y 6 h. Después del final del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1.500 rpm a 4 °C durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. Las células se lavaron usando 100 pl de PBS enfriado con hielo complementado con BSA al 0,2 %, después se centrifugaron y después se lavaron. La operación de lavado se llevó a cabo 3 veces en total. 50 pL de una solución de 1 pg/ml de un anticuerpo 02b006 anti-GPC1 marcado con biotina (WO 2018/199318) se añadió y se suspendió. El antígeno sobre la superficie celular se tiñó durante 30 minutos sobre hielo (se tiñó GPC1 que no se había internalizado). Después del final del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1.500 rpm a 4 °C durante 5 minutos, y se retiró el sobrenadante. Las células se lavaron usando 100 pl de PBS enfriado con hielo complementado con BSA al 0,2 %, después se centrifugaron y después se lavaron. La operación de lavado se llevó a cabo 3 veces en total. Se diluyó estreptavidina-PE (PharMingen, #554061) 200 veces usando PBS enfriado con hielo suplementado con BSA al 0,2 %, y se añadieron 50 pL de la solución diluida a las células y se suspendieron. La reacción se dejó progresar sobre hielo durante 30 minutos en un lugar oscuro. Después del final del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1.500 rpm a 4 °C durante 5 minutos, y se retiró el sobrenadante. Las células se lavaron usando 100 |jl de PBS enfriado con hielo complementado con BSA al 0,2 %, después se centrifugaron y después se lavaron. La operación de lavado se llevó a cabo 3 veces en total. Se añadieron 150 jL de PBS enfriado con hielo suplementado con BSA al 0,2 %. A continuación, la medición se llevó a cabo con FACS CantoII, y el análisis se llevó a cabo usando el software BD FACS Diva (BD).
[0302] Además, cuando el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y el GPC1-ADC humanizado (MMAE) se internalizaron usando la línea celular BxPC-3 positiva para GPC1, la localización del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y el GPC1 -ADC humanizado (MMAE) dentro de la célula se investigó usando un microscopio de fluorescencia.
[0304] Se sembraron células BxPC-3 de 7,5x104 (1 ml/pocillo) por pocillo de una placa de 12 pocillos (Corning: 3513) en donde se colocó un vidrio de microcubierta de 18 mm (Matsunami), y las células se cultivaron durante la noche en una incubadora a 37 °C y CO2 al 5 %.
[0306] Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo, se añadieron al pocillo 1,0 ml de RPMI1640 enfriado con hielo complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina, y las células se incubaron a 4 °C durante 1 hora para reducir la actividad de internalización de las células.
[0308] Posteriormente, se retiró el medio de cultivo en el pocillo, se añadieron 500 j l de una solución de 10 jg/m l de los anticuerpos primarios (solución enfriada con hielo del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) y el GPC1 -ADC humanizado (MMAE)) por pocillo, y las células se incubaron a 4 °C durante 15 minutos.
[0310] Después de 15 minutos, la solución de anticuerpo se aspiró, se añadieron 1,0 ml de RPMI1640 enfriado con hielo complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina, y las células se lavaron. La muestra en este momento se recogió como una muestra de 0 horas (0 h).
[0311] En cuanto a la muestra que se iba a internalizar, se aspiró la disolución, se añadieron 1,0 ml de RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, 100 U/ml de penicilina, y 100 jg/m l de estreptomicina (calentada a 37 °C), y se cultivaron las células durante 4 horas en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. La muestra en este momento se recogió como una muestra de 4 horas (4 h).
[0313] En cuanto a las muestras en los puntos de tiempo después de 0 horas y 4 horas, se retiró el medio de cultivo dentro del pocillo, y las células se lavaron usando 1 ml de PBS enfriado con hielo.
[0315] A continuación, se añadió 1 ml de metanol al 100 % (enfriado con hielo), las células se incubaron a -20 °C durante 15 minutos y, por lo tanto, se fijaron. Después de fijarlas, las células se lavaron tres veces usando 1 ml de PBS. Después, se añadió 1 ml de BSA al 1 %, Triton X-100 al 0,3 %/PBS(-), y se llevó a cabo el tratamiento de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del tratamiento de bloqueo, se retiró la solución, se añadieron 0,5 ml de solución de un anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal anti-CD107a (CST, Catálogo n.° #9091, LAMP1(D2D11)XP (marca registrada) mAb de conejo)) diluido 100 veces usando b Sa al 1 %, Triton X-100 al 0,3 %/PBS(-) por pocillo, y después se dejó que la reacción progresara a 4 °C durante la noche en un lugar oscuro.
