ES3041237T3 - Mutant fragments of ospa and methods and uses relating thereto - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones útiles para la prevención y el tratamiento de la infección por Borrelia. En particular, se refiere a un polipéptido inmunogénico que comprende un fragmento C-terminal híbrido de la proteína de superficie externa A (OspA), un ácido nucleico que lo codifica, una célula huésped que contiene dicho ácido nucleico, un método para la producción del polipéptido y una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o el ácido nucleico, especialmente para su uso como medicamento o vacuna, o para su uso en un método de tratamiento o prevención de la infección por Borrelia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones y a su uso en métodos para la prevención y el tratamiento de la infección porBorreliaEn particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende un fragmento híbrido C-terminal de una proteína de superficie externa A (OspA), la composición farmacéutica para uso como medicamento o en un método para el tratamiento o la prevención de una infección porBorreliay a un kit que comprende la composición farmacéutica y una segunda composición.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La borreliosis de Lyme, o enfermedad de Lyme, es la enfermedad transmitida por garrapatas más comúnmente reseñada en Europa y Norteamérica. La enfermedad es provocada por la infección con la espiroqueta similar a gram-negativa, transmitida por artrópodos,Borrelia burgdorferien sentido amplio(B. burgdorferis.l.), y puede afectar múltiples órganos o tejidos, resultando en trastornos cutáneos, cardíacos, musculoesqueléticos y neurológicos. En la mayoría de los países, la borreliosis de Lyme no es una enfermedad de declaración obligatoria; por lo tanto, no se dispone de datos exactos sobre las tasas de incidencia anuales. En Estados Unidos, el agente causante esB. burgdorferien sentido estricto (B.burgdorferis.s.) y la borreliosis de Lyme se localiza en los Estados del noreste, del Atlántico medio y del centro-norte superior. En 2010, se reportaron aproximadamente 30,000 casos de borreliosis de Lyme a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EE.UU. Un informe actualizado de los CDC en 2013, que tiene en cuenta datos de diagnóstico de otras fuentes, estima que el número real de casos nuevos por año en los Estados Unidos está más cerca de 300.000 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html). En Europa,B. afzeliiyB. gariniison los principales agentes causales de la borreliosis de Lyme, así comoB. burgdorferis.s. yB. bavariensis,que contribuyen en menor medida dependiendo de la ubicación geográfica. La prevalencia de la borreliosis de Lyme varía considerablemente en diferentes países europeos con un aumento general de la prevalencia de oeste a este. En gran parte de Europa, el número de casos notificados de borreliosis de Lyme ha aumentado desde principios de la década de 1990(p. e j,República Checa, Estonia, Lituania; véase Lyme borreliosis in Europe, informe de la OMS de 2006), y la distribución geográfica de los casos también se ha expandido.

Borreliapertenece a la familiaSpirochaetaceae,que se subdivide en los génerosTreponema, LeptospirayBorrelia,de importancia médica.B. burgdorferis.l. es una bacteria gram-negativa de forma en espiral, de movilidad vigorosa, de aproximadamente 10-20 gm de larga y 0,2-0,5 gm de ancha, que crece en condiciones microaerófilas. La pared celular de la espiroqueta consiste en una membrana citoplasmática rodeada de peptidoglicano y varios flagelos, y posteriormente por una membrana externa laxa.

La borreliosis de Lyme se presenta generalmente en fases caracterizadas por diferentes manifestaciones clínicas, con remisiones y exacerbaciones. La fase 1, infección temprana, consiste en una infección localizada de la piel, seguida en el espacio de días o semanas por la fase 2, infección diseminada, y meses o años más tarde por la fase 3, infección persistente. Sin embargo, la infección es variable; algunos pacientes solo presentan infecciones localizadas de la piel, mientras que otros solo presentan manifestaciones tardías de la enfermedad tales como artritis. Diferentes síndromes clínicos de borreliosis de Lyme también son provocados por la infección con diversas especies deB. burgdorferis.l.B. burgdorferis.s. provoca con mayor frecuencia manifestaciones articulares (artritis) y problemas cardíacos,B. afzeliiprovoca principalmente síntomas dérmicos (eritema migratorio; EM y acrodermatitis crónica atrófica; ACA), mientras queB. gariniiestá implicada en la mayoría de los casos de neuroborreliosis.

Infección localizada - El síntoma más común de la fase 1 de una infección es el eritema migratorio, que se presenta en el 70-80 % de las personas infectadas. Esta lesión cutánea va seguida a menudo de síntomas gripales, tales como mialgia, artralgia, cefalea y fiebre. Estos síntomas inespecíficos se presentan en el 50 % de los pacientes con eritema migratorio.

Infección diseminada - Durante la fase 2, las bacterias se desplazan al torrente sanguíneo desde el foco de infección hasta los tejidos y órganos distales. Los síntomas neurológicos, cardiovasculares y artríticos que se presentan en esta fase incluyen meningitis, neuropatía craneal y artritis inflamatoria intermitente.

Infección persistente - La fase 3 de la infección es crónica y se presenta desde meses hasta años después de la picadura de la garrapata. El síntoma más común en Norteamérica es la artritis reumatoide, provocada por una infección conB. burgdorferis.s. La infección persistente del sistema nervioso central conB. gariniiprovoca síntomas neurológicos más graves durante la fase 3, y una infección persistente de la piel conB. afzeliiresulta en acrodermatitis crónica atrófica.

En algunos casos de riesgo, tales como los granjeros, trabajadores forestales, senderistas, corredores o turistas, la seroprevalencia y las tasas de incidencia de la enfermedad han aumentado, así como en niños menores de 15 años y adultos de entre 39 y 59 años, sin preferencia de género. Esta incidencia incrementada de la borreliosis de Lyme está ligada a cambios en los hábitats forestales, así como con factores sociales. Los cambios medioambientales, tales como la fragmentación de los bosques, han conducido a una drástica reducción de roedores depredadores, tales como zorros y aves rapaces, lo que a su vez ha provocado un aumento de la población de ratones, con el consiguiente aumento de la población de garrapatas. Más recientemente, la reforestación irregular ha incrementado el número de ciervos y, por lo tanto, el de garrapatas. La expansión suburbana y el creciente uso de zonas forestales para actividades recreativas, tales como acampar y hacer senderismo, han puesto a los seres humanos en mayor contacto con un mayor número de vectores de garrapatas deBorrelia.Todos estos factores en conjunto han contribuido a una mayor distribución deBorreliay a una mayor incidencia de la borreliosis de Lyme.

Los agentes antimicrobianos son el principal método de tratamiento de una infección porBorrelia.El antibiótico utilizado depende de la fase de la enfermedad, los síntomas y las alergias del paciente a medicamentos. La duración del tratamiento antibiótico también depende de la fase de la enfermedad y de la gravedad de los síntomas. La borreliosis de Lyme temporana se trata típicamente con tetraciclinas orales tales como la doxiciclina, y penicilinas semisintéticas, tales como la amoxicilina o la penicilina V. Los trastornos artríticos y neurológicos se tratan con penicilina G o ceftriaxona intravenosas en dosis altas. Hasta un 30 % de los pacientes con borreliosis de Lyme no presentan los síntomas iniciales característicos de la infección porBorrelia,lo que dificulta el diagnóstico y el tratamiento. El tratamiento antibiótico puede ser prolongado (hasta varios meses) y, en ocasiones, ineficaz y, por lo tanto, es objeto de debate en el campo de laBorrelia,especialmente durante las fases avanzadas de la enfermedad. Incluso en el caso de un tratamiento eficaz contra laBorrelia,los pacientes pueden sufrir posteriormente fatiga, dolor o síntomas neurológicos debilitantes durante años, lo que se conoce como síndrome de Lyme postratamiento. En general, el uso de antibióticos puede tener consecuencias indeseables, tales como el desarrollo de resistencia por parte de los microorganismos diana. Finalmente, la terapia con antibióticos puede curar eficazmente la borreliosis de Lyme, pero no proporciona protección contra infecciones posteriores.

Una vacuna monovalente basada en OspA de serotipo 1 (LYMErix™) fue aprobada y comercializada en EE.UU. para la prevención de la enfermedad de Lyme provocada porBorrelia burgdorferis.s., pero ya no está disponible. Además, la heterogeneidad en las secuencias de OspA entre diferentes serotipos en Europa y otros lugares impide una protección eficaz con una vacuna basada en OspA contra un solo serotipo.

Se conocen en la técnica (documentos US 6.248.562 B1 y WO 02/16421 A2) dominios OspA mutantes y estabilizados, así como polipéptidos quiméricos que comprenden dos partes de OspA de diferentes especies. También se conoce el uso de moléculas de OspA quiméricas que comprenden la porción proximal de un serotipo de OspA, junto con la porción distal de otro serotipo de OspA, al tiempo que conservan las propiedades antigénicas de ambos polipéptidos progenitores, en la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Lyme o borreliosis (documentos WO2011/143617 y WO2011/143623).

Actualmente, no existe en el mercado medicamento preventivo alguno para la borreliosis de Lyme y, por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar un medicamento que pueda proporcionar simultáneamente protección eficaz contraBorreliapresente en EE.UU., Europa y otros lugares, especialmente contra varios serotipos deBorrelia.El heterodímero Lip-S4D1-S3hybD1, que contiene OspA del serotipo 3, de la presente invención, mejora el heterodímero previamente descrito de la presente solicitante, Lip-S4D1 -S3D1 (véase el documento WO2014/006226), tanto con respecto a la facilidad de producción como en la estimulación de anticuerpos específicos, medidos por la unión en superficie de anticuerpos a las espiroquetas de Borrelia del serotipo 3. Además, la mayor especificidad de la respuesta inmunitaria al nuevo heterodímero indica que su potencia también es superior en comparación con el heterodímero previamente descrito.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende un fragmento híbrido de la proteína A de la superficie externa(OspA)deBorrelia,una composición farmacéutica para uso como medicamento, en particular como vacuna, o en un método para tratar o prevenir una infección por Borrelia, métodos para diagnosticar una infección y métodos para tratar o prevenir una infecciónpor Borrelia,y un kit que comprende la composición farmacéutica y una segunda composición. En particular, la invención se refiere a un polipéptido mejorado para la inmunización contraBorrelia de serotipo 3,ya que el polipéptido es más favorable para la purificación e induce una respuesta inmunitaria más específica contraBorrelia,evaluada mediante la unión en superficie aBorrelia,en comparación con la construcción que contiene OspA de serotipo 3 descrita en la solicitud previa WO2014/006226 de la presente solicitante.

Esfuerzos para desarrollar una vacuna de subunidades para la prevención de la borreliosis de Lyme se han centrado principalmente en el uso de la proteína A de la superficie externa (OspA) de la borreliosis como antígeno. La proteína OspA es expresada porBorreliaúnicamente cuando se encuentra en el intestino de la vector de garrapata. Por lo tanto, los anticuerpos OspA producidos por la vacunación no combaten la infección en el organismo, sino que penetran en el intestino de la garrapata cuando ésta se alimenta de sangre. Allí, los anticuerpos neutralizan las espiroquetas y bloquean la migración de bacterias desde el intestino medio hasta las glándulas salivales de la garrapata, vía por la queBorreliapenetra en el huésped vertebrado. Por lo tanto, anticuerpos específicos para OspA previenen la transmisión deBorreliadesde el vector de garrapata al huésped humano.

La forma lipidada de OspA deB. burgdorferis.s., cepa ZS7, junto con hidróxido de aluminio, fue desarrollada comercialmente como vacuna contraBorrelia(LYMErix™) por SmithKline Beecham, ahora GlaxoSmithKline (GSK) para el mercado estadounidense. Se necesitaron tres dosis de LYMErix™ durante un año para obtener una protección óptima. Tras las dos primeras dosis, la eficacia de la vacuna contra la borreliosis de Lyme fue del 49 % y, tras la tercera, del 76 %.

Sin embargo, poco después de su comercialización, LYMErix™ se retiró del mercado en 2002. Las razones citadas fueron cuestiones de aplicación práctica de la vacuna, por ejemplo, la necesidad de inyecciones de refuerzo anuales o cada dos años, así como el coste relativamente elevado de este enfoque preventivo en comparación con el tratamiento antibiótico de la infección temprana. Además, existía la preocupación de que LYMErix™ pudiera desencadenar reacciones autoinmunes en un subgrupo de la población debido a su homología de secuencia con una proteína humana, aunque esto nunca se demostró. Además, esta vacuna no proporcionó protección cruzada contra otras especiesde Borreliaclínicamente importantes.

Por consiguiente, en una realización, un objetivo de la presente invención era proporcionar una vacuna mejorada, p. ej., para la prevención de la borreliosis de Lyme. Preferiblemente, la vacuna es fácil de producir, a la vez que ofrece protección, es segura y más eficaz que las terapias existentes, y/o proporciona protección contra más de una especie deBorrelia.Adicionalmente, es bien sabido en la técnica que diferentes pacientes responden de forma distinta a las diferentes composiciones de la vacuna. Por lo tanto, en cualquier caso, sería una clara ventaja disponer de vacunas alternativas como opciones adicionales para la vacunación contra Borrelia.

El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante un polipéptido que comprende un fragmento híbrido de OspA C-terminal, en donde el fragmento híbrido de OspA C-terminal consiste en una primera y una segunda porción de OspA de dos cepas diferentes de Borrelia, en donde el fragmento híbrido de OspA C-terminal difiere del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos por la introducción de al menos un enlace disulfuro, y en donde un fragmento híbrido de OspA C-terminal mutante es como se define, además, por SEQ ID NO: 1, que comprende opcionalmente a lo sumo 10 mutaciones adicionales.

Sorprendentemente, la introducción de dicho fragmento híbrido de OspA C-terminal, que comprende una secuencia deB. valaisiana,cepa VS116, condensada con una secuencia de OspA del serotipo 3 (B.garinii,cepa PBr), con un enlace disulfuro introducido, resultó en una proteína heterodímera (Lip-S4D1-S3hybD1) que fue más fácil de purificar y estimuló una respuesta inmunitaria más específica a OspA del serotipo 3 que el heterodímero LipS4D1 -S3D1 de la invención previa (documento WO2014/006226) de la presente solicitante. Como se muestra en los Ejemplos, el fragmento híbrido C-terminal de OspA de serotipo 3 de la presente invención tiene un isocontorno de potencial electrostático previsto que es más similar a otros fragmentos de OspA de otros serotipos que el fragmento de OspA de serotipo 3. Además, el heterodímero híbrido de OspA de serotipo 3 que contiene el fragmento C-terminal (Lip-S4D1-S3hybD1) fue más fácil de purificar, requiriendo menos pasos para obtener un rendimiento mucho mayor que el heterodímero Lip-S4D1-S3D1 de la invención previa. Adicionalmente, aunque los títulos de anticuerpos observados fueron similares, los anticuerpos estimulados por la vacuna combinada de heterodímeros mejorada se unieron más específicamente aBorreliaque expresaba OspA de serotipo 3, en comparación con la vacuna combinada de heterodímeros de la invención previa. Finalmente, la capacidad protectorain vivode la vacuna combinada de heterodímeros mejorada fue alta contra los cuatro serotiposde Borreliatestados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende a) un polipéptido que comprende un fragmento híbrido C-terminal de una proteína de superficie externa A (OspA) y, b) opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable, en dicho fragmento híbrido C-terminal de OspA consiste en la fusión del dominio C-terminal de dos OspA diferentes de cepas deBorreliay se diferencia del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos por la introducción de al menos un enlace disulfuro, p. ej., una cistina. En particular, el fragmento híbrido C-terminal de OspA consiste en una primera y una segunda porción de OspA de dos cepas diferentes de Borrelia, en donde el fragmento híbrido C-terminal de OspA difiere del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos por la introducción de al menos un enlace disulfuro, y en donde el fragmento híbrido C-terminal de OspA mutante se define, además, por la SEQ ID NO: 1, y comprende opcionalmente a lo sumo 10 mutaciones adicionales.

Se ha encontrado que un polipéptido de acuerdo con la invención puede producirse de forma fácil y eficaz (véase el Ejemplo 2). Su producción resultó en un rendimiento incrementado en comparación con los productos conocidos (véase el Ejemplo 2). La inmunización con un polipéptido de acuerdo con la invención produjo mayores niveles de anticuerpos específicos contra la proteína OspA en su forma nativa y, por lo tanto, es una vacuna mejorada (véase el Ejemplo 3). Además, proporcionó protección contra la infección por Borrelia in vivo (véase el Ejemplo 4).

Borreliaes un género de bacterias del filo de las espiroquetas. Provoca la borreliosis, una enfermedad zoonótica transmitida por vectores, principalmente por garrapatas y, en algunos casos, por piojos, dependiendo de la especie. Actualmente se conocen 36 especies deBorrelia,13 de estas especies se sabe que provocan la enfermedad de Lyme o borreliosis y son transmitidas por garrapatas. Las principales especies deBorreliaque provocan la enfermedad de Lyme sonBorrelia burgdorferi, Borrelia afzeliiyBorrelia garinii.La expresiónB. burgdorferis.l. abarca al menos 13 especiesde Borrelia(Tabla A-1). Estas especies se presentan en diferentes regiones geográficas y viven en la naturaleza en ciclos enzoóticos que implican garrapatas del complejoIxodes ricinus(también denominado complejoIxodes persulcatus)y una amplia gama de huéspedes animales. Cuatro especiesde Borreliason responsables de la mayoría de las infecciones en seres humanos:B. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii.Otras tres especies,B. lusitaniae, B. bissettiiyB. spielmanii,se han detectado ocasionalmente en seres humanos, pero su papel en la borreliosis de Lyme es incierto actualmente. Se siguen identificando nuevas especies deBorrelia.

Tabla A-1.

Como se detalló arriba, la proteína A de la superficie externa (OspA) deBorreliaes una lipoproteína inmunogénica abundante deBorrelia, de particular interés debido a su potencial como candidato vacunal. La OspA deB. burgdorferis.l. es una lipoproteína básica con una masa molecular de aproximadamente 30 kDa y es codificada en un plásmido lineal. Un aspecto importante de la proteína OspA es su lipidación N-terminal; es decir, ácidos grasos con una longitud de cadena de entre C14 y C19, con o sin dobles enlaces, se unen al residuo de cisteína N-terminal, una característica que potencia la inmunogenicidad de la proteína OspA. Se ha demostrado que los péptidos sintéticos poco inmunogénicos inducen respuestas de anticuerpos más intensas cuando se lipidizan, por ejemplo, cuando se acoplan covalentemente a Pam3Cys (Bessler y Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), una sustitución de ácido graso encontrada en el extremo amino de muchas lipoproteínas bacterianas que se sintetizan con una secuencia señal que especifica la fijación de lípidos. Adicionalmente, se ha demostrado que el resto Pam3Cys potencia las respuestas inmunitarias a OspA en ratones, parcialmente a través de su interacción con TLR-2/1 (Yoder, et al. (2003) Infection and Immunity 71:3894-3900). Por lo tanto, se esperaría que la lipidación de un fragmento C-terminal de OspA potencie la inmunogenicidad y la capacidad protectora del fragmento.

El análisis de aislados deB. burgdorferis.l. obtenidos en Norteamérica y Europa ha revelado que OspA presenta variabilidad antigénica y que se pueden definir varios grupos distintos de acuerdo con la serología. Se han descrito mAbs (siglas inglesas de anticuerpos monoclonales) anti-OspA que se unen a determinantes antigénicos específicos para los extremos N y C. Se han utilizado cristalografía de rayos X y análisis de RMN para identificar dominios hipervariables inmunológicamente importantes en OspA y se ha mapeado el epítopo LA-2 a los aminoácidos C-terminales 203-257 (Ding et al., Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). Estudios previos han demostrado que la producción de anticuerpos contra el epítopo C-terminal LA-2 se correlaciona con inmunidad protectora después de la vacunación con OspA (Van Hoecke et al. Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 y Steere et al., N Engl J Med (1998) 339:209-215). Se ha demostrado que los anticuerpos contra LA-2 bloquean la transmisión deBorreliade la garrapata al huésped (Golde et al., Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Estos estudios sugirieron que la porción C-terminal de la proteína OspA puede ser suficiente para inducir inmunidad protectora. Debe señalarse que la secuencia de la porción C-terminal de OspA está menos altamente conservada entre los serotipos deBorreliaque la porción N-terminal (véase la Fig. 1).

