ES3043007T3 - Stabilized minimal coiled-coil mimetics - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una macroestructura que incluye una estructura de bobina enrollada antiparalela que se muestra a continuación o una estructura de bobina enrollada paralela que se muestra a continuación y se describe en la presente solicitud. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Miméticos de hélice enrollada mínimos estabilizados

[0005] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con No. de serie 62/172,669, presentada el 8 de junio de 2015, y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con No. de serie 62/211,603, presentada el 28 de agosto de 2015.

[0007] Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención número R01GM073943 otorgada por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

[0009] Campo de la invención

[0011] Esta invención está dirigida a imitadores de hélices enrolladas.

[0013] Antecedentes de la invención

[0015] La imitación de motivos críticos de estructura secundaria que median las interacciones proteína-proteína (PPI) ofrece un enfoque prometedor para el descubrimiento de nuevas clases de terapias (Wells et al., Nature 450:1001 (2007)); Ko et al., Chem. Soc. Rev. 40: 4411 (2011); Milroy et al., Chem. Rev. 114: 4695 (2014); Arkin et al., Chem. Biol. 21: 1102 (2014)). Se han descrito varios inhibidores de las interfaces de proteínas helicoidales debido a la alta incidencia de hélices en las interfaces PPI (Bullock et al., J. Am. Chem. Soc. 133: 14220 (2011); Jochim et al., ACS Chem. Biol. 5: 919 (2010)) y el desarrollo de enfoques sintéticos que permitieron imitar esta estructura secundaria (Jayatunga et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 24: 717 (2014); Azzarito et al., Nat. Chem.

[0016] 5:161 (2013); Henchey et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 12:692 (2008)). El examen de las interfaces de PPI sugiere que muchos complejos a menudo utilizan contactos de múltiples hélices y que estos complejos potencialmente requerirán inhibidores que sean capaces de interacciones más allá del mimetismo de una sola hélice (Watkins et al., "Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs," J. Am. Chem. Soc. 137: 11622-11630 (2015); Checco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112: 4552 (2015)). Estas interfaces multihélice suelen estar compuestas de hélices individuales del motivo de hélice enrollada a-helicoidal (Crick, Acta Crystallographica 6: 689 (1953); Lupas et al., Adv. Protein Chem. 70: 37 (2005); Burkhard et al., Trends Cell Biol. 11: 82 (2001); Woolfson, Adv. Protein Chem. 70: 79 (2005)). Un ejemplo de dicha interfaz se muestra en la Figura 1, donde un compañero proteico presenta residuos críticos para el reconocimiento biomolecular de hélices que forman parte de ensamblajes de hélices enrolladas de dos cadenas. Se ha realizado un análisis exhaustivo de las estructuras de alta resolución en el Banco de Datos de Proteínas para identificar todas las PPI mediadas por dímeros de hélice (Watkins et al., " Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs", J. Am. Chem. Soc.", J. Am. Chem. Soc. 137: 11622-11630 (2015)).

[0018] La formación de ensamblajes de hélices enrolladas está implicada en muchos procesos biológicos. Las hélices enrolladas canónicas se estabilizan mediante una serie de interacciones de empaquetamiento de botones en ojales hidrofóbicos (Crick, Acta Crystallographica 6: 689 (1953)) junto con contactos electrostáticos entre cadenas y dentro de ellas (Lupas et al., Adv. Protein Chem. 70: 37 (2005); Burkhard et al., Trends Cell Biol. 11: 82 (2001); Woolfson, Adv. Protein Chem. 70: 79 (2005)). Se han descrito varios péptidos helicoidales e inhibidores peptidomiméticos que tienen como objetivo el dominio de hélice enrollada en procesos biológicos, como la fusión viral (Dimitrov, Nat. Rev. Microbiol. 2: 109 (2004); Eckert et al., Annu. Rev. BioChem. 70: 777 (2001); Horne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 106: 14751 (2009); Kilby et al., Nat. Med. 4: 1302 (1998); Wang et al., Angew. Chem. Ed. Int. Engl. 47: 1879 (2008); Eckert et al., Cell 99: 103 (1999); Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 13284 (2006)). Estos inhibidores funcionan inhibiendo la formación de hélice enrollada. Esta estrategia también puede ser aplicable a complejos entre proteínas globulares y hélices enrolladas preformadas, como la que se muestra en la Figura 1. Sin embargo, una estrategia alternativa podría ser utilizar imitadores de hélice enrollada o dímeros de hélice estables que muestren la funcionalidad deseada para interactuar con la proteína globular asociada.

[0020] Un estudio de los datos estructurales revela que los dímeros helicoidales típicos en las PPI abarcan 12-18 residuos por hélice (Watkins et al., "Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs", J. Am. Chem. Soc. 137: 11622-11630 (2015)), lo cual es consistente con la longitud promedio de las hélices en las interfaces de proteínas (Bullock et al., J. Am. Chem. Soc. 133: 14220 (2011); Jochim et al., ACS Chem. Biol., 5: 919 (2010)). Por lo tanto, una estructura de hélice dimérica adecuada sería capaz de abarcar esta longitud. Sin embargo, la estabilidad de las hélices enrolladas es directamente proporcional al número de repeticiones de heptada y al emparejamiento correcto de los residuos hidrófobos e iónicos. Las hélices enrolladas que constan de menos de tres heptadas generalmente no son estables (Lau et al., J. Biol. Chem. 259: 13253 (1984); Burkhard et al., Protein Sci. 9: 2294 (2000)). Aunque se han descrito hélices enrolladas cortas altamente modificadas (Woolfson, Adv. Protein Chem. 70: 79 (2005); Burkhard et al., Protein Sci. 9: 2294 (2000); Dong et al., Biomacromolecules 7: 691 (2006)), estos enfoques pueden no ser adecuados para el diseño de inhibidores, ya que se necesita al menos una cara del dímero para mostrar la funcionalidad adecuada para interactuar con el objetivo.

[0022] La presente invención está dirigida a superar estas y otras deficiencias en la técnica.

[0023] Resumen de la invención

[0025] La presente invención se refiere a una macroestructura y composición tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0027] Las hélices enrolladas son un motivo importante en las proteínas y orquestan la multimerización de varios complejos importantes para los procesos biológicos. La inhibición de las interacciones mediadas por hélices enrolladas tiene un potencial biomédico significativo. Sin embargo, los enfoques generales que brindan péptidos cortos con una conformación de hélice enrollada definida han resultado difíciles de alcanzar. Como se describe con más detalle en este documento, se evaluaron varias estrategias para estabilizar haces helicoidales mínimos con el motivo dímero como foco inicial. Se creó una estructura dimérica estable en una secuencia sintética reemplazando un enlace iónico inter helicoidal con un enlazador covalente. Para una interacción proteína-proteína nativa con una hélice enrollada nativa menos estable, se requiere una restricción adicional, un enlace disulfuro en la posición interior a/d' junto con un Enlazador En las posiciones e/e", se utilizó para mejorar la estabilidad conformacional. Se espera que la metodología de estabilización de hélice enrollada descrita en este documento pueda producir nuevas clases de moduladores para el subconjunto de interacciones proteína-proteína que utilizan este motivo para la formación de complejos y que este enfoque sintético se pueda aplicar para estabilizar una gama de dímeros helicoidales de una manera independiente de la secuencia.

[0029] Breve descripción de los dibujos

[0031] La Figura 1 muestra un ejemplo de un complejo proteico que utiliza residuos de ambas hélices de un dominio de hélice enrollada dimérico para dirigirse a la proteína asociada. El modelo representa el complejo entre IL-4 y la cadena alfa del receptor de IL-4 (código PDB 1IAR).

[0033] Las Figuras 2A-P son trazas de HPLC analítica del péptido. A (Figura 2A), péptido B (Figura 2B), péptidos restringidos AB-1, AB-2, y AB-3 (Figuras 2C-E, respectivamente), imitadores de hélices enrolladas AB-4, AB-5, y AB-6 (Figuras 2F-H, respectivamente), y los imitadores de NHR2 CHD-NHR2-1, CHD-NHR2-2, CHD-NHR2-6, CHD-NHR2-7, CHDDS-NHR2-3, CHDDS-NHR2-4, CHDDS-NHR2-5, y CHDDT-NHR2-3 (Figuras 2I-P, respectivamente).

[0035] Las Figuras 3A-B muestran espectros de CD de péptidos Ano restringidos (SEQ ID NO: 1) y B (SEQ ID NO: 2), mezcla equimolar de A y B péptidos (Figura 3A) y péptidos restringidos AB-1 (SEQ ID NO: 3), AB-2 (SEQ ID NO: 4), y AB-3 (SEQ ID<n>O: 5) (Figura 3<b>). Los espectros de CD se adquirieron en KF acuoso 50 mM, pH 7.4.

[0036] La Figura 4 es el espectro de RMN de 1H de AB-4.

[0038] Las Figuras 5A-B son espectros de RMN que muestran la región amida de NOESY (Figura 5A) y la conectividad de la amida con la cadena lateral de TOCSY (Figura 5B) de AB-4.

[0040] La Figura 6 es un espectro de RMN que muestra la región de huellas dactilares de NOESY de AB-4.

[0042] La Figura 7 muestra la estructura de flu-N2B utilizado en los ensayos de unión de péptidos (arriba) y su traza UV analítica medida a 220 nm en una columna XTerra RP18 de 3.5 pm y 2.1 x 150 mm (parte No. 186000410) (abajo). 10 % de B hasta 90 % de B durante 10 min; A: TFA acuoso al 0.1 %, B: acetonitrilo; caudal 400 pL/min. Masa exacta calculada [M+H]+ (m/z): 2056.0; encontrada: 2055.9 m/z.

[0044] La Figura 8 es la curva de unión de saturación de NHR<2482-551>con flu-N2B. Kd = 363 ± 60 pM. Reportado en la literatura: 380 ± 18 pM (Sun et al., Nature 500: 93 (2013)).

[0046] Las Figuras 9A-B son gráficos de la unión de saturación de flu-N2B con miméticos de CHD diseñados y un control nativo.

[0048] Las Figuras 10A-E muestran estrategias para modelar la formación de hélices enrolladas de péptidos diseñados. La Figura 10A muestra un posible ensamblaje antiparalelo de hélice enrollada entre péptidos A y B. La Figura 10B muestra el uso de hélices sustitutas de enlaces de hidrógeno para estabilizar dímeros helicoidales. La Figura 10C muestra la macrociclización de péptidos. La Figura 10D muestra la utilización de puentes disulfuro interhelicoidales en lugar de contactos hidrofóbicos para facilitar el ensamblaje. La Figura 10E muestra la ubicación de los enlaces covalentes en lugar de las interacciones iónicas entre cadenas. Véase la Tabla 1 a continuación.

[0050] Tabla 1. Estrategias utilizadas para estabilizar los imitadores de hélices enrolladas antiparalelas y sus características

[0052] Compuesto Modificación (ubicación) Mínimo a 222/208 |0222|

[0053] AB* N/A 0.58 9510

[0054] AB-1 Restricción de HBS del terminal N 0.73 8475 AB-2 Dos enlazadores GGSSGG en los terminales N y C 0.62 8950 AB-3 Puentes disulfuro de cisteína interhelicoidales en las posiciones A-D' 0.62 9460 AB-4* Bis-triazol azidolisina 0.86 9935 AB-5* Bis-triazol azidohomoalanina 0.71 11450 AB-6* Bis-triazol azidoalanina 0.46 8505 *Muestra una firma aleatoria similar a una hélice; *Reacción de clic realizada con éter propargílico

[0056] Las Figuras 11A-D se refieren al diseño de dímeros de hélice entrecruzados mediante el reemplazo de un contacto iónico entre cadenas con enlazadores de bis-triazol. Como se muestra en la Figura 11A, la cadena ácida A (SEQ ID NO:1) y la cadena básica B (SEQ ID NO:2) se utilizaron para sintetizar los dímeros de hélice entrecruzados. Se incorporaron enlazadores de bis-triazol de longitudes variables resultantes de residuos de azidoalanina, azidohomoalanina y azidolisina en posiciones de hélice enrollada e/e' para obtener dímeros AB-4, AB-5, y AB-6, respectivamente. La Figura 11B muestra los espectros de CD de AB-4-AB-6 en KF acuoso 50 mM, pH 7.4. La Figura 11C muestra un diagrama de rueda helicoidal de AB-4. La Figura 11D representa la estructura derivada de RMN de AB-4. Se muestran el confórmero más bajo (arriba) y el ensamblaje de los 20 confórmeros más bajos (abajo).

[0058] Las Figuras 12A-D se relacionan con el diseño de imitadores de hélice enrollada de NHR2. La Figura 12A es un modelo que representa la unión de NHR2 (gris) a N2B (magenta) con residuos críticos marcados. Código PDB: 4JOL. La Figura 12B son diagramas de ruedas helicoidales que representan secuencias para los miméticos de hélice enrollada de NHR2 nativos (CHD-NHR2-1) (Figura 12B, arriba), el rediseñado (CHD-NHR2-2) (Figura 12B, medio) y enlazados por disulfuro (CHDDS-NHR2-3) (Figura 12<b>, abajo). Z denota el Enlazador Bis-triazol derivado de azidolisina. La Figura 12C son los espectros de CD de CHD-NHR2-1, CHD-NHR2-2, y CHDDS-NHR2-3 en KF acuoso 50 mM, pH 7.4. La Figura<1 2>D muestra un modelo computacional de CHDDS-NHR2-3.

[0060] Las Figuras 13A-C muestran diagramas de ruedas helicoidales de dímeros de hélice NHR2 monoentrecruzados CHD-NHR2-1 (SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7) y CHD-NHR2-2 (SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9) (Figura 13A) y dímeros de hélice NHR2 doblemente entrecruzados estabilizados con disulfuro CHDDS-NHR2-3 (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11), CHDDS-NHR2-4 (SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13), y CHDDS-NHR2-5 (SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15) (Figura 13B) y espectros de CD de péptidos CHD-NHR2 diseñados (Figura 13C). Los espectros de CD se adquirieron en K<f>acuoso 50 mM, pH 7.4.

[0062] Descripción detallada de la invención y divulgación en el presente documento

[0064] En un primer aspecto, la presente invención proporciona una macroestructura que comprende:

[0066] (i) una estructura de hélice enrollada antiparalela de fórmula:

[0069]

[0070]

[0072] (vista bidimensional)

[0073] donde:

[0074] cada o y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete y hasta 21 residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde

[0075] a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

[0076] cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina;

[0077] cada ' ' está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos de aminoácidos, donde:

[0078] cada Enlazador A es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido g'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A;

[0079] cada Enlazador B es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido d'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

[0080] cada Enlazador C es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido a'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

[0081] cada Enlazador D es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido e'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A; y

[0082] al menos un Enlazador A o Enlazador D está presente y el o cada Enlazador A o Enlazador D se selecciona independientemente del grupo que consiste en

[0085]

[0086]

[0089] donde cada

[0092]

[0095] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo enlazado;

[0097] cada Enlazador B y Enlazador C, cuando está presente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno, éteres, tioéteres, amidas, maleimidas, ésteres, disulfuros, diseleniuros, -O-, -S-, -Se-, y cualquier combinación de los mismos;

[0099] cada

[0102]

[0105] es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0107] cada

[0110]

[0113] es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O)alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico; y

[0115] donde, en O y ®, cuando está presente, g<1>es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; f<2>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; g<2>es Leu, Met, Ala, His o Ser; a<3>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<3>es cualquier residuo; c'<1>es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; d'<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e'<1>es cualquier residuo; es cualquier residuo; g'<1>es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; a'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<2>es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; c'<2>es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; d'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e'<2>es cualquier residuo, donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par g-g' o e<2>-e'<2>;

[0117] o (ii) una estructura de hélice enrollada paralela de fórmula

[0118]

[0120] (vista bidimensional)

[0121] donde:

[0122] cada o y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete y hasta 21 residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde

[0123] a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

[0124] cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina;

[0125] cada ' está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos de aminoácidos, donde:

[0126] cada Enlazador E es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido e'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A;

[0127] cada Enlazador F es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido d'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

[0128] cada Enlazador G es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido a'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

[0129] cada Enlazador H es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido g'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A; y

[0130] al menos un Enlazador E o Enlazador H está presente y el o cada Enlazador E o Enlazador H se selecciona del grupo que consiste en

[0131]

[0133] donde cada

[0136]

[0138] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo enlazado;

[0139] cada Enlazador F y Enlazador G, cuando está presente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno, éteres, tioéteres, amidas, maleimidas, ésteres, disulfuros, diseleniuros, -O-, -S-, -Se-, y cualquier combinación de los mismos;

[0140] cada

[0143]

[0145] es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0146] cada

[0149]

[0151] es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O) alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico; y

[0152] donde, en O y ®, cuando está presente, fo es cualquier residuo; go es Trp, Met, Phe, Ala, Glu o His; a<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<1>es cualquier residuo; c es Gln, Trp, Leu, Phe, Tyr o Met; di es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<1>es cualquier residuo; f<1>es cualquier residuo; g<1>es

[0153] cualquier residuo; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es cualquier residuo; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val,

[0154] alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; g<'0>es cualquier

[0155] residuo; a<'1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<'1>es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; c<'1>es cualquier residuo; d<'1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<'1>es His, Phe, Trp, Tyr,

[0156] Val, Leu o Ile, e<'1>es cualquier residuo; f i es cualquier residuo; g<'1>es cualquier residuo; a<'2>es Cys, HCys, Leu,

[0157] Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<'2>Asp, Asn, Glu, Gln,

[0158] Tyr, Ser o Thr; c<'2>es cualquier residuo; d<'2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e<'2>es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; f<'2>es cualquier residuo; donde

[0159] cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por

[0160] ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-g'i.

[0162] En algunas realizaciones, al menos uno de Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F y Enlazador G, cuando está

[0163] presente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en disulfuros, diseleniuros, alquileno C<1>-<8>, alquenileno C<2>-<8>, arileno, heteroarileno, triazol-diilo y tiazol-diilo. Por ejemplo, al menos uno de Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F y Enlazador G, cuando está presente, es independientemente un enlace disulfuro de

[0164] un residuo de cisteína u homocisteína, un diseleniuro de un residuo de selenocisteína, un alquileno de un

[0165] residuo de alilglicina o un enlazador de arileno.

[0167] En algunas realizaciones, está presente un enlazador o están presentes dos enlazadores.

[0169] En algunas realizaciones,

[0171] (i) (a) está presente al menos un Enlazador A o un Enlazador D y está presente al menos un Enlazador B o un Enlazador C o (b) está presente al menos un Enlazador E o un Enlazador H y está presente al menos un Enlazador F o un Enlazador G; o

[0173] (ii) (a) está presente un Enlazador A o un Enlazador D y está presente un Enlazador B o un Enlazador C o (b)

[0174] está presente un Enlazador E o un Enlazador H y está presente un Enlazador F o un Enlazador G.

[0176] En algunas realizaciones,

[0178] (i) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula III:

[0181]

[0184] donde:

[0186] a<1>*, a<2>*, a3*, b<1>, b<2>, b3, c<1>, c<2>, c3, d<1>*, d<2>*, d3*, e<1>*, e<2>*, e3*, fi,

<1>, b<2>', b3', ci', c3', di'*, d<2>'*, d3'*, ei'*, e<2>'*, e3'*, fo', fi', f<2>', go'*, gi'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausentes residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0188]

cada uno independ

[0190] donde:

[0191] R1a, R1b, R1c, y R1d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al menos uno de R1a y R1c es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina; y

[0192] cuando un Enlazador B o un Enlazador C está unido al residuo de fórmula (a), el Enlazador B o el Enlazador C está unido a o reemplaza a uno de R1a, R1b, R1c, y R1d;

[0193] e-i*, e<2>*, e<3>*, gi*, g<2>*, e-T*, e<2>'*, e3'*, go'*, gi'*, y g<2>'* cada uno independientemente tiene la fórmula (b) y go* tiene la fórmula (b')

[0196]

[0198] donde:

[0199] R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos; y

[0200] el o cada al menos un Enlazador A o Enlazador D está unido a un residuo de fórmula (b) y el Enlazador A o Enlazador D está unido a o reemplaza uno de R2a, R2b, R2c, y R2d;

[0201] bi, b<2>, b3, ci, c<2>, c3, fi, f<2>, f<3>, bi', b<2>', b3', ci', c<2>', c3', fi', y f<2>' cada uno independientemente tiene la fórmula (c) y fo' tiene la fórmula (c')

[0204]

[0206] donde cada R3 es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5;

[0207] cada R4 es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo; y cada R5 en la Fórmula III se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -PG (donde PG es un grupo protector), un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo y un arilalquilo; o

[0208] (ii) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada paralela de Fórmula IV:

[0211]

[0213] donde:

[0215] io

[0216] ai*, a<2>*, a3*, bi, b<2>, b3, ci, C<2>, C<3>, di*, d<2>*, d3*, ei*, e<2>*, e3*, fo. fi, f<2>, go*, gi*, g<2>*, ai'*, a<2>'*, a3'*, bi', b¿, b3', ci', C<2>',

[0217] C<3>', di'*, d<2>'*, d3'*, ei'*, e<2>'*, e3'*, fo', fi', f<2>', go'*, gi'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausentes o un

[0218] residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0219]

'* cada uno independientemente tiene la fó

[0221] donde:

[0222] Ria, Rib, Ric, y Rid son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0223] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0224] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0225] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0226] menos uno de Ria y Ric es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del

[0227] grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina; y

[0228] cuando un Enlazador G o un Enlazador F está unido al residuo de fórmula (a), el Enlazador G o el Enlazador F

[0229] está unido a o reemplaza a uno de Ria, Rib, Ric, y Rid;

[0230]

cada uno independientemen

[0232] donde:

[0233] R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0234] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0235] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0236] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0237] menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos; y

[0238] el o cada al menos un Enlazador E o Enlazador H está unido a un residuo de fórmula (b) y el Enlazador E o Enlazador H está unido a o reemplaza uno de R2a, R2b, R2c, y R2d;

[0239] bi, b<2>, b3, ci, c<2>, c3, fi,

3', fi', y f<2>' cada uno independ fo' tienen la fórmula (c')

[0242]

[0244] donde cada R3 es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo,

[0245] un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral

[0246] de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5;

[0247] cada R4 es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo,

[0248] un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo; y cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en

[0249] H, -PG (donde PG es un grupo protector), un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo y un arilalquilo.