[0316] Después de que la reacción del anticuerpo primario se llevara a cabo durante la noche, las células se lavaron tres veces usando 1 ml de PBS.
[0318] A continuación, 0,5 ml de una solución de un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG(H+L)-Alexa Fluor 488 humano adsorbido de forma cruzada (Life Technology, A-11013, Lot. 2110842) diluido 200 veces usando Triton X-100 al 0,3 %/PBS(-) complementado con BSA al 1 % y 0,5 ml de una disolución de una IgG anti-conejo de burro-Alexa 647 (Life Technology, A31573, Lot. 1626613) diluido 200 veces se añadieron por pocillo, y se dejó que la reacción progresara a temperatura ambiente durante 1 hora en un lugar oscuro.
[0320] Después de la reacción del anticuerpo secundario, las células se lavaron tres veces usando 1 ml de PBS, se retiró el vidrio de cubierta al que se adhirieron las células y se montó en Vectashield (Vectashield H1200) en un portaobjetos de vidrio. Después, las células se observaron con un microscopio de fluorescencia todo en uno (KEYENCE, BZ-X800).
[0322] Resultados
[0324] Se evaluó la actividad de internalización celular. Se encontró a partir de los resultados del análisis de FACS usando las células BxPC3 que, en ambos casos de adición del anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2) a las células BxPC3 y adición del anti-GPC1-ADC humanizado a las mismas, del 60 % al 70 % o más de GPC1 se internalizó rápidamente en las células en el plazo de 2 horas tras la adición de los mismos (FIG. 8). Para hacer que este ADC muestre un efecto antitumoral, la fracción de ligador del ADC necesita escindirse por la enzima catepsina B en el lisosoma. Por lo tanto, la localización intracelular se evaluó determinando las localizaciones de un marcador lisosomal CD107a y la GPC1 mediante tinción doble de fluorescencia. Como resultado, tanto el anticuerpo antiGPC1 humanizado (T2) como el anti-GPCI-ADC humanizado se co-localizaron con el CD107a, y se encontró así que el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (T2) y el anti-GPC1-ADC humanizado se unían a GPC1 y después se movían a un lisosoma (FIG. 8).
[0325] Ejemplo 7: ensayo de ADCin-vitrousando GPC1-ADC humanizado (MMAE)
[0326] Materiales y métodos
[0327] Se llevó a cabo un análisis de expresión de GPC1 usando un FACS.
[0328] Para analizar la expresión de GPC1, se llevó a cabo un análisis FACS en los siguientes tipos de células: células de líneas celulares de cáncer de esófago (TE8, TE14); células de líneas celulares de cáncer de páncreas (BxPC3, KP-2, PK-8); TE8-GPC1 KO, células TE14-GPC1 KO y células BxPC3-GPC1 KO en donde GPC1 se inactivó usando una técnica de CRISPR-Cas9; células de una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa); células de líneas celulares tumorales de cabeza y cuello (Detroit562, FaDu); y células de líneas celulares de cáncer de células escamosas orales (Ho-1-u-1, KOSC2 cl3-43, KON). La medición se llevó a cabo con FACS CantoII (BD) usando el anticuerpo anti-GPC1 de ratón (clon 01a033) como anticuerpo primario y una IgG anti-ratón de cabra marcada con FITC (específica de la cadena H+L) (Southern Biotech) como anticuerpo secundario, y los datos de medición se analizaron usando el software FlowJo (marca comercial) (Tree Star).
[0329] El ensayo de ADCin-vitroque usa el GPC1-ADC humanizado (MMAE) producido en el Ejemplo 4 se llevó a cabo de la siguiente manera.
[0330] (1) Las células se sembraron en una placa blanca de 96 pocillos (catálogo n.° 136101) fabricada por Thermo Fisher Scientific (90 ql de una suspensión celular). Se usó RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 qg/ml como medio de cultivo (RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, GlutaMAX al 1 % (marca comercial) I, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 qg/ml se usó para las células BxPC-3, DMEM complementado con FBS al 10 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 qg/ml se usó para Detroit562, FaDu y KON, y DMEM/F12 complementado con FBS al 10 %, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 qg/ml se usó para Ho-1-u-1). Las células se sembraron en 60 pocillos en el medio de la placa, y se añadieron 100 qL del medio de cultivo a 36 pocillos ubicados a lo largo de la periferia externa. Las células se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2.
[0331] (2) Al día siguiente, se añadieron 10 qL de la solución de ADC a las células (cantidad total: 100 qL).
[0332] (3) Después de cultivar las células durante 144 horas, se añadieron 100 qL de reactivo de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (marca registrada) (Promega) por pocillo.