En base a la información de los estudios arriba esbozados, junto con otros, en la invención previa (documento WO2014/ 006226) se utilizaron formas truncadas de OspA que comprenden la porción C-terminal (también denominadas en esta memoria "fragmento de OspA" o "monómero"). Las formas truncadas de OspA demostraron ser menos protectoras que la proteína OspA completa. Sin embargo, sorprendentemente, en el curso de la invención previa se descubrió que la introducción de un enlace disulfuro en la forma truncada (también denominada en esta memoria "fragmento de OspA mutante", " fragmento de OspA estabilizado con cistina", "fragmento mutante" o "fragmento estabilizado con cistina") supera esta desventaja. Si bien no se limita a un mecanismo específico, se cree que la protección mejorada se debe a una estabilidad incrementada del fragmento de OspA, como se muestra en ensayos que miden la estabilidad térmica.

El fragmento de OspA muíante (también denominado segundo fragmento de OspA) puede derivarse de cualquier especiede Borrelia; sin embargo, debido a su prevalencia en el campo médico, especialmente en seres humanos, se prefierenB. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii.De acuerdo con la presente invención, la primera porción de OspA proviene de cualquier cepa de Borrelia, exceptoB. garinii,cepa PBr, y la segunda porción proviene deB. garinii,cepa PBr. Por lo tanto, el fragmento híbrido OspA se deriva de una fusión de aminoácidos de la OspA deB. garinii,cepa PBr con aminoácidos de la OspA de cualquier especiede Borrelia excepto B. garinii,cepa PBr (y, por lo tanto, una secuencia de aminoácidos diferente de la de los aminoácidos de la OspA deB. garinii,cepa PBr), particularmente deB. burgdorferis.s.,B. afzeliiyB. bavariensis,especialmenteB. valaisiana,cepa VS116. La primera porción de OspA consiste en los aminoácidos 125-176 o los aminoácidos 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no es el fragmento correspondiente deB. garinii,cepa PBr, con SEQ ID NO: 8, y la segunda porción de OspA consiste en los aminoácidos 176-274 o, más preferiblemente, los aminoácidos 177-274 de OspA deB. garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 8), en donde la segunda porción de OspA es mutante y está estabilizada con cistina en que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente al menos por la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 de SEQ ID NO: 8 con una cisteína y con la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 de SEQ ID NO: 8 con una cisteína y en donde está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho segundo fragmento de OspA; y en donde la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína coincide con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA completa deB. burgdorferis.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). Sin embargo, pueden estar presentes mutaciones adicionales relativas a las porciones de tipo salvaje en la primera y segunda porciones de acuerdo con la invención (véase también más adelante). En una realización preferida, las sustituciones anteriores con cisteína en las posiciones 182 y 269 son las únicas mutaciones relativas al tipo salvaje. Alternativamente, los aminoácidos 177-274 estabilizados con cistina deBorrelia garinii,cepa PBr, difieren de los mismos por la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de la OspA de tipo salvaje deBorrelia garinii,cepa PBr, por un residuo de prolina únicamente.

Ejemplos preferidos de polipéptidos comprenden

- un fragmento híbrido C-terminal de OspA que consiste en los aminoácidos 125-176 deB. valaisiana,cepa VS116, y los aminoácidos estabilizados con cistina 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 1),

- un fragmento híbrido C-terminal de OspA que consiste en los aminoácidos 126-175 deB. spielmaniiy los aminoácidos estabilizados con cistina 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 51).

Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. También se describen polipéptidos que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.

En una realización de la presente invención, la segunda porción de OspA es idéntica a los aminoácidos estabilizados con cistina 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr, pero difiere de ellos por la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de OspA de tipo salvaje deBorrelia garinii,cepa PBr, con un residuo de prolina (SEQ ID NO: 7).

Las cuatro especiesde Borrelia, B. burdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii,pueden clasificarse de acuerdo con sus serotipos de OspA, que han sido determinados mediante análisis con anticuerpos monoclonales específicos para la proteína OspA respectiva. Los serotipos 1 -7, responsables de la mayoría de las infecciones humanas porBorrelia,junto con sus tasas de prevalencia, se muestran en la Tabla A-2 que figura a continuación.

Tabla A-2. Designación de serotipos y prevalencia deB. burdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii.LasBorreliaaisladas de líquido cefalorraquídeo o piel humana, o de vectores de garrapatas, se serotipificaron mediante el sondeo de lisados de células completas con anticuerpos monoclonales murinos, cada uno específico para un epítopo particular de OspA (de acuerdo con lo descrito por Wilskeet al.,J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350 y presentado por Baxter Bioscience en "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases", Bruselas, 6 de febrero de 2009).

La estructura de la proteína OspA de la cepa B31 deB. burgdorferis.s. fue determinada por Li et al. (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). Está compuesta por láminas p N-terminal (cadenas a 1 a 4) y central (cadenas a 5 a 14n [parte N-terminal]), una lámina de barril 1 (cadenas a 14c [parte C-terminal] a 16), una lámina de barril 2 (cadenas a 17 a 21) y una hélice a C-terminal. La expresión "fragmento C-terminal de OspA", "dominio C-terminal de OspA", "dominio C-terminal", "fragmento de tipo salvaje" o "porción C-terminal" con respecto a OspA, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, debe significar la secuencia de aminoácidos C-terminal de OspA,es decir,OspA que carece al menos de la lámina p N-terminal (incluidas las cadenas a 1 a 4). En OspA deB. burgdorferís.s., cepa B31, la lámina N-terminal consiste en los aminoácidos 17 a 70 (tras la escisión post-traduccional del péptido señal de lipidación de 16 aminoácidos).

El fragmento de OspA C-terminal de la presente invención también puede incluir una secuencia de señal de lipidación en el extremo N, p. ej., la secuencia de señal de lipidación de los aminoácidos 1 a 16 de OspA (SEQ ID NO: 13) u OspB (SEQ ID NO: 14) de la cepa B31de B. burgdorferis.s., una secuencia de señal de lipidación deE. coli,a la que se alude en esta memoria como la "señal de lipidación lpp” (SEQ ID NO: 15), o cualquier otra secuencia de señal,p. ej.,como se define más adelante.

La lipidación de una proteína con una secuencia señal de lipidación N-terminal tales como las presentes en un polipéptido OspA naciente, se produce en el vector de expresiónde E. colimediante la acción gradual de las enzimas diacilgliceril transferasa, peptidasa señal II y transacilasa, respectivamente. El primer paso es la transferencia de un diacilglicérido al grupo sulfhidrilo de la cisteína de la prolipoproteína no modificada, seguida de la escisión del péptido señal por la peptidasa señal II y, finalmente, la acilación del grupo p-amino de la cisteína N-terminal de la apolipoproteína. El resultado es la colocación de un lípido y un grupo glicerol con dos lípidos adicionales unidos al residuo de cisteína N-terminal del polipéptido. La secuencia señal de lipidación, que se escinde durante la lipidación, no está presente en la secuencia polipeptídica final.

Los polipéptidos son moléculas biológicas compuestas de cadenas de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (amida). Los enlaces químicos covalentes se forman cuando el grupo carboxilo de un aminoácido reacciona con el grupo amino de otro. Polipéptidos de la presente invención son cadenas de aminoácidos continuas y no ramificadas. El polipéptido de la presente invención comprende un enlace de cistina. De acuerdo con la presente invención, el fragmento de OspA mutante puede ser una proteína lipidada, también llamada lipoproteína, en donde los restos lipídicos, junto con el grupo glicerol, también se denominan "Lip". De acuerdo con la invención, Lip comprende uno a tres lípidos tales como alquilo C14-20 y/o alquenilo C14-20 fijados a un glicerol y un grupo amino de la cisteína N-terminal del polipéptido de la invención o, preferiblemente, en donde Lip es un resto de fórmula (I) que figura a continuación,

Fórmula (I),

en la que uno de Ri, R20 Raes alquilo o alqueniloC<14 - C 20,>y cada uno de los otros, independientemente, es alquiloC<14->C20 o alquenilo C14-C20 , y X es una secuencia de aminoácidos fijada al residuo de cisteína mostrado en la Fórmula (I). Más preferiblemente, Lip más la cisteína N-terminal del polipéptido es N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi) propil cisteína (denominada en este documento "Pam3Cys") y está conectada mediante el carbono carbonilo C de la cisteína a la secuencia de aminoácidos de la invención. En la Fórmula (I) anterior, R1, R2 y R3 serían grupos palmitoílo y X es una secuencia de aminoácidos fijada al residuo de cisteína.

De acuerdo con la presente invención, el dominio C-terminal de una OspA puede carecer de al menos el dominio N-terminal homólogo a los aminoácidos 17 a 70 de OspA deB. burgdorferis.s., cepa B31. Adicionalmente, el dominio C-terminal de OspA, de acuerdo con la presente invención, también puede carecer de porciones adicionales de la lámina central, según se define por Li y colaboradores (Liet al.,supra), en particular de cadenas adicionales tales como las porciones de aminoácidos 17 a 82, 93, 105, 118 o 119, preferiblemente 17 a 129, más preferiblemente 1 a 124, 1 a 125, 1 a 129 o 1 a 130 de cualquierBorrelia,en particularB. burgdorferis.s., cepa B31, o de porciones homólogas de una proteína OspA deBorreia sp.exceptoB. burgdorferis.s., cepa B31.

En el contexto de la presente invención, al dominio C-terminal de OspA también se le alude como "fragmento OspA" o "fragmento de OspA".

El "fragmento C-terminal mutante de OspA" o "fragmento mutante" o "fragmento OspA mutante", en el contexto del polipéptido de la presente invención y tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva debe significar el fragmento C-terminal de OspA tal como se define arriba y en esta memoria, que difiere del fragmento de tipo salvaje en al menos dos cisteínas introducidas que pueden formar un enlace disulfuro; es decir, una cistina. Sin estar ligados por teoría alguna, se asume que el enlace disulfuro estabiliza el fragmento en una conformación que conduce a la inducción de la unión de anticuerpos. El plegamiento del fragmento C-terminal de OspA mutante muestra una estabilidad térmica reducida en comparación con la proteína de longitud completa (Koide et al., Structure-based Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). Para la presente invención, se analizóin silicola secuencia del dominio C-terminal de OspA deB. burgdorferis.s., cepa B31, para determinar la posición de los puentes disulfuro introducidos, lo que podría potenciar la estabilidad del plegamiento de este dominio C-terminal. Los resultados del análisis se transfirieron a fragmentos homólogos de OspA de otras especiesde Borrelia, asumiendo que el plegamiento se conserva entre especies.

El "fragmento C-terminal híbrido de OspA" o "fragmento híbrido" o "fragmento híbrido de OspA", tal como se utiliza en toda la presente memoria descriptiva, significará el fragmento C-terminal de OspA, como se define arriba y en esta memoria, que difiere del fragmento de tipo salvaje en que

a) el fragmento híbrido C-terminal de OspA consiste en una fusión de aminoácidos de una primera proteína OspA de una cepa diferente aB. garinii,cepa PBr, p. ej.,B. valaisiana,cepa VS116, oB. spielmanii(a la que se alude como primera porción de OspA); con aminoácidos de una segunda proteína OspA deB. garinii,cepa PBr, con la introducción de al menos un enlace disulfuro (cistina) (a la que se alude como segunda porción de OspA) y, opcionalmente, una o más mutaciones adicionales; y

b) las al menos dos cisteínas introducidas en el fragmento híbrido C-terminal de OspA forman un enlace disulfuro, es decir, una cistina, y en donde dichas cisteínas introducidas se introducen como se describe en esta memoria y de acuerdo con las enseñanzas del documento WO2014/006226; y

en donde el fragmento C-terminal híbrido de OspA da como resultado un fragmento plegado naturalmente como se mide, p. ej., mediante la eficiencia de unión de los anticuerpos resultantes de la vacunación con este fragmento híbrido C-terminal de OspA en, p. ej., ratones al antígeno de Borrelia serotipo 3, p. ej., testando la unión de dichos anticuerpos (obtenidos después de tres inmunizaciones) a la superficie deBorreliaserotipo 3 por citometría de flujo, p. ej., como se describe en los Ejemplos.

Típicamente, el enlace disulfuro se puede introducir mediante la introducción de uno o más, preferiblemente dos residuos cisteína, en donde se forma un enlace disulfuro (puente S-S) entre los grupos tiol de dos residuos cisteína que forman el aminoácido cistina. Solo es necesario introducir un residuo cisteína si se forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína presente en el fragmento de OspA de tipo salvaje. Las dos cisteínas se introducen mediante sustitución de aminoácidos. Las sustituciones están: a) en la posición 182 del aminoácido de la secuencia de aminoácido OspA de tipo salvaje relevante con una cisteína, y b) en la posición 269 del aminoácido de la secuencia de aminoácido de OspA de tipo salvaje relevante por una cisteína y en donde está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho fragmento de OspA, formando por lo tanto una cistina. La numeración de las sustituciones de cisteína coincide con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa deB. burgdorferis.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

El fragmento de OspA mutante o híbrido también puede comprender mutaciones adicionales con respecto al tipo salvaje. Como se detalló anteriormente, la estructura y el dominio de superficie de OspA son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el fragmento mutante puede comprender mutaciones adicionales, particularmente en sitios que no se encuentran en la superficie de la proteína y/o que no están implicados en la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, no afectan la capacidad antigénica. Éstas pueden incluir una o más deleciones de aminoácidos, particularmente deleciones pequeñas(p. ej,de hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos), una o más adiciones de aminoácidos (particularmente en el extremo C o N), una o más sustituciones de aminoácidos, particularmente una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Preferiblemente, el número de mutaciones adicionales en la primera y segunda porción, con respecto al tipo salvaje respectivo, es a lo sumo de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, más preferiblemente de 3 o 2, especialmente de 1. Más preferiblemente, la(s) mutación(es) adicional(es) se encuentra(n) únicamente en la segunda porción de OspA. Mutaciones preferidas son sustituciones, especialmente sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a las que se enumeran a continuación:

Ala Ser Leu Ile; Val

Arg Lis Lis Arg; Gln; Asn

Asn Gln; His Met Leu; Ile

Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr

Cys Ser Ser Thr

Gln Asn Thr Ser

Glu Asp Trp Tyr

His Asn; Gln Tyr Trp; Phe

Ile Leu, Val Val Ile; Leu

Mutaciones preferidas incluyen cambios en porciones seleccionadas del fragmento, por ejemplo, en donde la secuencia con similitud de secuencia con el antígeno asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1), que existe enB. burgdorferis.s., se modifica, por ejemplo, se reemplaza por una secuencia homóloga de una proteína OspA de otraBorrelia sp. La razónfundamental de esta modificación es reducir el riesgo de inducir reacción cruzada inmunológica con proteínas humanas. Otra mutación preferida es la sustitución de la treonina con una prolina en la posición 233 en la secuencia del polipéptido OspA de B.garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 8). También es posible la adición de una secuencia señal para la lipidación en el fragmento final o intermedio, o la adición de una proteína marcadora (p.ej.,para la identificación o purificación).

En algunas realizaciones, el fragmento OspA mutante o híbrido se define como se define como en las reivindicaciones y tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, e incluso más preferiblemente al menos el 95 % con el fragmento de tipo salvaje. En otra realización, la secuencia difiere a lo sumo en un 10 %, a lo sumo en un 9 %, a lo sumo en un 8 %, a lo sumo en un 7 %, a lo sumo en un 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, y lo más preferiblemente a lo sumo en un 1 %, debido a una adición, deleción o sustitución de secuencia.

La identidad, como se conoce en la técnica y como se utiliza en esta memoria es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, según se determina por la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad significa también el grado de relación secuencial entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre las cadenas de secuencias de este tipo. La identidad se puede calcular fácilmente. Si bien existe un cierto número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas, el término es bien conocido por los expertos en la materia (p. ej., Sequnece Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para obtener la mayor coincidencia posible entre las secuencias testadas. Métodos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCG (Devereux, J.et al.,1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S.et al.,1990).

A diferencia del fragmento de OspA mutante o híbrido, el "fragmento de tipo salvaje" o "fragmento de OspA de tipo salvaje", en el contexto de la presente invención, se refiere a un fragmento de una OspA presente de forma natural deBorrelia.El fragmento de tipo salvaje se obtiene mediante deleciones N-terminales, pero no comprende deleciones internas (excepto de las secuencias señal, como se detalla en esta memoria) ni mutaciones. En relación con el fragmento de OspA híbrido y mutante, el fragmento de tipo salvaje consiste en una parte idéntica de la OspA (longitud idéntica y misma cepa de OspA, etc.) y difiere únicamente en la(s) alteración(es) arriba detallada(s).

Los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención

Un polipéptido es un polímero lineal simple de aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos, en algunos casos también por enlaces disulfuro. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido también puede comprender una o más modificaciones postraduccionales;es decir,un grupo funcional bioquímico fijado, tal como un acetato, fosfato, lípido o carbohidrato fijado, preferiblemente un lípido o lípidos fijados a la cisteína N-terminal junto con un glicerol, más preferiblemente de 1 a 3 restos alquilo o alquenilo C14-C20, incluso más preferiblemente de 1 a 3 grupos palmitoílo, lo más preferiblemente tres grupos palmitoílo (Pam3).

El polipéptido de la presente invención es como se define en las reivindicaciones y comprende o consiste en un fragmento de OspA C-terminal híbrido, en donde el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a C-terminal, en

i) una primera porción de OspA que consiste en aminoácidos de una primera parte C-terminal de OspA de una cepa de Borrelia que no es el fragmento correspondiente deB. garinii,cepa PBr, con SEQ ID NO: 8, y comienza en una posición alrededor de 125 o 126 y termina en la posición 175 o 176; y

ii) una segunda porción de OspA que consiste en una segunda parte C-terminal de OspA que sigue continuamente a la primera parte C-terminal (p. ej., si la primera parte C-terminal termina en la posición 175, la segunda parte C-terminal continúa en la posición 176; o si la primera parte C-terminal termina en la posición 176, la segunda parte C-terminal continúa en la posición 177 y así sucesivamente, sin embargo, también puede ser que uno o dos o más hasta 10 aminoácidos se puedan eliminar en el área de fusión de las 2 partes C-terminales, p. ej., y más preferiblemente, si la primera parte C-terminal termina en la posición 175, la segunda parte C-terminal continúa en la posición 177), en donde el segundo fragmento de OspA difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente por la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 de SEQ ID NO: 8 por una cisteína y por la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 de SEQ ID NO: 8 por una cisteína y en donde está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho segundo fragmento de OspA, formando una cisteína (también denominada "fragmento de OspA estabilizado con cistina"); y

en donde la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína está de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa deB. burgdorferis.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

En una realización preferida de la presente invención, el polipéptido comprende o consiste en el fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste en los aminoácidos 125-176 deB. valaisiana,cepa VS116, y los aminoácidos estabilizados con cistina 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 1).

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido es como se define en esta memoria, y en donde la segunda porción de OspA es idéntica a los aminoácidos estabilizados con cistina 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr, pero difiere de ellos solo por la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de OspA de tipo salvaje deBorrelia garinii,cepa PBr, con un residuo de prolina.

