ES2740985T3

ES2740985T3 - Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos

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Publication number: ES2740985T3
Application number: ES15703228T
Authority: ES
Inventors: Urban Lundberg; Wolfgang Schüler
Original assignee: Valneva Austria GmbH
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2035-01-09
Also published as: EP3564257A1; WO2015104396A1; CN105980398B; JP6505110B2; CY1121734T1; KR20160102993A; AU2015205520B2; TR201910117T4; PT3092246T; US10766931B2; HRP20191086T1; US20210054032A1; RS59075B1; BR112016015678B1; EP3092246A1; JP2017503792A; US20230322869A1; US20160333056A1; LT3092246T; ZA201602690B

Abstract

Un polipéptido que comprende un fragmento de OspA C-terminal híbrido (proteína A de la superficie externa de Borrelia), en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en i) una primera porción de OspA que consiste en los aminoácidos 125-176 o 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8 y ii) una segunda porción de OspA que consiste en - los aminoácidos 176-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) o - los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) o - los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) con una sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 con un residuo de prolina, en el que el segundo fragmento de OspA es mutante y está estabilizado por cistina en tanto que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente al menos en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 +/- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 +/- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 +/- 3 y la cisteína en la posición 269 + / -3 de dicho segundo fragmento de OspA; y en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y su uso en métodos para la prevención y tratamiento de la infección por Borrelia Particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento C-terminal híbrido de una proteína A de la superficie externa (OspA), un ácido nucleico que codifica la misma, una célula huésped que comprende el ácido nucleico, un método para producir el polipéptido y una composición farmacéutica (particularmente para su uso como medicamento en un método para tratar o prevenir una infección por Borrelia) que comprende el polipéptido y/o el ácido nucleico, así como un kit que comprende la composición farmacéutica y una segunda composición.

Antecedentes de la invención

La borreliosis de Lyme, o enfermedad de Lyme, es la enfermedad transmitida por garrapatas más común en Europa y América del Norte. La enfermedad es causada por la infección con la espiroqueta de tipo gram-negativo transmitida por artrópodos, Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.), y puede afectar a múltiples órganos o tejidos, dando como resultado trastornos cutáneos, cardíacos, musculoesqueléticos y neurológicos. En la mayoría de los países, la borreliosis de Lyme no es una enfermedad de notificación obligatoria y no hay disponibles datos exactos relacionados con las tasas anuales de incidentes. En Estados Unidos, el agente causal es B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) y la borreliosis de Lyme se localiza en estados del noreste, el Atlántico central y la región superior norcentral. En 2010, se notificaron en Estados Unidos un total de aproximadamente 30.000 casos de borreliosis de Lyme a los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC). En un informe actualizado por CDC en 2013, que tiene en cuenta los datos de diagnóstico de otras fuentes, estima que el número real de nuevos casos cada año en Estados Unidos es cercano a 300.000 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lymedisease.html). En Europa, B. afzelii y B. garinii son los principales agentes causales de la borreliosis de Lyme, así como B. burgdorferi s.s. y B. bavariensis, que contribuyen en menor grado, dependiendo de la ubicación geográfica. La prevalencia de la borreliosis de Lyme varía de manera considerable en distintos países europeos con un aumento generalizado de la prevalencia del oeste al este. En gran parte de Europa, la cantidad de casos informados de borreliosis de Lyme aumentó desde principios de los años 1990 (por ejemplo, República Checa, Estonia, Lituania; véase borreliosis de Lyme en Europa, informe de la OMS de 2006) y la distribución geográfica de los casos también se ha ampliado.

Borrelia pertenece a la familia Spirochaetaceae, la cual se subdivide en los géneros de importancia médica Treponema, Leptospira y Borrelia. B. burgdorferi s.l. es una bacteria con forma de espiral, vigorosamente mótil y gram-negativa, con una longitud de aproximadamente 10-20 pm y una anchura de 0,2-0,5 pm, que crece en condiciones microaerófilas. La pared celular espiroquetal consiste en una membrana citoplásmica rodeada por peptidoglucano y varios flagelos, y después por una membrana exterior asociada holgadamente.

La borreliosis de Lyme generalmente tiene lugar en fases caracterizadas por diferentes manifestaciones clínicas, con remisiones y exacerbaciones. La fase 1, infección temprana, consiste en una infección localizada de la piel, seguida en pocos días o semanas de la etapa 2, infección diseminada, y en meses a años después por la fase 3, infección persistente. No obstante, la infección es variable; algunos pacientes tienen únicamente infecciones cutáneas localizadas, mientras que otros presentan únicamente manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como artritis. Los diferentes síndromes clínicos de la borreliosis de Lyme también son causados mediante infección con diversas especies de B. burgdorferi s.l. B. burgdorferi s.s. causa más frecuentemente manifestaciones de las articulaciones (artritis) y problemas cardíacos, B. afzelii causa principalmente síntomas dérmicos (eritema migrans; EM y acrodermatitis crónica atrófica; ACA), mientras que B. garinii está implicado en la mayoría de los casos de neuroborreliosis.

Infección localizada - El síntoma más común de la fase 1 de una infección es eritema migrans, que ocurre en el 70 80 % de las personas infectadas. Esta lesión cutánea a menudo viene seguida de síntomas similares a la gripe, tales como mialgia, artralgia, dolor de cabeza y fiebre. Estos síntomas no específicos ocurren en el 50 % de los pacientes con eritema migrans.

Infección diseminada - Durante la fase 2, las bacterias se mueven hacia el torrente sanguíneo desde el sitio de la infección a órganos y tejidos distales. Los síntomas neurológicos, cardiovasculares y artríticos que se producen en esta etapa incluyen meningitis, neuropatía craneal y artritis inflamatoria intermitente.

Infección persistente - La fase 3 de la infección es crónica y se produce de meses a años después de la picadura de garrapata. El síntoma más común en Norteamérica es la artritis reumatoide, causada por una infección con B. burgdorferi s.s. La infección persistente del sistema nervioso central con B. garinii causa síntomas neurológicos más severos durante la fase 3 y una infección persistente de la piel con B. afzelii da como resultado acrodermatitis crónica atrófica.

En algunos grupos de riesgo, tales como granjeros, trabajadores forestales, senderistas, corredores, turistas, han aumentado las tasas de seroprevalencia y de incidencia de la enfermedad, así como en niños menores a 15 años y adultos entre 39 y 59 años, sin preferencia de género. Este aumento en la incidencia de la borreliosis de Lyme está vinculado a los cambios en los hábitats forestales, así como los factores sociales. Los cambios medioambientales, tal como la fragmentación de bosques, han llevado a una reducción brusca de depredadores roedores tales como zorros y aves de carroña, lo cual ha llevado a una disminución en la población de ratones, con un aumento posterior en la población de garrapatas. Más recientemente, la reforestación irregular ha aumentado la cantidad de venados y, por consiguiente, la cantidad de garrapatas. La expansión suburbana y el aumento del uso de superficies forestales para recreación tal como el camping y senderismo ha llevado a los seres humanos a tener mayor contacto con la mayor cantidad de vectores de Borrelia de garrapatas. Todos estos factores en conjunto han contribuido a una mayor distribución de Borrelia y una mayor incidencia de borreliosis de Lyme.

Los agentes antimicrobianos son el método principal de tratamiento de la infección por Borrelia. El antibiótico usado depende de la fase de la enfermedad, síntomas y las alergias del paciente a la medicación. La duración de la aplicación del antibiótico también depende de la fase de la enfermedad y la gravedad de los síntomas. La borreliosis de Lyme temprana típicamente se trata con tetraciclinas orales, tales como doxiciclina y penicilinas semisintéticas, tales como amoxicilina o penicilina V. Los trastornos artríticos y neurológicos se tratan con ceftriaxona o penicilina G intravenosa de dosis altas. Hasta el 30 % de los pacientes de borreliosis de Lyme no presentan los síntomas tempranos característicos o la infección con Borrelia, lo que hace que el diagnóstico y el tratamiento sean problemáticos. La aplicación del antibiótico puede ser prolongada (hasta varios meses) y a veces ineficaz y, por lo tanto, tema de debate en el campo de la Borrelia, especialmente durante las fases posteriores de la enfermedad. Incluso en el caso de tratamiento ineficaz de Borrelia, los pacientes pueden terminar con fatiga debilitante, dolor o síntomas neurológicos durante años, lo que se denomina síndrome postratamiento de la enfermedad de Lyme. En general, el uso de antibióticos puede tener consecuencias no deseadas, tales como el desarrollo de resistencia a los microorganismos diana. Finalmente, la terapia antibiótica puede curar la borreliosis de Lyme de manera eficaz, pero no proporciona protección contra infecciones posteriores.

Se aprobó y se comercializó una vacuna monovalente basada en OspA de serotipo 1 (LYMErix™) en Estados Unidos para la prevención de la enfermedad de Lyme causada por Borrelia burgdorferi s.s, pero la vacuna ya no está disponible. Además, la heterogeneidad en secuencias de OspA en diferentes serotipos en Europa y otros lugares descarta la protección eficaz con una vacuna basada en OspA de un único serotipo.

Pueden usarse moléculas quiméricas de OspA que comprenden la porción proximal de un serotipo de OspA, junto con la porción distal de otro serotipo de OspA, al mismo tiempo que conservan propiedades antigénicas de ambos polipéptidos precursores, en la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Lyme o borreliosis (documentos WO2011/143617, WO2011/143623). Además, se demostró que una vacuna que comprende fragmentos C-terminales estabilizados de una OspA de seis serotipos de Borrelia diferentes proporciona amplia protección contra la infección por Borrelia en ratones (Comstedt, P, et al., 2014, Design and Development of a Novel Vaccine for Protection against Lyme Borreliosis, PLoS ONE 9(11):e113294).

Actualmente, no hay un medicamento preventivo para la borreliosis de Lyme en el mercado y, por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un desarrollo de tal medicamento que pueda proporcionar una protección eficaz contra Borrelia y que esté presente en Estados Unidos, Europa y otros lugares, especialmente para el desarrollo de un medicamento que pueda proporcionar protección eficaz contra varios serotipos de Borrelia de manera simultánea. El heterodímero que contiene OspA de serotipo 3, Lip-S4D1-S3hybD1, de la presente invención mejora el heterodímero divulgado previamente (véase el documento WO2014/006226) con respecto a la facilidad de producción y estimulación de anticuerpos específicos como se mide mediante unión superficial del anticuerpo a espiroquetas de Borrelia de serotipo 3. Adicionalmente, cuanto mayor sea la calidad específica de la respuesta inmunitaria al nuevo heterodímero indica que la potencia también es superior en comparación con el heterodímero divulgado previamente.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento híbrido de la proteína A de la superficie externa (OspA) de Borrelia, un ácido nucleico que codifica la misma, un vector o célula huésped que comprende dicha molécula de ácido nucleico. Además, la invención proporciona un proceso para producir dicho polipéptido y un proceso para producir una célula que expresa dicho polipéptido. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido o molécula de ácido nucleico y dicho polipéptido o molécula de ácido nucleico para su uso como una vacuna o en un método para el tratamiento o la prevención de una infección por Borrelia. En particular, la invención se refiere a un polipéptido mejorado para la inmunización contra a Borrelia de serotipo 3, en tanto que el polipéptido es más favorable para su purificación e induce una respuesta inmunitaria más específica a Borrelia como se evalúa mediante unión superficial a Borrelia en comparación con la construcción que contiene OspA de serotipo 3 divulgada en la solicitud WO2014/006226 previa. Los esfuerzos para desarrollar una vacuna de subunidad para la prevención de la borreliosis de Lyme se han enfocado en gran parte en el uso de la proteína A de la superficie externa (OspA) borrelial como antígeno. La proteína OspA se expresa por Borrelia únicamente cuando está en los intestinos de la garrapata vector. Por lo tanto, los anticuerpos de OspA producidos mediante vacunación no combaten la infección en el cuerpo, sino que ingresan al intestino de la garrapata cuando consume la sangre. Allí, los anticuerpos neutralizan las espiroquetas y bloquean la migración de bacterias del intestino medio a las glándulas salivales de la garrapata, la ruta a través de la cual Borrelia se introduce en el huésped vertebrado. Por lo tanto, los anticuerpos específicos de OspA impiden la transmisión de Borrelia de la garrapata vector al huésped humano.

La forma lipidada de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa ZS7, junto con hidróxido de aluminio, se desarrolló comercialmente como una vacuna contra Bórrela (LYMErix™) por SmithKline Beecham, ahora GlaxoSmithKline (GSK) para el mercado de Estados Unidos. Fueron necesarias tres dosis de LYMErix™ durante un período de un año para ofrecer una protección óptima. Después de las primeras dos dosis, la eficacia de la vacuna contra la borreliosis de Lyme fue del 49 %, y tras la tercera dosis fue del 76 %. Sin embargo, poco tiempo después de que LYMErix™ estuvo disponible en el mercado, se retiró de éste en 2002. Las razones citadas fueron asuntos de administración práctica de la vacuna, por ejemplo, la necesidad de inyecciones de refuerzo cada año o cada dos años, así como el coste relativamente alto de este enfoque preventivo en comparación con el tratamiento antibiótico de la infección temprana. Además, preocupaba que LYMErix™ pudiera desencadenar reacciones autoinmuntarias en un subgrupo de población debido a la homología de secuencia con la proteína humana, aunque esto nunca se probó. Además, esta vacuna no proporcionó protección cruzada contra otras especies clínicamente importantes de Borrelia.

Por consiguiente, en una realización, fue un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna mejorada, por ejemplo, para la prevención de la borreliosis de Lyme. Preferiblemente, la vacuna se produce fácilmente mientras que brinda protección, es segura y más eficaz que las terapias existentes y/o proporciona protección contra más de una especie de Bórrela. Adicionalmente se conoce bien en la técnica que pacientes diferentes responden de forma diferente a diferentes composiciones de vacuna. Por tanto, en cualquier caso, sería una clara ventaja tener vacunas alternativas disponibles como opciones adicionales para las vacunas contra Bórrela.

El problema que subyace a la presente invención se resuelve mediante un polipéptido que comprende un fragmento de OspA C-terminal híbrido, en el que el fragmento híbrido consiste en un dominio C-terminal de una proteína OspA de Bórrela que comprende un fragmento derivado de una proteína OspA de una cepa de Bórrela diferente de B. garinii, cepa PBr, y un segundo fragmento de OspA de B. garinii, cepa PBr, y difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente al menos en la introducción de al menos un enlace disulfuro. Específicamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento de OspA C-terminal híbrido como se describe anteriormente, en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en i) una primera porción de OspA que consiste en los aminoácidos 125-176 o los aminoácidos 126-175 de OspA de una cepa de Bórrela que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8, y ii) una segunda porción de OspA que consiste en a) los aminoácidos 176-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) o b) los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID No : 8) o c) los aminoácidos 177- 274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) con una sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 con un residuo de prolina, en el que el segundo fragmento de OspA de a), b) o c) es mutante y está estabilizado por cistina en tanto que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente en al menos la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 /- 3 y la cisteína en la posición 269 /- 3 de dicho segundo fragmento de OspA; y en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdórferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

De manera sorprendente, la introducción de dicho fragmento de OspA C-terminal híbrido que comprende una secuencia de B. valaisiana, cepa VS116, fusionada con una secuencia de OspA de serotipo 3 (B. garinii, cepa PBr), con un enlace disulfuro introducido, dio como resultado una proteína heterodímera (Lip-S4D1-S3hybD1) que fue más fácil de purificar y estimuló una respuesta inmunitaria más específica a OspA de serotipo 3 que el heterodímero LipS4D1-S3D1 de la invención previa (documento WO2014/006226). Como se muestra en los ejemplos, el fragmento C-terminal de OspA híbrido de serotipo 3 de la presente invención tiene un isocontorno de potencial electrostático predicho que es más similar a otros fragmentos de OspA de otros serotipos que el fragmento de OspA de serotipo 3. Además, fue más fácil de purificar el heterodímero que contiene el fragmento C-terminal de OspA híbrido de serotipo 3 (Lip-S4D1-S3hybD1), que requirió menos etapas para obtener un rendimiento mucho más alto que el heterodímero Lip-S4D1-S3D1 de la invención previa. Además, aunque los títulos de anticuerpos observados fueron similares, los anticuerpos estimulados por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada se unieron más específicamente a Bórrela que expresaba OspA de serotipo 3 en comparación con la vacuna de combinación de heterodímeros de la invención previa. Finalmente, la capacidad protectora in vivó de la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada fue alta frente a los cuatro serotipos de Bórrela sometidos a prueba.

Descripción detallada de la invención

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento C-terminal híbrido de una proteína A de la superficie externa (OspA), en el que dicho fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste en una fusión del dominio C-terminal de dos OspA diferentes de cepas de Bórrela y difiere del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos en la introducción de al menos un enlace disulfuro, por ejemplo, una cistina. En particular, el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste en una fusión de aminoácidos de las proteínas OspA de una cepa diferente a B. garinii, cepa PBr, por ejemplo, B. valaisiana, cepa VS116, o B. spielmanii; con aminoácidos de la proteína OspA de B. garinii, cepa PBr, con la introducción de al menos un enlace disulfuro (cistina). Específicamente, el polipéptido de la invención comprende un fragmento de OspA (proteína A de la superficie externa de Borrelia) C-terminal híbrido, en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en i) una primera porción de OspA que consiste en los aminoácidos 125-176 o los aminoácidos 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8, y ii) una segunda porción de OspA que consiste en los aminoácidos 177-274 o los aminoácidos 176-274, (pero lo más preferiblemente los aminoácidos 177-274, opcionalmente con una sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 con un residuo de prolina), de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8), en el que la segunda porción de OspA es mutante y está estabilizada por cistina en tanto que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente en al menos la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 /- 3 en la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 /- 3 y la cisteína en la posición 269 /- 3 de dicho segundo fragmento de OspA; y en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). Se aprecia que:

La posición 182 /- 3 es una abreviatura para la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184 o 185, preferiblemente 182.

La posición 269 /- 3 es una abreviatura para la posición 266, 267, 268, 269, 270, 271 o 272, preferiblemente 269.

Preferiblemente, el polipéptido comprende un fragmento de OspA C-terminal híbrido, en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en

i) un primer fragmento de OspA (también denominado una primera porción de OspA) que consiste en los aminoácidos 125-176 o los aminoácidos 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8 y

ii) un segundo fragmento de OspA (también denominado una segunda porción de OspA) que consiste en los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8), en el que el segundo fragmento de OspA difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 /- 3 y la cisteína en la posición 269 /- 3 de dicho segundo fragmento de OspA; y

en el que la numeración de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

Se ha descubierto que se puede producir fácil y eficazmente un polipéptido de acuerdo con la invención (véase el ejemplo 2). Su producción dio como resultado un rendimiento incrementado en comparación con los productos conocidos (véase el ejemplo 2). La inmunización con un polipéptido de acuerdo con la invención produjo niveles más altos de anticuerpos específicos para la proteína OspA en su forma natural y, por tanto, es una vacuna mejorada (véase el ejemplo 3). Además, proporcionó protección frente a la exposición a Borrelia in vivo (véase el ejemplo 4). Borrelia es un género de bacterias del filo espiroqueta. Provoca borreliosis, una enfermedad zoonótica transmitida por vectores transmitida principalmente por garrapatas, y algunas por piojos, dependiendo de la especie. En la actualidad existen 36 especies conocidas de borrelia. De las 36 especies conocidas de Borrelia, se sabe que 13 de estas especies provocan la enfermedad de Lyme o borreliosis y se transmiten por garrapatas. Las principales especies de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme son Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii y Borrelia garinii. El término B. burgdorferi s.l. incluye al menos 13 especies de Borrelia (Tabla A-1). Estas especies se encuentran en diferentes regiones geográficas y viven en la naturaleza en ciclos enzoóticos que implican garrapatas del complejo Ixodes ricinus (también llamado complejo Ixodes persulcatus) y una amplia gama de huéspedes animales. Cuatro especies de Borrelia son responsables de la mayoría de las infecciones en seres humanos: B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. Otras tres especies, B. lusitaniae, B. bissettii y B. spielmanii, se han detectado ocasionalmente en seres humanos, pero su papel en la borreliosis de Lyme es incierto en la actualidad. Aún se identifican nuevas especies de Borrelia.