[0333] (4) La medición se llevó a cabo usando un lector de placas.
[0334] (5) El análisis se llevó a cabo usando GraphPad Prism 6.
[0335] El valor de CI50 se calculó usando la ecuación siguiente (Hossain MM, Hosono-Fukao T, Tang R, Sugaya N, van Kupppevelt TH, Jenniskens GJ, Kimata K, Rosen SD, Uchimura K (2010)Direct detection of HSulf-1 and HSulf-2 activities on extracellular heparan sulphate and their inhibition by PI-88,Glycobiology 20(2): 175-186).
[0336] Gi50= 10A(L°g[A][B]x(50C)/(DC)+Log[B])
[0337] A: concentración superior al 50 %
[0338] B: concentración inferior al 50 %
[0339] C: tasa de inhibición en B
[0340] D: tasa de inhibición en A
[0341] Resultados
[0342] Con el fin de evaluar la eficacia del GPC1-ADC humanizado producido, se prepararon una línea celular positiva para la expresión de GPC1 y una línea celular negativa para la expresión de GPC1. Las líneas celulares de cáncer de esófago positivas para GPC1, TE8 y TE14, y la línea celular de cáncer de páncreas positiva para GPC1 BxPC3 se usaron para producir las células TE8-GPC1-KO, las células TE14-GPC1-K<o>y las células BxPC3-GPC1-KO en las cuales GPC1 se inactivó usando un sistema CRISPR-Cas9, y el análisis FACS se llevó a cabo para confirmar si GPC1 se inactivó (FIG. 9). Como resultado de llevar a cabo el ensayo de ADCin-vitro,el GPC1 -ADC humanizado tenía eficacia en las líneas celulares de cáncer positivas para GPC1, pero no tenía eficacia en las líneas celulares de cáncer negativas para GPC1. Por lo tanto, se encontró que el GPC1-ADC humanizado tenía eficacia de una manera dependiente de la expresión de GPC1 (FIG. 10). Se encontró que el GPC1-ADC humanizado también tenía eficacia en la línea celular de cáncer de cuello uterino, las líneas celulares tumorales de cabeza y cuello y las líneas celulares de cáncer de células escamosas orales de una manera dependiente de la expresión de GPC1 (FIGS. 11 y 12) además de la línea celular de cáncer de páncreas y las líneas celulares de cáncer de esófago. Ejemplo 9: ensayo de eficaciain-vivode GPC1-ADC humanizado (MMAE) usando PDX de cáncer de páncreas (PK565)
[0343] Materiales y métodos
[0344] La expresión de GPC1 en PDX de cáncer de páncreas (PK565) se confirmó como sigue.
[0345] Las secciones de un tejido incluido en parafina se sometieron a desparafinización y después se deshidrataron usando alcohol. La tinción inmunohistoquímica de GPC1 se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-GPC-1 (Genetex: GTX104557) y el kit ChemMate Envision HRP 500T (Dako: K5007). Se encontró que PK565 era un tumor heterogéneo en el cual coexistían células de cáncer de páncreas positivas para la expresión de GPC1 y células de cáncer de páncreas negativas para la expresión de GPC1.
[0346] PDX de cáncer de páncreas se implantó por vía subcutánea en ratones NOG hembra de 6 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor implantado alcanzó aproximadamente 100 mm3, se inició la administración de PBS, un ADC de control (10 mg/kg) y el anti-GPC1-ADC humanizado (MMAE) producido en el Ejemplo 4 (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg). El día en el cual se inició la administración se tomó como el día 0, y la administración intravenosa se llevó a cabo el día 0, el día 7, el día 14 y el día 21. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron desde el día 0 hasta el día 42 a una frecuencia de dos veces a la semana.
[0347] Resultados
[0348] Como resultado de la administración por vía intravenosa del medicamento semanalmente, cuatro veces en total, en la prueba de eficaciain-vivo,el GPC1-ADC humanizado también tenía un alto efecto antitumoral en los ratones PDX con cáncer de páncreas positivo para GPC1 (PK565) de una manera dependiente de la concentración (FIG.
[0349] 13). En este momento, no se observó una reducción en el peso corporal, lo cual muestra que el GPC1-ADC no tenía toxicidad característica a diferencia del ADC de control. En comparación con la administración sistémica de un agente anticanceroso, se logran una mayor eficacia y una menor toxicidad mediante la administración de un agente anticanceroso específicamente a células cancerosas positivas para GPC1 usando el GPC1 -ADCin vivo,lo cual conduce al desarrollo de un reactivo terapéutico de revolución para el cáncer positivo para GPC1.