Los polipéptidos tal como se definen en las reivindicaciones proporcionan títulos de anticuerpos en animales inmunizados, en donde dichos anticuerpos muestran una unión mejorada a sus respectivos antígenosin situen comparación con los polipéptidos de la técnica anterior relevantes (p. ej., tal como se define en el documento WO2014/006226 ). Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento C-terminal híbrido de OspA de la invención produce un aumento de al menos 1,5 veces , preferiblemente de al menos 2 veces, más preferiblemente de al menos 3 veces, incluso más preferiblemente de al menos 4 veces, incluso más preferiblemente de al menos 5 veces, lo más preferiblemente de al menos 10 veces en la intensidad de fluorescencia, medida por citometría de flujo e inducida por anticuerpos generados después de tres inmunizaciones con el polipéptido en ratones mediante la unión a la superficie deBorreliade serotipo 3, en comparación con la intensidad de fluorescencia inducida por anticuerpos generados contra un polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA deBorreliaque difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente por al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1 como se define en SEQ ID NO: 31, particularmente en donde el aumento puede determinarse como se describe en el Ejemplo 3.

Además, en una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se puede producir con rendimientos más altos con procesos estándares y requiere menos pasos de purificación en comparación con los polipéptidos de la técnica anterior relevantes (p. ej., como se define en el documento WO2014/006226 ). Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento C-terminal híbrido de OspA de la invención muestra al menos un incremento de 1,5 veces, preferiblemente al menos un incremento de 2 veces, más preferiblemente al menos un incremento de 3 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 4 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 5 veces, lo más preferiblemente al menos un incremento de 10 veces en el rendimiento de producción, medido en miligramos por gramo de biomasa, en comparación con un polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA deBorreliaque difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente por al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1 como se define por SEQ ID NO: 31, particularmente en donde el aumento puede determinarse como se describe en el Ejemplo 2.

Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento C-terminal híbrido de OspA de la invención requiere menos pasos de purificación que un polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA deBorreliaque difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente por al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1 -S3D1 como se define por SEQ ID NO: 31; más específicamente, requiere al menos un paso de cromatografía menos.

El polipéptido puede comprender a) un fragmento C-terminal híbrido de OspA como se define en las reivindicaciones y en esta memoria, y b) un fragmento de OspA mutante.

El polipéptido de la invención puede comprender a) un fragmento C-terminal híbrido de OspA como se define en las reivindicaciones, y b) un segundo fragmento de OspA, en donde dicho fragmento de OspA es C-terminal porque consiste en un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borreliayes mutante y estabilizado con cistina en que difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente al menos por la sustitución del aminoácido en la posición 182 de la secuencia de tipo salvaje por una cisteína y por la sustitución del aminoácido en la posición 269 de la secuencia de tipo salvaje por una cisteína y en donde está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho fragmento de OspA; y, además, en donde dicho fragmento de OspA mutante comienza en la posición 123, 124 o 125 y termina en la posición 273 o 274; y, además, en donde la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína se corresponde con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa deB. burgdorferis.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). En una realización de la presente invención, el segundo fragmento de OspA puede ser cualquiera de los fragmentos mutantes C-terminales de OspA, tal como se definió arriba, p. ej., en el contexto de la invención previa (documento WO2014/006226).

De acuerdo con la presente invención, dicho fragmento de OspA mutante y dicho fragmento híbrido de la invención no comprenden (i) la lámina N-terminal, como se definió arriba, ni (ii) opcionalmente, una o más cadenas adicionales de la lámina central, como se definió arriba. Sin embargo, el polipéptido puede comprender una o más secuencias funcionales tales como una secuencia señal,p. ej,una secuencia señal de lipidación, o una modificación postraduccional tal como la lipidación.

El polipéptido de la presente invención puede consistir en (i) uno o más fragmentos de OspA mutantes, en donde al menos uno es un fragmento de OspA híbrido C-terminal de acuerdo con la presente invención, unido opcionalmente por enlazadores,p. e j,como se define a continuación o uno o más fragmentos de OspA mutantes y un fragmento C-terminal de OspA híbrido de serotipo 3 y (ii) opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos a OspA, particularmente una secuencia señal y (iii) opcionalmente, una modificación postraduccional, tal como lipidación.

Por tanto, en una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la invención tal como se define en las reivindicaciones y en esta memoria puede comprender adicionalmente:

i) un polipéptido que está lipidado o en el que el polipéptido comprende una señal de lipidación, preferiblemente la señal de lipidación lpp derivadade E.coli MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15); y/o

ii) un polipéptido que comprende un péptido de sitio de lipidación liderado por un residuo de cisteína N-terminal como sitio de lipidación, preferiblemente CSS; y/o

iii) un polipéptido que comprende un enlazador entre el fragmento de OspA C-terminal híbrido y el segundo fragmento de OspA estabilizado con cisteína, particularmente en donde dicho enlazador comprende, p. ej., GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16).

En una realización de la presente invención, el segundo fragmento C-terminal de OspA es un fragmento C-terminal híbrido de OspA de acuerdo con la presente invención.

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido comprende o consiste en el heterodímero Lip-S4D1 -S3hybD1 (SEQ ID NO: 27). Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (heterodímero de Lip-S4D1-S3hybD1).

El polipéptido de la presente invención tiene capacidad protectora. Como se detalló arriba, la introducción de un enlace disulfuro en el fragmento híbrido e híbrido/mutante de OspA, pero también la naturaleza híbrida del fragmento de OspA de la invención, aumenta la capacidad protectora del polipéptido en comparación con un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el/los enlace(s) disulfuro y la naturaleza híbrida del fragmento de OspA. En algunas realizaciones, la capacidad protectora aumenta al menos un 10 %, más preferiblemente al menos un 20 %, más preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 40 %, más preferiblemente al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 80 %, e incluso más preferiblemente al menos un 90 %, en comparación con un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el/los enlace(s) disulfuro y la naturaleza híbrida del fragmento de OspA.

La expresión capacidad protectora describe la capacidad de proteger a un sujeto contra una infección porBorrelia.Con respecto al polipéptido de la invención, la capacidad protectora se refiere a la capacidad para inducir una respuesta inmunitaria que protege al sujeto contra una infección porBorrelia.La capacidad protectora puede testarse administrando el polipéptido a un sujeto de forma que induzca una reacción inmunitaria contra el polipéptido. Posteriormente, el sujeto puede ser sometido a una prueba de provocación conBorrelia.Se monitoriza la reacción del sujeto a la infección. En particular, puede determinarse la presencia deBorreliaen el sujeto. Por ejemplo, el polipéptido es protector si no se puede detectarBorreliaen el sujeto. La presencia deBorreliapuede determinarse detectando ácidos nucleicos específicos paraBorrelia (p. e j,mediante PCR) o anticuerpos específicos paraBorrelia (p. ej.,mediante ELISA o transferencia Western) o detectando la propiaBorrelia (p. ej.,cultivando órganos o tejidos en un medio de cultivo y verificando la presencia deBorreliamediante microscopía). En particular, la capacidad protectora ("pc"), reseñada como porcentaje, para una dosis particular se define de la siguiente manera:

pc (%) = [(número total de sujetos examinados - número de sujetosinfectados con Borrelia)/ número total de sujetos examinados] x 100

Diferencias en la capacidad protectora (Apc) se pueden determinar, p. ej., comparando la capacidad protectora (pc) de un fragmernto de OspA mutante con uno o más enlaces disulfuro (pc [con enlace]) con la capacidad protectora (pc) de un fragmernto de OspA sin uno o más enlaces disulfuro (pc [sin enlace]). De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos a comparar difieren únicamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro. El cambio en la capacidad protectora (Apc) por la introducción de uno o más enlaces disulfuro se determina de la siguiente manera:

Apc = (pc [muestra] - pc [control])

p. ej.,

Apc = (pc [con enlace] - pc [sin enlace])

Si Apc es mayor que cero (> 0), asumiendo que todos los demás parámetros (p. ej., dosis y ensayo) son iguales, la capacidad protectora de la muestra (p. ej., el fragmento de OspA mutante con uno o más enlaces disulfuro) es mejor que la capacidad protectora del control (p. ej., el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro). Por el contrario, si Apc es menor que cero (< 0) y asumiendo que todos los demás parámetros (p. ej., dosis y ensayo) son iguales, la capacidad protectora de la muestra (p. ej., el fragmento de OspA mutante con uno o más enlaces disulfuro) es menor que la capacidad protectora del control (p. ej., el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro).

Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención se evalúa por su capacidad protectora mediante un ensayo de desafíoin vivo,en donde ratones inmunizados con el polipéptido de la invención o con un control placebo son enfrentados aBorreliaintroducida en los sujetos inmunizados con una aguja hipodérmica (Método de Desafío con Aguja) o mediante introducción por un vector de garrapata (Método de Desafío con Garrapata).

El Método de Desafío con Aguja se lleva a cabo para la cepa deBorreliadeseada (p. ej.,B. burgdorferi,cepa ZS7) introduciendoBorreliapor vía subcutánea a una dosis entre 20 y 50 veces la dosis infecciosa (DI)50 a ratones inmunizados con dicho primer polipéptido del primer aspecto o con un control placebo (negativo) apropiado, tal como tampón o adyuvante solo, y comparando las tasas de infección en los ratones desafiados. La DI50 se define como la dosis a la que el 50 % de los ratones desafiados están infectados. La dosis deBorreliase mide en número de bacterias. La dosis de desafío puede variar ampliamente y depende de la cepa; por lo tanto, la virulencia de la cepa debe evaluarse primero mediante experimentos de desafío para la determinación de la DI50. Cuatro semanas después del desafío con aguja, se recolectan sangre y tejidos para métodos de lectura para determinar el estado de la infección. Estos métodos de lectura pueden ser, p. ej., ELISA de VlsE en sueros o qPCR en tejidos recolectados para la identificación deBorrelia,como se describe en esta memoria, u otros métodos.

El Método de Desafío con Garrapata se lleva a cabo aplicando al menos una ninfa de garrapata (p. ej.,I. ricinus)infectada conBorrelia (p. ej., B. afzelii,cepa IS1) a un ratón inmunizado con dicho primer polipéptido del primer aspecto; y b) aplicando al menos una ninfa de garrapata infectada a un segundo ratón inmunizado con dicho segundo polipéptido del primer aspecto; y c) comparando las tasas de infección en los dos ratones, generalmente seis semanas después del desafío. Preferiblemente, el ensayo o test se realiza con un grupo de ratones por polipéptido a testar. También se describe e ilustra un test adecuado en los Ejemplos. La evaluación del estado de infección puede realizarse mediante ELISA de VlsE en suero o qPCR en ADN aislado de tejidos recolectados, o utilizando otros métodos adecuados.

Los productos de la invención tales como, p. ej., los polipéptidos de la composición de la invención que comprenden el fragmento híbrido de OspA y, preferiblemente, el fragmento C-terminal de OspA mutante, pueden administrarse 3 veces a un sujeto en una dosis de 30 pg, preferiblemente 10 pg, preferiblemente 5,0 pg, preferiblemente 1,0 pg, preferiblemente 0,3 pg o inferior, y tienen una capacidad protectora del 50 % o más, preferiblemente del 60 % o más, más preferiblemente del 70 % o más, más preferiblemente del 80 % o más, más preferiblemente del 90 % o más, incluso más preferiblemente del 95 % o más, y lo más preferiblemente del 99 % o más. La capacidad protectora puede evaluarse mediante un método de desafíoin vivo,preferiblemente un Método de Desafío con Garrapata, más preferiblemente un Método de Desafío con Aguja, p. ej., como se describe en los Ejemplos.

La diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre los polipéptidos de la invención que comprenden el fragmento C-terminal híbrido de OspA y el control de placebo (negativo) puede ser de al menos 50 %, especialmente al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, incluso más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 %, lo más preferiblemente al menos 99 %, cuando se administra 3 veces a un sujeto a una dosis de 30 pg, preferiblemente 10 pg, preferiblemente 5,0 pg, preferiblemente 1,0 pg, preferiblemente 0,3 pg o inferior.

De acuerdo con la presente invención, la primera parte de la OspA híbrida puede ser de cualquier cepade Borreliadistinta de B.garinii,cepa PBr, con SEQ ID NO: 8, particularmente de las especificadas en esta memoria, talescomo B. burgdorferis.s.,B. garinii (no la cepa PBr), B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdioB. sinica, B. bavariensis,preferiblemente deB. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisoB. garinii, ounafusiónde fragmentos de proteína OspA de dos o más de estas especies. Preferiblemente, la OspA es deB. valaisiana,particularmente la cepa VS116 (SEQ ID NO: 4) pero puede ser deB. afzelii,particularmente la cepa K78, serotipo 2 de OspA (SEQ ID NO: 6);B. burgdorferis.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 de OspA (SEQ ID NO: 5);B. garinii,particularmente la cepa PBr, serotipo 3 de OspA (SEQ ID NO: 8);B. bavariensis,particularmente la cepa PBi, OspA serotipo 4 (SEQ ID NO: 9);B. garinii,particularmente la cepa PHei, OspA serotipo 5 (SEQ ID NO: 10);B. garinii,particularmente la cepa DK29, OspA serotipo 6 (SEQ ID NO: 11) oB. garinii,particularmente la cepa T25, OspA serotipo 7 (SEQ ID NO: 12). Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas OspA (de longitud completa) se proporcionan más adelante.

De acuerdo con la presente divulgación, el enlace disulfuro también puede formarse entre cisteínas que han sido introducidas en cualquier posición del fragmento de OspA, lo que permite o favorece el plegamiento adecuado del fragmento. Las posiciones pueden seleccionarse, como se detalló arriba, basándose en la estructura conocida de la OspA. Polipéptidos ejemplares contienen al menos un enlace disulfuro introducido mediante la inserción de un residuo de cisteína en uno de los residuos 182 ± 3 y uno de los residuos 269 ± 3 (enlace disulfuro tipo 1; "D1") de unaB. afzelii,en particular OspA deB. afzeliiK78 serotipo 2, o los aminoácidos homólogos de una OspA de unaBorreliadistinta deB. afzelii, tal comoB. burgdorferis.s., en particular la cepa B31, serotipo 1;B. garinii,en particular la cepa PBr, serotipo 3;B. bavariensis,en particular la cepa PBi, serotipo 4;B. garinii,en particular la cepa PHei, serotipo 5;B. garinii,en particular la cepa DK29, serotipo 6;B. garinii,en particular la cepa T25, serotipo 7, o una fusión de los aminoácidos 125-176 de OspA deB. valaisiana,cepa VS116, o de los aminoácidos 126-175 de OspA de B. spielmanii y los aminoácidos 177-274 deB. garinii,cepa PBr (SEQ ID NO: 8), en donde la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína coincide con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa deB. burgdorferis.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). El polipéptido de la presente invención se define como se define en las reivindicaciones.

Se observa que:

La posición 182 /- 3 es una abreviatura de la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184 o 185, preferiblemente 182. La posición 269 /- 3 es una abreviatura de la posición 266, 267, 268, 269, 270, 271 o 272, preferiblemente 269.

El fragmento muíante adicional puede derivarse de los aminoácidos desde la posición 125, 126, 130 o 131 hasta la posición 273 de la secuencia de tipo salvaje de la OspA de la cepa K78 deB. afzelii, serotipo 2 (SEQ ID NO: 6) y difiere solo por la introducción de al menos un enlace disulfuro, particularmente en donde el al menos un enlace disulfuro está entre las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro tipo 1); o los fragmentos homólogos y posiciones de una OspA de unaBorrelia sp.distinta deB. afzelii,tal comoB. burgdorferis.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1;B. garinii,particularmente la cepa PBr, serotipo 3;B. bavariensis,particularmente la cepa PBi, serotipo 4;B. garinii,particularmente la cepa PHei, serotipo 5;B. garinii,particularmente la cepa DK29, serotipo 6 oB. garinii,particularmente la cepa T25, serotipo 7.

El fragmento mutante puede ser una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, preferiblemente SEQ ID NO: 46, y una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, incluso más preferiblemente al menos un 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias con SEQ ID NO: 19 a 25, en donde las cisteínas no están reemplazadas. Se proporcionan más detalles sobre las mutaciones y la identidad de secuencia anteriormente.

Como se detalla arriba, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias señal. Se ha demostrado que la lipidación confiere propiedades adyuvantes a OspA. Por consiguiente, se prefieren las formas lipidadas del polipéptido de la invención o los polipéptidos que comprenden una señal de lipidación. En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende una señal de lipidación, preferiblemente una señal de lipidación de una proteína de la superficie externade Borrelia,OspA u OspB (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente) o, más preferiblemente, una secuencia señal de lipidaciónde E. colilpp (SEQ ID NO: 15). El fragmento de OspA de la invención que comprende una señal de lipidación se lipidiza durante el procesamiento y el péptido señal de lipidación se escinde; por lo tanto, el péptido señal ya no está presente en la proteína lipidada madura.

Proteínas lipidadas de acuerdo con la presente invención se marcan con "Lip" en el extremo N para indicar la adición de 3 grupos de ácidos grasos y un glicerol al polipéptido. Las señales de lipidación adecuadas, como se describe arriba, incluyen MKKYLLGIGLILALIA (SEQ ID NO: 13), MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) y MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15). Dado que los restos lipídicos y un glicerol están fijados al residuo de cisteína N-terminal que está presente en la proteína OspA de tipo silvestre de longitud completa, los fragmentos C-terminales de OspA para la lipidación pueden comprender adicionalmente un péptido que comprende un residuo de cisteína seguido de aminoácidos adicionales. Por ejemplo, secuencias tales como CSS o CKQN (SEQ ID NO: 62), inmediatamente en posición C-terminal a la secuencia señal de lipidación, proporcionan un residuo de cisteína N-terminal para la lipidación tras la escisión del péptido señal de lipidación. Los péptidos lipidados que contienen cisteína están presentes en el polipéptido lipidado final de la invención.

Se ha especulado que la proteína OspA deB. burgdorferis.s. comprende una secuencia capaz de unirse a un receptor de células T que también tiene la capacidad de unirse al antígeno asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1) (en adelante, a lA que también se alude como "secuencia similar a hLFA-1"). La similitud de esta región OspA con hLFA-1 puede resultar en una respuesta inmunitaria con reactividad cruzada tras la administración de OspA deB. burgdorferis.s. a un sujeto humano y puede inducir enfermedades autoinmunes, en particular artritis autoinmune, en individuos susceptibles. Por consiguiente, el polipéptido de la presente invención puede o no comprender una secuencia con capacidad de unión al receptor de células T que tiene una capacidad de unión al antígeno asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1) y, en particular, no comprende la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17). Para este fin, la secuencia similar a hLFA-1, particularmente la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17), puede reemplazarse por una secuencia homóloga de una proteína OspA de otraBorrelia sp.,particularmente con NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 18).

En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención que comprende al menos un enlace disulfuro establece esencialmente la misma capacidad protectora con dicho polipéptido contra una infección porBorreliaen relación con al menos una de las proteínas OspA de longitud completa de tipo salvaje derivadas de al menos una cepade Borrelia,particularmenteB. afzeliiK78, serotipo 2 de OspA (SEQ ID NO: 6);B. burgdorferis.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 (SEQ ID NO: 5);B. garinii,particularmente la cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NOs: 7 y 8);B. bavariensis,particularmente la cepa PBi, serotipo 4 (SEQ ID NO: 9);B. garinii,particularmente la cepa PHei, serotipo 5 (SEQ ID NO: 10);B. garinii,particularmente la cepa DK29, serotipo 6 (SEQ ID NO: 11) oB. garinii,particularmente la cepa T25, serotipo 7 (SEQ ID NO: 12).

Téngase en cuenta que arriba se proporcionan detalles adicionales sobre las mutaciones y la identidad de secuencia.

Tabla A-3. Nomenclatura y SEQ ID NOs. de los heterodímeros del fragmento OspA mutante lipidado descritos en la presente invención.