[0250] En algunas realizaciones,

[0251] (i) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula III y se cumple al

[0252] menos una de las siguientes condiciones:

[0253] i i

[0254] (A) en al menos un residuo de fórmula (a), (i) uno de R1a y R1c es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina, y (ii) R1b, R1d, y el otro R1a y R1c son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>, o un alquenilo C<2-3>;

[0255] (B) en al menos un residuo de fórmula (b), (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>; o

[0256] (ii) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada paralela de Fórmula IV y se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

[0257] (A) en al menos un residuo de fórmula (a), (i) uno de R1a y R1c es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina, y (ii) R1b, R1d, y el otro de R1a y R1e son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>, o un alquenilo C<2-3>;

[0258] (B) en al menos un residuo de fórmula (b), (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>.

[0259] En algunas realizaciones, la macroestructura comprende la estructura de hélice enrollada antiparalela.

[0260] En algunas realizaciones,

[0261] (i) la primera cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados, donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos tienen la fórmula gX1-X2-X3-X4-X5-Xa-X7-Xa-Xg-X10b, donde X<1>es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; X<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<3>es cualquier residuo; X<4>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; X<5>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X6 es cualquier residuo; X<7>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; X8 es Leu, Met, Ala, His o Ser; Xg es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; y X<10>es cualquier residuo;

[0262] (ii) la segunda cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados, donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos tienen la fórmula c'X1'-X2'-X3'-X4'-X5'-X6'-X7'-X8'-Xg'-X10e', donde X<1>' es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; X<2>' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<3>' es cualquier residuo; X<4>' es cualquier residuo; X<5>' es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; Xa' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<7>' es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; Xa' es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; Xg' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; y X<10>' es cualquier residuo;

[0263] (iii) g, b, c', y e' indican dónde aparecen los diez aminoácidos contiguos dentro de la estructura de hélice enrollada antiparalela;

[0264] (iv) los residuos en las posiciones e/e' y g/g' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador o reemplazarse con un Enlazador, si está presente; y

[0265] (v) los residuos en las posiciones a/a' y d/d' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un Enlazador, si está presente.

[0266] En algunas realizaciones, la macroestructura es

[0269]

[0271] o

[0272]

[0274] donde a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f' y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada;

[0275] E es ácido glutámico; I es isoleucina; L es leucina; H es histidina; C es cisteína; Z es el enlazador bistriazol derivado de azidolisina; R es arginina; S es serina; V es valina; y W es triptófano.

[0276] En algunas realizaciones, la macroestructura comprende la estructura de hélice enrollada paralela.

[0277] En algunas realizaciones, la macroestructura consiste en la estructura de hélice enrollada antiparalela (i) o la estructura de hélice enrollada paralela (ii).

[0278] Se divulga en el presente documento una macroestructura que comprende:

[0279] (i) una estructura de hélice enrollada antiparalela de fórmula: 15

[0282]

[0284] (vista bidimensional)

[0285] donde:

[0286] cada O y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o análogo del mismo, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde

[0287] a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f' y g' indican la ubicación de los residuos/análogos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

[0288] cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores;

[0289] cada r ! está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos/análogos de aminoácidos, donde:

[0290] cada Enlazador A es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido g'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A;

[0291] cada Enlazador B es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido d'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

[0292] cada Enlazador C es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido a'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

[0293] cada Enlazador D es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido e'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A; y

[0294] está presente al menos un Enlazador A o un Enlazador D;

[0295] cada

[0298]

[0300] es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0301] cada

[0304]

[0306] es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1>-<6>, -NHC(O)alquilo C<1>-<6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico;

[0307] o (ii) una estructura de hélice enrollada paralela de fórmula

[0308]

[0310] (vista de rueda helicoidal)

[0313]

[0315] (vista bidimensional)

[0316] donde:

[0317] cada O y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o un análogo del mismo, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f y g' indican la ubicación de los residuos/análogos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

[0318] cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores;

[0319] cada r ! está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos/análogos de aminoácidos, donde:

[0320] cada Enlazador E es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido e'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A;

[0321] cada Enlazador F es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido d'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

[0322] cada Enlazador G es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido a'*, en donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

[0323] cada Enlazador H es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido g'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A; y

[0324] está presente al menos un Enlazador E o un Enlazador H; y

[0325] cada

[0326]

[0329] es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0331] cada

[0334]

[0337] es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O)alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico.

[0339] También se divulga en este documento una hélice antiparalela enrollada de fórmula I:

[0341] go-a1-b1-c1-d1-e1-f1-g1-a2-b2-c2-d2-e2-f2-g2-a3-b3-c3-d3-e3-f3/ fo-g 'o-a'1-b'rc 'rd 're 'rfrg 'ra '2-b '2-

[0342] c'2-d'2-e'2-f'2-g'2-a'3-b'3-c'3-d'3-e'3 (I);

[0344] donde cada b1-3, c1-3, e1-3, f i<-3>, go<-2>, b'<1-3>, c'<1-3>, e'<1-3>, f'<0-2>, y g'<0-2>está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o un análogo del mismo, y cada a<1-3>, d<1-3>, a'<1-3>, y d'<1-3>, está ausente de forma independiente o es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los aminoácidos anteriores, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0345] donde uno o más de los siguientes pares están unidos covalentemente por un enlazador: go-g'<2>, g rg '<1>, g<2>-g'o. a1-d'3, a<2>-d'<2>, a3-d'1, d ra '<3>, d<2>-a'<2>, d3-a'1, e1-e'3, e<2>-e'<2>, y e3-e'1.

[0347] También se divulga en este documento una hélice antiparalela enrollada de fórmula I:

[0349] go-a1-b1-c1-d1-e1-f1-g1-a2-b2-c2-d2-e2-f2-g2-a3-b3-c3-d3-e3-f3/ fo-g'o-a'<1>- b 'r c 'r d 'r e 'r f r g 'r a '<2>-b'<2>-

[0350] c'2-d'2-e'2-f'2-g'2-a'3-b'3-c'3-d'3-e'3 (I);

[0352] donde cada b1-3, c1-3, e1-3, f<1-3>, go<-2>, b'<1-3>, c'<1-3>, e'<1-3>, f'o<-2>, y g'o<-2>está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o un análogo del mismo, y cada a<1-3>, d<1-3>, a'<1-3>, y d'<1-3>, está ausente de forma independiente o es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los aminoácidos anteriores, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0353] donde uno o más de los siguientes pares están unidos covalentemente por un enlazador: go-g'<2>, g rg '<1>, g<2>-g'o. a1-d'3, a<2>-d'<2>, a3-d'1, d ra '<3>, d<2>-a'<2>, d3-a'1, e re '<3>, e<2>-e'<2>, y e3-e'1

[0355] donde el nitrógeno terminal de cada hélice está unido covalentemente a uno o más H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0357] donde el carbonilo terminal de cada hélice está unido covalentemente a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O)alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico.

[0359] También se divulga en este documento una hélice enrollada en paralelo de fórmula II:

[0361] fo-go-arbrcrdrerfrgra2-b2-c2-d2-e2-f2-g2-a3-b3-c3-d3-e3/fo-g'o-a'rb'rc'rd're'rfrg'ra'2-b'2-c'2-d'2-e'2-f'2-g'2-a'3-b'3-c'3-d'3-e'3 (II);

[0362] donde cada bi<-3>, C<1-3>, ei-3, fo<-2>, go<-2>, b'<1-3>, c'<1-3>, e'<1-3>, f'<0-2>, y g'<0-2>está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o un análogo del mismo, y cada a i<-3>, d i<-3>, a'<1-3>, y d'<1-3>, está ausente de forma independiente o es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los aminoácidos anteriores, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0363] donde uno o más de los siguientes pares están unidos covalentemente por un enlazador: g<0>-e'<1>, g re '<2>, g<2>-e'<3>, d<1>-d'<1>, d<2>-d'<2>, d3-d'3, a ra '<1>, a<2>-a'<2>, a3-a'3, e<1>-g'<0>. e<2>-g'<1>, y e3-g'2.

[0365] También se divulga en este documento una hélice enrollada en paralelo de fórmula II:

[0367] f0-g0-a1-b1-c1-d1-e1-f1-g1-a2-b2-c2-d2-e2-f2-g2-a3-b3-c3-d3-e3/f0-g'0-a'1-b'1-c'1-d'1-e'1-f'1-g'1-a'2-b'2-c'2-d'2-e'2-f'2-g'2-a'3-b'3-c'3-d'3-e'3 (II);

[0369] donde cada b1-3, c1-3, e1-3, f<0-2>, g<0-2>, b'<1.3>, c'<1.3>, e'<1.3>, f'<0-2>, y g'<0-2>está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado o un análogo del mismo, y cada a<1-3>, d<1-3>, a'<1-3>, y d'<1-3>, está ausente de forma independiente o es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los aminoácidos anteriores, con la condición de que al menos siete residuos/análogos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0370] donde uno o más de los siguientes pares están unidos covalentemente por un enlazador: g<0>-e'<1>, g re '<2>, g<2>-e'<3>, d<1>-d'<1>, d<2>-d'<2>, d3-d'3, a ra '<1>, a<2>-a'<2>, a3-a'3, er go. e<2>-g'<1>, y e3-g'2;

[0372] donde el nitrógeno terminal de cada hélice está unido covalentemente a uno o más H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

[0374] donde el carbonilo terminal de cada hélice está unido covalentemente a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>,-NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O)alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico.

[0376] Las estructuras de hélices enrolladas antiparalelas y las estructuras de hélices enrolladas paralelas tienen cada una, una primera cadena de aminoácidos (o primera hélice) y una segunda cadena de aminoácidos (o segunda hélice). Como será fácilmente evidente para el experto en la materia, las siguientes convenciones se utilizan comúnmente para caracterizar estructuras de hélices enrolladas y se emplean en toda esta solicitud. La convención "A/B" o "xAy/x'By’" se utiliza para identificar la secuencia de cada cadena (ya sea específica o genéricamente), donde A es la secuencia (X<1>-X<2>-X<3>...) de la primera cadena, B es la secuencia (X<1>-X<2>-X<3>'...) de la segunda cadena, x, x', y e y' identifican las ubicaciones iniciales (x, x') y finales (y, y') de las secuencias correspondientes en relación con la(s) heptada(s) en cada cadena, y "/" separa una secuencia de la otra. Convencionalmente, tanto para las estructuras de hélices enrolladas paralelas como antiparalelas, las secuencias A y B se escriben, de izquierda a derecha, en una orientación de N a C. Sin embargo, como será fácilmente evidente para el experto en la materia, las cadenas en una estructura de hélice enrollada antiparalela están alineadas espacialmente en direcciones opuestas, por ejemplo, en una vista superior tomada perpendicular al eje de una hélice enrollada antiparalela, el terminal N de la primera cadena será el más alto y el terminal C de la segunda cadena será el más alto; por el contrario, como será fácilmente evidente para el experto en la materia, las cadenas en una estructura de hélice enrollada paralela están alineadas espacialmente en la misma dirección, por ejemplo, en una vista superior tomada perpendicular al eje de una hélice enrollada paralela, el terminal N de la primera cadena será el más alto y el terminal N de la segunda cadena será el más alto. Como será fácilmente evidente para el experto en la materia, en los compuestos de la presente invención y divulgación, también hay al menos un enlazador covalente entre un residuo en la primera cadena y un residuo en la segunda cadena. La ubicación y la estructura del o los enlazadores a veces se identifican utilizando "Z" y "Z'" en lugar de X y X', respectivamente, en las secuencias A y B. Alternativamente, la ubicación y la estructura del(los) enlazador(es) se identifican mediante una explicación adicional (por ejemplo, "hay un enlazador disulfuro entre el residuo Xn y el residuo Xn''').

[0378] Como será fácilmente evidente para el experto en la materia, las vistas de rueda helicoidal en este documento muestran el direccionamiento espacial de cada hélice en la estructura de hélice helicoidal antiparalela o paralela, mientras que las vistas bidimensionales muestran las conexiones entre residuos.

[0380] Tal como se utilizó anteriormente y a lo largo de la presente descripción, los términos siguientes, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que tienen los siguientes significados. A menos que se defina lo contrario en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenecen esta invención y divulgación. En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para un término en este documento, prevalecerán las de esta sección a menos que se indique lo contrario.

[0382] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alquilo" significa un grupo hidrocarburo alifático que puede ser lineal o ramificado y que tiene entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 (por ejemplo, 1-2, 1­ 3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8) átomos de carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferiores, como metilo, etilo o propilo, están unidos a una cadena de alquilo lineal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo y 3-pentilo.

[0384] El término "alquenilo" significa un grupo hidrocarburo alifático que contiene un doble enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado con aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8) átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo e ibutenilo.

[0386] El término "alquinilo" significa un grupo hidrocarburo alifático que contiene un triple enlace carbono-carbono y que puede ser lineal o ramificado con aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 2-3, 2-4, 2-5, 2­ 6, 2-7, 2-8) átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo preferidos tienen de 2 a aproximadamente 4 átomos de carbono en la cadena. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo y n-pentinilo.

[0388] Tal como se utiliza en este documento, el término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillo mono o policíclico saturado o insaturado no aromático que puede contener de 3 a 8 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 5-6, 5-7, 5-8, 6-7, 6-8, 7-8) átomos de carbono, y que puede incluir al menos un doble enlace. Los grupos cicloalquilo ejemplares incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, aní/'-biciclopropano, o s/n-biciclopropano.

[0390] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alcano" se refiere a hidrocarburos alifáticos de fórmula CnH<2>n+<2>, que puede ser lineal o ramificado y tener entre 1 y 8 (por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8) átomos de carbono en la cadena. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferiores, como metilo, etilo o propilo, están unidos a una cadena de alquilo lineal. Los alcanos ejemplares incluyen metano, etano, npropano, i-propano, n-butano, t-butano, n-pentano y 3-pentano. El término "alquileno" se refiere a un grupo divalente formado a partir de un alcano mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno. Los grupos alquileno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos divalentes derivados de los alcanos descritos anteriormente.

[0392] Como se utiliza en el presente documento, el término "alqueno" se refiere a hidrocarburos alifáticos insaturados de fórmula CnH<2>n, que puede ser lineal o ramificado y tener entre aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8) átomos de carbono en la cadena. Los alquenos ejemplares incluyen etileno, propileno, n-butileno y i-butileno. El término "alquenileno" se refiere a un grupo divalente formado a partir de un alqueno mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno. Los alquenilenos contienen un doble enlace carbono-carbono y están representados por la fórmula -(CnH<2>n-<2>)-. Los grupos alquenileno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos divalentes derivados de los alquenos descritos anteriormente.

[0394] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alquino" se refiere a hidrocarburos alifáticos insaturados de fórmula CnH<2>n-<2>, que puede ser lineal o ramificado y tener entre aproximadamente 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8) átomos de carbono en la cadena. Los alquinos ejemplares incluyen acetileno, propino, butino y pentino. El término "alquinileno" se refiere a grupos divalentes formados a partir de alquinos mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno. El alquinileno contiene un triple enlace carbono-carbono y está representado por la fórmula -(CnH<2>n-<4>)-. Los grupos alquinileno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos divalentes derivados de los alquinos descritos anteriormente.

[0396] Los anillos aromáticos y los anillos heteroaromáticos pueden ser cualquier estructura de anillo simple, múltiple o fusionada. Por ejemplo, los anillos aromáticos o heteroaromáticos incluyen anillos aromáticos o heteroaromáticos de 5 o 6 miembros que contienen de 0 a 3 (0. 1,2 o 3) heteroátomos seleccionados entre O, N y S; un sistema de anillo aromático o heteroaromático bicíclico de 9 o 10 miembros que contiene de 0 a 3 (0.

[0397] 1, 2 o 3) heteroátomos seleccionados entre O, N y S; o un sistema de anillo aromático o heteroaromático tricíclico de 13 o 14 miembros que contiene de 0-3 (0. 1, 2 o 3) heteroátomos seleccionados entre O, N y S. Los anillos carbocíclicos aromáticos de 5 a 14 miembros (5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13 o 14 miembros) incluyen, por ejemplo, ciclopenta-1,3-dieno, benceno, naftaleno, indano, tetralina y antraceno. Los anillos heterocíclicos aromáticos de 5 a 10 miembros (5, 6, 7, 8, 9 o 10 miembros) incluyen, por ejemplo, imidazol, piridina, indol, tiofeno, benzopiranona, tiazol, furano, benzimidazol, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, pirimidina, pirazina, tetrazol, pirazol, benzimidazol, piridazina, pirrol, imidazol, oxazol, isooxazol, indazol, isoindol, imidazol, purina, triazina, quinazolina, cinolina, benzoxazol, acridina, benzisooxazol y benzotiazol. El término "arileno" se refiere a un grupo divalente derivado de un anillo aromático mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de dos átomos de carbono del anillo. Los grupos arileno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos divalentes derivados de los anillos aromáticos descritos anteriormente. El término "heteroarileno" se refiere a un grupo divalente derivado de un anillo heteroaromático. Los grupos heteroarileno ejemplares incluyen, pero no se limitan a, grupos divalentes derivados de los anillos heteroaromáticos descritos anteriormente.

[0399] El término "éter" significa un grupo que tiene la fórmula -R-O-R-. Cada R puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno y heteroarileno. Los éteres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -alquileno C-i-s-O-alquileno C<1-8>(por ejemplo, -(CH<2>)<2>-O-(CH<2>)<2>-), -alquenileno C<2-8>-O-alquenileno C<2-8>, -arileno-O-arileno-, -heteroarileno-O-heteroarileno- y -alquileno C<1-8>-O-heteroarileno-.

[0401] El término "tioéter" significa un grupo que tiene la fórmula -R-S-R-. Cada R puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno y heteroarileno. Los tioéteres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -alquileno C<1-8>-S-alquileno C<1-8>- (por ejemplo, -(CH<2>)<2>-S-(CH<2>)<2>-), -alquenileno C<2-8>-S-alquenileno C<2-8>-, -arileno-S-arileno-, -heteroarileno-S-heteroarileno- y -alquileno C<1-8>-S-heteroarileno-.

[0403] El término "amida" significa un grupo que tiene la fórmula -C(O)N(R1)(R1) o -C(O)N(R1)-. Las amidas incluyen, por ejemplo, -C(O)N(R1)R-, -R-C(O)N(R1)R-, -CHR1-C(O)N(R1)R-, y -C(R1)(R1)-C(O)N(R1)R-. Cada R puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno y heteroarileno, y cada R1 puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C<1-8>, alquenilo C<2-8>, alquinilo C<2-8>, cicloalquilo C<3.8>, arilo, heteroarilo, heterociclilo y arilalquilo. Las amidas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -alquileno C<1-8>-C(O)N(arilo)-, -alquenileno C<2-8>-C(O)N(arilo)-, y -alquileno C<1-8>-C(O)N(alquilo C<1.8>)- (por ejemplo, -(CH2)2-C(O)N(Ch 3)-).

[0405] El término "éster" significa un grupo que tiene la fórmula -C(O)O-. Los ésteres incluyen, por ejemplo, -R-C(O)O-R-, -CHR1-C(O)O-R-, y -C(R1)(R1)-C(O)OR-. Cada R puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un enlace, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno y heteroarileno, y cada R1 puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C<1-8>, alquenilo C<2-8>, alquinilo C<2-8>, cicloalquilo C<3-8>, arilo, heteroarilo, heterociclilo y arilalquilo. Los ésteres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, -alquileno C<1-8>,-C(O)O-arileno, alquenileno-C<2-8>-C(O)O-arileno-, -alquileno C<1-8>-C(O)O-heteroarileno-, -alquileno C<1-8>-C(O)O-alquileno C<1.8>- (por ejemplo, -(CH<2>)<2>-C(O)O-(CH<2>)<2>-), y -alquileno C<1-8>-C(O)O- (por ejemplo, -(CH<2>)<2>-C(O)O-).