[0350] Ejemplo 10: ensayo de eficaciain-vivode GPC1-ADC humanizado (MMAE) usando PDX de cáncer de páncreas (PK175)
[0351] Materiales y métodos
[0352] La expresión de GPC1 en PDX de cáncer de páncreas (PK175) se confirmó como sigue.
[0353] Secciones de un tejido incluido en parafina se sometieron a desparafinización, y después se deshidrataron usando alcohol. La tinción inmunohistoquímica de GPC1 se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-GPC-1 (Genetex: GTX104557) y el kit ChemMate Envision HRP 500T (Dako: K5007). Se encontró que PK175 era un tumor en el cual la expresión de GPC1 era positiva tanto en las células de cáncer de páncreas como en los fibroblastos asociados al cáncer (CAF).
[0354] PDX de cáncer de páncreas se implantó por vía subcutánea en ratones NOG hembra de 6 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor implantado alcanzó aproximadamente 100 mm3, se inició la administración de PBS y el anti-GPC1 -ADC humanizado (MMAE) (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg). El día en el cual se inició la administración se tomó como el día 0, y la administración intravenosa se llevó a cabo el día 0, el día 7, el día 14 y el día 21. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron desde el día 0 hasta el día 42 a una frecuencia de dos veces a la semana.
[0355] Resultados
[0356] Como resultado de la administración por vía intravenosa de los medicamentes semanalmente, cuatro veces en total, en la prueba de eficaciain-vivo,el GPC1-ADC humanizado también tenía un alto efecto antitumoral en los ratones PDX con cáncer de páncreas positivo para GPC1 (PK175) de una manera dependiente de la concentración (FIG. 14). En este momento, no se observó una reducción en el peso corporal, lo cual muestra que el GPC1-ADC no tenía toxicidad característica a diferencia del ADC de control. En comparación con la administración sistémica de un agente anticanceroso, se logran una mayor eficacia y una menor toxicidad mediante la administración de un agente anticanceroso específicamente a células cancerosas positivas para GPC1 usando el ADC-GPC1in vivo,lo cual conduce al desarrollo de un reactivo terapéutico transcendental para el cáncer positivo para GPC1.
[0357] Ejemplo 11: ensayo de eficaciain-vivode GPC1-ADC usando PDX de cáncer de esófago (ESCC14) Materiales y métodos
[0358] La expresión de GPC1 en PDX de cáncer de esófago (ESCC14) se confirmó como sigue.
[0359] Secciones de un tejido incluido en parafina se sometieron a desparafinización, y después se deshidrataron usando alcohol. La tinción inmunohistoquímica de GPC1 se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-GPC-1 (Genetex: GTX104557) y el kit ChemMate Envision HRP 500T (Dako: K5007). Se encontró que ESCC14 era un tumor homogéneo en el cual GPC1 se expresaba altamente de manera homogénea en las células de cáncer de esófago. PDX de cáncer de esófago se implantó subcutáneamente en ratones NOG hembra de 6 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor implantado alcanzó aproximadamente 100 mm3, se inició la administración de PBS que sirve como control y el anti-GPC1-ADC humanizado (MMAE) producido en el Ejemplo 4 (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg). El día en el cual se inició la administración se tomó como el día 0, y la administración intravenosa se llevó a cabo el día 0, el día 7, el día 14 y el día 21. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron desde el día 0 hasta el día 42 a una frecuencia de dos veces a la semana.
[0360] Resultados
[0361] Como resultado de la administración por vía intravenosa de los medicamentos semanalmente, cuatro veces en total, en la prueba de eficaciain-vivo, el GPC1-ADC humanizado también tenía un alto efecto antitumoral en los ratones con PDX de cáncer de esófago positivo para GPC1 (ESCC14) de una manera dependiente de la concentración (FIG. 15). En este momento, no se observó una reducción en el peso corporal, lo cual muestra que el GPC1-ADC no tenía toxicidad característica a diferencia del ADC de control. En comparación con la administración sistémica de un agente anticanceroso, se logran una mayor eficacia y una menor toxicidad mediante la administración de un agente anticanceroso específicamente a células cancerosas positivas para GPC1 usando el ADC-GPC1in vivo,lo cual conduce al desarrollo de un reactivo terapéutico transcendental para el cáncer positivo para GPC1.
