BR122023024315A2

BR122023024315A2 - Polipeptídeo contendo fragmentos mutantes de ospa e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR122023024315A2
Application number: BR122023024315-3A
Authority: BR
Inventors: Urban Lundberg; Wolfgang Schüler
Original assignee: Valneva Austria Gmbh
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2015-01-09
Publication date: 2023-12-26
Also published as: SI3092246T1; US20160333056A1; CA2931110A1; BR112016015678B1; EP3564257A1; AU2015205520B2; WO2015104396A1; HUE043779T2; TR201910117T4; EP3092246B1; AU2015205520A1; NZ721015A; EP3092246A1; PL3092246T3; LT3092246T; CN105980398A; DK3092246T3; CN105980398B; ES2740985T3; US20230322869A1

Abstract

polipeptídeo contendo fragmentos mutantes de ospa e composição farmacêutica. a presente invenção refere-se a composições e métodos para a prevenção e tratamento de infecção por borrelia. particularmente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um fragmento híbrido c-terminal de uma proteína da superfície externa a (ospa), um ácido nucleico que codifica o mesmo, um anticorpo que se liga especificamente ao mesmo, uma composição farmacêutica (particularmente para utilização como um medicamento ou em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por borrelia) que compreende o polipeptídeo e/ou o ácido nucleico e/ou o anticorpo, um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por borrelia e um método de imunização de um indivíduo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a composições e métodos para a prevenção e tratamento de infecção por Borrelia. Particularmente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um fragmento híbrido C-terminal de uma proteína da superfície externa A (OspA), um ácido nucleico que codifica o mesmo, um anticorpo que se liga especificamente ao mesmo, uma composição farmacêutica (particularmente para utilização como um medicamento ou em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia) que compreende o polipeptídeo e/ou o ácido nucleico e/ou o anticorpo, um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia e um método de imunização de um sujeito.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Borreliose de Lyme, ou doença de Lyme, é a doença transmitida por carrapatos mais comumente relatada na Europa e América do Norte. A doença é causada por infecção com a espiroqueta gram-negativa semelhante transmitida por artrópodes, borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sl), e pode envolver vários órgãos ou tecidos, resultando em distúrbios epiteliais, cardíacos, músculo- esqueléticos e neurológicos. Na maioria dos países, borreliose de Lyme não é uma doença de notificação obrigatória; portanto, os dados exatos sobre taxas de incidência anuais não estão disponíveis. Nos Estados Unidos, o agente causador é o B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi ss) e borreliose de Lyme é localizada estados do nordeste, centro-atlântico e estados do norte central. Em 2010, um total de cerca de 30.000 casos de borreliose de Lyme foram relatados para o Centro de Controle de Doenças e Prevenção (CDC). Um relatório atualizado pelo CDC em 2013, que leva em conta dados de diagnóstico de outras fontes, estima que o número real de novos casos por ano nos Estados Unidos está mais perto de 300.000 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html). Na Europa, B. afzelii e B.gariniisão os principais agentes causadores da borreliose de Lyme, bem como B. burgdorferi s.s e B. bavariensis, o que contribui, em menor grau, dependendo da localização geográfica. A prevalência de borreliose de Lyme varia consideravelmente em diferentes países europeus, com um aumento da prevalência global de oeste para leste. Em grande parte da Europa, o número de casos notificados de borreliose de Lyme tem aumentado desde o início de 1990 (por exemplo, na República Tcheca, Estônia, Lituânia; ver borreliose de Lyme na Europa, relatório da OMS de 2006), e a distribuição geográfica dos casos tem também se expandido.

[003] Borrelia pertence à família Spirochaetaceae, que é subdividida nos gêneros medicamente importantes Treponema, Leptospira e Borrelia. B. burgdorferi s.l. é uma bactéria gram-negativa em forma de espiral, vigorosamente móvel, de cerca de 10-20 µm de comprimento e 0,2-0,5 m de largura, que cresce em condições microaerofílicas. A parede celular das espiroquetas consiste de uma membrana citoplasmática rodeado por peptidoglicanos e vários flagelos e, em seguida, por uma membrana externa fracamente associada.

[004] Borreliose de Lyme geralmente ocorre em fases caracterizadas por diferentes manifestações clínicas, com remissões e exacerbações. Estágio 1, infecção precoce, consiste de uma infecção localizada da pele, seguida após dias ou semanas do estágio 2, infecção disseminada e meses ou anos mais tarde por estágio 3, a infecção persistente. No entanto, a infecção é variável; alguns pacientes têm apenas as infecções da pele localizada, enquanto outros mostram manifestações tardias da doença, tais como artrite. Síndromes clínicas diferentes da borreliose de Lyme também são causadas por infecção com diversas espécies s.l. de B. burgdorferi. B. burgdorferi mais frequentemente provoca manifestações articulares (artrite) e problemas cardíacos, B. afzelii provoca sintomas principalmente dérmicos (eritema migratório; EM e acrodermatite crônica atrofiante; ACA), enquanto B.gariniiestá implicada na maioria dos casos de neuroborreliose.

[005] Infecção localizada - O sintoma mais comum da fase 1 de uma infecção é eritema migratório, que ocorre em 70-80% das pessoas infectadas. Esta lesão de pele é geralmente seguida por sintomas semelhantes aos da gripe, como mialgia, artralgia, dor de cabeça e febre. Estes sintomas não específicos ocorrem em 50% dos doentes com eritema migratório.

[006] Infecção disseminada - Durante a fase 2, as bactérias se move para a corrente sanguínea, a partir do local da infecção para tecidos e órgãos distais. Sintomas neurológicos, cardiovasculares e de artrite que ocorrem nesta fase incluem meningite, neuropatia craniana e artrite inflamatória intermitente.

[007] A infecção persistente - Fase 3 da infecção é crônica e ocorre de meses a anos após a picada do carrapato. O sintoma mais comum na América do Norte é artrite reumatoide, causada por uma infecção com s.s. B. burgdorferi. A infecção persistente do sistema nervoso central com B.garinii provoca sintomas neurológicos mais graves durante a fase 3, e uma infecção persistente da pele com B. afzelii resulta em acrodermatite crônica atrofiante.

[008] Em alguns grupos de risco, como agricultores, trabalhadores florestais, pessoas que fazem trilhas, corredores ou veranistas, a soroprevalência e as taxas de incidência da doença tem aumentado, bem como em crianças com menos de 15 anos de idade e adultos entre 39 e 59 anos, sem predileção por sexo. Este aumento da incidência de borreliose de Lyme está ligada a mudanças nos habitats florestais, bem como fatores sociais. As mudanças ambientais, tais como a fragmentação da floresta, levaram a uma redução acentuada de predadores de roedores, tais como raposas e aves de rapina, que por sua vez levou a um aumento da população de ratos, com um consequente aumento da população de carrapatos. Mais recentemente, arborização desigual tem aumentado o número de veados e, portanto, o número de carrapatos de veados. A expansão para o subúrbio e o uso crescente das zonas florestais para recreação, como acampamento e caminhadas fez com que seres humanos entrassem em maior contato com um maior número de vetores do carrapato Borrelia. Todos esses fatores juntos têm contribuído para uma distribuição mais ampla de Borrelia e uma maior incidência de borreliose de Lyme.

[009] Agentes antimicrobianos são o princípio método de tratamento para infecção com Borrelia. O antibiótico usado depende da fase da doença, sintomas e alergias do paciente à medicação. A duração do tratamento com antibiótico depende também da fase da doença e da gravidade dos sintomas. Borreliose de Lyme inicial é tipicamente tratada com tetraciclinas orais, tais como, doxiciclina e penicilinas semissintéticas, tais como amoxicilina ou penicilina V. Doenças artríticas e neurológicas são tratados com altas doses de penicilina G ou ceftriaxona intravenosa. Até 30% dos pacientes com borreliose de Lyme não apresentam os sintomas característicos da infecção inicial por Borrelia, o que torna o diagnóstico e o tratamento problemáticos. O tratamento com antibiótico pode ser longo (até vários meses) e, por vezes, ineficaz e é, portanto, debatido no campo da Borrelia, especialmente durante o estágio tardio da doença. Mesmo no caso de um tratamento eficaz para Borrelia, os pacientes podem ser deixadas com fadiga debilitante, dor ou sintomas neurológicos por anos após o tratamento, ao que se refere como síndrome doença de Lyme post-tratamento. Em geral, a utilização de antibióticos pode ter consequências indesejáveis, tais como o desenvolvimento de resistência por parte dos micro-organismos alvo. Finalmente, a terapia antibiótica pode curar eficazmente borreliose de Lyme, mas não fornece nenhuma proteção contra infecções posteriores.

[0010] Uma vacina baseada em OspA sorotipo 1 monovalente (LYMErixTM) foi aprovada e comercializada nos EUA para a prevenção da doença de Lyme causada por borrelia burgdorferi s.s, mas a vacina já não está disponível. Além disso, a heterogeneidade nas sequências OspA em diferentes sorotipos na Europa e em outros lugares impede uma proteção eficaz com uma vacina com base em OspA a partir de apenas um único sorotipo.

[0011] Moléculas de OspA quiméricas compreendem a porção proximal de um sorotipo de OspA, em conjunto com a porção distal de outro sorotipo de OspA, ao mesmo tempo em que retém as propriedades antigênicas de ambos os polipeptídeos parentais, pode ser utilizada na prevenção e tratamento de doenças ou borreliose de Lyme (WO2011/143617, WO2011/143623).

[0012] Atualmente, não há nenhum medicamento preventivo para a borreliose de Lyme no mercado e, assim, existe uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de tal medicamento que pode proporcionar proteção eficaz contra Borrelia que está presentes nos EUA, Europa e em outros países, especialmente o desenvolvimento de um medicamento que pode proporcionar proteção eficaz contra vários sorotipos de Borrelia simultaneamente. O sorotipo 3, OspA que contém o heterodímero, Lip-S4D1-S3hybD1, da presente invenção é melhor do que nosso heterodímero previamente descrito, Lip-S4D1-S3D1 (veja WO2014/006226), no que respeito tanto a facilidade de produção quanto ao estímulo de anticorpos específicos, tal como medido por ligação do da superfície do anticorpo ao sorotipo 3 de espiroquetas Borrelia. Além disso, a qualidade mais específica da resposta imune ao novo heterodímero indica que a potência é também superior, em comparação com o heterodímero previamente descrito.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um fragmento híbrido de superfície externa A (OspA) da proteína de Borrelia, um ácido nucleico que codifica a mesma, um vetor que compreende tal molécula de ácido nucleico e uma célula hospedeira que compreende tal vetor. Além disso, a invenção proporciona um processo para produzir tal polipeptídeo e um processo para produzir uma célula que expressa esse polipeptídeo. Além disso, a presente invenção proporciona anticorpos que se ligam especificamente a esse polipeptídeo, uma célula de hibridoma que produz esses anticorpos, métodos para produção de tais anticorpos, uma composição farmacêutica que compreende esse polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vetor ou anticorpo, a utilização de tal polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vetor ou anticorpo para a preparação de um medicamento ou de uma composição farmacêutica (particularmente para utilização como uma vacina ou em um método de tratamento ou na prevenção de uma infecção por Borrelia), os métodos para o diagnóstico, métodos para o tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia e métodos de imunização de um sujeito. Em particular, a invenção refere-se a um polipeptídeo melhorado para a imunização contra o sorotipo 3 da Borrelia, em que o polipeptídeo é mais favorável para a purificação e induz uma resposta imunitária mais específica para Borrelia tal como avaliado pela ligação à superfície de Borrelia quando comparado com o do sorotipo 3 de OspA que contém o construto revelado no nosso anterior pedido WO2014/006226.

[0014] Os esforços para desenvolver uma vacina de subunidade para a prevenção da borreliose de Lyme focam, em grande parte, na utilização de proteína A (OspA) superfície exterior borrelial como um antígeno. A proteína OspA é expressa por Borrelia apenas quando está no intestino do vetor do carrapato. Assim, os anticorpos de OspA produzidos pela vacinação não combatem a infecção no corpo, mas sim entram no intestino do carrapato quando este toma uma refeição de sangue. Ali, os anticorpos neutralizam as espiroquetas e bloqueiam a migração de bactérias a partir do intestino médio das glândulas salivares do carrapato, o percurso através do qual Borrelia entra no hospedeiro vertebrado. Assim, anticorpos específicos para OspA evitam a transmissão de Borrelia a partir do vetor carrapato para o hospedeiro humano.

[0015] A forma lipidada de OspA a partir B. burgdorferi s.s., cepa ZS7, em conjunto com hidróxido de alumínio foi desenvolvida comercialmente como uma vacina contra Borrelia (LYMErixTM) Pela SmithKline Beecham, agora GlaxoSmithKline (GSK) para o mercado americano. Três doses de LYMErixTM ao longo de um período de um ano eram necessários para uma ótima proteção. Após as primeiras duas doses, a eficácia da vacina contra a Borreliose de Lyme foi de 49% e após a terceira dose foi de 76%. No entanto, pouco depois de LYMErixTM se tornar comercialmente disponível, foi retirada do mercado em 2002. As razões citadas foram questões de aplicação prática da vacina, por exemplo, a necessidade de injeções de reforço a cada ano ou a cada dois anos, bem como o custo relativamente elevado desta abordagem preventiva em comparação com o tratamento antibiótico da infecção inicial. Além disso, havia a preocupação de que LYMErixTM poderia desencadear reações autoimunes em um subgrupo da população devido à homologia de sequências com uma proteína humana, embora isto nunca tenha sido provado. Além disso, a proteção cruzada contra outras espécies clinicamente importantes da Borrelianão era fornecida por esta vacina.

[0016] Por conseguinte, em uma modalidade, foi um objetivo da presente invenção proporcionar uma vacina melhorada, por exemplo, para a prevenção da borreliose de Lyme. De preferência, a vacina é ao mesmo tempo facilmente produzida e protetora, segura e mais eficaz do que as terapias existentes e/ou fornece proteção contra mais do que uma espécie de Borrelia. Além disso, é bem conhecido na técnica que pacientes diferentes respondem de forma diferente a diferentes composições de vacina. Portanto, em qualquer caso, seria uma vantagem distinta ter-se vacinas alternativas disponíveis como opções adicionais de vacinação contra Borrelia.

[0017] O problema subjacente a presente invenção é resolvido por um polipeptídeo que compreende um fragmento de OspA C-terminal híbrido, em que o fragmento híbrido consiste de um domínio C-terminal de uma proteína OspA de Borrelia que é composto de um fragmento derivado de uma proteína OspA de uma cepa diferente de Borrelia garinii B., cepa PBr, e um segundo fragmento de OspA de B. garinii, cepa PBr, e difere da correspondente sequência de tipo selvagem por pela introdução de, pelo menos, uma ligação de dissulfeto.

[0018] Surpreendentemente, a introdução do referido fragmento híbrido C-terminal de OspA que compreende uma sequência de B. valaisiana, Coe VS116, fundido com uma sequência de OspA sorotipo 3 (B.garinii, cepa PBR), com uma ligação de dissulfeto introduzida, resultou em uma proteína heterodimérica (Lip-S4D1-S3hybD1) que é mais fácil de purificar e estimulou uma resposta imunitária mais específica de OspA sorotipo 3 do que o heterodímero Lip-S4D1-S3D1 da nosso anterior invenção (WO2014/006226). Como mostrado nos Exemplos, o fragmento C-terminal OspA de sorotipo 3 híbrido da presente invenção tem um potencial de isocontorno eletrostático previsto que é mais semelhante ao de outros fragmentos de OspA provenientes de outros sorotipos do que o fragmento de sorotipo 3 de OspA. Por outro lado, o heterodímero que contém o fragmento C- terminal OspA de sorotipo 3 (Lip-S4D1-S3hybD1) é mais fácil de purificar, necessitando de menos etapas para se obter um rendimento muito mais elevado do que o heterodímero Lip-S4D1-S3D1 da invenção anterior. Além disso, embora os títulos de anticorpos observados fossem semelhantes, os anticorpos estimulados pela vacina de combinação heterodímero melhorada ligam-se mais especificamente a Borrelia que expressa sorotipo 3 de OspA em comparação com a vacina de combinação de heterodímero da invenção anterior. Finalmente, a capacidade de proteção in vivo da vacina de combinação de heterodímero melhorada foi alta contra os quatro sorotipos de Borrelia testados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] Em conformidade, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um fragmento C- terminal híbrido de uma proteína da superfície externa A (OspA), em que o referido fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste de uma fusão do domínio C-terminal de duas cepas diferentes de OspA de Borrelia e difere do fragmento correspondente de tipo selvagem, pelo menos, pela introdução de pelo menos uma ligação de dissulfeto, por exemplo, uma cisteína. Em particular, o fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste de uma fusão de aminoácidos das proteínas OspA de uma cepa diferente B. garinii, cepa PBr, por exemplo, B. valaisiana, Tensão VS116, ou B. spielmanii; com aminoácidos da proteína OspA de B. garinii, cepa PBr, com a introdução de pelo menos uma ligação de dissulfeto (cisteína). Especificamente, o polipeptídeo compreende fragmento de OspA (a proteína A da superfície externa de Borrelia) C- terminal híbrido, em que o fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, a partir da direção N- para C-terminal de i) uma primeira porção de OspA que consiste em aminoácidos 125-176 ou aminoácidos 126-175 da OspA de uma cepa de Borrelia que não é o fragmento correspondente de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8, e ii) uma segunda porção de OspA que consiste nos aminoácidos 177-274 ou os aminoácidos 176-274, (mas mais preferencialmente os aminoácidos 177-274), de OspA a partir de B.garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8), em que a segunda porção é de OspA mutante e estabilizada com cisteína, na medida em que difere da correspondente sequência de tipo selvagem, pelo menos, pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 182 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 269 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e em que uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 do dito segundo fragmento de OspA está presente; e em que a numeração dos aminoácidos e as substituições de cisteína é de acordo com a numeração de aminoácidos correspondentes do comprimento completo da OspA de B. burgdorferi s.s., da cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

[0020] Alternativamente, o polipeptídeo compreende um fragmento híbrido C-terminal de OspA, em que o fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, a partir da direção N- para C-terminal, de i) um primeiro fragmento de OspA (também referido como uma primeira porção de OspA) constituído pelos aminoácidos 125-176 ou os aminoácidos 126-175 de OspA de uma cepa de Borrelia que não é a do fragmento correspondente de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8 e ii) um segundo fragmento de OspA (também referida como uma segunda porção de OspA) que consiste nos aminoácidos 177-274 de OspA a partir de B.garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8), em que o segundo fragmento de OspA difere da correspondente sequência de tipo selvagem pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 182 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 269 da SEQ ID NO: 8 e em que uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 do dito segundo fragmento de OspA está presente; e em que a numeração das substituições de cisteína é de acordo com a numeração dos aminoácidos correspondentes do OspA de comprimento total de B. burgdorferi ss, da cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

[0021] Verificou-se que um polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser produzido facilmente e de forma eficaz (ver Exemplo 2). A sua produção resultou em um aumento de rendimento em comparação com produtos conhecidos (ver Exemplo 2). A imunização com um polipeptídeo, de acordo com a invenção produziu níveis mais elevados de anticorpos específicos para a proteína OspA na sua forma nativa e é, portanto, uma vacina melhorada (veja-se Exemplo 3). Além disso, forneceu proteção contra o desafio da Borrelia in vivo (ver Exemplo 4).

[0022] Borreliaé um gênero de bactérias do filo espiroquetas. Isso faz com que borreliose, uma doença zoonótica vetorial, transmitida principalmente por carrapatos e, em alguns casos, por piolhos, dependendo da espécie. Atualmente, existem 36 espécies conhecidas de Borrelia. Dos 36 espécies conhecidas de Borrelia, 13 dessas espécies são conhecidos por causar a doença de Lyme ou borreliose e são transmitidas por carrapatos. As principais espécies de Borrelia que causam a doença de Lyme são Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, e Borrelia garinii. O termo B. burgdorferi s.l engloba, pelo menos, 13 espécies de Borrelia (Tabela A-1). Estas espécies ocorrem em diferentes regiões geográficas, e vivem na natureza em ciclos enzoóticos que envolvem carrapatos do complexo Ixodes ricinus (também chamado de complexo Ixodes persulcatus) e uma grande variedade de hospedeiros animais. Quatro espécies de Borreliasão responsáveis pela maioria das infecções em seres humanos: B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. bavariensis e B.garinii. Três outras espécies, B. lusitaniae, B. bissettii e B. spielmanii, têm sido ocasionalmente detectadas em seres humanos, mas o pape; destas na borreliose de Lyme é incerto no momento. Novas espécies de Borrelia ainda estão sendo identificados. Tabela A-1.

[0023] Como detalhado acima, proteína de superfície externa A (OspA) da Borreliaé uma lipoproteína imunogênica abundante da Borrelia de particular interesse devido ao seu potencial como um candidato para vacina. OspA de B. burgdorferi s.l. é uma lipoproteína de base que tem uma massa molecular de aproximadamente 30 kDa e é codificada em um plasmídeo linear. Um aspecto importante da proteína OspA é a sua lipidação N-terminal; isto é, ácidos gordos com um comprimento de cadeia entre C14 e C19, com ou sem ligações duplas estão ligados a o resíduo de cisteína N-terminal, uma característica que melhora a imunogenicidade da proteína OspA. Tem sido demonstrado que os peptídeos sintéticos fracamente imunogênicos induzem respostas de anticorpo mais fortes quando lipidados; por exemplo, quando ligado de forma covalente a Pam3Cys (Bessler e Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), uma substituição de ácido gordo encontrado no terminal amino de muitas lipoproteínas bacterianas que são sintetizadas com uma sequência de sinal que especifica ligação de lipídios. Além disso, mostrou-se que a meação Pam3 Cys aumenta as respostas imunitárias para OspA em camundongos, parcialmente através da sua interação com TLR-2/1 (Yoder, et al. (2003) Infection and Immunity 71: 3.894-3.900). Portanto, esperar-se-ia que a lipidação de um fragmento C-terminal de OspA melhore a imunogenicidade e capacidade protetora do fragmento.