En otra realización, el polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con el primer aspecto comprende al menos dos o tres fragmentos mutantes que están conectados a través de uno o más enlazadores. Un enlazador es una secuencia de aminoácidos más bien corta, empleada para conectar dos fragmentos. Debe diseñarse con el fin de evitar cualquier impacto negativo en los fragmentos, su interacción con los sujetos a tratar o vacunar o tras su capacidad protectora. Se prefieren enlazadores cortos de a lo sumo 21 aminoácidos, en particular de a lo sumo 15 aminoácidos y, en particular, de a lo sumo 12 u 8 aminoácidos. Más preferiblemente, el uno o más enlazadores están compuestos por aminoácidos pequeños, tal como glicina, serina y alanina, con el fin de reducir o minimizar las interacciones con los fragmentos. Un enlazador preferido es el enlazador peptídico "LN1", una fusión de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA deB. burgdorferis.s., cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, con un intercambio de aminoácidos en la posición 53 de D53S), que tiene la siguiente secuencia: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16). El enlazador puede incluir un sitio de lipidación.

En otra realización preferida, el polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con el primer aspecto comprende un polipéptido con un tamaño total de a lo sumo 500 aminoácidos, que comprende dos o tres fragmentos mutantes diferentes según se define en realizaciones preferidas del primer aspecto; o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, uno o dos enlazadores y, opcionalmente, una cisteína N-terminal; y/o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, una extensión N-terminal del fragmento que consiste en a lo sumo 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos, preferiblemente a lo sumo 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos, aún más preferiblemente a lo sumo 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s), en donde la extensión N-terminal se localiza directamente en el extremo N del fragmento en la respectiva OspA deBorreliay, opcionalmente, una cisteína N-terminal. La cisteína N-terminal puede ir seguida opcionalmente de un enlace peptídico corto de 1-10 aminoácidos de longitud, y preferiblemente adopta la forma de un péptido CSS N-terminal.

Los ácidos nucleicos de la invención y aspectos relacionados

La descripción proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido, tal como se define en esta memoria y arriba en el contexto de la presente invención. El ácido nucleico puede estar contenido en un vector y/o una célula.

La expresión "ácido(s) nucleico(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o a DN no modificado o ARN o ADN modificado, incluidas regiones/formas de cadena sencilla y doble.

La expresión “ácido nucleico que codifica un polipéptido”, tal como se utiliza en esta memoria, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un péptido o polipéptido de la invención. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el péptido o polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada, o debido a la edición de ARN o la reorganización del ADN genómico), junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

Los expertos ordinarios en la técnica comprenderán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como el descrito en esta memoria. Algunos de estos polinucleótidos presentan una similitud mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo (es decir, que se presenta de forma natural). No obstante, la presente invención contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo , los polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en seres humanos, primates oE. co li.

Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden sintetizarse, en su totalidad o en parte, utilizando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers, M.H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. Pp.215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Alternativamente, la proteína en sí puede producirse utilizando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, la síntesis de péptidos puede realizarse utilizando diversas técnicas en fase sólida (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) y la síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando el sintetizador de péptidos ASI 431 A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Además, las secuencias de polinucleótidos comprendidas en la composición farmacéutica de la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética mediante métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias codificantes de polipéptidos por diversas razones, incluyendo, pero no limitadas a alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento o la expresión del producto génico. Por ejemplo, la recombinación del ADN mediante fragmentación aleatoria y el re-ensamblaje por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos pueden utilizarse para modificar por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Además, la mutagénesis dirigida al sitio puede utilizarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme o introducir mutaciones, entre otros.

También se describen vectores que comprenden un ácido nucleico, p. ej., enlazado a un promotor inducible, tal como cuando al inducirse el promotor, se expresa un polipéptido codificado por el ácido nucleico. En una realización preferida, el vector es pET28b(+) (http://www.addgene.org/vector-database/2566/).

Dicho vector puede comprender un promotor inducible que se activa mediante la adición de una cantidad suficiente de IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido), preferiblemente al medio de cultivo. Opcionalmente, esta concentración está comprendida entre 0,1 y 10 mM, 0,1 y 5 mM, 0,1 y 2,5 mM, 0,2 y 10 mM, 0,2 y 5 mM, 0,2 y 2,5 mM, 0,4 y 10 mM, 1 y 10 mM, 1 y 5 mM, 2,5 y 10 mM, 2,5 y 5 mM, 5 y 10 mM. Alternativamente, el promotor puede inducirse mediante un cambio de temperatura o pH.

La molécula de ácido nucleico, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere generalmente a cualquier molécula de ácido ribonucleico o desoxirribonucleico, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, la expresión molécula de ácido nucleico, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere al menos a ADN de cadena sencilla o doble, moléculas híbridas de ADN y ARN que pueden ser de cadena sencilla o, más típicamente, de cadena doble, o a una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble. La expresión molécula de ácido nucleico, tal como se utiliza en esta memoria, incluye moléculas de ADN o ARN, como se describe arriba, que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, las moléculas de ADN o ARN con cadenas principales modificadas para su estabilidad o por otros motivos se consideran “moléculas de ácido nucleico”, tal como se entiende esta expresión en esta memoria. Además, las especies de ADN o ARN que comprenden bases inusuales tales como inosina, o bases modificadas tales como las bases tritiladas, por mencionar solo dos ejemplos, también son moléculas de ácido nucleico tal como se define en esta memoria. Se apreciará que se ha realizado una gran diversidad de modificaciones en las moléculas de ADN y ARN que cumplen diversas funciones útiles, conocidas por los expertos en la técnica. La expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza en esta memoria, abarca las formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de moléculas de ácido nucleico, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas,entre otras.La expresión "molécula de ácido nucleico" también abarca moléculas cortas de ácido nucleico, a las que se alude a menudo como oligonucleótidos. El término "polinucleótido" y las expresiones "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se utilizan indistintamente en esta memoria.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar químicamente. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden aislarse deBorreliay modificarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Lo mismo se aplica a los polipéptidos de la presente invención.

Además, el ácido nucleico de la presente invención se puede enlazar funcionalmente, utilizando técnicas estándares tales como la clonación, a cualquier secuencia deseada, ya sea una secuencia reguladora deBorreliao una secuencia reguladora heteróloga, una secuencia conductora heteróloga, una secuencia marcadora heteróloga o una secuencia codificante heteróloga para crear un gen de fusión.

Moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden presentarse en forma de ARN, tal como ARNm o ARNc, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenidos por clonación o producidos mediante técnicas de síntesis química, o mediante una combinación de ambos. El ADN puede ser de triple cadena, de cadena doble o de cadena sencilla. El ADN de cadena sencilla puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena sentido, o la cadena no codificante, también conocida como cadena antisentido.

El ácido nucleico puede estar contenido en un vector o en una célula huésped, preferiblemente E.col,que comprende una molécula de ácido nucleico. El vector puede comprender el ácido nucleico arriba mencionado de tal manera que el vector sea replicable y pueda expresar la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.

Para la producción recombinante de los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención, las células huésped pueden modificarse por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos del ácido nucleico de la invención. La introducción de un ácido nucleico en una célula huésped puede efectuarse mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986 ) y Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989 ), tales como la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transvección, la microinyección, la transfección mediada por lípidos catiónicos, la electroporación, la conjugación, la transducción, la carga por raspado, la introducción balística y la infección.

Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas gram-negativas, tales como células deE. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio y Yersinia.En una realización, la célula huésped es una célula deEscherichia coli.En una realización preferida, la célula huésped es una célula deE. coliBL21 (DE3) o una célula deE. coliBL21 Star™ (DE3).

Alternativamente, también se pueden utilizar células bacterianas gram-positivas. Se puede utilizar una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. El vector se puede derivar de plásmidos bacterianos. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped puede utilizarse para la expresión en este sentido. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante una diversidad de técnicas conocidas y rutinarias tales como, por ejemplo, las recogidas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra).

Las células pueden cultivarse bajo presión selectiva, tal como en presencia de antibióticos, preferiblemente kanamicina. Alternativamente, pueden cultivarse en ausencia de antibióticos.

Se puede utilizar una gran diversidad de vectores de expresión para expresar los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar ácidos nucleicos que expresen un polipéptido en un huésped puede utilizarse para la expresión en este sentido. El vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector fágico de cadena sencilla o de cadena doble, o un vector viral de ARN o ADN de cadena sencilla o de cadena doble. Los plásmidos de partida descritos en esta memoria están disponibles comercialmente, son de acceso público o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles mediante la aplicación rutinaria de procedimientos bien conocidos y publicados. Entre los vectores preferidos, en determinados aspectos, se encuentran aquellos para la expresión de moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Construcciones de ácido nucleico en células huésped pueden utilizarse de forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

También se describe una célula huésped que comprende este vector. Ejemplos representativos de células huésped adecuadas incluyen bacterias, tales como estreptococos, estafilococos,E. coli, StreptomycesyBacillus subtilis;hongos tales como levaduras yAspergillus;células de insecto, tales como célulasde DrosophilaS2 ySpodopteraSf9; células de mamífero, tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 o células de melanoma de Bowes; y células vegetales. También se pueden emplear sistemas de traducción acelular para producir proteínas de este tipo utilizando ARN derivado de la construcción de ADN.

Con el fin de expresar la secuencia de aminoácidos deseada de forma práctica mediante la introducción del vector anterior en una célula huésped, el vector puede contener, además de la secuencia de ácido nucleico que la codifica, otras secuencias para controlar la expresión (p.ej.,secuencias promotoras, secuencias terminadoras y secuencias potenciadoras) y marcadores genéticos para seleccionar microorganismos, células de insecto, células de cultivo animal o similares (p.e j, genes de resistencia a la neomicina y genes de resistencia a la kanamicina). Además, el vector puede contener la secuencia de ácido nucleico en una forma repetida (p.ej.,en tándem). El vector puede construirse mediante procedimientos convencionales en el campo de la ingeniería genética.

Las células huésped pueden cultivarse en un medio apropiado, y la proteína comprendida en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede obtenerse del producto de cultivo. La proteína de acuerdo con la presente invención puede recuperarse del medio de cultivo y purificarse de forma convencional.

Por consiguiente, la descripción proporciona un procedimiento para producir una célula que expresa un polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, que comprende transformar o transfectar una célula huésped adecuada con un vector adecuado o un procedimiento para producir el polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, que comprende expresar una molécula de ácido nucleico codificante.

Alternativamente, un método para producir un polipéptido como se definió arriba puede caracterizarse por las siguientes etapas:

a) introducir un vector que codifica el polipéptido en una célula huésped,

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido,

c) homogeneizar dicha célula huésped, y

d) someter el homogeneizado de células huésped a etapas de purificación.

Alternativamente, un método para producir un polipéptido como se definió arriba puede caracterizarse por las siguientes etapas

a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,

b) b) introducir dicho vector en una célula huésped,

c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido,

d) homogeneizar dicha célula huésped,

e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases, y

f) purificar adicionalmente sobre una columna de filtración en gel.

Alternativamente, un método para producir un polipéptido como se definió arriba puede caracterizarse por las siguientes etapas:

a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,

b) introducir dicho vector en una célula huésped,

c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido,

d) homogeneizar dicha célula huésped,

e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases,

g) purificar sobre una columna de filtración en gel, y

h) opcionalmente, procesar adicionalmente a través de una columna de intercambio de tampón.

Anticuerpos y aspectos relacionados

También se describe un anticuerpo, o al menos una parte eficaz del mismo, que se une selectivamente al fragmento C-terminal híbrido de OspA como se define en el contexto de la presente invención, pero no a la primera porción de OspA y a la segunda porción de OspA solas (es decir, si no se condensa a la otra porción).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

La parte eficaz puede comprender un fragmento Fab, un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)N, un fragmento F(ab)2 o un fragmento Fv o un anticuerpo de dominio único.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado.

Los anticuerpos pueden unirse específicamente a polipéptidos de fragmento híbrido de OspA descritos en el contexto de la invención, pero no a la primera porción de OspA y a la segunda porción de OspA sola y no a correspondientes polipéptidos de fragmento de OspA de tipo salvaje. En particular, el anticuerpo puede unirse específicamente al enlace disulfuro del fragmento de OspA mutante de la invención.

El término “especificidad” se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que se puede unir una molécula de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno particular (tal como un nanocuerpo o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse mediante su afinidad o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio de disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (Kd), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína: cuanto menor sea el valor de K<d>, mayor será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (Ka) , que es 1/Kd).

Como resultará claro para el experto (por ejemplo, basándose en la divulgación adicional de esta memoria), la afinidad puede determinarse de manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión al antígeno (tal como un anticuerpo o una parte eficaz del mismo) y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en la molécula de unión al antígeno como con el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión al antígeno. Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tales como un anticuerpo o una parte efectiva del mismo) se unirán a su antígeno con una constante de disociación (K<d>) de 10-5 a 10-12 M o menos, y preferiblemente de 10 7 a 10-12 M o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 M (es decir, con una constante de asociación (K<a>) de 105 a 1012 M-1 o más, y preferiblemente de 107 a 1012 litros /moles o más y más preferiblemente de 108 a 1012 M -1). Cualquier valor de K<d>mayor que 104 M (o cualquier valor de K<a>menor que 104 M-1) generalmente se considera que indica unión no específica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM, tal como inferior a 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse mediante cualquier método conocido, incluyendo, por ejemplo, el análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas en la técnica, así como las otras técnicas mencionadas en esta memoria.

La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como resultará evidente para el experto. Métodos para determinar la constante de disociación resultarán evidentes para el experto, e incluyen, por ejemplo, las técnicas mencionadas en esta memoria. A este respecto, también resultará evidente que puede no ser posible medir constantes de disociación superiores a 10"4 M o 10-3 M (p. ej., 10-2 M). Opcionalmente, como también resultará evidente para el experto en la materia, la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse sobre la base de la constante de asociación (real o aparente) (Ka), mediante la relación [Kd = 1/Ka].

La afinidad designa la fuerza o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se expresa comúnmente mediante la Kd, o constante de disociación, cuyas unidades son moles/litro (o M). La afinidad también puede expresarse como una constante de asociación, Ka, que equivale a 1/Kd y sus unidades son (litro/mol)-1 (o M-1). En la presente memoria descriptiva, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tal como una secuencia de aminoácidos, un nanocuerpo o un polipéptido de la invención y su diana pretendida) se expresará principalmente en términos del valor de K<d>de su interacción; siendo evidente para el experto que, a la vista de la relación K<a>= 1/K<d>, especificar la fuerza de la interacción molecular mediante su valor de K<d>también puede utilizarse para calcular el valor de K<a>correspondiente. El valor K<d>caracteriza la fuerza de una interacción molecular también en un sentido termodinámico, ya que está relacionado con la energía libre (DG) de enlace por la conocida relación DG = RT.ln(KD) (equivalentemente DG = -RT.ln(KA)), en que R es igual a la constante del gas, T es igual a la temperatura absoluta y In designa el logaritmo natural.

La Kd para interacciones biológicas consideradas significativas (p. ej., específicas) está típicamente en el intervalo de 10 10 M (0,1 nM) a 10-5 M (10000 nM). Cuanto más intensa sea la interacción, menor será su Kd.

La Kd del anticuerpo puede estar entre 10-12 M y 10-5 M, menos de 10-6, menos de 10-7, menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, menos de 10-11 M- menos de 10'12 M.

La K<d>también puede expresarse como la relación entre la constante de velocidad de disociación de un complejo, designada como koff, y la velocidad de su asociación, designada kon (de modo que K<d>= koff/kon y K<a>= kon/koff). La velocidad de disociación koff tiene unidades s-1 (en donde s es la notación de unidades SI para el segundo). La velocidad de activación kon tiene unidades M-1 s-1. La velocidad de activación puede variar entre 10"2 M-1 s-1 y aproximadamente 10"2 M-1 s-1, aproximándose a la constante de velocidad de asociación limitada por difusión para interacciones bimoleculares. La velocidad de disociación está relacionada con la semivida de una interacción molecular dada mediante la relación ty2= ln(2)/koff . La tasa de disociación puede variar entre 10 -6 s-1 (complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días) y 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).

La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse mediante diferentes técnicas conocidas per se, tales como la conocida técnica de biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR) (véase, por ejemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001), en la que una molécula se inmoviliza en el chip del biosensor y la otra se hace pasar sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo, produciendo mediciones de kon y koff y, por consiguiente, valores de K<d>(o K<a>). Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando los conocidos instrumentos BIACORE.

El experto en la también tendrá claro que la Kd medida puede corresponder a la Kd aparente si el proceso de medición influye de alguna manera en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, mediante artefactos relacionados con el recubrimiento del biosensor de una molécula. También se puede medir una K<d>aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En tal situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción entre ambas moléculas.

Otro enfoque que puede utilizarse para evaluar la afinidad es el procedimiento ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) de dos etapas de Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición del equilibrio de unión en fase solución y evita posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas en un soporte como el plástico.

Sin embargo, la medición precisa de Kd puede ser bastante laboriosa; por lo tanto, a menudo se determinan los valores de K<d>aparente con el fin de evaluar la fuerza de unión de dos moléculas. Debe señalarse que, siempre que todas las mediciones se realicen de forma consistente (p. ej., manteniendo inalteradas las condiciones del ensayo), las mediciones de la K<d>aparente pueden utilizarse como una aproximación de la K<d>real; por lo tanto, en el presente documento, K<d>y K<d>aparente deben tratarse con la misma importancia o relevancia.

Finalmente, debe señalarse que, en muchas situaciones, un científico experimentado puede considerar conveniente determinar la afinidad de unión con respecto a una molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la fuerza de unión entre las moléculas A y B, se puede utilizar una molécula de referencia C que se sabe que se une a B y que está adecuadamente marcada con un fluoróforo, un grupo cromóforo u otro resto químico tal como biotina, para facilitar su detección mediante ELISA, citometría de flujo u otro formato (el fluoróforo para la detección de la fluorescencia, el cromóforo para la detección de la absorción de luz, la biotina para la detección mediante ELISA mediada por estreptavidina). Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A se varía para una concentración o cantidad dada de B. Como resultado, se obtiene un valor de Concentración Inhibitoria (CI)50 correspondiente a la concentración de A a la que la señal medida para C en ausencia de A se reduce a la mitad. Siempre que se conozca K<d>ref, la K<d>de la molécula de referencia, así como la concentración total cref de la molécula de referencia, la Kd aparente para la interacción A-B se puede obtener de la siguiente fórmula: Kd = CI5ü/(1 cref /KDref). Téngase en cuenta que si cref << KDref, Kd = CI50. Siempre que la medición de la CI50 se realice de forma consistente (p. ej., manteniendo cref fijo) para los aglutinantes que se comparan, la fuerza o estabilidad de una interacción molecular se puede evaluar por la CI50 y esta medición se juzga como equivalente a K<d>o a la K<d>aparente a lo largo de este texto.

Además, en esta memoria se describe una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo como se define arriba. También, en esta memoria se describe un método para producir un anticuerpo como se define arriba, caracterizado por las siguientes etapas:

a) iniciar una respuesta inmunitaria en un animal no humano mediante la administración a dicho animal de un polipéptido como se define arriba,

b) extraer un fluido corporal que contenga anticuerpos de dicho animal, y

c) producir el anticuerpo sometiendo dicho fluido corporal que contiene el anticuerpo a etapas de purificación adicionales.

o caracterizado por las siguientes etapas:

a) iniciar una respuesta inmunitaria en un animal no humano mediante la administración a dicho animal de un polipéptido como se define arriba,

b) extraer el bazo o las células del bazo de dicho animal,

c) producir células de hibridoma de dicho bazo o células del bazo,

d) seleccionar y clonar células de hibridoma específicas para dicho polipéptido,

e) producir el anticuerpo mediante el cultivo de dichas células de hibridoma clonadas, y

f) realizar opcionalmente etapas de purificación adicionales.

Composiciones farmacéuticas y aspectos médicos relacionados

La composición farmacéutica de la presente invención comprende

(i) el polipéptido según se define en las reivindicaciones; y

(ii) opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica de la presente invención puede ser

- para uso como un medicamento, en particular como una vacuna o

- para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección porBorrelia,en particular una infección porB. burgdorferis.s.,B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdioB. sinica,preferiblemente una infección porB. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisoB. garinii.