[0362] Ejemplo 12: análisis de expresión de GPC1 a través de análisis FACS de línea celular de cáncer colorrectal en ratón forzada a expresar mGPC1 (mGPC1 -MC38)
[0363] Materiales y métodos
[0364] La medición de las células mGPC1 -MC38 se llevó a cabo con FACS CantoII (BD) usando el anticuerpo anti-GPC1 humanizado (clon T2) como anticuerpo primario y anti-IgG humana-FITC marcada con FITC (Jackson Immuno Research, catálogo n.° 109-095-098) como anticuerpo secundario, y los datos de medición se analizaron usando el software BD FACS Diva (BD).
[0365] Además, el ensayo de ADCin-vitrose llevó a cabo en las células mGPC1-MC38 de la misma manera que en el Ejemplo 8.
[0366] Resultados
[0367] Se sabe que algunos tipos de cargas útiles como, por ejemplo, MMAE, usadas en un ADC inducen la muerte celular de células cancerosas incluyendo la muerte celular inmunogénica (ICD, por sus siglas en inglés). Las células cancerosas con ICD inducida liberan proteínas intranucleares como, por ejemplo, HMGB1, conocidas como patrones moleculares asociados al daño (DAMP, por sus siglas en inglés) al exterior, y por lo tanto la maduración y activación de las células dendríticas se promueven a través de TLR-4. A continuación, las células T específicas de antígeno invaden un tumor y muestran un efecto antitumoral. Por consiguiente, se espera que el uso del GPC1-ADC humanizado y un inhibidor del punto de control inmunitario juntos provean un efecto antitumoral sinérgico. Por lo tanto, se usó MC38-mGPC1, que es MC38 (línea celular de cáncer colorrectal en ratón) que expresa de manera estable GPC1 de ratón, para llevar a cabo un experimentoin-vitro,y se usaron ratones singénicos para llevar a cabo un experimentoin-vivo.El anti GPC1-ADC humanizado tenía una actividad inhibidora de la proliferación celular contra el MC38-mGPC1in vitro(FIG. 16).
[0368] Ejemplo 13: cuantificación de HMGB-1 en sobrenadante de cultivo usando ELISA
[0369] Materiales y métodos
[0370] Se añadieron un ADC de control, el GPC1-ADC humanizado y MMAE al MC38-mGPC1in vitro,y los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de 48 horas. La concentración de HMGB-1 en el sobrenadante de cultivo se midió usando el kit de ELISA II de HMGB1 - reactivo de medición de HMGB1 (Shino-Test Corporation, catálogo n.2 SNO-326054329).
[0371] Resultados
[0372] Como resultado de añadir el anti-GPC1-ADC humanizado producido en el Ejemplo 4 al MC38-mGPC1 y cuantificar la HMGB1 en el sobrenadante de cultivo a través de ELISA, se encontró que se indujo la liberación extracelular de la HMGB1 (FIG. 17). La HMGB1 (caja del grupo de alta movilidad 1) es una proteína intranuclear conocida como una de los DAMP (patrones moleculares asociados al daño). Cuando algún tipo de agente anticanceroso causa la muerte celular de las células cancerosas, la HMGB1 se libera al exterior de la célula y, por lo tanto, se conoce como un índice de muerte celular inmunogénica. La HMGB1 liberada al exterior de la célula se une a TLR4 en una célula dendrítica para promover la activación y maduración de la célula dendrítica y, como resultado, se promueve la invasión de células T en un tejido tumoral y similares.
[0373] Ejemplo 14: confirmación del efecto sinérgico causado por el uso concurrente de GPC1-ADC humanizado (MMAE) y anticuerpo anti-PD1 usando un ratón de modelo singénico de cáncer colorrectal
[0374] Materiales y métodos
[0375] El MC38-mGPC1 se implantó por vía subcutánea en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor implantado alcanzó aproximadamente 75 mm3, los ratones se dividieron en cuatro grupos, y se inició la administración de PBS, el anti-GPC1-ADC humanizado (MMAE) producido en el Ejemplo 4 (10 mg/kg), el anticuerpo anti-PD1 de ratón (clon RMP1-14) (3 mg/kg), y una combinación del anti-GPC1-ADC humanizado (MMAE) (10 mg/kg) y el anticuerpo anti-PD1 de ratón (clon RMP1-14) (3 mg/kg). El día en el que se inició la administración se tomó como día 0, y la administración intravenosa del ADC y la administración intraperitoneal del anticuerpo anti-PD1 de ratón se llevaron a cabo el día 0, día 3, día 7 y día 10. El volumen del tumor y el peso corporal se midieron desde el día 0 hasta el día 21 a una frecuencia de dos veces a la semana.