[0024] Análise de isolados de B. burgdorferi s.l obtido na América do Norte e na Europa revelou que OspA possui variabilidade antigênica e que vários grupos distintos podem ser definidos com base na sorologia. mAbs anti-OspA que se ligam a determinantes antigênicos N- e C-terminais foram relatados. A cristalografia de raio-X e análise de NMR foram usadas para identificar os domínios hipervariáveis imunologicamente importantes em OspA e mapearam o epítopo LA-2 para os aminoácidos 203-257 do C-terminal (Ding et al., Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). Estudos anteriores têm mostrado que a produção de anticorpos contra o epítopo C-terminal de LA-2 se correlaciona com a imunidade protetora após a vacinação com OspA (Van Hoecke et al. Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 e Steere et al., N Engl J Med (1998) 339:209-215). Mostrou-se que os anticorpos para LA-2 bloqueiam a transmissão de Borrelia do carrapato para o hospedeiro (Golde et al., Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Estes estudos sugeriram que a porção C-terminal da proteína OspA pode ser suficiente para induzir imunidade protetora. Deve notar-se que a sequência da porção C- terminal de OspA é menos altamente conservada entre sorotipos de Borrelia do que a porção N-terminal (ver figura 1).

[0025] Com base nas informações dos estudos descritos acima, juntamente com outros, as formas truncadas de OspA, que compreendem a porção de terminal-C (também referidas neste documento como "fragmento de OspA" ou "monômero") foram usadas na invenção anterior (WO2014/006226). Provou-se que as formas truncadas de OspA são menos protetoras do que a proteína OspA de comprimento completo. Surpreendentemente, no entanto, verificou-se no âmbito da invenção anterior que a introdução de uma ligação de dissulfeto na forma truncada (a qual também se refere neste documento como "fragmento mutante de OspA", "fragmento de OspA com cisteína estabilizada", ou "fragmento mutante" ou "fragmento de com cisteína estabilizada") supera essa desvantagem. Embora não estando limitado a um mecanismo específico, pensa-se que a melhoria da proteção é devido a um aumento da estabilidade do fragmento de OspA, como se mostra em ensaios que medem a estabilidade térmica.

[0026] De acordo com a invenção anterior, o fragmento de OspA mutante (também referido na presente invenção como segundo fragmento de OspA) pode ser derivado de qualquer espécie de Borrelia ; No entanto, devido à sua prevalência no campo da medicina, em especial para seres humanos, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis e B.gariniisão preferidos. De acordo com a presente invenção, a primeira porção de OspA a de qualquer cepa de Borrelia exceto B. garinii, cepa PBr e a segunda porção é de B. garinii, cepa PBr. Portanto, o fragmento de OspA híbrido é derivado de uma fusão de aminoácidos de OspA de B. garinii, cepa PBr com aminoácidos de OspA de qualquer espécie de Borreliaespécies, exceto B. garinii, cepa PBr (e, por conseguinte, uma sequência de aminoácidos diferente daquela dos aminoácidos de OspA de B. garinii, cepa PBr), particularmente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, e B. bavariensis, especialmente B. valaisiana, cepa VS116. A primeira porção de OspA consiste de aminoácidos 125176 ou os aminoácidos 126-175 da OspA de uma cepa de Borrelia que não é o fragmento correspondente de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8, e a segunda porção de OspA consiste de aminoácidos 176274 ou, mais preferencialmente, aminoácidos 177-274 de OspA de B.garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8), em que a segunda porção é de OspA mutante e estabilizada com cisteína, na medida em que difere da correspondente sequência de tipo selvagem, pelo menos, pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 182 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 269 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e em que uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 do dito segundo fragmento de OspA está presente; e em que a numeração dos aminoácidos e as substituições de cisteína são de acordo com a numeração de aminoácidos correspondentes do comprimento completo da OspA de B. burgdorferi s.s., da cepa B31 (SEQ ID NO: 5). No entanto, as mutações adicionais em relação às porções de tipo selvagem podem estar presentes nas primeira e segunda porções, de acordo com a invenção (ver também abaixo). Em uma modalidade preferida, as substituições acima com cisteína nas posições 182 e 269 são as únicas mutações em relação ao tipo selvagem. Alternativamente, os aminoácidos 177-274 estabilizados com cisteína de Borrelia garinii, cepa PBr difere daqueles pela substituição do resíduo de treonina no aminoácido 233 da OspA de tipo selvagem de Borrelia garinii, cepa PBr, com apenas um resíduo de prolina.

[0027] Os exemplos preferidos de polipeptídeos compreendem - um fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste dos aminoácidos 125-176 da B. Valaisiana, cepa VS116 e os aminoácidos estabilizados com cisteína 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 1), ou - um fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste nos aminoácidos 126-175 da B. spielmanii e os aminoácidos 177-274 estabilizados com cisteína de Borrelia garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 51).

[0028] Portanto, em uma modalidade preferida da invenção, o polipeptídeo compreende ou consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o polipeptídeo compreende ou consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.

[0029] Em uma modalidade da presente invenção, a segunda porção de OspA é idêntica aos aminoácidos 177-274 estabilizado com cisteína de Borrelia garinii, de cepa PBr, mas difere dos mesmos pela substituição do resíduo treonina no aminoácido 233 da OspA de tipo selvagem de Borrelia garinii, cepa PBr, com um resíduo de prolina (SEQ ID NO: 7).

[0030] As quatro espécies de Borrelia B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis e B.garinii podem ainda ser classificadas de acordo com os sorotipos de OspA, que foram determinados por análise com anticorpos monoclonais específicos para a respectiva proteína OspA. Sorotipos 17, que representam a maioria das infecções de humanos por Borrelia, juntamente com as suas taxas de prevalência, estão mostrados na Tabela A-2 abaixo. Tabela A-2. Designação sorotipo e prevalência de B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis e B.garinii. Borrelia isoladas a partir de fluido cerebrospinal humano ou pele ou a partir de vetores carrapatos foram sorotipadas por sondagem de lisados de células inteiras com anticorpos monoclonais de camundongos, cada um específico para um epítopo particular de OspA (como descrito por Wilske et al., J. de Clin Microbiol (1993) 31 (2): 340-350 e apresentado por Baxter Bioscience em "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases", Brussels, 06 de fevereiro de 2009).

[0031] A estrutura da proteína OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31 foi determinada por Li et al. (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). É composto de N-terminal (a-cepas 1 a 4)e ß-camadas centrais (a- cepas 5 a 14n [parte N-terminal]), uma camada de barril 1 (a -cepas 14c [parte C-terminal] a 16), camada de barril 2 (a -cepas 17 a 21) e uma a- hélice de C-terminal. O termo "fragmento de OspA C-terminal" ou "domínio C-terminal de OspA" ou "domínio C-terminal" ou "fragmento de tipo selvagem" ou "porção C-terminal" com respeito a OspA, como utilizado ao longo do presente relatório descritivo deve significar a sequência de aminoácidos C-terminal de OspA, isto é,OspA na qual falta, pelo menos, ß-camadas de N-terminal(incluindo a-fitas 1 a 4). Em OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31, a camada de N-terminal consiste dos aminoácidos 17-70 (após a clivagem pós-tradução do peptídeo de sinal de lipidação longa de 16 aminoácidos).

[0032] O fragmento C-terminal de OspA da presente invenção pode também incluir uma sequência de sinal de lipidação na extremidade N- terminal, por exemplo, a sequência de sinal de lipidação de aminoácidos 1 a 16 de OspA (SEQ ID NO: 13) ou OspB (SEQ ID NO: 14) de B. burgdorferi s.s cepa B31, uma sequência de sinal de lipidação de E. coli, referida neste documento como o "sinal de lipidação LPP" (SEQ ID NO: 15), ou qualquer outra sequência de sinal, por exemplo, tal como definido abaixo.

[0033] Lipidação de uma proteína com uma sequência de sinal de lipidação N-terminal, tais como aquelas presentes em um polipeptídeo de OspA nascente, ocorre no vetor de expressão de E. coli pela ação passo a passo das enzimas transferase de diacilgliceril, peptidase II e transacilase de sinal, respectivamente. O primeiro passo é a transferência de um diacilglicerídeo ao grupo sulfidril de cisteína da pró- lipoproteína não modificada, seguida por clivagem do peptídeo de sinal pela peptidase II de sinal e, finalmente, a acilação do grupo p-amina da cisteína N-terminal da apolipoproteína. O resultado é a colocação de um lipídio e um grupo de glicerol com dois outros lipídios ligados no resíduo de cisteína N-terminal do polipeptídeo. A sequência de sinal de lipidação, que é clivada durante a lipidação, não está presente na sequência de polipeptídeo final.

[0034] Os polipeptídeos são moléculas biológicas das cadeias de monômeros de aminoácidos ligados por ligações peptídicas (amida). As ligações químicas covalentes são formadas quando o grupo carboxil de um aminoácido reage com o grupo amina de outro. Os polipeptídeos da presente invenção são cadeias de aminoácidos contínuas e não ramificadas. O polipeptídeo da presente invenção compreende uma ligação de cisteína. De acordo com a presente invenção, o fragmento de OspA mutante pode ser uma proteína lipidada, também lipoproteína, em que as frações lipídicas, juntamente com o grupo de glicerol, também referido como "Lip". De acordo com a invenção, Lip compreende de um a três lipídios, tais como C14-20 alquilo e/ou C14-20 alquenil ligado a um glicerol e um grupo amina da cisteína N-terminal do polipeptídeo da invenção ou, de preferência, em que Lip é uma porção de fórmula (I) abaixo, em que um de R1, R2 ou R3 é C14-C20 alquilo ou alquenil e cada um dos outros, independentemente, é C14-C20 alquilo ou C14-C20 alquenil e X é uma sequência de aminoácidos ligada ao resíduo de cisteína representado na Fórmula (I). Mais preferivelmente, Lip mais cisteína N- terminal do polipeptídeo é N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi) propil cisteína (aqui referida como "Pam3Cis ") e está ligada através do carbonil C da cisteína a referida sequência de aminoácidos da invenção. Na fórmula (I) acima, R1, R2 e R3 seriam frações de palmitoil e X é uma sequência de aminoácidos ligada ao resíduo de cisteína.

[0035] De acordo com a presente invenção, ao domínio C-terminal de uma OspA pode faltar pelo menos o domínio homólogo N-terminal para os aminoácidos 17-70 de OspA de B. burgdorferi ss, cepa B31. Além disso, ao domínio C-terminal de OspA, de acordo com a presente invenção, também pode também faltar outras porções da camada central, como definido por Li e colegas de trabalho (Li et al., supra), em particular mais fios, tais como as porções de aminoácidos do aminoácido 17 e 82, 93, 105, 118 ou 119, preferencialmente 17-129, mais preferencialmente de 1 a 124, 1-125, 1 a 129 ou 1 a 130 de qualquer Borrelia, particularmente B. burgdorferi s.s., da cepa B31, ou porções homólogas de uma proteína OspA de uma Borrelia sp. outra que não seja B. burgdorferi s.s., cepa B31.

[0036] No contexto da presente invenção, o domínio C-terminal de OspA é também referido como "fragmento de OspA" ou "fragmento de OspA".

[0037] O "fragmento de OspA C-terminal mutante" ou "fragmento mutante" ou "fragmento de OspA mutante" no contexto do polipeptídeo da presente invenção e tal como utilizado ao longo do presente relatório descritivo devem significar o fragmento C-terminal de OspA, tal como definido acima e neste documento, o qual difere do fragmento do tipo selvagem pelo menos por pelo menos duas cisteínas introduzidas que podem formar uma ligação de dissulfeto; ou seja, uma cisteína. Sem estar preso a esta teoria, supõe-se que a ponte de dissulfeto estabiliza o fragmento em uma conformação favorável para a indução da ligação ao anticorpo. A dobra do fragmento do tipo selvagem C-terminal de OspA mostra estabilidade de temperatura reduzida, em comparação com a proteína de comprimento completo (Koide et al., Projeto baseado na estrutura de uma vacina de segunda geração para doença de Lyme baseado em um fragmento C-terminal de Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350: 290-299). Para a presente invenção, a sequência do domínio C-terminal da B. burgdorferi ss, cepa B31 de OspA foi analisada in silico para determinar as posições de pontes dissulfeto introduzidas que podem aumentar a estabilidade da dobra deste domínio C-terminal. Os resultados da análise foram transferidos para fragmentos de OspA homólogos de outras espécies de Borrelia com a suposição de que a dobra está conservada em todas as espécies.

[0038] A "fragmento de OspA C-terminal híbrido"ou "fragmento híbrido"ou "fragmento de OspA híbrido"no contexto do polipeptídeo da presente invenção, e tal como utilizado ao longo do presente relatório descritivo, deve significar o fragmento C-terminal de OspA, tal como definido acima e neste documento, o qual difere do fragmento do tipo selvagem em que a) o fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste de uma fusão de aminoácidos a partir de uma primeira proteína OspA de uma cepa diferente de B. garinii, cepa PBr, por exemplo. B. valaisiana, cepa VS116, ou B. spielmanii (Referida como primeira porção de OspA); com os aminoácidos de uma segunda proteína de OspA de B. garinii, cepa PBr, com a introdução de pelo menos uma ligação de dissulfeto (cisteína) (referida como segunda porção de OspA) e, opcionalmente, uma ou mais mutações; e b) as, pelo menos, duas cisteínas introduzidas no fragmento de OspA C-terminal híbrido formam uma ligação de dissulfeto, ou seja, um cisteína e em que as referidas cisteínas introduzidas são introduzidas tal como descrito neste documento e de acordo com os ensinamentos da WO2014/006226; e em que o fragmento de OspA C-terminal híbrido de OspA em um fragmento naturalmente dobrado, tal como medido, por exemplo, pela eficiência de ligação dos anticorpos resultantes da vacinação por este fragmento de OspA C-terminal híbrido em, por exemplo, camundongos para o antígeno do sorotipo 3 de Borrelia, por exemplo, através do teste da ligação dos referidos anticorpos (obtidos após três imunizações) à superfície do sorotipo 3 de Borrelia por citometria de fluxo, por exemplo, como descrito nos Exemplos.

[0039] Tipicamente, a ligação dissulfeto pode ser introduzida através da introdução de um ou mais, de preferência dois, resíduos de cisteína, em que uma ligação de dissulfeto (ponte S-S) é formada entre os grupos tiol de dois resíduos de cisteína que formam a cisteína de aminoácido. Necessita-se apenas um que resíduo de cisteína seja introduzido se uma ponte de dissulfeto é formada com um resíduo de cisteína presente no fragmento de OspA de tipo selvagem. As duas cisteínas são introduzidas por substituição de aminoácidos. As substituições são a) na posição 182 do aminoácido do tipo selvagem de sequência de aminoácidos de OspA relevante por uma cisteína e b) na posição 269 do aminoácido do tipo selvagem de sequência de aminoácidos de OspA relevante por uma cisteína e em que um ponte de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 do referido fragmento de OspA está presente formando-se assim uma cisteína. A numeração das substituições de cisteína é de acordo com a numeração dos aminoácidos correspondentes do OspA de comprimento total de B. burgdorferi ss, da cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

[0040] O fragmento de OspA mutante ou híbrido pode também compreender outras mutações em relação ao tipo selvagem. Como detalhado acima, a estrutura e o domínio de superfície de OspA são conhecidos na técnica. Por conseguinte, o fragmento mutante pode compreender mais mutações, particularmente em locais que não estão sobre a superfície da proteína e/ou que não estão envolvidos na resposta imune e, por conseguinte, não impactam na capacidade antigênica. Estes podem incluir um ou mais deleção de aminoácido(s), deleções particularmente pequenas (por exemplo,até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos), uma ou mais adições de aminoácidos(s) (em particular C ou N-terminal), ácido uma ou mais substituições de aminoácidos, particularmente uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas. De preferência, o número de novas mutações na primeira e segunda porção em relação ao respectivo tipo selvagem é no máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, mais preferencialmente 3 ou 2 e especialmente 1. Mais preferencialmente ainda a(s) mutação(ões) é/são apenas na segunda parte de OspA. Mutações preferenciais são substituições, particularmente as substituições conservativas. Exemplos de substituições conservativas de aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, aquelas listados abaixo:

[0041] Mutações preferenciais incluem alterações em porções selecionadas do fragmento, por exemplo, em que a sequência de sequência semelhante ao antígeno associado à função de leucócito humano (hLFA-1), que existe em B. burgdorferi s.s. for modificado, por exemplo, substituído por uma sequência homóloga de uma proteína OspA de outra Borrelia sp. A razão para esta modificação é reduzir o risco de indução de reação cruzada imunológica com proteínas humanas. Outra mutação preferida é a substituição de uma prolina pela treonina na posição 233 na sequência de polipeptídeo de OspA de B.garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8). Também é possível a adição de uma sequência de sinal de lipidação no fragmento final ou em um intermediário, ou a adição de uma proteína marcadora (por exemplo, para a identificação ou purificação).

[0042] Em algumas modalidades, o fragmento de OspA mutante ou híbrido tem uma sequência de aminoácidos que tem 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com o fragmento de tipo selvagem. Em uma outra modalidade, a sequência difere em não mais de 10%, no máximo 9%, no máximo 8%, no máximo 7%, no máximo, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, mais preferencialmente no máximo 1 %, devido a uma adição de sequência, deleção ou substituição.

[0043] Identidade, tal como é conhecido na técnica e tal como utilizado neste documento, é a relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos, tal como determinado por comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequências entre sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas, conforme o caso, como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. A identidade pode ser facilmente calculada. Embora existam diversos métodos para medir a identidade entre dois polinucleotídeos ou duas sequências de polipeptídeos, o termo é bem conhecido por aqueles versados na técnica (por exemplo Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Os métodos preferenciais para determinar identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programas GCG (Devereux, J. et al., 1984), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. et al., 1990).

[0044] Em contraste com o fragmento de OspA mutante ou híbrido, o "fragmento de tipo selvagem" ou "fragmento de OspA de tipo selvagem ", no contexto da presente invenção refere-se a um fragmento de uma OspA que ocorre naturalmente de Borrelia. O fragmento de tipo selvagem é obtido por deleções de N-terminais, mas não compreende deleções internas (exceto a partir de sequências de sinal, tal como detalhado neste documento) ou mutações. Em relação ao fragmento de OspA híbrido ou mutante, o fragmento do tipo selvagem consiste de uma peça idêntica de OspA (comprimento idêntico e mesma cepa de OspA, etc.) e difere apenas na(s) alteração(ões) detalhadas acima.

Os polipeptídeos da invenção

[0045] Um polipeptídeo é um polímero de linha única de aminoácidos ligados por ligações peptídicas, em alguns casos também por ligações de dissulfeto. De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo pode também compreender uma ou mais modificações pós-tradução; isto é, um grupo funcional bioquímico anexado, tal como um acetato, fosfato, lipídios ou carboidrato ligado, de preferência um lipídio ou lipídios ligado(s) à cisteína N-terminal, juntamente com um glicerol, mais preferivelmente de 1 a 3 C14-C20 frações de alquilo ou alquenil, ainda mais preferencialmente 1 a 3 grupos de palmitoil, mais preferencialmente três grupos de palmitoil (Pam3).

[0046] O polipeptídeo da presente invenção é tal como definido acima e compreende ou consiste de um fragmento de OspA C-terminal híbrido, em que o fragmento de OspA C-terminal híbrido consiste, da direção N- para C-terminal, de i) uma primeira porção de OspA que consiste em aminoácidos de uma primeira parte de C-terminal de OspA a de uma cepa de Borrelia que não é o fragmento correspondente de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8 e começa em uma posição de cerca de 125 ou 126 e termina na posição 175 ou 176; e ii) uma segunda porção de OspA que consiste de uma segunda parte de C- terminal de OspA que continuamente segue a primeira parte C-terminal (por exemplo, se a primeira parte C-terminal termina na posição 175, a segunda parte C-terminal continua na posição 176; ou se a primeira parte C-terminal termina na posição 176, a segunda parte C-terminal continua nas posições 177 e assim por diante, no entanto, também é possível que um ou dois ou mais, até 10 aminoácidos posam ser eliminados na área de fusão das 2 partes C- terminais, por exemplo, e ainda mais preferencialmente, se a primeira parte C-terminal terminar na posição 175, a segunda parte C-terminal continua na posição 177), em que o segundo fragmento de OspA difere da correspondente sequência de tipo selvagem pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 182 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 269 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e em que uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 do dito segundo fragmento de OspA está presente formando uma cisteína (também referido como "fragmento de OspA estabilizado com cisteína"); e em que a numeração das substituições de cisteína é de acordo com a numeração dos aminoácidos correspondentes do OspA de comprimento total de B. burgdorferi s.s., da cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

[0047] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo compreende ou consiste em um fragmento de OspA C- terminal híbrido que consiste dos aminoácidos 125-176 da B. Valaisiana, cepa VS116 e os aminoácidos estabilizados com cisteína 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 1).

[0048] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo compreende ou consiste do fragmento de OspA C-terminal híbrido que consiste de aminoácidos 126-175 de B. spielmanii e aminoácidos 177-274 estabilizados com cisteína de Borrelia garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 51).

[0049] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo é como definido neste documento, e em que a segunda porção de OspA é idêntica aos aminoácidos 177-274 estabilizado com cisteína de Borrelia garinii, cepa PBr, mas difere dos mesmos apenas pela substituição do resíduo treonina no aminoácido 233 da OspA de tipo selvagem da Borrelia garinii, cepa PBr, com um resíduo de prolina.

[0050] Os polipeptídeos da invenção, como definido acima, e ainda mais tal como definido neste documento fornecem títulos de anticorpos em animais imunizados, em que os referidos anticorpos demonstram uma melhor ligação aos seus respectivos antígenos in situ quando comparado aos polipeptídeos relevantes da técnica anterior (por exemplo, tal como definido em WO2014/006226). Preferencialmente, um polipeptídeo que compreende o fragmento de OspA C-terminal híbrido da invenção causa pelo menos um aumento de dobra de 1,5 vezes, de preferência pelo menos um aumento de 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos um aumento de 3 vezes, ainda mais preferencialmente, pelo menos, um aumento de 4 vezes de dobra, ainda mais preferencialmente, pelo menos, um aumento de 5 vezes, mais de preferência, pelo menos, um aumento de 10 vezes de dobra na intensidade da fluorescência, medido por citometria de fluxo e causado por anticorpos produzidos após três imunizações com o polipeptídeo em camundongos por ligação à superfície do sorotipo 3 de Borrelia, em comparação com a intensidade de fluorescência causada por anticorpos produzidos contra um polipeptídeo que compreende um domínio C- terminal de uma proteína OspA de Borrelia que difere da sequência de tipo selvagem de OspA correspondente por, pelo menos, a adição de pelo menos uma ligação de cisteína, mais preferivelmente a proteína heterodimérica Lip-S4D1-S3D1, tal como definido pela SEQ ID NO: 31, particularmente em que o aumento pode ser determinado como descrito no Exemplo 3.