[0407] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo estable de 3 a 18 miembros (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 miembros) que consta de átomos de carbono y de uno a cinco (1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, 4-5) heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El heterociclilo puede ser un sistema de anillo monocíclico o policíclico, que puede incluir sistemas de anillo fusionado, puenteado o espiro; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el anillo puede estar parcial o totalmente saturado. Los heterociclilos monocíclicos representativos incluyen piperidina, piperazina, pirimidina, morfolina, tiomorfolina, pirrolidina, tetrahidrofurano, pirano, tetrahidropirano, oxetano y similares. Los heterociclilos policíclicos representativos incluyen indol, isoindol, indolizina, quinolina, isoquinolina, purina, carbazol, dibenzofurano, cromeno, xanteno y similares.

[0409] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico o policíclico aromático que contiene de 6 a 19 (6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 6-7, 6-8, 6-9, 6­ 10. 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 6-16, 1-17, 6-18, 7-8, 7-9, 7-10. 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 7-16, 7-18, 7-19, 8-9, 8-10. 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 9-10. 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9­ 18, 9-19, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11­ 17, 11-18, 11-19, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 16-17, 16-18, 16-19, 17-18, 17-19, 18-19) átomos de carbono, donde el sistema de anillo puede estar opcionalmente sustituido. Los grupos arilo de la presente invención y divulgación incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como fenilo, naftilo, azulenilo, fenantrenilo, antracenilo, fluorenilo, pirenilo, trifenilenilo, crisenilo y naftacenilo.

[0411] Como se utiliza en este documento, "heteroarilo" se refiere a un radical de anillo aromático que consta de átomos de carbono y de uno a cinco heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, furilo, tiofenilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, triazinilo, tienopirrolilo, furopirrolilo, indolilo, azaindolilo, isoindolilo, indolinilo, indolizinilo, indazolilo, benzimidazolilo, imidazopiridinilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzoxadiazolilo, benzotiazolilo, pirazolopiridinilo, triazolopiridinilo, tienopiridinilo, benzotiadiazolilo, benzofurilo, benzotiofenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, cinolinilo, quinazolinilo, quinolizilinilo, ftalazinilo, benzotriazinilo, cromenilo, naftiridinilo, acridinilo, fenanzinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, pteridinilo y purinilo. Se describen heteroarilos adicionales en COMPREHENSIVE HETEROCYCLIC CHEMISTRY: THE STRUCTURE, REACTIONS, SYNTHESIS AND USE OF HETEROCYCLIC COMPOUNDS (Katritzky et al. eds., 1984).

[0412] El término "arilalquilo" se refiere a una fracción de la fórmula -RaRb donde Ra es un alquilo o cicloalquilo como se definió anteriormente y Rb es un arilo o heteroarilo como se definió anteriormente.

[0414] Los compuestos descritos en este documento pueden contener uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisómeras. Cada centro quiral puede definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-. Esta tecnología pretende incluir todos estos isómeros posibles, así como sus mezclas, incluidas las formas racémicas y ópticamente puras. Los isómeros ópticamente activos (R) y (S), (-) y (+) o (D) y (L) pueden prepararse utilizando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse utilizando técnicas convencionales. Cuando los compuestos descritos en este documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos incluyan isómeros geométricos tanto E como Z. Asimismo, también se pretende incluir todas las formas tautoméricas.

[0416] El término "carbociclo monocíclico" significa un sistema de anillo monocíclico de 5 a aproximadamente 8 (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 5-6, 5-7, 6-7, 6-8, 7-8) átomos de carbono del anillo, preferiblemente 5 o 6. El anillo no es aromático, pero puede contener uno o más enlaces dobles carbono-carbono. El término "carbociclo monocíclico" también incluye grupos divalentes derivados de un sistema de anillo monocíclico. Los carbociclos monocíclicos representativos incluyen grupos divalentes derivados de ciclopentano, ciclohexano, ciclopenteno, ciclohexeno y similares.

[0418] El término "carbociclo bicíclico fusionado" significa un sistema de anillo bicíclico que consta de aproximadamente 8 a 11 (por ejemplo, 8, 9, 10. 11, 8-9, 8-10. 9-10. 9-11, 10-11) átomos de carbono del anillo, preferiblemente 9 o 10. Uno o ambos anillos son aromáticos. El término "carbociclo bicíclico fusionado" también abarca grupos divalentes derivados de un sistema de anillo bicíclico. Los carbociclos monocíclicos representativos incluyen grupos divalentes derivados de dihidronaftaleno, tetrahidronaftaleno, tetrahidrobenzoanuleno y similares.

[0420] El término "heterociclo no aromático" significa un sistema monocíclico no aromático que contiene de 3 a 10 átomos (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10. 5-6, 5-7, 5­ 8, 5-9, 5-10. 6-7, 6-8, 6-9, 6-10. 7-8, 7-9, 7-10. 8-9, 8-10. 9-10), preferiblemente de 4 a aproximadamente 7 átomos de carbono, en los que uno o más de los átomos del sistema de anillo es/son elemento(s) distinto(s) del carbono, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno o azufre. El término "heterociclo no aromático" también incluye grupos divalentes derivados de anillos heterocíclicos no aromáticos. Los grupos heterocíclicos no aromáticos representativos incluyen grupos divalentes derivados de pirrolidina, 2-oxopirrolidina, piperidina, 2-oxopiperidina, azepano, 2-oxoazepano, 2-oxooxazolidina, morfolina, 3-oxomorfolina, tiomorfolina, 1,1-dioxotiomorfolina, piperazina, tetrohidro-2H-oxazina y similares.

[0422] El término "monocíclico" utilizado en este documento indica una estructura molecular que tiene un anillo.

[0423] El término "policíclico" o "multicíclico" utilizado en este documento indica una estructura molecular que tiene dos o más anillos, incluidos, pero sin limitarse a, anillos fusionados, puenteados o espiro.

[0425] El término "opcionalmente sustituido" se utiliza para indicar que un grupo puede tener un sustituyente en cada átomo sustituible del grupo (incluido más de un sustituyente en un solo átomo), siempre que no se exceda la valencia normal del átomo designado y la identidad de cada sustituyente sea independiente de los demás. Hasta tres átomos de H en cada residuo se reemplazan con alquilo, halógeno, haloalquilo, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi, carboalcoxi (también conocido como alcoxicarbonilo), carboxamido (también conocido como alquilaminocarbonilo), ciano, carbonilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, mercapto, alquiltio, sulfóxido, sulfona, acilamino, amidino, fenilo, bencilo, heteroarilo, fenoxi, benciloxi o heteroariloxi. Los átomos "no sustituidos" portan todos los átomos de hidrógeno dictados por su valencia. Cuando un sustituyente es ceto (es decir, =0), entonces se reemplazan dos hidrógenos en el átomo. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables sólo son permisibles si dichas combinaciones dan como resultado compuestos estables; por "compuesto estable" o "estructura estable" se entiende un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción y a la formulación en un agente terapéutico eficaz.

[0427] El término "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.

[0429] Un "péptido", como se utiliza en este documento, es cualquier oligómero de dos o más aminoácidos naturales o no naturales, incluidos los aminoácidos alfa, los aminoácidos beta, los aminoácidos gamma, los L-aminoácidos, los D-aminoácidos y combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas, el péptido es de ~2 a ~30 (por ejemplo, ~2 a ~5, ~2 a ~10. ~5 a ~10. ~2 a ~17, ~5 a ~17, ~10 a ~17, ~5 a ~30. ~10 a ~30 o ~18 a ~30) aminoácidos de longitud. Normalmente, el péptido tiene una longitud de 10-17 aminoácidos. En al menos una realización, el péptido contiene una mezcla de aminoácidos alfa y beta, preferiblemente en el patrón a3/p1.

[0430] Un aminoácido, tal como se utiliza en este documento, puede ser cualquier aminoácido natural o no natural, incluidos los aminoácidos alfa, aminoácidos beta, aminoácidos gamma, L-aminoácidos y D-aminoácidos. Las cadenas laterales de aminoácidos pueden ser cualquier cadena lateral de dicho aminoácido.

[0431] Un aminoácido como se utiliza en este documento también incluye un análogo de un aminoácido natural o no natural. Un análogo de aminoácido es un aminoácido alfa con una cadena lateral no natural que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, cicloarilo, alquenilo o alquinilo; o un aminoácido beta3 con una cadena lateral que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, cicloarilo, alquenilo o alquinilo. Tal como se utiliza en el presente documento, un análogo de aminoácido también se refiere a un aminoácido natural o no natural que puede ser sustituido por un residuo de aminoácido en la hélice enrollada sin pérdida de función en relación con la secuencia de hélice enrollada nativa. Los análogos/sustituciones de aminoácidos adecuados incluyen las sustituciones de aminoácidos naturales descritas en Betts y Russell, "Amino Acid Properties and Consequences of Substitutions", en Bioinformatics for Geneticists 289-316 (Michael R. Barnes & Ian C. Gray eds. 2003), así como las sustituciones no naturales que se exponen a continuación (todas disponibles en Sigma Aldrich) y las sustituciones no naturales descritas en Gfeller et al., "SwissSidechain: A Molecular and Structural Database of Non-Natural Sidechains," Nucl. Acids Res. 41: D327-D332 (2013). Como comprenderá el experto en la materia, los análogos en la tabla a continuación que figuran como que tienen un grupo protector en el terminal N y/o C se desprotegerían durante la conjugación con un residuo adyacente.

[0432]

[0433]

[0436] 

[0439] 

[0442] Los ejemplos no limitantes de sustituciones de ciertos residuos de aminoácidos incluyen, sin limitación, los que

[0443] se muestran a continuación.

[0446]

[0449] Los aminoácidos presentes en este documento también pueden modificarse opcionalmente. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, la fosforilación (por ejemplo, fosfoserina, fosfotirosina, fosfotreonina), halogenación (especialmente con 3-9 halógenos) (preferiblemente con flúor, por ejemplo, hexafluoroleucina, hexafluorovalina), metilación (por ejemplo, éster metílico del ácido aspártico, éster metílico del ácido glutámico, metillisina, dimetillisina, trimetillisina, dimetilarginina, metilarginina, metiltriptófano) y acetilación (por ejemplo, acetillisina).

[0451] Como será evidente para el experto en la materia, los enlazadores descritos en este documento crean un

[0452] puente covalente entre un residuo/análogo de aminoácido en una hélice de la estructura de hélice enrollada y

[0453] un residuo/análogo de aminoácido en la otra hélice de la estructura de hélice enrollada. Como será evidente

[0454] para el experto en la materia, en las macromoléculas de la presente divulgación, se puede utilizar prácticamente

[0455] cualquier enlazador covalente, siempre que se mantenga la distancia espacial adecuada entre los dos residuos enlazados. La distancia espacial, como se utiliza en este documento, se refiere a la distancia de los átomos en

[0456] la estructura de hélice enrollada cuando está en su estado sólido, determinada utilizando un programa de modelado molecular estático (por ejemplo, UCSF Chimera) y/o evaluando la estructura cristalina del macrociclo.

[0457] Para los enlazadores entre los residuos g o e y g' o e' (Enlazador A, Enlazador D, Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para g<0>-g'<2>, g rg '<1>, g<2>-g'<0>. e-i-e'<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e'<1>en la Fórmula I, y enlazadores para gü-e'-i, g-i-e'<2>, g<2>-e'<3>, ei-g'o e<2>-g'i, y e<3>-g'<2>en la Fórmula II) la distancia espacial apropiada es 10-25 A (10-11, 10-12, 10-13, 10­

[0458] 14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20. 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11­

[0459] 17, 11-18, 11-19, 11-20. 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12­

[0460] 20. 12-21, 12-22, 12-23, 12-24, 12-25, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20. 13-21, 13-22, 13-23,

[0461] 13-24, 13-25, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20. 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 15-16, 15-17, 15­

[0462] 18, 15-19, 15-20. 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20. 16-21, 16-22, 16-23, 16-24,

[0463] 16-25, 17-18, 17-19, 17-20. 17-21, 17-22, 17-23, 17-24, 17-25, 18-19, 18-20. 18-21, 18-22, 18-23, 18-24, 18­

[0464] 25, 19-20. 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 21-22, 21-23, 21-24, 21-25,

[0465] 22-23, 22-24, 22-25, 23-24, 23-25 o 24-25 A). En al menos una realización, la distancia espacial es de 11-17

[0466] A. En al menos una realización, la distancia espacial es de 15-20 A. Para los enlazadores entre los residuos a

[0467] o d y a' o d' (Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F, Enlazador G, enlazadores para a<1>-d'<3>, a<2>-d'<2>, a<3>-d'<1>, d<1>-a'<3>,

[0468] d<2>-a'<2>, y d<3>-a'<1>en la Fórmula I, y enlazadores para d<1>-d'<1>, d<2>-d'<2>, d<3>-d'<3>, a ra '<1>, a<2>-a'<2>, y a<3>-a'<3>en la Fórmula II) la

[0469] distancia espacial apropiada es 5-15 A (5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10. 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10. 6-11,

[0470] 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 7-8, 7-9, 7-10. 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 8-9, 8-10. 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 9-10.

[0471] 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 12-13, 12-14, 12­

[0472] 15, 13-14, 13-15 o 14-15 A). En al menos una realización, la distancia espacial es de 6-8 A. En al menos una realización, la distancia espacial es de 5-10 A. Los métodos para modificar residuos de aminoácidos para

[0473] facilitar la unión de un Enlazador Adecuado (incluyendo el reemplazo de una cadena lateral de aminoácido con

[0474] el enlazador) también serán evidentes para el experto en la materia.

[0476] En una realización preferida de la presente divulgación, los dos aminoácidos/análogos pueden estar conectados covalentemente entre sí usando alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno, éteres, tioéteres,

[0477] amidas, maleimidas, ésteres, disulfuros, diseleniuros, -O-, -S-, -Se- y cualquier combinación de los mismos.

[0478] Como será evidente para el experto en la materia, los enlazadores pueden ser simétricos o asimétricos.

[0480] En las macromoléculas de la presente divulgación, se proporcionan ejemplos adecuados de enlazadores entre

[0481] los residuos g o e y g' o e' (Enlazador A, Enlazador D, Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para g<0>-g'<2>, g<1>-g'<1>, g<2>-g'<0>. e<1>-e'<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e'<1>en la Fórmula I, y enlazadores para g<0>-e'<1>, g re '<2>, g2-e'3, e rg '<0>. e<2>-g'<1>, y e la Fórmula II) incluyen, sin limitación, aquellos que tienen la fórmula -Zn-, donde n es un número de 1 a 25 (1,

[0482] 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. 21, 22, 23, 24, 25, o cualquier intervalo entre 1 y

[0483] 25, incluyendo, por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10. 1-11, 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17,

[0484] 1-18, 1-19, 1-20. 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10. 2-11, 2-12, 2-13, 2-14, 2

[0485] 15, 2-16, 2-17, 2-18, 2-19, 2-20. 2-21,2-22, 2-23, 2-24, 2-25, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10. 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20. 3-21, 3-22, 3-23, 324, 3-25, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10. 4-11, 4-12, 4­<1 3>,<4>-<1 4>,<4>-<1 5>,<4>-<1 6>, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20. 4-21,4-22, 4-23, 4-24, 4-25, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10. 5-11, 5-12, 5­ 13, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17, 5-18, 5-19, 5-20. 5-21, 5-22, 5-23, 5-24, 5-25, 6-10. 6-15, 6-20. 6-25, 7-10. 7-15, 7­ 20. 7-25, 8-10. 8-15, 8-20. 8-25, 9-10. 9-15, 9-20. 9-25, 10-15, 10-20. 10-25, 11-15, 11-20. 11-25, 12-15, 12-20.

[0486] 12-25, 13-15, 13-20. 13-25, 14-15, 14-20. 14-25, 15-20. 15-25, 16-20. 16-25, 17-20. 17-25, 18-20. 18-25, 19­ 20. 19-25, 20-25, 21-25, 22-25, 23-25, 24-25; en al menos una realización, n es 5-25) y cada Z se selecciona independientemente en cada aparición del mismo del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno (especialmente, triazol-diilo, tiazol-diilo, oxazol-diilo), éteres, amidas, ésteres, maleimidas, tioéteres, O, S y Se. Algunos ejemplos preferidos de enlazadores simétricos incluyen, sin limitación,

[0488]

[0491] en donde cada

[0494]

[0497] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo/análogo enlazado. En al menos una realización, el enlazador entre los residuos g o e y g' o e' (Enlazador A, Enlazador D, Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para g<0>-g'<2>, g-i-g'-i, g<2>-g'<0>. e<1>-e'<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e<'1>en la Fórmula I, y enlazadores para gü-e'-i, g-i-e'<2>, g<2>-e'<3>, e<1>-g'ü. e<2>-g'<1>, y e<3>-g<'2>en la Fórmula II) tiene la siguiente fórmula

[0500]

[0503] o

[0504]

[0507] donde X es O, S, CR<2>, NR o P (preferiblemente O, S, CH<2>o NR), donde X1 es O, S, NH y NR, donde cada R es independientemente H, alquilo o arilo, donde Y es S, y

[0509] en donde cada

[0512]

[0515] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo/análogo enlazado.

[0517] En al menos una realización, el enlazador entre los residuos g o e y g' o e' (Enlazador A, Enlazador D, Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para go-g'<2>, gi-g'i, g<2>-g'o. ei-e'<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e'i en la Fórmula I, y enlazadores para go-e'i, gi-e'<2>, g2-e'3, ei-g'o. e<2>-g'i, y e<3>-g'<2>en la Fórmula II) tiene la fórmula

[0520]

[0523] donde:

[0525] Qi es un alquileno C<1-8>o una fracción de fórmula (alquileno Ci-8-X-alquileno Co-8)ni

[0527] Q<2>es alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno, una fracción de fórmula alquileno Ci-8-X-alquileno C<1-8>o una fracción de fórmula -Q<4>-Q<5>-Q<6>-; donde cada alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno pueden estar opcionalmente sustituidos de 1 a 4 (1, 2, 3 o 4) veces con sustituyentes seleccionados independientemente en cada aparición de los mismos del grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C<1-8>, =C(O), NHR, N(R)<2>, OR y SR;

[0529] Q<3>es un alquileno C<1-8>o una fracción de fórmula (alquileno Ci-8-X-alquileno Co-8)n;

[0531] Q<4>se selecciona del grupo que consiste en O, -C(O)-NR-, -NR-C(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(O)-S-, -SC(O)-, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno, donde cada alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno pueden estar opcionalmente sustituidos de 1 a 4 (1, 2, 3 o 4) veces con sustituyentes seleccionados independientemente en cada aparición de los mismos del grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C<1-8>, =C(O), NHR, N(R)<2>, OR y SR;

[0533] Q<5>se selecciona del grupo que consiste en -C(O)-NR-, -NR-C(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(O)-S-, -SC(O)-, alquileno C<1-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno, o es una fracción de fórmula alquileno C<1-8>-(X-alquileno C<1-8>)n, donde cada uno de alquileno C<1-8>alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno pueden estar opcionalmente sustituidos de 1 a 4 (1, 2, 3 o 4) veces con sustituyentes seleccionados independientemente en cada aparición de los mismos del grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C<1-8>, =C(O), NHR, N(R)<2>, OR y SR;

[0535] Q6 se selecciona del grupo que consiste en O, -C(O)-NR-, -NR-C(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-, -C(O)-S-, -SC(O)-, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno, donde cada alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, alquinileno C<2-8>, carbociclo monocíclico, carbociclo bicíclico fusionado, heterociclo no aromático, arileno y heteroarileno pueden estar opcionalmente sustituidos de 1 a 4 (1, 2, 3 o 4) veces con sustituyentes seleccionados independientemente en cada aparición de los mismos del grupo que consiste en H, halógeno, alquilo C<1-8>, =C(O), NHR, N(R)<2>, OR y SR;

[0537] cada X se selecciona del grupo que consiste en O, S, CR<2>, NR, P, alquinileno C<2-8>, arileno y heteroarileno (preferiblemente O, S, CH<2>,<n>R, o CR<e>CR);

[0539] cada R es independientemente H, alquilo C<1-8>o arilo;

[0541] n es 1 a 1o; y

[0543] cada

[0544]

[0547] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo/análogo enlazado.

[0549] En al menos una realización, el enlazador entre los residuos g o e y g' o e' (Enlazador A, Enlazador D, Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para g<0>-g'<2>, g rg '<1>, g<2>-g'<0>. e<1>-e'<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e<'1>en la Fórmula I, y enlazadores para g<0>-e'<1>, g<1>-e'<2>, g2-e'3, e<1>-g'<0>. e<2>-g'<1>, y e<3>-g<'2>en la Fórmula II) tiene la siguiente fórmula

[0551]

[0554] donde X es O, S, CR<2>, NR o P (preferiblemente O, S, CH<2>o NR), donde X1 es O, S, C, CR, N, NH y NR, donde cada R es independientemente H, alquilo o arilo, donde Y es S, y donde cada

[0557]

[0560] marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo/análogo enlazado.

[0562] Ejemplos preferidos de enlazadores entre los residuos a o d y a' o d' (Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F, Enlazador G, enlazadores para a rd '<3>, a<2>-d'<2>, a<3>-d'<1>, d ra '<3>, d<2>-a'<2>, y d<3>-a'<1>en la Fórmula I, y enlazadores para d<1>-d'<1>, d<2>-d'<2>, d<3>-d'<3>, a ra '<1>, a<2>-a'<2>, y a<3>-a'<3>en la Fórmula II) incluyen disulfuros, diseleniuros, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno y heteroarileno (especialmente, triazol-diilo y tiazol-diilo). En una realización preferida, los enlazadores entre los residuos a o d y a' o d' (Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F, Enlazador G, enlazadores para a rd '<3>, a<2>-d'<2>, a<3>-d'<1>, d ra '<3>, d<2>-a'<2>, y d<3>-a'<1>en la Fórmula I, y enlazadores para d rd '<1>, d<2>-d'<2>, d3-d'<3>, a<1>-a'<1>, a<2>-a'<2>, y a<3>-a'<3>en la Fórmula II) son un enlace disulfuro de cisteína/homocisteína, un diseleniuro de selenocisteína, un alquileno de alilglicina o un enlazador arileno.

[0564] Como será evidente para el experto en la materia, las estructuras de hélices enrolladas antiparalelas y las estructuras de hélices enrolladas paralelas de acuerdo con la presente divulgación pueden contener cada una desde solo uno de los enlazadores hasta todos los enlazadores. En al menos una realización preferida, sólo está presente un enlazador. En al menos una realización preferida, sólo están presentes dos enlazadores. En al menos una realización preferida de las estructuras de hélices enrolladas antiparalelas, al menos un enlazador entre un par g-g' o entre un par e-e' (Enlazador A, Enlazador D, enlazadores para g<0>-g'<2>, g rg '<1>, g<2>-g'<0>. e re '<3>, e<2>-e'<2>, y e<3>-e'<1>en la Fórmula I) está presente y al menos un enlazador entre un par ad' o un par da' (Enlazador B, Enlazador C, enlazadores para a rd '<3>, a<2>-d'<2>, a<3>-d'<1>, d ra '<3>, d<2>-a'<2>, y d<3>-a'<1>en la Fórmula I) está presente. En al menos una realización preferida de las estructuras de hélices enrolladas antiparalelas, está presente un enlazador entre un par g-g' o entre un par e-e' y está presente un enlazador entre un par a-d' o un par d-a'. En al menos una realización preferida de las estructuras de hélices enrolladas paralelas, se utiliza al menos un enlazador entre un par g-e' o entre un par e-g' (Enlazador E, Enlazador H, enlazadores para g<0>-e'<1>, g re '<2>, g<2>-e'<3>, e<1>-g'<0>. e<2>-g'<1>, y e<3>-g'<2>en la Fórmula II) está presente y al menos un enlazador entre un par dd' o entre un par aa' (Enlazador F, Enlazador G, enlazadores para d rd '<1>, d<2>-d'<2>, d3-d'3, a ra '<1>, a<2>-a'<2>, y a<3>-a'<3>en la Fórmula II) está presente. En al menos una realización preferida de las estructuras de hélices enrolladas paralelas, está presente un enlazador entre un par g-e' o entre un par e-g' y está presente un enlazador entre un par d-d' o entre un par a-a'. Normalmente, las estructuras de hélice enrollada contendrán la cantidad mínima de enlazadores necesarios para estabilizar la hélice enrollada. Este número variará dependiendo de la estabilidad general de la hélice enrollada nativa, como será evidente para el experto en la materia. En una realización preferida, solo está presente un enlazador. En otra realización preferida, sólo están presentes dos enlazadores.

[0565] Los grupos protectores funcionan principalmente para proteger o enmascarar la reactividad de los grupos funcionales. Los grupos protectores que son adecuados para la protección de un grupo amina son bien conocidos en la técnica, incluidos, pero sin limitarse a, carbamatos, amidas, n-alquilo y n-aril aminas, derivados de imina, derivados de enamina y derivados de W-heteroátomos como se describe en THEODORA W. GREENE & PETER G.M. WUTS, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 494-615 (1999). Los grupos protectores adecuados de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención y divulgación incluyen, por ejemplo, terc-butiloxicarbonilo ("Boc"), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo ("Fmoc"), carbobenciloxi ("Cbz") y tritilo. También son bien conocidos en la técnica los grupos protectores que son adecuados para la protección de un alcohol. Los grupos protectores de alcohol adecuados incluyen, sin limitación, éteres de sililo, ésteres y éteres de alquilo/arilo. Los grupos protectores que son adecuados para la protección de un grupo tiol también son bien conocidos en la técnica. Los grupos protectores de tiol adecuados incluyen, sin limitación, éteres de arilo/alquil tio y disulfuros. Como será evidente para aquellos con conocimientos ordinarios en la materia, las cadenas laterales de aminoácidos de Asn, Asp, Gln, Glu, Cys, Ser, His, Lys, Arg, Trp o Thr normalmente necesitarán ser protegidas mientras se llevan a cabo los métodos descritos en este documento. Los grupos protectores que son adecuados para proteger estas cadenas laterales de aminoácidos también son bien conocidos en la técnica. Los métodos de protección y desprotección de grupos funcionales varían dependiendo del grupo protector elegido; sin embargo, estos métodos son bien conocidos en la técnica y se divulgan en THEODORA W. GREENE Y PETER G.M. WUTS, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 372-450 y 494-615 (1999).

[0567] Una "etiqueta", como se utiliza en este documento, incluye cualquier fracción de etiquetado que facilite la detección, cuantificación, separación y/o purificación de los compuestos de la presente invención y divulgación. Las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas de purificación, etiquetas radiactivas o fluorescentes y etiquetas enzimáticas.

[0569] Etiquetas de purificación, como la polihistidina (Hisa.), una glutatión-S-transferasa (GST-), o proteína de unión a maltosa (MBP-), puede ayudar en la purificación o separación de compuestos, pero puede eliminarse posteriormente, es decir, escindidas del compuesto después de la recuperación. Se pueden utilizar sitios de escisión específicos de la proteasa para facilitar la eliminación de la etiqueta de purificación. El producto deseado se puede purificar aún más para eliminar las etiquetas de purificación escindidas.

[0571] Otras etiquetas adecuadas incluyen etiquetas radiactivas, como, 125I, 131I, 111In, o 99TC. Los métodos de radiomarcaje de compuestos son conocidos en la técnica y se divulgan en la patente de los Estados Unidos No. 5,830.431 de Srinivasan et al. La radiactividad se detecta y cuantifica utilizando un contador de centelleo o autorradiografía. Alternativamente, el compuesto se puede conjugar con una etiqueta fluorescente. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, sin limitación, quelatos (quelatos de europio), fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lisamina, ficoeritrina y Texas Red. Las etiquetas fluorescentes se pueden conjugar con los compuestos utilizando técnicas divulgadas en CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligen et al. eds., 1991). La fluorescencia se puede detectar y cuantificar utilizando un fluorómetro.

[0573] Las etiquetas enzimáticas generalmente catalizan una alteración química de un sustrato cromogénico que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Los ejemplos de etiquetas enzimáticas adecuadas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,737,456 de Weng et al.), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (por ejemplo, uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con proteínas y péptidos se divulgan en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, en METHODS IN ENZYMOLOGY 147-66 (Langone et al. eds., 1981).

[0575] Una fracción de direccionamiento de acuerdo con la presente invención y divulgación funciona para (i) dirigir la captación celular del compuesto, (ii) dirigir el compuesto a un tipo particular de célula o tejido (por ejemplo, secuencia de péptidos de señalización), o (iii) dirigir el compuesto a una localización subcelular específica después de la captación celular (por ejemplo, secuencia de péptido de transporte).

[0577] Para dirigir la captación celular de un compuesto de la presente invención o divulgación, la fracción de direccionamiento puede ser un péptido penetrante celular (CPP). Los CPP se translocan a través de la membrana plasmática de las células eucariotas mediante una vía aparentemente independiente de la energía y se han utilizado con éxito para la administración intracelular de macromoléculas, incluidos anticuerpos, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos, con pesos moleculares varias veces mayores que los suyos. Varios CPP de uso común, incluidos las poliargininas, el transportador, la protamina, la maurocalcina y el M918, son fracciones de direccionamiento adecuadas para su uso en la presente invención y divulgación y son bien conocidas en la técnica (véase, Stewart et al., "Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vehicles for Biology and Medicine", Organic Biomolecular Chem. 6: 2242-55 (2008)). Además, se divulgan métodos para fabricar CPP en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20080234183 de Hallbrink et al.

[0578] Otra fracción de direccionamiento adecuada, útil para mejorar la captación celular de un compuesto, es un péptido señal "competente para la importación", como se divulga en la patente de los Estados Unidos No.

[0579] 6,043,339 de Lin et al. un péptido señal competente para la importación generalmente tiene una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 residuos de aminoácidos (normalmente residuos hidrófobos) que hacen que el compuesto sea capaz de penetrar a través de la membrana celular desde el exterior de la célula hasta el interior de la misma. Un péptido señal competente para la importación ejemplar incluye el péptido señal del factor de crecimiento de fibroblastos de Kaposi (véase patente de Estados Unidos No. 6,043,339 de Lin et al.). Se pueden seleccionar otras secuencias de péptidos adecuadas de la base de datos SIGPEP (véase von Heijne G., "SIGPEP: Sequence Database for Secretory Signal Peptides," Protein Seq. Data Anal. 1(1): 41-42 (1987)).

[0581] Otra fracción de direccionamiento adecuada es una secuencia de péptido señal capaz de dirigir los compuestos de la presente invención y divulgación a un tejido o tipo de célula particular. El péptido de señalización puede incluir al menos una porción de una proteína de unión a ligando. Las proteínas de unión a ligando adecuadas incluyen fragmentos de anticuerpos de alta afinidad (por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')<2>, fragmentos de anticuerpos Fv de cadena sencilla), nanocuerpos o fragmentos de nanocuerpos, fluorocuerpos o aptámeros. Otras proteínas de unión a ligandos incluyen proteínas de unión a biotina, proteínas de unión a lípidos, proteínas de unión periplásmicas, lectinas, albúminas séricas, enzimas, proteínas de unión a fosfato y sulfato, inmunofilinas, metalotioneína o varias otras proteínas receptoras. Para el direccionamiento específico de la célula, el péptido de señalización es preferiblemente un dominio de unión de ligando de un receptor de membrana específico de la célula. Por lo tanto, cuando el compuesto modificado se administra por vía intravenosa o se introduce de otro modo en la sangre o la linfa, el compuesto se adsorberá a la célula objetivo y la célula objetivo internalizará el compuesto. Por ejemplo, si la célula objetivo es una célula cancerosa, el compuesto puede conjugarse con un anticuerpo anti-C3B(I) como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 6,572,856 de Taylor et al. Alternativamente, el compuesto puede conjugarse con un receptor de proteína alfa-feto como se divulga en la patente de Estados Unidos No. 6,514,685 de Moro, o a un anticuerpo monoclonal GAH como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 5,837,845 de Hosokawa. Para dirigir un compuesto a una célula cardíaca, el compuesto puede conjugarse con un anticuerpo que reconoce la interfaz de microfibrillas de elastina (EMILIN2) (Van Hoof et al., "Identification of Cell Surface for Antibody-Based Selection of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes," J. Proteom. Res. 9: 1610-18 (2010)), troponina cardíaca I, conexina-43 o cualquier receptor de membrana de superficie celular cardíaca que sea conocida en la técnica. Para dirigir un compuesto a una célula hepática, el péptido de señalización puede incluir un dominio de ligando específico para el receptor de asialoglicoproteína específico del hepatocito. Los métodos para preparar dichas proteínas y péptidos quiméricos se divulgan en la patente de los Estados Unidos No. 5,817,789 de Heartlein, et al.

[0582] Otra fracción de direccionamiento adecuada es un péptido de transporte que dirige la compartimentación intracelular del compuesto una vez que es internalizado por una célula o tejido objetivo. Para el transporte al retículo endoplásmico (ER), por ejemplo, el compuesto se puede conjugar con una secuencia de péptido de transporte del ER. En la técnica se conocen varios de estos péptidos señal, incluido el péptido señal MMSFVSLLLVGILFYATEAEQLTKCEVFQ (SEQ ID NO: 16). Otros péptidos señal de ER adecuados incluyen la secuencia dirigida al retículo endoplásmico del terminal N de la enzima 17p-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 11 (Horiguchi et al., "Identification and Characterization of the ER/Lipid Droplet-Targeting Sequence in 17phydroxysteroid Dehydrogenase Type 11," Arch. Biochem. Biophys. 479(2): 121-30 (2008)), o cualquiera de los péptidos de señalización del ER (incluidas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los péptidos señal del ER) divulgados en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20080250515 de Reed et al. Además, los compuestos pueden contener una señal de retención del ER, como la señal de retención KEDL (SEQ ID NO: 17). Los métodos para modificar los compuestos de la presente invención y divulgación para incorporar péptidos de transporte para la localización de los compuestos al ER se pueden llevar a cabo como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No.

[0583] 20080250515 de Reed et al. Para el transporte al núcleo, los compuestos de la presente invención y divulgación pueden incluir una señal de transporte de localización nuclear. En la técnica se conocen secuencias de péptidos de transporte nuclear adecuadas, incluido el péptido de transporte nuclear PPKKKRKV (SEQ ID NO: 18). Otras señales de transporte de localización nuclear incluyen, por ejemplo, la secuencia de localización nuclear del factor de crecimiento de fibroblastos ácido y la secuencia de localización nuclear del factor de transcripción NF-KB p50 como se divulga en la patente de los Estados Unidos No. 6,043,339 de Lin et al. Otras secuencias de péptidos de localización nuclear conocidas en la técnica también son adecuadas para su uso en los compuestos de la presente invención y divulgación.

[0585] Las secuencias de péptidos de transporte adecuadas para el direccionamiento a las mitocondrias incluyen MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL<( S e q>ID NO: 19). Otras secuencias de péptidos de transporte adecuadas para dirigir selectivamente los compuestos de la presente invención y divulgación a las mitocondrias se divulgan en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20070161544 de Wipf.

[0587] En una realización preferida de los compuestos de la presente divulgación, la estructura de hélice enrollada antiparalela es una hélice enrollada antiparalela de Fórmula III:

[0588]

[0590] donde:

[0591] * representa el residuo al que se puede unir un enlazador opcional;

[0592] ai*, a<2>*, a3*, bi, b<2>, b3, ci, C<2>, C<3>, di*, d<2>*, d3*, ei*, e<2>*, e3*, fi, f<2>, f3, go*, gi*, g<2>*, ai'*, a<2>'*, a3'*, bi', b<2>', b3', ci', C<2>',

[0593] C<3>', di'*, d<2>'*, d3'*, ei'*, e<2>'*, e3'*, fo', fi', f<2>', go'*, gi'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausente o un

[0594] residuo de aminoácido modificado o no modificado o análogo del mismo, con la condición de que al menos

[0595] siete residuos de aminoácidos/análogos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0596] ai*, a<2>*, a<3>*, di*, d<2>*, d<3>*, ai'*, a<2>'*, a3'*, di'*, d<2>'*, y d<3>'* cada uno independientemente tiene la fórmula (a)

[0599]

[0601] ei*, e<2>*, e<3>*, gi*, g<2>*, ei'*, e<2>'*, e3'*, go'*, gi'*, y g<2>'* cada uno independientemente tiene la fórmula (b) y go* tiene

[0602] la fórmula (b')

[0605]

[0607] y

[0608] bi, b<2>, b3, ci,

fi,

, y f<2>' c fo' tiene la fórmula (c')

[0611]

[0613] Cada R4 en la Fórmula III es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo. Preferiblemente, R4 es hidrógeno.

[0614] En cada residuo de fórmula (a):

[0615] Ria, Rib, Ric, y Rid son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0616] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0617] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0618] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0619] menos uno de R ia y Ric es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del

[0620] grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores. Cuando un Enlazador

[0621] B o un Enlazador C está unido a un residuo de fórmula (a), el Enlazador B o el Enlazador C está unido a o

[0622] reemplaza a uno de Ria, Rib, Ric, y Rid.

[0623] En una realización preferida, (i) uno de Ria y Ric es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores, y (ii) R1b, R1d, y el otro de R1a y R1c son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>(preferiblemente metilo o etilo), o un alquenilo C<2-3>(preferiblemente etenilo).

[0625] En cada residuo de fórmula (b):

[0627] R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0628] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0629] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0630] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0631] menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos. Cuando un Enlazador A o un Enlazador D está

[0632] unido a un residuo de fórmula (b), el Enlazador A o el Enlazador D está unido a o reemplaza a uno de R2a, R2b,

[0633] R2c, y R2d.

[0635] En una realización preferida, (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro

[0636] de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>(por ejemplo, metilo, etilo).

[0638] En cada residuo de fórmula (c):

[0640] cada R<3>es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo, un

[0641] alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5. En al menos una realización, al menos un R<3>es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado.

[0643] En una realización preferida, los residuos de fórmula (c) se seleccionan para facilitar el reconocimiento molecular de un objetivo por la estructura de hélice enrollada.

[0645] Cada R<5>en la Fórmula III se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -PG (donde PG es

[0646] un grupo protector), un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo

[0647] y un arilalquilo.

[0649] En una realización preferida de los compuestos de la presente divulgación, la estructura de hélice enrollada

[0650] paralela es una hélice enrollada paralela de Fórmula IV:

[0653]

[0656] donde:

[0658] * representa el residuo al que se puede unir un enlazador opcional;

[0660] a<1>*, a<2>*, a3*, b<1>, b<2>, b3, c<1>, c<2>, c3, d<1>*, d<2>*, d3*, e<1>*, e<2>*, e3*, f0. f<1>, f<2>, g<0>*, g<1>*, g<2>*, aV*, a<2>'*, a3'*, bV, b<2>', b3', cV, c<2>',

[0661] c<3>', d<1>'*, d<2>'*, d<3>'*, e<1>'*, e<2>'*, e<3>'*, f<0>', f<1>', f<2>', g<0>'*, g<1>'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausente o un

[0662] residuo de aminoácido modificado o no modificado o análogo del mismo, con la condición de que al menos

[0663] siete residuos de aminoácidos/análogos contiguos estén presentes en cada hélice;

[0665] a uno independientemente tie

[0667]

cada uno independientemen

[0668]

[0671] y

[0673] bi, b<2>, b<3>, ci, C<2>,

fi,

, y f<2>' cada uno in fo' tienen la fórmula (c')

[0676]

[0679] Cada R4 en la Fórmula IV es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo. Preferiblemente, R4 es hidrógeno.

[0681] En cada residuo de fórmula (a):

[0683] R1a, R1b, R1c, y R1d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0684] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0685] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0686] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0687] menos uno de R1a y R1c es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del

[0688] grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores. Cuando un Enlazador

[0689] B o un Enlazador C está unido a un residuo de fórmula (a), el Enlazador B o el Enlazador C está unido a o

[0690] reemplaza a uno de R1a, R1b, R1c, y R1d.

[0692] En una realización preferida, (i) uno de R1a y R1c es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina, treonina y análogos de cada uno de los residuos anteriores, y (ii) R1b, R1d, y el otro de R1a y R1c son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>(preferiblemente metilo o etilo), o un alquenilo C<2-3>(preferiblemente etenilo).

[0694] En cada residuo de fórmula (b):

[0696] R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

[0697] un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

[0698] cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

[0699] puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

[0700] menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos. Cuando un Enlazador A o un Enlazador D está

[0701] unido a un residuo de fórmula (b), el Enlazador A o el Enlazador D está unido a o reemplaza a uno de R2a, R2b,

[0702] R2c, y R2d.

[0704] En una realización preferida, (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro

[0705] de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>(por ejemplo, metilo, etilo).

[0707] En cada residuo de fórmula (c):

[0709] cada R3 es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo, un

[0710] alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5. En al menos una realización, al menos un R3 es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado.

[0712] En una realización preferida, los residuos de fórmula (c) se seleccionan para facilitar el reconocimiento molecular de un objetivo por la estructura de hélice enrollada.

[0714] Cada R5 en la Fórmula IV se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -PG (donde PG es

[0715] un grupo protector), un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo

[0716] y un arilalquilo.

[0718] En al menos algunas realizaciones de los compuestos de la presente divulgación, PG se selecciona independientemente en cada aparición de los mismos del grupo que consiste en un grupo protector para la

[0719] protección de una amina, un grupo protector para la protección de un tiol y un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico.

[0721] En al menos una realización de las hélices enrolladas paralelas de la presente divulgación, fo es cualquier residuo; g<0>es Trp, Met, Phe, Ala, Glu o His; a<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<1>es cualquier residuo; c es Gln, Trp, Leu, Phe, Tyr o Met; d<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<1>es cualquier residuo; fi es cualquier residuo; g<1>es cualquier residuo; g<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es cualquier residuo; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; g'o es cualquier residuo; a'i es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'i es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; c'i es cualquier residuo; d'i es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e'i es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile, e'i es cualquier residuo; f'i es cualquier residuo; g'i es cualquier residuo; a'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<2>Asp, Asn, Glu, Gln, Tyr, Ser o Thr; c'<2>es cualquier residuo; d'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e'<2>es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; f'<2>es cualquier residuo; donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-g'i.

[0723] En al menos una realización de las hélices enrolladas paralelas de la presente divulgación, ci es Glu; di es Leu; ei es Glu; fi es Arg; gi es Glu; a<2>es Ile; b<2>es Arg; c<2>es Trp;d<2>es Leu; e<2>es Z; c'i es Glu; d'i es Leu; e'i es Glu; f'i es Arg; g'i es Z; a'<2>es Ile; b'<2>es Arg; c'<2>es Trp; d'<2>es Leu, e'<2>es Arg; donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador bis-triazol) entre el par gi-e'<2>.

[0725] En al menos una realización de las hélices enrolladas paralelas de la presente divulgación, ci es Glu; di es Cys; ei es Glu; fi es Arg; gi es Glu; a<2>es Ile; b<2>es Arg; c<2>es Trp;d<2>es Leu; e<2>es Z; c'i es Glu; d'i es Cys; e'i es Glu; f'i es Arg; g'i es Z; a'<2>es Ile; b'<2>es Arg; c'<2>es Trp; d'<2>es Leu, e'<2>es Arg; donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador bis-triazol) entre el par gi-e'<2>.

[0727] En algunas realizaciones de los compuestos de la presente divulgación, el compuesto comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de homología Nervy dos (NHR2) del complejo de factor de transcripción que contiene AMLi-ETO (AETFC). En estas realizaciones, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en (i) una macroestructura que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2 y (ii) una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula I que imita el dominio de NHR2. En estos compuestos, (i) la primera cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados (o análogos de los mismos), donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos/análogos tienen la fórmula gXi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-Xiob, donde Xi, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>, X6, X<7>, X8, X<9>, y Xio se seleccionan del grupo de residuos de aminoácidos (o análogos de los mismos) que se establece a continuación; y (ii) la segunda cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados (o análogos de los mismos), donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos/análogos tienen la fórmula cXi'-X2'-X3'-X4'-X5'-X6'-X7'-X8'-Xg'-Xioe', donde Xi', X<2>', X<3>', X<4>', X<5>', X6', X<7>', X8', Xg', y Xio' se seleccionan del grupo de residuos de aminoácidos (o análogos de los mismos) que se exponen a continuación. Como será evidente para el experto en la materia, g, b, c', y e' indica dónde aparecen los diez aminoácidos/análogos contiguos dentro de la estructura de hélice enrollada antiparalela (es decir, la primera cadena puede comenzar en la posición go. gi, o g<2>y la segunda cadena puede comenzar en la posición ci', c<2>', o c<3>'). Como será evidente para el experto, los residuos en las posiciones e/e' y g/g' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador o reemplazarse con un enlazador, si está presente. Como será evidente para el experto, los residuos en las posiciones a/a' y d/d' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador, si está presente.

[0729] Secuencias preferidas de NHR2

[0731]

[0732]

[0734] En al menos una realización de las hélices enrolladas antiparalelas de la presente divulgación, gi es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; f<2>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; g<2>es Leu, Met, Ala, His o Ser; a<3>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<3>es cualquier residuo; c'<1>es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; d'<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e'<1>es cualquier residuo; f<1>es cualquier residuo; g'<1>es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; a'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<2>es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; c'<2>es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; d'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e'<2>es Cys, donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par g-g' o e<2>-e'<2>.

[0736] En al menos una realización de las hélices enrolladas antiparalelas de la presente divulgación, g<1>es Glu, a<2>es Leu, b<2>es Trp, c<2>es His, d<2>es Leu, e<2>es Z, f<2>es Glu, g<2>es Leu, a<3>es Leu, b<3>es Arg, c'<1>es Glu, d'<1>es Leu, e'<1>es Trp, Í<1>es Arg, g'<1>es Ser, a'<2>es Ile, b'<2>es Arg, c'<2>es val, d'<2>es Leu, e'<2>es Z, y cada Z es un residuo de lisina que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-e'<2>.

[0738] En al menos una realización de las hélices enrolladas antiparalelas de la presente divulgación, g<1>es Glu, a<2>es Leu, b<2>es Trp, c<2>es His, d<2>es Leu, e<2>es Z, f<2>es Glu, g<2>es Leu, a<3>es Z', b<3>es Arg, c'<1>es Glu, d'<1>es Z', e'<1>es Trp, f<1>es Arg, g'<1>es Ser, a'<2>es Ile, b'<2>es Arg, c'<2>es val, d'<2>es Leu, e'<2>es Z, cada Z es un residuo de lisina que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-e'<2>, y cada Z' es un residuo de cisteína que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente. (por ejemplo, un enlace disulfuro) entre el par a<3>-d'<1>.

[0740] En al menos una realización de los compuestos de la presente divulgación, el compuesto es un mimético de hélice enrollada de NHR2 seleccionado del grupo que consiste en CHD-NHR2-2, CHDDS-NHR2-3, CHD-NHR2-6 y CHD-NHR2-7. CHD-NHR2-2 y CHDDS-NHR2-3 son particularmente preferidos.

[0742] Otro aspecto de la presente (i) invención y (ii) divulgación se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los compuestos descritos anteriormente (i) de la presente invención o (ii) de la presente divulgación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticos aceptables incluyen soluciones, suspensiones, emulsiones, excipientes, polvos o estabilizadores. El vehículo debe ser adecuado para el modo de administración deseado.

[0744] Además, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención y divulgación pueden comprender además uno o más diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes conservantes, rellenos, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes perfumantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes dispensadores, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y las formas de dosificación. Los ejemplos de agentes de suspensión incluyen alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias. La prevención de la acción de los microorganismos se puede garantizar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o portadores adecuados incluyen agua, etanol, polioles, mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los ejemplos de excipientes incluyen lactosa, azúcar de la leche, citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato dicálcico. Los ejemplos de agentes desintegrantes incluyen almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio, talco, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.

[0745] Se divulga en este documento un método para inhibir la interacción entre el AETFC y un motivo de unión de NHR2 (por ejemplo, en una proteína E). Este método implica poner en contacto el complejo del factor de transcripción y/o el motivo de unión de NHR2 con un compuesto que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2, como se describió anteriormente, en condiciones efectivas para inhibir la interacción entre el complejo del factor de transcripción que contiene AML1-ETO y el motivo de unión de NHR2. Preferiblemente, el contacto se realiza en una célula. En otra realización preferida, el contacto se lleva a cabo en un sujeto y el contacto comprende administrar el compuesto al sujeto.

[0747] Los compuestos de la presente invención y divulgación pueden administrarse por vía oral, parenteral, por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por instilación intranasal o por aplicación a las membranas mucosas, tales como las de la nariz, la garganta y los bronquios. Pueden administrarse solos o con vehículos farmacéuticos adecuados y pueden estar en forma sólida o líquida, como comprimidos, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones.

[0749] Los compuestos activos de la presente invención y divulgación pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte, o con un vehículo comestible asimilable, o pueden estar encerrados en cápsulas de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse para formar comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, estos compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos 0.1 % de compuesto activo. El porcentaje del compuesto en estas composiciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 % y aproximadamente 60 % del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invención y divulgación se preparan de modo que una unidad de dosificación oral contenga entre aproximadamente 1 y 250 mg de compuesto activo.

[0750] Los comprimidos, cápsulas y similares también pueden contener un aglutinante como goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; un agente desintegrante como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico; un lubricante como estearato de magnesio; y un agente edulcorante como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo mencionado anteriormente, un vehículo líquido, tal como un aceite graso.

[0751] Pueden estar presentes otros materiales diversos como recubrimientos o para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos pueden estar recubiertos con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe puede contener, además del ingrediente activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante como sabor a cereza o naranja.

[0753] Estos compuestos activos también pueden administrarse por vía parenteral. Se pueden preparar soluciones o suspensiones de estos compuestos activos en agua mezclada adecuadamente con un surfactante, como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. Los aceites ilustrativos son aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, el agua, la solución salina, la solución acuosa de dextrosa y azúcar relacionada y los glicoles como el propilenglicol o el polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

[0755] Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida hasta el punto de permitir una fácil irrigación. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

[0757] Los compuestos de la presente invención y divulgación también pueden administrarse directamente a las vías respiratorias en forma de aerosol. Para su uso como aerosoles, los compuestos en solución o suspensión pueden envasarse en un recipiente de aerosol presurizado junto con propelentes adecuados, por ejemplo, propelentes de hidrocarburos como propano, butano o isobutano con adyuvantes convencionales. Los materiales de la presente invención y divulgación también pueden administrarse en una forma no presurizada, tal como en un nebulizador o atomizador.

[0759] También se divulga en este documento un método para modular la transcripción de un gen en una célula, en donde la transcripción del gen está regulada por la interacción entre AETFC y un motivo de unión de NHR2. Este método implica poner en contacto la célula con un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2, como se describió anteriormente, en condiciones efectivas para modular la transcripción del gen. En una realización preferida, la célula se pone en contacto en condiciones efectivas para provocar la captación nuclear del compuesto, donde el compuesto interrumpe la interacción de AETFC y el dominio de unión de NHR2 y, por lo tanto, reduce la transcripción del gen.

[0761] La modulación de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación se refiere a la sobrerregulación de la transcripción de genes que normalmente son subregulados por AETFC, o subregulando la transcripción de genes que normalmente son sobrerregulados por AETFC. Los genes que normalmente son subregulados por AETFC incluyen, por ejemplo, FOS, EGFR1, s Ty K1, MYCN, TAL1, BAALC y 1D1. Los genes que normalmente se sobrerregulan mediante AETFC incluyen, por ejemplo, VAV1, SLA, ANXA1, PTPN12, BPI y OGG1.

[0763] Los genes cuya transcripción puede modularse de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación incluyen FOS, EGFR1, STYK1, MYCN, TAL1, BAALC, 1D1, VAV1, SLA, ANXA1, PTPN12, BPI, OGG1 y los descritos en Sun et al., "A Stable Transcription Factor Complex Nucleated by Oligomeric AML1-ETO Controls Leukaemogenesis," Nature 500:93-98 (2013); Westendorf et al., "The t(8;21) Fusion Product, AML-1-ETO, Associates with C/EBP-a, Inhibits C/EBP-a-Dependent Transcription, and Blocks Granulocytic Differentiation," Mol. Cell. Biol. 18:322-333 (1998); Mao et al., "Functional and Physical Interactions Between AML1 Proteins and an ETS Protein, MEF: Implications for the Pathogenesis of t(8;21)-Positive Leukemias," Mol. Cell. Biol.

[0764] 19:3635-3644 (1999); Elagib et al., "RUNX1 and GATA-1 Coexpression and Cooperation in Megakaryocytic Differentiation," Blood 101:4333-4341 (2003); Zhang et al., "E Protein Silencing by the Leukemogenic AML1-ETO Fusion Protein," Science 305:1286-1289 (2004); Gardini et al. "AML1/ETO Oncoprotein Is Directed to AML1 Binding Regions and Co-Localizes with a Ml 1 and HEB on Its Targets," PLoS Genet. 4:e1000275 (2008); Guo et al., "Multivalent Binding of the ETO Corepressor to E Proteins Facilitates Dual Repression Controls Targeting Chromatin and the Basal Transcription Machinery," Mol. Cell. Biol. 29:2644-2657 (2009); Martens et

[0765] al., "ERG and FLI1 Binding Sites Demarcate Targets for Aberrant Epigenetic Regulation by AML1-ETO in Acute Myeloid Leukemia," Blood 120:4038-4048 (2012); Wang et al., "The Leukemogenicity of AML1-ETO Is Dependent on Site-Specific Lysine Acetylation," Science 333:765-769 (2011); Shia et al., "PRMT1 Interacts with AML1-ETO to Promote Its Transcriptional Activation and Progenitor Cell Proliferative Potential," Blood 119:4953-4962 (2012); and Miyoshi et al., "The t(8;21) Translocation in Acute Myeloid Leukemia Results in Production of an AML1-MTG8 Fusion Transcript," EMBO J. 12:2715-2721 (1993).

[0767] Se ha demostrado que la oligomerización de AML1-ETO mediada por NHR2 es fundamental para la leucaemogénesis (Sun et al., "A Stable Transcription Factor Complex Nucleated by Oligomeric AML1-ETO Controls Leukaemogenesis," Nature 500: 93-98 (2013)). Por lo tanto, también se divulga en el presente documento un método para tratar la leucemia en un sujeto. Este método implica administrar al sujeto un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2, como se describió anteriormente, en condiciones efectivas para tratar la leucemia en el sujeto.

[0769] En todos los aspectos de la presente divulgación que implican poner en contacto una célula con, o administrar a un sujeto, un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en (i) una macroestructura que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2 y (ii) una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula I que imita el dominio de NHR2. En estos compuestos, (i) la primera cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados (o análogos de los mismos), donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos/análogos tienen la fórmula gX-i-X<2>-X<3>-X<4>-X<5>-X<6>-X<7>-X<8>-Xg-X<10>b, donde X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>, X6, X<7>, Xa, X<9>, y X<10>se seleccionan del grupo de residuos de aminoácidos (o análogos de los mismos) que se establece a continuación; y (ii) la segunda cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados (o análogos de los mismos), donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos/análogos tienen la fórmula cXi'-X2'-X3'-X4'-X5'-Xa'-X7'-Xs'-Xg'-Xioe', donde X-T, X<2>', X<3>', X<4>', X<5>', X6', X<7>', Xs', X<9>', y X<10>' se seleccionan del grupo de residuos de aminoácidos (o análogos de los mismos) que se detallan a continuación. Como será evidente para el experto en la materia, g, b, c', y e' indica dónde aparecen los diez aminoácidos/análogos contiguos dentro de la estructura de hélice enrollada antiparalela (es decir, la primera cadena puede comenzar en la posición go. gi, o g<2>y la segunda cadena puede comenzar en la posición c-T, c<2>', o c<3>'). Como será evidente para el experto, los residuos en las posiciones e/e' y g/g' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador o reemplazarse con un enlazador, si está presente. Como será evidente para el experto, los residuos en las posiciones a/a' y d/d' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador, si está presente.

[0771] Secuencias preferidas de NHR2

[0773]

[0775] En al menos una realización de todos los aspectos de la presente divulgación que implica poner en contacto una célula con, o administrar a un sujeto, un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela, gi es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; f<2>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; g<2>es Leu, Met, Ala, His o Ser; a<3>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<3>es cualquier residuo; c'i es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; d'i es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e'i es cualquier residuo; f i es cualquier residuo; g'i es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; a'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<2>es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; c'<2>es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; d'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e'<2>es cualquier residuo, donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par g-g' o e<2>-e'<2>.

[0776] En al menos una realización de todos los aspectos de la presente divulgación que implica poner en contacto una célula con, o administrar a un sujeto, un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela, gi es Glu, a<2>es Leu, b<2>es Trp, c<2>es His, d<2>es Leu, e<2>es Z, f<2>es Glu, g<2>es Leu, a<3>es Leu, b<3>es Arg, c'i es Glu, d'i es Leu, e'i es Trp, f i es Arg, g'i es Ser, a'<2>es Ile, b'<2>es Arg, c'<2>es val, d'<2>es Leu, e'<2>es Z, y cada Z es un residuo de lisina que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-e'<2>.

[0777] En al menos una realización de todos los aspectos de la presente divulgación que implica poner en contacto una célula con, o administrar a un sujeto, un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela, g<1>es Glu, a<2>es Leu, b<2>es Trp, c<2>es His, d<2>es Leu, e<2>es Z, f<2>es Glu, g<2>es Leu, a<3>es Z', b<3>es Arg, c'<1>es Glu, d'<1>es Z', e'<1>es Trp, Í<1>es Arg, g'<1>es Ser, a'<2>es Ile, b'<2>es Arg, c'<2>es val, d'<2>es Leu, e'<2>es Z, cada Z es un residuo de lisina que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-e'<2>, y cada Z' es un residuo de cisteína que ha sido modificado para la unión de un enlazador covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro) entre el par a<3>-dV

[0779] En al menos una realización de todos los aspectos de la presente divulgación que implica poner en contacto una célula con, o administrar a un sujeto, un compuesto de la presente invención o divulgación que comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela que imita el dominio de NHR2, el compuesto es un mimético de hélice enrollada de NHR2 seleccionado del grupo que consiste en CHD-NHR2-2, C<h>D<ds>-NHR2-3, CHD-NHR2-6 y CHD-NHR2-7 (especialmente CHD-NHR2-2 o CHDDS-NHR2-3).

[0781] En todos los aspectos de la presente divulgación que implican el contacto con una célula, las células adecuadas incluyen, sin limitación, células de mamíferos (por ejemplo, células humanas, células de gato, células de perro, células de caballo, células de ganado, células de cabra, células de oveja, células de cerdo, células de ratón, células de rata) y células aviares (por ejemplo, células de pollo). En al menos una realización preferida, las células son células de leucemia (especialmente células de leucemia mieloide aguda, células de leucemia positivas para t(8;21)).

[0783] En todos los aspectos de la presente divulgación que involucran un sujeto, los sujetos adecuados incluyen mamíferos (por ejemplo, humanos, gatos, perros, caballos, ganado, cabras, ovejas, cerdos, ratones, ratas) y aves (por ejemplo, pollos). En al menos una realización preferida, el sujeto tiene leucemia (especialmente leucemia mieloide aguda, leucemia positiva para t(8;21)).

[0785] En todos los aspectos de la presente divulgación dirigidos a métodos que implican poner en contacto una célula con uno o más compuestos, el contacto se puede llevar a cabo utilizando métodos que serán evidentes para el experto en la materia, y se puede hacer in vitro o in vivo.

[0787] Un enfoque para administrar agentes a las células implica el uso de liposomas. Básicamente, esto implica proporcionar un liposoma que incluye uno o más agentes a administrar y luego poner en contacto la célula, el tejido o el órgano objetivo con los liposomas en condiciones efectivas para la administración del agente en la célula, el tejido o el órgano.

[0789] Este sistema de administración de liposomas también puede acumularse en un órgano, tejido o célula objetivo mediante un direccionamiento activo (por ejemplo, mediante la incorporación de un anticuerpo u hormona en la superficie del vehículo liposomal). Esto se puede conseguir mediante métodos conocidos.

[0791] Un enfoque alternativo para la administración de agentes que contienen proteínas o polipéptidos implica la conjugación del agente deseado con un polímero que se estabiliza para evitar la degradación enzimática de la proteína o el polipéptido conjugado. Las proteínas o polipéptidos conjugados de este tipo se describen en la patente de los Estados Unidos No. 5,681,811 de Ekwuribe.

[0793] Otro enfoque para la administración de agentes implica la preparación de agentes quiméricos de acuerdo con la patente de Estados Unidos No. 5,817,789 de Heartlein et al. El agente quimérico puede incluir un dominio de ligando y el agente (por ejemplo, un compuesto de la invención o divulgación). El dominio del ligando es específico para los receptores ubicados en una célula objetivo. Por lo tanto, cuando el agente quimérico se administra por vía intravenosa o se introduce de otro modo en la sangre o la linfa, el agente quimérico se adsorberá a la célula objetivo, y la célula objetivo internalizará el agente quimérico.

[0795] Los compuestos de la presente invención y divulgación pueden administrarse directamente a la célula/tejido/órgano objetivo.

[0797] Adicional y/o alternativamente, los compuestos pueden administrarse a un área no objetivo junto con uno o más agentes que facilitan la migración de los compuestos a (y/o la absorción por) un tejido, órgano o célula objetivo. Como será evidente para una persona con conocimientos ordinarios en la materia, el compuesto en sí puede modificarse para facilitar su transporte a un tejido, órgano o célula objetivo, incluido su transporte a través de la barrera hematoencefálica; y/o para facilitar su captación por una célula objetivo (por ejemplo, su transporte a través de las membranas celulares). En una realización preferida, el péptido de la invención o divulgación se modifica y/o se administra con un vehículo apropiado para facilitar su administración al núcleo de la célula diana (Wender et al., "The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97: 13003-08 (2000); Roberts, "Buyer's Guide to Protein Transduction Reagents," Scientist 18: 42-43 (2004); Joliot & Prochiantz, "Transduction Peptides: From Technology to Physiology," Nat. Cell Biol. 6: 189-96 (2004)).

[0799] La presente invención y divulgación pueden ilustrarse aún más mediante referencia a los siguientes ejemplos.

[0800] Ejemplos

[0801] Ejemplo 1 - Materiales y métodos generales

[0802] Se utilizaron disolventes y reactivos de grado de investigación sin purificación adicional. Los aminoácidos Fmoc y los reactivos de síntesis de péptidos se adquirieron de Novabiochem y Chem-Impex International. Los aminoácidos Fmoc-azido se sintetizaron como se describió previamente (Lau et al., Synlett 1917 (2011); Sminia et al., Synlett 2643 (2012)).

[0803] Ejemplo 2 - Síntesis de una imitación de hélice enrollada sustituta de enlace de hidrógeno (AB-1) Imitación de hélice enrollada sustituta de enlace de hidrógeno AB-1 como se muestra en el Esquema 1 a continuación.

[0804] Esquem a 1

[0807]

[0811]

[0815]

[0817] TFA:TIPS:H,0

[0819] Los péptidos HBS se sintetizaron como se describió previamente (Patgiri et al., Org. Biomol. Chem. 8: 1773 (2010)). Las secuencias de péptidos hasta el i+3er residuo de la cadena original se sintetizaron en fase sólida en un Sintetizador de péptidos Liberty CEM®. Se añadió una solución que contenía cloruro de onitrobencesulfonilo premezclado (10 eq) y 2,4,6-colidina (10 eq) en DCM a la resina que contenía el péptido desprotegido de Fmoc. La resina se lavó secuencialmente con diclorometano, dimetilformamida y éter dietílico (3 x 5 mL cada uno). La resina se secó durante la noche al vacío. La resina seca, PPh3 y Pd<2>(dba)3 se lavaron con argón inerte durante 30 minutos. La resina con reactivos se hinchó en THF y se añadió alilmetilcarbonato al recipiente de reacción. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas bajo argón para obtener el péptido alilado. La resina se filtró y se lavó con DCM, DMF, dietilcarbamato de sodio trihidratado 0.2 M en NMP y éter dietílico (3 x 5 mL). Luego, el grupo protector nosilo se eliminó mediante la adición de 1,8­ diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU, 5 eq) y 2-mercaptoetanol (10 eq) en DMF. La resina se lavó con DMF, DCM y éter dietílico (3 x 5 mL) y se trató con el aminoácido Fmoc deseado (20 eq), DIC (20 eq) y HOAt (10 eq) en<d>M<f>. La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 12 a 16 horas. La resina que contenía el péptido alargado se lavó y se acopló al residuo de aminoácido Fmoc deseado (5 eq) y al ácido 4-pentenoico (5 eq) con HBTU (5 eq) y DIEA (10 eq) en DMF. La metátesis de cierre de anillo de la bis-olefina 9 se realizó con el catalizador Hoveyda-Grubbs II (20 % mol) en 1,2-dicloroetano bajo irradiación de microondas a 120 °C durante 10 min como se describió previamente (Miller et al., Curr. Prot. Chem. Biol. 6: 101 (2014); Patgiri et al., Nat. Prot. 5:1857 (2010)). La reacción de cierre de anillo se controló mediante MALDI-TOF. Los péptidos se escindieron de la resina utilizando 95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O, y se purificó por HPLC de fase inversa (gradiente 15-60 acetonitrilo/agua con 0.1 % de TFA durante 60 min) y se caracterizó por MALDI-TOF.

[0821] Ejemplo 3 - Síntesis de una imitación de hélice enrollada de macrociclo (AB-2)

[0823] La imitación de hélice enrollada de macrociclo AB-2 se sintetizó como se muestra en el Esquema 2 a continuación.

[0824] Esquema 2

[0827]

[0830] La resina PEG RAM 0.4 mmol/g se hinchó en DMF y se precargó con Fmoc-Asp-OAlilo (1 eq), HBTU (1.5 eq) y dMsopropiletilamina (1.5 eq) durante 1 hora. Luego, la resina de N-acetilo se protegió con anhídrido acético 0.5 M (2 x 5 ml) y la carga se modificó a una carga de ~0.2 mmol/g, según se evaluó mediante el % de carga. La síntesis de péptidos en fase sólida se realizó utilizando química de fase sólida Fmoc estándar en un sintetizador de péptidos Liberty CEM®. La resina que contiene el péptido original se transfirió a un tubo SPE de polipropileno sinterizado. Tras la desprotección del terminal N con piperidina al 20 % en NMP (2 x 5 mL) y el lavado con diclorometano, metanol y dimetilformamida (3 x 5 mL cada uno), se realizó la desprotección del alilo utilizando Pd(PPh3)<4>(3 eq) en una solución de cloroformo: ácido acético: N-metilmorfolina (37:3:1). Después de 3 horas, la resina se lavó nuevamente con diclorometano, metanol y dimetilformamida (3 x 5 mL cada uno). La adición de PyBOP (1.5 eq) y DIPEA (1.5 eq) produjo una macrociclización completa sin observarse ningún producto lineal. Los péptidos se escindieron de la resina utilizando 95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O, y se purificó por HPLC de fase inversa (gradiente 15-60 acetonitrilo/agua con 0.1 % de TFA durante 60 min) y se caracterizó por MALDI-TOF.

[0832] Ejemplo 4 - Síntesis de una imitación de hélice enrollada con disulfuro (AB-3)

[0833] La imitación superenrollada con disulfuro AB-3 se sintetizó como se muestra en el Esquema 3 a continuación.

[0835] Esquema 3

[0838]

[0841] El péptido original (0.25 mmol) se sintetizó en un sintetizador de péptidos Liberty CEM® que utiliza química de fase sólida Fmoc estándar con resina Knorr Amida MBHA y N-acetilo protegida con anhídrido acético 0.5 M en DMF (2 x 5 mL), lo que da como resultado una imitación de hélice enrollada unida a resina. El péptido se trató con una solución que contenía 95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El sólido crudo se precipitó con éter dietílico frío y se secó bajo una corriente de gas nitrógeno. Los péptidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa (gradiente 15-60 acetonitrilo/agua con 0.1 % de TFA durante 60 min) y, después de la liofilización, se produjo bistiol como un polvo blanco. El bis tiol se oxidó con 20 % de DMSO, 20 % de TFE en bicarbonato de amonio 0.8 M y ácido acético 0.84 M (pH 6.0), lo que produjo solo formación de disulfuro intramolecular monitoreado por MALDI-TOF (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 6657 (1991); Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.

[0842] 111: 6636 (2014)). 10-30 mg de producto purificado recuperado de una escala de 0.25 mmol.

[0844] Ejemplo 5 - Síntesis de imitaciones de hélice enrolladas con dímero de hélice entrecruzada (AB-4, AB-5 y AB-6)

[0846] La imitación superenrollada con dímero de hélice entrecruzada AB-4 se sintetizó como se muestra en el Esquema 4 a continuación.

[0847] Esquema 4

[0850]

[0853] El péptido original (0.25 mmol) se sintetizó en un Sintetizador de péptidos Liberty CEM® que utiliza química estándar de fase sólida Fmoc con resina Knorr Amide MBHA. La resina que contiene el péptido original se transfirió a un tubo SPE de polipropileno sinterizado, se lavó y se transfirió a un tubo de microondas. Posteriormente, la resina se hinchó en 3 mL de NMP y se añadió el éter propargílico de bisalquino (257<j>L, 2.5 mmol, 10 eq).

[0855] Una solución de CuSO<4>(20 mg, 0.125 mmol, 0.5 eq) disuelto en 500<j>L de agua se preparó por separado. A esta solución se añadió Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (132 mg, 0.25 mmol, 1 eq) disuelta en 1 mL de NMP. Esta mezcla se añadió a una solución de ascorbato de sodio (495 mg, 2.5 mmol, 10 eq) preparada en 1.5 mL de agua. La mezcla resultante se pipeteó en el tubo de microondas que contenía éter propargílico y péptido. Se añadió una barra agitadora magnética y la mezcla de reacción se sometió a irradiación de microondas a 80 °C durante 45 minutos, después de lo cual la resina se transfirió a un tubo SPE de polipropileno sinterizado y se lavó con una solución 20 mM de dietilditiocarbamato de sodio en agua (3 x 15 mL) seguido de NMP (3 x 15 mL). Una microescisión de resina (95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O) mostró que el material de partida se consumía después de una reacción.

[0857] Después de la reacción inicial de CuAAC, el péptido monotriazol se transfirió a otro tubo de microondas que contenía CuSO<4>(20 mg, 0.125 mmol, 0.5 eq), ascorbato de sodio (149 mg, 0.75 mmol, 3 eq), Fmoc-azidolisina-NH<2>(294 mg, 0.75 mmol, 3 eq) y Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (132 mg, 0.25 mmol, 1 eq) en solución preparada como se describe anteriormente. La mezcla de reacción resultante se sometió a irradiación de microondas a 80 °C durante 45 minutos, después de lo cual la resina se transfirió a un tubo SPE de polipropileno sinterizado y se lavó como se describió anteriormente. Una microescisión de resina (95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O) mostró que el material de partida se consumía después de una reacción.

[0859] El péptido resultante sobre resina se añadió al sintetizador de péptidos de microondas Liberty CEM®. La secuencia se continuó utilizando química de fase sólida Fmoc estándar y N-acetilo protegido con anhídrido acético 0.5 M en DMF (2 x 5 mL), lo que dio como resultado una imitación de hélice enrollada unida a resina. El péptido se trató con una solución que contenía 95 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de TIPS y 2.5 % de H<2>O. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se filtró y se concentró al vacío. El sólido crudo se precipitó con éter dietílico frío y se secó bajo una corriente de gas nitrógeno. La purificación por HPLC (gradiente 15-60 acetonitrilo/agua con 0.1 % de t Fa durante 60 minutos) y la liofilización produjeron el péptido como un polvo blanco, que se caracterizó por MALDI-TOF. Los péptidos CHD producen, dependiendo de la secuencia, entre 20 y 40 mg de péptido a partir de una escala de 0.25 mmol.

[0861] AB-5 y AB-6 se sintetizaron de manera similar.

[0862] Ejemplo 6 - Síntesis de imitadores de hélices enrolladas con dímeroDS de hélice entrecruzada

[0863] Los imitadores de hélices enrolladas con dímeroDS de hélice entrecruzada se sintetizaron como se muestra en el Esquema 5 a continuación.

[0864] E squem a 5

[0867]

[0870] El péptido original (0.25 mmol) se sintetizó como se describió anteriormente, donde, tras la elongación, se implementaron reacciones consecutivas de CuAAC y se alargó aún más utilizando la química de fase sólida Fmoc estándar para obtener el dímero de hélice entrecruzada con ditiol (CHDDT). Después de la protección de N-acetilo con 0.5 M de anhídrido acético en DMF (2 x 5 ml), el péptido CHDDT se escindió de la resina utilizando 94 % de ácido trifluoroacético, 2.5 % de 1,2-etanoditiol y 2.5 % de H<2>O y 1 % de triisopropilsilano. El péptido resultante se precipitó con éter dietílico frío y se secó bajo una corriente de gas nitrógeno. El péptido crudo se purificó por HPLC de fase inversa (gradiente 15-60 acetonitrilo/agua con 0.1 % de TFA durante 60 min) y, después de la liofilización, se obtuvo bistiol como un polvo blanco. El bistiol se oxidó con 20 % de DMSO, 20 % de TFE en bicarbonato de amonio 0.8 M y ácido acético 0.84 M, pH 6.0, produciendo solo formación de disulfuro intramolecular monitoreado mediante MALDI-TOF (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 6657 (1991); Miller et at., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 111: 6636 (2014)).

[0871] Ejemplo 7 - HPLC analítica y espectrometría de masas

[0872] Se obtuvieron trazas de péptidos mediante HPLC analítica a 220 nm a partir de un gradiente de 10 % de B hasta 90 % de B durante 10 min en una columna XTerra RP18 de 3.5 pm y 2.1 x 150 mm (parte No. 186000410); A: TFA acuoso al 0.1 %, B: acetonitrilo; caudal 400 pL/min. Las masas exactas se encontraron utilizando un instrumento de desorción/ionización láser asistida por matriz Bruker (MALDI-TOF). 10-30 mg de producto purificado recuperado de una escala de 0.25 mmol. Véase las Figuras 2A-2P

[0873] Ejemplo 8 - Espectroscopia CD

[0874] Los espectros de CD se registraron en un espectrómetro de CD AVIV 202SF equipado con un controlador de temperatura utilizando celdas de 1 mm de longitud y una velocidad de escaneo de 5 nm/min. Los espectros se promediaron en<8>escaneos con el fondo restado de acuerdo con las condiciones experimentales análogas. Cada muestra se preparó en una solución de fluoruro de potasio 50 mM en agua (pH 7.4) con una concentración final de 20 pM. Las concentraciones de cada péptido se determinaron mediante la absorción UV de residuos de triptófano a 280 nm. Véase las Figuras 3A-3<b>.

[0876] Ejemplo 9 - Espectroscopia de RMN

[0878] Todos los experimentos se llevaron a cabo en un espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz a 25 °C. Una solución de 500 pM de AB-4 se preparó en 400 pL de CO-CH<3>CN al 10 % en H<2>O con ácido trifluoroacético al 0.1 % (pH = 5). Se utilizaron los espectros de RMN de protones, TOCSY y NOESY para asignar protones de amida (véase la Tablas 2 y la Tabla 3 a continuación). La supresión de disolventes se logró con una secuencia de pulsos Watergate 3919. Todos los espectros 2D se registraron recopilando 4092 puntos de datos complejos en el dominio t2 promediando 64 escaneos y 128 incrementos en el dominio t1 con el modo States-TPPI. Los experimentos TOCSY se realizaron con un tiempo de mezcla de 80 ms, mientras que los experimentos NOESY se realizaron con un tiempo de mezcla de 300 ms. Todos los datos de RMN fueron procesados y analizados utilizando el programa TOPSPIN de Bruker. Las desintegraciones por inducción libre originales se rellenaron con ceros para dar una matriz final de 2048 por 2048 puntos de datos reales. Se aplicó una función de ventana de seno cuadrado de 90° en ambas dimensiones. Los picos cruzados del efecto Overhauser Nucleaver (NOE) se enumeran en la Tabla 3 a continuación. Véase la Figura 4 (RMNH), la Figura 5A (amida NOESY), la Figura<6>(huella digital NOESY) y la Figura 5B (amida TOCSY para cadena lateral).

[0880] Tabla 2. Asignaciones de 1H RMN y desplazamientos químicos (<6>, ppm) para AB-4 (298 K) en d<3>-CH<3>CN al 10 % en D<2>O (pH 5), y ángulos diedros calculados, O, derivados de las constantes de acoplamiento<3>JNHCaH.

[0881] Residuo O° NH Ha Hp Hy H<6>He

[0882] E (A1) -53.86 7.824 4.10 N / A N / A N / A N / A

[0883] L (A<2>) -52.67 8.217 4.15 1.89 N / A 0.756 N / A

[0884] A (A3) -52.67 8.06 4.03 1.54 N / A N / A N / A

[0885] Y (A4) -55.60 7.907 3.97 1.96 2.31 N / A N / A

[0886] L (A5) -57.84 7.75 4.03 1.58 N / A N / A N / A

[0887] Z(A<6>) -52.07 7.16 4.06 1.76 1.57 N / A 3.08

[0888] W (A7) -51.47 7.65 4.48 3.19 N / A N / A N / A

[0889] R (A<8>) -57.29 7.85 3.9 1.58 1.04 N / A N / A

[0890] L (A9) -52.67 7.818 4.10 1.44 1.39 1.388 1.296

[0891] L (B1) -55.60 7.76 3.80 2.05 1.41 1.04 N / A

[0892] W (B2) -55.60 7.91 4.38 3.19 N / A N / A N / A

[0893] E (B3) -56.73 8.18 3.98 N / A N / A N / A N / A

[0894] R (B4) -52.07 7.143 4.04 N / A N / A N / A N / A

[0895] I (B5) -53.27 7.77 3.92 1.76 N / A 0.74 N / A

[0896] A (B<6>) -55.60 8.03 3.97 1.24 N / A N / A N / A

[0897] R (B7) -55.60<8 .2>4.12 N / A N / A N / A N / A

[0898] L (B<8>) -49.62 7.78 4.13 1.60 N / A 0.76 N / A

[0899] Z(B9) -58.38 7.1 4.04 1.66 1.39 N / A 3.5

[0900] <3>Las constantes de acoplamiento JNHCaH se obtuvieron del espectro TOCSY (Wang et al., J. Biomol. NMR 10: 373 (1997)). Los ángulos $ se calcularon aplicando la ecuación de Karplus parametrizada por Pardi (Pardi et al. , J. Mol. Biol. 180: 741 (1984)).

[0901] Tabla 3. Picos cruzados de NOE observados a partir de los espectros NOESY de AB-4.

[0902] Residuo Desplazamiento químico, ppm

[0903] Átomo<1>Átomo<2>Átomo<1>Átomo<2>Intensidad NOE E(A1)-NH E(A1)-Ha 7.82 4.10 fuerte E(A1)-Ha L(A5)-Hp 4.10 1.58 débil L(A2)-NH L(A2)-Ha 8.216 4.15 fuerte L(A2)-Ha L(A2)-Hp 4.15 1.89 media L(A2)-Ha A(A3)-Hp 4.15 1.54 débil L(A2)-Ha L(A2)-Hp 4.15 1.898 débil A(A3)-NH A(A3)-Ha 8.06 4.12 fuerte A(A3)-NH Z(A<6>)-Ha 8.06 4.06 débil A(A3)-NH E(A4)-Ha 8.06 4.06 media A(A3)-NH A(A3)-Hp 8.06 1.54 media E(A4)-NH E(A4)-Ha 7.907 4.06 fuerte E(A4)-NH E(A4)-H<y>7.907 2.31 débil E(A4)-NH E(A4)-Hp 7.907 1.96 fuerte E(A4)-Ha E(A4)-Hp 4.06 1.96 fuerte L(A5)-NH L(A4)-Ha 7.75 4.03 fuerte

[0904] L(A5)-Ha I(B5)-Hp 4.03 1.76 débil

[0905] Z(A6)-NH Z(A6)-Ha 7.16 4.06 fuerte

[0906] Z(A6)-Ha Z(A6)-Hp 4.06 1.758 media

[0907] Z(A6)-Ha Z(A6)-H£ 4.06 3.08 fuerte W(A7)-NH W(A7)-Ha 7.65 4.48 fuerte W(A7)-NH R(A8)-Ha 7.65 3.9 media W(A7)-Ha W(A7)-Hp 4.48 3.19 fuerte

[0908] R(A8)-NH R(A8)-Ha 7.85 4.48 fuerte

[0909] R(A8)-NH L(A9)-Ha 7.85 3.9 media R(A8)-NH R(A8)-H<y>7.85 1.04 media R(A8)-NH R(A8)-Hp 7.85 1.58 media

[0910] L(A9)-NH L(A9)-Ha 7.82 4.10 fuerte

[0911] L(A9)-NH L(B1)-Ha 7.82 3.8 débil

[0912] L(A9)-NH L(A9)-Hp 7.82 1.44 media

[0913] L(A9)-NH L(A9)-H<y>7.82 1.41 fuerte

[0914] L(A9)-NH L(A9)-H8 7.82 1.38 media

[0915] L(A9)-H8 L(B1)-H<y>1.38 1.04 débil L(A9)-Ha I(B5)-Hp 4.10 1.758 débil L(B1)-NH L(B1)-Ha 7.76 3.8 fuerte

[0916] L(B1)-NH W(B2)-Ha 7.76 3.19 fuerte

[0917] L(B1)-NH L(B1)-Hp 7.76 2.05 débil

[0918] L(B1)-NH L(B1)-H<y>7.76 1.41 fuerte

[0919] L(B1)-NH L(B1)-H8 7.76 1.04 media

[0920] L(B1)-Ha I(B5)-Hp 3.80 1.758 débil L(B1)-H<y>L(B1)-H8 1.41 1.04 media W(B2)-NH W(B2)-Ha 7.91 4.38 fuerte W(B2)-NH E(B3)-Ha 7.91 3.98 media W(B2)-NH W(B2)-Hp 7.91 3.19 fuerte

[0921] E(B3)-NH E(B3)-Ha 8.18 3.98 media

[0922] E(B3)-NH A(B6)-Ha 8.18 8.03 débil

[0923] E(B3)-Ha A(B6)-Hp 3.98 1.24 débil

[0924] R(B4)-NH R(B4)-Ha 7.143 4.04 fuerte

[0925] R(B4)-Ha I(B5)-Hp 4.04 1.76 débil

[0926] I(B5)-NH I(B5)-Ha 7.77 3.92 fuerte I(B5)-NH A(B6)-Ha 7.77 3.97 media I(B5)-NH I(B5)-Hp 7.77 1.76 fuerte I(B5)-NH A(B6)-Hp 7.77 1.04 fuerte I(B5)-Hp I(B5)-H8 1.76 0.74 débil I(B5)-Ha L(B1)-Hp 3.92 2.05 débil A(B6)-NH A(B6)-Ha 8.03 3.97 fuerte

[0927] A(B6)-NH A(B6)-Hp 8.03 1.24 fuerte

[0928] A(B6)-Ha A(B6)-Hp 3.97 1.24 débil

[0929] R(B7)-NH R(B7)-Ha 8.20 4.12 fuerte

[0930] R(B7)-Ha R(B7)-Hp 4.12 1.58 débil

[0931] L(B8)-NH L(B8)-Ha 7.78 4.13 fuerte

[0932] L(B8)-NH L(B8)-Hp 7.78 1.60 débil

[0933] L(B8)-NH L(B8)-H6 7.78 0.77 débil

[0934] L(B8)-Hp L(A1)-H8 1.60 0.756 débil L(B8)-Ha Z(B9)-Hp 4.13 1.66 débil Z(B9)-NH Z(B9)-Ha 7.1 4.04 fuerte

[0936] Ejemplo 10 - Cálculo de la estructura de RMN

[0938] La estructura de RMN de la solución de AB-4 se calculó utilizando la búsqueda conformacional de Monte Cario en Macromodel 2015. El campo de fuerza molecular de Merck (MMFF) se aplicó al péptido AB-4 con agua como disolvente explícito. Se obtuvieron un total de 70 confórmeros utilizando 65 restricciones NOESY y 18 de ángulo diedro (O). Las 20 estructuras de menor energía muestran una desviación general mínima entre sí. Las restricciones de distancia se implementaron en el modelo estructural de acuerdo con los picos cruzados NOE observados: fuerte (2.5 Á), medio (4.0 Á) y débil (5.5 Á). Se utilizaron las constantes de acoplamiento 3^ NHCHa para calcular los ángulos O de la ecuación de Karplus.

[0940] Ejemplo 11 - Expresión y purificación de proteínas

[0942] La proteína NHR2 marcada con GST se expresó y purificó como se informó previamente (Sun et al., Nature 500: 93 (2013)); Bartel et al., Biomed. Res. Int. 2013: 297692 (2013)). El vector de fusión pGEX4T-3-NHR2 se transformó en E. coli competente para BL21 (DE3) (Novagen) en medio LB. La producción de proteínas se indujo con 1 mM de IPTG a OD<600>de 0.75 durante 4 horas a 25 °C. La producción del producto de fusión GST-NHR2 deseado se verificó mediante SDS-PAGE. Las células se recolectaron y se resuspendieron en un tampón de lisis (50 mM de Tris pH 7.5, 150 mM de NaCl, 0.05 % de TritonX 100) con 10 mg/mL de leupeptina A, 1 mg/mL de pepstatina A, 500 pM de PMSF, 1 mM de DTT y 0.5 % de glicerol (Sigma). Los sedimentos celulares se lisaron mediante sonicación y se centrifugaron a 4 °C a 5,000 rpm durante 40 minutos. El sobrenadante bacteriano se vertió sobre perlas de glutatión Sefarosa previamente equilibradas (G-Biosciences) y se les permitió unirse durante 1 hora a 25 °C. Las proteínas de unión inespecífica se eliminaron de la resina con tampón de lavado (100 mM de Tris pH 8.0, 0.5 % de glicerol, 1 mM de D<t>T), y la proteína de fusión GST-NHR2 se eluyó con tampón (100 mM de Tris, pH 8.0, 0.5 % de glicerol, 1 mM de DTT, 10 mM de glutatión). La pureza se evaluó mediante SDS-PAGE.

[0944] Ejemplo 12 - Ensayo de unión de péptidos

[0946] La afinidad relativa de la proteína NHR2 marcada con GST nativa y los péptidos CHD-NHR2 se determinó utilizando un ensayo de unión directa basado en polarización de fluorescencia con el péptido N2B marcado con fluoresceína, flu-N2B (véase la Figura 7). Los experimentos de polarización se realizaron con un detector multimodo DTX 880 (Beckman) a 25 °C, con longitudes de onda de excitación y emisión a 485 y 525 nm, respectivamente. Cada experimento de unión se preparó en placas de 96 pocillos en tampón de ensayo: 10 mM de Tris, 20 mM de NaCl pH=7.4 con 0.1 % de Pluronic F-68 (Sigma). Los valores de afinidad de unión (K<d>) informados para cada péptido CHD y GST-NHR2 se realizaron por triplicado y se determinaron ajustando los datos experimentales a un modelo de regresión no lineal de dosis-respuesta sigmoidea en GraphPad Prism 6.0.

[0948] La afinidad de flu-N2B se determinó por primera vez para su compañero nativo GST-NHR2. La adición de concentraciones diluidas en serie de GST-NHR2 de 2.35 mM a 2.5 pM en 100 nM de flu-N2b en el tampón de ensayo produjo la curva de unión de saturación (Figura 8) de acuerdo con los resultados informados previamente (Sun et al., Nature 500: 93 (2013)). La afinidad de flu-N2b para cada péptido CHD-NHR2 se preparó de la misma manera (Figuras 9A-B). Kd se calculó utilizando la ecuación 1 abajo.

[0950] Ü'<d>= (R r x (1 -F<sb>) L<st x>F<sb>2)/F<sb>- L<st>) 1

[0952] dónde,

[0954] R<t>= Concentración total de NHR2

[0956] L<st>= Concentración total de péptido fluorescente

[0958] Fsb = Fracción de péptido fluorescente unido

[0960] Ejemplo 13 - Evaluación de cuatro estrategias generales para la estabilización de hélice enrollada

[0962] Las hélices enrolladas consisten en repeticiones de heptada con contactos hidrófobos críticos en las posiciones a y d y residuos iónicos en las posiciones e y g. Se planteó la hipótesis de que una hélice capaz de un mínimo de tres contactos hidrófobos a/d (o 1.5 heptadas) proporcionan un punto de partida razonable para el desarrollo de imitadores de hélices enrolladas mínimas. Se postuló que las estrategias que estabilizan estos dímeros de hélice corta también serían aplicables para cadenas más largas, ya que la estabilidad de la hélice enrollada aumenta con el número de contactos (Lau et al., J. Biol. Chem. 259: 13253 (1984)). Los dímeros helicoidales cortos pueden proyectar cadenas laterales para el reconocimiento biomolecular solo si las hélices individuales están empaquetadas unas contra otras (Crick, Acta Crystallographica 6: 689 (1953)). Cuatro enfoques diferentes para el diseño de novo de imitadores de hélices enrolladas mínimas para la estabilización de una secuencia modelo (Figuras 10B-10E). La secuencia modelo incorpora residuos hidrofóbicos favorables en posiciones a/d, así como interacciones iónicas inter e intracadena cuidadosamente ubicadas para mejorar la estabilidad tanto de la hélice como del dímero. Se creó una interfaz hidrofóbica siguiendo las reglas de diseño recientemente descritas para tríadas verticales (Hadley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105:530 (2008)). Gellman y Woolfson y colaboradores sugieren que la colocación de residuos Leu-Ile-Leu en las posiciones aa'-a contribuyen significativamente a la estabilidad del dímero helicoidal debido a las interacciones de empaquetamiento óptimas (Hadley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105: 530 (2008)). Los puentes salinos intra e interhelicoidales se colocaron en posiciones apropiadas para mejorar la estabilidad de los ensamblajes superenrollados (Burkhard et al., Trends Cell Biol. 11: 82 (2001); Woolfson, Adv. Protein Chem. 70: 79 (2005)); Mason et al., ChemBiochem 5: 170 (2004)). Estas consideraciones de diseño condujeron a secuencias de péptidos A: Ac-ELAELEWRL-NH (SEQ ID NO:1) y B: Ac-LWERIARLR-NH (SEQ ID NO: 2). Posibles interacciones inter e intracatenarias entre A y B en el contexto de una hélice enrollada antiparalela se representan en la Figura 10A.

[0964] El trabajo seminal que investiga las estabilidades de hélices enrolladas diseñadas mínimas de novo sugiere que los péptidos diseñados (A y B) no se ensamblarían espontáneamente en solución acuosa (Lau et al., J. Biol. Chem. 259: 13253 (1984); Burkhard et al., Protein Sci. 9:2294 (2000)), porque (a) los péptidos cortos no adoptan conformaciones helicoidales estables (Scholtz et al., FASEB J. 6: a 345 (1992); Zimm et al., J. Chem.

[0965] Phys. 31: 526 (1959)) y (b) las hélices cortas no crean suficientes contactos para favorecer el ensamblaje del dímero. Se utilizó espectroscopia de dicroísmo circular para evaluar la estabilidad conformacional de los péptidos. El CD proporciona una firma distintiva para las hélices a con un máximo cerca de 190 nm y mínimos a 208 y 222 nm (Kallenbach et al., en CIRCULAR DICHROISM AND THE CONFORMATIONAL ANALYSIS OF BIO<m>O<l>ECULES 201-260 (Gerald D. Fasman ed., 1996)). La helicidad relativa de los péptidos se estima típicamente mediante la elipticidad media del residuo a 222 nm (Kallenbach et al., en CIRCULAR DICHROISM AND THE CONFORMATIONAL ANALYSIS OF BIOMOLECULES 201-260 (Gerald D. Fasman ed., 1996); Manning et al., Biopolymers 31: 569 (1991)), aunque estas estimaciones a menudo no son precisas para hélices cortas (Shepherd et al., J. Am. Chem. Soc. 127:2974 (2005); Chin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Ee . UU. 99: 15416 (2002); Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 128: 9248 (2006)). La relación de las bandas de 222 y 208 nm ofrece una medida adicional de a-helicidad. El origen y el efecto de la secuencia de péptidos en esta relación aún no están bien definidos (Kallenbach et al., en CIRCULAR DICHROISM AND THE CONFORMATIONAL ANALYSIS OF BIOMOLEC<u>L<e>S 201-260 (Gerald D. Fasman ed., 1996)), pero se espera una relación >1 de hélices a estables (Wallimann et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 1203 (2003)). Los resultados del CD mostraron firmas no helicoidales para cada péptido individual (A y B), y su mezcla equimolar a una concentración de 20 |jM (Figura 3A).

[0967] Se evaluó el potencial de cuatro estrategias sintéticas para crear imitadores de hélices enrolladas definidas conformacionalmente (Figuras 10B-10E). El diseño mimético mínimo se construyó sobre las siguientes hipótesis clave: (a) la estabilización de hélices individuales mejorará la estabilidad del ensamblaje dimérico, y la formación de hélices en un péptido unido puede nuclearse con una hélice preformada (Torres et al., ChemBiochem 9: 1701 (2008); Houston et al., J. Mol. Biol. 262: 270 (1996); Litowski et al., J. Biol. Chem. 277: 37272 (2002)). (b) La macrociclización del andamiaje dimérico ayudaría a los contactos interpeptídicos y a la formación de hélices. (c) Los contactos interhelicoidales no covalentes pueden fortalecerse mediante la sustitución con enlaces covalentes (Patgiri et al., Acc. Chem. Res. 41: 1289 (2008); Zhou et al., Biochemistry 32: 3178 (1993); Haney et al., Chemistry 19: 11342 (2013)). Cada uno de estos modelos fue evaluado sistemáticamente. Los estudios revelaron que el reemplazo de un enlace iónico interhelicoidal con un enlace covalente proporciona un enfoque general y versátil para la estabilización de dímeros de hélice corta. Los imitadores de hélices enrolladas antiparalelas y restringidas se caracterizaron ampliamente mediante dicroísmo circular (CD) y espectroscopias de RMN 2D, y luego el diseño se aplicó a la modulación de un PPI involucrado en la leucaemogénesis, donde la formación de complejos depende del ensamblaje de hélice enrollada.

[0969] Primero se determinó si una hélice preformada podría nuclear la conformación helicoidal en un péptido unido. Se utilizó la estrategia del sustituto del enlace de hidrógeno (HBS) (Wallimann et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 1203 (2003); Patgiri et al., Acc. Chem. Res. 41: 1289 (2008)) para estabilizar la conformación helicoidal en el péptido. A, y un enlazador GGSSGG (SEQ ID NO:20) (Hadley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 105: 530 (2008)) se instaló entre la hélice HBS-A y el péptido B para sintetizar AB-1 como un posible motivo hélice-buclehélice antiparalelo (Figura 10B). Sin embargo, los estudios de CD indicaron una firma helicoidal débil en AB-1 que recuerda a una única hélice corta estabilizada mediante el enfoque HBS (Figura 3B).

[0971] A continuación, se probó si la macrociclización de péptidos A y B con dos bucles (GGSSGG (SEQ ID NO: 20) y GGSNGG (SEQ ID NO: 21)) (AB-2: ciclo(GGSSGGELAELEWRLGGSNGGLAERIARLR (SEQ ID NO: 4)) podría inducir la asociación de dímeros helicoidales en ambas secuencias (Figura 10C). Este andamio limitaría potencialmente el deshilachado en los cuatro extremos peptídicos y al mismo tiempo promovería interacciones hidrofóbicas entre cadenas. Sin embargo, la espectroscopia de CD reveló nuevamente una helicidad mínima, lo que sugiere que la macrociclización no condujo a una estabilidad conformacional significativa en relación con la estrategia h Bs (Figura 3B). Posteriormente, se determinó si un enlace disulfuro interhelicoidal en lugar de un apareamiento hidrofóbico conduciría a un dímero de hélice estable (Figura 10D). Hodges y colaboradores han demostrado previamente que la mutación de residuos hidrófobos para crear puentes disulfuro con residuos de cisteína aumenta la estabilidad de la hélice enrollada al tiempo que preserva la estructura de la hélice enrollada (Zhou et al., Biochemistry 32: 3178 (1993)). Su trabajo seminal sirve como base del actual diseño de disulfuro. Un péptido de bis-cisteína (AB-3: ECAEl Ew RLGGSSGGLAERIARCR (SEQ ID NO: 5)) se sintetizó en resina seguido de formación de disulfuro y se caracterizó su contenido helicoidal por CD (Figura 3B). El análisis reveló que este enfoque tampoco proporcionó una estabilización helicoidal significativa en secuencias cortas.

[0973] Las redes de puentes salinos contribuyen significativamente a la alineación de la cadena de hélice enrollada, así como a la estabilidad general de la hélice ((Woolfson, Adv. Protein Chem. 70:79 (2005); O'Shea et al., Cell 68: 699 (1992); Steinmetz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 104: 7062 (2007)); aunque existe debate (Lavigne et al., Science 271: 1136 (1996)); Lumb et al., Science 268: 436 (1995)), se cree que los puentes salinos individuales estabilizan las hélices y las hélices enrolladas en <0.5 kcal/mol (Spek et al., Protein Sci. 7: 2431 (1998); Zhou et al., J. Mol. Biol. 237: 500 (1994); Marqusee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 84: 8898 (1987)). Se previó que la sustitución de un enlace iónico interhelicoidal débil en las posiciones g/g' o e/e' con un enlace covalente ofrecerían una opción atractiva para estabilizar los dímeros helicoidales (Figura 10E). Los enlazadores de bis-trizol se forman a través de la reacción de cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (Meldal et al., Chem. Rev. 108: 2952 (2008)); Rostovtsev et al., Angew. Chem. Int. Ed. 4: 2596 (2002)) fueron diseñados para restringir los péptidos A y B (Figuras 11A-D) (Torres et al., ChemBiochem 9: 1701 (2008); Horne et al., J. Am. Chem. Soc. 126: 15366 (2004); Angell et al., Chem. Soc. Rev. 36: 1674 (2007)); Holub et al., Chem. Soc. Rev. 39: 1325 (2010)). Se incorporaron puentes de bis-triazol de longitudes variables resultantes de residuos de azidoalanina, azidohomoalanina y azidolisina en las posiciones e/e' para obtener dímeros AB-4, AB-5, y AB-<6>, respectivamente (véase la Figura 11A). Las cadenas laterales azido se hicieron reaccionar con éter propargílico para obtener los enlazadores bis-triazol. La síntesis en fase sólida de AB-4-AB-6 se describe en el Ejemplo 5 más arriba. El análisis de CD revela que el reemplazo de un enlace iónico con un enlace covalente tiene un efecto dramático en la estabilidad conformacional de una manera dependiente de la longitud del enlace (Figura 11B). Basado en la intensidad del mínimo de 222 nm y la relación 222/208 nm, se encontró que las construcciones AB-4 y AB-5 derivadas de azidolisina y azidohomoalanina eran significativamente más helicoidales que AB-<6>.

[0975] La estabilidad conformacional del dímero de hélice entrecruzada (CHD) AB-4 (Figura 11C) se evaluó además utilizando una combinación de RMN de 1D, espectroscopia de correlación total (TOCSY) y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) en 10 % de d3-C ^C N en H<2>O con 0.1 % de TFA (pH 5). Se encontró que era necesaria la adición de 10 % de acetonitrilo para limitar la agregación del péptido a la concentración de 0.5 mM necesaria para la RMN. El espectro de NOESY reveló picos cruzados NOE indicativos de una estructura terciaria helicoidal, mostrando una secuencia dNN (i, i+1) y varios NOE de intervalo medio (daN (i, i+3)) lo que sugiere hélices a estables (Figuras 5A-B). Además, los ángulos diedros de la cadena principal (O) calculados a partir de constantes de acoplamiento<3>Jnhcho caen en el intervalo esperado para las hélices a canónicas ( Kurt Wüthrich, NMR OF PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS (1986)). Los ángulos diedros encontrados para los residuos de azidolisina entrecruzados no difirieron de los calculados para el resto de los residuos en el dímero helicoidal. Un modelo estructural de AB-4 se calculó utilizando 65 picos cruzados NOESY y 18 restricciones O (Figura 11D).

[0977] Ejemplo 14 - Imitaciones de hélices enrolladas del dominio de homología de Nervy dos (NHR2) del complejo del factor de transcripción que contiene AML1-ETO (AETFC)

[0979] Para establecer que la estrategia CHD se puede traducir de una secuencia diseñada a una proteína nativa de hélice enrollada, se desarrollaron imitaciones del dominio de homología Nervy dos (NHR2) del complejo del factor de transcripción que contiene AML1-ETO (AETFC) que interactúa con el motivo de unión a NHR2 (N2B) de las proteínas E (Sun et al., Nature 500: 93

[0981] (2013)). Este complejo es fundamental para la leucaemogénesis y presenta una hélice enrollada antiparalela y dimérica desde n Hr 2 en la interfaz para unirse a N2B (Figura 12A). Escaneo computacional de alanina (véase la Tabla 4 a continuación) y datos de mutagénesis experimental (Sun et al., Nature 500: 93 (2013)), revelan los residuos E501, H504, L508, V525 y S522 como claves para la unión.

[0983] Tabla 4: Análisis de la interacción NHR2-N2B. Los residuos de puntos calientes se identificaron mediante escaneo computacional de alanina (Kortemme et al., Sci. Signal. 2004: pl2 (2004); Sun et al., Nature 500: 93

[0985] (2013)).

[0987] Secuencia AAG del análisis de Rosetta en kcal/mol 501 - EWKHLDHLN (SEQ ID NO: 22) E501 (1.41)

[0988] H504 (1.81)

[0989] L508 (1.40)

[0990] 518 - KTRRSLTVLR (SEQ ID NO: 23) V525 (1.05)

[0991] S522 (enlace de hidrógeno)

[0993] Para investigar el potencial de un puente de bis-triazol para inducir una conformación helicoidal dimérica estable en una secuencia de NHR2, se insertaron residuos de azidolisina en la posición e/e" de la secuencia nativa para obtener CHD-NHR2-1: gEWKHLZHLLNb/c' KTRRSLTVLZe' (SEQ ID NO:<6>/SEQ ID NO: 7) (Figura 12B, arriba). La espectroscopia CD mostró que esta construcción es en gran parte no helicoidal (Figura 12C). Este resultado se atribuyó a la falta de contribución estabilizadora de la tríada vertical hidrofóbica, ya que la secuencia nativa contiene triptófano grande potencialmente disruptivo y treonina polar dentro del interior de su núcleo hidrofóbico (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE UU 101:16156 (2004); Akey et al., Biochemistry. 40: 6352 (2001)). La secuencia nativa también contiene dos residuos cargados positivamente cerca del terminal amino, lo que probablemente reduce la estabilidad helicoidal. CHD-NHR2-1 fue rediseñado para incluir los residuos hidrófobos óptimos de AB-4 y puentes salinos intrahelicoidales en las posiciones i e i+3 mientras se conservan los residuos nativos que interactúan con N2B para obtener CHD-NHR2-2: gELWHLZELLRb/c'ELWRSIRVLZe' (SEQ ID NO:<8>/SEQ ID NO: 9) (Figura 12B, mitad). La secuencia rediseñada es significativamente más helicoidal que la original, como lo demuestra la intensidad del mínimo de<2 2 2>nm y la relación de las bandas de 222 nm y 208 nm (Figura 12C). Sin embargo, la estabilidad helicoidal general de esta secuencia nativa permaneció baja (<8222>< 10,000) en comparación con la secuencia diseñada AB-4 (<8222>= 14,000). Este resultado motivó la reevaluación del enfoque de estabilización para determinar si se pueden imponer restricciones adicionales para estabilizar el dímero en el contexto de secuencias biológicas difíciles.

[0994] La colocación de más de un enlazador en la posición g/g' no es deseable ya que influiría en la superficie de unión. Aunque el puente disulfuro interno no ofreció una estabilidad significativa en el contexto de una atadura flexible (AB-3), se buscó determinar el efecto de los enlaces disulfuro interhelicoidales en la mejora de la estabilidad del dímero entrecruzado de triazol CHD-NHR2-2.

[0996] Los puentes disulfuro pueden colocarse en diferentes posiciones a/d dentro de CHD-NHR2-2 de tal manera que estén ubicados adyacentes al enlace triazol en las posiciones e/e' o más alejadas (Figura 12D y Figuras 13A-C). Se conjeturó que la ubicación del enlace disulfuro más alejado del puente triazol tendría el mayor impacto en la estabilidad de la hélice, ya que el sustituto del puente salino diseñado puede no ser un nucleador de hélice óptimo (Patgiri et al., "Acc. Chem. Res. 41: 1289 (2008)). Los resultados apoyan esta hipótesis. CHDDS-NHR2-3 (gELWHLZELCRb/c'ECWRSIRVLZe' (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11)) (Figura 12B, abajo) en la que el disulfuro se encuentra distal al puente de triazol que es significativamente más helicoidal, de acuerdo con la espectroscopia CD, que CHDDS-NHR2-4 (gELWHCZELLRb/c'ELWRSCRVLZe' (SEQ ID NO: 12/SEQ ID NO: 13)) y CHDDS-NHR2-5 (gECWHLZELLRb/c'ELWRSIRVCZe' (SEQ ID NO: 14/SEQ ID NO: 15)) donde los enlaces disulfuro se colocan cerca del enlazador triazol (Figuras 13A-C). CHDDS-NHR2-3 también es significativamente más helicoidal que CHD-NHR2-2, con la firma general del CD similar en intensidad a la de la construcción artificial AB-4 (Figura 12C).

[0998] Se determinaron las afinidades de unión de los miméticos de NHR2 diseñados para correlacionar sus atributos de reconocimiento molecular con la estabilidad conformacional. Se utilizó un ensayo de polarización de fluorescencia descrito previamente con un péptido N2B marcado con fluoresceína para evaluar la unión de los dímeros entrecruzados en comparación con la hélice enrollada NHR2 nativa (NHR<2482>-<551>) (Sun et al., Nature 500: 93 (2013)). El dominio nativo NHR2 se une al péptido N2B de acuerdo con los resultados publicados (Kd = 356 ± 90 |<j>M), mientras que CHD-NHR2-1, CHD-NHR2-2, y CHDDS-NHR2-3 dirigen N2B con valores de Kd > 10,000<j>M, 212 ± 80<j>M, 66 ± 20<j>M respectivamente, destacando la influencia de la estabilidad conformacional en el reconocimiento molecular (véase Tabla 5 a continuación). Como se esperaba, el dímero doblemente entrelazado, con mayor estabilidad conformacional, se une al objetivo con la mayor afinidad. La afinidad cinco veces mejorada del mimético CHDDS-NHR2-3 mucho más corto (20 residuos) frente a la hélice enrollada NHR2 nativa (138 residuos) es notable y respalda los principios de diseño actuales.

[1000] Tabla 5. Secuencias y afinidades de unión de los imitadores nativos de hélice enrollada NHR2 y de dímero de hélice entrelazada (CHD).

[1001] Compuesto_____________________________Secuencia3_____________________________ Kd (j M)¿

[1002] NHR2 GST-NHR2(482-551) 356 ± 90

[1003] CHD-NHR2-1 EWKHLZHLLN/KTRRSLTVLZ (SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7) >10.000

[1004] CHD-NHR2-2 ELWHLZELLR/ELWRSIRVLZ (SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9) 212 ±80

[1005] CHDDS-NHR2-3 ELWHLZELCR/ECWRSIRVLZ SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11) 66 ± 20

[1006] CHD-NHR2-6 ALWHLZEALR/ELWRSIRVLZ (SEQ ID NO: 24/SEQ ID NO: 9) >3000

[1007] CHD-NHR2-7________ ELWHLZELLR/ELWRAIRALZ (SEQ ID NO: 8/SEQ ID: 25)__________ > 3000

[1008] aZ = enlazador bis-triazol derivado de azidolisina; las mutaciones de alanina están subrayadas. b Afinidad de unión calculada utilizando un ensayo de polarización de fluorescencia con péptido N2B marcado con fluoresceína.

[1010] A continuación, se investigó si los contactos de ambas hélices son necesarios para la unión al péptido N2B -es decir, si la construcción dimérica es necesaria para interactuar con el péptido objetivo. Se sugiere que los residuos S522 y V525 en una cadena de hélice y E501 y L508 en la cadena opuesta son críticos para la unión. CHD-NHR2-6 (S522A/V525A) y CHD-NHR2-7 (E501A/L508A) fueron diseñados como controles para CHD-NHR2-2, y contienen mutaciones de alanina en una cadena por dímero mientras conservan la secuencia CHD-NHR2-2 en la otra cadena (véase Tabla 5 anterior). Ambas construcciones de control se unieron a N2B con afinidad disminuida (Kd>3000<j>M) lo que respalda el requisito de residuos críticos en cada cadena helicoidal y la hipótesis actual de que se necesita un dímero para activar dichos PPI.

[1012] En resumen, se investigaron varias estrategias de estabilización para diseñar imitaciones mínimas de estructuras terciarias helicoidales. Los estudios actuales revelan que el reemplazo juicioso de contactos iónicos interhelicoidales con enlaces covalentes y la sustitución de interacciones hidrofóbicas internas con enlaces disulfuro producen conformaciones helicoidales diméricas estables en secuencias biológicas difíciles. Los principios de diseño se aplicaron a la estabilización de secuencias cortas de un ensamblaje biológico para evaluar el potencial de los miméticos mínimos para reproducir interacciones de unión nativas de hélices enrolladas de proteínas mucho más largas. Los estudios actuales ilustran que los miméticos son capaces de participar en el reconocimiento biomolecular con alta especificidad ya que la mutación de residuos específicos anula la unión. Previamente examinamos las hélices enrolladas y los haces de hélices que median la formación de complejos para crear una plataforma para el descubrimiento de posibles miméticos de la estructura terciaria e identificamos características críticas de estas interfaces helicoidales con respecto a las hélices enrolladas y otras PPI helicoidales (Watkins et al., "Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs," J. Am. Chem. Soc. 137: 11622-11630 (2015)). El análisis reveló que más de 300 complejos biomédicamente relevantes en el actual Banco de Datos de Proteínas requerirán un dímero de hélice o un imitador de hélice enrollada para su inhibición, porque los residuos del punto caliente residen en dos hélices vecinas (Watkins et al., "Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs," J. Am. Chem. Soc. 137: 11622­ 11630 (2015)). Dada la ubicuidad de las PPI mediadas por hélice enrollada (Watkins et al., "Protein-Protein Interactions Mediated by Helical Tertiary Structure Motifs," J. Am. Chem. Soc., 137: 11622-11630 (2015)), se espera que los imitadores de hélices enrolladas resulten ser pistas útiles para el diseño de ligandos.

[1013] Ejemplo 15 - Enlazador Adicional

[1014] También se han sintetizado miméticos de hélice enrollada que contienen el siguiente enlazador, utilizando un precursor bromado y acoplando el precursor a cadenas laterales de cisteína.

[1017]

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Una macroestructura que comprende:

(i) una estructura de hélice enrollada antiparalela de fórmula:

(vista de rueda helicoidal)

(vista bidimensional)

donde:

cada O y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete y hasta 21 residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde

a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina;

cada está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos de aminoácidos, donde:

cada Enlazador A es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido g'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A;

cada Enlazador B es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido d'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

cada Enlazador C es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido a'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

cada Enlazador D es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido e'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A; y

al menos un Enlazador A o Enlazador D está presente y el o cada Enlazador A o Enlazador D se selecciona independientemente del grupo que consiste en

marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo enlazado;

cada Enlazador B y Enlazador C, cuando está presente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno, éteres, tioéteres, amidas, maleimidas, ésteres, disulfuros, diseleniuros, -O-, -S-, -Se-, y cualquier combinación de los mismos;

cada

es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PGi es un grupo protector para la protección de una amina; y

cada

es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O)alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico; y

donde, en O y ®, cuando está presente, g<1>es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; f<2>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; g<2>es Leu, Met, Ala, His o Ser;

a<3>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, aliiglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<3>es cualquier residuo; c<'1>es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; d<'1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<'1>es cualquier residuo; f<'1>es cualquier residuo; g<'1>es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; a<'2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<'2>es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; c<'2>es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; d<'2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e<'2>es cualquier residuo, donde cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par g-g' o e<2>-e'<2>;

o (ii) una estructura de hélice enrollada paralela de fórmula

(vista de rueda helicoidal)

(vista bidimensional)

donde:

cada O y cada ® está ausente de forma independiente o es un residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete y hasta 21 residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice, donde

a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada y

cada residuo de aminoácido ® es un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina;

cada ' ' está ausente o es un enlazador covalente (Enlazador) entre dos residuos de aminoácidos, donde:

cada Enlazador E es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido g* y un residuo de aminoácido e'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido g* y la posición Ca del residuo de aminoácido e'* es 10-25 A;

cada Enlazador F es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido d* y un residuo de aminoácido d'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido d* y la posición Ca del residuo de aminoácido d'* es 5-15 A;

cada Enlazador G es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido a* y un residuo de aminoácido a'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido a* y la posición Ca del residuo de aminoácido a'* es 5-15 A;

cada Enlazador H es independientemente un enlazador entre un residuo de aminoácido e* y un residuo de aminoácido g'*, donde la longitud del enlazador es tal que la distancia espacial entre la posición Ca del residuo de aminoácido e* y la posición Ca del residuo de aminoácido g'* es 10-25 A; y

al menos un Enlazador E o Enlazador H está presente y el o cada Enlazador E o Enlazador H se selecciona del grupo que consiste en

donde cada

marca un punto de conexión con el carbono Ca en un residuo enlazado;

cada Enlazador F y Enlazador G, cuando está presente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquileno, alquenileno, arileno, heteroarileno, éteres, tioéteres, amidas, maleimidas, ésteres, disulfuros, diseleniuros, -O-, -S-, -Se-, y cualquier combinación de los mismos;

cada

es un punto de unión de un nitrógeno terminal a H, -PG<1>, -C(O)R, -C(O)NR<2>, -C(O)NH<2>, -R, -C(O)OR, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<1>es un grupo protector para la protección de una amina; y

cada

es un punto de unión de un carbonilo terminal a H, -OPG<2>, -NPG<2>, -OR, -OH, -NR<2>, -NH<2>, -NRC(O)alquilo C<1-6>, -NHC(O) alquilo C<1-6>, un aminoácido, un péptido, una etiqueta o una fracción de direccionamiento, donde cada R es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un arilalquilo, un péptido, una fracción de direccionamiento o una etiqueta; y donde PG<2>es un grupo protector para la protección de un ácido carboxílico; y

donde, en O y ®, cuando está presente, fo es cualquier residuo; go es Trp, Met, Phe, Ala, Glu o His; a<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b es cualquier residuo; c es Gln, Trp, Leu, Phe, Tyr o Met; d<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<1>es cualquier residuo; f es cualquier residuo; g<1>es cualquier residuo; a<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b<2>es cualquier residuo; c<2>es cualquier residuo; d<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val,

alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e<2>es cualquier residuo; g'o es cualquier

residuo; a'<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<1>es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; c'<1>es cualquier residuo; d'<1>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; e'<1>es His, Phe, Trp, Tyr,

Val, Leu o Ile, e'<1>es cualquier residuo; Í<1>es cualquier residuo; g'<1>es cualquier residuo; a'<2>es Cys, HCys, Leu,

Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; b'<2>Asp, Asn, Glu, Gln,

Tyr, Ser o Thr; c'<2>es cualquier residuo; d'<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina, e'<2>es His, Phe, Trp, Tyr, Val, Leu o Ile; f'<2>es cualquier residuo; donde

cualquier residuo de aminoácido puede modificarse para la unión de Z, que es un enlazador covalente (por

ejemplo, un enlazador de bis-triazol) entre el par e<2>-g'<1>.

2. La macroestructura de la reivindicación 1, donde al menos uno del Enlazador B, Enlazador C, Enlazador F y Enlazador G, cuando está presente:

(i) se selecciona independientemente del grupo que consiste en disulfuros, diseleniuros, alquileno C<1-8>, alquenileno C<2-8>, arileno, heteroarileno, triazol-diilo y tiazol-diilo; por ejemplo

(ii) es independientemente un enlace disulfuro de un residuo de cisteína u homocisteína, un diseleniuro de un

residuo de selenocisteína, un alquileno de un residuo de alilglicina o un enlazador arileno.

3. La macroestructura de la reivindicación 1, donde está presente un Enlazador o están presentes dos Enlazadores.

4. La macroestructura de la reivindicación 1, donde:

(i) (a) está presente al menos un Enlazador A o un Enlazador D y está presente al menos un Enlazador B o un Enlazador C o (b) está presente al menos un Enlazador E o un Enlazador H y está presente al menos un Enlazador F o un Enlazador G; o

(ii) (a) está presente un Enlazador A o un Enlazador D y está presente un Enlazador B o un Enlazador C o (b)

está presente un Enlazador E o un Enlazador H y está presente un Enlazador F o un Enlazador G.

5. La macroestructura de la reivindicación 1, donde:

(i) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula III:

donde:

a<1>*, a<2>*, a3*, b<1>, b<2>, b3, c<1>, c<2>, c3, d<1>*, d<2>*, d3*, e<1>*, e<2>*, e3*, fi, f<2>, f3, go*, g<1>*, g<2>*, aV*, a<2>'*, a3'*, bV, b<2>', b3', c<1>', c<2>',

c3', d<1>'*, d<2>'*, d3'*, e<1>'*, e<2>'*, e3'*, fo', f<1>', f<2>', go'*, g<1>'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausentes o un

residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete residuos de aminoácidos contiguos estén presentes en cada hélice;

d<3>'*cada uno independientemente tie

donde:

R1a, R1b, R1c, y R1d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al menos uno de R1a y R1c es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina; y

cuando un Enlazador B o un Enlazador C está unido al residuo de fórmula (a), el Enlazador B o el Enlazador C está unido a o reemplaza a uno de R1a, R1b, R1c, y R1d;

e-i*, e<2>*, e<3>*, g-i*, g<2>*, e-T*, e<2>'*, e<3>'*, go'*, gi'*, y g<2>'* cada uno independientemente tiene la fórmula (b) y go* tiene la fórmula (b')

donde:

R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos; y

el o cada al menos un Enlazador A o Enlazador D está unido a un residuo de fórmula (b) y el Enlazador A o Enlazador D está unido a o reemplaza uno de R2a, R2b, R2c, y R2d;

bi, b<2>, b3, ci, c<2>, c3, fi, f<2>, f<3>, bi', b<2>', b3', ci', c<2>', c3', fi', y f<2>' cada uno independientemente tiene la fórmula (c) y fo' tiene la fórmula (c')

donde cada R3 es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o - SR5;

cada R4 es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo; y

cada R5 en la Fórmula III se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -PG (donde PG es un grupo protector), un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo y un arilalquilo; o

(ii) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada paralela de Fórmula IV:

donde:

ai*, a<2>*, a3*, di*, d<2>*, d3*, ei*, e<2>*, e3*, go*, gi*, g<2>*, ai'*, a<2>'*, a3'*, bi', b<2>', b3', ci', C<2>', C<3>', di'*, d<2>'*, d3'*, ei'*, e<2>'*,

e<3>'*, fo', fi', f<2>', go'*, gi'*, y g<2>'* están cada uno independientemente ausentes o un residuo de aminoácido modificado o no modificado, con la condición de que al menos siete residuos de aminoácidos contiguos estén

presentes en cada hélice;

y d<3>'* cada uno independientemen

donde:

Ria, Rib, Ric, y Rid son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

menos uno de Ria y Ric es una cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del

grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina; y

cuando un Enlazador G o un Enlazador F está unido al residuo de fórmula (a), el Enlazador G o el Enlazador F

está unido a o reemplaza a uno de Ria, Rib, Ric, y Rid;

cada uno independientemen

donde:

R2a, R2b, R2c, y R2d son cada uno independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un alquilo,

un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada

cadena lateral de aminoácido, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo

puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o -SR5; y al

menos uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos; y

el o cada al menos un Enlazador E o Enlazador H está unido a un residuo de fórmula (b) y el Enlazador E o Enlazador H está unido a o reemplaza uno de R2a, R2b, R2c, y R2d;

bi, b<2>, b3, ci, c<2>, c3, fi,

3', fi', y f<2>' cada uno independ fo' tienen la fórmula (c')

donde cada R3 es independientemente hidrógeno, una cadena lateral de aminoácidos, un alquilo, un alquenilo,

un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo, un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo, donde cada cadena lateral

de aminoácidos, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo y arilalquilo puede estar opcionalmente sustituido con H, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, una azida, -OR5, o - SR5;

cada R4 es independientemente hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un heterociclilo,

un arilo, un heteroarilo o un arilalquilo; y

cada R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, -PG (donde PG es un grupo protector),

un alquilo, un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo y un arilalquilo.

6. La macroestructura de la reivindicación 5, donde:

6o

(i) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada antiparalela de Fórmula III y se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

(A) en al menos un residuo de fórmula (a), (i) uno de R1a y R1c es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina, y (ii) R1b, R1d, y el otro de R1a y R1c son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>, o un alquenilo C<2-3>;

(B) en al menos un residuo de fórmula (b), (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>; o

(ii) la macroestructura comprende una estructura de hélice enrollada paralela de Fórmula IV y se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

(A) en al menos un residuo de fórmula (a), (i) uno de R1a y R1c es la cadena lateral de un aminoácido modificado o no modificado seleccionado del grupo que consiste en cisteína, homocisteína, selenocisteína, leucina, isoleucina, hexafluoroleucina, valina, hexafluorovalina, alilglicina y treonina, y (ii) R1b, R1d, y el otro de R1a y R1c son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C<1-3>, o un alquenilo C<2-3>;

(B) en al menos un residuo de fórmula (b), (i) uno de R2a y R2c es una cadena lateral de aminoácidos y (ii) R2b, R2d, y el otro de R2a y R2c son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo C<1-3>.

7. La macroestructura de la reivindicación 1, donde la macroestructura comprende la estructura de hélice enrollada antiparalela.

8. La macroestructura de la reivindicación 7, donde:

(i) la primera cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados, donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos tienen la fórmula gX1-X2-X3-X4-X5-Xa-X7-Xa-Xg-X10b, donde X<1>es Glu, Leu, Arg, Lys, Thr o Val; X<2>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<3>es cualquier residuo; X<4>es His, Tyr, Phe, Lys, Gln o Trp; X<5>es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X6 es cualquier residuo; X<7>es Glu, Asn, Trp, Leu, Glu o Gln; Xa es Leu, Met, Ala, His o Ser; Xg es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; y X<10>es cualquier residuo;

(ii) la segunda cadena de la estructura de hélice enrollada antiparalela comprende al menos diez residuos de aminoácidos contiguos modificados o no modificados, donde los al menos diez residuos de aminoácidos contiguos tienen la fórmula c'X1'-X2'-X3'-X4'-X5'-Xa'-X7'-Xa'-Xg-X10e', donde X<1>' es Glu, Asn, Leu, Gln, Met o Ala; X<2>' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<3>' es cualquier residuo; X<4>' es cualquier residuo; X<5>' es Ala, Ser, Thr, Gly o Asp; Xa' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; X<7>' es Arg, Leu, Gln, Met, Glu o Asp; Xa' es Tyr, Val, Phe, Trp o Met; Xg' es Cys, HCys, Leu, Ile, alilleucina, Val, alilglicina, Thr, selenocisteína, hexafluoroleucina o hexafluorovalina; y X<10>' es cualquier residuo;

(iii) g, b, c', y e' indican dónde aparecen los diez aminoácidos contiguos dentro de la estructura de hélice enrollada antiparalela;

(iv) los residuos en las posiciones e/e' y g/g' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un enlazador o reemplazarse con un Enlazador, si está presente; y

(v) los residuos en las posiciones a/a' y d/d' pueden modificarse opcionalmente para facilitar la unión de un Enlazador, si está presente.

9. La macroestructura de la reivindicación 1, donde la macroestructura es

o

donde a, b, c, d, e, f, g, a', b', c', d', e', f' y g' indican la ubicación de los residuos de aminoácidos dentro de la estructura de hélice enrollada;

E es ácido glutámico; I es isoleucina; L es leucina; H es histidina; C es cisteína; Z es el enlazador bistriazol derivado de azidolisina; R es arginina; S es serina; V es valina; y W es triptófano.

10. La macroestructura de la reivindicación 1, donde la macroestructura comprende la estructura de hélice enrollada paralela.

11. Una composición farmacéutica que comprende una macroestructura de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Una macroestructura como se describe en la reivindicación 1, donde la macroestructura consiste en dicha estructura de hélice enrollada antiparalela (i) o en dicha estructura de hélice enrollada paralela (ii).