Tabla A-1.

Según se detalló anteriormente, la proteína A de la superficie externa (OspA) de Borrelia es una lipoproteína inmunogénica abundante de Borrelia de interés particular dado su potencial como vacuna candidata. La OspA de B. burgdorferi s.l. es una lipoproteína básica que tiene una masa molecular de aproximadamente 30 kDa y está codificada en un plásmido lineal. Un aspecto importante de la proteína OspA es su lipidación N-terminal; es decir, los ácidos grasos con una longitud de cadena de entre C14 y C19 con o sin dobles enlaces se unen al residuo de cisteína N-terminal, una característica que potencia la inmunogenicidad de la proteína OspA. Se ha demostrado que los péptidos sintéticos poco inmunogénicos inducen respuestas mayores de anticuerpos al lipidarse; por ejemplo, al acoplarse covalentemente a Pair^Cys (Bessler y Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), una sustitución de ácidos grasos encontrada en el extremo amino de muchas lipoproteínas bacterianas que se sintetizan con una secuencia señal que especifica la unión lipídica. Adicionalmente, se mostró que el resto PamaCys potenciaba respuestas inmunitarias a OspA en ratones, parcialmente a través de su interacción con TLR-2/1 (Yoder, et al. (2003) Infection and Immunity 71:3894-3900). Por lo tanto, se esperaría que la lipidación de un fragmento C-terminal de OspA potenciara la inmunogenicidad y capacidad protectora del fragmento.

El análisis de aislados de B. burgdorferi s.l. obtenidos en Norteamérica y Europa ha revelado que OspA tiene una variabilidad antigénica y que pueden definirse varios grupos distintos basándose en la serología. Se han observado mAb anti-OspA que se unen a determinantes antigénicos específicos N y C-terminales. Se ha usado cristalografía de rayos X y análisis por RMN para identificar dominios hipervariables con relevancia inmunológica en OspA y se ha mapeado el epítopo LA-2 con respecto a los aminoácidos C-terminales 203-257 (Ding et al., Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). Estudios anteriores han demostrado que la producción de anticuerpos contra el epítopo C-terminal LA-2 se correlaciona con la inmunidad protectora después de la vacunación con OspA (Van Hoecke et al. Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 y Steere et al., N Engl J Med (1998) 339:209-215). Se mostró que los anticuerpos contra LA-2 bloquean la transmisión de Borrelia de la garrapata al huésped (Golde et al., Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Estos estudios sugirieron que la porción C-terminal de la proteína OspA puede ser suficiente para inducir la inmunidad protectora. Debería apreciarse que la secuencia de la porción C-terminal de OspA está menos conservada entre serotipos de Borrelia que la porción N-terminal (véase la Figura 1).

Basándose en información de los estudios descritos anteriormente, junto con otros, se usaron en la invención previa formas truncadas de OspA que comprendían la porción C-terminal (también denominada en el presente documento "fragmento de OspA" o "monómero) (documento WO2014/006226). Las formas truncadas de OspA probaron ser menos protectoras que le proteína OspA de longitud completa. De manera sorprendente, sin embargo, se encontró en el transcurso de la invención previa que la introducción de un enlace disulfuro en la forma truncada (también denominada en el presente documento "fragmento mutante de OspA", "fragmento de OspA estabilizado por cistina" o "fragmento mutante" o "fragmento estabilizado por cistina") supera esta desventaja. Sin desear quedar limitado a un mecanismo específico, se considera que la mejora de la protección se debe a un aumento en la estabilidad del fragmento de OspA, como se muestra en ensayos que miden la estabilidad térmica.

El fragmento de OspA mutante (también denominado en el presente documento como segundo fragmento de OspA) se puede derivar de cualquier especie de Borrelia; sin embargo, debido a su prevalencia en el campo médico, particularmente para los seres humanos, son preferibles B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. De acuerdo con la presente invención, la primera porción de OspA es de cualquier cepa de Borrelia excepto B. garinii, cepa PBr, y la segunda porción es de B. garinii, cepa PBr. Por lo tanto, el fragmento de OspA híbrido se deriva de una fusión de aminoácidos de la OspA de B. garinii, cepa PBr, con aminoácidos de la OspA de cualquier especie de Borrelia excepto B. garinii, cepa PBr (y, por lo tanto, una secuencia de aminoácidos diferente de la que los aminoácidos de la OspA de B. garinii, cepa PBr), particularmente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, y B. bavariensis, especialmente B. valaisiana, cepa VS116. La primera porción de OspA consiste en los aminoácidos 125-176 o los aminoácidos 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8, y la segunda porción de OspA consiste en los aminoácidos 176-274 o lo más preferiblemente los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8), en la que la segunda porción de OspA es mutante y está estabilizada por cistina en tanto que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente al menos en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho segundo fragmento de OspA; y en la que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). Sin embargo, pueden estar presentes mutaciones adicionales con respecto a las porciones de tipo salvaje en la primera y segunda porciones de acuerdo con la invención (véase también a continuación). En una realización preferida, las sustituciones anteriores con cisteína en las posiciones 182 y 269 son las únicas mutaciones con respecto al tipo salvaje. Como alternativa, los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, difieren de los mismos en la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de OspA de tipo salvaje de Borrelia garinii, cepa PBr, con solo un residuo de prolina.

Los ejemplos preferidos de polipéptidos comprenden

- un fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste en los aminoácidos 125-176 de B. valaisiana, cepa VS116, y los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 1) o - un fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste en los aminoácidos 126-175 de B. spielmanii y los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 51).

Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Como alternativa, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.

En una realización de la presente invención, la segunda porción de OspA es idéntica a los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, pero difiere de los mismos en la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de OspA de tipo salvaje de Borrelia garinii, cepa PBr, con un residuo de prolina (SEQ ID NO: 7).

Las cuatro especies de Borrelia B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii se pueden clasificar adicionalmente de acuerdo con sus serotipos de OspA, que se han determinados mediante análisis con anticuerpos monoclonales específicos para la proteína OspA respectiva. Los serotipos 1-7, que representan la mayoría de las infecciones por Borrelia en seres humanos, junto con sus tasas de prevalencia, se muestran en la tabla A-2 a continuación.

Tabla A-2. Designación de serotipo y prevalencia de B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. Se serotipó Borrelia aislada de líquido cefalorraquídeo o piel de ser humano o de garrapatas vectores sondando lisados de células enteras con anticuerpos monoclonales de ratón, cada uno específico de un epítopo particular de OspA (como se describe por Wilske et al., J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350, y se presenta por Baxter Bioscience en "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases", Bruselas, 06 de febrero de 2009).

La estructura de la proteína OspA de la cepa de B. burgdorferi s.s. B31 se determinó por Li et al. (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). Se compone por láminas p N-terminales (cadenas a 1 a 4) y centrales (cadenas a 5 a 14n [parte N-terminal]), lámina barril 1 (cadenas a 14c [parte C-terminal] a 16), lámina barril 2 (cadenas a 17 a 21) y una hélice a C-terminal. El término “fragmento de OspA C-terminal” o "dominio C-terminal de OspA" o "dominio C-terminal" o "fragmento de tipo salvaje" o "porción C-terminal" con respecto a OspA como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva significará la secuencia de aminoácidos C-terminal de OspA, es decir, OspA que carece al menos de la lámina p N-terminal (incluyendo las cepas p 1 a 4). En OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s., la lámina N-terminal consiste en los aminoácidos 17 a 70 (tras la escisión postraduccional del péptido señal de lipidación de 16 aminoácidos de longitud).

El fragmento C-terminal de OspA de la presente invención también incluye una secuencia señal de lipidación en el extremo N, por ejemplo, secuencia señal de lipidación de los aminoácidos 1 a 16 de OspA (SEQ ID NO: 13) u OspB (SEQ ID NO: 14) de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s., una secuencia señal de lipidación de E. coli, denominada en el presente documento "señal de lipidación lpp" (SEQ ID NO: 15), o cualquier otra secuencia señal, por ejemplo, como se define a continuación.

La lipidación de una proteína con una secuencia señal de lipidación N-terminal, tal como las presentes en un polipéptido OspA naciente, se produce en el vector de expresión de E. coli mediante la acción por etapas de la diacilgliceril transferasa de las enzimas, peptidasa señal II y transacilasa, respectivamente. La primera etapa es la transferencia de un diacilglicérido al grupo sulfhidrilo de cisteína de la polipoproteína no modificada seguida de la escisión del péptido señal por la peptidasa señal II y, finalmente, la acilación del grupo a-amino de la cisteína N-terminal de la apolipoproteína. El resultado es la colocación de un lípido y un grupo glicerol con dos lípidos adicionales unidos en el residuo de cisteína N-terminal del polipéptido. La secuencia señal de lipidación, que se elimina por escisión durante la lipidación, no está presente en la secuencia polipeptídica final.

Los polipéptidos son moléculas biológicas de cadenas de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (amida). Los enlaces químicos covalentes se forman cuando el grupo carboxilo de un aminoácido reacciona con el grupo amino de otro. Los polipéptidos de la presente invención son cadenas de aminoácidos continuas y no ramificadas. El polipéptido de la presente invención comprende un enlace de cistina. De acuerdo con la presente invención, el fragmento de OspA mutante puede ser una proteína lipidada, también lipoproteína, en la que los restos lipídicos, junto con el grupo glicerol, también se denominan "Lip". De acuerdo con la presente invención, el fragmento mutante de OspA puede ser una proteína lipidada, también lipoproteína, en donde los restos lipídicos, junto con el grupo glicerol, también se denominan "Lip". De acuerdo con la invención, Lip comprende de uno a tres lípidos, tales como alquilo C14-20 y/o alquenilo C14-20 unidos a un glicerol y un grupo amino de la cisteína N-terminal del polipéptido de la invención o, preferiblemente, en donde Lip es un resto de la fórmula (I) a continuación,

Fórmula (I),

en la que uno de Ri , R2 o R3 es alquilo o alquenilo C14-C20, y cada uno de los otros, independientemente, es alquilo C14-C20 o alquenilo C14-C20, y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína que se muestra en la Fórmula (I). Más preferiblemente, Lip más la cisteína N-terminal del polipéptido es N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi)propil cisteína (denominada en el presente documento "Pam3Cys") y está conectada mediante el carbonilo C de la cisteína de dicha secuencia de aminoácidos de la invención. En la Fórmula (I) anterior, R1 , R2 y R3 serán restos de palmitoílo y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína.

De acuerdo con la presente invención el dominio C-terminal de una OspA puede carecer de al menos el dominio N-terminal homólogo a los aminoácidos 17 a 70 de OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. Adicionalmente, el dominio C-terminal de OspA, de acuerdo con la presente invención, puede también carecer de porciones adicionales de la lámina central, como se define por Li y sus colaboradores (Li et al., anteriormente), particularmente cepas adicionales, tales como las porciones de aminoácidos de los aminoácidos 17 a 82, 93, 105, 118 o 119, preferiblemente 17 a 129, más preferiblemente 1 a 124, 1 a 125, 1 a 129 o 1 a 130 de cualquier Borrelia, particularmente una cepa B31 de B. burgdorferi s.s., o porciones homologas de una proteína OspA de una Borrelia sp. distinta de la cepa de B31 de B. burgdorferi s.s.

En el contexto de la presente invención, el domino C-terminal de OspA también se denomina "fragmento OspA" o "fragmento de OspA".

El “fragmento de OspA C-terminal” o "fragmento mutante" u “OspA mutante”, en el contexto del polipéptido de la presente invención y como se utiliza a lo largo de la presente memoria descriptiva, significará el fragmento C-terminal de OspA, según se definió anteriormente y en el presente documento, el cual difiere del fragmento de tipo salvaje en al menos dos cisteínas introducidas que pueden formar un enlace disulfuro, es decir, una cistina. Sin limitarse a esa teoría, se asume que el enlace disulfuro estabiliza el fragmento en una conformación propicia para la inducción de la unión a anticuerpos. El pliegue del fragmento C-terminal de tipo salvaje de OspA muestra una estabilidad reducida de la temperatura en comparación con la proteína de longitud completa (Koide et al., Structurebased Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). Para la presente invención, la secuencia del dominio C-terminal de la OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. se ha analizado in silico para determinar posiciones de puentes disulfuro introducidos que puedan potenciar la estabilidad del pliegue de este dominio C-terminal. Los resultados del análisis se han transferido a fragmentos homólogos de OspA de otras especies de Borrelia bajo la premisa de que el pliegue se conserva a través de las especies.

El "fragmento de OspA C-terminal híbrido" o "fragmento híbrido" o "fragmento de OspA híbrido" en el contexto del polipéptido de la presente invención y como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva significará el fragmento C-terminal de OspA, como se define anteriormente y en el presente documento, que difiere del fragmento de tipo salvaje en que

a) el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste en una fusión de aminoácidos de una primera proteína OspA de una cepa diferente a B. garinii, cepa PBr, por ejemplo, B. valaisiana, cepa VS116, o B. spielmanii (denominada primera porción de OspA); con aminoácidos de una segunda proteína OspA de B. garinii, cepa PBr, con la introducción de al menos un enlace disulfuro (cistina) (denominada segunda porción de OspA) y opcionalmente una o más mutaciones adicionales; y

b) las al menos dos cisteínas introducidas en el fragmento de OspA C-terminal híbrido forman un enlace disulfuro, es decir, una cistina, y en el que dichas cisteínas introducidas se introducen como se describe en el presente documento y de acuerdo con las enseñanzas del documento WO2014/006226; y

en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido da como resultado un fragmento plegado naturalmente como se mide, por ejemplo, mediante la eficacia de la unión de anticuerpos que resultan de la vacunación mediante este fragmento de OspA C-terminal híbrido en, por ejemplo, ratones con respecto al antígeno de serotipo 3 de Borrelia, por ejemplo, sometiendo la unión de dichos anticuerpos (obtenidos después de tres inmunizaciones) a la superficie de Borrelia de serotipo 3 mediante citometría de flujo, por ejemplo, como se describe en los ejemplos.

Típicamente, el enlace disulfuro se puede introducir mediante la introducción de uno o más, preferiblemente dos, residuos de cisteína, en la que se forma un enlace disulfuro (puente S-S) entre los grupos tiol de dos residuos de cisteína que forman el aminoácido cistina. Solo se necesita introducir un residuo de cisteína si se forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína presente en el fragmento de OspA de tipo salvaje. Las dos cisteínas se introducen mediante sustitución de aminoácidos. Las sustituciones son a) en la posición 182 del aminoácido de la secuencia de aminoácidos de OspA de tipo salvaje pertinente con una cisteína y b) en la posición 269 del aminoácido de la secuencia de aminoácidos de OspA de tipo salvaje pertinente con una cisteína y en las que está presente el enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho fragmento de OspA, formando así una cistina. La numeración de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

El fragmento de OspA mutante o híbrido puede también comprender mutaciones adicionales relativas al tipo salvaje. Según se ha detallado anteriormente, la estructura y el dominio superficial de OspA se conocen en la técnica. Por consiguiente, el fragmento mutante puede comprender mutaciones adicionales, particularmente en sitios que no se encuentran en la superficie de la proteína y/o no están involucrados en la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, no afectan a la capacidad antigénica. Estos pueden incluir una o más eliminaciones de aminoácidos, particularmente eliminaciones pequeñas (por ejemplo, hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos), una o más adiciones de aminoácidos (particularmente en el extremo N o C), una o más sustituciones de aminoácidos, particularmente una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Preferiblemente, el número de mutaciones adicionales en la primera y segunda porción con respecto al tipo salvaje respectivo es como máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, más preferiblemente 3 o 2, especialmente 1. Más preferiblemente, la(s) mutación/mutaciones adicional(es) solo está(n) en la segunda porción de OspA. Las mutaciones preferidas son sustituciones, especialmente sustituciones conservadoras. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, las enumeradas a continuación:

Ala Ser Leu lie; Val

Arg Lys Lys Arg; Gln; Asn

Asn Gln; His Met Leu; lie

Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr

Cys Ser Ser Thr

Gln Asn Thr Ser

Glu Asp Trp Tyr

His Asn: Gln Tyr Trp; Phe

lie Leu. Val Val lie; Leu

Las mutaciones preferidas incluyen cambios en porciones seleccionadas del fragmento, por ejemplo, en las que se modifica la secuencia con similitud de secuencia con respecto antígeno humano asociado a la función leucocitaria (hLFA-1), que existe en B. burgdorferi s.s., por ejemplo, se reemplaza por una secuencia homologa de una proteína OspA de otra Borrelia sp. La lógica de esta modificación es disminuir el riesgo de la inducción de reacciones inmunológicas cruzadas con proteínas humanas. Otra mutación preferida es la sustitución de una prolina con la treonina en la posición 233 en la secuencia del polipéptido OspA de B. garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8). También es posible la adición de una secuencia señal para la lipidación en el fragmento final, o un fragmento intermedio, o la adición de una proteína marcadora (por ejemplo, para identificación o purificación).

En algunas realizaciones, el fragmento mutante o híbrido de OspA se define como en las reivindicaciones y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 60 %, preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, incluso más preferiblemente al menos un 95 % de identidad de secuencia con el fragmento de tipo salvaje. En otra realización, la secuencia difiere en un máximo del 10 %, un máximo del 9 %, un máximo del 8 %, un máximo del 7 %, un máximo del 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, mucho más preferiblemente un máximo del 1 % debido a una adición, eliminación o sustitución de secuencia.

La identidad, como se conoce en la técnica y como se usa en el presente documento, es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos, según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad también implica el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, determinada por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente. Aunque existe una cantidad de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos, el término se conoce bien por los expertos en la técnica (por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J. et al., 1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. et al., 1990).

En oposición al fragmento mutante o híbrido de OspA, el "fragmento de tipo salvaje" o "fragmento de OspA de tipo salvaje" en el contexto de la presente invención se refiere a un fragmento de una OspA de origen natural de Borrelia. El fragmento de tipo salvaje se obtiene mediante eliminaciones N-terminal, pero no comprende eliminaciones internas (salvo de secuencias señal, como se detalla en el presente documento) o mutaciones. Con relación al fragmento híbrido o mutante de OspA, el fragmento de tipo salvaje consiste en una parte idéntica de la OspA (longitud idéntica y misma cepa de OspA, etc.) y difiere únicamente en la alteración o alteraciones detalladas anteriormente.

Los polipéptidos de la invención

Un polipéptido es un polímero lineal único de aminoácidos unido mediante enlaces peptídicos, en algunos casos también por enlaces disulfuro. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido también puede comprometer una o más modificaciones postraduccionales; es decir, un grupo funcional bioquímico adjunto, tal como un acetato, fosfato, lípido o carbohidrato adjunto, preferiblemente un lípido o lípidos adjuntos a la cisteína N-terminal, junto con un glicerol, más preferiblemente 1 a 3 restos alquilo o alquenilo C14-C20, incluso más preferiblemente 1 a 3 grupos palmitoílo, mucho más preferiblemente tres grupos palmitoílo (Pam3).