[0051] Além disso, em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo da invenção, tal como definido acima e neste documento pode ser produzido em rendimentos mais elevados, com processos padrão e requer menos etapas de purificação quando comparado com os polipeptídeos relevantes da técnica anterior (por exemplo, tal como definido na WO2014/006226). Preferencialmente, um polipeptídeo que compreende o fragmento híbrido C-terminal de OspA da presente invenção apresenta pelo menos um aumento de 1,5 vezes, de preferência, pelo menos, um aumento de 2 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, um aumento de 3 vezes, ainda mais preferencialmente, pelo menos, um aumento de 4 vezes de dobra, ainda mais preferencialmente, pelo menos, um aumento de 5 vezes, mais de preferência, pelo menos, um aumento de 10 vezes no rendimento de produção, medido em miligramas por grama de biomassa, em comparação com um polipeptídeo que compreende um domínio C- terminal de uma proteína OspA da Borrelia que difere da sequência de tipo selvagem de OspA correspondente por, pelo menos, a adição de pelo menos uma ligação de cisteína, mais preferencialmente a proteína heterodimérica Lip-S4D1-S3D1, tal como definido pela SEQ ID NO: 31, particularmente em que o aumento pode ser determinado como descrito no Exemplo 2.

[0052] Preferencialmente, um polipeptídeo que compreende o fragmento de OspA C-terminal híbrido da invenção requer menos etapas de purificação do que um polipeptídeo que compreende um domínio C-terminal de uma proteína OspA de Borrelia que difere da sequência de tipo selvagem de OspA correspondente por, pelo menos, a adição de pelo menos uma ligação de cisteína, mais preferivelmente a proteína heterodimérica Lip-S4D1-S3D1, tal como definido pela SEQ ID NO: 31; mais especificamente, exige, pelo menos, um passo de cromatografia a menos.

[0053] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo compreende a) um fragmento de OspA C-terminal híbrido, tal como definido acima e neste documento, e b) um fragmento de OspA mutante.

[0054] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo da invenção compreende a) um fragmento de OspA C- terminal híbrido, conforme definido neste documento, e o fragmento b) um segundo OspA, onde disse a OspA fragmento é C-terminal, que consiste em um domínio C-terminal de uma proteína OspA de Borrelia e é mutante e estabilizado com cisteína, em que difere da sequência OspA de tipo selvagem correspondente pelo menos pela substituição do aminoácido na posição 182 da sequência de tipo selvagem por uma cisteína e a substituição do aminoácido na posição 269 da sequência de tipo selvagem por uma cisteína e onde uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 182 e a cisteína na posição 269 da OspA deste fragmento está presente; e além disso, em que tal fragmento de OspA mutante começa na posição 123, 124 ou 125 e termina na posição 273 ou 274; e, além disso, em que a numeração dos aminoácidos e das substituições de cisteína é de acordo com a numeração dos aminoácidos correspondentes da OspA de comprimento completo da B. burgdorferi, cepa B31 s.s. (SEQ ID não: 5). Em uma modalidade da presente invenção, o segundo fragmento de OspA pode ser qualquer um dos fragmentos C-terminal mutantes de OspA, tal como definido acima, por exemplo, no contexto da invenção anterior (WO2014/006226).

[0055] De acordo com a presente invenção, o referido fragmento híbrido mutante e fragmento de OspA da presente invenção não compreendem (i) a camada N-terminal, tal como definida acima e (ii) opcionalmente uma ou mais outras fitas da camada central, como definido acima. No entanto, o polipeptídeo pode compreender uma ou mais sequências funcionais, tais como uma sequência de sinal, por exemplo, uma sequência de sinal de lipidação ou uma modificação pós- tradução, tal como lipidação.

[0056] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo da presente invenção consiste em (i) um ou mais fragmentos de OspA mutantes, em que pelo menos um é um fragmento de OspA C-terminal híbrido de acordo com a presente invenção, opcionalmente unidos por ligantes, por exemplo, tal como definido abaixo ou um ou mais fragmentos OspA mutantes e um fragmento de OspA C-terminal híbrido de sorotipo 3 e (ii) opcionalmente um ou mais aminoácidos heterólogos à OspA, especialmente uma sequência de sinal e (iii) opcionalmente, uma modificação pós-tradução, tais como lipidação.

[0057] Assim, em uma outra modalidade da presente invenção, o polipeptídeo da invenção, tal como definido acima e neste documento, adicionalmente pode compreender: i) um polipeptídeo que é lipidado ou em que o polipeptídeo compreende um sinal de lipidação, de preferência o E. coli sinal de lipidação derivado de lpp MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15); e/ou ii) um polipeptídeo que compreende um peptídeo de local de lipidação ao qual se segue um resíduo de cisteína N-terminal como um local de lipidação, de preferência CSS; e/ou iii) um polipeptídeo que compreende um agente de ligação entre o fragmento de OspA C-terminal híbrido e o segundo fragmento de OspA estabilizado com cisteína, particularmente em que o referido ligante compreende, por exemplo GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16).

[0058] Em uma modalidade da presente invenção, o segundo fragmento de OspA C-terminal é um fragmento de OspA C-terminal híbrido, de acordo com a presente invenção.

[0059] Em uma outra forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo compreende ou consiste em o heterodímero de Lip-S4D1- S3hybD1 (SEQ ID NO: 27). Por conseguinte, em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende ou é constituído de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (heterodímero de Lip-S4D1-S3hybD1).

[0060] O polipeptídeo da presente invenção tem capacidade de proteção. Tal como detalhado acima, a introdução de uma ligação de dissulfeto no fragmento de OspA híbrido e híbrido/mutante, mas também a natureza híbrida do fragmento de OspA da presente invenção aumenta a capacidade de proteção do polipeptídeo em relação a um polipeptídeo que compreende o respectivo fragmento sem a ligação(ões) de dissulfeto e da natureza híbrida do fragmento de OspA. Em algumas modalidade, a capacidade protetora é aumentada em pelo menos 10%, mais preferivelmente em pelo menos 20%, mais preferivelmente em pelo menos 30%, mais preferivelmente em pelo menos 40%, mais preferivelmente em pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferivelmente em pelo menos 70%, mais preferivelmente em pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente em pelo menos 90% em relação a um polipeptídeo que compreende o respectivo fragmento sem ligação(ões) de dissulfeto e natureza híbrida do fragmento de OspA.

[0061] A capacidade protetora do termo descreve a capacidade de proteger um sujeito contra uma infecção de Borrelia. No que se refere ao polipeptídeo da invenção, a capacidade de proteção refere-se à capacidade do polipeptídeo para induzir uma resposta imunitária que protege um sujeito contra uma infecção por Borrelia. Capacidade protetora pode ser testada através da administração do polipeptídeo a um sujeito, de um modo a induzir uma reação imunitária contra o polipeptídeo. Depois disso, o sujeito pode ser exposto a Borrelia. A reação do sujeito à infecção é monitorada. Particularmente, a presença de Borrelia no sujeito pode ser determinada. Por exemplo, o polipeptídeo é protetor se Borrelianão puder ser detectada no indivíduo. A presença de Borrelia pode ser determinada através da detecção de ácidos nucleicos específicos a Borrelia (por exemplo, por PCR) ou anticorpos específicos a Borrelia (por exemplo, por meio de ELISA ou Western blot) ou através da detecção da Borrelia em si (por exemplo, a cultura de órgãos ou tecidos em meio de crescimento e verificação da presença de Borrelia por microscopia). Em particular, a capacidade de proteção ("PC"), relatada como uma percentagem, para uma determinada dose é definida como se segue: pc (%) = [(número total de indivíduos testados - número de indivíduos infectados por Borrelia)/número total de indivíduos testados] x 100

[0062] As diferenças na capacidade de proteção (?pc) podem ser determinadas por, por exemplo, comparação da capacidade de proteção (PC) de um fragmento de OspA mutante com ligação(ões) de dissulfeto (pc [com ligação]) para a capacidade protetora de um fragmento de OspA sem uma ligação de dissulfeto (s) (pc [sem ligação]). De acordo com a presente invenção, os polipeptídeos a serem comparados diferem apenas na introdução de pelo menos uma ligação dissulfeto. A alteração da capacidade de proteção (?pc) pela introdução da ligação(ões) de dissulfeto é determinada como se segue: ?pc = (pc [amostra] - pc [controle]) por exemplo, ?pc = (pc [com ligação] - pc [sem ligação])

[0063] Se ?pc é maior do que zero (> 0), pressupondo-se que todos os outros parâmetros (por exemplo, a dose e ensaio) são os mesmos, então a capacidade de proteção da amostra (por exemplo, o fragmento de OspA mutante com ligação(ões) de dissulfeto) é melhor do que a capacidade protetora do controle (por exemplo, o fragmento de OspA sem ligação(ões) de dissulfeto). Por outro lado, se ?pc é menor que zero (< 0), pressupondo-se que todos os outros parâmetros (por exemplo, a dose e o ensaio) são os mesmos, então a capacidade de proteção da amostra (por exemplo, o fragmento de OspA mutante com ligação(ões) de dissulfeto) é menor do que a capacidade de proteção da comparação (por exemplo, o fragmento de OspA sem ligação(ões) de dissulfeto).

[0064] De preferência, o polipeptídeo da presente invenção, é avaliado quanto à sua capacidade de proteção por um ensaio de estimulação in vivo, em que os camundongos imunizados com o polipeptídeo da invenção ou com um placebo de controle são estimulados com Borrelia introduzida em todos os indivíduos imunizados com uma agulha hipodérmica (Método de Estímulo por Agulha) ou por meio da introdução de um carrapato vetor (Método de Estimulação por Carrapato).

[0065] O Método de Estimulação por Agulha é realizado para a cepa de Borrelia desejada (por exemplo, B. burgdorferi, cepa ZS7) por via subcutânea introduzindo Borrelia a uma dose entre 20 e 50 vezes a dose infecciosa (ID)50 a ratos que estão imunizados com o referido primeiro polipeptídeo do primeiro aspecto ou com um placebo de controle apropriado (negativo), tal como um tampão ou apenas um adjuvante e comparando as taxas de infecção nos camundongos estimulados. a ID50 é definida como a dose para a qual 50% dos camundongos estimulados são infectados. A dose de Borreliaé medida em número de bactérias. A dose de estímulo pode variar amplamente e é dependente da cepa; por conseguinte, a virulência da cepa deve primeiro ser avaliada por experiências de estímulo para a determinação de ID50. Quatro semanas após estímulo por agulha, sangue e tecidos são coletados para métodos de leitura para determinar o estado da infecção. Estes métodos de leitura podem ser, por exemplo, VlsE ELISA em soros ou qPCR em tecidos coletados para identificação de Borrelia, tal como descrito neste documento, ou por outros métodos.

[0066] O Método de Estímulo por Carrapato é levada a cabo através da aplicação de pelo menos uma ninfa de carrapato (por exemplo, I. ricinus) infectado com Borrelia (por exemplo, B. afzelii, cepa IS1), a um camundongo que é imunizado com o referido primeiro polipeptídeo do primeiro aspecto; e b) aplicar pelo menos uma ninfa de carrapato infectado a um segundo camundongo que é imunizado com o referido segundo polipeptídeo do primeiro aspecto; e c) comparar as taxas de infecção nos dois camundongos, geralmente seis semanas após o estímulo. Preferencialmente, o ensaio ou teste é feito com um grupo de camundongos por polipeptídeo a ser testado. Um teste adequado é também descrito e ilustrado nos Exemplos. Avaliação do estado da infecção pode ser feito usando VlsE ELISA em soro ou qPCR no DNA isolado a partir de tecidos recolhidos ou através de outros métodos adequados.

[0067] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os produtos da invenção, tais como, por exemplo, os polipeptídeos da invenção que compreendem o fragmento de OspA híbrido e de preferência, o fragmento de OspA C-terminal mutante administrado 3 vezes a um sujeito em uma dose de 30 µg, preferivelmente 10 µg, preferencialmente 5,0 µg, preferencialmente 1,0 µg, preferencialmente 0,3 µg ou menos tem uma capacidade protetora de 50% ou mais, preferencialmente 60% ou mais, mais preferencialmente 70% ou mais preferencialmente ainda de 80% ou mais, mais preferencialmente 90 % ou ainda mais preferencialmente 95% ou mais, ou preferencialmente de 99% ou mais. Em uma modalidade, a capacidade protetora é avaliada em um método de estimulação in vivo, de preferência um Método de Estímulo por Carrapato, mais preferencialmente em um Método de Estimulação por Carrapato, por exemplo, como descrito nos Exemplos.

[0068] Em uma modalidade preferida, a diferença de capacidade protetora (?pc) entre os polipeptídeos da invenção que compreende o fragmento de OspA de C-terminal híbrido e o controle placebo (negativo) é pelo menos 50%, especialmente pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 99%, quando administrado 3 vezes a um sujeito em uma dose de 30 µg, preferencialmente 10 µg, preferencialmente 5,0 µg, preferencialmente 1,0 µg, preferencialmente 0,3 µg ou menos.

[0069] De acordo com a presente invenção, a primeira parte da OspA híbrida pode ser de qualquer cepa de Borrelia diferente de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8, particularmente daquelas especificadas neste documento, tal como B. burgdorferi s.s., B. garinii (que não seja cepa PBr), B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ou B. sinica, B. bavariensis, preferencialmente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis ou B.garinii, ou uma fusão de fragmentos de proteína OspA de duas ou mais dessas espécies. Preferencialmente, OspA é de B. valaisiana, particularmente da cepa VS116 (SEQ ID NO: 4), mas pode ser de B. afzelii, particularmente da cepa K78, OspA sorotipo 2 (SEQ ID NO: 6); B. burgdorferi SS, particularmente da cepa B31, sorotipo 1 de OspA (SEQ ID NO: 5); B.garinii, particularmente da cepa PBr, OspA de sorotipo 3 (SEQ ID NO: 8); B. bavariensis, particularmente da cepa PBi, OspA do sorotipo 4 (SEQ ID NO: 9); B.garinii, particularmente da cepa PHei, OspA de sorotipo 5 (SEQ ID NO: 10); B.garinii, particularmente da cepa DK29, OspA sorotipo 6 (SEQ ID NO: 11) ou B.garinii, particularmente da cepa T25, OspA de sorotipo 7 (SEQ ID NO: 12). As sequências de aminoácidos destas proteínas OspA (de comprimento total) são dadas abaixo.

[0070] De acordo com a presente invenção, a ligação de dissulfeto pode também ser formada entre resíduos de cisteína que foram introduzidos em qualquer posição do fragmento de OspA, permitindo ou dando suporte à dobra adequada do fragmento. As posições podem ser selecionadas, como descrito acima, com base na estrutura conhecida da OspA. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo da invenção atual contém pelo menos uma ligação de dissulfeto introduzida através da inserção de um resíduo de cisteína em um dos resíduos 182 +/-3 e um dos resíduos 269 +/-3 (tipo de ligação de dissulfeto 1; "D1") de um B. afzelii, particularmente de B. afzelii K78 de OspA de sorotipo 2, ou os aminoácidos homólogos de um OspA de uma Borrelia, diferente de B. afzelii, tais como B. burgdorferi s.s., particularmente cepa B31, sorotipo 1; B. garinii, particularmente cepa PBr, sorotipo 3; B. bavariensis, particularmente cepa PBi, sorotipo 4; B. garinii, particularmente cepa PHei, sorotipo 5; B. garinii, particularmente cepa DK29, sorotipo 6; B. garinii, particularmente a cepa T25, sorotipo 7 ou uma fusão de aminoácidos 125-176 da OspA de B. valaisiana, cepa VS116, ou aminoácidos 126-175 da OspA de B. spielmanii e aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBr (SEQ ID NO: 8).

[0071] Nota-se que: Posição 182 +/- 3 é uma abreviatura para a posição 179, 180, 181, 182, 183, 184 ou 185, preferencialmente 182. Posição 269 +/- 3 é uma abreviatura para a posição 266, 267, 268, 269, 270, 271 ou 272, preferencialmente 269.

[0072] Em uma modalidade preferida, o fragmento mutante adicional é derivado dos aminoácidos da posição 125, 126, 130 ou 131 para a posição 273 da sequência de tipo selvagem de OspA de B. afzelii cepa K78, sorotipo 2 (SEQ ID NO: 6) e difere apenas pela introdução de pelo menos uma ligação de dissulfeto, particularmente em que a pelo menos uma ligação de dissulfeto é entre as posições 182 e 269 (dissulfeto de ligação tipo 1); ou os fragmentos homólogos e posições de uma OspA de uma Borrelia sp. outra que não seja B. afzelii, tal como B. burgdorferi SS, particularmente cepa B31, sorotipo 1; B.garinii, particularmente cepa PBr, sorotipo 3; B. bavariensis, particularmente cepa PBi, sorotipo 4; B.garinii, particularmente cepa PHei, sorotipo 5; B.garinii, particularmente cepa DK29, sorotipo ou 6 B.garinii, particularmente cepa T25, o sorotipo 7.

[0073] Em uma outra modalidade, o fragmento mutante pode ser uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 43, e SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, mais preferencialmente a SEQ ID NO: 46, e uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com pelo menos uma das sequências com SEQ ID NOs: 19 a 25, em que as cisteínas não são substituídas. Mais detalhes sobre as mutações de identidade de sequência são dadas acima.

[0074] Como detalhado acima, o polipeptídeo da presente invenção pode compreender sequências de sinal. Tem sido demonstrado que lipidação confere propriedades adjuvantes na OspA. Por conseguinte, as formas lipidadas do polipeptídeo da invenção ou polipeptídeos que compreendem um sinal de lipidação são preferidos. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo da presente invenção compreende um sinal de lipidação, de preferência, um sinal de lipidação de uma proteína de superfície exterior, OspA ou OspB de uma Borrelia (SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente) ou mais preferencialmente uma sequência de sinal de lipidação lpp de E. coli (SEQ ID NO: 15). O fragmento de OspA da invenção que compreende um sinal de lipidação é lipidado durante o processamento e o peptídeo de sinal de lipidação é clivado; assim, o peptídeo de sinal não mais está presente na proteína madura lipidada.

[0075] Proteínas lipidadas, de acordo com a presente invenção, são marcados com "lip" no N-terminal para indicar a adição de 3 grupos de ácido graxos e um glicerol ao polipeptídeo. Sinais de lipidação adequados, como descrito acima, incluem MKKYLLGIGLILALIA (SEQ ID NO: 13), MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14) e MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 15). Devido ao fato de que as unidades lipídicas e um glicerol estão ligados ao resíduo de cisteína do terminal N que está presente na proteína OspA de comprimento completo de tipo selvagem, os fragmentos C-terminal de OspA para lipidação podem compreender adicionalmente um peptídeo que compreende um resíduo de cisteína seguido por aminoácidos adicionais. Por exemplo, sequências tais como CSS ou CKQN (SEQ ID NO: 62) imediatamente no C-terminal para que a sequência de sinal de lipidação proporcione um resíduo de cisteína N-terminal para lipidação após clivagem do peptídeo de sinal de lipidação. Os peptídeos contendo cisteína lipidada estão presentes no polipeptídeo lipidado final da invenção.

[0076] Especula-se que a proteína OspA de B. burgdorferi s.s. compreende uma sequência com a capacidade de se ligar a um receptor de células T, que também tem a capacidade de se ligar ao antígeno leucocitário humano associado à função (hLFA-1) (aqui também referido como "sequência de tipo hLFA-1"). A semelhança entre esta região de OspA a hLFA-1 pode resultar em uma resposta imunitária com reatividade cruzada após a administração de B. burgdorferi ss OspA a um indivíduo humano e pode induzir doenças autoimunes, em particular artrite autoimune em indivíduos susceptíveis. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, o polipeptídeo da presente invenção não compreende uma sequência com capacidade de ligação ao receptor de células T que tem uma capacidade de ligação ao antígeno associado a função de leucócito humano (hLFA-1) e, particularmente, não inclui a sequência de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17). Para este fim, a sequência de tipo hLFA-1, em particular a sequência de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17), pode ser substituída com uma sequência homóloga de uma proteína OspA de outra Borrelia sp., particularmente com a NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 18).

[0077] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo da presente invenção que compreende pelo menos uma ligação de dissulfeto, essencialmente estabelece a mesma capacidade protetora com o referido polipeptídeo contra uma infecção por Borrelia em relação a pelo menos uma das proteínas de comprimento total de OspA de tipo selvagem derivada de pelo menos uma cepa de Borrelia, particularmente B. afzelii K78, OspA sorotipo 2 (SEQ ID NO: 6); B. burgdorferi s.s., particularmente cepa B31, sorotipo 1 (SEQ ID NO: 5); B.garinii, particularmente da cepa PBr, sorotipo 3 (SEQ ID NO: 7 e 8); B. bavariensis, particularmente da cepa PBi, sorotipo 4 (SEQ ID NO: 9); B.garinii, particularmente da cepa PHei, sorotipo 5 (SEQ ID NO: 10); B.garinii, particularmente da cepa DK29, sorotipo 6 (SEQ ID NO: 11) ou B.garinii, particularmente da cepa T25, sorotipo 7 (SEQ ID NO: 12).

[0078] Por favor, note que mais detalhes sobre mutações e identidade de sequência são dados acima. Tabela A-3. Nomenclatura e SEQ ID NOs. dos heterodímeros de fragmentos de OspA lipidados mutantes descritos na presente invenção. *S=Sorotipo (1-6) (ver Tabela A-2); S3hyb = fusão de aminoácidos 125-176 de B. valaisiana e os aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBr D1 = Ligação Dissulfeto Tipo 1 (resíduos de cisteína inseridos na posição 183 +/- 3 270 +/- 3); Lip = lipidação A adição N-terminal de resíduos de glicerol e de ácidos graxos.

[0079] Em uma outra modalidade preferida, o polipeptídeo, de acordo com o primeiro aspecto, compreende pelo menos dois ou três fragmentos mutantes os quais são ligados através de um ou mais ligantes. Um ligante é uma sequência de amino ácido bastante curta empregue para ligar dois fragmentos. Deve ser projetado de modo a evitar qualquer impacto negativo sobre os fragmentos, sua interação em sujeitos a serem tratados ou vacinados ou em sua capacidade de proteção. Preferem-se os ligantes curtos de no máximo 21 aminoácidos, particularmente no máximo 15 aminoácidos, especialmente, no máximo, 12 ou 8 aminoácidos. Mais preferivelmente, o um ou mais ligantes é/são compostos por aminoácidos pequenos, a fim de reduzir ou minimizar as interações com os fragmentos, tais como glicina, serina e alanina. Um ligante preferido é o ligante peptídico "LN1", uma fusão de duas regiões separadas de alça da metade N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (aa 65-74 e aa 42-53, com uma troca de aminoácidos na posição 53 de D53S) que tem a seguinte sequência: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 16). O ligante pode compreender um local de lipidação.

[0080] Em uma outra modalidade preferida, o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto compreende um polipeptídeo com um tamanho total de, no máximo, 500 aminoácidos, que compreende dois ou três fragmentos de diferentes mutantes, como definido nas modalidades preferidas do primeiro aspecto; ou um polipeptídeo que consiste essencialmente de dois ou três fragmentos de diferentes mutantes, um ou dois elementos de ligação e, opcionalmente, uma cisteína N-terminal; e/ou um polipeptídeo que consiste essencialmente de dois ou três diferentes fragmentos mutantes, uma extensão N- terminal do fragmento que consiste em, no máximo, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 aminoácidos, de preferência, no máximo 10, 9, 8, 7 ou 6 aminoácidos, ainda mais preferencialmente, no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1, cinco, quatro, três, dois ou um aminoácido, em que a extensão N-terminal é localizada no N-terminal diretamente a partir do fragmento na respectiva OspA de Borrelia e, opcionalmente, uma cisteína N-terminal. A cisteína N-terminal pode ser opcionalmente seguida por um ligante peptídico curto de comprimento de 1-10 aminoácidos e, de preferência, toma a forma de um peptídeo CSS N- terminal.

Os ácidos nucleicos da invenção e aspectos relacionados

[0081] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo, tal como definido acima e neste documento no contexto da presente invenção. O ácido nucleico pode estar compreendido em um vetor e/ou em uma célula.

[0082] A invenção proporciona ainda um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção. Para os fins da invenção o termo "ácido(s) nucleico(s)" refere-se geralmente a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado incluindo regiões/formas simples e de cadeia dupla.

[0083] O termo "ácido nucleico que codifica um polipeptídeo" como utilizado neste documento abrange polinucleotídeos que incluem uma sequência que codifica um peptídeo ou polipeptídeo da invenção. O termo abrange também polinucleotídeos que incluem uma única região contínua ou regiões descontinuas que codificam o peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, polinucleotídeos interrompidos por fago integrado, uma sequência de inserção integrada, uma sequência de vetor integrada, uma sequência de transposon integrada, ou devido a edição de RNA ou reorganização genômica do DNA) juntamente com regiões adicionais, que também podem conter sequências codificantes e/ou não codificadoras.

[0084] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degenerescência do código genético, há muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, tal como descrito neste documento. Alguns desses polinucleotídeos possuem similaridade mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo (isto é, que ocorrem naturalmente). No entanto, os polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização de códigos genéticos estão especificamente contemplados pela presente invenção, por exemplo, polinucleotídeos que são optimizados para o ser humano e/ou de primata e/ou seleção de código genético de E. coli.

[0085] As sequências que codificam um polipeptídeo desejado podem ser sintetizadas, no todo ou em parte, utilizando métodos químicos bem conhecidos na técnica (ver Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Alternativamente, a própria proteína pode ser produzida utilizando métodos químicos para sintetizar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma porção sua. Por exemplo, a síntese de peptídeos pode ser realizada usando várias técnicas de fase sólida (Roberge et al., Science 269: 202-204 (1995)) e a síntese automática pode ser conseguida, por exemplo, usando o ASI 431, um sintetizador de peptídeos (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

[0086] Além disso, as sequências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser manipuladas usando métodos conhecidos de modo geral na arte, a fim de alterar as sequências que codificam o polipeptídeo por uma variedade de razões, incluindo, mas não se limitando a, alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do produto do gene. Poe exemplo, DNA shuffling por meio de fragmentação aleatória e remontagem de PCR de fragmentos de genes e oligonucleotídeos sintéticos pode ser usado para projetar sequências de nucleotídeos. Além disso, a mutagênese direcionada ao local pode ser utilizada para inserir novos locais de restrição, alterar os padrões de glicosilação, alteração de preferência de código genético, produzir variantes de processamento ou introduzir mutações e assim por diante.

[0087] Em um outro aspecto da invenção, a presente invenção refere-se a vetores que compreendem um ácido nucleico da invenção, por exemplo, ligado a um promotor induzível de tal modo que, quando o promotor é induzido, um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico é expresso. Em uma modalidade preferida, o vetor é pET28b(+) (http://www.addgene.org/vetor-database/2566/).

[0088] Um aspecto adicional da invenção compreende o referido vetor, em que o promotor induzível é ativado pela adição de uma quantidade suficiente de IPTG (isopropil ß-D-L-tiogalactopiranodideo), de preferência ao meio de crescimento. Opcionalmente, esta é a uma concentração de entre 0,1 e 10 mM, 0,1 e 5 mM, 0,1 e 2,5 mM, 0,2 e 10 mM, 0,2 e 5 mM, 0,2 e 2,5 mM, 0,4 e 10 mM, 1 e 10 mM, 1 e 5 mM, 2,5 e 10 mM, 2,5 e 5 mM, 5 e 10 mM. Alternativamente, o promotor pode ser induzido por uma mudança na temperatura ou pH.

[0089] Molécula de ácido nucleico, tal como utilizado neste documento geralmente refere-se a qualquer molécula de ácido ribonucleico ou molécula de ácido desoxirribonucleico, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Assim, por exemplo, molécula de ácido nucleico, tal como aqui utilizado refere-se, pelo menos, a DNA de simples e de cadeia dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla, ou uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla. Tal como utilizado neste documento, o termo molécula de ácido nucleico inclui moléculas de DNA ou RNA, tal como descrito acima que contenham uma ou mais bases modificadas. Assim, moléculas de DNA ou RNA com estruturas modificadas para a estabilidade ou por outras razões, são "molécula de ácido nucleico", tal como se entende o termo neste documento. Além disso, as espécies de DNA ou RNA que compreendem bases pouco usuais, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiladas, para nomear apenas dois exemplos, são também moléculas de ácido nucleico, tal como definido neste documento. Será apreciado que uma grande variedade de modificações têm sido feitas a moléculas de DNA e RNA que servem a muitos fins úteis conhecidos por aqueles versados na técnica. O termo molécula de ácido nucleico, como utilizado neste documento, engloba tais formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de moléculas de ácido nucleico, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo células simples e complexas, inter alia. O termo molécula de ácido nucleico também abrange moléculas de ácido nucleico curtas, muitas vezes referidos como oligonucleotídeo(s). Os termos "polinucleotídeo"e "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico"são utilizados neste documento de modo intercambiável.

[0090] Os ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, podem ser quimicamente sintetizados. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser isolados a partir de Borrelia e modificado por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. O mesmo aplica- se aos polipeptídeos de acordo com a presente invenção.

[0091] Além disso, o ácido nucleico da presente invenção pode ser funcionalmente ligado, utilizando técnicas padrão, tais como a clonagem, a quaisquer sequência(s) desejada(s), seja uma sequência reguladora ou uma sequência reguladora heteróloga, sequência líder heteróloga, sequência marcadora heteróloga ou uma sequência de codificação heteróloga de Borrelia para criar um gene de fusão.

[0092] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem estar na forma de RNA, tal como RNAm ou RNAc, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, DNAc e DNA genômico obtidos por clonagem ou produzidos por técnicas de síntese química ou através de uma combinação das mesmas. O DNA pode ser de cadeia tripla, de cadeia dupla ou de cadeia simples. DNA de cadeia simples pode ser a cadeia de codificação, também conhecida como a cadeia de sentido, ou pode ser a cadeia não codificante, também referida como a cadeia antisense.

[0093] O ácido nucleico da presente invenção pode ser compreendido em um vetor ou em uma célula hospedeira. Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um vetor ou uma célula hospedeira, de preferência E. coli, que compreende uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. O vetor pode compreender o ácido nucleico acima mencionado de tal modo que o vetor seja replicável e pode expressar a proteína codificada pela sequência nucleotídica em uma célula hospedeira.

[0094] Para a produção recombinante dos polipeptídeos da invenção, as células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas para incorporar sistemas de expressão ou porções destes do ácido nucleico da invenção. A introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira pode ser efetuada por métodos descritos em muitos manuais laboratoriais padrão, tais como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) e Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2aEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tais como, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção, microinjeção, transfecção mediada por lipídios catiônica, eletroporação, conjugação, transdução, scrape loading, introdução balística e infecção.

[0095] Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas gram-negativas, tais como as células de E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, cianobactérias, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteu, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, vibrião, Yersinia. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de Escherichia coli. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula de E. coli BL21 (DE3) ou uma célula de E. coli BL21 Star™ (DE3).

[0096] Alternativamente, células de bactérias gram-positivas podem também ser utilizadas.. Uma grande variedade de sistemas de expressão pode ser utilizada para produzir os polipeptídeos da invenção. Em uma modalidade, o vetor é derivado de plasmídeos bacterianos. Geralmente qualquer sistema ou vetor adequado para manter, propagar ou expressar polinucleotídeos e/ou para expressar um polipeptídeo em um hospedeiro podem ser usados para a expressão, a este respeito. A sequência de DNA adequada pode ser inserida no sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, aquelas apresentadas em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra).

[0097] Em uma modalidade da presente invenção, as células são cultivadas sob pressão seletiva, tal como na presença de antibióticos, de preferência, canamicina. Em uma outra modalidade, as células são cultivadas na ausência de antibióticos.

[0098] Uma grande variedade de vetores de expressão podem ser utilizados para expressar os polipeptídeos, de acordo com a presente invenção. De um modo geral, qualquer vetor adequado para manter, propagar ou expressar os ácidos nucleicos para expressar um polipeptídeo em um hospedeiro podem ser usados para a expressão, a este respeito. De acordo com este aspecto da invenção, o vetor pode ser, por exemplo, um vetor plasmidial, um vetor de fago de cadeia simples ou dupla ou um vetor viral de RNA ou DNA de cadeia simples ou dupla. Plasmídeos de partida descritos neste documento ou estão disponíveis comercialmente, disponíveis publicamente ou podem ser construídos a partir dos plasmídeos disponíveis pela aplicação de técnicas rotineiras bem conhecidas de procedimentos publicados. São preferidos entre os vetores, em certos aspectos, aqueles para expressão de moléculas de ácido nucleico e os polipeptídeos de acordo com a presente invenção. As construções de ácido nucleico em células hospedeiras podem ser usados de um modo convencionado a fim de produzir o produto genético codificado pela sequência recombinante. Alternativamente, os polipeptídeos de acordo com a presente invenção, podem ser produzidos sinteticamente por sintetizadores de peptídeos convencionais.

[0099] Além disso, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo esse vetor. Exemplos representativos de células hospedeiras apropriadas incluem bactérias, como estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces e Bacillus subtilis; fungos, como leveduras e Aspergillus; células de insetos, como células Sf9 Drosophila e S2 Spodoptera; células de mamíferos, como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 ou células de melanoma de Bowes; e células vegetais. Sistemas de tradução isentos de células também podem ser utilizados para produzir essas proteínas utilizando RNA derivado do construto de DNA da presente invenção.

[00100] A fim de expressar a sequência de aminoácidos desejada praticamente através da introdução do vetor de acordo com a presente invenção em uma célula hospedeira, o vetor pode conter, além da sequência de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, outras sequências de controle da expressão (por exemplo, sequências promotoras, sequências terminadoras e sequências estimuladoras) e genes marcadores de seleção de micro-organismos, células de insetos, células de cultivo animal e afins (por exemplo, genes de resistência à neomicina e genes de resistência à canamicina). Além disso, o vetor pode conter a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção em uma forma repetida (por exemplo, em conjunto). O vetor pode ser construído com base em procedimentos que são convencionalmente utilizados no campo da engenharia genética.

[00101] As células hospedeiras podem ser cultivadas em um meio adequado e a proteína de acordo com a presente invenção pode ser obtida a partir do produto de cultivo. A proteína de acordo com a presente invenção pode ser recuperada a partir do meio de cultivo e purificada de uma maneira convencional.

[00102] Por conseguinte, a presente invenção também se refere a um processo para produzir uma célula que expressa um polipeptídeo de acordo com a presente invenção, compreendendo a transformação ou transfecção de uma célula hospedeira adequada com o vetor de acordo com a presente invenção ou um processo para a produção do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, compreendendo a expressão da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[00103] Alternativamente, um método para a produção de um polipeptídeo, conforme definido acima, pode ser caracterizado pelas etapas a seguir: a) a introdução de um vetor codificando o polipeptídeo em uma célula hospedeira, b) o cultivo da célula hospedeira sob condições que permitam a expressão do referido polipeptídeo, c) a homogeneização da referida célula hospedeira e d) a sujeição do homogeneizado de célula hospedeira a etapas de purificação.

[00104] A invenção refere-se ainda a um método para a produção de um polipeptídeo conforme definido acima, caracterizado pelas seguintes etapas: a) a introdução de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo em um vetor, b) a introdução do referido vetor em uma célula hospedeira, c) o cultivo da referida célula hospedeira sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo, d) a homogeneização da referida célula hospedeira, e) o enriquecimento do polipeptídeo na fase lipídica pela separação de fase e f) a purificação adicional através de uma coluna de filtração em gel.

[00105] A invenção refere-se ainda a um método para a produção de um polipeptídeo conforme definido acima, caracterizado pelas seguintes etapas: a) a introdução de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo em um vetor, b) a introdução do referido vetor em uma célula hospedeira, c) o cultivo da referida célula hospedeira sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo, d) a homogeneização da referida célula hospedeira, e) o enriquecimento do polipeptídeo na fase lipídica por fase de separação, g) a purificação através de uma coluna de filtração em gel e h) opcionalmente, o processamento adicional através de uma coluna de permuta de tampão.

Os anticorpos da invenção e aspectos relacionados

[00106] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um aspecto adicional por um anticorpo, ou pelo menos uma parte efetiva do mesmo, que se liga seletivamente ao fragmento de OspA com terminação C híbrida conforme definido no contexto da presente invenção, mas não à primeira porção de OspA e à segunda porção de OspA isoladamente (isto é, se não estiver fundido à outra porção).

[00107] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[00108] Em outra modalidade preferida, a referida parte efetiva compreende um fragmento Fab, um fragmento F(ab), um fragmento F(ab)N, um fragmento F(ab)2 ou um fragmento Fv ou um anticorpo de domínio simples.

[00109] Em outra modalidade da invenção, ainda, o anticorpo é um anticorpo quimérico.

[00110] Em outra modalidade, ainda, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[00111] Em um aspecto preferido, os anticorpos da invenção se ligam especificamente a polipeptídeos de fragmento de OspA híbrido da invenção, mas não à primeira porção de OspA e à segunda porção de OspA isoladamente e não aos polipeptídeos do fragmento de OspA de tipo selvagem correspondente. Em um aspecto mais preferencial, o anticorpo se liga especificamente à ligação de dissulfeto do fragmento de OspA mutante da invenção.

[00112] O termo "especificidade" refere-se ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos a que uma molécula de ligação a antígeno específica ou proteína de ligação a antígeno (como um nanocorpo ou um polipeptídeo da invenção) pode se ligar. A especificidade de uma proteína de ligação a antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou na avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação a antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um local de ligação a antígeno na proteína de ligação a antígeno: quanto menor o valor de KD, mais forte será a força de ligação entre um determinante antigênico e a molécula de ligação a antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a constante de afinidade (KA), que é 1/KD).

[00113] Como ficará evidente para aqueles versados na técnica (por exemplo, na base da divulgação adicional neste documento), a afinidade pode ser determinada de uma maneira conhecida por si, dependendo do antígeno específico de interesse. A avidez é a medida da força de ligação entre uma molécula de ligação a antígeno (como um anticorpo ou uma parte efetiva da invenção do mesmo) e o antígeno pertinente. A avidez está relacionada com a afinidade entre um determinante antigênico e o seu local de ligação a antígeno na molécula de ligação a antígeno e a quantidade de locais de ligação pertinentes na molécula de ligação a antígeno. Tipicamente, as proteínas de ligação a antígeno (como um anticorpo ou uma parte efetiva da invenção) ligar- se-ão ao seu antígeno com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 a 10-12 M ou menos, e de preferência 10-7 a 10-12 M ou menos e mais preferencialmente 10-8 a 10-12 M (isto é, com uma constante de associação (KA) de 105a 1012 M-1 ou mais, e preferencialmente 107 1012 litros/moles ou mais e mais preferencialmente 108a 1012 M-1). Qualquer valor de KD maior do que 104 M ( ou qualquer valor de KA inferior a 104 M-1) é considerado geralmente como indicativo de uma ligação não específica. Preferencialmente, uma sequência de imunoglobulina monovalente da invenção ligar-se-á ao antígeno desejado com uma afinidade de menos do que 500 nM, preferencialmente menos do que 200 nM, mais preferencialmente de menos do que 10 nM, como, por exemplo, menos do que 500 pM. A ligação específica de uma proteína de ligação a antígeno ou a um determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira apropriada conhecida por si, incluindo, por exemplo, a análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitivos, como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição de sanduíche, e as diferentes variantes dos mesmos conhecidos por si na técnica, bem como outras técnicas aqui mencionadas.

[00114] A constante de dissociação pode ser a constante de dissociação aparente ou real, como ficará evidente para aqueles versados na técnica. Os métodos para determinar a constante de dissociação ficarão evidentes àqueles versados na técnica e, por exemplo, incluem as técnicas aqui mencionadas. A este respeito, também ficará evidente que pode não ser possível medir as constantes de dissociação de mais do que 10-4 M ou 10-3 M (por exemplo, de 10-2 M). Opcionalmente, como também ficará evidente a alguém versado na técnica, a constante de dissociação (real ou aparente) pode ser calculada com base na constante de associação (real ou aparente) (KA), por meio da relação [KD = 1/KA].

[00115] A afinidade indica a intensidade ou a estabilidade de uma interação molecular. A afinidade é geralmente dada conforme KD, ou constante de dissociação, que tem unidades de moles/litro (ou M). A afinidade também pode ser expressa na forma de uma constante de associação, KA, que é igual a 1/KD e tem unidades de (litro/mol)-1 (ou M-1). No presente relatório descritivo, a estabilidade da interação entre duas moléculas (como uma sequência de aminoácidos, nanocorpos ou polipeptídeos da invenção e seu alvo pretendido) será expressa principalmente em termos do valor de KD de sua interação/ficando evidente àqueles versados na técnica que em vista da relação KA = 1/KD, a especificação da força da interação molecular pelo seu valor de KD também pode ser usada para calcular o valor de KA correspondente. O valor de KD caracteriza a força de uma interação molecular também em um sentido termodinâmico, uma vez que está relacionado com a energia livre (DG) de ligação pela relação conhecida de DG = RT.ln (KD) (equivalentemente, DG = -RT.ln (KA)), em que R é igual à constante dos gases, T é igual à temperatura absoluta e ln indica o logaritmo natural.

[00116] O KD para interações biológicas que são consideradas significativas (por exemplo, específico) ficam tipicamente na gama de 10-10 M (0,1 nM) a 10-5 M (10,000 nM). Quanto mais forte a interação, menor o seu KD.

[00117] Em uma modalidade preferida, o KD do anticorpo da presente invenção fica entre 10-12 M e 10-5 M, preferencialmente menos do que 10-6, preferencialmente menos do que 10-7, preferencialmente menos do que 10-8 M, preferencialmente menos do que 10-9 M, mais preferencialmente menos do que 10-10 M, ainda mais preferencialmente menos do que 10-11 M, mais preferencialmente menos do que 10-12 M.

[00118] O KD também pode ser expresso como a razão entre a constante de velocidade de dissociação de um complexo, como denotado por koff, para a taxa de sua associação, denotada como kon (de modo que KD = koff/kon e KA= Kon/koff). O koff tem unidades s-1 (onde s é a notação de unidade SI por segundo). A taxa de associação de kon tem unidades M-1 s-1. A taxa de associação pode variar entre 102 M-1 s-1 a cerca de 107 M-1s-1, aproximando-se da constante de taxa de associação limitada por difusão para interações bimoleculares. A taxa de dissociação está relacionada à meia-vida de uma determinada interação molecular pela relação t1/2 = In(2)/koff. A taxa de dissociação pode variar entre 10-6 s-1(próximo ao complexo irreversível com um t1/2 de vários dias) a 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).

[00119] A afinidade de uma interação molecular entre duas moléculas pode ser medidas através de várias técnicas conhecidas por si, como a conhecida técnica de biossensor de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (ver, por exemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001), em que uma molécula é imobilizada no chip de biossensor e a outra molécula é passada pela molécula imobilizada sob condições e fluxo, gerando as medidas de kon, koff e, por conseguinte, os valores de KD (ou KA). Isso pode ser realizado, por exemplo, utilizando os conhecidos instrumentos BIACORE.

[00120] Também ficará evidente àqueles versados na técnica que o KD medido pode corresponder ao KD aparente se o processo influenciar de alguma maneira a afinidade de ligação intrínseca das moléculas implicadas, por exemplo, por artefatos relacionados ao revestimento no biossensor de uma molécula. Além disso, uma KD aparente pode ser medido se uma molécula contiver mais de um local de reconhecimento para a outra molécula. Em uma situação assim, a afinidade medida pode ser afetada pela avidez da interação pelas duas moléculas.

[00121] Outra abordagem que pode ser utilizada para avaliar a afinidade é o procedimento ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) de 2 etapas de Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Esse método estabelece uma medida de equilíbrio de ligação em fase de solução e evita possíveis artefatos relacionados com a adsorção de uma das moléculas em um suporte, como um plástico.

[00122] No entanto, a medição precisa de KD pode ser bastante trabalhosa; portanto, os valores aparentes de KD frequentemente são determinados a fim de avaliar a força de ligação de duas moléculas. Deve-se observar que, conquanto as medidas forem feitas de uma maneira consistente (por exemplo, mantendo as condições de ensaio inalteradas), as medições aparentes de KD podem ser usadas como uma aproximação do KD real e, assim, no presente documento, KD e o KD aparente devem ser tratados com igual importância e relevância.

[00123] Por fim, deve-se observar que, em diversas situações, o cientista experiente pode julgar conveniente determinar a afinidade de ligação relativa a alguma molécula de referência. Por exemplo, para avaliar a força de ligação entre as moléculas A e B, pode-se usar, por exemplo, uma molécula de referência C que é conhecida por se ligar a B e que é devidamente marcada com um grupo fluoróforo ou cromóforo ou outra fração química, como a biotina, para fácil detecção por ELISA ou citometria de fluxo ou outro formato (o fluoróforo para detecção por fluorescência, o cromóforo para detecção de absorção de luz, a biotina para a detecção por ELISA mediado por estreptavidina). Normalmente, a molécula de referência C é mantida a uma concentração fixa e a concentração de A é variada para uma determinada concentração ou quantidade de B. Como resultado, um valor de concentração inibitória (IC)50 é obtido correspondendo à concentração de A a que o sinal medido para C na ausência de A é dividido por dois. Visto que KD ref, o KD da molécula de referência, é conhecido, assim como a concentração total de Cref da molécula de referência, o KD aparente para a interação A-B pode ser obtido a partir de seguinte fórmula: KD= IC50/(1 + cref/KDref). Observe-se que se Cref <<KDref, KD ~ IC50. Contanto que a medição da IC50 seja realizada de forma consistente (por exemplo, mantendo cref fixo) para os ligantes que são comparados, a força ou a estabilidade de uma interação molecular pode ser avaliada pela IC50 e esta medida é considerada equivalente a KD ou KD aparente ao longo deste texto.

[00124] Outro aspecto da invenção refere-se a uma linha celular de hibridoma, que produz um anticorpo conforme definido acima.

[00125] O problema subjacente à presente invenção é resolvido, ademais, por um método para produzir um anticorpo como definido acima, caracterizado pelas seguintes etapas: a) a iniciação de uma resposta imune em um animal não humano pela administração de um polipeptídeo, tal como definido acima, ao referido animal, b) a remoção do fluido corporal contendo anticorpos do referido animal e c) a produção do anticorpo pela sujeição do referido anticorpo contendo fluido corporal a outras etapas de purificação.

[00126] A invenção refere-se ainda a um método para a produção de um anticorpo conforme definido acima, caracterizado pelas seguintes etapas: a) a iniciação de uma resposta imune em um animal não humano pela administração de um polipeptídeo, tal como definido acima, ao referido animal, b) a remoção do baço ou de células do baço do referido animal, c) a produção de células de hibridoma do referido baço ou células de baço, d) a seleção e a clonagem de células de hibridoma específicas para o referido polipeptídeo, e) a produção do anticorpo pelo cultivo das referidas células de hibridoma clonadas e f) opcionalmente, a condução de etapas de purificação adicionais.

Composições farmacêuticas e aspectos médicos relacionados

[00127] Um outro aspecto da presente invenção está relacionado a uma composição farmacêutica que compreende i) o polipeptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção e/ou o anticorpo de acordo com a presente invenção; e ii) opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00128] Assim, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o anticorpo de acordo com a presente invenção ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser - para utilização como um medicamento, em particular como uma vacina, ou - para utilização em um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia, especialmente B. burgdorferi ss, B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ou infecção por B. sinica, preferencialmente uma infecção por B. burgdorferi s.s., B. afzelii ou B.garinii.

[00129] De preferência, a composição compreende, adicionalmente, Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33), a composição compreende, adicionalmente, Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), a composição compreende, adicionalmente, Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) ou a composição compreende Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33).

[00130] Outro aspecto, ainda, relaciona-se a uma composição farmacêutica conforme definida acima para uso no tratamento ou na prevenção de uma infecção com espécies Borrelia, mais preferencialmente espécies patogênicas de Borrelia, conforme divulgadas aqui, compreendendo, mais preferencialmente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis e B. garinii.

[00131] O problema subjacente à presente invenção é resolvido em um outro aspecto com a utilização do polipeptídeo de acordo com a presente invenção, do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e/ou com o anticorpo de acordo com a presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir infecções com espécies Borrelia, mais preferencialmente espécies patogênicas de Borrelia conforme divulgadas aqui, compreendendo, mais preferencialmente, B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. bavariensis e B. garinii.

[00132] A composição farmacêutica pode conter opcionalmente qualquer transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, como substâncias de tampão, estabilizantes ou outros ingredientes ativos, especialmente ingredientes conhecidos em ligação com as composições farmacêuticas e/ou com a produção de vacinas. De preferência, o excipiente farmaceuticamente aceitável compreende L- metionina. De preferência, a composição farmacêutica é para utilização na forma de medicamento, em particular como uma vacina ou para prevenir ou tratar uma infecção causada pela espécie Borrelia, mais preferencialmente as espécies patogênicas de Borrelia, conforme divulgadas aqui, compreendendo, de preferência, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis e B.garinii, e/ou outros agentes patogénicos contra os quais os antígenos foram incluídos na vacina. De preferência, a composição farmacêutica é para uso em um método para tratar ou prevenir uma infecção por Borrelia, especialmente B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ou uma infecção por B. sinica, preferencialmente uma infecção por B. burgdorferi s.s., B. afzelii ou B. garinii.

[00133] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende ainda um adjuvante. A escolha de um adjuvante adequado para ser misturado com toxinas bacterianas ou conjugados feitos pelo uso do processo da invenção faz parte do conhecimento de alguém versado na técnica. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, mas também podem ser outros sais metálicos, como aqueles de cálcio, magnésio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, sacarídeos derivados cationicamente ou anionicamente ou polifosfazenos. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é adjuvada com hidróxido de alumínio.

[00134] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreende uma substância imunoestimulante, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em polímeros policatiônicos, especialmente peptídeos policatiônicos, oligodesoxinucleotídeos imunoestimulantes (ODNs), especialmente oligo(dldC)13 (SEQ ID NO: 63), os peptídeos contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61), compostos neuroativos, especialmente hormônio de crescimento humano, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, adjuvantes de Freund completos ou incompletos ou combinações destes. De preferência, a substância imunoestimulante é uma combinação de um polímero policatiônico e de desoxinucleotídeos imunoestimulantes ou de um peptídeo contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys e desoxinucleotídeos imunoestimulantes, preferencialmente uma combinação de KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 61) e oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 63). Mais preferencialmente, o peptídeo policatiônico referido é poliarginina.

[00135] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreende fosfato de sódio, cloreto de sódio, L-metionina, sacarose e Polissorbato-20 (Tween-20) a um pH de 6,7 +/- 0,2. De preferência, a composição farmacêutica compreende também o hidróxido de alumínio, de preferência a uma concentração de 0,15%.

[00136] Em uma modalidade, a formulação compreende entre 5 mM e 50 mM de fosfato de sódio, entre 100 e 200 mM de cloreto de sódio, entre 5 mM e 25 mM de L-metionina, entre 2,5% e 10% de sacarose, entre 0,01% e 0,1% de Tween 20 e entre 0,1% e 0,2% (w/v) de hidróxido de alumínio. Mais preferencialmente, a formulação compreende fosfato de sódio de 10 mM, cloreto de sódio de 150 mM, 10 mM de L-metionina, 5% de sacarose, 0,05% de Tween 20 e 0,15% (w/v) de hidróxido de alumínio a um pH de 6,7 ± 0,2. Ainda mais preferencialmente, a formulação compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três heterodímeros de OspA mutante de acordo com a invenção.

[00137] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende 3 heterodímeros, preferencialmente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33). De preferência, os três heterodímeros são misturados a uma razão molar de 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, de preferência 1:1:1.

[00138] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende dois heterodímeros, de preferência Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33), Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) e Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) ou Lip-S4D1- S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) em uma razão molar de 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, preferencialmente 1:1.

[00139] Em uma modalidade, a composição farmacêutica ou vacina da invenção compreende ainda pelo menos um antígeno adicional de Borrelia ou de um agente patogênico diferente de Borrelia (referido aqui genericamente como "composição farmacêutica de combinação ou vacina"). Em uma modalidade preferida, pelo menos um antígeno adicional é derivado de uma espécie de Borrelia que causa borreliose de Lyme. Em diversos aspectos, pelo menos um antígeno adicional é derivado de outro patógeno, preferencialmente um patógeno transmitido por carrapatos. Em outro aspecto, o agente patógeno causa febre maculosa, erliquiose granulocítica humana (HGE), febre de Sennetsu, erliquiose monocítica humana (HME), anaplasmose, febre botonosa, Rickettsia parkeri Rickettsioses, erupção cutânea associada a carrapato do sul (STARI), 364D Rickettsioses, febre maculosa africana, febre recorrente, encefalite tularemia, febre de carrapato do Colorado, encefalite causada por carrapato (TBE, também conhecida como FSME), febre hemorrágica da Crimeia-Congo, febre Q, febre hemorrágica de Omsk, doença da floresta de Kyasanur, encefalite de Powassan, doença do vírus de Heartland ou babesiose. Em um aspecto adicional, a doença é a encefalite japonesa.

[00140] Em outra modalidade, pelo menos um antígeno adicional é derivado de um patógeno causado por vetor, preferencialmente causado por carrapato, selecionado a partir do grupo que consiste em Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Neoehrlichia mikurensis, Coxiella burnetii e Borrelia lonestari, vírus da encefalite causado por carrapato (TBEV, também conhecido como vírus FSME), vírus da febre do carrapato do Colorado (CTFV), vírus da febre hemorrágica da Criemeia-Congo (CCHFV), vírus da febre hemorrágica de Omsk (OHFV), vírus da encefalite japonesa (JEV) e Babesia spp.

[00141] Em outro aspecto, a invenção se relaciona a um kit que compreende a composição farmacêutica da presente invenção e um antígeno adicional, como definido acima, onde pelo menos um antígeno adicional é compreendido em uma segunda composição, particularmente onde a segunda composição é uma vacina, preferencialmente uma vacina de encefalite causada por carrapato, uma vacina de encefalite japonesa ou uma vacina contra a febre maculosa. A primeira composição pode ser também uma vacina. A composição de combinação farmacêutica ou de vacina da invenção compreende qualquer composição aqui discutida em combinação com no mínimo uma segunda composição (vacina). Em alguns aspectos, a segunda composição de vacina protege contra uma doença transmitida por vetor, de preferência uma doença transmitida por carrapatos. Em vários aspectos, a segunda composição de vacina tem um calendário de imunização sazonal compatível com a imunização contra infecção por Borrelia ou borreliose de Lyme. Em outros aspectos, as vacinas de combinação são úteis na prevenção de várias doenças para uso em áreas geográficas onde essas doenças são prevalecentes.

[00142] Em um aspecto, a segunda composição é uma vacina selecionada a partir do grupo que consiste em uma vacina de encefalite causada por carrapato, uma vacina contra encefalite japonesa e uma vacina contra a febre maculosa. Em um aspecto preferido, a composição de vacina é FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) ou TBE Moscow Vaccine® (Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences). Em outro aspecto preferido, a composição de vacina é IXIARO®/JESPECT® (Valneva SE), Jeev® (E Biológica, Ltd.) ou IMOJEV® (Sanofi Pasteur).

[00143] É fornecida ainda uma composição farmacêutica que é uma vacina, essa vacina pode compreender ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, o excipiente é a L-metionina.

[00144] A invenção também inclui composições imunogênicas. Em alguns aspectos, uma composição imunogênica da invenção compreende qualquer uma das composições aqui descritas e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em vários aspectos, a composição imunogênica tem a propriedade de induzir a produção de um anticorpo que se liga especificamente a uma externa da proteína A (OspA). Em certos aspectos, a composição imunogênica tem a propriedade de induzir a produção de um anticorpo que se liga especificamente a Borrelia. Em aspectos particulares, a composição imunogênica tem a propriedade de induzir a produção de um anticorpo que neutraliza Borrelia. Em alguns aspectos, o anticorpo é produzido por um animal. Em aspectos adicionais, o animal é um mamífero. Em outros aspectos, ainda, o mamífero é um humano.

[00145] As preparações de vacina que contêm as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadas para proteger um mamífero suscetível a infecção por Borrelia ou tratar um mamífero com uma infecção por Borrelia, por meio de administração da referida vacina através de uma via sistêmica ou mucosa. Essas administrações podem incluir injeção através de injeção intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou administração por via mucosa para os tratos oral/alimentar, respiratório ou genitourinário. Embora a vacina da invenção possa ser administrada na forma de uma dose única, os seus componentes também podem ser coadministrados juntamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes.

[00146] Em um aspecto da invenção, é fornecido um kit de vacina que compreende um frasco contendo uma composição farmacêutica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada, e compreendendo ainda um tubo de ensaio contendo um adjuvante tal como aqui descrito. Prevê-se que, neste aspecto da invenção, o adjuvante será utilizado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada. Em um aspecto adicional, a composição farmacêutica da invenção pode ser pré- misturada em um frasco, preferencialmente em uma seringa.

[00147] Um aspecto adicional da invenção é um método de tratar ou prevenir uma infecção por Borrelia em um indivíduo em necessidade compreendendo a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da presente invenção, do ácido nucleico da presente invenção, do anticorpo da presente invenção ou da composição farmacêutica da presente invenção.

[00148] Um outro aspecto da invenção é um método de imunização de um indivíduo em necessidade compreendendo a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da presente invenção, do ácido nucleico da presente invenção, do anticorpo da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção.

[00149] Um outro aspecto se relaciona a um método para a imunização de um animal ou ser humano contra a infecção com um organismo de Borrelia, compreendendo a etapa de administração ao referido animal ou humano de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da presente invenção, do ácido nucleico da presente invenção, do anticorpo da presente invenção ou da composição farmacêutica da presente invenção, onde a quantidade eficaz é adequada para induzir uma resposta imunológica no referido animal ou humano.

[00150] Um outro aspecto se relaciona a um método para estimular uma resposta imunológica em um animal ou humano contra um organismo de Borrelia que compreende a etapa de administração ao referido animal ou humano de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da presente invenção, do ácido nucleico da presente invenção, do anticorpo da presente invenção ou da composição farmacêutica da presente invenção, onde a quantidade eficaz é adequada para estimular uma resposta imunológica no referido animal ou humano.

[00151] De um modo preferido, o organismo de Borreliaé selecionado a partir do grupo que compreende B. burgdorferi, particularmente B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ou B. sinica, preferencialmente B. burgdorferi s.s., B. afzelii ou B. garinii.

[00152] Em uma modalidade, é fornecido um método para evitar ou tratar episódios primários e/ou recorrentes de infecção por Borrelia compreendendo a administração ao hospedeiro de uma dose imunoprotetora da composição farmacêutica, vacina ou kit da invenção.

[00153] Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica da invenção para utilização no tratamento ou prevenção da doença Borrelial. Em uma modalidade, proporciona-se uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou na prevenção de infecção por Borrelia.

[00154] Um aspecto adicional da invenção é a utilização da composição farmacêutica, vacina ou kit da presente invenção na produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção por Borrelia. Em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica da invenção para uso na produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção por Borrelia.

[00155] A invenção também inclui métodos para a indução de uma resposta imunológica em um indivíduo. Em vários aspectos, tais métodos compreendem a etapa de administração de qualquer uma das composições imunogênicas ou composições de vacina discutidas aqui ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imunológica. Em certos aspectos, a resposta imunológica compreende a produção de um anticorpo anti-OspA.

[00156] A invenção inclui métodos para a prevenção ou tratamento de uma infecção por Borrelia ou boreliose de Lyme em um indivíduo. Em vários aspectos, tais métodos compreendem a etapa de administração de qualquer das composições de vacina aqui discutidas ou qualquer uma das vacinas de combinação aqui discutidas ao indivíduo em uma quantidade eficaz para prevenir ou tratar a infecção por Borrelia ou borreliose de Lyme.

[00157] A invenção inclui o uso de polipeptídeos, ácidos nucleicos, anticorpos, composições farmacêuticas ou vacinas da invenção para o preparo de medicamentos. Outros aspectos relacionados também são fornecidos na presente invenção.

[00158] Os termos "compreendendo", "compreende" e "que compreende", no presente documento, são destinados, por parte dos inventores, a ser opcionalmente substituíveis pelos termos "consistindo em", "consiste em", "que consiste em", respectivamente, em todos os casos. O termo "compreende" significa "inclui". Assim, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreende" e variações como "que compreende" e "compreendendo"serão entendidas como implicando a inclusão de um composto ou composição especificados (por exemplo, ácido nucleico, polipeptídeo, anticorpo) ou etapa, ou grupo de compostos ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro componente, composição, etapas ou grupos dos mesmos. A abreviatura "e.g."é derivada do latim, exemplo gratia, e é usada aqui para indicar um exemplo não limitativo. Desse modo, a abreviatura "e.g."é sinônimo do termo "por exemplo".

[00159] As modalidades neste documento que se relacionam a "composições de vacina" da invenção também são aplicáveis às modalidades que se relacionam a "composições farmacêuticas"da invenção e vice-versa.

[00160] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta divulgação pertence. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.) The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado pela Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 - 56081 -569-8).

[00161] Os termos singulares "um", "uma", e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo "pluralidade" refere-se a dois ou mais. Deve-se compreender ainda que todos os tamanhos de base ou de aminoácido e todos os valores de peso e de massa molecular proporcionados para os ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados e são fornecidos para fins de descrição. Além disso, as limitações numéricas proporcionadas no que diz respeito às concentrações ou níveis de uma substância, tal como um antígeno, podem ser aproximadas.

[00162] Um transportador ou excipiente preferível para os polipeptídeos de acordo com a presente invenção em suas diversas modalidades, ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, é um composto imunoestimulante, como um adjuvante, para estimular adicionalmente a resposta imunológica do polipeptídeo de acordo com a presente invenção ou uma molécula de ácido nucleico de codificação do mesmo.

[00163] Adjuvantes ou compostos imunoestimulantes podem ser utilizados em composições da invenção. De um modo preferido, o composto imunoestimulante em composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção é selecionado dentre o grupo de substâncias policatiônicas, especialmente peptídeos policatiônicos, moléculas de ácidos nucleicos imunoestimulantes, desoxinucleotídeos, preferencialmente imunoestimulantes, óleo-em-água ou água-em-óleo, MF59, sais de alumínio, o adjuvante de Freund completo, o adjuvante de Freund incompleto, compostos neuroativos, especialmente o hormônio de crescimento humano, ou suas combinações.

[00164] O uso de um hidróxido de alumínio e/ou de um adjuvante de fosfato de alumínio é particularmente preferido e os antígenos são geralmente adsorvidos a esses sais. De um modo preferido, o hidróxido de alumínio está presente a uma concentração final de 0,15%. Um adjuvante de fosfato de alumínio útil é o hidroxifosfato de alumínio amorfo com PO4/Al de razão molar entre 0,84 e 0,92. Outro adjuvante útil na presente invenção é um sal de alumínio capaz de proporcionar uma composição aquosa que tenha menos de 350 ppb de metal pesado com base no peso total da composição aquosa. Um adjuvante à base de alumínio ainda mais útil é AS04, uma combinação de hidróxido de alumínio e monofosforil-lipídio A (MPL).

[00165] Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é uma composição farmacêutica que compreende pelo menos qualquer um dos seguintes compostos ou combinações dos mesmos: as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, os polipeptídeos de acordo com a presente invenção nas suas diversas modalidades, o vetor de acordo com a presente invenção, as células de acordo com a presente invenção e o anticorpo de acordo com a presente invenção. Em ligação com isso, qualquer desses compostos podem ser empregados em combinação com um transportador ou transportadores não estéreis ou estéreis para uso com células, tecidos ou organismos, como um transportador farmacêutico apropriado para administração a um indivíduo. Tais transportadores podem incluir, mas não estão limitados a, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol e suas combinações. A formulação deve se adequar ao modo de administração.

[00166] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um estabilizador. O termo "estabilizador" refere-se a um excipiente de vacina ou substância que protege a composição imunogênica da vacina de condições adversas, como aquelas que ocorrem durante o aquecimento ou a refrigeração e/ou prolonga a estabilidade ou o tempo de prateleira da composição imunogênica em um estado ou condição estável e imunogênico. Exemplos de estabilizadores incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais como sacarose, lactose e manose; álcoois de açúcar, tais como manitol; aminoácidos, tais como glicina ou ácido glutâmico; e proteínas, tais como albumina de soro humano ou gelatina.

[00167] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de qualquer maneira eficaz e conveniente, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal, intratraqueal ou intradérmica, entre outras. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas são administradas subcutaneamente ou por via intramuscular, mais preferencialmente por via intramuscular.

[00168] Em terapia ou como um profiláctico, o agente ativo da composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrado a um indivíduo como uma composição injetável, por exemplo, como uma dispersão aquosa esterilizada, de preferência isotônica.

[00169] Em alternativa, a composição, de preferência a composição farmacêutica, pode ser formulada para aplicação tópica, por exemplo sob a forma de pomadas, cremes, loções, pomadas para os olhos, gotas para os olhos, gotas para os ouvidos, elixir, pensos impregnados e suturas e aerossóis, e pode conter aditivos convencionais apropriados, incluindo, por exemplo, conservantes, solventes para auxiliar a penetração da droga e emolientes em pomadas e cremes. Essas formulações tópicas podem também conter transportadores convencionais compatíveis, por exemplo, bases de creme ou pomada, e etanol ou álcool oleílico para loções. Esses transportadores podem constituir desde cerca de 1% a cerca de 98% em peso da formulação; com mais frequência, eles constituirão até cerca de 80% em peso da formulação.

[00170] Além da terapia descrita acima, as composições da presente invenção podem ser usadas em geral como um agente de tratamento de feridas para evitar a adesão de bactérias às proteínas de matriz expostas no tecido do ferimento e para uso profilático no tratamento dental como uma alternativa para ou em conjunto com a profilaxia antibiótica.

[00171] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica é uma composição de vacina. De preferência, uma composição de vacina dessas se encontra, convenientemente, em forma injetável. Adjuvantes convencionais podem ser empregados para aumentar a resposta imunológica. Uma dose unitária adequada para a vacinação com um antígeno proteico é para adultos entre 0,02 µg e 3 µg de antígeno por kg de peso corporal e para crianças entre 0,2 µg e 10 µg de antígeno por kg de peso corporal, e essa dose é administrada preferencialmente de 1 a 3 vezes, em intervalos de 2 a 24 semanas.

[00172] Na gama de dose indicada, nenhum efeito toxicológico adverso que impedisse sua administração aos indivíduos adequados é esperado com os compostos da invenção.

[00173] Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma ou mais formulações farmacêuticas para administração a um indivíduo embaladas de uma maneira que facilite seu uso para administração a indivíduos. Em uma modalidade preferida, os kits compreendem a formulação em um volume final de 2 mL, mais preferencialmente em um volume final de 1 mL.

[00174] Em uma modalidade específica, a invenção inclui kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits, em vários aspectos, contêm, cada, um primeiro recipiente com uma proteína seca e um segundo recipiente com uma formulação aquosa. Também estão incluídos no escopo desta invenção kits contendo seringas pré-carregadas simples e com múltiplas câmaras (por exemplos, seringas de líquido e liosseringas).

[00175] Em outra modalidade, esse kit inclui uma formulação farmacêutica descrita aqui (por exemplo, uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo terapêuticos), embalada em um recipiente, como uma garrafa ou um recipiente vedado, com uma etiqueta fixada no recipiente ou inclusa no pacote, descrevendo o uso do composto ou da composição na prática do método. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é embalada no recipiente de modo que a quantidade de espaço livre no recipiente (por exemplo, a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja bastante pequena. De preferência, a quantidade de espaço livre é insignificante (isto é, quase nula).

[00176] Em um aspecto, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma proteína terapêutica ou composição de peptídeo e um segundo recipiente com uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição. Em um aspecto, a formulação farmacêutica é embalada em uma forma de dosagem unitária. O kit inclui ainda opcionalmente um dispositivo adequado para administrar a formulação farmacêutica de acordo com uma via específica de administração. Em alguns aspectos, o kit contém um rótulo que descreve a utilização das formulações farmacêuticas.

[00177] A composição farmacêutica pode conter uma gama de diferentes antígenos. Exemplos de antígenos são organismos completamente mortos ou atenuados, subfrações desses organismos, proteínas ou, em sua forma mais simples, peptídeos. Os antígenos também podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico na forma de proteínas ou peptídeos glicosilados e também podem ser ou conter polissacarídeos ou lipídios. Peptídeos curtos podem ser usados, visto que as células T citotóxicas (CTL) reconhecem os antígenos na forma de peptídeos curtos, em geral com 8-11 aminoácidos, juntamente com o complexo de histocompatibilidade principal (MHC). As células B podem reconhecer epítopos de 4 a 5 aminoácidos, bem como estruturas tridimensionais (epítopos conformacionais).

[00178] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica de outro aspecto compreende adicionalmente um antígeno soro-reativo hiperimune contra uma proteína Borrelia ou um fragmento ativo ou variante do mesmo, como, por exemplo, os antígenos, fragmentos e variantes, conforme descrito em WO2008/031133.

[00179] De acordo com a invenção, a composição farmacêutica de acordo com um outro aspecto pode ser usada como um medicamento, em particular como uma vacina, particularmente em ligação com uma doença ou condição médica que é causada por, ligada ou associada à Borrelia.

[00180] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada como um medicamento, em particular como uma vacina, particularmente em ligação com uma doença ou condição médica que é causada por, ligada com ou associada a Borrelia, mais preferencialmente qualquer espécie patogênica de Borrelia e mais preferencialmente em um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia, especialmente infecção por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi ou B. sinica, preferencialmente B. burgdorferi s.s., B. afzelii ou B. garinii.

[00181] Em ligação com isso, deve notar-se que as várias espécies de Borrelia, incluindo B. burgdorferi s.l., compreendem várias espécies e cepas, incluindo as apresentadas aqui. Uma doença relacionada, causada ou associada com a infecção bacteriana a ser prevenida e/ou tratada de acordo com a presente invenção inclui a borreliose de Lyme (doença de Lyme). Outros aspectos, sintomas, etapas e subgrupos da borreliose de Lyme, bem como grupos específicos de pacientes que sofrem de tais doenças, como também descritos no presente documento, incluindo na parte introdutória, são aqui incorporados por referência. Mais especificamente, a borreliose de Lyme geralmente ocorre em etapas, com remissão e exacerbações com manifestação clínica diferentes em cada fase. O estágio inicial de infecção 1 consiste em uma infecção localizada da pele, ocorrida após dias ou semanas do estágio 2, infecção disseminada e meses ou anos mais tarde pelo estágio 3, infecção persistente. No entanto, a infecção é variável; alguns pacientes têm apenas as infecções da pele localizada, enquanto outros mostram manifestações tardias da doença, tais como artrite.

[00182] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por Borrelia em um indivíduo em necessidade, compreendendo a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de acordo com o terceiro aspecto.

[00183] O termo "indivíduo" é utilizado ao longo do relatório descritivo para descrever um animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano, a quem um tratamento ou um método de acordo com a presente invenção é fornecido. Para o tratamento destas infecções, condições ou estados de doença que são específicos para um animal específico, como um paciente humano, o termo paciente refere-se a esse animal específico. De preferência, o indivíduo é um humano; todavia, o uso médico da composição também pode incluir animais, como aves, incluindo frango, peru, pato ou ganso, animais como cavalo, vaca ou ovelha ou animais domésticos, como cães e gatos.

[00184] O termo "quantidade eficaz"é utilizado ao longo do relatório descritivo para descrever uma quantidade da presente composição farmacêutica que pode ser usada para induzir um resultado almejado quando usado no método da presente invenção. Em vários aspectos da presente invenção, o termo quantidade eficaz é utilizado em conjunto com o tratamento ou prevenção. Em outros aspectos, o termo quantidade eficaz refere-se simplesmente a uma quantidade de um agente que produz um resultado que é visto como sendo benéfico ou útil, incluindo nos métodos de acordo com a presente invenção, em que o tratamento ou prevenção de uma infecção por Borreliaé almejada.

[00185] O termo quantidade eficaz, no que diz respeito aos compostos e composições descritos presentemente, é utilizado ao longo do relatório descritivo para descrever a quantidade administrada a um paciente mamífero do composto de acordo com a presente invenção, incluindo especialmente um paciente humano, sofrendo de uma doença associada com Borrelia, para reduzir ou inibir uma infecção por Borrelia.

[00186] Em uma modalidade preferida, o método para imunizar um indivíduo de acordo com o aspecto acima compreende a etapa de administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica do terceiro aspecto da presente invenção.

[00187] O método compreende a indução de uma resposta imunológica em um indivíduo através da terapia de gene ou de outra forma, através da administração de um polipeptídeo ou ácido nucleico de acordo com a presente invenção in vivo a fim de estimular uma resposta imunológica para produzir anticorpos ou uma resposta de células T mediada por células, de células T produtoras de citocinas ou células T citotóxicas, para proteger o referido indivíduo da doença, independente se essa doença já está estabelecida no indivíduo ou não.

[00188] Os produtos da presente invenção, em particular os polipeptídeos e ácidos nucleicos, são de preferência proporcionados em forma isolada, e podem ser purificados até à homogeneidade. O termo "isolado", tal como aqui utilizado, significa separado "pela mão do homem" a partir do seu estado natural; isto é, se ocorre na natureza, foi alterado ou removido do seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural ou um polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivo no seu estado natural não está "isolado", mas a mesma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes do seu estado natural está "isolado", como o termo é aqui utilizado. Como parte de, ou após o isolamento, tais moléculas de ácido nucleico podem ser unidas a outras moléculas de ácidos nucleicos, tais como moléculas de DNA, para mutagênese, para formar genes de fusão e para a propagação ou expressão em um hospedeiro, por exemplo. As moléculas de ácidos nucleicos isoladas, sozinhas ou unidas a outras moléculas de ácidos nucleicos, tais como vetores, podem ser introduzidas em células hospedeiras, em cultura ou em organismos inteiros. Introduzidas em células hospedeiras em cultura ou em organismos inteiros, tais moléculas de DNA ainda estariam isoladas, tal como o termo é aqui utilizado, pois não estariam na sua forma de ocorrência natural ou ambiental. Do mesmo modo, as moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos podem ocorrer em uma composição, tais como formulações de meios, soluções para a introdução de moléculas de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, por exemplo, em células, composições ou soluções para reações químicas ou enzimáticas, por exemplo, que não são composições que ocorrem naturalmente, e, nela permanecem moléculas de ácido nucleico isoladas ou polipeptídeos dentro do significado desse termo tal como é aqui utilizado.

[00189] A invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos aqui, porque eles podem variar. Além disso, a terminologia é aqui usada com a finalidade de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a se limitar ao âmbito da presente invenção. Como usado neste documento e nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as plurais referências, a menos que o contexto especifique claramente o contrário. Da mesma forma, as palavras "compreender", "conter" e "abranger"são para serem interpretadas inclusivamente, em vez de exclusivamente.

[00190] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos e quaisquer acrônimos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica no campo da invenção. Apesar de quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento poderem ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos neste documento.

[00191] A presente invenção é ainda ilustrada pelas seguintes figuras, tabelas, exemplos e listagem de sequências, a partir dos quais podem ser aproveitadas características, vantagens e modalidades adicionais. Como tal, as modificações específicas discutidas não serão interpretadas como limitações no escopo da invenção. Será evidente para a pessoa versada na técnica que vários equivalentes, alterações e modificações podem ser feitos sem nos afastarmos do escopo da invenção e assim é para ser compreendido que tais modalidades equivalentes serão incluídas neste documento.

[00192] Em ligação com a presente invenção.

[00193] A figura 1 mostra isocontornos de potencial eletrostático de fragmentos estabilizados de ligação dissulfeto de sorotipo 1-sorotipo 6 e OspA de B. valaisiana (S1D1-S6D1 e BvaD1), bem como o fragmento OspA da fusão mutante da invenção que consiste nos aminoácidos 125176 de B. valaisiana, cepa VS116 e aminoácidos 177-274 de B. garinii, cepa PBR, e com uma ligação dissulfeto introduzida (S3hybD1).

[00194] A figura 2 mostra o alinhamento de aminoácidos de Lip- S4D1-S3hybD1, a proteína heterodimérica que contém o fragmento de fusão OspA de sorotipo 3 mutante da invenção, com a proteína heterodimérica Lip-S4D1-S3D1.

[00195] A figura 3 mostra esquematicamente a produção de heterodímeros de fragmentos de OspA mutantes de acordo com a presente invenção.

[00196] A figura 4 representa, esquematicamente, os componentes de polipeptídeo de uma composição farmacêutica da presente invenção, uma "vacina de combinação melhorada", que compreende três heterodímeros de OspA mutantes diferentes, incluindo Lip-S4D1- S3hybD1.

[00197] A figura 5 mostra a estrutura química de Pam3Cys, um exemplo de uma cisteína substituída por ácido graxo, tal como seria encontrado no terminal-N dos polipeptídeos lipidados da presente invenção.

[00198] A figura 6 mostra os títulos de anticorpos IgG para proteínas OspA de Borrelia de sorotipo 1-6 produzidos em camundongos em resposta à imunização com a vacina melhorada de combinação heterodimérica da invenção.

[00199] A figura 7 mostra a ligação de anticorpos a partir de camundongos imunizados com a vacina melhorada de combinação heterodimérica da invenção para a superfície da célula de espiroquetas de Borrelia de sorotipos OspA 1-6. Tabela 1 compara o rendimento de purificação do heterodímero Lip- S4D1-S3hybD1 e o heterodímero Lip-S4D1-S3D1. Tabela 2 mostra a capacidade protetora da vacina melhorada de combinação heterodimérica da invenção contra o desafio in vivo com Borrelia de sorotipos OspA 1, 2, 5 e 6.

[00200] As figuras e tabelas, que podem ser referidas na especificação são descritas abaixo em mais detalhe.

[00201] A figura 1 A simulação de potencial eletrostático dos fragmentos OspA estabilizados da ligação dissulfeto dos sorotipos 1-6 (S1D1-S6D1) e B. valaisiana (BvaD1), bem como o fragmento OspA da fusão estabilizada de ligação dissulfeto (S3hybD1). Os isocontornos (+/1 kT/e) são de cor brilhante para cargas negativas e de cor escura para cargas positivas, tal como uma superfície sólida. A superfície de solvente acessível é processado como um gráfico em grade de linhas. As setas brancas indicam a posição das duas aglomerações estendidas dando origem a polaridade eletrostática no mesmo plano do fragmento de sorotipo 3. Pode ser visto que as superfícies do fragmento de terminal-C de OspA híbrido não possuem as aglomerações polares eletrostáticas estendidas como o monômero S3D1.

[00202] A figura 2 o alinhamento da sequência de aminoácido de polipeptídeos heterodimericos Lip-S4D1-S3hybD1 e Lip-S4D1-S3D1, mostrando a sequência de consenso. O heterodímero Lip-S4D1- S3hybD1 difere do heterodímero Lip-S4D1-S3D1 por apenas 31 aminoácidos no total.

[00203] A figura 3 A produção de um heterodímero mutante de OspA da invenção que compreende dois fragmentos do terminal-C de OspA mutante selecionados a partir de diferentes sorotipos OspA de Borrelia sp. ou um fragmento do terminal-C de OspA mutante híbrido. (A) A representação esquemática de um ácido nucleico que codifica um heterodímero de OspA mutante lipidado. Os componentes, a partir de 5' para 3', compreendem as sequências de codificação para uma sequência de sinal de lipidação (sinal de Lip), um peptídeo de CSS para a lipidação do terminal-N, um fragmento do terminal-C mutante de OspA com duas cisteínas não nativas, um peptídeo ligante curto (LN1), seguido por um segundo fragmento do terminal-C de OspA mutante com duas cisteínas não nativas. (B) O polipeptídeo heterodimérico de OspA mutante intermediário compreende o produto nascente diretamente após a tradução da construção de ácido nucleico. A partir do terminal-N ao terminal-C, este polipeptídeo é composto por uma sequência de sinal de lipidação (sinal de Lip), um peptídeo CSS para a lipidação, um fragmento de OspA mutante com uma ligação dissulfeto não nativa, um peptídeo ligante curto (LN1), seguido por um segundo fragmento de OspA mutante com uma ligação dissulfeto não nativa. (C) O polipeptídeo heterodimérico de OspA mutante lipidado final após a modificação pós-translacional. O heterodímero, a partir do terminal-N ao terminal-C, é composto por um peptídeo CSS com a cisteína lipidada do terminal-N, um fragmento de OspA mutante estabilizado por uma ligação dissulfeto, um peptídeo ligante (LN1), e um segundo fragmento de OspA mutante estabilizado por uma ligação dissulfeto. A sequência de sinal de lipidação é clivada durante a modificação pós-tradução do polipeptídeo como mostrado.

[00204] A figura 4 Um exemplo de uma composição farmacêutica preferida de acordo com a presente invenção. Três heterodímeros de OspA mutantes, cada um compreendendo dois fragmentos de OspA mutados selecionados a partir de diferentes sorotipos de OspA de Borrelia ou um fragmento do terminal-C de OspA mutante híbrido (S3hybD1) estão presentes na composição, proporcionando em conjunto antígenos de OspA a partir de seis sorotipos de OspA de Borrelia diferentes. Esta composição farmacêutica permite a imunização simultânea contra seis sorotipos de Borrelia.

[00205] A figura 5 A ilustração da estrutura química de Pam3Cys, um exemplo de uma substituição de ácido graxo da cisteína de terminal-N da proteína de OspA de tipo selvagem de comprimento inteiro, bem como os heterodímeros de fragmento de OspA mutante lipidado da invenção. Durante a modificação pós-tradução de uma proteína de OspA de comprimento inteiro ou polipeptídeos da invenção, a sequência de sinal de lipidação do terminal-N é clivada e ácidos graxos, mais comumente três frações de palmitoil ("Pam3"), são enzimaticamente ligados covalentemente ao resíduo da cisteína do terminal-N (o átomo de enxofre,"S", é indicado por uma seta). Os resíduos restantes da cadeia polipeptídica, que estão localizados no terminal-C do resíduo de Pam3Cys, são representados por "Xn". (Modificados a partir de Bouchon, et al. (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61).

[00206] A figura 6 Os títulos de anticorpos gerados para todos os seis sorotipos de proteínas de OspA de comprimento inteiro. Os camundongos foram imunizados três vezes com 3 µg cada um com as vacinas de combinação indicadas: Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 e Lip-S5D1-S6D1 em conjunto em uma razão de 1:1:1 ("Combo het"); Lip- S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 e Lip-S5D1-S6D1 em conjunto em uma razão de 1:1:1 ("Combo het melhorado") ou com Lip-quimérico OspA ST1/ST2-His, Lip-quimérico OspA ST5/ST3-His e Lip-quimérico OspA ST6/ST4-His juntos em uma razão de 1:1:1 ("Combo quimérico") em intervalos de duas semanas e os soros foram coletados a uma semana após a última dose. Os títulos dos anticorpos de IgG para seis sorotipos diferentes das proteínas de OspA de comprimento inteiro foram determinados por ELISA.

[00207] A figura 7 A ligação de anticorpos a partir de camundongos imunizados para a superfície celular de espiroquetas de Borrelia. Os camundongos foram imunizados conforme descrito acima e os soros foram coletados a uma semana após a última dose e agrupados. As diluições em série dos soros foram testadas quanto à ligação à superfície celular de espiroquetas de Borrelia via coloração celular e citometria de fluxo. Os valores de intensidade de fluorescência observados quando da coloração com soros coletados de camundongos de controle imunizados com Al(OH)3 adjuvante isoladamente foram subtraídos para explicar a ligação não específica. (Borrelia utilizada no ensaio de ligação foram os seguintes: B. burgdorferi, sorotipo 1 de OspA, cepa N40; B. afzelii, sorotipo 2 de OspA, cepa PKo; B. garinii, sorotipo 3 de OspA, cepa Fr; B. bavariensis, sorotipo 4 de OspA, cepa Fin; B. garinii, sorotipo 5 de OspA, cepa PHei; B. garinii, sorotipo 6 de OspA, cepa KL11.)

EXEMPLOS Exemplo 1. Modelagem molecular do fragmento C-terminal de OspA do sorotipo 3 híbrido Motivação para construir fragmentos C-terminal de ST3 de OspA híbrido

[00208] A vacina de combinação de borreliose de Lyme, como descrito no nosso pedido anterior (WO2014/006226) é composta por três heterodímeros de OspA mutantes. Os fragmentos estabilizados curtos a partir de dois serotipos (ST) diferentes de OspA, derivados do domínio C-terminal, são fundidos com um ligante curto para formar um heterodímero. Os três heterodímeros são compostas por OspA ST1- ST2, ST4-ST3 e ST5-ST6. Para a melhoria da imunogenicidade dos heterodímeros, uma sequência de sinal para lipidação é adicionada em analogia com OspA maduro de comprimento inteiro que é uma lipoproteína.

[00209] O heterodímero lipidado composto por OspA ST4-ST3 (Lip- S4D1-S3D1; SEQ ID NO: 31) se provou ser menos solúvel do que os dois outros heterodímeros, o que resulta em baixa recuperação durante a purificação. Este problema pode ser atribuído principalmente à porção OspA ST3 estabilizado curto a partir desta proteína, como um monômero lipidado, não pode ser expressada nem purificada.

Modelagem molecular

[00210] A investigação estrutural comparativa dos monômeros estabilizados foi realizada in silico para elucidar a compatibilidade das dobras entre os modelos monoméricos em comparação com a estrutura cristalina de OspA (PDB:1OSP; Li H, Dunn JJ, Luft BJ, Lawson CL (1997) Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. Proc Natl Acad Sci 94: 3584-3589) e para comparar suas propriedades superficiais com o monômero tipo ST3. A estrutura cristalina representa sorotipo 1 de Borrelia burgdorferi B31, e mostra OspA ligada com seu N-terminal, com o anticorpo de murino Fab 184,1. Os modelos de estrutura de homologia dos seis monômeros de OspA estabilizados curtos foram construídos começando com os modelos de homologia e estrutura cristalina de OspA de ST1 disponíveis (SwissModel; Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Schwede T (2009) The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37: D387-392), que foram, então, modificados para incorporar as ligações dissulfeto de estabilização e alterações de sequência quando aplicáveis (The PyMOL Molecular Graphics System, Version Open-Source, Schrodinger LLC).

[00211] Os isocontornos de potencial eletrostático de todos os seis monômeros de OspA estabilizados curtos foram simulados com o solucionador adaptativo de Poisson-Boltzmann (APBS; Baker NA, Sept D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA (2001) Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci 98: 10037-10041, pdb2pqr; Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, et al. (2007) PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res 35: W522-525) para determinar se a proteína de OspA ST3 estabilizada curta tem um padrão na eletrostática da superfície que se desvia dos outros ST OspA, o que poderia explicar o problema da solubilidade de OspA ST3 curto estabilizado ("S3D1", figura 1). A polaridade significativa na distribuição de carga foi observada de um lado do S3D1 (ver setas), que não foi observada em nenhum dos outros STs de OspA curtos estabilizados.

[00212] Uma simulação de potencial eletrostático também foi realizada com OspA curto estabilizado a partir de B. valaisiana ("BvaD1", figura 1). O fragmento BvaD1 OspA exibiu uma polaridade variante dos isocontornos de potencial eletrostático na superfície, o que tornava um bloco de construção de candidato potencial para uma troca segmentar parcial com o objetivo de modificar a superfície global de não mostrar quaisquer aglomerações estendidas significativas da polaridade eletrostática estendida como encontrado em S3D1. A ligação preferencial entre a parte do sorotipo 3 e a parte trocada a partir de B. valaisiana no monômero híbrido foi escolhida para substituir o N- terminal em folha beta do monômero e para deixar duas folhas beta e hélice a C-terminal da parte de sorotipo 3 intacta, sob retenção da dobra global. A última condição depende em grande medida da compatibilidade estérica dos resíduos hidrofóbicos densamente empacotados no núcleo da molécula. A compatibilidade de dobra para o modelo do monômero estabilizado híbrido, S3hybD1, foi verificada com a simulação mecânica molecular (Gromacs; Pronk S, Pall S, Schulz R, Larsson P, Bjelkmar P, et al. (2013) GROMACS 4.5: a high- throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29: 845-854). Aplicação em forma de heterodímeros que contêm o fragmento de OspA híbrido

[00213] Como resultado das simulações de potencial eletrostático, um novo heterodímero contendo a fusão experimental de fragmentos de proteínas de OspA a partir de B. valaisiana e B.garinii (S3hybD1, figura 1), foi clonado: Lip-S4D1-S3hybD1. Para além das alterações do primeiro terço do fragmento de sorotipo 3 de OspA no heterodímero, S4D1-S3hybD1, em comparação com Lip S4D1-S3D1, uma substituição de aminoácido na posição 233 (P233T, nomenclatura de aminoácidos de acordo com OspA de comprimento inteiro imaturo; SEQ ID NO: 8) de OspA ST3 foi introduzida.

[00214] Conforme ilustrado em mais detalhe abaixo, este novo heterodímero mostra substancialmente uma solubilidade melhorada, bem como a imunogenicidade contra a Borrelia que expressa OspA de sorotipo 3 quando purificada e utilizada para imunizar camundongos.

Exemplo 2. Purificação e formulação de heterodímeros de fragmento de OspA mutante lipidados Clonagem e expressão de heterodímeros de fragmento de OspA mutante não marcado com His lipidados

[00215] O monômero de OspA da fusão B. valaisiana/B.garinii da cepa VS116/PBr foi códon-otimizado para a expressão de E. coli pela GeneArt (Alemanha). A sequência de sinal de lipidação adicionada à extremidade N-terminal foi derivada a partir da lipoproteína de membrana externa principal de E. coli, Lpp, e foi seguido diretamente no C-terminal por um peptídeo CSS para proporcionar uma cisteína N- terminal para lipidação. A construção melhorada do heterodímero foi gerada através da fusão do fragmento de OspA mutante do sorotipo 4 e do fragmento de OspA híbrido do sorotipo 3 através da sequência ligante "LN1". Os fragmentos de genes foram clonados no vetor pET28b(+) (Novagen, EUA), e os heterodímeros estabilizados foram expressados em células BL21(DE3) (Invitrogen, EUA). As células foram coletadas após 4 horas por centrifugação e o sedimento foi armazenado a -70°C durante até 12 meses antes do processamento adicional. Purificação de heterodímeros de fragmento de OspA mutante lipidados

[00216] As células foram rebentadas mecanicamente através da homogeneização de alta pressão e os heterodímeros de fragmento de OspA mutante lipidados, Lip-S4D1-S3D1 e Lip-S4D1-S3hybD1, foram enriquecidos na fase lipídica por separação de fases, utilizando Triton X-114, como detergente. Subsequentemente, a fase de detergente diluído foi submetida a cromatografia de permuta aniônica (Q- sepharose; GE Healthcare, Reino Unido) operada em modo de não ligação. O efluente resultante foi carregado em uma coluna de hidroxiapatite (Bio-Rad, EUA) e as proteínas lipidadas foram eluídas da coluna por um gradiente linear de sal. O eluato foi submetido a purificação adicional através de uma coluna de DEAE-Sepharose (GE Healthcare) no modo de não ligação, seguida por coluna de filtração em gel (Superdex 200, GE Healthcare) para a permuta de tampão. Os picos de heterodímero de OspA mutante lipidados foram agrupados com base na coluna de exclusão de tamanho analítica e SDS-PAGE. Após uma filtração esterilizada, os heterodímeros purificados foram armazenados a -20 ° C até à formulação.

Formulação da vacina de combinação

[00217] Estudos sobre a formulação da vacina de combinação da presente invenção foram realizados a fim de optimizar a estabilidade. Diferentes tipos de tampões e estabilizadores foram testados a várias concentrações em combinação com hidróxido de alumínio e antígeno, conforme descrito no nosso anterior pedido WO2014/006226. Uma formulação ideal de 40 µg/mL de cada um dos três heterodímeros (120 µg de proteína total), 10 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, 10 mM de L-metionina, 5% de sacarose, 0,05% de Tween 20 (polissorbato 20) e 0,15% (w/v) de hidróxido de alumínio a um pH de 6,7 ± 0,2 foi determinada.

Resultados

[00218] O heterodímero melhorado, Lip-S4D1-S3hybD1 mostrou um rendimento de cerca de 4 vezes mais elevado em termos de mg/g de biomassa, uma melhoria significativa sobre Lip-S4D1-S3D1. Adicionalmente, a pureza comparável da preparação de heterodímero melhorada foi obtida com menos uma etapa de cromatografia. (Consultar a Tabela 1.) Tabela 1. Rendimento melhorado de heterodímero Lip S4D1-S3hybD1 em comparação com Lip-S4D1-S3D1.

Exemplo 3. Imunogenicidade de heterodímeros de fragmento de OspA mutante lipidados de diferentes sorotipos. Imunização de camundongos

[00219] Camundongos C3H/HeN fêmeas foram usados para todos os estudos. Antes da imunização, os grupos de dez camundongos foram sangrados através da veia facial e os soros pré-imunes foram preparados e agrupados. Três imunizações s.c., de 100 µL cada uma, foram administradas em intervalos de duas semanas. Cada dose continha 1 µg das proteínas do heterodímero respectivas. Para a melhoria da vacina de combinação de heterodímero: Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27) e Lip-S5D1- S6D1 (SEQ ID NO: 33); para a vacina de combinação de heterodímero da invenção anterior: Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29), Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 31) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33) e para a vacina de combinação quimérica: Lip-quimérica OspA ST1/ST2-His (SEQ ID NO: 40), Lip-quimérica OspA ST5/ST3-His (SEQ ID NO: 41) e Lip-quimérica OspA ST6/ST4-His (SEQ ID NO: 42). Todas as vacinas de combinação foram formuladas com hidróxido de alumínio (Al (OH)3) a uma concentração final de 0,15%. Uma semana após a terceira imunização, foi coletado sangue da veia facial e soros imunes preparados. Em cada ensaio, um grupo imunizado com PBS formulado com Al (OH)3 foi incluído como um controle negativo (grupo de placebo). Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a legislação austríaca (BGB1 N° 501/1989) e aprovado pelo "Magistratsabteilung 58".

ELISA de OspA

[00220] ELISA de placas (Maxisorp, Nunc, Dinamarca) foram revestidas com 50 ng (1 µg/mL) de proteína diluída em tampão de revestimento (PBS) por poço e incubadas a 4 ° C durante 16 a 72 horas. Os antígenos de revestimento foram ST1-6 de OspA lipidado de comprimento inteiro marcado com His no C-terminal. O tampão de revestimento foi rejeitado e foram adicionados 100 µL de tampão de bloqueio (1% de BSA, 0,5% de Tween-20, PBS) e incubado à temperatura ambiente durante 1-2 horas. As placas foram lavadas três vezes com 300 µL (transbordo) PBST (0,1% de Tween-20, PBS). As diluições de cinco vezes de soros foram feitas em tampão de bloqueio e 50 µL foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 µL (transbordo), PBST. O anticorpo secundário (peroxidase de rábano, coelho [HRP]-conjugado, IgG anti-camundongo, DAKO, Dinamarca) foi diluído 1:2000 em tampão de bloqueio e 50 µL foi adicionado a cada poço e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 µL (transbordo), PBST. ABTS (ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico), Sigma-Aldrich, EUA) foi utilizado como substrato para HRP, 50 µL de ABTS foi adicionado a cada poço e incubado durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 50 µL de 1% de SDS e a absorvância foi lida a 405 nm. Uma placa foi considerada válida quando a absorvância do branco foi inferior a 0,1. Uma amostra foi válida quando a menor diluição tinha uma absorvância acima de 1,0 e a diluição mais elevada estava abaixo de 0,1. Quando esses critérios foram cumpridos, foi determinado o título de meio-max. A título de meio- max é o recíproco da diluição que corresponde à absorvância média entre as mais altas e mais baixas diluições.

Citometria de fluxo

[00221] Espiroquetas (1x106) foram misturados com um volume igual de paraformaldeído a 4% e incubados durante 2 horas à temperatura ambiente em uma placa de 96 poços (Nunclon 96U, Nunc). A placa foi centrifugada durante 5 minutos a 2.000 g e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas com 150 µL de HBSS com BSA a 2% (HBSS-B), centrifugadas conforme acima, e o sobrenadante foi descartado. Os soros de camundongo foram inativados pelo calor, incubando-os a 56 ° C durante 35 minutos. Os soros inativados pelo calor foram diluídos em HBSS-B e filtrados estéreis por centrifugação a 4.000 g durante 3 minutos usando filtros de tubo de centrifugação Costar spin-X (0,22 µm, Corning, EUA). As espiroquetas foram dissolvidas em 100 µL de soro e incubadas durante 45 minutos à temperatura ambiente. A placa foi centrifugada durante 15 minutos a 2.000 g e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas uma vez com 150 µL de HBSS- B e, em seguida, suspensas novamente em 100 µL de HBSS-B. Um microlitro de anticorpo secundário (IgG anti-camundongo de cabra conjugada PE, Beckman Coulter, EUA) foi adicionado às células e incubado à temperatura ambiente durante 45 minutos no escuro. As espiroquetas foram lavadas uma vez com 150 µL de HBSS-B e, em seguida, suspensas novamente em 200 µL de HBSS contendo 2,5 µM de SYTO-17 corante de DNA e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. As espiroquetas coradas foram sedimentadas por centrifugação durante 5 minutos a 2.000 g e subsequentemente suspensas novamente em 200 µL de HBSS. As espiroquetas marcadas foram medidas com um citômetro de fluxo FC500 (Beckman Coulter), fechado para ventos positivos de SYTO-17.

Resultados

[00222] Duas formulações diferentes de heterodímero de OspA ("Combo het" e "Combo het melhorado"), bem como uma combinação quimérica de OspA ("Combo quimérico") foram testadas quanto à imunogenicidade em camundongos. Os soros hiperimunes foram analisados por ELISA quanto a reatividade contra OspA de comprimento inteiro (antígeno de revestimento), bem como para a ligação à superfície às cepas de Borrelia que expressam diferentes sorotipos de OspA (ST1 a ST6).

[00223] Os resultados de ELISA indicaram que todas as combinações de vacina estimularam as respostas de anticorpos para todos os seis sorotipos de OspA (consultar a figura 6). É especialmente notável no que diz respeito à presente invenção que a melhoria da vacina de combinação de heterodímero de OspA resultou em níveis mais elevados de anticorpos específicos para o sorotipo 3 de OspA em comparação com a vacina de combinação de heterodímero de OspA da invenção anterior, ao passo que os níveis de anticorpos para outros sorotipos de OspA foram comparavelmente estimulados por ambas as vacinas.

[00224] A ligação de anticorpos a partir de soros de camundongo hiper-imunes diretamente para espiroquetas de borrelia foi observada no caso de Borreliae expressando todos os seis sorotipos de OspA (ver a figura 7), indicando que os anticorpos gerados em resposta a todos os antígenos são funcionalmente ativos e podem ligar-se a OspA nativa in situ. A intensidade de fluorescência foi linear ao longo de um grande intervalo de diluições do soro. A intensidade de fluorescência observada em resposta à melhoria da vacina de combinação de heterodímero às espiroquetas foi comparável às observadas em resposta à vacina de combinação de heterodímero e a vacina de combinação quimérica. Notavelmente, no que diz respeito à ligação ao serotipo 3 de OspA de borrelia, os anticorpos gerados por imunização com a vacina melhorada foram superiores aos anticorpos da geração em resposta a ambas as outras vacinas de combinação.

Exemplo 4. Capacidade de proteção da vacina de combinação de heterodímero melhorada contra o desafioin vivo de Borrelia Imunização de camundongos

[00225] Camundongos C3H/HeN (H-2k) fêmeas foram usadas para todos os estudos (Janvier, França). Antes de cada desafio, os grupos de cinco camundongos de 8 semanas de idade foram sangrados através da veia da cauda e os soros pré-imunes foram preparados e agrupados. Três (s.c.) imunizações subcutâneas de 100 µL foram administradas a intervalos de duas semanas nas doses indicadas na Tabela 2. Tanto a vacina de combinação de heterodímero melhorada quanto a vacina de combinação quimérica incluíram três proteínas a uma razão de 1: 1: 1, tal como descrito no Exemplo 3. Todas as formulações de hidróxido de alumínio incluíram (Al (OH)3) a uma concentração final de 0,15%. Uma semana depois da terceira imunização, o sangue foi coletado e os soros hiper-imunes foram preparados. Em cada ensaio, um grupo injetado com apenas Al (OH)3 (em tampão de formulação ou PBS) foi incluído como um controle negativo e um grupo de camundongos imunizados com a proteína de OspA lipidada de comprimento inteiro de tipo selvagem do sorotipo de OspA apropriado serviram como grupo de controle positivo (B. burgdorferi cepa B31 (sorotipo 1 de OspA, SEQ ID NO: 34), B. afzelii cepa K78 (sorotipo 2 de OspA, SEQ ID NO: 35), B.garinii cepa PHei (sorotipo 5 de OspA, SEQ ID NO: 38) ou B.garinii cepa DK29 (sorotipo 6 de OspA, SEQ ID NO: 39)). Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a legislação austríaca (BGB1 N° 501/1989) e aprovado pelo "Magistratsabteilung 58". Desafio de agulha de camundongos imunizados com in vitro Borrelia madura

[00226] Duas semanas após a última imunização, os camundongos foram desafiados s.c. com espiroquetas diluídas em 100 µL de meio de crescimento (BSKII). B. burgdorferi cepa ZS7 expressando sorotipo 1 de OspA (experimentos 1 e 2), B.garinii cepa PHei expressando sorotipo 5 de OspA (experimentos 10 a 13) ou B.garinii cepa Ma expressando serotipo 6 de OspA (experimentos 14 a 17) foram utilizados para o desafio. As doses de desafio foram dependentes da cepa e dependente da virulência das cepas individuais, o que foi avaliado por ensaios de desafio para a determinação de ID50. As doses utilizadas para os ensaios de desafio de agulha variaram de 20 a 50 vezes o ID50. Antes de cada desafio, a expressão de OspA foi verificada por meio de citometria de fluxo (ver o exemplo 3). Desafio de camundongos foi apenas realizado com culturas em que > 80% das células foram positivas para a expressão de OspA. Desafio de camundongos imunizados com carrapatos infectados com B. burgdorferi ou B. afzelii ("Desafio de carrapato")

[00227] Duas semanas após a última imunização, os camundongos foram desafiados com carrapatos portando B. burgdorferi cepa Pra4 expressando sorotipo 1 de OspA (experimento 3), B. burgdorferi cepa Pra1 expressando sorotipo 1 de OspA (experimentos 4 e 5) ou B. afzelii expressando sorotipo 2 de OspA (experimentos 6 a 9). A fim de facilitar a infecção por carrapato dos camundongos imunizados, os pelos da parte traseira de cada camundongo foram removidos com creme Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) e um recipiente ventilado pequeno foi colado à pele com super-cola (Pattex, Alemanha). Posteriormente, duas ou três ninfas I. ricinus infetadas com B. burgdorferi cepa Pra1 ou Pra 4 ou B. afzelii cepa IS1 foram aplicadas por camundongo e deixadas a se amarrar e alimentar até que elas estavam totalmente inchadas e caíram. O estado de alimentação foi monitorado diariamente para cada carrapato individual. Apenas aqueles camundongos a partir dos quais, pelo menos, um carrapato totalmente ou quase totalmente alimentado foi coletado foram incluídos na leitura final.

Sacrifício de camundongos e coleta de material

[00228] Quatro ou seis semanas após o estímulo de carrapato ou agulha, respectivamente, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. O sangue foi coletado por sangramento orbital e os soros finais foram preparados e utilizados para VlsE ELISA e/ou Western blot para determinar o estado da infecção. Além disso, a bexiga urinária de cada camundongo foi coletada e o DNA foi extraído e submetido a PCR quantitativa (qPCR) para a identificação de Borrelia.

ELISA com a Região Invariável 6 (IR6) de VlsE

[00229] Um peptídeo de 25-mer biotinilado (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK, SEQ ID NO: 59) derivado da sequência de B.garinii cepa IP90 foi utilizada para a análise (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. Uma região conservada imunodominante dentro do domínio variável de VlsE, o antígeno de superfície variável de Borrelia burgdorferi. J Immunol. 1999; 163:5566-73). As placas de ELISA com 96 poços pré-revestidos de estreptavidina (Nunc) foram revestidas com 100 µL/poço (1 µg/mL) de peptídeo em PBS suplementado com 0,1% de Tween (PBS/0,1T). As placas foram incubadas durante a noite a 4 ° C. Após revestimento com o peptídeo, as placas foram lavadas uma vez com PBS/0,1T. As placas foram depois bloqueadas durante uma hora à temperatura ambiente (RT) com 100 µL/poço de PBS + BSA a 2%, antes de serem novamente lavadas com PBS/0,1T. Reatividade de soros pós-desafiados (soro final) com o peptídeo foi testada a diluições de 1: 200 e 1: 400 em PBS + BSA a 1%. As placas foram incubadas durante 90 minutos à temperatura ambiente antes de serem lavadas três vezes com PBS/0,1T. Cada poço recebeu então 50 µL de 1,3 µg/mL de IgG anti- camundongo policlonal de coelho conjugada a HRP (Dako) em PBS + BSA a 1%. As placas foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS/0,1T, ABTS (50 µL/ poço) foi adicionado como substrato (Sigma-Aldrich) e a cor foi deixada a desenvolver durante 30 minutos. A absorvância foi medida a 405 nm. Todos os soros foram testados em duplicata. Os controles negativos incluíram PBS em vez de soro, bem como placas não revestidas com o peptídeo. Os soros de camundongos que se mostram ser positivos para cultura para a infecção por Borrelia foram utilizados como controles positivos. Purificação e extração de DNA

[00230] A bexiga urinária cada camundongo foi submetido a extração e purificação de DNA utilizando o Kit "DNeasy Blood and Tissue" (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, com a seguinte modificação. Cada bexiga urinária foi digerida durante a noite a 60 ° C, utilizando 100 µL de proteinase K recombinante (grau de PCR; 14-22 mg/mL, Roche). O DNA foi eluído em 50 µL de água desionizada estéril e armazenado a -20 ° C. Como um controle negativo, cada décima amostra foi seguida por uma coluna de purificação vazia em cada extração e purificação de DNA. qPCR direcionando recA

[00231] Os iniciadores oligonucleotídicos foram projetados para o gene recA de uma maneira em que eles poderiam ser usados em qPCR para a identificação de todas as espécies relevantes de Borrelia que causam borreliose de Lyme (frente: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, SEQ ID NO: 57, reverso: CCCATTTCTCCATCTATCTC, SEQ ID NO: 58). O fragmento recA foi clonado a partir de B. burgdorferi S.S. cepa N40 em pET28b(+), para ser utilizado como padrão em cada reação. O DNA cromossômico extraído da bexiga urinária de camundongo foi diluído 1: 4 em água a fim de reduzir os efeitos da matriz observados com DNA não diluído. A mistura principal que consiste em 10 µL de SSoAdvanced ™ SYBR® Green Supermix, 0,3 µL de cada iniciador (10 µM), e 7,4 µL de água foi preparada para cada ensaio. Dezoito µL de mistura principal foi misturada com 2 µL do DNA diluído extraído a partir da bexiga urinária em placas de micro-titulação e o DNA foi amplificado utilizando um sistema de detecção por PCR em tempo real CFX96 (BioRad). O DNA foi desnaturado durante 3 minutos a 95 ° C, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95 ° C e 30 segundos a 55 ° C. Após a amplificação, o DNA foi preparado para análise de curva de fusão por desnaturação durante 30 segundos a 95 ° C, seguido de 2 minutos a 55 ° C. A análise da curva de fusão foi realizada por 5 segundos de incubação a 55 ° C, com um aumento de 0,5 ° C por ciclo, e 5 segundos a 95 ° C. Em cada placa, quatro controles de não molde (NTC) foram incluídos, bem como uma curva padrão em duplicado com números de cópias de molde variando de 10 a 10.000.

Western Blot

[00232] A ligação dos soros finais para os lisados de células inteiras a partir de Borrelia pertencente ao sorotipo de OspA correspondente foi analisado por western blot. Resumidamente, 2,5 µg de lisado de espiroqueta por soros de camundongo a ser analisado foi separado por SDS-PAGE sob condições redutoras utilizando 4-12% de géis Tris- Glicina Zoom (Invitrogen). As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema de iBlot® a seco (Invitrogen). Após o bloqueio em leite a 5% durante 1 hora, os soros finais foram adicionados a uma diluição de 1: 2000 e incubados a +4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes com PBS/0,1T seguidas por uma incubação de uma hora em IgG anti- camundongo policlonal de coelho conjugada a HRP (Dako) diluídas de 1: 10000. Os imunoblots foram visualizados com reagentes de detecção de Western Blot de Amersham ECL PlusTM (GE Healthcare) e películas Kodak Biomax (Kodak).

Leitura de infecção

[00233] A leitura de infecção final foi baseada em dois métodos distintos: A detecção da presença de anticorpos de Borreliaespecífica (western blot e VlsE ELISA) e presença de DNA de Borrelia (segmentação qPCR recA). Em ensaios onde B. burgdorferi cepa ZS7 foi usada para o desafio (experimentos 1 e 2), western blot, juntamente com qPCR foram aplicados. Em todos os outros ensaios, foram usados VlsE ELISA e qPCR. Houve uma alta consistência entre os dois métodos (> 95%); Por conseguinte, um camundongo foi considerado como infectado, quando pelo menos um dos dois métodos foi positivo. A significância estatística foi determinada pelo teste exato de Fisher (bicaudal).

Resultados

[00234] A vacina de combinação de heterodímero melhorada foi testada para a capacidade de proteção contra desafio de Borrelia. Os resultados desses ensaios estão resumidos na Tabela 2. Os camundongos imunizados foram desafiados com B. burgdorferi s.s. (sorotipo 1 de OspA, cepa ZS7, desafio de agulha, Experimentos 1 e 2 ou cepa Pra1 ou Pra 4, desafio de carrapato, Experimentos 3 ou 4 e 5, respectivamente), B. afzelii (sorotipo 2 de OspA, cepa IS1, desafio de carrapato, Experimentos 6-9), B.garinii (sorotipo 5 de OspA, cepa PHei, desafio de agulha, Experimentos 10-13) ou B.garinii (sorotipo 6 de OspA, cepa Ma, desafio de agulha, Experimentos 14-17). Em alguns ensaios, outros antígenos à base de OspA, tais como a vacina de combinação quimérica ou uma proteína de OspA de comprimento inteiro lipidada, foram incluídos. Um grupo de camundongos imunizados com PBS ou tampão de formulação combinada com Al (OH)3 serviu de um grupo de controle de placebo (apenas adjuvante) em cada ensaio.

[00235] Os dados de proteção dos 17 ensaios estão resumidos na Tabela 2. Em todos os ensaios, um elevado nível de infecção foi observado em todos os grupos tratados com placebo. Além disso, uma baixa taxa de infecção foi observada nos grupos que receberam a proteína de OspA de comprimento inteiro correspondente, com a excepção do sorotipo 6 de OspA de comprimento inteiro, em que apenas uma proteção parcial foi observada (ensaios 14 a 17). Estes resultados validam o arranjo e leitura de métodos experimentais.

[00236] A vacina combinada de heterodímero melhorada conferiu proteção significativa (valores-p<0,05), a uma dose de 3 µg, quando os camundongos foram desafiados in vitro com B. burgdorferi s.s. ou B.garinii madura (sorotipo 5 ou 6 de OspA), ou carrapatos portando B. burgdorferi ou B. afzelii. Além disso, quando diferentes doses de imunização foram avaliadas quanto a eficácia da vacina, a proteção altamente significativa (valores-p<0,01) pôde ser mostrada quando 0,03 µg da vacina melhorada de combinação de heterodímero foi administrada e os camundongos foram desafiados com B. afzelii ou B. garinii (sorotipo 5 ou 6 de OspA) (Experimento 8, 9, 12, 13 e 16). Em resumo, a vacina de combinação de heterodímero melhorada induziu a imunidade protetora contra três espécies de Borrelia (B. burgdorferi, B. afzelii e B.garinii), incluindo quatro sorotipos clinicamente relevantes de OspA (1, 2, 5 e 6), como mostrado nos modelos de camundongo que utilizam espiroquetas cultivadas in vitro ou carrapatos infectados para o desafio.

[00237] Também se observou proteção contra os sorotipos 5 e 6 comparáveis à conferida pela vacina de combinação de heterodímero melhorada em camundongos imunizados com a vacina de combinação quimérica (dados não mostrados). Tabela 2. A capacidade de proteção da vacina de combinação de heterodímero de OspA mutante melhorada da invenção contra o sorotipo 1 de OspA, sorotipo 2, sorotipo 5 e sorotipo 6 do desafio de Borrelia. Grupos de camundongos foram imunizados três vezes com as doses indicadas de imunogênio ou Al(OH)3 adjuvante sozinho, em intervalos de duas semanas. Os imunogênios utilizados foram uma combinação de 1: 1: 1 dos heterodímeros de OspA mutantes Lip-S1D1- S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 e Lip-S5D1-S6D1 ("Vacina de combinação de heterodímero melhorada"), uma combinação de 1: 1: 1 de Lip - quimérica OspA ST1/ST2-His, Lip-quimérica OspA ST5/ST3-His e Lip- quimérica OspA ST6/ST4-His ("Vacina de combinação quimérica") e Lip-OspA1-His (proteína de OspA de comprimento inteiro lipidada de B. burgdorferi cepa B31) ou Lip-OspA2-His (proteína de OspA de comprimento inteiro lipidada de B. afzelii cepa K78), Lip-OspA5-His (proteína de OspA de comprimento inteiro lipidada de B.garinii cepa PHei) ou Lip-OspA6-His (proteína de OspA de comprimento inteiro lipidada de B.garinii cepa DK29). Os camundongos imunizados foram desafiados s.c. duas semanas depois da última imunização com as espécies de borrelia indicadas, utilizando uma seringa (B. burgdorferi cepa ZS7, B.garinii cepa PHei ou B.garinii cepa Ma) ou usando carrapatos (B. burgdorferi cepa Pra1 ou Pra4 ou B. afzelii cepa IS1). A Proteção contra o desafio de agulha com o sorotipo 1 de OspA de borrelia pela vacina combinada quimérica e vacina de combinação de heterodímero melhorada (uma dose: 3 µg) B Proteção contra o desafio de carrapato com o sorotipo 1 de OspA de borrelia pela vacina de combinação quimérica e vacina de combinação de heterodímero melhorada (uma dose: 3 µg) C Proteção contra o desafio de carrapato com o sorotipo 1 de OspA de borrelia por vacina de combinação de heterodímero melhorada (doses decrescentes: 3 µg e 0,3 µg) D Proteção contra o desafio de carrapato com o sorotipo 2 de OspA de borrelia pela vacina de combinação quimérica e vacina de combinação de heterodímero melhorada (uma dose: 3 µg) E Proteção contra o desafio de carrapato com o sorotipo 2 de OspA de borrelia pela vacina de combinação de heterodímero melhorada (doses decrescentes: 0,03 µg e 0,003 µg) F Proteção contra o desafio de agulha com o sorotipo 5 de OspA de borrelia pela vacina de combinação de heterodímero melhorada (uma dose: 3 µg) G Proteção contra o desafio de agulha com o sorotipo 5 de OspA de borrelia pela vacina de combinação de heterodímero melhorada (doses decrescentes: 3 µg, 0,3 µg e 0,03 µg) H Proteção contra o desafio de agulha com o sorotipo 6 de OspA de borrelia pela vacina de combinação de heterodímero melhorada (uma dose: 3 µg) I Proteção contra o desafio de agulha com o sorotipo 6 de OspA de borrelia pela vacina de combinação de heterodímero melhorada (doses decrescentes: 3 µg, 0,3 µg e 0,03 µg) Valor-p; teste exato de Fisher, bicaudal, em comparação com o grupo de adjuvante por si só, são indicados entre parêntesis. não significativos (n.s.). SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 S3hybD1: fragmento C-terminal de OspA híbrido; aminoácidos das posições 125-176 de Borrelia valaisiana, cepa VS116 e aminoácidos 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr, com ligação dissulfeto tipo 1 e T na posição 233 FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNL VGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSD TSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAEL CAALK SEQ ID NO: 2 B. valaisiana (cepa VS116), OspA aa 125-176 FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNL VGGK SEQ ID NO: 3 B.garinii (cepa PBr, sorotipo 3), OspA aa 177-274, com T na posição 233, de OspA de comprimento inteiro (SEQ ID NO: 8) TKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTL TISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAA LK SEQ ID NO: 4 B. valaisiana (cepa VS116), OspA MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDK DGKYSLVATVDKVELKGTSDKNNGSGTLEGVKDDKSKVKLTISDDLG ETKLETFKEDGTLVSRKVNFKDKSFTEEKFNEKGEVSEKILTRSNGTT LEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITEGTVTLSKHI AKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTK QDTITVQSYNPAGNKLEGTAVEIKTLQELKNALK SEQ ID NO: 5 B. burgdorferi s.s. (cepa B31, sorotipo 1 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNK DGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLG QTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGT RLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNI SKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTK ENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK SEQ ID NO: 6 B. afzelii (cepa K78; sorotipo 2 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDK DGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSK TTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGT KLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTK QDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK SEQ ID NO: 7 B.garinii (cepa PBr, sorotipo 3 de OspA) com P na posição 233 (adesão embl X80256.1) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDK DGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLN QTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANG TRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSK NISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVF TKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO: 8 B.garinii (cepa PBr, sorotipo 3 de OspA) com T na posição 233 (adesão embl ACL34827.1) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDK DGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLN QTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANG TRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSK NISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFT KENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK SEQ ID NO: 9 B. bavariensis (cepa PBi, sorotipo 4 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDK DGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLS KTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTR LEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPN SGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKED TITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK SEQ ID NO: 10 B.garinii (cepa PHei, sorotipo 5 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDK DGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLS KTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTR LEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNIS KSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKED TITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 11 B.garinii (cepa DK29, sorotipo 6 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDK DGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLS QTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGT RLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKN ILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTK EDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK SEQ ID NO: 12 B.garinii (cepa T25, sorotipo 7 de OspA) MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDK DGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLS QTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGT RLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKN ISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTK ENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK SEQ ID NO: 13 Borrelia sinal de lipidação de OspA MKKYLLGIGLILALIA SEQ ID NO: 14 Borrelia sinal de lipidação de OspB MRLLIGFALALALIG SEQ ID NO: 15 E. coli sinal de lipidação de lpp MKATKLVLGAVILGSTLLAG SEQ ID NO: 16 ligante peptídico de LN1 construído a partir de duas regiões separadas de ciclo da metade de N-terminal de OspA a partir de B. burgdorferi s.s. cepa B31 (aa 65-74 e aa 42-53, permuta de aminoácidos na posição 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS SEQ ID NO: 17 sequência semelhante a hLFA-1 de B. burgdorferi s.s. cepa B31 (sorotipo 1 de OspA) GYVLEGTLTAE SEQ ID NO: 18 sequência não semelhante a hLFA-1 de B. afzelii cepa K78 (sorotipo 2 de OspA) NFTLEGKVAND SEQ ID NO: 19 B. burgdorferi s.s. (cepa B31, sorotipo 1), OspA aa 126-273 com a sequência semelhante a hLFA substituída a partir do sorotipo 1 de OspA FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKN ALK SEQ ID NO: 20 B. afzelii (cepa K78, sorotipo 2), OspA aa 126-273 FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVA NDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSK TSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDEL KNALK SEQ ID NO: 21 B.garinii (cepa PBr, sorotipo 3), OspA aa 126-274 FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLT DGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSD TSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAEL KAALK SEQ ID NO: 22 B.bavariensis (cepa PBi, sorotipo 4), OspA aa 126-273 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAA DKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTS TLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNA LK SEQ ID NO: 23 B.garinii (cepa PHei, sorotipo 5), OspA aa 126-273 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAAD GKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTST LTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNA LK SEQ ID NO: 24 B.garinii (cepa DK29, sorotipo 6), OspA aa 126-274 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAA DGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKT STLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELK NALK SEQ ID NO: 25 B.garinii (cepa T25, sorotipo 7) OspA aa 126-274 FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLT ADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSK TSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEAL KAALK SEQ ID NO: 26 Sequência de codificação de Lip-S4D1-S3hybD1-nt para proteínas de fusão de heterodímero intermediárias e finais de sorotipo 4 de OspA e sorotipo 3 de OspA com ligação dissulfeto tipo 1, sinal de lipidação Ipp de E. coli,sequência de ligação de LN1, fragmento do sorotipo 3 de OspA compreendendo os aminoácidos 125-176 da cepa B. valaisiana, VS116 (SEQ ID NO: 2) e os aminoácidos 177-274 de B.garinii, cepa PBr, sorotipo 3 (SEQ ID NO: 3) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCT ACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTG AGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATAC ACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTG AAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACG CTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCG AACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGATAGCAATTCTACG CAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCAC GCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTC ACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAA CTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCT GGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAA AAAGGCGAAGTGAGCGAAAAAATTCTGACCCGTAGCAATGGCACC ACCCTGGAATATAGCCAGATGACCGATGCAGAAAATGCAACCAAA GCAGTTGAAACCCTGAAAAACGGTATTAAACTGCCTGGTAATCTG GTTGGTGGTAAAACCAAACTGACCGTTACCTGTGGCACCGTTACC CTGAGCAAAAACATTAGCAAAAGCGGTGAAATTACCGTGGCACTG AATGATACCGAAACCACACCGGCAGACAAAAAAACCGGTGAATGG AAAAGCGATACCAGCACCCTGACCATTAGTAAAAATAGCCAGAAA ACAAAACAGCTGGTGTTTACCAAAGAAAACACCATTACCGTGCAG AATTATAACCGTGCAGGTAATGCACTGGAAGGTAGTCCGGCAGAA ATTAAAGATCTGGCAGAACTGTGTGCAGCCCTGAAATAA SEQ ID NO: 27 Lip-S4D1-S3hybD1-aa: Proteína de fusão de heterodímero do sorotipo 4 de OspA e sorotipo 3 de OspA, compreendendo os aminoácidos 125176 de B. valaisiana, cepa VS116 (SEQ ID NO: 2) e os aminoácidos 177-274 de B.garinii, cepa PBr, sorotipo 3 (SEQ ID NO: 3), com ligação dissulfeto tipo 1, CSS de N-terminal para a adição de lípidos, sequência ligante de LN1, lipidação de N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALE GTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKW DSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTL DELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKILTRSNG TTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLS KNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLV FTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK SEQ ID NO: 28 Lip-S1D1-S2D1-nt: sequência de codificação para as proteínas de fusão de heterodímero intermédias e finais de sorotipo 1 de OspA e sorotipo 2 de OspA com ligação dissulfeto tipo 1, sinal de lipidação Ipp de E. coli, sequência de ligação de LN1, aa 164-174 do sorotipo 1 de OspA substituída por uma sequência NFTLEGKVAND não semelhante a hLFA-1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCT ACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAGTC AGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATA CACCGGCATCAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTC TGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCA CCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTA GTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACCGACAGCT CTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCG ACGCTGACCATTACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTC TTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAAT GGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGAT GAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCT CTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACG AAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGC ACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACCGGTAAA GCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCC AATGACAAAGTCACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTG TCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAAC GATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGA CAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGCAAGAAAACC ACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAA TACGACAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAAT CAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAA SEQ ID NO: 29 Lip-S1D1-S2D1-aa: proteína de fusão de heterodímero de sorotipo 1 de e sorotipo 2 de OspA com ligação dissulfeto tipo 1, CSS N-terminal para a adição de lipídios, sequência de ligação LN1, aa 164-174 do sorotipo 1 deOspA substituído pela sequência NFTLEGKVAND não semelhante a hLFA-1, lipidação N-terminal LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLE GKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAA WNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEICNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRE NGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQL VFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK SEQ ID NO: 30 Lip-S4D1-S3D1-nt: sequência de codificação para as proteínas de fusão de heterodímero intermédias e finais de serotipos 4 e 3 de OspA os dois com ligação dissulfeto tipo 1, sinal de lipidação Ipp de E. coli, CSS N- terminal para a adição de lipídios, sequência ligante de LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCT ACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAATGCTAAGGGCGAACTG AGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATAC ACCGAAATCAAATCCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTG AAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACG CTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCG AACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGATAGCAATTCTACG CAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCAC GCTGACCATTTCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTC ACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAA CTGTGTAACGCCCTGAAGGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCT GGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGAT AAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCAC CCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGCGGCAAAG CGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACG GATGGCGGTGAAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTAC GCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACT GAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAAT GGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAACTCGCAGA AACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGC AGAACTATAATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTG AAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAA SEQ ID NO: 31 Lip-S4D1-S3D1-aa: proteína de fusão de heterodímero de sorotipos 4 e 3 de OspA os dois com ligação dissulfeto tipo 1, CSS N-terminal para a adição de lipídios, sequência de ligação LN1, lipidação de N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALE GTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKW DSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTL DELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANG TRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSK NISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVF TKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK SEQ ID NO: 32 Lip-S5D1-S6D1-nt: sequência de codificação para as proteínas de fusão de heterodímero intermédias e finais de serotipos 6 de OspA os dois com ligação dissulfeto tipo 1, sinal de lipidação Ipp de E. coli, CSS N- terminal para a adição de lipídios, sequência ligante de LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCT ACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAACGAAAAGGGCGAAATC TCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATAC ACCGACATCAAATCAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTG AAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACC ACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATT AGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATGACACCGATAG CTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGA CGCTGACCATTTCTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTT CACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGG TACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGA ACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCT GGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGC AAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTAC CCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAGCGGCAAAG CAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAG CAGACGGTAAAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTT CTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTG GATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATG GGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAA AACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCA ACGCTATGACAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTG AAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA SEQ ID NO: 33 Lip-S5D1-S6D1-aa: proteína de fusão de heterodímero de sorotipos 6 de OspA os dois com ligação dissulfeto tipo 1, CSS N-terminal para a adição de lipídios, sequência de ligação LN1, lipidação de N-terminal LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLE GTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTW DSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTL KELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANG TRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSK NILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFT KEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK SEQ ID NO: 34 B. burgdorferi (cepa B31, sorotipo 1 de OspA) aa 18-273, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDK LELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGK TLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGS GKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELND TDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEIKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 35 B. afzelii (cepa K78, sorotipo 2 de OspA) aa 18-273, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSF para adição de lipídios CSSFKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVD KIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGK TLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSD GTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVAL NDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYD SAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 36 B. garinii (cepa PBr, sorotipo 3 de OspA) aa 18-274, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSF para adição de lipídios CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVE KLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGK TLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDG SGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVAL NDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYN RAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 37 B. bavariensis (cepa PBi, sorotipo 4 de OspA) aa 18-273, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSF para adição de lipídios CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVD KLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGK TLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTG KAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSN STQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGT NLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 38 B. garinii (cepa PHei, sorotipo 5 de OspA) aa 18-273, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSF para adição de lipídios CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVE KLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGK TLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTG KAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDT DSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAG TNLEGKAVEITTLKELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 39 B. garinii (cepa DK29, sorotipo 6 de OspA) aa 18-274, lpp sequência de sinal de lipidação removida (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, SEQ ID NO: 15), marcação C-terminal His (LEHHHHHH), N-terminal CSSF para adição de lipídios CSSFKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVD KLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGK TLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGS GKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDD SDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSA GTNLEGKAVEITTLKELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 40 Sorotipo 1/Sorotipo 2 de OspA Quimérico, lipidação do N-terminal, marcado com His, incluindo a sequência de sinal de lipidação de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14), que é clivado durante o processamento MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKNGK YDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKTNKSKVKLTISDDLGQTTL EVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITMADGTRLEY TGIKSDGTGKAKYVLKNFTLEGKVANDKTTLEVKEGTVTLSMNISKSG EVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTI TVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 41 Sorotipo 5/Sorotipo 3 de OspA Quimérico, lipidação do N-terminal, marcado com His, incluindo a sequência de sinal de lipidação de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14), que é clivado durante o processamento MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKNGK YSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIAEDLSKTTF EIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVMANGTRLEYT DIKSDKTGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSMNISKSG EITVALDDTDSSGNKKSGTWDSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTIT VQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 42 Sorotipo 6/Sorotipo 4 de OspA Quimérico, lipidação do N-terminal, marcado com His, incluindo a sequência de sinal de lipidação de OspB: MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 14), que é clivado durante o processamento MRLLIGFALALALIGCAQKGAESIGSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKNGK YSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTNKSKVKLTIADDLSQTKF EIFKEDAKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGETSEKTIVMANGTRLEY TDIKSDGSGKAKYVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSMNILKS GEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTI TVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKLEHHHHHH SEQ ID NO: 43 S1D1 FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVAN DKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIC NALK SEQ ID NO: 44 S2D1 FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVA NDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSK TSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDEL CNALK SEQ ID NO: 45 S3D1 FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLT DGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSD TSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAEL CAALK SEQ ID NO: 46 S4D1 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAA DKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTS TLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCN ALK SEQ ID NO: 47 S5D1 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAAD GKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTS TLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCN ALK SEQ ID NO: 48 S6D1 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAA DGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKT STLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELC NALK SEQ ID NO: 49 S3HYBD1 (BVA) FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNL VGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSD TSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAEL CAALK SEQ ID NO: 50 BVAD1 FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNL VGGKTTLKITCGTVTLSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDAR NSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNPAGNKLEGTAVEIKTLQEL CNALK SEQ ID NO: 51 S3hybD1 (BSP): fragmento de C-terminal de OspA híbrido; aminoácidos 126-175 de Borrelia spielmanii e aminoácidos 177-274 de Borrelia garinii, cepa PBr, com ligação dissulfeto tipo 1 e T na posição 233 FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLAN EKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTS TLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCA ALK SEQ ID NO: 52 MSPD1 FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLAN EKATLTVKCGTVTLSKNIDKSGEVTVALNDTDSTAATKKTGAWDSKT STLTITVNSKKTKDLVFTKQDTITVQKYDSAGTTLEGSAVEIKTLDELC NALK SEQ ID NO: 53 iniciador forward para o espaçador intergênico 16S-23S GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG SEQ ID NO: 54 Iniciador reverse para o espaçador intergênico 16S-23S GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG SEQ ID NO: 55 iniciador aninhado forward para o espaçador intergênico 16S-23S AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG SEQ ID NO: 56 Iniciador aninhado reverse para o espaçador intergênico 16S-23S GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA SEQ ID NO: 57 Iniciador forward para o gene RecA de Borrelia CATGCTCTTGATCCTGTTTA SEQ ID NO: 58 Iniciador reverse para o gene RecA de Borrelia CCCATTTCTCCATCTATCTC SEQ ID NO: 59 peptídeo de 25-mer a partir da região invariável 6 (IR6) de VlsE MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK SEQ ID NO: 60 Rato cathelin RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE SEQ ID NO: 61 peptídeo KLK KLKLLLLLKLK SEQ ID NO: 62 peptídeo de N-terminal para lipidação CKQN SEQ ID NO: 63 5’-(dIdC)13-3’ dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC dIdC

[00238] Os conteúdos inteiros de todas as referências (incluindo as referências bibliográficas, patentes emitidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citadas por todo este pedido são expressamente incorporados para referência.

Claims

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento (proteína A da superfície externa de Borrelia) de OspA de C-terminal híbrido, sendo que o dito fragmento de OspA de C-terminal híbrido consiste, a partir da direção de N- para C-terminal, em: (i) uma primeira porção de OspA consistindo em aminoácidos 125-176 ou os aminoácidos 126-175 da OspA de uma cepa de Borrelia diferente de OspA de B.garinii, cepa PBr, com a SEQ ID NO: 8; e (ii) uma segunda porção de OspA que consiste em (a) aminoácidos 176-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, de acordo com SEQ ID NO: 8; (b) aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, de acordo com SEQ ID NO: 8; ou (c) aminoácidos 177-274 de OspA de B. garinii, cepa PBr, de acordo com SEQ ID NO: 8, com substituição do resíduo de treonina na posição 233 por um resíduo de prolina, em que a segunda porção de OspA é mutada e estabilizada com cisteína, na medida em que difere da correspondente sequência de tipo selvagem, pelo menos, pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 182+/-3 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e pela substituição do aminoácido do tipo selvagem na posição 269+/-3 da SEQ ID NO: 8 por uma cisteína e em que uma ligação de dissulfureto entre a cisteína na posição 182+/-3 e a cisteína na posição 269+/-3 da dita segunda porção de OspA está presente; e sendo que a numeração das substituições de cisteína é de acordo com a numeração dos aminoácidos correspondentes do OspA de comprimento total de B. burgdorferi s.s., da cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo fragmento de OspA de C-terminal; sendo que o referido fragmento de OspA consiste em um domínio C-terminal de uma proteína de OspA de Borrelia e é mutada e difere da sequência de OspA de tipo selvagem correspondente pela substituição do aminoácido na posição 182+/-3 da sequência de tipo selvagem por uma cisteína e pela substituição do aminoácido na posição 269+/-3 da sequência de tipo selvagem por uma cisteína, em que uma ligação dissulfeto entre a cisteína na posição 182+/-3 e a cisteína na posição 269+/-3 do referido fragmento de OspA está presente; em que o referido fragmento de OspA começa na posição 123, 124, ou 125 e termina na posição 273 ou 274; em que a numeração dos aminoácidos e as substituições de cisteína é de acordo com a numeração de aminoácidos correspondentes da OspA de comprimento inteiro de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (SEQ ID NO: 5).

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende um ligante entre o fragmento OspA de C-terminal híbrido e o segundo fragmento C- terminal de OspA.

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: (i) o polipeptídeo é lipidado, (ii) o polipeptídeo compreende um sinal de lipidação; ou (iii) o polipeptídeo compreende um peptídeo com sítio de lipidação liderado por um resíduo de cisteína N-terminal como sítio para lipidação.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um sinal de lipidação lpp derivado de E. coli compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

6. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que consiste no heterodímero de Lip-S4D1-S3hybD1 (SEQ ID NO: 27).

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, em que o ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 26 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácidos; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 29) e Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 33).

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável compreende L-metionina.

10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um antígeno adicional de Borrelia.