Preferiblemente, la composición comprende adicionalmente Lip-S1 D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) y Lip-S5D1 -S6D1 (SEQ ID NO: 33), la composición comprende adicionalmente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), la composición comprende adicionalmente Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) o la composición comprende Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33).

Aún otro aspecto se refiere a una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones para uso en el tratamiento o la prevención de una infección con especies deBorrelia,más preferiblemente especies deBorreliapatógenas como se describe en esta memoria, que comprenden más preferiblementeB. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii.

El problema subyacente de la presente invención se resuelve mediante el polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para uso en un método de tratamiento o prevención de infecciones con especiesde Borrelia,más preferiblemente especies deBorreliapatógenas como las descritas en esta memoria que comprenden más preferiblementeB. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii.

La composición farmacéutica puede contener opcionalmente cualquier soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como sustancias tampón, estabilizantes o ingredientes activos adicionales, especialmente ingredientes conocidos en relación con composiciones farmacéuticas y/o la producción de vacunas. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende L-metionina. Preferiblemente, la composición farmacéutica es para uso como un medicamento, en particular como una vacuna, o para la prevención o el tratamiento de una infección provocada por especies deBorrelia,más preferiblemente especies patógenas deBorrelia, como se describe en esta memoria, que comprenden, más preferiblemente,B. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisyB. garinii,y/u otros patógenos contra los cuales se han incluido los antígenos en la vacuna. Preferiblemente, la composición farmacéutica es para uso en un método para tratar o prevenir una infección porBorrelia,particularmente una infección porB. burgdorferis.s.,B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdioB. sinica,preferiblemente una infección porB. burgdorferis.s.,B. afzeliioB. garinii.

En una realización, la composición farmacéutica comprende, además, un adyuvante. La elección de un adyuvante adecuado para mezclar con toxinas bacterianas o conjugados elaborados utilizando los procedimientos de la invención está dentro del conocimiento del experto en la técnica. Adyuvantes adecuados incluyen sales de aluminio tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también pueden ser otras sales metálicas, tales como las de calcio, magnesio, hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, sacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente, o polifosfacenos. En una realización preferida, la composición farmacéutica se adyuva con hidróxido de aluminio.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende, además, una sustancia inmunoestimulante, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODNs), especialmente oligo(d IdC)13 (SEQ ID NO: 63), péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61), compuestos neuroactivos, especialmente la hormona del crecimiento humana, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, adyuvantes completos o incompletos de Freund, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la sustancia inmunoestimulante es una combinación de un polímero policatiónico y desoxinucleótidos inmunoestimulantes, o de un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys y desoxinucleótidos inmunoestimulantes, preferiblemente una combinación de KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61) y oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 63). Más preferiblemente, dicho péptido policatiónico es poliarginina.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende fosfato de sodio, cloruro sódico, L-metionina, sacarosa y polisorbato 20, (Tween-20) a un pH de 6,7 /- 0,2. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende también hidróxido de aluminio, preferiblemente a una concentración del 0,15 %.

En una realización, la formulación comprende fosfato de sodio entre 5 mM y 50 mM, cloruro sódico entre 100 y 200 mM, L-metionina entre 5 mM y 25 mM, sacarosa entre 2,5 % y 10 %, Tween 20 entre 0,01 % y 0,1 % e hidróxido de aluminio entre 0,1 % y 0,2 % (p/v). Más preferiblemente, la formulación comprende fosfato de sodio 10 mM, cloruro sódico 150 mM, L-metionina 10 mM, 5 % de sacarosa, 0,05 % de Tween 20 y 0,15 % (p/v) de hidróxido de aluminio a pH 6,7 ± 0,2. Incluso más preferiblemente, la formulación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres heterodímeros de OspA mutantes de acuerdo con la invención.

En una realización, la composición farmacéutica comprende 3 heterodímeros, preferiblemente Lip-S1 D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33). Preferiblemente, los tres heterodímeros se mezclan en una relación molar de1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1,2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1,2:3:2, 2:3:3, 3:1:1,3 :1 :2, 3:1:3, 3:2:1,3:2:2, 3:2:3, 3:3:1,3:3:2, lo más preferiblemente 1:1:1.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende dos heterodímeros, preferiblemente LipS1 D1 -S2D1 (SEQ ID NO: 29) and Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33), Lip-S1 D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) and Lip-S4D1-S3hybD1

(S<e>Q ID NO: 27) or Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y LipS5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) en una relación molar de 1:2, 1:3, 2:1,3:1,2:3, 3:2, preferiblemente 1:1.

En una realización, la composición farmacéutica o vacuna de la invención comprende, además, al menos un antígeno adicional deBorreliao de un patógeno distinto deBorrelia(al que se alude en adelante genéricamente como "composición farmacéutica o vacuna combinada"). En una realización preferida, el al menos un antígeno adicional se deriva de una especie deBorreliacausante de la borreliosis de Lyme. En diversos aspectos, el al menos un antígeno adicional se deriva de otro patógeno, preferiblemente un patógeno transmitido por garrapatas. En un aspecto adicional, el patógeno causa la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, la ehrlichiosis granulocítica humana (HGE), la fiebre de Sennetsu, la ehrlichiosis monocítica humana (HME), la anaplasmosis, la fiebre botonosa, la rickettsiosis por Rickettsia parkeri, la enfermedad eruptiva asociada a garrapatas del sur (STARI), la fiebre maculosa de Helvetica, la rickettsiosis 364D, la fiebre maculosa africana, la fiebre recurrente, la tularemia, la fiebre por garrapatas de Colorado, la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, también conocida como FSME), la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, la fiebre Q, la fiebre hemorrágica de Omsk, la enfermedad del bosque de Kyasanur, la encefalitis de Powassan, la enfermedad del virus Heartland o la babesiosis. En un aspecto adicional, la enfermedad es la encefalitis japonesa.

En una realización adicional, el al menos un antígeno adicional se deriva de un patógeno transmitido por vector, preferiblemente un patógeno transmitido por garrapatas, seleccionado del grupo que comprendeBorrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetiiyBorrelia lonestari,virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV también conocido como virus FSME), virus de la fiebre por garrapatas de Colorado (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV), virus de la encefalitis japonesa (JEV) yBabesiaspp.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y un antígeno adicional, como se define arriba, en donde el al menos un antígeno adicional está comprendido en una segunda composición, en particular en donde la segunda composición es una vacuna, preferiblemente una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa o una vacuna contra la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas. La primera composición también puede ser una vacuna. La composición farmacéutica combinada o vacuna de la invención comprende cualquier composición como se define en las reivindicaciones, en combinación con al menos una segunda composición (vacuna). En algunos aspectos, la segunda composición de vacuna protege contra una enfermedad transmitida por vectores, preferiblemente una enfermedad transmitida por garrapatas. En diversos aspectos, la segunda composición de vacuna tiene un calendario de vacunación estacional compatible con la vacunación contra la infección porBorreliao la borreliosis de Lyme. En otros aspectos, las vacunas combinadas son útiles en la prevención de múltiples enfermedades para uso en zonas geográficas en donde estas enfermedades son prevalentes.

En un aspecto, la segunda composición es una vacuna seleccionada del grupo que consiste en una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa y una vacuna contra la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas. En un aspecto preferido, la composición de la vacuna es FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) o TBE Moscow Vaccine® (Instituto Chumakov de Poliomielitis y Encefalitis Virales de la Academia Rusa de Ciencias Médicas). En otro aspecto preferido, la composición de la vacuna es IXIARO®/ JESPECT® (Valneva SE), JEEV® (Biological E, Ltd.) o IMOJEV® (Sanofi Pasteur).

Se proporciona, además, una composición farmacéutica que es una vacuna, esta vacuna puede comprender, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el excipiente es L-metionina.

La invención también incluye composiciones inmunogénicas según se define en las reivindicaciones. En algunos aspectos, una composición inmunogénica de la invención comprende cualquiera de las composiciones definidas en las reivindicaciones y un soporte farmacéuticamente aceptable. En diversos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de superficie externa A (OspA). En determinados aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente aBorrelia.En aspectos particulares, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que neutralizaBorrelia.En algunos aspectos, el anticuerpo es producido por un animal. En aspectos adicionales, el animal es un mamífero. Incluso en aspectos adicionales, el mamífero es un ser humano.

Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para proteger a un mamífero susceptible a la infección porBorreliao para tratar a un mamífero con una infección porBorreliamediante la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o administración mucosal en las vías oral/digestiva, respiratoria o genitourinaria. Si bien la vacuna de la invención puede administrarse en una sola dosis, componentes de la misma también pueden co-administrarse simultáneamente o en momentos diferentes.

En una realización, la invención proporciona la composición farmacéutica en forma de un kit de vacuna que comprende un vial que contiene una composición farmacéutica de la invención, opcionalmente en forma liofilizada, y que comprende, además, un vial que contiene un adyuvante como se describe en esta memoria. Se prevé que, en esta realización, el adyuvante se utilice para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada. Alternativamente, la composición farmacéutica de la invención puede premezclarse en un vial, preferiblemente en una jeringa.

La descripción proporciona

un método para tratar o prevenir una infección porBorreliaen un sujeto que lo necesite, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención, un método para inmunizar a un sujeto que lo necesite, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención,

un método para inmunizar a un animal o ser humano contra una infección con un organismoBorrelia,que comprende la etapa de administrar a dicho animal o ser humano una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la presente invención, en donde la cantidad efectiva es adecuada para provocar una respuesta inmune en dicho animal o ser humano,

un método para estimular una respuesta inmunitaria en un animal o ser humano contra un organismoBorrelia,que comprende la etapa de administrar a dicho animal o ser humano una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la presente invención, en donde la cantidad eficaz es adecuada para estimular una respuesta inmunitaria en dicho animal o ser humano.

Preferiblemente, el organismoBorreliase selecciona del grupo que comprendeB. burgdorferi,particularmenteB. burgdorferis.s.,B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusit japonica, B. tanukii, B. turdioB. sínica,preferiblementeB. burgdorferis.s.,B. afzeliioB. garinii.

Se describe un método para prevenir o tratar episodios primarios y/o recurrentes de infección porBorrelia,que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica o vacuna o kit de la invención.

Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad porBorrelia.En una realización, se proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o la prevención de la infección porBorrelia.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de la composición farmacéutica o vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección porBorrelia.En una realización, se proporciona una composición farmacéutica de la invención para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección porBorrelia.

La descripción incluye también métodos para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto. En diversos aspectos, métodos de este tipo comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna descritas en esta memoria al sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunológica. En determinados aspectos, la respuesta inmunológica comprende la producción de un anticuerpo anti-OspA.

La descripción incluye métodos para prevenir o tratar una infección porBorreliao la borreliosis de Lyme en un sujeto. En diversos aspectos, métodos de este tipo comprenden la administración al sujeto de cualquiera de las composiciones de vacuna comentadas en esta memoria o de las vacunas combinadas comentadas en esta memoria en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la infección porBorreliao la borreliosis de Lyme.

La invención incluye usos de composiciones farmacéuticas o vacunas de la invención para la preparación de medicamentos. La presente invención también describe otros aspectos relacionados.

La expresión “que comprende”, los términos “comprenden” y “comprende” en esta memoria pretenden ser por parte de los inventores sustituibles por las expresiones “que consiste en”, “consisten en” y “consiste en” en cada caso. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto lo requiera, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" implican la inclusión de un compuesto o una composición establecido (p. ej., ácido nucleico, polipéptido, anticuerpo) o etapa o grupo de compuestos o etapas, pero sin excluir otros compuestos, composiciones, etapas o grupos de los mismos. La abreviatura "p. ej." se utiliza en esta memoria para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónimo de la expresión "por ejemplo".

Realizaciones en esta memoria relacionadas con “composiciones de vacunas” de la invención también son aplicables a realizaciones relacionadas con "composiciones farmacéuticas" de la invención, y viceversa.

A menos que se explique de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que comúnmente entiende un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Se pueden encontrar definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los términos en singular “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" incluye "y", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan a título descriptivo. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia tal como un antígeno pueden ser aproximadas.

Un soporte o excipiente preferible para el polipéptido de acuerdo con la presente invención en sus diversas realizaciones, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es un compuesto inmunoestimulante tal como un adyuvante para estimular adicionalmente la respuesta inmunitaria al polipéptido de acuerdo con la presente invención o a una molécula de ácido nucleico codificante del mismo.

Adyuvantes o compuestos inmunoestimulantes se pueden utilizar en las composiciones de la invención. Preferiblemente, el compuesto inmunoestimulante en las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo de sustancias policatiónicas, especialmente péptidos policatiónicos, moléculas de ácidos nucleicos inmunoestimulantes, preferiblemente desoxinucleótidos inmunoestimulantes, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, MF59, sales de aluminio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, compuestos neuroactivos, especialmente hormona del crecimiento humana, o combinaciones de los mismos.

Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio, y los antígenos se adsorben generalmente a estas sales. Preferiblemente, el hidróxido de aluminio está presente en una concentración final del 0,15 %. Un adyuvante de fosfato de aluminio útil es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92. Otro adyuvante útil en la presente invención es una sal de aluminio que es capaz de proporcionar una composición acuosa con menos de 350 ppb de metal pesado, basado en el peso de la composición acuosa. Un adyuvante útil adicional basado en aluminio es el ASO4, una combinación de hidróxido de aluminio y monofosforil lípido A (MPL).

También, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos según se define en las reivindicaciones. En relación con ello, cualquiera de estos compuestos puede emplearse en combinación con un soporte o soportes no estériles o estériles para uso con células, tejidos u organismos tales como un soporte farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Soportes de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe ser adecuada para la vía de administración.

La composición farmacéutica puede comprender un estabilizador. El término “estabilizador” se refiere a una sustancia o excipiente de vacuna que protege a la composición inmunogénica de la vacuna de condiciones adversas tales como las que se presentan durante el calentamiento o la congelación y/o prolonga la estabilidad o la vida útil de la composición inmunogénica en un estado estable e inmunogénico. Ejemplos de estabilizantes incluyen, pero no se limitan a azúcares, tales como sacarosa, lactosa y manosa; alcoholes de azúcar tal como manitol; aminoácidos tal como glicina o ácido glutámico; y proteínas tales como albúmina sérica humana o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en de cualquier manera eficaz, conveniente, incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal o intradérmica, entre otras. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía subcutánea o intramuscular, lo más preferiblemente por vía intramuscular.

En terapia o como un profiláctico, el agente activo de la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Alternativamente, la composición, preferiblemente la composición farmacéutica, se puede formular para la aplicación tópica, por ejemplo, en forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos oftálmicos, gotas oftálmicas, gotas óticas, colutorios, apósitos impregnados, suturas y aerosoles, y puede contener aditivos convencionales apropiados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para facilitar la penetración del fármaco y emolientes en ungüentos y cremas. Formulaciones tópicas de este tipo también pueden contener soportes convencionales compatibles, por ejemplo, bases para cremas o ungüentos, y etanol o alcohol oleílico para lociones. Soportes de este tipo pueden constituir entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 98 % en peso de la formulación; más habitualmente, constituirán hasta aproximadamente 80 % en peso de la formulación.

Además de la terapia arriba descrita, las composiciones de esta invención se pueden utilizar generalmente como un agente de tratamiento de heridas para prevenir la adhesión de bacterias a las proteínas de la matriz expuestas en el tejido de la herida y para uso profiláctico en el tratamiento dental como una alternativa a, o junto con la profilaxis con antibióticos.

En una realización preferida, la composición farmacéutica es una composición de vacuna. Preferiblemente, una composición de vacuna de este tipo está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación con un antígeno proteico es para adultos entre 0,02 pg y 3 pg de antígeno por kg de peso corporal y entre 0,2 pg y 10 pg de antígeno por kg de peso corporal para niños. Esta dosis se administra preferiblemente de 1 a 3 veces con intervalos de 2 a 24 semanas.

En el intervalo de dosis indicado, no se esperan efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención, que impidan su administración a individuos adecuados.

Como un aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden una o más formulaciones farmacéuticas según se define en las reivindicaciones, para administración a un sujeto, envasadas de forma que facilite su uso para administración a sujetos. Preferiblemente, los kits comprenden la formulación en un volumen final de 2 mL, más preferiblemente en un volumen final de 1 mL.

La invención incluye kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits, en diversos aspectos, contiene cada uno un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se incluyen en el alcance de esta invención kits que contienen jeringas precargadas de una o varias cámaras (p. ej., jeringas para líquidos y liojeringas).

Un kit de este tipo incluye una formulación farmacéutica descrita en esta memoria (p.. ej., una composición que comprende una proteína o un péptido terapéutico), envasada en un recipiente, tal como una botella o recipiente sellado, con una etiqueta adherida al recipiente o incluida en el envase, que describe el uso del compuesto o la composición en la puesta en práctica del método. En una realización, la formulación farmacéutica está envasada en el recipiente de tal manera que el espacio libre en el recipiente (p. ej., la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del recipiente) es muy pequeño. Preferiblemente, el espacio libre es insignificante (es decir, prácticamente nulo).

El kit puede contener un primer recipiente que tiene una composición terapéutica de proteína o péptido y un segundo recipiente con una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica se envasa en una forma de dosificación unitaria. Opcionalmente, el kit incluye, además, un dispositivo adecuado para administrar la formulación farmacéutica de acuerdo con una vía de administración específica. En algunos aspectos, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.

La composición farmacéutica puede contener una gama de diferentes antígenos. Ejemplos de antígenos son organismos totalmente muertos o atenuados, sustracciones de estos organismos, proteínas o, en su forma más simple, péptidos. Los antígenos también se pueden reconocer por el sistema inmunitario también en forma de proteínas o péptidos glicosilados, y también pueden ser o contener polisacáridos o lípidos. Se pueden utilizar péptidos cortos, ya que las células T citotóxicas (CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos, generalmente de 8-11 aminoácidos, junto con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las células B pueden reconocer epítopos lineales tan cortos como de 4 o 5 aminoácidos, así como estructuras tridimensionales (epítopos conformacionales).

La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un antígeno reactivo al suero hiperinmune contra una proteína deBorreliao un fragmento activo o variante de la misma, tal como,p. ej.,los antígenos, fragmentos y variantes como se describe en el documento WO2008/031133.

De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica de acuerdo con otro aspecto puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o afección que es provocada por, está vinculada o asociada conBorrelia.

La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en conexión con una enfermedad o afección que es provocada por, está vinculada o asociada conBorrelia,más preferiblemente cualquier especie patógena deBorreliay más preferiblemente en un método para tratar o prevenir una infección porBorrelia,particularmente una infección porB. burgdorferis.s.,B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdioB. sinica, preferiblemente una infección porB. burgdorferis.s.,B. afzeliioB. garinii.

En relación con esto, debe señalarse que las diversas especiesde Borrelia,incluyendoB. burgdorferis.l., comprenden diversas especies y cepas, incluidas las descritas en esta memoria. Una enfermedad relacionada, provocada o asociada con la infección bacteriana que se pretende prevenir y/o tratar de acuerdo con la presente invención incluye la borreliosis de Lyme (enfermedad de Lyme). Más específicamente, la borreliosis de Lyme se presenta generalmente en fases, con remisiones y exacerbaciones con diferentes manifestaciones clínicas en cada una de las fases. La fase 1 de la infección temprana consiste en una infección localizada de la piel, seguida en días o semanas por la fase 2 (infección diseminada) y, meses o años después, por la fase 3 (infección persistente). Sin embargo, la infección es variable; algunos pacientes solo presentan infecciones localizadas de la piel, mientras que otros solo presentan manifestaciones posteriores de la enfermedad tal como artritis.

La composición farmacéutica de la invención se puede utilizar en un método para tratar o prevenir una infección porBorreliaen un sujeto que lo necesite, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica.