[0376] Resultados
[0377] Se usaron ratones C57BL/6 en los que se implantó por vía subcutánea MC38-mGPC1 como modelos singénicos y se dividieron en cuatro grupos, concretamente grupos para el control de vehículo, el anti-GPC1 -ADC humanizado, el anticuerpo anti-PD1 y la combinación del anti-GPC1-ADC humanizado y el anticuerpo anti-PD1. Los medicamentos se administraron a una frecuencia de dos veces a la semana, cuatro veces en total, y se evaluó el efecto antitumoral. Como resultado, el GPC1-ADC humanizado y el anticuerpo anti-PD1 tenían un efecto antitumoral significativo en el grupo de administración concurrente, a diferencia de los grupos de administración única. Por otro lado, no se observó una reducción en el peso corporal causada por la administración concurrente del GPC1-ADC humanizado y el anticuerpo anti-PD1 (FIG. 18). Se espera a partir de estos resultados que el uso del GPC1-ADC humanizado y un inhibidor del punto de control juntos provea un efecto antitumoral sinérgico. Ejemplo 15: análisis del mecanismo de acciónin-vivode GPC1 -ADC humanizado (MMAE) usando PDX de cáncer de páncreas (PK565)
[0378] Materiales y métodos
[0379] Se implantó subcutáneamente un PDX de cáncer de páncreas (PK565) en ratones NOG hembra de 6 semanas de edad. Cuando el tamaño del tumor implantado alcanzó aproximadamente 100 mm3, se inició la administración de PBS, un ADC de control (10 mg/kg) y el anti-GPC1 -ADC humanizado (MMAE) producido en el Ejemplo 4 (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg). El tumor se eliminó 24 horas después de la administración. Después de fijar el tejido extirpado usando tampón de hormalina neutro al 10 %, se produjo un tejido incluido en parafina, y se prepararon secciones. Para evaluar las células cancerosas cuyo ciclo celular se detuvo en la fase G2/M en cada sección, se analizó la expresión de fosfohistona H3 (Ser10) mediante tinción inmunohistoquímica.
[0380] Resultados
[0381] Se encontró a partir de los resultados que, en comparación con el grupo de administración de PBS y el grupo de administración de ADC de control (10 mg/kg), la relación de células cancerosas cuyo ciclo celular se detuvo en la fase G2/M aumentó significativamente de una manera dependiente de la concentración en el grupo de administración de anti-GPC1-ADC (MMAE) humanizado (FIG. 19). Cuando la carga útil del ADC actúa sobre las células cancerosas y detiene el ciclo celular en la fase G2/M, se detiene la proliferación de las células cancerosas, contribuyendo así a la extensión del tiempo de supervivencia de un paciente con cáncer.
[0382] Ejemplo 16: análisis de expresión de GPC1 de tejido metastásico de cáncer de páncreas distante a través de tinción inmunohistoquímica
[0383] Las metástasis distantes como, por ejemplo, metástasis de ganglios linfáticos y metástasis hepáticas, se conocen como factores de pronóstico pobre del cáncer de páncreas. Por lo tanto, si GPC1 se expresa no solo en la lesión primaria del cáncer de páncreas sino también en lesiones metastásicas distantes, es concebible que GPC1 sea muy útil como diana de tratamiento. Por consiguiente, la expresión de GPC1 en tejidos metastásicos de cáncer de páncreas en el ganglio linfático, el hígado y la glándula suprarrenal se evaluó a través de tinción inmunohistoquímica. Como resultado, se encontró que la expresión de GPC1 era positiva en todos los tejidos metastásicos de cáncer de páncreas en el nódulo linfático, el hígado y la glándula suprarrenal (FIG. 20). Por consiguiente, esto sugiere que el GPC1-ADC humanizado (MMAE) de la presente invención es eficaz en el tratamiento o prevención de cáncer metastásico de cáncer positivo para GPC1.
[0385] Ejemplo 17: producción del modelo de metástasis hepática de cáncer de páncreas y prueba de eficacia de GPC1-ADC humanizado
[0387] Con el fin de confirmar el efecto de tratamiento del cáncer metastásico o el efecto de prevención del cáncer metastásico del GPC1-ADC humanizado (MMAE), que se sugirió en el Ejemplo 16, se produjo un modelo de metástasis hepática de cáncer de páncreas.
[0389] Materiales y métodos
[0391] Se administraron células BxPC3-Luc al bazo de un ratón SCID según el procedimiento mostrado en la FIG. 21, y se extrajo el bazo 1 a 2 semanas después de la administración. Por tanto, se produjo un modelo de metástasis hepática de cáncer de páncreas. La proliferación de las células BxPC3-Luc metastásicas al hígado se monitorizó midiendo la actividad de luciferasa usando IVIS. Los ratones modelo de metástasis hepática se dividieron en dos grupos, a saber, un grupo de administración de PBS y un grupo de administración de anti-GPC1-ADC (MMAE) humanizado (producido en el Ejemplo 4) (10 mg/kg), y la prueba de eficacia se llevó a cabo en el mismo procedimiento que en el Ejemplo 16.