El polipéptido de la presente invención es como se define en las reivindicaciones y comprende o consiste en un fragmento de OspA C-terminal híbrido, en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en

i) una primera porción de OspA que consiste en los aminoácidos de una primera parte C-terminal de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8, y comienza en una posición alrededor de 125 o 126 y termina en la posición 175 o 176; y

ii) una segunda porción de OspA que consiste en una segunda parte C-terminal de OspA que sigue continuamente a la primera parte C-terminal (por ejemplo, si la primera parte C-terminal termina en la posición 175, la segunda parte C-terminal continúa en la posición 176; o si la primera parte C-terminal termina en la posición 176, la segunda parte C-terminal continúa en las posiciones 177 y así sucesivamente, sin embargo, también puede ser que se puedan eliminar uno o dos o más hasta 10 aminoácidos en el área de fusión de las 2 partes C-terminales, por ejemplo y lo más preferiblemente si la primera parte C-terminal termina en la posición 175, la segunda parte C-terminal continúa en la posición 177), en el que el segundo fragmento de OspA difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 /- 3 y la cisteína en la posición 269 /- 3 de dicho segundo fragmento de OspA formando una cisteína (también denominado "fragmento de OspA estabilizado por cistina"); y

en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido comprende o consiste en el fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste en los aminoácidos 125-176 de B. valaisiana, cepa VS116, y los aminoácidos 177 274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 1).

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido comprende o consiste en el fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste en los aminoácidos 126-175 de B. spielmanii y los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 51).

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido es como se define en el presente documento, y en el que la segunda porción de OspA es idéntica a los aminoácidos 177-274 estabilizados por cistina de Borrelia garinii, cepa PBr, pero difiere de los mismos solo en la sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 de OspA de tipo salvaje de Borrelia garinii, cepa PBr, con un residuo de prolina.

Los polipéptidos como se define anteriormente y adicionalmente como se define en el presente documento proporcionan títulos de anticuerpos en animales inmunizados, en los que dichos anticuerpos muestran una unión mejorada a sus respectivos antígenos en situ en comparación con los polipéptidos de la técnica anterior pertinente (por ejemplo, como se define en el documento WO2014/006226). Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento de OspA C-terminal híbrido de la invención efectúa al menos un incremento de 1,5 veces, preferiblemente al menos un incremento de 2 veces, más preferiblemente al menos un incremento de 3 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 4 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 5 veces, lo más preferiblemente al menos un incremento de 10 veces en la intensidad de fluorescencia, medida mediante citometría de flujo y producida por anticuerpos obtenidos después de tres inmunizaciones con el polipéptido en ratones al unirse a la superficie de Borrelia de serotipo 3, en comparación con la intensidad de fluorescencia producida por anticuerpos obtenidos frente a polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia que difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente en al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1 como se define por la SEQ ID NO: 31, particularmente en el que se puede determinar el incremento como se describe en el ejemplo 3.

Además, en una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la invención como se define por las reivindicaciones se puede producir en rendimientos más altos con procedimientos estándar y requiere menos etapas de purificación en comparación con los polipéptidos de la técnica anterior pertinente (por ejemplo, como se define en el documento WO2014/006226). Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento de OspA C-terminal híbrido de la invención muestra al menos un incremento de 1,5 veces, preferiblemente al menos un incremento de 2 veces, más preferiblemente al menos un incremento de 3 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 4 veces, incluso más preferiblemente al menos un incremento de 5 veces, lo más preferiblemente al menos un incremento de 10 veces en el rendimiento de producción, medido en miligramos por gramo de biomasa, en comparación con un polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia que difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente en al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1 como se define por la SEQ ID NO: 31, particularmente en el que se puede determinar el incremento como se describe en el ejemplo 2.

Preferiblemente, un polipéptido que comprende el fragmento de OspA C-terminal híbrido de la invención requiere menos etapas de purificación que un polipéptido que comprende un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia que difiere de la secuencia de OspA de tipo silvestre correspondiente en al menos la adición de al menos un enlace de cisteína, más preferiblemente la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1 como se define por la SEQ ID NO: 31; más específicamente, requiere al menos una etapa de cromatografía menos.

El polipéptido puede comprender a) un fragmento de OspA C-terminal híbrido como se define en las reivindicaciones y b) un fragmento de OspA mutante adicional como se define en las reivindicaciones.

El polipéptido de la invención puede comprender a) un fragmento de OspA C-terminal híbrido como se define por las reivindicaciones, y b) un segundo fragmento de OspA, en el que dicho fragmento de OspA es C-terminal en tanto que consiste en un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia y es mutante y está estabilizado por cistina en tanto que difiere de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente al menos en la sustitución del aminoácido en la posición 182 de la secuencia de tipo salvaje en una cisteína y en la sustitución del aminoácido en la posición 269 de la secuencia de tipo salvaje en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 y la cisteína en la posición 269 de dicho fragmento de OspA; y, además, en el que dicho fragmento de OspA mutante comienza en la posición 123, 124 o 125 y termina en la posición 273 o 274; y, además, en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). En una realización de la presente invención, el segundo fragmento de OspA puede ser cualquiera de los fragmentos C-terminales mutantes de OspA como se define anteriormente, por ejemplo, en el contexto de la invención previa (documento WO2014/006226).

De acuerdo con la presente invención, dicho fragmento de OspA mutante y fragmento híbrido de la presente invención no (i) la lámina N-terminal según se ha definido anteriormente y (ii) opcionalmente una o más cadenas adicionales de la lámina central según se ha definido anteriormente. Sin embargo, el polipéptido puede comprender una o más secuencias funcionales tales como una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal de lipidación o una modificación postraduccional, tal como una lipidación.

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la presente invención consiste en (i) uno o más fragmentos mutantes de OspA, en el que al menos un es un fragmento de OspA C-terminal híbrido de acuerdo con la presente invención, opcionalmente unidos por enlazadores, por ejemplo, como se define a continuación, o uno o más fragmentos de OspA mutantes y un fragmento C-terminal de OspA híbrido de serotipo 3 y (ii) opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos a OspA, particularmente una secuencia señal, y (iii) opcionalmente una modificación postraduccional, tal como una lipidación.

Por lo tanto, en una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la invención como se define por las reivindicaciones puede comprender adicionalmente:

i) un polipéptido que está lipidado o en el que el polipéptido comprende una señal de lipidación, preferiblemente la señal de lipidación de lpp derivada de E. coli MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15); y/o

ii) un polipéptido que comprende un péptido del sitio para la lipidación liderado por un residuo de cisteína N-terminal como un sitio para la lipidación, preferiblemente CSS; y/o

iii) un polipéptido que comprende un enlazador entre el fragmento de OspA C-terminal híbrido y el segundo fragmento de OspA estabilizado por cistina, particularmente en el que dicho enlazador comprende, por ejemplo, GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16).

En una realización de la presente invención, el segundo fragmento C-terminal de OspA es un fragmento C-terminal híbrido de OspA de acuerdo con la presente invención.

En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido comprende o consiste en el heterodímero de Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27). Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 (heterodímero de LipS4D1-S3hybD1).

El polipéptido de la presente invención tiene capacidad protectora. Como se ha detallado anteriormente, la introducción de un enlace disulfuro en el fragmento de OspA híbrido e híbrido/ mutante, aunque también la naturaleza híbrida del fragmento de OspA de la invención, aumenta la capacidad protectora del polipéptido con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro y ni la naturaleza híbrida del fragmento de OspA. En algunas realizaciones, la capacidad protectora aumenta en al menos el 10 %, más preferiblemente en al menos el 20 %, más preferiblemente en al menos el 30 %, más preferiblemente en al menos el 40 %, más preferiblemente en al menos el 50 %, más preferiblemente en al menos el 60 %, más preferiblemente en al menos el 70 %, más preferiblemente en al menos el 80 %, incluso más preferiblemente en al menos el 90 % con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro ni la naturaleza híbrida del fragmento de OspA.

El término capacidad protectora describe la capacidad de proteger un sujeto contra una infección por Borrelia. Con respecto al polipéptido de la invención, la capacidad protectora se refiere a la capacidad del polipéptido de inducir una respuesta inmunitaria que protege a un sujeto contra una infección por Borrelia. La capacidad protectora puede ensayarse administrando a un sujeto el polipéptido de manera que se induzca una reacción inmunitaria contra el polipéptido. Posteriormente, el sujeto puede exponerse a Borrelia.

Se supervisa la reacción del sujeto a la infección. Particularmente, puede determinarse la presencia de Borrelia en el sujeto. Por ejemplo, el polipéptido es protector si no puede detectarse Borrelia en el sujeto. La presencia de Borrelia puede determinarse detectando ácidos nucleicos específicos de Borrelia (por ejemplo, mediante PCR) o anticuerpos específicos de Borrelia (por ejemplo, mediante ELISA o transferencia Western), o detectando la propia Borrelia (por ejemplo, cultivando órganos o tejidos en medio de cultivo y verificando la presencia de Borrelia con un microscopio). En particular, la capacidad protectora ("pc"), indicada como un porcentaje, para una dosis particular se define de la siguiente manera:

pc (%) = [(número de sujetos ensayados totales - número de sujetos infectados por Borrelia)/número de sujetos ensayados totales] x 100

Las diferencias en la capacidad protectora (Apc) pueden determinarse mediante, por ejemplo, comparando la capacidad protectora (pc) de un fragmento mutante de OspA con uno o varios enlaces disulfuro (pc [con enlace]) con respecto a la capacidad protectora de un fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro (pc [sin enlace]). De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos a comparar difieren únicamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro. El cambio en la capacidad protectora (Apc) por la introducción del enlace o enlaces disulfuro se determina de la siguiente manera:

Apc = (pc [muestra] - pc [control])

por ejemplo

Apc = (pc [con enlace] - pc [sin enlace])

Si Apc es mayor de cero (>0), asumiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, dosis y ensayo) son iguales, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento mutante de OspA con uno o más enlaces disulfuro) es mejor que la capacidad protectora del control (por ejemplo, el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro). Por el contrario, si Apc es menor de cero (<0), y asumiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, dosis y ensayo) son iguales, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento mutante de OspA con uno o más enlaces disulfuro) es peor que la capacidad protectora de la comparación (por ejemplo, el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro).

Preferiblemente, se evalúa la capacidad protectora del polipéptido de la presente invención mediante un ensayo de exposición in vivo en el que los ratones inmunizados con el polipéptido de la invención o con un placebo de control se exponen a Borrelia introducida en los sujetos inmunizados con una aguja hipodérmica (método de exposición con aguja) o mediante la introducción con una garrapata vector (método de exposición por garrapatas).

El método de exposición con aguja se realiza para la cepa de Borrelia deseada (por ejemplo, B. burgdorferi, cepa 7S7) mediante la introducción subcutánea de Borrelia en una dosis entre 20 y 50 veces la dosis infecciosa (ID)50 a ratones inmunizados con dicho primer polipéptido del primer aspecto o de un placebo de control (negativo) adecuado, tal como un tampón o adyuvante en solitario y por la comparación de las tasas de infección en los ratones expuestos. La ID50 se define como la dosis a la que se infectan el 50 % de los ratones expuestos. La dosis de Borrelia se mide en cantidad de bacterias. La dosis de exposición puede variar en gran medida y depende de la cepa; por lo tanto, debe calificarse primero la virulencia de la cepa mediante experimentos de exposición para la determinación de la ID50. Cuatro semanas después de la exposición por aguja, se recolecta sangre y tejidos para que los métodos de lectura determinen el estado infeccioso. Estos métodos de lectura pueden ser, por ejemplo, VlsE ELISA en sueros o qPCR en tejidos recolectados para la identificación de Borrelia, como se describe en el presente documento, u otros métodos.

El método de exposición por garrapata se lleva a cabo aplicando al menos una ninfa de garrapata (por ejemplo, I. ricinus) infectada con Borrelia (por ejemplo, B. afzelii, cepa IS1), a un ratón inmunizado con dicho primer polipéptido del primer aspecto; y (b) aplicando al menos una ninfa de garrapata infectada a un segundo ratón inmunizado con dicho segundo polipéptido del primer aspecto; y (c) comparando las tasas de infección en ambos ratones, generalmente seis semanas después de la exposición. Preferiblemente, el ensayo o prueba se realizan con un grupo de ratones por polipéptido a ensayar. En los Ejemplos también se describe y se ilustra una prueba adecuada. Puede realizarse una evaluación del estado infeccioso con VlsE ELISA en sueros o por qPCR en ADN aislado a partir de tejidos recolectados, o mediante otros métodos adecuados.

Los productos de la invención tales como, por ejemplo, los polipéptidos de la invención que comprenden el fragmento de OspA híbrido y preferiblemente el fragmento C-terminal de OspA mutante se pueden administrar 3 veces a un sujeto en una dosis de 30 |jg, preferiblemente 10 |jg, preferiblemente 5,0 |jg, preferiblemente 1,0 |jg, preferiblemente 0,3 jig, o menos tienen una capacidad protectora del 50 % o más, preferiblemente del 60 % o más, más preferiblemente del 70 % o más, más preferiblemente del 80 % o más, más preferiblemente del 90 % o más, incluso más preferiblemente del 95 % o más, mucho más preferiblemente del 99 % o más. La capacidad protectora se puede evaluar en un método de exposición in vivo, preferiblemente un método de exposición por garrapatas, más preferiblemente un método de exposición por aguja, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos..

La diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre los polipéptidos de la invención que comprenden el fragmento C-terminal de OspA híbrido y el placebo de control (negativo) puede ser al menos del 50 %, especialmente al menos del 60 %, preferiblemente al menos del 70 %, más preferiblemente al menos del 80 %, incluso más preferiblemente al menos del 90 %, incluso más preferiblemente al menos del 95 %, mucho más preferiblemente al menos del 99 %, al administrarse 3 veces a un sujeto en una dosis de 30 jig, preferiblemente 10 jig, preferiblemente 5,0 jig, preferiblemente 1,0 jig, preferiblemente 0,3 jig o inferior.

De acuerdo con la presente invención, la primera parte de la OspA híbrida puede ser de cualquier cepa de Borrelia distinta de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ iD NO: 8, particularmente de las especificadas en el presente documento, tales como B. burgdorferi s.s., B. garinii (no la cepa PBr),, B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, B. bavariensis, preferiblemente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis o B. garinii o una fusión de fragmentos de proteína OspA. Preferiblemente, la OspA es de B. valaisiana, particularmente la cepa VS116 (SEQ ID NO: 4), pero puede ser de B. afzelii, particularmente la cepa K78, serotipo 2 de OspA (SEQ ID NO: 6); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 de OspA (SEQ ID NO: 5); B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3 de OspA (SEQ ID NO: 8); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4 de OspA (SEQ ID NO: 9); B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5 de OspA (SEQ ID NO: 10); B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 de OspA (SEQ ID NO: 11) o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7 de OspA (SEQ ID NO: 12). Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas OspA (longitud completa) se proporcionan a continuación.

De acuerdo con la presente divulgación, el enlace disulfuro también puede formarse entre cisteínas que se han introducido en cualquier posición del fragmento de OspA, lo que permite o soporta el pliegue adecuado del fragmento. Pueden seleccionarse las posiciones, como se ha detallado anteriormente, basándose en la estructura conocida de la OspA. Los polipéptidos ejemplares contienen al menos un enlace disulfuro introducido por la inserción de un residuo de cisteína en uno de los residuos 182 /- 3 y uno de los residuos 269 /- 3 (enlace disulfuro de tipo 1; "D1") de una B. afzelii, particularmente OspA de serotipo 2 de B. afzelii K78, o los aminoácidos homólogos de una OspA de una Borrelia distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6, B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7 o una fusión de los aminoácidos 125-176 de OspA de B. valaisiana, cepa VS116, o los aminoácidos 126-175 de OspA de B. spielmanii y los aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8), en los que la numeración de los aminoácidos de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5). El polipéptidos de la presente invención contiene al menos un enlace disulfuro introducido por la inserción de un residuo de cisteína en uno de los residuos 182 /- 3 y uno de los residuos de 269 /- 3 (enlace disulfuro de tipo 1; "D1") de una B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8).

Se aprecia que:

El fragmento mutante adicional se puede derivar de los aminoácidos de la posición 125, 126, 130 o 131 a la posición 273 de la secuencia de tipo salvaje de la OspA de B. afzelii cepa K78, serotipo 2 (SEQ ID NO: 16) y difiere solamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro, particularmente en donde el al menos un enlace disulfuro está entre las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro de tipo 1) o los fragmentos homólogos y posiciones de una OspA de una Borrelia sp. distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6, o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.

El fragmento mutante es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, lo más preferiblemente la SEQ ID NO: 46 y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, incluso más preferiblemente al menos un 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias con SEQ ID NOs: 19 a 25, en donde las cisteínas no se reemplazan. Se han proporcionado anteriormente detalles adicionales sobre mutaciones e identidad de secuencia.

Como se ha detallado anteriormente, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias señal. Se ha mostrado que la lipidación confiere propiedades de adyuvante a OspA. Por consiguiente, las formas lipidadas del polipéptido de la invención o polipéptidos que comprenden una señal de lipidación son preferidos. En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende una señal de lipidación, preferiblemente una señal de lipidación de una proteína de la superficie externa, OspA o OspB de Borrelia (SEQ ID NOs: 13 y 14, respectivamente) o más preferiblemente una secuencia señal de lipidación lpp de E. coli (SEQ ID NO: 15). El fragmento de OspA de la invención que comprende una señal de lipidación, se lipida durante el procesamiento, y el péptido señal de lipidación se elimina por escisión, por lo tanto, el péptido señal ya no está presente en la proteína lipidada madura.

Las proteínas lipidadas de acuerdo con la presente invención se marcan con "Lip" en el extremo N para indicar la adición de 3 grupos ácidos grasos y un glicerol al polipéptido. Las señales de lipidación adecuadas, como se han descrito anteriormente, incluyen MKKYLLGIGLILALIA (SEQ ID NO: 13), MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) y MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15). Dado que los restos lipídicos y un glicerol están unidos al residuo de cisteína N-terminal, que está presente en la proteína OspA de tipo salvaje de longitud completa, los fragmentos C-terminal de OspA para la lipidación pueden comprender adicionalmente un péptido que comprende un residuo de cisteína seguido de aminoácidos adicionales. Por ejemplo, las secuencias tales como CSS o CKQN (SEQ ID NO: 62) inmediatamente C-terminales con respecto a la secuencia señal de lipidación proporcionan un residuo de cisteína N-terminal para la lipidación, después de la escisión del péptido señal de lipidación. Los péptidos lipidados que contienen cisteína están presentes en el polipéptido lipidado final de la invención.

Se ha especulado que la proteína OspA de B. burgdorferi s.s. comprende una secuencia con la capacidad de unirse a un receptor de linfocitos T que también tiene la capacidad de unirse a un antígeno humano asociado a función leucocitaria (hLFA-1) (mencionada en el presente documento como "secuencia de tipo hLFA-1"). La similitud de esta región de OspA con hLFA-1 puede dar como resultado una respuesta inmunitaria con reactividad cruzada después de la administración de OspA de B. burgdorferi s.s. a un sujeto humano y puede inducir enfermedades autoinmunitarias, particularmente artritis autoinmune, en sujetos susceptibles. Por consiguiente, en una realización preferida, el polipéptido de la presente invención no comprende una secuencia con capacidad de unión al receptor de linfocitos T que tiene una capacidad de unión al antígeno humano asociado con la función leucocitaria (hLFA-1) y, particularmente, no comprende la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17). Para este fin, la secuencia de tipo hLFA-1, particularmente la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17), puede reemplazarse con una secuencia homóloga de una proteína OspA de otra Borrelia sp., particularmente con NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 18).

En una realización preferida, el polipéptido de la presente invención que comprende al menos un enlace disulfuro establece esencialmente la misma capacidad protectora con dicho polipéptido contra una infección por Borrelia en relación con al menos una de las proteínas OspA de longitud completa de tipo salvaje derivadas de al menos una cepa de Borrelia, particularmente B. afzelii K78, OspA de serotipo 2 (SEQ ID NO: 6); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 (SEQ ID NO: 5); B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NOs: 7 y 8); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4 (SEQ ID NO: 9); B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5 (SEQ ID NO: 10); B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 (S^eQ ID NO: 11), o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7 (SEQ ID NO: 12).