El término “sujeto” se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, al que se proporciona un tratamiento o un método de acuerdo con la presente invención. Para el tratamiento de infecciones, afecciones o estados patológicos específicos de un animal específico, tal como un paciente humano, el término paciente se refiere a ese animal específico. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano; sin embargo, el uso médico de la composición también puede incluir animales tales como aves de corral, incluyendo pollos, pavos, patos o gansos, ganado, tales como caballos, vacas u ovejas, o animales de compañía, tales como perros o gatos.

La expresión “cantidad eficaz” se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir una cantidad de la presente composición farmacéutica que puede utilizarse para inducir un resultado deseado al emplearse en el método de la presente invención. En numerosos aspectos de la presente invención, la expresión "cantidad eficaz" se utiliza en relación con el tratamiento o la prevención. En otros aspectos, la expresión "cantidad eficaz" simplemente se refiere a una cantidad de un agente que produce un resultado considerado beneficioso o útil, incluido en los métodos de acuerdo con la presente invención que buscan el tratamiento o la prevención de una infección porBorrelia.

La expresión cantidad eficaz con respecto a los compuestos y composiciones descritos en la presente se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir la cantidad del compuesto de acuerdo con la presente invención que se administra a un paciente mamífero, especialmente que incluye un paciente humano, que sufre una enfermedad asociada a Borrelia, para reducir o inhibir una infección porBorrelia.

En una realización preferida, el método de inmunizar a un sujeto de acuerdo con el aspecto anterior comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica del tercer aspecto de la presente invención.

El método comprende inducir una respuesta inmunológica en un individuo a través de terapia génica o de otro modo, administrando un polipéptido o ácido nucleico de acuerdo con la presente invenciónin vivocon el fin de estimular una respuesta inmunológica para producir anticuerpos o una respuesta de células T mediada por células, ya sean células T productoras de citocinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo de una enfermedad, ya sea que dicha enfermedad ya esté establecida dentro del individuo o no.

Los productos de la presente invención, particularmente los polipéptidos de la composición farmacéutica se proporcionan preferiblemente en forma aislada y pueden purificarse hasta homogeneidad. El término “aislada”, tal como se utiliza en esta memoria, significa separado ‘por la mano del hombre’ de su estado natural; es decir, si se presenta en la naturaleza, ha sido modificado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo en su estado natural no se considera "aislado", sino que la misma molécula de ácido nucleico o polipéptido separada de los materiales coexistentes en su estado natural sí se considera "aislada", en el sentido del término empleado en esta memoria. Como parte del aislamiento o después de él, moléculas de ácido nucleico de este tipo pueden unirse a otras moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN, para mutagénesis, para formar genes de fusión y para su propagación o expresión en un huésped, por ejemplo. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, solas o unidas a otras moléculas de ácido nucleico tales como vectores, pueden introducirse en células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidas en células huésped en cultivo o en organismos completos, moléculas de ADN de este tipo seguirían estando aisladas, tal como se utiliza el término en esta memoria, ya que no se encontrarían en su forma o entorno natural. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos pueden presentarse en una composición tal como formulaciones de medios, soluciones para la introducción de moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones naturales y, en consecuencia, permanecen aisladas como moléculas de ácido nucleico o polipéptidos en el sentido del término en esta memoria.

La invención no se limita a la metodología particular, a los protocolos y reactivos descritos en esta memoria, ya que pueden variar. Además, la terminología utilizada en esta memoria se utiliza únicamente con el propósito de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Tal como se utiliza en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el”, “la” incluyen la referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, las palabras “comprender”, “contener” y “abarcar” deben interpretarse de forma inclusiva y no exclusiva.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos y cualesquiera acrónimos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que comúnmente entiende un experto en la materia en el campo de la invención. Si bien en la práctica de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, los métodos y materiales preferidos se describen en esta memoria.

La presente invención se ilustra, además, mediante las siguientes Figuras, Tablas, Ejemplos y Listado de Secuencias de las que se pueden tomar características, realizaciones y ventajas adicionales. Como tal, las modificaciones específicas comentadas no deben interpretarse como limitaciones del alcance de la invención. Resultará evidente para el experto en la técnica que se pueden realizar diversas equivalencias, cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, por lo que se entiende que realizaciones equivalentes de este tipo se incluyen en esta memoria.

En relación con la presente invención

La Fig. 1 muestra los isocontornos del potencial electrostático de los fragmentos estabilizados por enlace disulfuro del serotipo 1 -serotipo 6 y OspAde B. valaisiana(S1D1-S6D1 y BvaD1), así como el fragmento de fusión mutante de OspA de la invención que consiste en los aminoácidos 125-176 deB. valaisiana,cepa VS116, y los aminoácidos 177-274 deB. garinii,cepa PBr, con un enlace disulfuro introducido (S3hybD1).

La Fig. 2 muestra el alineamiento de aminoácidos de Lip-S4D1-S3hybD1, la proteína heterodímera que contiene el fragmento de fusión OspA mutante de serotipo 3 de la invención, con la proteína heterodímera Lip-S4D1 -S3D1.

La Fig. 3 muestra esquemáticamente la producción de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes de acuerdo con la presente invención.

La Fig. 4 representa esquemáticamente los componentes polipeptídicos de una composición farmacéutica de la presente invención, una "vacuna combinada mejorada", que comprende tres heterodímeros de OspA mutantes diferentes, incluido Lip-S4D1-S3hybD1.

La Fig. 5 muestra la estructura química de PamaCys, un ejemplo de una cisteína sustituida con ácido graso, tal como se encontraría en el extremo N de los polipéptidos lipidados de la presente invención.

La Fig. 6 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra las proteínas OspA deBorreliaserotipos 1-6 producidas en ratones en respuesta a la inmunización con la vacuna combinada de heterodímeros mejorada de la invención.

La Fig. 7 muestra la unión de anticuerpos de ratones inmunizados con la vacuna combinada de heterodímeros mejorada de la invención a la superficie celular de espiroquetas deBorreliade serotipos 1 -6 de OspA.

La Tabla 1 compara el rendimiento de purificación del heterodímero Lip-S4D1-S3hybD1 y del heterodímero Lip-S4D1-S3D1.

La Tabla 2 muestra la capacidad protectora de la vacuna combinada de heterodímeros mejorada de la invención frente al desafíoin vivoconBorreliaserotipos 1,2, 5 y 6 de OspA.

A continuación se describen con más detalle las figuras y tablas a las que se puede hacer referencia en la memoria descriptiva.

Fig. 1. Simulación del potencial electrostático de los fragmentos de OspA estabilizados por enlaces disulfuro de los serotipos 1-6 (S1D1-S6D1) yB. valaisiana(BvaD1), así como del fragmento de fusión estabilizado por enlaces disulfuro (S3hybD1) de OspA. Los isocontornos (+/- 1 kT/e) se muestran en color brillante para cargas negativas y oscuro para cargas positivas, como una superficie sólida. La superficie accesible al disolvente se representa como un esquema. Las flechas blancas indican la posición de las dos agrupaciones extendidas que dan lugar a la polaridad electrostática en el mismo plano del fragmento de serotipo 3. Se puede observar que las superficies del fragmento híbrido C-terminal de OspA no poseen las agrupaciones polares electrostáticas extendidos del monómero S3D1.

Fig. 2. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos heterodímeros Lip-S4D1-S3hybD1 y Lip-S4D1-S3D1, mostrando la secuencia consenso. El heterodímero Lip-S4D1-S3hybD1 difiere del heterodímero Lip-S4D1-S3D1 en tan solo 31 aminoácidos en total.

Fig. 3 Producción de un heterodímero de OspA mutante de la invención que comprende dos fragmentos C-terminales de OspA mutantes seleccionados de diferentes serotipos de OspA deBorrelia sp.o un fragmento C-terminal de OspA mutante híbrido (A). Representación esquemática de un ácido nucleico que codifica un heterodímero de OspA mutante lipidado. Los componentes, de 5' a 3', comprenden las secuencias codificantes para una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido CSS para la lipidación N-terminal, un fragmento C-terminal mutante de OspA con dos cisteínas no nativas, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento C-terminal de OspA mutante con dos cisteínas no nativas. (B) El polipéptido heterodímero de OspA mutante intermedio comprende el producto naciente directamente después de la traducción de la construcción de ácido nucleico. Desde el extremo N al C, este polipéptido consiste en una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido CSS para lipidación, un fragmento de OspA mutante con un enlace disulfuro no nativo, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento de OspA mutante con un enlace disulfuro no nativo. (C) El polipéptido heterodímero de OspA mutante lipidado final después de la modificación postraduccional. El heterodímero, desde el extremo N al C, consiste en un péptido CSS con la cisteína N-terminal lipidada, un fragmento de OspA mutante estabilizado por un enlace disulfuro, un péptido enlazador (LN1), y un segundo fragmento de OspA mutante estabilizado por un enlace disulfuro. La secuencia señal de lipidación se escinde durante la modificación postraduccional del polipéptido como se muestra.

Fig.4. Ejemplo de una composición farmacéutica preferida de acuerdo con la presente invención. En la composición están presentes tres heterodímeros de OspA mutantes, comprendiendo cada uno dos fragmentos de OspA mutados, seleccionados de diferentes serotipos deBorreliao un fragmento híbrido mutante del extremo C-terminal de OspA (S3hybD1), que juntos proporcionan antígenos de OspA de seis serotipos diferentesde Borrelia.Una composición farmacéutica de este tipo permite la inmunización simultánea contra seis serotiposde Borrelia.

Fig. 5. Ilustración de la estructura química de PamaCys, un ejemplo de sustitución de la cisteína N-terminal con un ácido graso de la proteína OspA salvaje de longitud completa, así como de los heterodímeros lipidados del fragmento de OspA mutante de la invención. Durante la modificación postraduccional de una proteína OspA de longitud completa o de polipéptidos de la invención, la secuencia señal de lipidación N-terminal se escinde y los ácidos grasos, comúnmente tres restos palmitoílo ("Pam3"), se unen enzimáticamente de manera covalente al residuo de cisteína N-terminal (el átomo de azufre, "S", se indica con una flecha). Los residuos restantes de la cadena polipeptídica, ubicados en el extremo C-terminal del residuo PamaCys, se representan con "Xn". (Modificado de Bouchon, et al. (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61).

Fig. 6. Títulos de anticuerpos generados contra los seis serotipos de la proteína OspA completa. Ratones se inmunizaron tres veces con 3 gg de cada una de las vacunas combinadas indicadas: Lip-S1 D1-S2D1, LipS4D1-S3D1 y Lip-S5D1 -S6D1 juntas en una relación 1:1:1 ("combinación Het"); Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3hybD1 y Lip-S5D1-S6D1 juntas en una relación 1:1:1 ("combinación het mejorada") o con Lip-OspA quimérico ST1/ST2-His, Lip-OspA quimérico ST5/ST3-His y Lip-OspA quimérico ST6/ST4-His juntas en una relación 1:1:1 ("combo Chimera"), a intervalos de dos semanas. Los sueros se recogieron una semana después de la última dosis. Se determinaron los títulos de anticuerpos IgG frente a seis serotipos diferentes de proteínas OspA de longitud completa mediante ELISA.

Fig. 7. Unión de anticuerpos de ratones inmunizados a la superficie celular de espiroquetasde Borrelia.Los ratones se inmunizaron como se indicó arriba y los sueros se recogieron una semana después de la última dosis y se agruparon. Se analizó la unión de diluciones seriadas de los sueros a la superficie celular de espiroquetasde Borreliamediante tinción celular y citometría de flujo. Los valores de intensidad de fluorescencia observados al teñir con sueros recogidos de ratones control inmunizados solo con adyuvante Al(OH)3 se restaron para tener en cuenta la unión inespecífica. (LasBorreliautilizadas en el ensayo de unión fueron:B. burgdorferi,OspA serotipo 1, cepa N40;B. afzelii,OspA serotipo 2, cepa PKo;B. garinii,OspA serotipo 3, cepa Fr;B. bavariensis,OspA serotipo 4, cepa Fin;B. garinii,OspA serotipo 5, cepa PHei;B. garinii,OspA serotipo 6, cepa KL11).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Modelado molecular del fragmento C-terminal de OspA de serotipo híbrido 3

Motivación para construir fragmentos híbridos C-terminales de OspA ST3

La vacuna combinada contra la borreliosis de Lyme, descrita en la solicitud previa de la presente solicitante (documento WO2014/006226) está compuesta por tres heterodímeros mutantes de OspA. Fragmentos cortos estabilizados de dos serotipos diferentes de OspA (ST), derivados del dominio C-terminal, se fusionan con un enlazador corto para formar un heterodímero. Los tres heterodímeros están compuestos por OspA ST1-ST2, ST4-ST3 y ST5-ST6. Para mejorar la inmunogenicidad de los heterodímeros, se añade una secuencia señal para la lipidación, similar a la OspA madura de longitud completa, que es una lipoproteína.

El heterodímero lipidado compuesto de OspA ST4-ST3 (Lip-S4D1-S3D1; SEQ ID NO: 31) demostró ser menos soluble que los otros dos heterodímeros, lo que resulta en una baja recuperación durante la purificación. Este problema se puede atribuir principalmente a la corta porción estabilizada de OspA ST3, ya que esta proteína, como monómero lipidado, no puede expresarse ni purificarse.

Modelado molecular

Se realizó una investigación estructural comparativain silicode los monómeros estabilizados para dilucidar la compatibilidad de los pliegues entre los modelos monoméricos en comparación con la estructura cristalina de OspA (PDB:1OSP; Li H, Dunn JJ, Luft BJ, Lawson CL (1997) Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab.

Proc Natl Acad Sci 94: 3584-3589) y para comparar sus propiedades superficiales con el monómero de tipo ST3. La estructura cristalina representa el serotipo 1 deBorrelia burgdorferiB31 y muestra OspA unida con su extremo N al anticuerpo murino Fab 184.1. Los modelos de estructura de homología de los seis monómeros de OspA cortos estabilizados se construyeron comenzando con la estructura cristalina de OspA ST1 y los modelos de homología disponibles (SwissModel; Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Schwede T (2009) The sW iSS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37: D387-392), que luego se modificaron para incorporar los enlaces disulfuro estabilizadores y los cambios de secuencia cuando correspondía (The PyMOL Molecular Graphics System, versión de código abierto, Schrodinger LLC).

Los isocontornos del potencial electrostático de los seis monómeros de OspA cortos estabilizados se simularon con el solucionador adaptativo de Poisson-Boltzmann (APBS; Baker NA, Sept D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA (2001) Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci 98: 10037-10041, pdb2pqr; Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, et al. (2007) PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res 35: W522-525) para determinar si la proteína ST3 de OspA corta estabilizada tiene un patrón en la electrostática de superficie que se desvía de las otras STs de OspA, lo que podría explicar el problema de solubilidad del ST3 de OspA corto y estabilizado ("S3D1", Fig. 1). Se observó una polaridad significativa en la distribución de carga en un lado de S3D1 (véanse las flechas), lo cual no se observó en ninguno de los demás ST de OspA corto y estabilizado.

También se realizó una simulación del potencial electrostático con OspA corto estabilizado deB.valaisiana ("BvaD1", Fig. 1). El fragmento OspA de BvaD1 mostró una polaridad variante de los isocontornos del potencial electrostático en la superficie, lo que lo convirtió en un posible candidato a componente básico para un intercambio segmental parcial con el objetivo de modificar la superficie general para que no presente agrupaciones extendidas significativas de polaridad electrostática extendida, como los encontrados en S3D1. Se seleccionó el enlace preferido entre la parte del serotipo 3 y la parte intercambiada deB. valaisianaen el monómero híbrido para reemplazar la lámina beta N-terminal del monómero y dejar intactas las dos láminas beta y la hélice C-terminal de la porción del serotipo 3, manteniendo el plegamiento general. Esta última condición depende en gran medida de la compatibilidad estérica de los residuos hidrofóbicos densamente empaquetados en el núcleo de la molécula. La compatibilidad de pliegues para el modelo del monómero híbrido estabilizado, S3hybD1, se verificó con simulación de mecánica molecular (Gromacs; Pronk S, Pall S, Schulz R, Larsson P, Bjelkmar P,

et al. (2013) GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29: 845-854).

Aplicación en forma de heterodímeros que contienen el fragmento híbrido OspA

Como resultado de las simulaciones de potencial electrostático, se clonó un nuevo heterodímero que contiene la fusión experimental de fragmentos de las proteínas OspA deB. valaisianayB. garinii(S3hybD1, Fig. 1): Lip-S4D1-S3hybD1. Además de los cambios en el primer tercio del fragmento de OspA de serotipo 3 en el heterodímero, S4D1 -S3hybD1, en comparación con Lip S4D1-S3D1, se introdujo una sustitución de aminoácidos en la posición 233 (P233T, nomenclatura de aminoácidos de acuerdo con la OspA inmadura de longitud completa; SEQ ID NO: 8) de OspA ST3.

Como se ilustra con más detalle más adelante, este nuevo heterodímero muestra una solubilidad sustancialmente mejorada, así como inmunogenicidad contra Borrelia que expresa el serotipo 3 de OspA cuando se purifica y se utiliza para inmunizar ratones.

Ejemplo 2. Purificación y formulación de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidadosClonación y expresión de heterodímeros de fragmentos OspA mutantes no marcados con His y lipidados

El monómero de fusión de OspA de la cepaB. valaisiana/B. gariniiVS116/PBr fue optimizado para codones para la expresión enE. co lipor GeneArt (Alemania). La secuencia señal de lipidación añadida al extremo N-terminal se derivó de la lipoproteína principal de la membrana externa deE. coli, Lpp, y fue seguida directamente en el extremo C por un péptido CSS para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. La construcción heterodímera mejorada se generó fusionando el fragmento de OspA serotipo 4 mutante y el fragmento de OspA serotipo 3 híbrido mediante la secuencia enlazadora "LN1". Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen, EE.UU.) y los heterodímeros estabilizados se expresaron en células BL21(DE3) (Invitrogen, EE.UU.). Las células se recolectaron después de 4 h mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes de su posterior procesamiento.

Purificación de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados

Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros del fragmento de OspA mutante lipidados, Lip-S4D1 -S3D1 y Lip-S4D1 -S3hybD1, se enriquecieron en la fase lipídica mediante separación de fases, utilizando Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase diluida con detergente se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (Q-sepharosa; GE Healthcare, Reino Unido) en modo no enlazante. El flujo resultante se cargó en una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad, EE.UU.) y las proteínas lipidadas se eluyeron de la columna mediante un gradiente salino lineal. El material eluido se purificó posteriormente en una columna DEAE-Sepharosa (GE Healthcare) en modo no enlazante, seguida de una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) para el intercambio de tampón. Los picos del heterodímero OspA mutante lipidado se agruparon mediante la columna analítica de exclusión por tamaño y SDS-PAGE. Tras la filtración en condiciones estériles, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta su formulación.

Formulación de la vacuna combinada

Se realizaron estudios sobre la formulación de la vacuna combinada de la invención para optimizar su estabilidad. Se testaron diferentes tipos de tampones y estabilizadores a diversas concentraciones en combinación con hidróxido de aluminio y antígeno, como se describe en la solicitud previa de la presente solicitante WO2014/006226. Se determinó una formulación óptima de 40 pg/mL de cada uno de los tres heterodímeros (120 pg de proteína total), fosfato de sodio 10 mM, cloruro sódico 150 mM, L-metionina 10 mM, 5 % de sacarosa, 0,05 % de Tween 20 (polisorbato 20) y 0,15 % (p/v) de hidróxido de aluminio a pH 6,7 ± 0,2.

Resultados

El heterodímero mejorado, Lip-S4D1 -S3hybD1, mostró un rendimiento aproximadamente 4 veces mayor en términos de mg/g de biomasa, una mejora significativa frente a Lip-S4D1-S3D1. Adicionalmente, una pureza comparable de la preparación de heterodímero mejorada se pudo alcanzar con una etapa cromatográfica menos. (Véase la Tabla 1).

Tabla 1. Rendimiento mejorado del heterodímero Lip S4D1 -S3hybD1 en comparación con Lip-S4D1-S3D1.