[0393] Resultados
[0395] Como resultado, como se muestra en el diagrama izquierdo de la FIG. 22, se encontró a partir de los valores obtenidos a través de las mediciones usando IVIS que la emisión del grupo de administración anti-GPC1-ADC (MMAE) humanizado (10 mg/kg) se inhibió significativamente en comparación con el grupo de administración de PBS. Además, se encontró a partir de los resultados de un análisis de supervivencia que el anti-GPC1-ADC humanizado (MMAE) (10 mg/kg) extendió significativamente el tiempo de supervivencia del modelo de metástasis hepática de cáncer de páncreas.
[0397] Ejemplo 18: ensayo de eficacia de GPC1 -ADC humanizado usando cáncer metastásico
[0399] Se producen modelos de metástasis de metástasis en el hígado, el pulmón, el cerebro, el hueso, el peritoneo, la suprarrenal y similares, y se confirma la eficacia del GPC1-ADC humanizado en los modelos de metástasis. Se espera que el GPC1-ADC humanizado tenga eficacia tanto en la lesión primaria como en las lesiones metastásicas y exhiba un efecto de extender el tiempo de supervivencia.
[0401] Ejemplo 19: ejemplo de formulación
[0403] El anti-GPC 1-ADC (MMAE) humanizado de la presente invención puede proveerse como una formulación para inyección intravenosa que tiene la siguiente composición.
[0406]
[0409] Como se ha descrito anteriormente, las realizaciones preferidas de la presente descripción se han usado como ejemplos de la presente descripción, pero se entiende que el alcance de la presente descripción debe interpretarse solo por las reivindicaciones. La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de La Solicitud de Patente Japonesa n.° 2020-101856, presentada el 11 de junio de 2020.
[0411] Aplicabilidad industrial
[0413] Se proporcionó un fármaco farmacéutico para el tratamiento o prevención del cáncer. Se provee una tecnología capaz de usarse en las industrias (p. ej., industria farmacéutica) basadas en tal tecnología.
[0414] Texto libre del listado de secuencias
[0415] ID de SEC n.°: 1: secuencia de ácido nucleico de Glipicano-1 humano
[0416] ID de SEC n.°: 2: secuencia de aminoácidos de Glipicano-1 humano
[0417] ID de SEC n.°: 3: secuencia de ácido nucleico de Glipicano-1 de ratón
[0418] ID de SEC n.°: 4: secuencia de aminoácidos de Glipicano-1 de ratón
[0419] ID de SEC n.°: 5: secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 01a033
[0420] ID de SEC n.°: 6: secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 01a033
[0421] ID de SEC n.°: 7: secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada humanizada
[0422] ID de SEC n.°: 8: secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera humanizada del clon T2 ID de SEC n.°: 9: secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T7 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T8 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T1 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T36 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T57 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T10 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T34 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T56 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T3 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T11 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T28 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T43 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T59 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T31 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T22 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T26 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T32
secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T33 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera humanizada del clon T29 ID de SEC n.°: 28: aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de la cadena pesada humanizada
[0423] ID de SEC n.°: 29: aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de la cadena pesada humanizada
[0424] ID de SEC n.°: 30: aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de la cadena pesada humanizada
[0425] ID de SEC n.°: 31: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T2
[0426] ID de SEC n.°: 32: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T2
[0427] ID de SEC n.233: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T2 ID de SEC n.234: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T7 ID de SEC n.235: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T7 ID de SEC n.236: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T7 ID de SEC n.237: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T8 ID de SEC n.238: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T8 ID de SEC n.239: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T8 ID de SEC n.240: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T1 ID de SEC n.241: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T1 ID de SEC n.242: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T1 ID de SEC n.243: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T36 ID de SEC n.244: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera del clon T36 ID de SEC n.245: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T36 ID de SEC n.246: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T57 ID de SEC n.247: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T57 ID de SEC n.248: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T57 ID de SEC n.249: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T10 ID de SEC n.250: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera del clon T10 ID de SEC n.251: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T10 ID de SEC n.252: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T34 ID de SEC n.253: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T34 ID de SEC n.254: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T34 ID de SEC n.255: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T56 ID de SEC n.256: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T56 ID de SEC n.257: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T56 ID de SEC n.258: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T3 ID de SEC n.259: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera del clon T3 ID de SEC n.260: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T3 ID de SEC n.261: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T11 ID de SEC n.262: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T11 ID de SEC n.263: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T11 ID de SEC n.2 : 64: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T28 ID de SEC n.265: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera del clon T28 ID de SEC n.°: 66: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T28 ID de SEC n.°: 67: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T43
[0428] ID de SEC n.°: 68: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T43
[0429] ID de SEC n.°: 69: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T43
[0430] ID de SEC n.°: 70: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T59
[0431] ID de SEC n.°: 71: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T59
[0432] ID de SEC n.°: 72: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T59
[0433] ID de SEC n.°: 73: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T31
[0434] ID de SEC n.°: 74: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T31
[0435] ID de SEC n.°: 75: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T31
[0436] ID de SEC n.°: 76: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T22
[0437] ID de SEC n.°: 77: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T22
[0438] ID de SEC n.°: 78: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T22
[0439] ID de SEC n.°: 79: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T26
[0440] ID de SEC n.°: 80: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T26
[0441] ID de SEC n.°: 81: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T26
[0442] ID de SEC n.°: 82: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T32
[0443] ID de SEC n.°: 83: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera del clon T32
[0444] ID de SEC n.°: 84: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T32
[0445] ID de SEC n.°: 85: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera del clon T33
[0446] ID de SEC n.°: 86: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T33
[0447] ID de SEC n.°: 87: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T33
[0448] ID de SEC n.°: 88: secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera del clon T29
[0449] ID de SEC n.°: 89: secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera del clon T29
[0450] ID de SEC n.°: 90: secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera del clon T29
[0451] ID de SEC n.°: 91: secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada del anticuerpo quimérico y el anticuerpo humanizado
[0452] ID de SEC n.°: 92: secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera del anticuerpo quimérico y el anticuerpo humanizado

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-GPC-1 humanizado humanizado en base a un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 5 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 6, o un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo anti-GPC-1 humanizado,
el anticuerpo humanizado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene mayor afinidad por GPC-1 en comparación con el anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 5 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID n.°: 6,
en donde el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la ID de SEC n.°: 7 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos expuestas en las ID de SEC n.°: 8, 10, 11, 12, 14, 16 y 17.
2. Una composición farmacéutica para transferir un principio activo a una célula, que comprende el anticuerpo humanizado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1
3. Un complejo del anticuerpo humanizado, o del fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 y un medicamento que tiene actividad citotóxica.
4. El complejo según la reivindicación 3, en donde el anticuerpo humanizado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, está unido operativamente al medicamento que tiene actividad citotóxica a través de un ligador.
5. El complejo según la reivindicación 3 o 4, en donde el medicamento que tiene actividad citotóxica se selecciona del grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), DM1, DM4, caliqueamicina, duocarmicina, pirrolobenzodiazepina (PBD) e inhibidores de topoisomerasa, preferiblemente del grupo que consiste en MMAE, PBD, eribulina, SN-38, Dxd y DM4; y/o tiene permeabilidad de membrana celular.
6.El complejo según la reivindicación 4 o 5, en donde el ligador:
se selecciona del grupo que consiste en un ligador escindible enzimáticamente, un ligador lábil a ácido y un ligador disulfuro; y/o
es un ligador escindible que puede ser escindido por la catepsina B.
7. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el complejo tiene un CI<50>de aproximadamente 0,1 nM o menos en una célula positiva a Glipicano-1.
8. Una composición para su uso en un método para prevenir o tratar cáncer positivo a Glipicano-1 o cáncer metastásico de cáncer positivo a Glipicano-1, comprendiendo la composición el complejo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.
9. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer positivo para Glipicano-1 se selecciona de cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer del conducto biliar, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, leiomiosarcoma uterino, cáncer de próstata, cáncer de células escamosas orales y cualquier combinación de los mismos.
10. La composición para su uso según la reivindicación 8 o 9, en donde:
el cáncer positivo para Glipicano-1 es cáncer de esófago o cáncer de páncreas;
el cáncer positivo para Glipicano-1 tiene fibroblastos asociados al cáncer (CAF);
la composición se administra junto con un inhibidor del punto de control inmunitario, preferiblemente un anticuerpo anti-PD-1;
el cáncer metastásico es cáncer metastásico de cáncer de páncreas; y/o
el cáncer metastásico es cáncer metastásico que ha metastatizado a un hígado, esófago, conducto biliar, cuello uterino, pulmón, región de cabeza y cuello, mama, músculo liso uterino, próstata, epitelio escamoso oral, cerebro, hueso, peritoneo o suprarrenal.
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