Cabe destacar que se han proporcionado anteriormente detalles adicionales sobre mutaciones e identidad de secuencia.

Tabla A-3. Nomenclatura y SEQ ID NO de los heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados descritos en la presente invención

En otra realización preferida, el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto puede comprender al menos dos o tres fragmentos mutantes que están conectados a través de uno o más enlazadores. Un enlazador es una secuencia de aminoácidos bastante corta empleada para conectar dos fragmentos. Debería ser diseñada para evitar cualquier impacto negativo en los fragmentos, su interacción en los sujetos a tratar o vacunar, o sobre su capacidad protectora. Se prefieren los enlazadores cortos de como máximo 21 aminoácidos, particularmente como máximo 15 aminoácidos, especialmente como máximo 12 u 8 aminoácidos. Más preferiblemente, el uno o más enlazadores están compuestos por aminoácidos pequeños para reducir o minimizar las interacciones con los fragmentos, tales como glicina, serina y alanina. Un enlazador preferido es el enlazador peptídico "LN1", una fusión de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, con un intercambio de aminoácidos en la posición 53 de D53S) que tiene la siguiente secuencia: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID nO: 184). El enlazador puede comprender un sitio de lipidación.

En otra realización preferida, el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto comprende un polipéptido con un tamaño total de un máximo de 500 aminoácidos, que comprende dos o tres diferentes fragmentos mutantes, como se define en realizaciones preferidas del primer aspecto; o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, uno o dos enlazadores y, opcionalmente, una cisteína N-terminal; y/o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, una extensión N-terminal del fragmento consiste en un máximo de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos, preferiblemente un máximo de 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos, todavía más preferiblemente un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 amino ácidos, en donde la extensión N-terminal está ubicada directamente junto al extremo N a partir del fragmento en la OspA de Borrelia respectiva y, opcionalmente, una cisteína N-terminal. La cisteína N-terminal puede ir seguida opcionalmente de un enlazador peptídico corto de 1-10 aminoácidos de longitud, y preferiblemente adopta la forma de un péptido CSS N-terminal.

Los ácidos nucleicos de la invención y aspectos relacionados

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención. El ácido nucleico puede estar comprendido en un vector y/o célula.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Para los fines de la invención, el término "ácido(s) nucleico(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluidas las regiones/formas monocatenarias y bicatenarias.

El término "ácido nucleico que codifica un polipéptido", como se usa en el presente documento, comprende polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un péptido o polipéptido de la invención. El término también incluye polinucleótidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el péptido o polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos mediante fagos integrados, una secuencia de inserción integrada, una secuencia integrada de vector, una secuencia integrada de transposones, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

Los expertos en la técnica apreciarán, como resultado de la degeneración del código genético, que hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos poseen una similitud mínima a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen natural (es decir, de origen natural). No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente por la presente invención, por ejemplo, los polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones humanos y/o de primate y/o de E. coli.

Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden sintetizarse, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs.

215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs. 225-232 (1980)). Como alternativa, la propia proteína puede producirse usando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede realizarse usando diversas técnicas de fase sólida (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) y la síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ASI 431 A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Además, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención se pueden modificar genéticamente usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican polipéptidos con una diversidad de razones, incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto genético. Por ejemplo, se puede utilizar la transposición de ADN mediante fragmentación aleatoria, y reagrupación por PCR de fragmentos genéticos y oligonucleótidos sintéticos para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos. Además, puede utilizarse mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, o introducir mutaciones, etc.

En un aspecto adicional de la invención, la presente invención se refiere a vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, unido a un promotor inducible, de manera que cuando el promotor es inducido, se expresa un polipéptido codificado por el ácido nucleico. En una realización preferida, el vector es pET28b(+) (http://www.addgene.org/vector-database/2566/).

Un aspecto adicional de la invención comprende dicho vector, en el que el promotor inducible se activa mediante la adición de una cantidad suficiente de IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido) preferiblemente al medio de cultivo. Opcionalmente, éste está a una concentración de entre 0,1 y 10 mM, 0,1 y 5 mM, 0,1 y 2,5 mM, 0,2 y 10 mM, 0,2 y 5 mM, 0,2 y 2,5 mM, 0,4 y 10 mM, 1 y 10 mM, 1 y 5 mM, 2,5 y 10 mM, 2,5 y 5 mM, 5 y 10 mM. Como alternativa, el promotor puede ser inducido mediante un cambio en la temperatura o el pH.

La molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a cualquier molécula de ácido ribonucleico o molécula de ácido desoxirribonucleico, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, se refiere a al menos ADN monocatenario o bicatenario, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de monocatenario, o más comúnmente, bicatenario, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Como se usa en el presente documento, el término molécula de ácido nucleico incluye moléculas de ADN o ARN, como se ha descrito anteriormente, que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, las moléculas de ADN o ARN con esqueletos modificados para la estabilidad o por otros motivos son "moléculas de ácido nucleico", con el significado previsto para este término en el presente documento. Además, las especies de ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tal como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solamente dos ejemplos, también son moléculas de ácido nucleico, como se define en el presente documento. Se apreciará que se ha realizado una gran diversidad de modificaciones a las moléculas de ADN y ARN que tienen varios fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, comprende dichas formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de moléculas de ácido nucleico, así como formas químicas de a Dn y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas, entre otras. El término ácido nucleico también incluye moléculas de ácido nucleico cortas a menudo mencionadas como oligonucleótidos. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se usan en el presente documento de manera intercambiable.

Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse químicamente. Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden aislarse a partir de Borrelia y modificarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Lo mismo se aplica a los polipéptidos de acuerdo con la presente invención.

Además, el ácido nucleico de la presente invención puede unirse de manera funcional utilizando técnicas estándar, tales como clonación, a cualquier secuencia deseada, ya sea una secuencia reguladora de Borrelia o una secuencia reguladora heteróloga, secuencia líder heteróloga, secuencia marcadora heteróloga, o una secuencia codificante heteróloga para crear un gen de fusión.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm o ARNc, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido por medio de técnicas de síntesis química o mediante una combinación de las mismas El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también mencionada como cadena antisentido.

El ácido nucleico de la presente invención puede estar comprendido en un vector o en una célula huésped. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un vector o a una célula huésped, preferentemente E. coli, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El vector puede comprender el ácido nucleico mencionado anteriormente de tal manera que el vector sea replicable y pueda expresar la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped pueden modificarse genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos del ácido nucleico de la invención. La introducción de un ácido nucleico en una célula huésped puede realizarse mediante los métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tal como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tal como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, conjugación, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen células bacterianas gram negativas, tales como células de E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. En una realización, la célula huésped es una célula es una célula de Escherichia coli. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de E. coli BL21 (DE3) o una célula de E. coli BL21 Star™ (DE3).

Como alternativa, pueden también usarse células bacterianas gram positivas. Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. En una realización, el vector se deriva de plásmidos bacterianos. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped pueden usarse para la expresión en este sentido. La secuencia de ADN adecuada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).

En una realización de la presente invención, las células se cultivan a presión selectiva, tal como en presencia de antibióticos, preferiblemente kanamicina. En otra realización, las células se cultivan en ausencia de antibióticos. Puede usarse una gran diversidad de vectores de expresión para expresar los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar ácidos nucleicos para expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para la expresión en este sentido. De acuerdo con este aspecto de la invención, el vector puede ser, por ejemplo, un vector de plásmido, un vector de fagos monocatenario o bicatenario, o un vector viral de ADN o ARN monocatenario o bicatenario. Los plásmidos de partida divulgados en el presente documento están disponibles comercialmente, disponibles públicamente o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles mediante la aplicación de rutina de procedimientos publicados bien conocidos. Entre los vectores preferidos, en determinados aspectos, están aquellos para la expresión de moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Pueden usarse construcciones de ácido nucleico en células huésped de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende este vector. Los ejemplos representativos de células huésped adecuadas incluyen bacterias, tales como estreptococos y estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; hongos, tales como levadura y Aspergillus; células de insectos, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de mamífero, tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 o células de melanoma de Bowes; y células vegetales. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas usando ARN derivado de la construcción de ADN de la presente invención. Para poder expresar la secuencia de aminoácidos deseada de manera práctica mediante la introducción del vector de acuerdo con la presente invención en una célula huésped, el vector puede contener, además de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, otras secuencias para controlar la expresión (por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias de terminación y secuencias potenciadoras) y marcadores genéticos para seleccionar microorganismos, células de insecto, células de cultivo animales, o similares (por ejemplo, genes de resistencia a la neomicina y genes de resistencia a la kanamicina). Además, el vector puede contener la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en una forma repetida (por ejemplo, en tándem). El vector puede construirse basándose en procedimientos que se usan convencionalmente en el campo de la ingeniería genética.

Las células huésped pueden cultivarse en un medio adecuado, y la proteína de acuerdo con la presente invención puede obtenerse a partir del producto de cultivo. La proteína de acuerdo con la presente invención puede recuperarse del medio de cultivo y purificarse de la manera convencional.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un procedimiento para producir una célula que expresa el polipéptido de acuerdo con la presente invención, que comprende transformar o transfectar una célula huésped adecuada con el vector de acuerdo con el presente invención o un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con la presente invención, que comprende expresar la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

Como alternativa, un método para producir un polipéptido, como se ha definido anteriormente, se puede caracterizar por las siguientes etapas:

a) introducir un vector que codifica el polipéptido en una célula huésped,

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido,

c) homogeneizar dicha célula huésped, y

d) someter el homogenado de la célula huésped a etapas de purificación.

La invención se refiere adicionalmente a un método para producir un polipéptido como se ha definido anteriormente caracterizado por las siguientes etapas:

a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,

b) introducir dicho vector en una célula huésped,

c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la expresión de polipéptidos,

d) homogeneizar dicha célula huésped,

e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases, y

f) purificar adicionalmente sobre una columna de filtración en gel.

La invención se refiere adicionalmente a un método para producir un polipéptido como se ha definido anteriormente, caracterizado por las siguientes etapas:

a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,

b) introducir dicho vector en una célula huésped,

d) homogeneizar dicha célula huésped,

e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases,

g) purificar sobre una columna de filtración en gel, y

h) opcionalmente, procesar adicionalmente sobre una columna de intercambio de tampón.

Anticuerpos y aspectos relacionados

También se divulga un anticuerpo, o al menos una parte eficaz del mismo, que se une selectivamente al fragmento de OspA C-terminal híbrido como se define en el contexto de la presente invención, pero no a la primera porción de OspA y a la segunda porción de OspA en solitario (es decir, si no se fusiona a la otra porción).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

La parte eficaz puede comprender un fragmento Fab, un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)N, un fragmento F(ab⁾²o un fragmento Fv o un anticuerpo de dominio único.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado.

Los anticuerpos pueden unirse específicamente a polipéptidos de fragmento de OspA híbrido de la , pero no a la primera porción de OspA y a la segunda porción de OspA en solitario y no a los polipéptidos de fragmento de OspA de tipo salvaje correspondientes. Particularmente, el anticuerpo puede unirse específicamente al enlace disulfuro del fragmento mutante de OspA de la invención.

El término "especificidad" se refiere a la cantidad de tipos diferentes de antígenos o determinantes antigénicos a los cuales se puede unir una molécula particular de unión a antígenos o proteína de unión a antígenos (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse basándose en la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión al antígeno (K^d) , es una medida para la potencia de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al antígeno en la proteína de unión a antígenos: cuanto menor sea el valor de K^d, más potente será la potencia de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (K^a), que es 1/K^d).

Como será evidente para un experto (por ejemplo, en base a la divulgación adicional en el presente documento), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la potencia de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o una parte eficaz del mismo) y un antígeno pertinente. La avidez se relaciona tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en la molécula de unión a antígeno y la cantidad de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno. Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o una parte eficaz del mismo) se unirán a su antígeno con una constante de disociación (K^d) de 10^-5a 10^-12M o menos, y preferiblemente 10^-7a 10^-12M o menos, y más preferiblemente 10^-8a 10^-12M (es decir, con una constante de asociación (K^a) de 10⁵a 10¹²M^-1o más, y preferiblemente 10⁷a 10¹²litros/moles o más y más preferiblemente 10⁸a 10¹²M^-1). Cualquier valor de K^dmayor de 10⁴M (o cualquier valor de K^amenor de 10⁴M^-1) se considera generalmente como indicación de unión no específica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tal como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos de enzimas (EIA) y ensayos de competición tipo sándwich, y las variantes diferentes de los mismos conocidas en la técnica, así como las demás técnicas mencionadas en el presente documento.

La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como será evidente para un experto en la técnica. Los métodos para determinar la constante de disociación serán evidentes para el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, las técnicas mencionadas en el presente documento A este respecto, será también evidente que puede no ser posible medir las constantes de disociación de más de 10^-4M o 10^-3M (por ejemplo, de 10^-2M). Opcionalmente, será evidente también para el experto en la técnica que la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse en base a la constante de asociación (real o aparente) (K^a), por medio de la relación [K^d= 1/K^a].

La afinidad representa la potencia o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se proporciona comúnmente por la K^d, o constante de disociación, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad también puede expresarse como una constante de asociación, K^a, que equivale a 1/K^dy tiene unidades de (litro/mol)^-1(o M^-1). En la presente memoria descriptiva, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tales como una secuencia de aminoácidos, Nanocuerpo o polipéptido de la invención y su diana pretendida) se expresará principalmente en términos del valor de K^dde su interacción; será evidente para el experto en la técnica que, a la vista de la relación K^a= 1/K^d, especificar la potencia de la interacción molecular mediante su valor de K^dtambién puede usarse para calcular el valor de K^acorrespondiente. El valor de K^dtambién caracteriza la potencia de una interacción molecular en un sentido termodinámico, ya que se relaciona con la energía libre (DG) de unión mediante la relación ya conocida DG = RT.ln(Ko) (de manera equivalente DG = -RT.ln(KA)), donde R equivale a la constante de gas, T equivale a la temperatura absoluta, y ln representa el logaritmo natural.

Las K^dpara interacciones biológicas que se consideran significativas (por ejemplo, específicas) están típicamente en el intervalo de 10^-10M (0,1 nM) a 10^-5M (10000 nM). Cuando mayor sea la interacción, menor será su K^d.

La K^ddel anticuerpo puede estar entre 10^-12M y 10^-5M, menor de 10^-6, menor de 10^-7, menor de 10^-8M, menor de 10^-9M, menor de 10^-10M, menor de 10^-11M, menor de 10^-12M.

La K^dtambién puede expresarse como la relación de la constante de la tasa de disociación de un complejo, representada como koff, con respecto a la tasa de su asociación, representada kon (de manera que K^d= koff/kon y K^a= kon/koff). La tasa de disociación koff tiene las unidades s^-1(donde s es la notación para la unidad internacional de segundo). La tasa de asociación kon tiene las unidades M^-1s^-1. La tasa de asociación puede variar entre 10²M^-1s^-1a aproximadamente 10⁷M^-1s^-1, que se acerca a la constante de tasa de asociación limitada por difusión para interacciones moleculares. La tasa de disociación se refiere a la semivida de una interacción molecular dada mediante la relación t1/2 = ln(2)/koff. La tasa de disociación puede variar entre 10^-6s^-1(complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días) a 1 s^-1(t1/2 = 0,69 s).

La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse mediante diferentes técnicas conocidas per se, tal como la técnica de biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SPR) ya conocida (véase, por ejemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) donde una molécula se inmoviliza en el chip del biosensor y la otra molécula se pasa sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo, lo que produce mediciones de kon, koff y, por lo tanto, valores de K^d(o K^a). Esto puede realizarse, por ejemplo, usando los instrumentos BIACORE ya conocidos.

También será evidente para el experto en la técnica que la Kd medida puede corresponder a la Kd aparente si el proceso de medición de alguna manera influye en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, mediante artefactos relacionados con el recubrimiento en el biosensor de una molécula. También puede medirse una Kd aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En dicha situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción por las dos moléculas.

Otro enfoque que puede usarse para evaluar la afinidad es un procedimiento de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) de 2 etapas de Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición de equilibrio de unión de fase en solución y evita los posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas en un soporte, tal como plástico.

Sin embargo, la medición precisa de la Kd puede requerir mucho trabajo; por lo tanto, los valores de Kd aparente a menudo se determinan para evaluar la potencia de unión de dos moléculas. Cabe destacar que siempre que las mediciones se realicen de una manera consistente (por ejemplo, al mantener las condiciones de ensayo inalteradas), las mediciones de KD aparente pueden usarse como una aproximación de la KD verdadera y, por lo tanto, en el presente documento K^dy K^daparente deberían tratarse como de igual importancia o relevancia.

Finalmente, cabe destacar que en muchas situaciones el científico experimentado puede considerar conveniente la determinación de la afinidad de unión en relación con alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la potencia de unión entre moléculas A y B, se puede usar, por ejemplo, una molécula de referencia C que se sabe que se une a B y que está marcada de manera adecuada con un grupo fluoróforo o cromóforo u otro resto químico, tal como biotina para la fácil detección por medio de ELISA o citometría de flujo u otro formato (el fluoróforo para la detección por fluorescencia, el cromóforo para la detección de absorción de luz, la biotina para la detección por ELISA mediada por estreptavidina). Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A varía para una concentración o cantidad de B dada. Como resultado, se obtiene un valor de concentración inhibidora (IC)50 correspondiente a la concentración de A a la que la señal medida para C en ausencia de A disminuye a la mitad. Siempre que se conozca Kd ref, la Kd de la molécula de referencia, así como la concentración total cref de la molécula de referencia, la Kd aparente para la interacción A-B puede obtenerse a partir de la siguiente fórmula: Kd = IC⁵o/(1 cref/KDref). Ha de apreciarse que si Cref << KDref, Kd “ IC50. Siempre que la medición de la IC50 se realice de una manera consistente (por ejemplo, manteniendo la cref fija) para los aglutinantes que se están comparando, la potencia o estabilidad de una interacción molecular puede evaluarse mediante la IC50 y esta medición se considera como equivalente a la K^do a la K^daparente a lo largo de este texto.

Además, en el presente documento se describe una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo como se ha definido anteriormente.

En el presente documento también se describe un método para producir un anticuerpo como se ha definido anteriormente caracterizado por las siguientes etapas:

a) iniciar una respuesta inmune en un animal no humano mediante la administración de un polipéptido, como se ha definido anteriormente, a dicho animal,

b) extraer fluido corporal que contiene anticuerpo de dicho animal, y

c) producir el anticuerpo sometiendo dicho fluido corporal que contiene anticuerpo a etapas posteriores de purificación

o caracterizado por las siguientes etapas:

b) extraer el bazo o células esplénicas de dicho animal,

c) producir células de hibridoma de dicho bazo o células esplénicas,

d) seleccionar y clonar células de hibridoma específicas para dicho polipéptido,

e) producir el anticuerpo mediante cultivo de dichas células de hibridoma clonadas, y

f) opcionalmente realizar etapas adicionales de purificación.

Composiciones farmacéuticas y aspectos médicos relacionados

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende

(i) el polipéptido de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; y

(ii) opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, el polipéptido de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden ser

- para su uso como medicamento, particularmente como vacuna o

- para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.

Preferiblemente, la composición comprende adicionalmente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33), la composición comprende adicionalmente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), la composición comprende adicionalmente Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) o la composición comprende Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33).

Todavía otro aspecto se refiere a una composición farmacéutica , como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento o prevención de la infección con especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia como se divulga en el presente documento, que comprenden, más preferiblemente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.

El problema que subyace a la presente invención se resuelve en otro aspecto mediante el uso de un polipéptido de acuerdo con la presente invención y/o el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir infecciones con especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia, como se divulga en el presente documento, más preferiblemente que comprenden B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.

La composición farmacéutica puede contener, opcionalmente, cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tales como sustancias tamponantes, estabilizadores u otros principios activos, especialmente ingredientes conocidos relacionados con la producción de vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende L-metionina. Preferiblemente, la composición farmacéutica es para su uso como un medicamento, particularmente como una vacuna o para la prevención o tratamiento de una infección causada por especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia como se divulga en el presente documento, que comprenden, más preferiblemente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii, y/u otros patógenos contra los cuales se han incluido los antígenos en la vacuna. Preferiblemente, la composición farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii infection.

En una realización, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un adyuvante. La elección de un adyuvante adecuado a mezclar con toxinas bacterianas o conjugados realizados usando los procesos de la invención se encuentra en el conocimiento del experto en la técnica. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también pueden ser otras sales metálicas tales como las de calcio, magnesio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos derivados de manera aniónica o catiónica, o polifosfacenos. En una realización preferida, la composición farmacéutica se forma como adyuvante con hidróxido de aluminio.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende además una sustancia inmunoestimulante, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODN), especialmente oligo(dIdC)-i³(SEQ ID NO: 63), péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61), compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, adyuvante completo o incompleto de Freund, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la sustancia inmunoestimulante es una combinación de un polímero policatiónico y desoxinucleótidos inmunoestimulantes o de un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys y desoxinucleótidos inmunoestimulantes, preferiblemente una combinación de KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61) y oligo(dIdC⁾¹³(SEQ ID NO: 63). Más preferiblemente, dicho péptido policatiónico es poliarginina.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, L-metionina, sacarosa y polisorbato-20 (Tween-20) a un pH de 6,7 /- 0,2. Preferiblemente, la composición farmacéutica también comprende hidróxido de aluminio, preferiblemente en una concentración del 0,15 %.

En una realización, la formulación comprende fosfato de sodio entre 5 mM y 50 mM, cloruro de sodio entre 100 y 200 mM, L-metionina entre 5 mM y 25 mM, sacarosa entre el 2,5 % y el 10 %, Tween 20 entre el 0,01 % y el 0,1 % e hidróxido de aluminio entre el 0,1 % y el 0,2 % (p/v). Más preferiblemente, la formulación comprende fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, L-metionina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween 20 al 0,05 % e hidróxido de aluminio al 0,15 % (p/v) a pH 6,7 ± 0,2. Aun más preferiblemente, la formulación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres heterodímeros mutantes de OspA de acuerdo con la invención.

En una realización, la composición farmacéutica comprende 3 heterodímeros , preferiblemente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33). Preferiblemente, los tres heterodímeros se mezclan en una relación molar de 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, mucho más preferiblemente 1:1:1.

En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende dos heterodímeros , preferiblemente LipS1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33), Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) y Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) o Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y LipS5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) en una relación molar de 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, preferiblemente 1:1.

En una realización, la composición farmacéutica o vacuna de la invención comprende además al menos un antígeno adicional de Borrelia o un patógeno distinto de Borrelia (mencionado en el presente documento de manera genérica como "composición farmacéutica o vacuna de combinación"). En una realización preferida, el al menos un antígeno adicional se deriva de una especie de Bórrela causando borreliosis de Lyme. En diversos aspectos, el al menos un antígeno adicional se deriva de otro patógeno, preferiblemente un patógeno transmitido por garrapatas. En un aspecto adicional, el patógeno causa la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, ehrlichiosis granulocítica humana (HGE), fiebre sennetsu, ehrlichiosis monocítica humana (HME), anaplasmosis, fiebre botonosa, Rickettsia parkeri Rickettsiosis, erupción asociada a garrapatas del sur (STARI), fiebre manchada por Rickettsia, rickettsiosis 364D, fiebre manchada africana, fiebre reincidente, tularemia, fiebre de Colorado por garrapatas, encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, también conocida como FSME), fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre Q, fiebre hemorrágica de Omsk, enfermedad de la selva de Kyasanur, encefalitis de Powassan, enfermedad del virus Heartland o babesiosis. En un aspecto adicional, la enfermedad es encefalitis japonesa.

En una realización adicional, el al menos un antígeno adicional se deriva de un patógeno transmitido por vector, preferiblemente transmitido por garrapatas, seleccionado del grupo que comprende Bórrela hermsii, Bórrela parkeri, Bórrela duttoni, Bórrela miyamotoi, Bórrela turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagócytóphilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neóehrlichia mikurensis, Coxiella burnetii y Bórrela lonestari, virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV, también conocida como virus FSME), virus de la fiebre de Colorado transmitida por garrapatas (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV), virus de la encefalitis japonesa (JEV) y Babesia spp.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y un antígeno adicional como se define anteriormente, en el que el al menos un antígeno adicional está comprendido en una segunda composición, particularmente en el que la segunda composición es una vacuna, preferiblemente una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa o una vacuna contra la fiebre manchada de las Montañas Rocosas. La primera composición también puede ser una vacuna. La composición farmacéutica o vacuna de combinación de la invención comprende cualquier composición como se define por las reivindicaciones en combinación con al menos una segunda composición (de vacuna). En algunos aspectos, la segunda composición de vacuna protege contra una enfermedad transmitida por vector, preferiblemente una enfermedad transmitida por garrapatas. En diversos aspectos, la segunda composición de vacuna tiene un programa de inmunización por estaciones compatible con la inmunización contra la infección por Borrelia o borreliosis de Lyme. En otros aspectos, las vacunas de combinación son útiles en la prevención de múltiples enfermedades para su uso en ubicaciones geográficas donde son prevalentes estas enfermedades.

En un aspecto, la segunda composición es una vacuna seleccionada del grupo que consiste en una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa y una vacuna contra la fiebre manchada de las Montañas Rocosas. En un aspecto preferido, la composición de vacuna es FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) o TBE Moscow Vaccine® (Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences). En otro aspecto preferido, la composición de vacuna es IXIARO®/JESPECT® (Valneva SE), JEEV® (Biological E, Ltd.) o IMOj Ev® (Sanofi Pasteur).

Se proporciona adicionalmente una composición farmacéutica, que es una vacuna, esta vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el excipiente es L-metionina. La invención también incluye composiciones inmunogénicas, como se define por las reivindicaciones. En algunos aspectos, una composición inmunogénica de la invención comprende cualquiera de las composiciones como se define por las reivindicaciones y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En diversos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína A de la superficie externa (OspA). En ciertos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a Borrelia. En aspectos particulares, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que neutraliza a Borrelia. En algunos aspectos, el anticuerpo es producido por un animal. En aspectos adicionales, el animal es un mamífero. Incluso en aspectos adicionales, el mamífero es un ser humano.

Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse para proteger a un mamífero susceptible a infección por Borrelia o tratar a un mamífero con infección por Borrelia, mediante la administración de dicha vacuna a través de una vía sistémica o una mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección mediante las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración a través de mucosas al tracto oral/alimenticio, respiratorio o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención puede administrarse como una única dosis, los componentes de la misma pueden coadministrarse también en conjunto al mismo tiempo o en diferentes momentos.

En un aspecto de la invención, se proporciona un kit de vacunación que comprende un vial que contiene una composición farmacéutica de la invención, opcionalmente de forma liofilizada, y que comprende además un vial que contiene un adyuvante como se describe en el presente documento. Se prevé que en este aspecto de la invención el adyuvante se usará para reconstruir la composición inmunogénica liofilizada. En un aspecto adicional, la composición farmacéutica de la invención puede premezclarse en un vial, preferiblemente en una jeringa.

También se describe un método de tratamiento o prevención de una infección por Borrelia en un sujeto que lo necesita que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención, el anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención.

También se describe un método de inmunización de un sujeto que lo necesita que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención, el anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención.

Todavía se describe adicionalmente un método para inmunizar a un animal o ser humano contra una infección con un organismo de Borrelia, que comprende la etapa de administrar a dicho animal o ser humano una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención, el anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención, en el que la cantidad eficaz es adecuada para provocar una respuesta inmunitaria en dicho animal o ser humano.

Aún se describe un método para estimular una respuesta inmunitaria en un animal o ser humano contra un organismo de Borrelia, que comprende la etapa de administrar a dicho animal o ser humano una cantidad eficaz de un polipéptido de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención, el anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención, en el que la cantidad eficaz es adecuada para estimular una respuesta inmunitaria en dicho animal o ser humano.

Preferiblemente, el organismo de Borrelia se selecciona del grupo que comprende B. burgdorferi, particularmente B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. hisitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.

Se describe un método para la prevención o tratamiento de episodios primarios y/o recurrentes de la infección por Borrelia que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica, vacuna o kit de la invención.

Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Borrelia. En una realización se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de la composición farmacéutica, vacuna o kit de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia. En una realización se proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.

La descripción también incluye métodos para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto. En diversos aspectos, dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna analizadas en el presente documento al sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunológica. En ciertos aspectos, la respuesta inmunológica comprende la producción de un anticuerpo anti-OspA.

La descripción incluye métodos para la prevención o tratamiento de una infección por Borrelia o borreliosis de Lyme en un sujeto. En diversos aspectos, dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones de vacuna analizadas en el presente documento o cualquiera de las vacunas de combinación analizadas en el presente documento al sujeto en una cantidad eficaz para la prevención o tratamiento de la infección por Borrelia o borreliosis de Lyme.

La invención incluye usos de polipéptidos, ácidos nucleicos, composiciones farmacéuticas o vacunas de la invención para la preparación de medicamentos. También se proporcionan en la presente invención otros aspectos relacionados.

Los términos "que comprende", "comprenden" y "comprende" en el presente documento pretender ser reemplazables opcionalmente por los inventores con los términos "que consiste en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en cada caso. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" implicarán la inclusión de un compuesto o composición indicada (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, anticuerpo) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no implicará la exclusión de ningún otro compuesto, composición, etapa o grupo de los mismos. La abreviatura "e.g." deriva del latín exempli gratia y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "e.g." es sinónimo de la expresión "por ejemplo".

Las realizaciones de la presente relacionadas con "composiciones de vacuna" de la invención se pueden aplicar también a realizaciones relacionadas con "composiciones farmacéuticas" de la invención y viceversa.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).

Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas proporcionadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.

Un vehículo o excipiente preferible para los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus distintas realizaciones, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un compuesto inmunoestimulante tal como un adyuvante para una estimulación adicional de la respuesta inmunitaria al polipéptido de acuerdo con la presente invención o una molécula codificante de ácido nucleico de la misma.

Pueden usarse adyuvantes o compuestos inmunoestimulantes en composiciones de la invención.

Preferiblemente, el compuesto inmunoestimulante en las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo de sustancias policatiónicas, especialmente péptidos policatiónicos, moléculas de ácidos nucleicos inmunoestimulantes, preferiblemente desoxinucleótidos inmunoestimulantes, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, MF59, sales de aluminio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, o combinaciones de los mismos.

Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio, y los antígenos se adsorben generalmente en estas sales. Preferiblemente, el hidróxido de aluminio está presente en una concentración final del 0,15 %. Un adyuvante de fosfato de aluminio útil es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al de entre 0,84 y 0,92. Otro adyuvante útil en la presente invención es una sal de aluminio que pueda proporcionar una composición acuosa que tenga menos de 350 ppb de metal pesado en base al peso de la composición acuosa. Un adyuvante basado en aluminio útil adicional es AS04, una combinación de hidróxido de aluminio y lípido monofosforilado A (MPL).

Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una composición farmacéutica que comprende al menos cualquiera de los siguientes compuestos o combinaciones de los mismos: las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus distintas realizaciones, el vector de acuerdo con la presente invención, y las células de acuerdo con la presente invención. Con respecto a esto, cualquiera de estos compuestos puede emplearse en combinación con uno o más vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tal como un vehículo farmacéutico adecuado para su administración a un sujeto. Dichos vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debería adaptarse al modo de administración.

La composición farmacéutica puede comprender un estabilizador. El término "estabilizador" se refiere a una sustancia o excipiente de vacuna que protege la composición inmunogénica de la vacuna de condiciones adversas, tales como aquellas que se producen durante el calentamiento o la congelación, y/o prolonga la estabilidad o semivida de la composición inmunogénica en una condición o estado estable e inmunogénico. Los ejemplos de estabilizadores incluyen, pero sin limitación, azúcares, tales como sacarosa, lactosa y mañosa; alcoholes de azúcar, tal como manitol; aminoácidos, tales como glicina o ácido glutámico; y proteínas, tales como albúmina sérica humana o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas de cualquier manera eficaz y conveniente, incluyendo, por ejemplo, administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal o intradérmica, entre otras En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía subcutánea o intramuscular, más preferiblemente intramuscular.

En terapia o como un profiláctico, el agente activo de la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Como alternativa, la composición, preferiblemente la composición farmacéutica, puede formularse para administración tópica, por ejemplo, en forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos para los ojos, gotas para los ojos, gotas para los oídos, enjuague bucal, apósitos y suturas impregnados y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales adecuados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en ungüentos y cremas. Dichas formulaciones tópicas pueden contener también vehículos convencionales compatibles, por ejemplo, bases de cremas o ungüentos, y etanol u alcohol oleílico para lociones. Dichos vehículos pueden constituir de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 98 % en peso de la formulación; más usualmente constituirán hasta aproximadamente el 80 % en peso de la formulación.

Además de la terapia descrita anteriormente, las composiciones de esta invención pueden utilizarse generalmente como un agente de tratamiento de heridas para evitar la adhesión de bacterias a las proteínas de matriz expuestas en el tejido de la herida y para uso profiláctico en tratamientos dentales como una alternativa a, o junto con, la profilaxis antibiótica.

En una realización preferida, la composición farmacéutica es una composición de vacuna. Preferiblemente, dicha composición de vacuna se encuentra, convenientemente, en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación con un antígeno de proteína es, para adultos, entre 0,02 |jg y 3 |jg de antígeno por kg de peso corporal, y para niños, entre 0,2 y 10 jg de antígeno por kg de peso corporal, y dicha dosis se administra preferiblemente de 1 a 3 veces en intervalos de 2 a 24 semanas.

En el intervalo de dosis indicado, no se esperan efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención, lo cual impediría su administración a individuos adecuados.

Como un aspecto adicional, la invención incluye kits que comprenden una o más formulaciones farmacéuticas como se define en las reivindicaciones para su administración a un sujeto, envasadas de forma que facilite su uso para la administración a sujetos. Preferiblemente, los kits comprenden la formulación en un volumen final de 2 ml, más preferiblemente en un volumen final de 1 ml.

La invención incluye kits para producir una única dosis unitaria de administración. En diversos aspectos, cada kit contiene tanto un primer recipiente con una proteína seca como un segundo recipiente con una formulación acuosa. Se incluyen también dentro del alcance de esta invención los kits que contienen jeringas precargadas con cámara individual y múltiple (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).

Tal kit puede incluir una formulación farmacéutica como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o péptido terapéutico), envasada en un recipiente tal como una botella o frasco sellados, con una etiqueta pegada al recipiente o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o composición para poner en práctica el método. En una realización, la formulación farmacéutica se envasa en el recipiente de forma que la cantidad de espacio vacío en el recipiente (por ejemplo, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del recipiente) sea muy pequeño. Preferiblemente, la cantidad de espacio vacío es insignificante (es decir, casi nula).

El kit puede contener un primer recipiente que tiene una composición de proteína o péptido terapéutica y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición En un aspecto, la formulación farmacéutica se envasa en una forma de dosificación unitaria. El kit incluye además, opcionalmente, un dispositivo adecuado para la administración de la formulación farmacéutica de acuerdo con una vía específica de administración. En algunos aspectos, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.

La composición farmacéutica puede contener una gama de antígenos diferentes. Los ejemplos de antígenos son organismos atenuados o eliminados en su totalidad, subfracciones de estos organismos, proteínas o, en su forma más simple, péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario en la forma de proteínas o péptidos glucosilados y pueden también ser, o contener, polisacáridos o lípidos. Pueden utilizarse péptidos cortos, dado que los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos, usualmente de 8-11 aminoácidos de longitud, junto con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los linfocitos B pueden reconocer epítopos lineales de 4 a 5 aminoácidos, así como estructuras tridimensionales (epítopos conformacionales).

La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un antígeno reactivo al suero hiperinmune contra una proteína de Borrelia o un fragmento activo o variante del mismo, tales como, por ejemplo, los antígenos, fragmentos y variantes que se describen en el documento WO2008/031133.

De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica de acuerdo con otro aspecto puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o patología que está causada por, vinculada a, o asociada con Borrelia.

La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o patología que está causada, vinculada a, o asociada con Bórrela, más preferiblemente cualquier especie patogénica de Bórrela, y más preferiblemente para su uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección por Bórrela, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.

Con respecto a esto, debería observarse que las distintas especies de Borrelia, inclusive B. burgdorferi s.l., comprenden varias especies y cepas que incluyen las divulgadas en el presente documento. Una enfermedad relacionada, causada o asociada con la infección bacteriana a prevenir y/o tratar de acuerdo con la presente invención incluye la borreliosis de Lyme (enfermedad de Lyme). Más específicamente, la borreliosis de Lyme generalmente tiene lugar en fases, con remisión y exacerbaciones con diferentes manifestaciones clínicas en cada fase. La fase 1 de infección temprana consiste en una infección localizada de la piel, seguida en pocos días o semanas de la etapa 2, infección diseminada, y en meses a años después por la fase 3, infección persistente. No obstante, la infección es variable; algunos pacientes tienen únicamente infecciones cutáneas localizadas, mientras que otros presentan únicamente manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como artritis.

La composición farmacéutica de la invención se puede usar en un método para el tratamiento o la prevención de una infección por Borrelia en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de acuerdo con el tercer aspecto.

El término "sujeto" se usa a lo largo de la memoria descriptiva para describir un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, a quien se proporciona un tratamiento o un método de acuerdo con la presente invención. Para el tratamiento de esas infecciones, afecciones o patologías que son específicas de un animal específico, tal como un paciente humano, el término paciente se refiere a ese animal específico. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano; sin embargo, el uso médico de la composición puede incluir también animales tales como aves, incluyendo gallinas, pavos, patos o gansos, ganado tal como caballos, vacas u ovejas, o animales de compañía tales como perros o gatos.

La expresión "cantidad eficaz" se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir una cantidad de la presente composición farmacéutica que puede usarse para inducir un resultado previsto al utilizarse en el método de la presente invención. En varios aspectos de la presente invención, el término cantidad eficaz se usa junto con el tratamiento o prevención. En otros aspectos, el término cantidad eficaz simplemente se refiere a una cantidad de un agente que produce un resultado que se observa como beneficioso o útil, inclusive en métodos de acuerdo con la presente invención, donde se busca el tratamiento o prevención de una infección por Borrelia.

El término cantidad eficaz con respecto a los compuestos y composiciones descritos en el presente documento se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir esa cantidad del compuesto de acuerdo con la presente invención que se administra a un paciente mamífero, especialmente un paciente humano, que padece una enfermedad asociada a Borrelia, para reducir o inhibir la infección por Borrelia.

En una realización particular, se puede usar la composición farmacéutica de la invención en un método para inmunizar a un sujeto que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica del tercer aspecto de la presente invención.

El método comprende inducir una respuesta inmunológica en un individuo mediante terapia génica o de otra forma, mediante la administración de un polipéptido o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención in vivo a fin de estimular una respuesta inmunológica para producir anticuerpos o una respuesta mediada por células de linfocitos T, ya sean linfocitos T productores de citocinas o linfocitos T citotóxicos, para proteger a dicho individuo de la enfermedad, aunque esa enfermedad ya se haya establecido en el individuo.

Los productos de la presente invención, particularmente los polipéptidos y ácidos nucleicos, se proporcionan preferiblemente de forma aislada y pueden purificarse hasta la homogeneidad. El término "aislado", como se usa en el presente documento, significa separado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir, si ocurre de manera natural, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de origen natural o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo en su estado natural no está "aislado", pero la misma molécula o polipéptido de ácido nucleico separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según el término que se emplea en el presente documento. Como parte del aislamiento o después del mismo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden unirse a otras moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN, para la mutagénesis, para formar genes de fusión y para propagación o expresión en un huésped, por ejemplo. Las moléculas aisladas de ácido nucleico, solas o unidas a otras moléculas de ácido nucleico tales como vectores, pueden introducirse en células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidas en células huésped en cultivo o en organismos completos, dichas moléculas de ADN aún se encontrarían aisladas, según se utiliza el término en el presente documento, dado que no estarían en su forma o entorno natural. De forma similar, las moléculas y polipéptidos de ácido nucleico pueden aparecer en una composición, tales como formulaciones de medio, soluciones para la introducción de polipéptidos o moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones de origen natural, y quedan en las mismas moléculas o polipéptidos aislados de ácido nucleico dentro del significado de ese término empleado en el presente documento.

La invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos en particular descritos en el presente documento, dado que pueden variar. Además, la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, las palabras "comprender", "contener" e "incluir" deben interpretarse de forma inclusiva y no de forma exclusiva.

A menos que se defina otra cosa, toda expresión técnica y científica, y cualquier acrónimo usado en el presente documento, tiene el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica en el campo de la invención. Aunque en la práctica de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen los métodos y materiales preferidos.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes Figuras, Tablas, Ejemplos y la Lista de secuencias, de los cuales pueden tomarse características, realizaciones y ventajas adicionales. Como tales, las modificaciones específicas analizadas no deben interpretarse como limitaciones del alcance de la invención. Será evidente para el experto en la técnica que pueden realizarse diversas equivalencias, cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, y debe entenderse que dichas realizaciones equivalentes se incluyen en el presente documento.

En relación con la presente invención

La Fig. 1 muestra los isocontornos de potencial electrostático de fragmentos estabilizados por enlaces disulfuro de serotipo 1-serotipo 6 y OspA de B. Valaisiana (S1D1-S6D1 y BvaD1), así como el fragmento de OspA de fusión mutante de la invención que consiste en los aminoácidos 125-176 de B. valaisiana, cepa VS116, y los aminoácidos 177-274 de B. garinii,, cepa PBr, con un enlace disulfuro introducido (S3hybD1).

La Fig. 2 muestra el alineamiento de aminoácidos de Lip-S4D1-S3hybD1, la proteína heterodímera que contiene el fragmento de fusión de OspA de serotipo 3 mutante de la invención, con la proteína heterodímera Lip-S4D1-S3D1.

La Fig. 3 muestra esquemáticamente la producción de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes de acuerdo con la presente invención.

La Fig. 4 representa esquemáticamente los componentes polipeptídicos de una composición farmacéutica de la presente invención, una "vacuna de combinación mejorada", que comprende tres heterodímeros de OspA mutantes diferentes, incluyendo Lip-S4D1-S3hybD1.

La Fig. 5 muestra la estructura química de Pam3Cys, un ejemplo de una cisteína sustituida con ácido graso, tal como se encontraría en el extremo N de los polipéptidos lipidados de la presente invención.

La Fig. 6 muestra los títulos de anticuerpos IgG para las proteínas de OspA de Borrelia de serotipo 1-6 que se producen en ratones en respuesta a la inmunización con la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada de la invención.

La Fig. 7 muestra la unión de anticuerpos de ratones inmunizados con la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada de la invención a la superficie celular de espiroquetas de Borrelia de los serotipos 1-6 de OspA.

La tabla 1 compara el rendimiento de purificación del heterodímero Lip-S4D1-S3hybD1 y el heterodímero Lip-S4D1-S3D1.

La tabla 2 muestra la capacidad protectora de la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada de la invención contra a la exposición in vivo con Borrelia de los serotipos 1, 2, 5 y 6 de OspA.

[Las figuras y tablas a las que se puede hacer referencia en la memoria descriptiva se describen a continuación con más detalle.

Fig. 1 Simulación del potencial electrostático de los fragmentos de OspA estabilizados por enlaces disulfuro de los serotipos 1-6 (S1D1-S6D1) y B. valaisiana (BvaD1), así como el fragmento de OspA de fusión estabilizado por enlaces disulfuro (S3hybD1). Los isocontornos (+/- 1 kT/e) tienen un color brillante para las cargas negativas y oscuro para las cargas positivas, como una superficie sólida. La superficie accesible al disolvente se presenta como una representación en malla. Las flechas blancas indican la posición de las dos agrupaciones extensas que dan lugar a la polaridad electrostática en el mismo plano del fragmento de serotipo 3. Se puede observar que las superficies del fragmento C-terminal de OspA híbrido no poseen las agrupaciones polares electrostáticas extensas como el monómero S3D1.

Fig. 2 Alineamiento de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos heterodímeros Lip-S4D1-S3hybD1 y Lip-S4D1-S3D1, que muestra la secuencia consenso. El heterodímero Lip-S4D1-S3hybD1 se diferencia del heterodímero Lip-S4D1-S3D1 en solo 31 aminoácidos en total.

Fig. 3 Producción de un heterodímero de OspA mutante de la invención que comprende dos fragmentos mutantes C-terminal de OspA seleccionados de serotipos diferentes de OspA de Borrelia sp o un fragmento C-terminal de OspA híbrido mutante (A) Representación esquemática de un ácido nucleico que codifica un heterodímero mutante lipidado de OspA. Los componentes, de 5' a 3', comprenden las secuencias codificantes para una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido CSS para la lipidación N-terminal, un fragmento mutante C-terminal de OspA con dos cisteínas no naturales, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento mutante C-terminal de OspA con dos cisteínas no nativas. (B) El polipéptido heterodímero de OspA mutante intermedio comprende el producto naciente directamente después de la traducción de la construcción de ácido nucleico. Desde el extremo N al extremo C, este polipéptido consiste en una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido CSS para lipidación, un fragmento mutante de OspA con un enlace disulfuro no nativo, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento mutante de OspA con un enlace disulfuro no nativo. (C) El polipéptido heterodímero mutante de OspA lipidado final después de la modificación postraduccional. El heterodímero, desde el extremo N al extremo C, consiste en un péptido CSS con la cisteína N-terminal lipidada, un fragmento mutante de OspA estabilizado por un enlace disulfuro, un péptido enlazador (LN1), y un segundo fragmento mutante de OspA estabilizado por un enlace disulfuro. La secuencia señal de lipidación se escinde durante la modificación postraduccional del polipéptido, como se muestra.

Fig. 4 Un ejemplo de una composición farmacéutica preferida de acuerdo con la presente invención. Están presentes en la composición tres heterodímeros mutantes de OspA, comprendiendo cada uno dos fragmentos mutados de OspA seleccionados de serotipos diferentes de OspA de Borrelia o un fragmento C-terminal de OspA mutante híbrido (S3hybD1) están presentes en la composición, y juntos proporcionan antígenos de OspA de seis serotipos diferentes de OspA de Borrelia. Tal composición farmacéutica permite la inmunización simultánea contra seis serotipos de Borrelia.

Fig. 5 Ilustración de la estructura química de PaiTbCys, un ejemplo de una sustitución de ácidos grasos de la cisteína N-terminal de la proteína OspA de tipo salvaje de longitud completa, así como heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA lipidados de la invención. Durante la modificación postraduccional de polipéptidos o proteína OspA de longitud completa de la invención, la secuencia señal de lipidación N-terminal se elimina por escisión y los ácidos grasos, más comúnmente tres restos palmitoílo ("Pam³"), se unen enzimática y covalentemente al residuo de cisteína N-terminal (el átomo de azufre, "S", se indica por medio de una flecha). Los residuos restantes de la cadena de polipéptidos, que están ubicados hacia el extremo C respecto al residuo Pam³Cys se representan por "Xn" (modificado a partir de Bouchon, et al. (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61.)

Fig. 6 Títulos de anticuerpos generados para los seis serotipos de proteínas OspA de longitud completa. Los ratones se inmunizaron tres veces con 3 mg de cada una de las vacunas de combinación indicadas: Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 juntos en una relación 1:1:1 ("combinación de het"); Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3hybD1 y Lip-S5D1-S6D1 juntos en una relación 1:1:1 ("combinación de het mejorada") o con Lip-OspA quimérica de ST1/ST2-His, Lip-OspA quimérica de ST5/ST3-His y Lip-OspA quimérica de ST6/ST4-His juntos en una relación 1:1:1 ("combinación de quimeras") a intervalos de dos semanas y se recogieron los sueros una semana después de la última dosis. Los títulos de anticuerpos IgG para seis serotipos diferentes de proteínas OspA de longitud completa se determinaron mediante ELISA.

Fig. 7 Unión de anticuerpos a partir de ratones inmunizados con respecto a la superficie celular de espiroquetas de Borrelia. Los ratones se inmunizaron como anteriormente y se recogieron los sueros una semana después de la última dosis y agruparon. Se ensayaron diluciones en serie de sueros para determinar la unión a la superficie celular de espiroquetas de Borrelia por medio de tinción celular y citometría de flujo. Los valores de intensidad de fluorescencia observados en la tinción con sueros recogidos de los ratones de control inmunizados con adyuvante de Al(OH⁾³en solitario se extrajeron para estimar la unión no específica. (Las Borrelia usadas en el ensayo de unión fueron: B. burgdorferi, OspA de serotipo 1, cepa N40; B. afzelii, OspA de serotipo 2, cepa "Pko"; B. garinii, OspA de serotipo 3, cepa "Fr"; B. bavariensis, OspA de serotipo 4, cepa Fin; B. garinii OspA de serotipo 5, cepa PHei; B. garinii, OspA de serotipo 6, cepa KL11).

Ejemplos

Ejemplo 1. Modelado molecular del fragmento C-terminal de OspA de serotipo 3 híbrido

Motivación para construir fragmentos C-terminales de ST3 de OspA híbridos

La vacuna de combinación contra la borreliosis de Lyme como se describe en la solicitud previa (documento WO2014/ 006226) está compuesta de tres heterodímeros de OspA mutantes. Se fusionan fragmentos estabilizados cortos de dos serotipos (ST) de OspA diferentes, derivados del dominio C-terminal, con un enlazador corto para formar un heterodímero. Los tres heterodímeros se componen de ST1-ST2, ST4-ST3 y ST5-ST6 de OspA. Para mejorar la inmunogenicidad de los heterodímeros, se añade una secuencia señal para la lipidación en analogía con OspA de longitud completa madura, que es una lipoproteína.

El heterodímero lipidado compuesto de ST4-ST3 de OspA (Lip-S4D1-S3D1; SEQ ID NO: 31) demostró ser menos soluble que los otros dos heterodímeros, lo que da como resultado una baja recuperación durante la purificación. Este problema se puede atribuir principalmente a la porción de ST3 de OspA estabilizada corta, puesto que esta proteína, como un monómero lipidado, no se puede expresar y purificar.

Modelado molecular

Se llevó a cabo in silico una investigación estructural comparativa de los monómeros estabilizados para dilucidar la compatibilidad de los pliegues entre los modelos de monómero en comparación con la estructura cristalina de OspA (PDB:1OSP; Li H, Dunn JJ, Luft BJ, Lawson CL (1997) Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. Proc Natl Acad Sci 94: 3584-3589) y para comparar sus propiedades superficiales con el monómero de tipo ST3. La estructura cristalina representa el serotipo 1 de Borrelia burgdorferi, B31, y muestra OspA unida con su extremo N al anticuerpo murino Fab 184.1. Se construyeron modelos estructurales de homología de los seis monómeros de OspA estabilizados cortos a partir de la estructura cristalina de OspA de ST1 y modelos de homología disponibles (SwissModel; Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Schwede T (2009) The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37: D387-392), que entonces se modificaron para incorporar los enlaces de disulfuro estabilizantes y los cambios de secuencia donde correspondía (The PyMOL Molecular Graphics System, Version Open-Source, Schrodinger LLC).

Se simularon los isocontornos de potencial electrostático de los seis monómeros de OspA estabilizados cortos con la aplicación de cálculo adaptativa de Poisson-Boltzmann (APBS; Baker NA, Sept D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA (2001) Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci 98: 10037-10041, pdb2pqr; Dolinsky ^tJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, et al. (2007) PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res 35: W522-525) para determinar si la proteína de ST3 de OspA estabilizada corta tiene un patrón en la electrostática en la superficie que se desvía de los demás ST de OspA, lo que podría explicar el problema de solubilidad del ST3 de OspA estabilizado corto ("S3D1", Fig. 1). Se observó una polaridad significativa en la distribución de carga en un lado de S3D1 (véanse las flechas), que no se observó en ninguno de los demás ST de OspA estabilizados cortos. También se realizó una simulación del potencial electrostático con OspA estabilizada corta de B. valaisiana ("BvaD1", Fig. 1). El fragmento de OspA BvaD1 presentó una polaridad variable de los isocontornos de potencial electrostático en la superficie, lo que le convirtió en un bloque de construcción candidato potencial para un intercambio segmentario parcial con el objetivo de modificar la superficie global para no mostrar ninguna agrupación extensa significativa de polaridad electrostática extendida como se encuentra en S3D1. Se eligió el enlace preferido entre la parte de serotipo 3 y la parte intercambiada de B. valaisiana en el monómero híbrido para reemplazar la lámina beta N-terminal del monómero y dejar dos láminas beta y la hélice C-terminal de la porción de serotipo 3 intacta, con retención del pliegue global. La última condición depende en gran medida de la compatibilidad estérica de los residuos hidrófobos densamente empaquetados en el núcleo de la molécula. La compatibilidad del pliegue para el modelo del monómero estabilizado híbrido, S3hybD1, se verificó con simulación por mecánica molecular (Gromacs; Pronk S, Pall S, Schulz R, Larsson P, Bjelkmar P, et al. (2013) GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29: 845-854).

Aplicación en forma de heterodímeros que contienen el fragmento de OspA híbrido

Como resultado de las simulaciones del potencial electrostático, se clonó un nuevo heterodímero que contenía la fusión experimental de fragmentos de proteínas OspA de B. valaisiana y B. garinii (S3hybD1, Fig. 1): Lip-S4D1-S3hybD1. Además de los cambios del primer tercio del fragmento de OspA de serotipo 3 en el heterodímero, S4D1-S3hybD1, en comparación con Lip S4D1-S3D1, se introdujo una sustitución de aminoácidos en la posición 233 (P233T, nomenclatura de aminoácidos de acuerdo con la OspA de longitud completa inmadura; SEQ ID NO: 8) de ST3 de OspA.

Como se ilustra en mayor detalle a continuación, este nuevo heterodímero muestra sustancialmente solubilidad mejorada, así como inmunogenicidad contra Borrelia que expresa OspA de serotipo 3 cuando se purifica y usa para inmunizar ratones.

Ejemplo 2. Purificación y formulación de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados Clonación y expresión de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes no marcados con His lipidados

Se optimizó por codones B. valaisiana/B. Garinii,, cepa VS116/PBr, con monómero de OspA de fusión para la expresión en E. coli mediante GeneArt (Alemania). La secuencia señal de lipidación añadida al extremo N-terminal se derivó a partir de la lipoproteína, Lpp, de membrana externa principal de E. coli y se siguió directamente de forma C-terminal por un péptido CSS para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. La construcción heterodímera mejorada se generó fusionando el fragmento de OspA de serotipo 4 mutante y el fragmento de OspA de serotipo 3 híbrido por medio de la secuencia enlazadora "LN1". Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen, EE. UU.) y los heterodímeros estabilizados se expresaron en células BL21(DE3) (Invitrogen, EE. UU.). Las células se recogieron después de 4 h mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70 °C hasta 12 meses antes de su procesamiento adicional.

Purificación de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados

Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S4D1-S3hybD1, se enriquecieron en la fase lipídica mediante separación de fases, usando Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase detergente diluida se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (Q-sepharose; GE Healthcare, Reino Unido) que se hizo funcionar en modo sin unión. El flujo resultante se cargó en una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad) y las proteínas lipidadas se eluyeron de una columna mediante un gradiente de sal lineal. El eluato se sometió a purificación adicional sobre una columna de DEAE-Sepharose (GE Healthcare) en modo sin unión, seguida de columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) para el intercambio de tampón. Se agruparon los picos de heterodímeros de OspA mutantes lipidados basándose en la columna analítica de exclusión por tamaño y SDS-PAGE. Después de la filtración estéril, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta la formulación.

Formulación de la vacuna de combinación

Los estudios con respecto a la formulación de la vacuna de combinación de la invención se llevaron a cabo con para optimizar la estabilidad. Se sometieron a prueba diferentes tipos de tampones y estabilizadores a diversas concentraciones en combinación con hidróxido de aluminio y antígeno, como se describe en la solicitud previa WO2014/006226. Se determinó una formulación óptima de 40 mg/ml de cada uno de los tres heterodímeros (120 mg de proteína total), fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, L-metionina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween 20 (polisorbato 20) al 0,05% e hidróxido de aluminio al 0,15% (p/v) a pH 6,760,2.

Resultados

El heterodímero mejorado, Lip-S4D1-S3hybD1, mostró un rendimiento más alto de aproximadamente 4 veces en términos de mg/g de biomasa, una mejora significativa sobre Lip-S4D1-S3D1. Adicionalmente, se pudo lograr una pureza comparable de la preparación de heterodímero mejorada con una etapa de cromatografía menos. (Véase la tabla 1.)

Tabla 1. Rendimiento mejorado del heterodímero Lip S4D1-S3hybD1 en comparación con Lip-S4D1-S3D1.

Ejemplo 3. Inmunogenicidad de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes lipidados de diferentes serotipos.

Inmunización de ratones

Se usaron ratones C3H/HeN hembra para todos los estudios. Antes de las inmunizaciones, se extrajo sangre de grupos de diez ratones por medio de la vena facial y se prepararon y agruparon los sueros preinmunizados. Se administraron tres inmunizaciones s.c. de 100 ml cada una en intervalos de dos semanas. Cada dosis contenía 1 mg de las proteínas heterodímeras respectivas. Para la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada: Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33); para la vacuna de combinación de heterodímeros de la invención previa: Lip-S1D1-S2D1 (SEQ iD NO: 29), LipS4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 31) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) y para la vacuna de combinación de quimeras: Lip-OspA quimérica de ST1/ST2-His (Seq ID No: 40), Lip-OspA quimérica de ST5/ST3-His (Seq ID No: 41) y Lip-OspA quimérica de ST6/ST4-His (^{s e}Q ID NO: 42). Todas las vacunas de combinación se formularon con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se extrajo sangre de la vena facial y se prepararon sueros inmunizados. En cada experimento, se incluyó un grupo inmunizado con PBS formulada con Al(OH)3 como control negativo (grupo placebo). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".

ELISA para OspA

Se recubrieron placas de ELISA (Maxisorp, Nunc, Dinamarca) con 50 ng (1 mg/ml) de proteína diluida en tampón de recubrimiento (PBS) por pocillo y se incubaron a 4 °C durante 16 a 72 horas. Los antígenos de recubrimiento eran ST-6 de OspA1-6 lipidada de longitud completa marcada con His de forma C-terminal. El tampón de recubrimiento se desechó y se añadieron 100 ml de tampón de bloqueo (BSA al 1 %, Tween-20 al 0,5 %, PBS) y se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Las placas se lavaron tres veces con 300 ml (rebosamiento) de PBST (Tween-20 al 0,1%, PBS). Se realizaron diluciones de cinco veces de los sueros en tampón de bloqueo y se añadieron 50 ml a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 ml (rebosamiento) de PBST. El anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante [HRP], DAKO, Dinamarca) se diluyó 1:2000 en tampón de bloqueo y se añadieron 50 ml a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 ml (rebosamiento) de PBST. Se usó ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), Sigma-Aldrich, EE. UU) como sustrato para HRP, se añadieron 50 ml de ABTS a cada pocillo y se incubó durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 ml de SDS al 1 % y se leyó la absorbancia a 405 nm. Se consideraba una placa como válida cuando la absorbancia del blanco estaba por debajo de 0,1. Una muestra era válida cuando la dilución más baja tenía una absorbancia por encima de 1,0 y la dilución más alta estaba por debajo de 0,1. Cuando se cumplieron estos criterios, se determinó el título semimáximo. El título semimáximo es el recíproco de la dilución que corresponde a la absorbancia media entre las diluciones más alta y más baja.

Citometría de flujo

Se mezclaron espiroquetas (1x106) con un volumen igual de paraformaldehído al 4 % y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos (Nunclon 96U, Nunc). La placa se centrifugó durante 5 minutos a 2000 g y se desechó el sobrenadante. Las células se lavaron con 150 ml de HBSS con BSA al 2 % (HBSS-B), se centrifugaron como anteriormente y el sobrenadante se desechó. Los sueros de ratón se inactivaron con calor incubándolos a 56 °C durante 35 minutos. Los sueros inactivados con calor se diluyeron en HBSS-B y se filtraron de manera estéril mediante centrifugación a 4000 g durante 3 minutos usando filtros de tubo de centrífuga Costar spin-X (0,22 mm, Corning, EE. UU.). Las espiroquetas se disolvieron en 100 ml suero y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se centrifugó durante 15 minutos a 2000 g y se desechó el sobrenadante. Las células se lavaron una vez con 150 ml de HBSS-B y, entonces, se resuspendieron en 100 ml de HBSS-B. Se añadió un microlitro de anticuerpo secundario de (anti-IgG de ratón de cabra conjugado con PE, Beckman Coulter, EE. UU.) a las células y se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos en oscuridad. Las espiroquetas se lavaron una vez con 150 ml de HBSS-B y luego se resuspendieron en 200 ml de HBSS que contenía tinte de ADN SYTO-172.5 mM y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las espiroquetas teñidas se sedimentaron centrifugando durante 5 minutos a 2000 g y posteriormente se resuspendieron en 200 ml de HBSS. Las espiroquetas marcadas se midieron con un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter), seleccionado para eventos positivos a SYTO-17.

Resultados

Se sometieron a prueba dos formulaciones de heterodímeros de OspA ("combinación de het" y "combinación mejorada"), así como una combinación de quimeras de OspA ("combinación de quimeras") para determinar la inmunogenicidad en ratones. Los sueros hiperinmunizados se analizaron mediante ELISA para determinar la reactividad contra OspA de longitud completa (antígeno de recubrimiento), así como para determinar la unión en superficie a cepas deBorrelia que expresan diferentes serotipos (ST1 a ST6) de OspA.

Los resultados de ELISA indicaron que todas las combinaciones de vacuna que estimulan las respuestas de anticuerpos a los seis serotipos de OspA (véase la Fig. 6). Es especialmente digno de destacar con respecto a la presente invención que la vacuna de combinación de heterodímeros de OspA mejorada dio como resultado niveles más altos de anticuerpos específicos para OspA de serotipo 3 en comparación con la vacuna de combinación de heterodímeros de OspA de la invención previa, mientras que se estimularon de forma comparable los niveles de anticuerpos para a otros serotipos de OspA por ambas vacunas.

La unión de anticuerpos a partir de sueros de ratón hiperinmunizados directamente a espiroquetas de borrelia se observó en el caso de Borreliae que expresaban los seis serotipos de OspA (véase la Fig. 7), lo que indica que los anticuerpos generados en respuesta a todos los antígenos son funcionalmente activos y pueden unirse a OspA natural in situ. La intensidad de fluorescencia fue lineal en un amplio intervalo de diluciones de suero. La intensidad de fluorescencia observada en respuesta a la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada para espiroquetas fue comparable a las observadas en respuesta a la vacuna de combinación de heterodímeros y a la vacuna de combinación de quimeras. Notablemente, con respecto a la unión a Borrelia con OspA de serotipo 3, los anticuerpos generados por la inmunización con la vacuna mejorada fueron superiores a la generación de anticuerpos en respuesta a las otras dos vacunas de combinación.

Ejemplo 4. Capacidad protectora de la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada contra la exposición a Borrelia in vivo

Inmunización de ratones

Se usaron ratones C3H/HeN (H-2k) hembra para todos los estudios (Janvier, Francia). Antes de cada exposición, se extrajo sangre de grupos de cinco ratones de 8 semanas de edad por medio de la vena de la cola y se prepararon y agruparon los sueros preinmunizados. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 ml en intervalos de dos semanas a las dosis indicadas en la tabla 2. Tanto la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada como la vacuna de combinación de quimeras incluyeron tres proteínas en una relación 1:1:1 como se describe en el ejemplo 3. Todas las formulaciones incluían hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se extrajo sangre y se prepararon sueros hiperinmunizados. En cada experimento, se incluyó un grupo inyectado con Al(OH)3 en solitario (en el tampón de formulación o PBS) como control negativo y un grupo de ratones inmunizados con la proteína OspA lipidada de longitud completa de tipo salvaje del serotipo de OspA apropiado sirvió como grupo de control positivo (B. Burgdorferi,, cepa B31 (serotipo 1 de OspA, SEQ ID NO: 34), B. afzelii, cepa K78 (serotipo 2 de OspA, SeQ ID NO: 35), B. garinii, cepa PHei (serotipo 5 de OspA, SEQ ID NO: 38) o B. garinii, cepa DK29 (serotipo 6 de OspA, SEQ ID NO: 39)). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".

Exposición por aguja de ratones inmunizados con Borrelia cultivada in vitro

Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se expusieron s.c. con espiroquetas diluidas en 100 ml de medio de crecimiento (BSKII). Para la exposición se usaron B. burgdorferi, cepa ZS7, que expresa el serotipo 1 de OspA (experimentos 1 y 2),B. Garinii,, cepa PHei, que expresa el serotipo 5 de OspA (experimentos 10 a 13) o B. garinii, cepa Ma, que expresa el serotipo 6 de OspA (experimentos 14 a 17). Las dosis de exposición eran dependientes de la cepa y dependientes de la virulencia de las cepas individuales, que se evaluó mediante experimentos de exposición para la determinación de la ID50. Las dosis empleadas para los experimentos de exposición por aguja variaron de 20 a 50 veces la ID50. Antes de cada exposición, se verificó la expresión de OspA mediante citometría de flujo (véase el ejemplo 3). La exposición de los ratones solo se realizó con cultivos donde >80 % de las células fueron positivas para la expresión de OspA.

Exposición de ratones inmunizados con garrapatas infectadas con B. burgdorferi o B. afzelii ("exposición por garrapatas")

Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se expusieron con garrapatas que albergaban B. burgdorferi, cepa Pra4, que expresa el serotipo 1 de OspA (experimento 3), B. burgdorferi, cepa Pral, que expresa el serotipo 1 de OspA (experimentos 4 y 5) o B. afzelii que expresa el serotipo 2 de OspA (experimentos 6 a 9). Para facilitar la infección con garrapatas de los ratones inmunizados, se eliminó el pelo del lomo de cada ratón con crema Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un recipiente pequeño y ventilado a la piel con pegamento instantáneo (Pattex, Alemania). Posteriormente, se aplicaron de dos a tres ninfas por ratón de I. ricinus infectadas con B. burgdorferi, cepa Pral o Pra 4 o B. afzelii, cepa IS1, y se les permitió acoplarse y alimentarse hasta que se dilataron por completo y se cayeron. El estado de la alimentación se controló a diario para cada garrapata individual. En la lectura final solamente se incluyeron los ratones de los que se recogió al menos una garrapata completa o casi completamente alimentada.

Sacrificio de ratones y recolección de material

Cuatro o seis semanas después de la exposición por aguja o garrapatas, respectivamente, se sacrificaron los ratones por dislocación cervical. Se recogió la sangre mediante hemorragia orbital y los sueros finales se prepararon y usaron para VlsE ELISA y/o transferencia Western para determinar el estado de infección. Además, se recogió la vejiga urinaria de cada ratón y se extrajo el ADN y se sometió a PCR cuantitativa (qPCR) para la identificación de Borrelia.

ELISA con la región invariable 6 (IR6) de VlsE

Se usó un péptido 25-mero biotinilado (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) (SEQ ID NO: 59) derivado de la secuencia de la cepa IP90 de B. garinii para el análisis (Liang FT, et al. (1999) J Immunol. 163:5566-73). Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos precubiertas con estreptavidina (Nunc, Dinamarca) con 100 jl/pocillo (1 |jg/ml) de péptido biotinilado en PBS complementado con Tween 20 al 0,1 % (PBS/0,1T). Las placas se incubaron durante una noche a 4 °C. Después del recubrimiento con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1T. Las placas se bloquearon entonces durante una hora a temperatura ambiente (TA) con 100 jl/pocillo de PBS BSA al 2 %, antes del lavado de nuevo con PBS/0,1T. Se evaluó la reactividad después de la exposición (sueros finales) de los sueros al péptido con diluciones de 1:200 y 1:400 en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 minutos a TA antes de lavarlas tres veces con PBS/0,1T. Cada pocillo recibió entonces 50 pl de 1,3 pg/ml de IgG anti-ratón policlonal de conejo conjugada con HRP (Dako, Dinamarca) en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron entonces durante 1 hora a TA. Después de tres lavados con PBS/0,1T, se añadió ABTS (50 pl/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) y se dejó que se desarrollara color durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 405 nm. Todos los sueros se ensayaron por duplicado; los controles negativos incluían PBS en lugar de sueros, así como placas no recubiertas con el péptido. Los sueros de ratones que se mostró que eran positivos por cultivo para la infección por borrelia se usaron como controles positivos.

Extracción y purificación de ADN

La vejiga urinaria de cada ratón se sometió a extracción y purificación de ADN usando el kit DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la siguiente modificación. Cada vejiga urinaria se digirió durante la noche a 60 °C usando 100 ml de proteinasa K recombinante (grado de PCR; 14-22 mg/ml, Roche). El ADN se eluyó en 50 ml de agua desionizada estéril y se almacenó a -20 °C. Como control negativo, cada décima muestra se siguió de una columna de purificación vacía en cada extracción y purificación de ADN.

qPCR dirigida a recA

Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos para el gen recA de manera que pudieran ser usados en qPCR para identificar todas las especies relevantes de Borrelia que causan borreliosis de Lyme (directo: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, SEQ ID NO: 57, inverso: CCCATTTCTCCATCTATCTC, SEQ ID NO: 58). El fragmento de recA se clonó a partir de la cepa N40 de B. burgdorferi s.s. en pET28b(+), para usarse como estándar para cada reacción. El ADN cromosómico extraído de las vejigas urinarias de ratón se diluyó 1:4 en agua para reducir los efectos de matriz observados con el ADN no diluido. Se preparó una mezcla maestra que consistía en 10 pl de SSoAdvanced™ SYBR® Green Supermix, 0,3 pl de cada cebador (10 pm), y 7,4 pl de agua para cada experimento. Se mezclaron dieciocho pl de mezcla maestra con 2 pl del extracto de ADN diluido de cada vejiga urinaria en placas de microtitulación, y se amplificó el ADN usando el sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Se desnaturalizó el ADN durante 3 minutos a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 30 segundos a 55 °C. Después de la amplificación, el ADN se preparó para el análisis de la curva de fusión mediante desnaturalización por 30 segundos a 95 °C seguido de 2 minutos a 55 °C. El análisis de la curva de fusión se realizó mediante una incubación de 5 segundos a 55 °C, con un aumento de 0,5 °C por ciclo, y 5 segundos a 95 °C. En cada placa, se incluyeron cuatro controles no plantilla (NTC), así como una curva estándar por duplicado con las cantidades de copia de plantilla en el intervalo de 10 a 10.000.

Tranferencia Western

La unión de los sueros finales a los lisados de células enteras de borrelia que pertenecen al serotipo de OspA correspondiente se analizó mediante transferencia Western. En resumen, se separaron 2,5 mg de lisado de espiroquetas por sueros de ratón que se iban a analizar mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras usando geles ZOOM de Tris-Glicina al 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia en seco iBlot® (Invitrogen). Después del bloqueo en leche al 5 % durante 1 hora, los sueros finales se añadieron a una dilución de 1:2000 y se incubaron a 4 °C durante la noche. Entonces, las membranas se lavaron tres veces con PBS/0.1T, seguido de una incubación de una hora en anti-IgG de ratón de conejo policlonal conjugado con HRP (Dako) que se había diluido 1:10.000. Las inmunotransferencias se visualizaron con reactivos de detección de transferencias Western ECL Plus™ de Amersham (GE Healthcare) y películas BioMax de Kodak (Kodak).

Lectura de infección

La lectura de infección final se basó en dos métodos separados: detección de la presencia de anticuerpos específicos para Borrelia(transferencia Western y VIsE ELISA) y la presencia de ADN de Borrelia (qPCR dirigida a recA). En los experimentos donde se usó B. burgdorferi, cepa ZS7, para la exposición (experimentos 1 y 2), se aplicaron transferencia Western junto con qPCR. En todos los demás experimentos, se usaron VlsE ELISA y qPCR. Hubo una alta consistencia entre los dos métodos (>95 %); por lo tanto, se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos uno de los dos métodos era positivo. La significación estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher (de dos colas).

Resultados

Se sometió a prueba la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada para determinar su capacidad protectora contra la exposición a Borrelia. Los resultados de estos experimentos se resumen en la tabla 2. Los ratones inmunizados se expusieron con B. burgdorferi s.s. (serotipo 1 de OspA, cepa ZS7, exposición por aguja, experimentos 1 y 2 o cepas Pra1 o Pra 4, exposición por garrapatas, experimentos 3 o 4 y 5, respectivamente), B. afzelii (serotipo 2 de OspA, cepa IS1, exposición por garrapatas, experimentos 6-9), B. garinii (serotipo 5 de OspA, cepa PHei, exposición por aguja, experimentos 10-13) o B. garinii (serotipo 6 de OspA, cepa Ma, exposición por aguja, experimentos 14-17). En algunos experimentos, se incluyeron otros antígenos basados en OspA, tales como la vacuna de combinación de quimeras o una proteína OspA de longitud completa lipidada. Un grupo de ratones inmunizados con PBS o tampón de formulación combinado con Al(OH)3 sirvió de grupo de placebo de control (adyuvante en solitario) en cada experimento.

Los datos de protección de los 17 experimentos se resumen en la tabla 2. En todos los experimentos, se observó un alto nivel de infección en todos los grupos con placebo. Además, se observó una baja tasa de infección en los grupos que recibieron la proteína OspA de longitud completa correspondiente, con la excepción del serotipo 6 de OspA de longitud completa, en el que solo se observó protección parcial (experimentos 14 a 17). Estos resultados validan los métodos de configuración y lectura experimentales.

La vacuna de combinación de heterodímeros mejorada confirió una protección significativa (valores de p <0,05), a una dosis de 3 mg, cuando los ratones se expusieron con B. burgdorferi s.s. o B. garinii (serotipo 5 o 6 de OspA) cultivada in vitro, o garrapatas que albergaban B. burgdorferi o B. afzelii. Además, cuando se evaluaron diferentes dosis de inmunización para determinar la eficacia de la vacuna, sepudo demostrar una protección altamente significativa (valores de p <0,01) cuando se administraron 0,03 mg de la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada y los ratones se expusieron con B. afzelii o B. garinii (serotipo 5 o 6 de OspA) (experimento 8, 9, 12, 13 y 16). En resumen, la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada indujo inmunidad protectora frente a tres especies de Borrelia (B. burgdorferi, B. afzelii y B. garinii), que incluyen cuatro serotipos de OspA clínicamente pertinentes (1, 2, 5 y 6), como se muestra en modelos murinos usando espiroquetas cultivadas in vitro o bien garrapatas infectadas para la exposición.

También se observó protección contra los serotipos 5 y 6 comparable a la conferida por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada en ratones inmunizados con la vacuna de combinación de quimeras (datos no mostrados).

Tabla 2. Capacidad protectora de la vacuna de combinación de heterodímeros de OspA mutantes mejorada de la invención contra la exposición a Borrelia de serotipo 1, serotipo 2, serotipo 5 y serotipo 6 de OspA. Los grupos de ratones se inmunizaron tres veces con dosis indicadas de inmunógeno o adyuvante de Al(OH⁾³en solitario en intervalos de dos semanas. Los inmunógenos usados fueron una combinación 1:1:1 de los heterodímeros de OspA mutantes Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 y Lip-S5D1-S6D1 ("vacuna de combinación de heterodímeros mejorada"), una combinación 1:1:1 de Lip-OspA quimérica de ST1/ST2-His, Lip-OspA quimérica de ST5/ST3-His y Lip-OspA quimérica de ST6/ST4-His ("vacuna de combinación de quimeras") y Lip-OspA1-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de B. burgdorferi, cepa B31) o Lip-OspA2-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de B. afzelii, cepa K78), Lip-OspA5-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de B. garinii, cepa PHei) o Lip-OspA6-His (proteína OspA de longitud completa lipidada de B. garinii, cepa DK29). Los ratones inmunizados se expusieron s.c. dos semanas después de la última inmunización con las especies de borrelia indicadas usando una jeringa (B. burgdorferi, cepa ZS7, B. garinii, cepa PHei, o B. garinii, cepa Ma) o usando garrapatas (B. burgdorferi, cepa Pra1 o Pra4 o B. afzelii, cepa IS1).

A Protección contra la exposición por aguja con Borrelia con OspA de serotipo 1 por la vacuna de combinación de quimeras y la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 |jg)

B Protección contra la exposición por garrapatas con Borrelia con OspA de serotipo 1 por la vacuna de combinación de quimeras y la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 |jg)

C Protección contra la exposición por garrapatas con Borrelia con OspA de serotipo 1 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (dosis decrecientes: 3 |jg y 0,3 |jg)

D Protección contra la exposición por garrapatas con Borrelia con OspA de serotipo 2 por la vacuna de combinación de quimeras y la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 |jg)

E Protección contra la exposición por garrapatas con Borrelia con OspA de serotipo 2 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (dosis decrecientes: 0,03 |jg y 0,003 |jg)

F Protección contra la exposición por aguja con Borrelia con OspA de serotipo 5 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 jg )

G Protección contra la exposición por aguja con Borrelia con OspA de serotipo 5 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 |jg, 0,3 |jg y 0,03 |jg)

H Protección contra la exposición por aguja con Borrelia con OspA de serotipo 6 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 |jg)

I Protección contra la exposición por aguja con Borrelia con OspA de serotipo 6 por la vacuna de combinación de heterodímeros mejorada (una dosis: 3 jg, 0,3 jg y 0,03 jg )

Valor de p; prueba exacta de Fisher, de dos colas, en comparación con el grupo de adyuvante en solitario, se indica entre paréntesis. No significativo (n.s.).

SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1

S3hybD1: fragmento C-terminal de OspA híbrido; aminoácidos de las posiciones 125-176 de Borrelia valaisiana, cepa VS116, y aminoácidos 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr, con enlace disulfuro de tipo 1 y T en la posición 233

FNEKGEVSEKILTRSN GTTLEY S QMTD AENATKAVETLKN GIKLPGNLV GGKTKLTVT CGT V TLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYN RAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 2

B. valaisiana (cepa VS116), OspA, aa 125-176

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGK

SEQ ID NO: 3

B. garinii (cepa PBr, serotipo 3), OspA, aa 177-274, con T en la posición 233, de OspA de longitud completa (SEQ ID NO: 8)

TKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTK ENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

SEQ ID NO: 4

B. valaisiana (cepa VS116), OspA

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLVATVDKVE LKGTSDKNNGSGTLEGVKDDKSKVKLTISDDLGETKLETFKEDGTLVSRKVNFKDKSFTEEK FNEKGEVSEKILTRSN GTTLEYSQMTD AENATKAVETLKN GIKLPGNLV GGKTTLKITEGT VT LSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNP AGNKLEGT AVEIKTLQELKNALK

SEQ ID NO: 5

B. burgdorferi s.s. (cepa B31, serotipo 1 de OspA)

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLE LKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEE KFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLWKEGTVTL SKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDS NGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK

SEQ ID NO: 6

B. afzelii (cepa K78; serotipo 2 de OspA

MKKYLLGIGLILALIACKQNV S SLDEKN S AS VDLPGEMKVL VSKEKDKD GKY SLKAT VDKIE LKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDE MFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGT VTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQK YDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK

SEQ ID NO: 7

B. garinii (cepa PBr, serotipo 3 de OspA) con P en la posición 233 (acceso a embl X80256.1)

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEK FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK

SEQ ID NO: 8

B. garinii (cepa PBr, serotipo 3 de OspA) con T en la posición 233 (acceso a embl ACL34827.1) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEK FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO: 9

B. bavariensis (cepa PBi, serotipo 4 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLE LKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKF NAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTWLS KHIPN S GEITVELND SNSTQ ATKKT GKWD SNTSTLTIS YN SKKTKNIVFTKEDTITV QKYD S AG TNLEGNAVEIKTLDELKNALK SEQ ID NO: 10

B. garinii (cepa PHei, serotipo 5 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLE LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEK FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 11

B. garinii (cepa DK29, serotipo 6 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLE LKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEK FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTW LSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 12

B. garinii (cepa T25, serotipo 7 de OspA)

MKKYLLGIGLILALIACKQNY S SLDEKN S V S YDLPGEMKVLV SKEKDKDGKY SLEATVDKLE LKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEE KFNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTV TLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYN T AGTKLEGSP AEIKDLEALKAALK SEQ ID NO: 13

Señal de lipidación de ospA de Borrelia

MKKYLLGIGLILALIA SEQ ID NO: 14

Señal de lipidación de ospB de Borrelia

MRLLIGFALALALIG SEQ ID NO: 15

Señal de lipidación de lpp de E. coli

MKATKLVLGAVILGSTLLAG SEQ ID NO: 16

Enlazador peptídico LN1 construido a partir de dos regiones bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B.

burgdorferi s.s. cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, intercambio de aminoácidos en la posición 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS SEQ ID NO: 17

Secuencia de tipo hLFA-1 de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (serotipo 1 de OspA)

GYVLEGTLTAE SEQ ID NO: 18

Secuencia de tipo no hLFA-1 de B. afzelii, cepa K78 (serotipo 2 de OspA)

NFTLEGKVAND SEQ ID NO: 19

B. burgdorferi s.s. (cepa B31, serotipo 1), OspA, aa 126-273, con secuencia de tipo hLFA reemplazada de OspA de serotipo 1

FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLS KNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEIKNALK SEQ ID NO: 20

B. afzelii (cepa K78, serotipo 2), OspA, aa 126-273 FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYD SAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK SEQ ID NO: 21

B. garinii (cepa PBr, serotipo 3), OspA, aa 126-274 FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO: 22

B.bavariensis (cepa PBi, serotipo 4), OspA, aa 126-273 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTWLS KHIPN S GEITVELND SNSTQ ATKKT GKWD SNTSTLTIS VN SKKTKNIVFTKEDTITV QKYD S AG TNLEGNAVEIKTLDELKNALK SEQ ID NO: 23

B. garinii (cepa PHei, serotipo 5), OspA, aa 126-273 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 24

B. garinii (cepa DK29, serotipo 6), OspA, aa 126-274 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTW LSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 25

B. garinii (cepa T25, serotipo 7) OspA, aa 126-274 FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVT LSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNT AGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK

SEQ ID NO: 26

Lip-S4D1-S3hybD1-nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímero intermedias y finales de serotipo 4 de OspA y serotipo 3 de OspA con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación de lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, fragmento de OspA de serotipo 3 que comprende los aminoácidos 125-176 de B. valaisiana, cepa VS116, (s Eq ID NO: 2) y los aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 3)

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGG CACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCC TGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGT GCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGA ACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCC AC GCT GAC C ATTT C AGT C AACT C GAAAAAGACC AAAAAT ATT GT GTT C ACGAAGGAAGAT ACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGA AATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATG

GCTCT GGT AGC AAAGAGAAAAAC AAAGAT GGC AAGT ACT C ATT C AAC GAAAAAGGC GAA GTGAGCGAAAAAATTCTGACCCGTAGCAATGGCACCACCCTGGAATATAGCCAGATGAC CGATGCAGAAAATGCAACCAAAGCAGTTGAAACCCTGAAAAACGGTATTAAACTGCCTG GTAATCTGGTTGGTGGTAAAACCAAACTGACCGTTACCTGTGGCACCGTTACCCTGAGCA AAAACATTAGCAAAAGCGGTGAAATTACCGTGGCACTGAATGATACCGAAACCACACCG GCAGACAAAAAAACCGGTGAATGGAAAAGCGATACCAGCACCCTGACCATTAGTAAAAA TAGCCAGAAAACAAAACAGCTGGTGTTTACCAAAGAAAACACCATTACCGTGCAGAATT AT AACCGT GC AGGTAAT GCACT GGAAGGT AGTCCGGCAGAAATT AAAGAT CT GGC AGAA CTGTGTGCAGCCCTGAAATAA

SEQ ID NO: 27

Lip-S4D1-S3hybD1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de serotipo 4 de OspA y serotipo 3 de OspA, que comprende los aminoácidos 125-176 de B. valaisiana, cepa VS116, (SEQ ID NO: 2) y los aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 3), con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal

LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCG TWLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQK YDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKILTRS N GTTLEY S QMTD AENATKAVETLKN GIKLPGNLV GGKTKLTVTCGTVTLSKNISKS GEITVAL NDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKD LAELCAALK

SEQ ID NO: 28

Lip-S1D1-S2D1-nt: Secuencia codificante para las proteínas de fusión de heterodímero intermedias y finales de serotipo 1 de OspA y serotipo 2 de OspA con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación de lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de serotipo 1 de OspA, reemplazada por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGG CACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTC TGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTGGTGAAA TGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTG AAT GATACCGAC AGCT CT GCGGCC ACC AAGAAAACCGCAGCTT GGAACT C AGGCACCT C GACGCTGACCATTACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAA AC ACCAT C ACGGT GCAGC AAT AT GAC AGCAAT GGT ACC AAACT GGAAGGCTCCGCT GT G GAAAT C AC GAAACT GGAT GAA AT CTGT AAT GCTCT GAAAGGT ACTAGT GAC AAAAAC AA TGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCG AACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATG AAAAGCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAA AGTCGCC AAT GAC AAAGT C ACCCT GGAAGT GAAAT GCGGC ACCGTT ACGCT GT C AAAAG AAATT GC AAAATCGGGT GAAGT GACCGTT GCT CT GAACGAT ACGAAT ACC ACGC AAGCG ACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAG CAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACG ACAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTG TGTAACGCCCTGAAA

SEQ ID NO: 29

Lip-S1D1-S2D1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de serotipo 1 de OspA y serotipo 2 de OspA con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de serotipo 1 de OspA, reemplazada por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal

LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCG TYTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITYNSKKTKDLVFTKENTITVQ QYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTR ENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVA LNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIK TLDELCNALK

SEQ ID NO: 30

Lip-S4D1-S3D1-nt: Secuencia codificante para las proteínas de fusión de heterodímero intermedias y finales de los serotipos 4 y 3 de OspA, ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación de lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGG CACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCC TGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTGAAGGTGACGT GCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGA ACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCC ACGCT GACC ATTT CAGT C AACT CGAAAAAGACCAAAAAT ATT GT GTT C ACGAAGGAAGAT ACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGA AAT CAAAACCCT GGAT GAACT GT GTAACGC CCT GAAGGGT ACTAGT GAC AAAAAC AAT G GCT CT GGTAGCAAAGAGAAAAAC AAAGAT GGCAAGTACT C ATTTAACGAT AAGGGC AAA CTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAA AAACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCC TGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAA AAC ATT AGC AAGT CT GGT GAAAT C ACGGTCGC ACT GAAT GAT ACCGAAACC ACGCCGGCT GACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAACTC GC AGAAACCGAAGC AACT GGT CTT CACC AAAGAAAAC ACGAT C ACCGT GC AGAACT AT A ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGT GTGCGGCACTGAAA

SEQ ID NO: 31

Lip-S4D1-S3D1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de los serotipos 4 y 3 de OspA, ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCG

TWLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISYNSKKTKNIVFTKEDTITVQK YDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTR ANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVAL NDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLYFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKD LAELCAALK

SEQ ID NO: 32

Lip-S5D1-S6D1-nt: Secuencia codificante para las proteínas de fusión de heterodímero intermedias y finales de los serotipos 6 de OspA, ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación de lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1

ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGT TGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGG CACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTC TGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTG ACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCC CT GGAT GAC ACCGAT AGCT CT GGC AACA AAAAGAGCGGTACCT GGGATT C AGGCACCT C GACGCTGACCATTTCTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAG AT ACGAT CACCGT GC AAAACT AT GAC AGCGC AGGTACC AAT CT GGAAGGCAAAGCT GT G GAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAA T GGCT CT GGTAGCAAAGAGAAAAAC AAAGATGGCAAGTACT C ATT CAACGGCAAAGGT G AAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATT AAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTAC CCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAA AAAAC ATT CT GAAGTCGGGT GAAAT C ACCGC AGCT CT GGAT GAC AGCGATACC ACGCGT GCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAA CTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTA TGACAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAAC TGTGTAATGCTCTGAAA

SEQ ID NO: 33

Lip-S5D1-S6D1-aa: Proteína de fusión de heterodímero de los serotipos 6 de OspA, ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal

LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTC

GTVTLSKNISKS GEITVALDDTD S S GNKKS GT WD S GTSTLTISBCNRTKTKQLVFTKEDTITV QN YDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRA NGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTWLSKNILKSGEITAALD D SDTTRATKKT GKWD SKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTIT V QRYD S AGTNLEGKAVEITTL KELCNALK

SEQ ID NO: 34

B. burgdorferí (cepa B31, serotipo 1 de OspA), aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSG VLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKII TRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTD S S AATKKTAAWNSGT STLTITVN SKKTKDLVFTKENTITVQQ YD SN GTKLEGS AVEIT KLDEIKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 35

B. afzelii (cepa K78, serotipo 2 de OspA), aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSG

VLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKT MTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEV T VALNDTNTT Q ATKKT GAWD SKTSTLTIS VNSKKTT QLVFTKQDTITV QKYD S AGTNLEGT A VEIKTLDELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 36

B. garinii (cepa PBr, serotipo 3 de OspA), aa 18-274, secuencia señal de lipidación de Ipp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSG VLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKW TRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITV ALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEI KDLAELKAALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 37

B. bavariensis (cepa PBi, serotipo 4 de OspA), aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSG TLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILR ANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTWLSKHIPNSGEITVELN D SNST Q ATKKT GKWD SNTSTLTIS VN SKKTKNIVFTKEDTIT Y QKYD S AGTNLEGNAVEIKTL DELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 38

B. garinii (cepa PHei, serotipo 5 de OspA), aa 18-273, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKÑSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSG TLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVR

SEQ ID NO: 39

B. garinii (cepa DK29, serotipo 6 de OspA), aa 18-274, secuencia señal de lipidación de lpp eliminada (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marca His C-terminal (LEHHHHHH), CSSF N-terminal para la adición de lípidos

CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSG TLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIV RANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITAA LDD SDTTRATKKT GKWD SKTSTLTIS VN S QKTKNLVFTKEDTITV QRYD S AGTNLEGKAVEIT TLKELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 40

OspA quimérica de serotipo 1/serotipo 2, lipidación N-terminal, marcada con His, incluyendo la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento

MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGKYDLIATVDKLELKG TSDKNNGSGVLEGVKTNKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFN EKGEVSEKIITMADGTRLEYTGIKSDGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSM NISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAG TNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH

SEQ ID NO: 41

OspA quimérica de serotipo 5/serotipo 3, lipidación N-terminal, marcada con His, incluyendo la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKNGKYSLMATVEKLELKG TSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNE KGEISEKTIVMANGTRLEYTDIKSDKTGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSM NISKSGEITYALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLYFTKENTITVQNYNRAGN ALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 42

OspA quimérica de serotipo 6/serotipo 4, lipidación N-terminal, marcada con His, incluyendo la secuencia señal de lipidación de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) que se escinde durante el procesamiento MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKNGKYSLEATVDKLELKG TSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIADDLSQTKFEIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNE KGETSEKTIVMANGTRLEYTDIKSDGSGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSM NILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGT NLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 43

S1D1

FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLS KNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEICNALK SEQ ID NO: 44

S2D1

FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYD SAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK SEQ ID NO: 45

S3D1

FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNR AGNALEGSPAETKDLAELCAALK SEQ ID NO: 46

S4D1

FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTWLS KHIPN S GEITVELND SNSTQ ATKKT GKWD SNTSTLTIS VN SKKTKNIVFTKEDTITV QKYD S AG TNLEGNAVEIKTLDELCNALK SEQ ID NO: 47

S5D1

FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEGKAVEITTLKELCNALK SEQ ID NO: 48

S6D1

FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTW LSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDS AGTNLEGKAVEITTLKELCNALK SEQ ID NO: 49

S3HYBD1 (BVA)

FNEKGE V S EKILTRSN GTTLE Y S QMTD AENATKAVETLKN GIKLP GNL V GGKTKLT VT C GT V TLSKMSKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYN RAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK SEQ ID NO: 50

BVAD1

FNEKGEVSEKILTRSN GTTLEYSQMTD AENATKAVETLKN GIKLPGNLV GGKTTLKITCGT VT LSKHIAKS GEVTVEINDTS STPNTKKT GKWD ARN STLTIIVD SKNKTKLVFTKQDTITV Q S YNP AGNKLEGT AVEIKTLQELCNALK SEQ ID NO: 51

S3hybD1 (Bsp): fragmento C-terminal de OspA híbrido; aminoácidos 126-175 de Borrelia spielmanii y aminoácidos 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr, con enlace disulfuro de tipo 1 y T en la posición 233 FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKTKLTVTCGTVTLS KNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRA GNALEGSPAEIKDLAELCAALK SEQ ID NO: 52

MSPD1

FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKATLTVKCGTVTL SKNIDKS GEVTVALNDTD STAATKKT GA WD SKTSTLTITVN SKKTKDLVFTKQDTITV QKYD SAGTTLEGSAVEIKTLDELCNALK SEQ ID NO: 53

Cebador directo para el espaciador intergénico 16S-23S

GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG SEQ ID NO: 54

Cebador inverso para el espaciador intergénico 16S-23S

GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG SEQ ID NO: 55

Cebador anidado directo para el espaciador intergénico 16S-23S

AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG SEQ ID NO: 56

Cebador inverso anidado para el espaciador intergénico 16S-23S

GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA SEQ ID NO: 57

Cebador directo para el gen RecA de Borrelia

CATGCTCTTGATCCTGTTTA SEQ ID NO: 58

Cebador inverso para el gen RecA de Borrelia

CCCATTTCTCCATCTATCTC SEQ ID NO: 59

Péptido 25 mero de la región invariable 6 (IR6) de VlsE

MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK

SEQ ID NO: 60

Catelina de ratón RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE SEQ ID NO: 61

Péptido KLK

KLKLLLLLKLK SEQ ID NO: 62

Péptido N-terminal para la lipidación

CKQN SEQ ID NO: 63

5'-(dIdC)13-3'

dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende un fragmento de OspA C-terminal híbrido (proteína A de la superficie externa de Borrelia), en el que el fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, desde la dirección N- a la C-terminal, en i) una primera porción de OspA que consiste en los aminoácidos 125-176 o 126-175 de OspA de una cepa de Borrelia que no sea el fragmento correspondiente de B. garinii, cepa PBr, con la SEQ ID NO: 8 y ii) una segunda porción de OspA que consiste en

- los aminoácidos 176-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) o

- los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) o

- los aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, (SEQ ID NO: 8) con una sustitución del residuo de treonina en el aminoácido 233 con un residuo de prolina,

en el que el segundo fragmento de OspA es mutante y está estabilizado por cistina en tanto que difiere de la secuencia de tipo salvaje correspondiente al menos en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 182 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en la sustitución del aminoácido de tipo salvaje en la posición 269 /- 3 de la SEQ ID NO: 8 en una cisteína y en el que está presente un enlace disulfuro entre la cisteína en la posición 182 /- 3 y la cisteína en la posición 269 / -3 de dicho segundo fragmento de OspA; y en el que la numeración de los aminoácidos y de las sustituciones de cisteína es de acuerdo con la numeración de los aminoácidos correspondientes de la OspA de longitud completa de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un segundo fragmento de OspA C-terminal, en el que dicho segundo fragmento de OspA C-terminal es una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, que difieren de la secuencia de OspA de tipo salvaje correspondiente al menos en la sustitución del aminoácido en la posición 182 de la secuencia de tipo salvaje con una cisteína y en la sustitución del aminoácido en la posición 269 de la secuencia de tipo salvaje con una cisteína, y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, más preferiblemente al menos el 90 %, incluso más preferiblemente al menos el 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias con las SEQ ID NO: 19 a 25, en el que las cisteínas no se reemplazan.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2

i) en el que el polipéptido está lipidado o en el que el polipéptido comprende una señal de lipidación, preferiblemente la señal de lipidación de lpp derivada de E. coli MKATKLVLGAVILGSTLLAG (S^eQ ID NO: 15); y/o

ii) en el que el polipéptido comprende un péptido del sitio para la lipidación liderado por un residuo de cisteína N-terminal como un sitio para la lipidación, preferiblemente CSS; y/o

iii) en el que el polipéptido comprende un enlazador entre el fragmento de OspA C-terminal híbrido y el segundo fragmento de OspA C-terminal, particularmente en el que dicho enlazador comprende GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16).

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido consiste en el heterodímero de la SEQ ID NO: 27 (Lip-S4D1-S3hybD1).

5. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, particularmente un ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 26, en el que dicho ácido nucleico está opcionalmente comprendido en un vector.

6. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha célula huésped es preferiblemente E. coli.

7. Un método para producir el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por las siguientes etapas:

a) introducir un vector que codifica el polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 en una célula huésped,

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido,

c) homogeneizar dicha célula huésped, y

d) someter el homogenado de la célula huésped a etapas de purificación.

8. Una composición farmacéutica que comprende

(i) el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5; y

(ii) opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica que comprende la proteína heterodímera de la SEQ ID NO: 29 (LipS1D1-S2D1), la proteína heterodímera de la S^eQ ID NO: 27 (Lip-S4D1-S3hybD1) y la proteína heterodímera de la SEQ iD NO: 33 (Lip-S5D1-S6D1).

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en la que el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende L-metionina.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende adicionalmente al menos un antígeno adicional de Borrelia.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada por que comprende adicionalmente una sustancia inmunoestimulante, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODN), especialmente oligo(dIdC⁾¹³(SEQ ID NO: 63), péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61), compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, adyuvantes completos o incompletos de Freund o combinaciones de los mismos.

13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en la que dicha composición farmacéutica es una vacuna.

14. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para su uso como un medicamento, particularmente como una vacuna.

15. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.

16. Un kit que comprende la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 y una segunda composición, en el que la segunda composición comprende al menos un antígeno adicional y/o un adyuvante.