Ejemplo 3. Inmunogenicidad de heterodímeros de fragmentos OspA mutantes lipidados de diferentes serotipos.

Inmunización de ratones

Se utilizaron ratones C3H/HeN hembras para todos los estudios. Antes de las inmunizaciones, se sangraron grupos de diez ratones a través de la vena facial y se prepararon y agruparon sueros pre-inmunes. Tres inmunizaciones s.c. de 100 pL cada una se administraron a intervalos de dos semanas. Cada una de las dosis contenía 1 pg de las respectivas proteínas heterodímeras. Para la vacuna combinada heterodímera mejorada: Lip-S1 D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33); para la vacuna combinada heterodímera de la invención anterior: Lip-S1 D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), LipS4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 31) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) y para la vacuna combinada Chimera: Lip-Quimérica OspA ST1/ST2-His (SEQ ID NO: 40), Lip-Quimérica OspA ST5/ST3-His (SEQ ID NO: 41) y Lip-Quimérica OspA ST6/ST4-His (SEQ ID NO: 42). Todas las vacunas combinadas se formularon con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se extrajo sangre de la vena facial y se prepararon sueros inmunes. En cada experimento, se incluyó un grupo inmunizado con PBS formulado con Al(OH)3 como control negativo (grupo placebo). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la legislación austriaca (BGB1 N° 501/1989) y fueron aprobados por el "Magistratsabteilung 58"

ELISA de OspA

Placas ELISA (Maxisorp, Nunc, Dinamarca) se cubrieron con 50 ng (1 pg/mL) de proteína diluida en tampón de recubrimiento (PBS) por pocilio y se incubaron a 4 °C durante 16 a 72 horas. Los antígenos de recubrimiento fueron OspA ST1-6 lipidada de longitud completa marcadas con His en el extremo C. Se descartó el tampón de recubrimiento y se añadieron 100 pL de tampón de bloqueo (BSA al 1 %, Tween-20 al 0,5 %, PBS) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Las placas se lavaron tres veces con 300 pL (excedente) de PBST (Tween-20 al 0,1 %, PBS). Se realizaron diluciones quíntuples de los sueros en tampón de bloqueo y se añadieron 50 pL a cada uno de los pocillos, incubándose durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 pL (excedente) de PBST. El anticuerpo secundario (IgG de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante [HRP], DAKO, Dinamarca) se diluyó 1:2000 en tampón de bloqueo y se añadieron 50 pL a cada uno de los pocillos y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 pL (excedente) de PBST. Se utilizó ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), Sigma-Aldrich, EE. UU.) como sustrato para HRP; se añadieron 50 pL de ABTS a cada uno de los pocillos y se incubó durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 50 pL de SDS al 1 % y se leyó la absorbancia a 405 nm. Una placa se consideró válida cuando la absorbancia del blanco fue inferior a 0,1. Una muestra fue válida cuando la dilución más baja tuvo una absorbancia superior a 1,0 y la dilución más alta, inferior a 0,1. Cuando se cumplieron estos criterios, se determinó el semitítulo máximo. El semitítulo máximo es el recíproco de la dilución que corresponde a la absorbancia media entre las diluciones más alta y más baja.Citometría de flujo

Se mezclaron espiroquetas (1 x 106) con un volumen igual de paraformaldehído al 4 % y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos (Nunclon 96U, Nunc). La placa se centrifugó durante 5 minutos a 2.000 g y se descartó el sobrenadante. Las células se lavaron con 150 pL de HBSS con BSA al 2 % (HBSS-B), se centrifugaron como se indicó anteriormente y se descartó el sobrenadante. Los sueros de ratón se inactivaron por calor incubándolos a 56 °C durante 35 minutos. Los sueros inactivados por calor se diluyeron en HBSS-B y se esterilizaron por filtración mediante centrifugación a 4.000gdurante 3 minutos utilizando filtros para tubos de centrífuga Costar spin-X (0,22 pm, Corning, EE.UU.). Las espiroquetas se disolvieron en 100 pL de suero y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se centrifugó durante 15 minutos a 2.000 g y se descartó el sobrenadante. Las células se lavaron una vez con 150 pL de HBSS-B y luego se resuspendieron en 100 pL de HBSS-B. Se añadió un microlitro de anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón conjugada con PE, Beckman Coulter, EE. UU.) a las células y se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad. Las espiroquetas se lavaron una vez con 150 pL de HBSS-B y luego se resuspendieron en 200 pL de HBSS que contenía 2,5 pM de colorante de ADN SYTO-17 y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las espiroquetas teñidas se sedimentaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 2.000 g y posteriormente se resuspendieron en 200 pL de HBSS. Las espiroquetas marcadas se midieron con un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter), controlado para los eventos positivos de SYTO-17.

Resultados

Dos formulaciones de heterodímeros de OspA diferentes ("het combo" y "het combo mejorado"), así como de una combinación quimérica de OspA ("combo chimera") se testaron en cuanto a inmunogenicidad en ratones. Sueros hiperinmunes se analizaron mediante ELISA para determinar su reactividad frente a OspA de longitud completa (antígeno de recubrimiento), así como su unión superficial a cepas deBorreliaque expresan diferentes serotipos de OspA (ST1 a ST6).

Los resultados del ELISA indicaron que todas las combinaciones de vacunas estimularon las respuestas de anticuerpos contra los seis serotipos de OspA (véase la Fig. 6). Cabe destacar especialmente, en relación con la presente invención, que la vacuna combinada de heterodímeros de OspA mejorada generó niveles más altos de anticuerpos específicos contra el serotipo 3 de OspA en comparación con la vacuna combinada de heterodímeros de OspA de la invención anterior, mientras que ambas vacunas estimularon de forma comparable los niveles de anticuerpos contra otros serotipos de OspA.

Se observó la unión directa de anticuerpos de sueros de ratones hiperinmunes a espiroquetas de borrelia en el caso de Borreliaequeexpresaban los seis serotipos de OspA (véase la Fig. 7), lo que indica que los anticuerpos generados en respuesta a todos los antígenos son funcionalmente activos y pueden unirse a la OspA nativain situ.La intensidad de fluorescencia fue lineal en un amplio intervalo de diluciones séricas. La intensidad de fluorescencia observada en respuesta a la vacuna combinada de heterodímeros mejorada frente a espiroquetas fue comparable a la observada en respuesta a la vacuna combinada de heterodímeros y a la vacuna combinada de quimeras. Cabe destacar que, con respecto a la unión a la borrelia de OspA serotipo 3, los anticuerpos generados por la inmunización con la vacuna mejorada fueron superiores a la generación de anticuerpos en respuesta a las otras dos vacunas combinadas.

Ejemplo 4. Capacidad protectora de la vacuna combinada de heterodímeros mejorada contra la exposiciónin vivo a Borrelia

Inmunización de ratones

Ratones C3H/HeN hembra(H-2*)para todos los estudios (Janvier, Francia). Antes de cada exposición, se extrajo sangre de la vena de la cola a grupos de cinco ratones de 8 semanas de edad y se prepararon y agruparon sueros preinmunes. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 pL con intervalos de dos semanas a las dosis indicadas en la Tabla 2. Tanto la vacuna combinada de heterodímeros mejorados como la vacuna combinada de quimeras incluyeron tres proteínas en una proporción de 1:1:1, como se describe en el Ejemplo 3. Todas las formulaciones incluyeron hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se extrajo sangre y se prepararon sueros hiperinmunes. En cada uno de los experimentos, un grupo inyectado con Al(OH)3 solo (en tampón de formulación o PBS) se incluyó como control negativo y un grupo de ratones inmunizados con la proteína OspA lipidada de longitud completa de tipo salvaje del serotipo de OspA apropiado sirvió como grupo de control positivo (cepa B31 deB. burgdorferi(serotipo 1 de OspA, SEQ ID<n>O: 34), cepa K78 deB. afzelii(serotipo 2 de OspA, SEQ ID NO: 35), cepa PHei de B. garinii (serotipo 5 de OspA, SEQ ID NO: 38) o cepa DK29 deB. garinii(serotipo 6 de OspA, SEQ ID<n>O: 39)). Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 N° 501/1989) y fueron aprobados por "Magistratsabteilung 58".

Desafío con agujas de ratones inmunizados con Borrelia cultivadain vitro

Dos semanas después de la última inmunización, los ratones fueron desafiados s.c. con espiroquetas diluidas en 100 qL de medio de crecimiento (BSKII).B. burgdorfericepa ZS7 expresando OspA serotipo 1 (experimentos 1 y2), B. gariniicepa PHei expresando OspA serotipo 5 (experimentos 10 a 13) oB. gariniicepa Ma expresando OspA serotipo 6 (experimentos 14 a 17) se utilizaron para el desafío. Las dosis de desafío fueron dependientes de la cepa y dependientes de la virulencia de las cepas individuales, que se evaluó mediante experimentos de desafío para la determinación de ID50. Las dosis empleadas para los experimentos de desafío con aguja variaron de 20 a 50 veces la ID50. Antes de cada desafío, la expresión de OspA se verificó por citometría de flujo (véase el ejemplo 3). El desafío de ratones solo se realizó con cultivos donde > 80 % de las células eran positivas para la expresión de OspA.

Desafío de ratones inmunizados con garrapatas infectadas conB. burgdorferioB. afzelii ("desafío a garrapatas")

Dos semanas después de la última inmunización, se expuso a los ratones a garrapatas que albergaban la cepa Pra4 deB. burgdorferi,que expresaba el serotipo 1 de OspA (experimento 3), la cepa Pral deB. burgdorferi,que expresaba el serotipo 1 de OspA (experimentos 4 y 5) o la cepa 2 de OspA deB. afzelii(experimentos 6 a 9). Para facilitar la infección por garrapatas de los ratones inmunizados, se eliminó el pelo del dorso de cada uno de los ratones con Veet® Cream (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un pequeño recipiente ventilado a la piel con superpegamento (Pattex, Alemania). Posteriormente, se aplicaron de dos a tres ninfasde I. ricinusinfectadas con la cepa Pral o Pra 4 deB. burgdorferi, o la cepa IS1 de B. afzelii,por ratón, y se les permitió adherirse y alimentarse hasta que se llenaron completamente y se soltaron. Se monitorizó diariamente el estado de alimentación de cada una de las garrapatas. Solo se incluyeron en la lectura final aquellos ratones de los cuales se recogió al menos una garrapata completamente o casi completamente alimentada.

Sacrificio de ratones y recolección de material

Cuatro semanas después de la inoculación con aguja o garrapata, respectivamente, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se extrajo sangre mediante sangrado orbital y se prepararon los sueros finales, que se utilizaron para ELISA de VlsE y/o transferencia Western para determinar el estado de infección. Además, se extrajo la vejiga urinaria de cada uno de los ratones, se extrajo ADN y se sometió a PCR cuantitativa (qPCR) para la identificación deBorrelia.

ELISA con la Región Invariable 6 (IR6) de VlsE

Se utilizó un péptido biotinilado de 25 meros (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK, SEQ ID NO: 59) derivado de la secuencia de la cepa IP90 deB. gariniipara el análisis (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. Una región inmunodominante conservada dentro del dominio variable de VlsE, el antígeno de superficie variable de Borrelia burgdorferi. J Immunol. 1999; 163:5566-73). Las placas ELISA de 96 pocillos recubiertas previamente con estreptavidina (Nunc) se recubrieron con 100 qL/pocillo (1 qg/mL) de péptido en PBS suplementado con Tween al 0,1 % (PBS/0,1T). Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Tras recubrir con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1T. Posteriormente, se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente (TA) con 100 qL/pocillo de PBS BSA al 2%, antes de lavarse de nuevo con PBS/0,1T. La reactividad de los sueros post-exposición (sueros finales) al péptido se analizó en diluciones 1:200 y 1:400 en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 minutos a TA antes de lavarse tres veces con PBS/0,1T. Cada uno de los pocillo recibió 50 qL de 1,3 qg/mL de anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Dako) en PBS BSA al 1 %. Posteriormente, las placas se incubaron durante 1 hora a TA. Tras tres lavados con PBS/0,1T, se añadió ABTS (50 qL/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich) y se dejó que el color se desarrollara durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 405 nm. Todos los sueros se analizaron por duplicado. Los controles negativos incluyeron PBS en lugar de sueros, así como placas sin recubrir con el péptido. Se utilizaron como controles positivos los sueros de ratones con cultivo positivo para infección por borrelia.

Extracción y purificación de ADN

La vejiga urinaria de cada uno de los ratones se sometió a extracción y purificación de ADN utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación. Cada una de las vejigas urinarias se digirió durante la noche a 60 °C con 100 qL de proteinasa K recombinante (calidad PCR; 14-22 mg/mL, Roche).

El ADN se eluyó en 50 gL de agua desionizada estéril y se almacenó a -20 °C. Como control negativo, cada décima muestra se sometió a una columna de purificación vacía en cada extracción y purificación de ADN.

qPCR dirigida a recA

Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para el genrecAde manera que pudieran utilizarse en qPCR para la identificación de todas las especies relevantesde Borreliacausantes de la borreliosis de Lyme (directo: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, SEQ ID NO: 57, inverso: CCCATTTCTCCATCTATCTC, SEQ ID NO: 58). El fragmento recA se clonó de la cepa N40 deB. burgdorferis.s. en pET28b(+), para utilizarse como patrón en cada reacción. El ADN cromosómico extraído de vejigas urinarias de ratón se diluyó 1:4 en agua para reducir los efectos de matriz observados con el ADN sin diluir. Se preparó una mezcla maestra compuesta por 10 gL de SSoAdvanced™ SYBR® Green Supermix, 0,3 gL de cada uno de los cebadores (10 gM) y 7,4 gL de agua para cada experimento. Se mezclaron dieciocho gL de la mezcla maestra con 2 gL del ADN diluido extraído de la vejiga urinaria en microplacas de titulación. El ADN se amplificó utilizando un sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). El ADN se desnaturalizó durante 3 minutos a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 30 segundos a 55 °C. Tras la amplificación, el ADN se preparó para el análisis de la curva de fusión mediante desnaturalización durante 30 segundos a 95 °C, seguidos de 2 minutos a 55 °C. El análisis de la curva de fusión se realizó mediante una incubación de 5 segundos a 55 °C, con un aumento de 0,5 °C por ciclo, y 5 segundos a 95 °C. En cada una de las placas se incluyeron cuatro controles sin molde (NTC), así como una curva estándar por duplicado con un número de copias de molde de 10 a 10000.

Transferencia Western

La unión de los sueros finales a lisados de células completas de borrelia pertenecientes al serotipo OspA correspondiente se analizó mediante inmunotransferencia (transferencia Western). Brevemente, se separaron 2,5 gg de lisado de espiroqueta por cada suero de ratón a analizar mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras utilizando geles ZOOM de Tris-glicina al 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia en seco iBlot® (Invitrogen). Tras bloquear en leche al 5 % durante 1 hora, se añadieron los sueros finales a una dilución de 1:2000 y se incubaron a 4 °C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces con PBS/0,1 T, seguido de una incubación de una hora en anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Dako) diluido 1:10000. Las inmunotransferencias se visualizaron con reactivos de detección de transferencia Western Amersham ECL Plus™ (GE Healthcare) y películas Kodak BioMax (Kodak).

Lectura de la infección

La lectura final de la infección se basó en dos métodos distintos: detección de la presencia de anticuerpos específicoscontra Borrelia(transferencia Western y ELISA VlsE) y de ADN deBorrelia(qPCR que fija como objetivorecA).En los experimentos en los que se utilizó la cepa ZS7 de B.burgdorferipara el desafío (experimentos 1 y 2), se aplicó la transferencia Western junto con qPCR. En todos los demás experimentos, se utilizaron ELISA VlsE y qPCR. Se observó una alta consistencia entre ambos métodos (> 95 %); por lo tanto, se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos uno de los dos métodos era positivo. La significancia estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher (bilateral).

Resultados

Se evaluó la capacidad protectora de la vacuna combinada heterodímera mejorada contra la infección porBorrelia.Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 2. Los ratones inmunizados se expusieron aB. burgdorferis.s. (OspA serotipo 1, cepa ZS7, exposición con aguja, Experimentos 1 y 2, o cepas Pral o Pra 4, exposición con garrapatas, Experimentos 3 o 4 y 5, respectivamente),B. afzelii(OspA serotipo 2, cepa IS1, exposición con garrapatas, Experimentos 6-9),B. garinii(OspA serotipo 5, cepa PHei, exposición con aguja, Experimentos 10-13) oB. garinii(OspA serotipo 6, cepa Ma, exposición con aguja, Experimentos 14-17). En algunos experimentos, se incluyeron otros antígenos basados en OspA, tales como la vacuna combinada de quimeras o una proteína OspA de longitud completa lipidada. Un grupo de ratones inmunizados con PBS o un tampón de formulación combinado con Al(OH)3 sirvió como grupo de control placebo (adyuvante solo) en cada uno de los experimentos.

Los datos de protección de los 17 experimentos se resumen en la Tabla 2. En todos los experimentos, se observó un alto nivel de infección en todos los grupos placebo. Además, se observó una baja tasa de infección en los grupos que recibieron la proteína OspA completa correspondiente, con la excepción del serotipo 6 de OspA completa, en el que solo se observó una protección parcial (experimentos 14 a 17). Estos resultados validan la configuración experimental y los métodos de lectura.

La vacuna combinada de heterodímeros mejorada confirió protección significativa (p < 0,05) a una dosis de 3 gg al infectar a ratones conB. burgdorferiss oB. garinii(serotipos 5 o 6 de OspA) cultivadasin vitro,o con garrapatas que albergabanB. burgdorferioB. afzelii.Además, al evaluar la eficacia de la vacuna con diferentes dosis de inmunización, se observó una protección altamente significativa (p < 0,01) al administrar 0,03 gg de la vacuna combinada de heterodímeros mejorada e infectar a los ratones conB. afzelii o B. garinii(serotipos 5 o 6 de OspA) (Experimentos 8, 9, 12, 13 y 16). En resumen, la vacuna combinada de heterodímeros mejorada indujo inmunidad protectora contra tres especiesde Borrelia (B.

burgdorferi, B. afzeliiyB. garinii),incluidos cuatro serotipos de OspA clínicamente relevantes (1,2, 5 y 6), como se muestra en modelos de ratón utilizando espiroquetas cultivadasin vitroo garrapatas infectadas para el desafío.

También se observó una protección contra los serotipos 5 y 6 comparable a la conferida por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada en ratones inmunizados con la vacuna combinada de quimeras (datos no mostrados).

Tabla 2. Capacidad protectora de la vacuna combinada de heterodímeros de OspA mutante mejorada de la invención contra la exposición aBorreliade los serotipos 1,2, 5 y 6 de OspA. Los grupos de ratones se inmunizaron tres veces con las dosis indicadas de inmunógeno o adyuvante Al(OH)3 solo, a intervalos de dos semanas. Los inmunógenos utilizados fueron una combinación 1:1:1 de los heterodímeros OspA mutantes Lip-S1 D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 y Lip-S5D1-S6D1 ("Vacuna de combinación de heterodímeros mejorada"), una combinación 1:1:1 de Lip-Quimérico OspA ST1/ST2-His, Lip-Quimérico OspA ST5/ST3-His y Lip-Quimérico OspA ST6/ST4-His ("Vacuna combinada de quimeras") y Lip-OspA1-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de la cepa B31 deB. burgdorferi)o Lip-OspA2-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de la cepa K78 deB. afzelii),Lip-OspA5-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de la cepa PHei de B. garinii) o Lip-OspA6-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de la cepa PHei deB. garinii)Proteína OspA deB. garinii,cepa DK29. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones inmunizados fueron sometidos a una prueba s.c. con la especie de borrelia indicada, utilizando una jeringa (B.burgdorferi,cepa ZS7,B. garinii,cepa PHei oB. garinii,cepa Ma) o garrapatas (B.burgdorferi,cepa Pral o Pra4, oB. afzelii,cepa IS1). Protección contra la prueba de provocación con aguja con borrelia OspA de serotipo 1 mediante la vacuna combinada quimérica y la vacuna combinada heterodímera mejorada (una dosis: 3 gg).

B Protección contra la infección por garrapatas con borrelia de serotipo 1 OspA mediante vacuna combinada de quimeras y vacuna combinada de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 gg)

(continúa)

C Protección contra la infección por garrapatas con borrelia de serotipo 1 OspA mediante una vacuna combinada de heterodímeros mejorada (dosis decrecientes: 3 gg y 0,3 gg)

D Protección contra la infección por garrapatas con borrelia de serotipo 2 OspA mediante vacuna combinada de quimeras y vacuna combinada de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 gg)

(continúa)

E Protección contra la infección por garrapatas del serotipo 2 de borrelia OspA mediante una vacuna combinada de heterodímeros mejorada (dosis decrecientes: 0,03 gg y 0,003 gg)

F Protección contra la provocación con aguja de borrelia OspA de serotipo 5 mediante una vacuna combinada de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 gg)

G Protección contra la provocación con aguja de borrelia OspA de serotipo 5 mediante una vacuna combinada de heterodímeros mejorada (dosis decrecientes: 3 gg, 0,3 gg y 0,03 gg)

H Protección contra la provocación con agujas de borrelia OspA del serotipo 6 mediante una vacuna combinada de heterodímeros meorada una dosis: 3 u

I Protección contra la infección por borrelia OspA de serotipo 6 mediante una vacuna combinada de heterodímeros m r i r i n :

SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1

S3hybD1: fragmento híbrido C-terminal de OspA; aminoácidos de las posiciones 125-176 deBorrelia valaisiana,cepa VS116, y aminoácidos 177-274 deBorrelia garinii,cepa PBr, con enlace disulfuro tipo 1 y T en la posición 233

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTV

TLSKNLSKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTTTVQNYN

RAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 2

B. valaisiana(cepa VS116), OspA aa 125-176

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGK

B. garinii(cepa PBr, serotipo 3), OspA aa 177-274, con T en la posición 233, de OspA de longitud completa SEQ ID NO: 8);

TKLTVTCG.TVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTK

ENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 4

B. valaisiana(cepa VS116), OspA

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLVATVDKVE

LKGTSDKNNGSGTLEGVKDDKSKVKLTISDDLGETKLETFKEDGTLVSRKVNFKDKSFTEEK

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITEGTVT

LSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNP

AGNKLEGTAVEJKTLQELKNALK

S E Q ID NO: 5

B. bu rgd o rfe riss (cepa B 31 , O spA sero tipo 1);

MKKYLLGLGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGHMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLE LKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEE KFNEKGEVSEK1ITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTL SKN1SKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLT1TVNSKKTKDLVFTKENT1TVQQYDS NGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK

SEQ ID NO: 6

B. afzelii(cepa K78; OspA serotipo 2);

MKKYLLGIGLILAL1ACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIE LKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDE MFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGT VTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQK YDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK

SEQ ID NO: 7

B. garinii(cepa PBr, serotipo 3 de OspA) con P en la posición 233 (acceso embl X80256.1);

MKKYLLGIGL1LALJACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFETFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEK

F'IS'DKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGEALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK

SEQ ID NO: 8

B. garinii(cepa PBr, serotipo 3 de OspA) con T en la posición 233 (acceso embl ACL34827.1);

MKKYLLGIGLILAL1ACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEK FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTÍTVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK

SEQ ID NO: 9

B. bavariensis(cepa PBi, OspA serotipo 4)

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLE LKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSTEEKF NAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDEALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLS KHIPN SGE1TVELN DSNSTQ ATKK.TGKWDSNTSTLTIS VNS KKTKN1VFTKEDTIT VQK YDS AG TNLEGNAVEIKTLDELKNALK

SEQ ID NO: 10

B. garinii(cepa PHei, OspA serotipo 5);

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTTAEDLSKTTFETFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEK FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKOLVFTKEDT1TVONYDSAG TNLEGKAVEITTLKELKNALK

SEQ ID NO: 11

B. garinii(cepa DK29, serotipo 6 de OspA);

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLE LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEK FNGKGETSEKTTVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVV LSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELKNALK

S E Q ID NO: 12

B. ga rin ii(cepa T25, sero tipo 7 de O spA);

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLE LKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEE KFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTV TLSKNISESGEITVELKDTBTTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYN TAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK SEQ ID NO: 13

Señal de lipidación deBorrelia OspA

MKKYLLGIGLILALIA

SEQ ID NO: 14

Señal de lipidación de OspB deBorrelia

MRLLIGFALALALIG

SEQ ID NO: 15

Señal de lipidación de lppde E. coli

MKATKLVLGAVILGSTLLAG

SEQ ID NO: 16

Enlace peptídico LN1 construido a partir de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA dela cepa B31 de B. burgdorferis.s. (aa 65-74 y aa 42-53, intercambio de aminoácidos en la posición 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS

SEQ ID NO: 17

Secuencia similar a hLFA-1 de la cepa B31 deB. burgdorferis.s. (serotipo 1 de OspA) GYVLEGTLTAE

SEQ ID NO: 18

Secuencia distinta de hLFA-1 de la cepa K78de B. afzelii(serotipo 2 de OspA)

NFTLEGKVAND

SEQ ID NO: 19

B. burgdorferiss (cepa B31, serotipo 1), OspA aa 126-273 con secuencia similar a hLFA reemplazada del serotipo 1 de OspA

FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLS KNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTTTVNSKKTKDLVFTKENTTTVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEIKNALK

SEQ ID NO: 20

B. afzelii(cepa K78, serotipo 2), OspA aa 126-273

FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVT LSKF.T AKSGR VTV AI .NDTNTTQ ATKKTG A WDSKTSTI TfS VNS KKTTQI. VFTKQDTÍTVQK YD SAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK

SEQ ID NO: 21

B. garinii(cepa PBr, serotipo 3), OspA aa 126-274

FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAK.EVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO: 22

B. bavaríensis(cepa PBi, serotipo 4), OspA aa 126-273

FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLS KHTPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAG TNLEGNAVEIKTLDELKNALK

SEQ ID NO: 23

B. garinii(cepa PHei, serotipo 5), OspA aa 126-273

FNEKGHISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEG KA VEITTLKELKN ALK

S E Q ID NO: 24

B. ga rin ii(cepa DK29, sero tipo 6), O spA aa 126-274

FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVV LSKNILKSGE1TAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVETKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELKNALK

SEQ ID NO: 25

B. garinii(cepa T25, serotipo 7) OspA aa 126-274

FNDKGK.LSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVT LSKNISESC.EITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTTTVQKYNT AGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK

SEQ ID NO: 26

Lip-S4D1-S3hybD1 -nt Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA serotipo 4 y OspA serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación lppde E. coli, secuencia de enlace LN1, fragmento de OspA de serotipo 3 que comprende los aminoácidos 125-176 deB. valaisiana,cepa VS116 (SeQ ID NO: 2) y los aminoácidos 177-274 deB. garinii,cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 3)

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TÜCTCAAGCTTCAATGCTAAGGÜCGAACTÜAGCÜAAAAAACGATCCTGCGTÜCGAATGG CACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCC TGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGT GCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGA ACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCC ACGCTGACC ATTTC AGTC A ACTCGA A A A AGACC A A A A ATATTGTGTTC ACGA AGG A AG AT ACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGA AATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATG GCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAA GTGAGCGAAAAAATTCTGACCCGTAGCAATGGCACCACCCTGGAATATAGCCAGATGAC CGATGCAGAAAATGCAACCAAAGCAGTTGAAACCCTGAAAAACGGTATTAAACTGCCTG GTAATCTGGTTGGTGGTAAAACCAAACTGACCGTTACCTGTGGCACCGTTACCCTGAGCA AAA ACATT AGCA AA AGCGGTGAA ATTACCGTGGC ACTG AAT GAT ACCGAA ACCACACCG GCAGACAAAAAAACCGGTGAATGGAAAAGCGATACCAGCACCCTGACCATTAGTAAAAA TAGCCAGAAAACAAAACAGCTGGTGTTTACCAAAGAAAACACCATTACCGTGCAGAATT ATAACCGTGCAGGTAATGCACTGGAAC.GTAGTCCGGCAGAAATTAAAGATCTGGCAGAA CTGTGTGCAGCCCTGAAATAA

SEQ ID NO: 27

Lip-S4D1-S3hybD1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA serotipo 4 y OspA serotipo 3, que comprende los aminoácidos 125-176 deB. valaisiana,cepa VS116 (SEQ ID NO: 2) y los aminoácidos 177-274 deB. garinii,cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 3), con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia de enlace LN1, lipidación N-terminal

LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTETKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCG TVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQK YDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKTLTRS NGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVAL NDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKD LAELCAALK

SEQ ID NO: 28

Lip-S1D1-S2D1-nt: Secuencia codificante de proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales del serotipo 1 de OspA y del serotipo 2 de OspA con enlace disulfuro tipo 1, Señal de lipidación de lppde E. coli.secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA reemplazada por una secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGG CACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTC TGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTGGTGAAA TGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTG AATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTC GACGCTGACCATTACGGTTATAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAA ACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTG GAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAA TGGCTCTGGTAGCAAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCG AACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCAACCAAACTGGAATATACGGAAATG AAAAGCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAA AGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAG AAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGAATACCACGCAACG ACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAG CAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACG ACAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGAACGCCCT GAAA

SEQ ID NO: 29

Lip-S1D1-S2D1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA serotipo 1 y OspA serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para adición de lípidos, secuencia de enlazador LN1, aa 164-174 de OspA serotipo 1 reemplazados por secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal

LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCG TVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITYNSKKTKDLVFTKENTITVQ QYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTR ENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVA LNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIK TLDELCNALK

SEQ ID NO: 30

Lip-S4D1-S3D1-nt: Secuencia codificante de proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de los serotipos 4 y 3 de OspA, ambos con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación lppde E. coli, CSS N-terminal para adición de lípidos, secuencia de enlazador LN1

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGG CACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCC TGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGT GCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGA ACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCC ACGCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGAT ACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGA AATCAAAACCCTGGATCrAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATG GCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCAAA CTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAA AAACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCC TGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAA AACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCT GACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAACTC GCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATA ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGT GTGCGGCACTGAAA

SEQ ID NO: 31

Lip-S4D1-S3D1-aa: Proteína de fusión de heterodímeros de los serotipos 4 y 3 de OspA, ambos con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia de enlazador LN1, lipidación N-terminal

LipCSSFNAKGELSEKTTLRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCG TVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTTSVNSKKTKNIVFTKEDTTTVQK YDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTR ANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVAL NDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKD LAELCAALK

SEQ ID NO: 32

Lip-S5D1-S6D1-nt: Secuencia codificante de proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de los serotipos 6 de OspA, ambos con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidaciónde E. coli lpp,CSS N-terminal para adición de lípidos, secuencia de enlazador LN1

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT

TGC lC A A G C n C AACG AAAAGGGCGAAA TCICAGAAAAAACCA i'CG'i CCGCGCIAACGG CACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTC TGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTG ACCTGCGGTACCGTT ACGCTGTCCAA AA AC ATT AGT AAGTCCGGCGA A ATCACGGTCGCC CTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTC GACGCTGACCATTTCT AAAAATCGT ACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAG ATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTG GAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAA TGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTG AAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATT AAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTAC CCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAA AAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGT GCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAA CTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTA TGACAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAAC TGTGTAATGCTCTGAAA

SEQ ID NO: 33

Lip-S5D1 -S6D1 -aa: Proteína de fusión de heterodímeros de los serotipos 6 de OspA, ambos con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia de enlazador LN1, lipidación N-terminal

LipCSSFNEKGETSEKTIVRANGTRLEYTDTKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTC GTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQN YDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRA NGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALD DSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTTTVQRYDSAGTNLEGKAVEITTL KELCNALK

SEQ ID NO: 34

B. burgdorferi(cepa B31, serotipo 1 de OspA) aa 18-273, secuencia señal de lipidación lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSG VLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKII TRADGTRLEYTGTKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEIKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 35

B. afzelii(cepa K78; OspA serotipo 2) aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFK.QN VSSLDEKNS ASV DLPGEMKV LVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSG VLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKT MTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKETAKSGEV TVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 36

B. garinii(cepa PBr; serotipo 3 de OspA) aa 18-274, secuencia señal de lipidación lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSG VLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVV TRANGTRLEYTEIKNDGSGKAK.EVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITV ALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEI KDLAELKAALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 37

B. bavariensis(cepa PBi; serotipo 4 de OspA) aa 18-273, secuencia señal de lipidación Ipp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDK.DGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSG TLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFETFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSrEEKFNAKGELSEKTILR ANGTRLEYTETKSDGTC.KAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHTPNSGETTVELN DSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTL DELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 38

B. garinii(cepa PHei; OspA serotipo 5) aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEK.DKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSG TLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTTVR ANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNTSKSGEITVAL DDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTL KELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 39

B. garinii(cepa DK29; serotipo 6 de OspA) aa 18-274, secuencia señal de lipidación lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), etiqueta His C-terminal (LEHHHHHH, SEQ ID NO: 64), CSSF N-terminal (SEQ ID NO: 65) para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSG TLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFE1FKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIV RANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAA LDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEIT TLKELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 40

OspA quimérico serotipo 1/serotipo 2, lipidación N-terminal, marcado con His, incluida la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento

MRLLIGFALALALLGCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGKYDLIATVDKLELKG TSDKNNGSGVEFGVKTNKSKVKI/nSDDIGQTTLEVFKEDGKTFVSKKVTSKDKSSTEEKFN EKGEVSEKIITMADGTRLEYTG1KSDGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSM NISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAG TNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 41

OspA quimérica serotipo 5/serotipo 3, lipidación N-terminal, marcada con His, incluida la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento

MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMK.VLVSKEKDKNGKYSLMATVEKLELKG TSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTTAEDLSKTTFErFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNE KGETSEKTIVMANGTRLEYTDTKSDKTGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSM NISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGN ALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 42

OspA quimérica serotipo 6/serotipo 4, lipidación N-terminal, marcada con His, incluida la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento

MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKNGKYSLEATVDKLELKG TSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTTADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNE KGETSEKTIVMANGTRLEYTDIKSDGSGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSM NILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKN1VFTKEDTITVQKYDSAGT NLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 43

S1D1

FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLS KNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEICNALK

SEQ ID NO: 44

S2D1

FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEM KSDGTGK.A KEVLKNFTLEGKV AN DKVTLEV KCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYD SAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK

SEQ ID NO: 45

S3D1

FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVT

T ,SKNTSKSGF.TTVAT .NDTETTPADKKTGF.WKSDTSTT TTSKNS QKTKQI ,VFTKF.NTTTVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 46

S4D1

FNAKGELSEKT1LRANGTRLEYTE1KSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLS KHIPNSGKITVHENDSNSTQATKKTGKWIYSNTSTI.TISVNSKKTKNIVFTKHDTITVGKYDSAG TNLEGNAVEIK.TLDELCNALK

SEQ ID NO: 47

S5D1

FNEKGHISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKKRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEGKAVEITTLKELCNALK

SEQ ID NO: 48

S6D1

FNGKCiETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVV LSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELCNALK

SEQ ID NO: 49

S3HYBD1 (BVA)

FNEK.GEVSEK1LTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTV TLSKN1SKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYN RAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 50

BVAD1

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITCGTVT LSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNP AGNKLEGTAVEIKTLQELCNALK

SEQ ID NO: 51

S3hybD1(Bsp): fragmento híbrido C-terminal de OspA; aminoácidos 126-175 de Borrelia spielmanii y aminoácidos 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr, con enlace disulfuro tipo 1 y T en la posición 233

FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKTKLTVTCGTVTLS KNISKSGEITVALNDTETTPADKKTCEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRA GNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 52

MSPD1

FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKATLTVKCGTVTL SKNIDKSGEVTVALNDTDSTAATKKTGAWDSKTSTLTITVNSKKTKDLVFTKQDTITVQKYD SAGTTLEGSAVEIKTLDELCNALK SEQ ID NO: 53

Cebador directo para el espaciador intergénico 16S-23S GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG SEQ ID NO: 54

Cebador inverso para el espaciador intergénico 16S-23S GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG SEQ ID NO: 55

Cebador anidado directo para el espaciador intergénico 16S-23SAGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG SEQ ID NO: 56

Cebador anidado inverso para el espaciador intergénico 16S-23SGTCTGATAAACCTGAGGTCGGA SEQ ID NO: 57

Cebador directo para el gen RecA deBorrelia

CATGCTCTTGATCCTGTTTA SEQ ID NO: 58

Cebador inverso para el gen RecA deBorrelia

CCCATTTCTCCATCTATCTC SEQ ID NO: 59 Péptido de 25 meros de la Región Invariable 6 (IR6) de VlsE MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK SEQ ID NO: 60

Catelina de ratónRAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE

SEQ ID NO: 61

Péptido KLKKLKLLLLLKLK

SEQ ID NO: 62

Péptido N-terminal para la lipidaciónCKQN

SEQ ID NO: 635'-(dIdC)13 -3'

dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC SEQ ID NO: 64

Etiqueta HisLEHHHHHH

SEQ ID NO: 65

CSSFCSSF N-terminal

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica, que comprende

a) un polipéptido que comprende un fragmento híbrido de OspA C-terminal (proteína A de superficie externa deBorrelia),en donde el fragmento híbrido de OspA C-terminal consiste en una primera y una segunda porción de OspA de dos cepas diferentes deBorrelia, en donde el fragmento híbrido de OspA C-terminal difiere del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos por la introducción de al menos un enlace disulfuro, y en donde el fragmento híbrido de OspA C-terminal está definido además por SEQ ID NO: 1, que comprende opcionalmente a lo sumo 10 mutaciones adicionales,

b) opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido está definido por SEQ ID NO: 27.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende, además, el o los polipéptidos definidos por SEQ ID NO: 29 y/o SEQ ID NO: 33.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho excipiente farmacéutico es L-metionina.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha composición farmacéutica comprende al menos un antígeno adicional deBorreliao un patógeno distinto deBorrelia.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde dicho al menos un antígeno adicional se deriva de un patógeno transmitido por vector, particularmente un patógeno transmitido por garrapatas.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho patógeno transmitido por garrapatas es el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV).

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho patógeno transmitido por vector se selecciona del grupo que comprendeBorrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii,Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetiiyBorrelia lonestari, virus de la fiebre por garrapatas de Colorado (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV), virus de la encefalitis japonesa (JEV) yBabesiaspp.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho patógeno transmitido por vector provoca fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, ehrlichiosis granulocítica humana (HGE), fiebre de Sennetsu, ehrlichiosis monocítica humana (HME), anaplasmosis, fiebre botonosa, rickettsiosis por Rickettsia parkeri, enfermedad exantemática asociada a garrapatas del sur (STARI), fiebre maculosa de Helvetica, rickettsiosis 364D, fiebre maculosa africana, fiebre recurrente, tularemia, fiebre por garrapatas de Colorado, fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre Q, fiebre hemorrágica de Omsk, enfermedad del bosque de Kyasanur, encefalitis de Powassan, enfermedad del virus Heartland o babesiosis.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha composición farmacéutica es una vacuna.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como medicamento, particularmente como vacuna.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección porBorrelia,en particular, una infección porB. burgdorferis.s.,B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdioB. sinica,preferiblemente una infecciónpor B. burgdorferis.s.,B. afzelii, B. bavariensisoB. garinii.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende, además, un adyuvante, preferiblemente hidróxido de aluminio.

14. Un kit que comprende la composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en donde el uno o más antígenos adicionales están comprendidos en una segunda composición.

15. El kit de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha segunda composición es una vacuna, preferiblemente una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa o una vacuna contra la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas.