ES3037515T3 - New immunoregulatory cells and methods for their production - Google Patents

New immunoregulatory cells and methods for their production

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ES3037515T3 ES17709457T ES17709457T ES3037515T3 ES 3037515 T3 ES3037515 T3 ES 3037515T3 ES 17709457 T ES17709457 T ES 17709457T ES 17709457 T ES17709457 T ES 17709457T ES 3037515 T3 ES3037515 T3 ES 3037515T3
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Abstract

La presente invención se refiere a nuevas células macrófagas inmunorreguladoras útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones inmunológicas y no inmunológicas. Estas células se caracterizan por un marcador específico y un patrón de actividad que las distingue de otras células. La invención también proporciona un proceso para la preparación de células macrófagas inmunorreguladoras a partir de monocitos sanguíneos. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células macrófagas inmunorreguladoras de la invención o una fracción subcelular de las mismas. También se proporciona un proceso para la preparación de una fracción subcelular de una célula macrófaga inmunorreguladora de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas células inmunorreguladoras y procedimientos para su producción
Campo de la invención
La presente invención se refiere a novedosas células macrófagas inmunorreguladoras que son útiles en el tratamiento de diferentes enfermedades y afecciones inmunológicas y no inmunológicas. Las células se caracterizan por un marcador específico y un patrón de actividad que las distingue de otras células. La invención también proporciona un procedimiento para preparar las células macrófagas inmunorreguladoras a partir de monocitos sanguíneos. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células macrófagas inmunorreguladoras de la invención.
Antecedentes técnicos
La transferencia de células inmunorreguladoras de un donante tolerante a un receptor no tolerante como medio para establecer la tolerancia en el receptor es una técnica bien conocida en inmunología experimental, pero su aplicación clínica sólo ahora está recibiendo una atención seria [1]. En la actualidad, varios tipos de células inmunorreguladoras están alcanzando el punto de desarrollo preclínico que permitirá investigarlas como agentes inmunosupresores en ensayos clínicos de fase temprana, entre ellas las células T reguladoras [2], las células dendríticas tolerogénicas [3] y los macrófagos reguladores [4].
Un amplio espectro de afecciones inmunológicas puede ser susceptible de tratamiento con terapias inmunorreguladoras basadas en células, incluyendo enfermedades autoinmunes mediadas por células T y B, trastornos inflamatorios crónicos, enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y rechazo de trasplantes. En estas condiciones, las terapias inmunorreguladoras celulares podrían reducir o incluso obviar la necesidad de una terapia inmunosupresora o antiinflamatoria general, evitando así a los pacientes las complicaciones que conlleva. Dado que el tipo de tolerancia inmunológica soportada por las células reguladoras es dominante y autosostenida, existe la posibilidad de que la inmunoterapia celular ofrezca una opción curativa en enfermedades que, de otro modo, requerirían un tratamiento inmunosupresor o antiinflamatorio general a largo plazo.
Un tipo celular candidato particularmente prometedor para su uso como agente inmunosupresor adjunto en trasplante es el macrófago inmunorregulador (denominado en el presente documento y en la bibliografía "Mreg"). La célula Mreg refleja un estado único de diferenciación de macrófagos, que se distingue de los macrófagos en otros estados de activación por su fenotipo robusto y su potente función supresora de células T [5]. Las Mregs humanas suprimen potentemente la proliferación de células T estimulada por mitógenos in vitro, lo que puede atribuirse a la actividad de la indoleamina 2,3-dioxigenasa inducida por el interferón (IFN)<y>, así como a la eliminación dependiente del contacto de las células T activadas. Además, las Mregs impulsan el desarrollo de células T reguladoras inducidas activadas que, a su vez, suprimen la proliferación de células T efectoras e inhiben la maduración de las células dendríticas. Por lo tanto, cuando se administran Mregs a un receptor, se hipotetiza que se inicia un bucle de regulación inmunológica que conduce a la aceptación inmunológica a largo plazo de un trasplante extranjero o a la prevención de la inmunopatología. Se han administrado preparados de células que contienen Mreg a un total de 19 receptores de trasplante renal como forma de tratamiento inmunosupresor complementario en una serie de estudios de casos y dos ensayos clínicos de fase inicial [5]-[9]. Estos estudios piloto demuestran claramente la viabilidad de esta técnica para el trasplante de órganos sólidos.
En la actualidad se ha tratado a otros dos receptores de trasplante renal de donantes vivos con aproximadamente 8,0*10® células/kg de Mregs más puras derivadas de donantes [5]. Estos dos pacientes llevan ahora más de 6 años tras el trasplante con una función renal estable en monoterapia con dosis bajas de tacrolimus como única inmunosupresión de mantenimiento. Un ensayo clínico adicional de la terapia Mreg en el trasplante renal de donante vivo cuenta ahora con la aprobación reglamentaria en el marco del estudio ONE (Clinicaltrials.gov: NCT02085629). Este ensayo pretende tratar a 16 pacientes con células Mreg derivadas de donante a una dosis de 2,5*10® a 7,5*106/kg de peso corporal bajo cobertura de 500 mg/día de micofenolato mofetilo el día 7 antes de la cirugía.
El documento WO 2015/048641 A2 divulga un procedimiento para cambiar los macrófagos hacia un fenotipo M2 inmunorregulador o inhibir la formación de macrófagos profibróticos mediante la adición de amiloide sérico P (SAP). Ancuta et al. (2009): " El perfil transcripcional revela la relación de desarrollo y las funciones biológicas distintas de los subconjuntos de monocitos CD16+ y CD16-", BMC GENOM-ICS, vol. 10, n° 1, página 403 describe la relación de desarrollo y las distintas funciones biológicas de los subconjuntos de monocitos CD16+ y CD16-. La publicación se refiere a los monocitos y no a los macrófagos reguladores. Hutchinson et al. (2011): " Macrófagos reguladores humanos", Procedimientos en Biología Molecular, vol. 677, páginas 181-192 y Hutchinson et al.. (2012): " Macrófagos reguladores humanos como medicamento celular", Opinión actual sobre el trasplante de órganos, vol. 17, n° 1, páginas 48-54 se refieren a la generación y caracterización de macrófagos inmunorreguladores, que implican el cultivo celular de monocitos CD14+ con componentes de cultivo celular como M-CSF e interferón gamma. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones revela el cultivo en sacos.
A pesar de los grandes progresos realizados en los últimos años en el campo de las células inmunorreguladoras, sigue existiendo la necesidad de células reguladoras que puedan utilizarse con fines terapéuticos, por ejemplo, para inducir la aceptación inmunológica de un trasplante extranjero en un receptor, y de procedimientos para preparar estas células de la manera más eficiente posible. En particular, se necesitan terapias celulares que permitan reducir los medicamentos inmunosupresores utilizados habitualmente, que suelen asociarse a un alto grado de toxicidad para el paciente.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un tipo novedoso de célula Mreg que difiere significativamente de las Mregs que se han descrito anteriormente. Se descubrió que un procedimiento modificado para producir células Mreg daba lugar inesperadamente a un nuevo tipo de célula Mreg. En concreto, los inventores descubrieron que cuando las células monocíticas utilizadas para preparar las células Mreg se cultivaban en bolsas permeables al gas en lugar de en frascos de cultivo, se obtenían células Mreg de un fenotipo único que ejercían propiedades inmunorreguladoras que las hacían muy adecuadas para enfoques terapéuticos basados en células. Estas células se denominan aquí "Mregs-bc" para distinguirlas de las Mregs conocidas.
Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un procedimiento para producir un nuevo tipo de macrófago que incluye el cultivo de monocitos de una muestra de sangre de un sujeto en una bolsa permeable a gases en presencia de M-CSF, un ligando de CD16 (tal como una inmunoglobulina), e IFN-Y.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un tipo novedoso de célula Mreg, es decir, la célula Mreg-bc, que es obtenible mediante un procedimiento al que se hace referencia en el primer aspecto de la invención. La célula Mregbe tiene un fenotipo único que no se ha observado en la técnica anterior. La célula Mreg-be media actividades biológicas que le confieren propiedades terapéuticas útiles que son exclusivas de este tipo celular y no se han descrito en la técnica anterior.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención. La composición farmacéutica que contiene el nuevo tipo celular de la invención también puede contener otros principios activos o excipientes, según sea necesario.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere al uso de una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención con fines terapéuticos, en particular para la supresión de reacciones inmunológicas adversas.
Finalmente, en un quinto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una célula T inmunorreguladora mediante cocultivo de células T de una muestra de sangre de un sujeto con una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra que la ligadura FcvRIN impulsa el desarrollo de las Mregs. (A) Las Mregs humanas generadas en medio suplementado con un 10% de HABS presentan una morfología característica en forma de extensión, mientras que las MO de IFN-y cultivadas en medio con un 10% de FCS, pero en condiciones idénticas por lo demás, adquieren una forma irregular y alargada (barra = 50 pm). (B&C) Tras el tratamiento de HABS con cloroformo (Chl-HABS) no se perdió su capacidad inductora de Mreg, lo que implica la existencia de un componente no lipídico del suero humano responsable del desarrollo de Mreg (n=6). (D) El cultivo de monocitos en suero humano empobrecido en Ig disminuyó la expresión deDHRS9ARNm en comparación con los Mreg cultivados en HABS al 10% (n=4). La adición de Ig purificada a partir de suero o IGIV restauró la expresión deDHRS9ARNm. (D&E) La expresión de ARNm de DHRS9 por macrófagos cultivados en FCS al 10% pudo ser inducida en cierta medida tanto por Ig purificada como por IgIV. (H) El anticuerpo contra FcvRNI fue más eficaz para prevenir la expresión deDHRS9ARNm inducida por HABS por macrófagos cultivados en condiciones de cultivo Mreg (n=5). (G) La adición de un anticuerpo bloqueante contra FcvRIN, pero no contra otros receptores Fcv, impidió que los monocitos adquirieran la morfología Mreg (barra = 50 pm). (H) El silenciamiento de la expresión de FcvRIN mediante ARNi confirmó el papel de FcvRIN en la inducción del fenotipo Mreg por la inmunoglobulina sérica. En todos los casos, los gráficos de barras representan la media ± SEM.
La figura 2 muestra la comparación del fenotipo de Mregs cultivadas en matraces y Mregs-bc. (A) Mreg cultivadas en matraces (trazos rojos) y Mreg-bc (trazos azules) expresan la constelación de marcadores de superficie celular que definen Mreg de Cd 14-/Iow CD16'/low CD80'/low CD86+ CD85h+ CD258+. Las señales de control del isotipo se muestran en gris. (B) Una proporción de Mregs-bc, pero no de Mregs cultivadas en matraces, expresaron los antígenos CD10, Clec9a y CD103. (C) Los Mregs cultivados en matraces, pero no los Mregs-bc, expresaron altos niveles de los antígenos CD209, Syndecan-3 y CD38.
La Figura 3 muestra que la expresión del miembro 9 de la deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) (DHRS9) identifica de forma única el fenotipo Mreg. (A) El mAb ASOT1 reconoció un antígeno expresado por Mregs, pero no otros tipos de macrófagos. (B) Un antígeno de aproximadamente 35 kD fue precipitado específicamente por ASOT1. Este antígeno precipitado fue identificado por espectrometría de masas como DHRS9. (C) Se detectó una fuerte expresión de ARNm de DHRS9 en Mregs, pero no en otros tipos de macrófagos (n=6). (D) ASOT1 precipitó un antígeno que también fue reconocido por un pAb de conejo anti-DHRS9 y un mAb de ratón, confirmando que ASOT1 reconoce DHRS9. (E) La inmunotransferencia con un pAb anti-DHRS9 de conejo demostró que la expresión de DHRS9 a nivel proteico distingue a las Mregs de otros tipos de macrófagos.
La figura 4 muestra la coexpresión de IDO y arginasa-1 por las Mregs. (A) Los Mregs, los Mregs producidos sin estimulación con IFN-y y los Mregs tratados con lipopolisacárido expresaron niveles significativamente superiores de ARG1 ARNm que los tipos de macrófagos de comparación (n=3; media ± SEM). (B) La tinción por citometría de flujo revela la coexpresión de IDO y Arg1 por células Mreg individuales.
La Figura 5 muestra que las células T que han sido co-cultivadas con Mregs-bc inhiben la proliferación de células T Las consecuencias funcionales de la exposición a Mregs-bc para las células T CD3+ alogénicas se investigaron en experimentos de co-cultivo. (A) Mregs-bc humanas generadas a partir de monocitos CD14+ de sangre periférica se co-cultivaron en una proporción 1:1 con células T CD3+ alogénicas aisladas utilizando microperlas CD3 (Miltenyi) en medio X-vivo 10 suplementado con 2 mM Glutamax y 25 ng/ml rhM-CSF durante 5 días. Alternativamente, las Mregs-bc se co-cultivaron en una proporción 1:1 con células T alogénicas ingenuas CD4+ aisladas utilizando un kit de microperlas de aislamiento negativo de células T ingenuas CD4+ (Miltenyi) que luego se incubaron con microperlas CD3 (Miltenyi). Tras 5 días de cocultivo, se volvieron a aislar las células T para su fenotipado mediante citometría de flujo. Utilizando procedimientos convencionales para la tinción de la superficie celular e intracelular, por ejemplo, el kit de tampón de fijación y permeabilización Foxp3 (eBiosciences), las células T co-cultivadas se enriquecen para CD4+ CD25+ TIGIT+ FoxP3+ Tregs. Alternativamente, las células T reaisladas se utilizan como células supresoras en un ensayo de proliferación de células T alogénicas estimulado con anti-CD3 y basado en la dilución de CFSE. (B) La proliferación de células T CD4+ respondedoras marcadas con CFSE estimuladas con anti-CD3 unido a placa fue inhibida en mayor grado por células T alogénicas co cultivadas con Mreg que por células T cultivadas solas durante 5 días (n=6; media ± SEM). (C) Las células T CD3+ co-cultivadas con Mregs-bc alogénicas durante 5 días se enriquecieron en Tregs CD25+ FoxP3+, que se diferenciaron fácilmente de las células T activadas policlonalmente CD25+FoxP3low que habían sido estimuladas con microesferas aCD3/aCD28 durante 5 días. (Datos representativos de n=4 parejas de donantes).
La Figura 6 muestra que las Mregs presentan una morfología y un fenotipo de superficie celular únicos. (A) Las Mregs en cultivo adquieren una morfología distintiva (barra = 50 pm). (B) La micrografía electrónica de transmisión de las Mregs muestra una estrecha adherencia a la superficie de cultivo, núcleos activos con abundante cromatina fina, numerosos procesos celulares e inclusiones lipídicas. (C) Los Mregs se distinguen de forma fiable de otros estados de polarización de macrófagos por su morfología característica en cultivo. (D) Las Mregs se distinguen de un panel de macrófagos de comparación por una constelación de marcadores de superficie celular: CD14'/baj° CD16' TLR2'/baj° y CD163' (n=6; media ± SEM).
La figura 7 muestra la expresión de CD85h (LILRA2; ILT1) y CD258 (TNFSF14; LIGHT), que fueron identificados por análisis de micromatrices como marcadores de Mregs humanas, se expresan en la superficie celular por Mregs pero no por macrófagos IFN-<y>, como se demostró por citometría de flujo.
La figura 8 muestra que las Mregs-bc generan Tregs TIGIT+ productoras de IL-10 in vivo. (A) Se investigó la capacidad de las células Mreg-bc humanas para inducir TIGIT+ iTregs in vivo utilizando un modelo de ratón inmunodeficiente (NSG). Los ratones NSG recibieron (i) una inyección i.v. de 5 * 106 células T CD4+ naive humanas solas o (ii) una inyección i.v. de 5 * 106 células T CD4+ naive humanas más una inyección i.v. separada de 5 * 106 Mregs humanas alogénicas. Después de 5 días, se evaluaron los niveles séricos de IL-10 humana y las frecuencias de Treg TIGIT+ humanas esplénicas (n=12 pares de donantes). (B) Los receptores tratados con Mreg mostraron frecuencias de Treg esplénicas más altas y frecuencias de células T CD4+ TIGIT+ algo más altas que los animales de control no tratados. (C) Los niveles séricos de IL-10 humana fueron significativamente superiores en los receptores tratados con Mreg que en los controles.
La figura 9 muestra el montaje de un experimento para comprobar si las células Mreg-bc producen el factor angiogénico VEGF-A tras la estimulación con lípido monofosforil A (MPLA).
La figura 10 muestra la expresión de los miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular por las Mregs tras la estimulación con lipopolisacárido (LPS) o en condiciones de cultivo hipertónicas. (A) La estimulación con LPS provocó la expresión de VEGF-A, VEGF-C, pero no de VEGF-D; sin embargo, la estimulación con LPS también indujo la expresión de TNF-a, una potente citoquina inflamatoria. (B) Las Mregs respondieron al aumento de las concentraciones de NaCl secretando VEGF-C, pero no VEGF-A o VEGF-D; críticamente, la hipertonicidad no provocó la expresión de TNF-a.
Descripción detallada de la invención
Según la invención las células Mreg-bc se derivan de monocitos sanguíneos CD14+ humanos. Para inducir las propiedades biológicas que caracterizan a las células Mreg-bc, los monocitos se tratan con una combinación específica de factores de crecimiento, citocinas y ligandos de receptores. Las células obtenidas mediante el procedimiento de la invención se caracterizan por un fenotipo único que las distingue de los monocitos sanguíneos, otros tipos de macrófagos derivados de monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos y otros productos celulares mielomonocíticos supresores descritos en la técnica anterior.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar un tipo novedoso de célula macrófaga inmunorreguladora, dicho procedimiento comprende:
(a) Aislar monocitos CD14 positivos de una muestra de sangre de un sujeto;
(b) cultivar los monocitos en una bolsa de plástico permeable al gas en un medio de cultivo que contenga (i) M-CSF y (ii) un ligando de CD16, en el que la concentración de M-CSF esté en el intervalo de 5-100 ng/ml;
(c) poner en contacto las células con IFN-y, en el que la concentración de IFN-y está en el intervalo de 5-100
ng/ml; y
(d) obtención de la célula macrófaga inmunorreguladora a partir del medio de cultivo,
en el que los monocitos de la etapa b) se cultivan durante al menos 5 días antes de la estimulación con IFN-y.
El procedimiento de la invención utiliza monocitos sanguíneos como material de partida. Aunque se preferirá que e procedimiento de la invención se utilice para generar células Mreg-bc a partir de monocitos sanguíneos humanos, la invención no se limita a la diferenciación de células de origen humano. De hecho, la invención es aplicable también a otros tipos de células no humanas, en particular células de vertebrados, por ejemplo, células de primates no humanos o de cerdos. De este modo, la invención proporciona una importante contribución en el campo de la medicina de los trasplantes xenogénicos.
Según una realización preferente, el procedimiento de la invención se utiliza para diferenciar monocitos CD14 positivos de un donante humano en Mregs-bc. Los monocitos que sirven de material de partida para el procedimiento de la invención se obtienen de la sangre periférica de un donante humano. El donante puede ser un sujeto sano o un paciente que padezca una o varias enfermedades. En una realización, el donante de monocitos es el receptor previsto de las células Mreg-bc diferenciadas (enfoque autólogo). En otra realización, el donante de monocitos es una persona distinta del receptor previsto de las células Mreg-bc diferenciadas (enfoque alogénico). En este último caso, el donante y el receptor pueden estar genéticamente emparentados o no. En otra realización, el donante de monocitos es una persona distinta del receptor previsto de las células Mreg-bc diferenciadas, pero también es el donante de otras células, tejidos u órganos para trasplante en el mismo receptor. La relación preferida entre donante y receptor depende de la aplicación clínica. El uso de células Mreg-bc autólogas puede ayudar a evitar ciertas reacciones adversas. Por lo tanto, se prefiere el uso de células Mreg-bc autólogas en el caso de terapias regenerativas o antiinflamatorias.Enel contexto del trasplante, se prefiere el uso de células Mreg-bc derivadas del donante como terapia inmunosupresora porque las células que expresan antígenos del donante son más eficaces que las células derivadas del receptor [11].
Se conocen diferentes procedimientos en la técnica para el enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica, y cada uno de estos procedimientos puede usarse en el contexto con la presente invención. Por ejemplo, la sangre obtenida por venopunción puede tratarse con un anticoagulante y separarse posteriormente mediante el uso de un medio de separación, como Ficoll-Paque Plus. Para ello, la muestra de sangre tratada con anticoagulante se coloca en capas sobre la solución Ficoll-Paque Plus y se centrifuga, lo que dará lugar a la formación de capas que contienen los distintos tipos de células. La capa inferior contiene eritrocitos que han sido agregados y sedimentados por el reactivo Ficoll-Paque Plus. La capa inmediatamente superior a la capa de eritrocitos contiene principalmente granulocitos que han migrado a través de la capa de Ficoll-Paque Plus. Debido a su menor densidad, los monocitos y linfocitos se encuentran en la interfase entre el plasma y el Ficoll-Paque Plus. El enriquecimiento de la fracción de células mononucleares puede lograrse mediante el aislamiento de la capa y su posterior lavado y centrifugación.
Otro procedimiento utilizado rutinariamente para separar leucocitos mononucleares de muestras de sangre incluye la leucaféresis. La leucaféresis es un tipo específico de aféresis en el que se obtienen glóbulos blancos de la sangre periférica en función de sus densidades relativas en un proceso continuo. En este procedimiento, la sangre de un sujeto se hace pasar por un dispositivo especial de centrifugación que recoge la fracción elegida de glóbulos blancos y devuelve el resto de células sanguíneas y plasma al donante. La leucaféresis es hoy en día una medida clínica rutinaria para obtener leucocitos o células madre de la sangre periférica. Existen diferentes dispositivos de varios fabricantes que pueden utilizarse para realizar leucaféresis en el contexto de la presente invención, por ejemplo, el sistema de aféresis COBE® Spectra de Terumo BCT. Cuando la leucaféresis se lleva a cabo mediante el uso del Sistema de Aféresis COBE® Spectra, es preferible utilizar el protocolo manual proporcionado por el fabricante, ya que se ha observado que este protocolo da como resultado monocitos de mejor calidad en comparación con el protocolo AutoPBSC.
Tanto el uso de un medio de separación como Ficoll-Paque Plus como el uso de un dispositivo de leucaféresis proporcionarán una fracción celular que contiene, además de los monocitos, también linfocitos. Según la invención, los monocitos pueden enriquecerse y separarse de los linfocitos por procedimientos conocidos, por ejemplo, mediante separación por microesferas magnéticas, clasificación por citometría de flujo, elutriación, filtración o adherencia plástica, antes de que las células se introduzcan en el procedimiento de preparación de la presente invención. Sin embargo, no es obligatorio utilizar una fracción homogénea de monocitos en el procedimiento de la invención. De
hecho, la presencia de una cantidad de 0,1-20%, preferiblemente 10-20% de linfocitos en la fracción de monocitos puede influir positivamente en la diferenciación de los monocitos a macrófagos reguladores.
En una realización de la invención, la fracción de monocitos usada en el procedimiento de la invención es esencialmente pura y contiene menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, o menos del 1% por ciento de células sanguíneas nucleadas no monocíticas, tales como linfocitos o granulocitos. Para obtener una preparación de células mononucleares enriquecida en monocitos, las células mononucleares de sangre periférica pueden ponerse en contacto, por ejemplo, con microesferas CD14 a las que se unen los monocitos CD14 positivos. En una realización, los monocitos de la etapa (a) se aíslan por leucaféresis y posteriormente se someten a una etapa de separación utilizando moléculas de afinidad CD14, preferiblemente anticuerpos CD14. Esta etapa de purificación reduce enormemente la contaminación del material de partida con no monocitos. La reducción de la contaminación de células T es muy valiosa desde el punto de vista de la seguridad del paciente, ya que minimiza el riesgo potencial de reacciones entre donante y receptor. En una realización preferente de la invención, los monocitos CD14 que se utilizan en el procedimiento de la invención se han aislado con la tecnología CliniMACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania).
La fracción de monocitos, que se ha aislado mediante leucaféresis y/u otros procedimientos, puede utilizarse directamente para diferenciación mediante incubación con M-CSF y el ligando CD16, o puede almacenarse en plasma autólogo suplementado con solución de citrato dextrosa anticoagulante (ACD-A) o cualquier otro tampón adecuado hasta su uso posterior. Si la fracción de monocitos aislada debe transportarse a un lugar diferente donde se lleve a cabo el proceso de diferenciación, debe procurarse que la diferenciación de las células mediante incubación con M-CSF se inicie en las 24 horas siguientes al aislamiento de las células, preferiblemente en las 18 horas, en las 12 horas, en las 6 horas, en las 4 horas o en las 2 horas siguientes al aislamiento de los monocitos. Para el almacenamiento a largo plazo, la fracción de monocitos puede resuspenderse en una solución de criopreservación adecuada y almacenarse a temperaturas inferiores a 20°C, preferiblemente inferiores a 80°C durante largos periodos de tiempo.
Tras el aislamiento de los monocitos, las células se incuban en presencia de M-CSF y un ligando CD16. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en un medio que contenga M-CSF y un ligando CD16. Alternativamente, también es posible añadir M-CSF y el ligando CD16 algún tiempo después del inicio del cultivo celular. El medio de cultivo utilizado en la etapa (b) del procedimiento anterior puede ser cualquier medio descrito en la bibliografía como adecuado para el cultivo de monocitos y/o macrófagos. Los medios de cultivo adecuados incluyen, por ejemplo, el Medio de generación de macrófagos PromoCell (PromoCell GmbH, Heidelberg, Alemania), el Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la mezcla DMEM:F12, el medio 199 o el medio RPMI-1640. El medio de cultivo es preferiblemente un medio químicamente definido. Además del M-CSF, el medio de cultivo puede contener otros factores para promover la supervivencia y diferenciación de las Mregs, entre ellos: factores de crecimiento y citoquinas, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), o la IL-4; ácidos grasos, colesterol y otros lípidos; vitaminas, transferrina y oligoelementos; insulina, glucocorticoides, colecalciferol o ergocalciferol, y otras hormonas; inmunoglobulina inespecífica y otras proteínas plasmáticas. En una realización preferente de la invención, el medio de cultivo es RPMI-1640 o un medio derivado del mismo.
El medio de cultivo utilizado para incubar los monocitos CD14 positivos aislados contiene factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, también conocido como CSF1). El M-CSF es conocido en la técnica como un factor de crecimiento hematopoyético que influye en la proliferación, diferenciación y supervivencia de monocitos, macrófagos y células progenitoras de la médula ósea. El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, también conocido como CSF2) es una glicoproteína monomérica que funciona como citocina y es secretada por macrófagos, células T, mastocitos, células NK, células endoteliales y fibroblastos. Se han descrito proteínas M-CSF y GM-CSF de diferentes especies, que pueden adquirirse a distintos fabricantes. La elección del M-CSF utilizado en el procedimiento de la invención dependerá del origen de los monocitos que se van a diferenciar en células Mregbc. Por ejemplo, si se diferencian monocitos humanos a Mregs-bc mediante el procedimiento descrito en el presente documento, el medio utilizado contendrá M-CSF humano, preferiblemente M-CSf humano recombinante. Del mismo modo, si se utilizan monocitos porcinos en el procedimiento de diferenciación, el M-CSF añadido al medio será de origen porcino. En una realización particularmente preferente de la invención, el M-CSF es de origen humano, como el M-CSF humano recombinante, y los monocitos son monocitos humanos.
La persona experta podrá encontrar una cantidad de M-CSF que sea adecuada para diferenciar una alta proporción de los monocitos en Mregs-bc por procedimientos rutinarios. Según la invención, la concentración de M-CSF en el medio de cultivo en la etapa (b) del procedimiento anterior está en el rango de 5-100 ng de proteína por ml de medio. Los experimentos de evolución temporal para medir la cantidad de M-CSF en el medio de cultivo revelaron que el M-CSF se consumía o degradaba con el tiempo, de forma que los cultivos con una dosis inicial de 5 ng/ml de M-CSF contenían concentraciones inferiores a las fisiológicas al segundo día de cultivo; por el contrario, los cultivos con una dosis inicial de 25 ng/ml de M-CSF mantuvieron concentraciones de >10 ng/ml durante un periodo de cultivo de 7 días. Así, en una realización preferente de la invención, la concentración de M-CSF en el medio de cultivo está en el rango de 20-75 ng/ml, 20-50 ng/ml o 20-25 ng/ml. Se prefiere especialmente una concentración de al menos 25 ng de M-CSF por ml de medio de cultivo. Preferiblemente, las concentraciones anteriores se refieren a M-CSF humano recombinante.
En los casos en los que se utilizan tanto M-CSF como GM-CSF en el medio, las concentraciones globales de estos dos factores de crecimiento estarán en el intervalo mencionado anteriormente, es decir, en el intervalo de 20-75 ng/ml, 20-50 ng/ml o 20-25 ng/ml. Se prefiere especialmente una concentración global de M-CSF y GM-CSF de 25 ng de M-CSF por ml de medio de cultivo.
Aparte del M-CSF , el medio de cultivo usado en la etapa (b) del procedimiento anterior también comprende un ligando de CD16. Se ha descubierto que la estimulación del receptor de superficie celular CD16 en los monocitos es necesaria para inducir su diferenciación en células Mreg-bc. Más concretamente, los experimentos realizados en el curso de la presente invención revelaron que los monocitos cultivados en medio suplementado con suero AB humano (HABS) se convierten en Mregs, mientras que los monocitos cultivados en medio suplementado con suero de ternera fetal (FCS) no se convierten en Mregs. Los monocitos cultivados en una mezcla a partes iguales de ambos sueros desarrollan el fenotipo Mreg. Por lo tanto, HABS contiene una actividad inductora de Mreg positiva (véase la Figura 1A&B). La extracción de la fracción extraíble con cloroformo de HABS demostró que la actividad inductora de Mreg de HABS residía principalmente en la fracción resistente al cloroformo, por lo que era probable que se tratara de una proteína (véase la Figura 1B&C). Por fraccionamiento de tamaño, se descubrió que el principal componente proteínico de HABS responsable del desarrollo de Mreg-be era >100 kDa, lo que llevó a la hipótesis de que el factor desconocido era la inmunoglobulina (Ig). El HABS deplecionado de Ig utilizando sefarosa de proteína A/G fue incapaz de favorecer el desarrollo de la morfología Mreg-bc y la expresión de ARNm DHRS9 (ver Figura 1D). La nueva adición de Ig elutriada al suero sin Ig (o la adición de IgIV) restauró su capacidad de inducir la expresión de DHRS9 (véase la Figura 1D). Del mismo modo, cuando los monocitos se cultivaron en FCS suplementado con Ig humana, se observó un aumento de la expresión deDHRS9ARNm en comparación con los controles con FCS solo y se obtuvo una morfología Mreg-bc normal (Fig. 1D&E). Los monocitos tratados con anticuerpo anti-FcvRIN expresaron niveles significativamente más bajos deDHRS9ARNm que los monocitos tratados con anticuerpo anti-FcvRI (CD64), anti-FcvRNa/b (CD32a/b) o anticuerpo de control (véase la Figura 1F) y no desarrollaron morfología Mreg-bc (véase la Figura 1G). El bloqueo de FcvRIIb o DC-SIGN por separado, o de ambos receptores juntos, no tuvo efecto sobre la generación de Mregs DHRS9+ (ver Figura 1H). Para reforzar la observación de que FcvRIN es necesario para la generación de Mreg-bc, se silenció la expresión de FcvRIN utilizando ARNi (véase la Figura 1I). Se consiguió una supresión transitoria de la expresión de los transcritos FCGR3A y FCGR3B en monocitos recién aislados cultivados en HABS al 10%; es importante destacar que la expresión de FCGR2B no disminuyó con esta manipulación. La reducción de FcvRIN a nivel proteico se demostró mediante citometría de flujo (35,2% ± 4,4 células CD16+ con ARNsi de control negativo, frente a 15,3% ± 3,7 con ARNsi FCGR3; n=4, p=0,002). El silenciamiento de la expresión de FcvRNI (pero no la supresión de la expresión de MAPK1 ni el tratamiento con un ARNsi de control negativo) produjo una regulación a la baja significativa de la expresión de ARNm de DHRS9 (véase la Figura 1I).
De los hallazgos anteriores se concluyó que la Ig sérica actúa a través de FcvRIN (CD16) para inducir el fenotipo Mreg. La dependencia de la diferenciación del Mreg del FcvRIN distingue al Mreg de otros tipos de macrófagos inducidos por complejos Ig descritos en el estado de la técnica. En particular, el modo de derivación distingue el Mreg inducido por FcvRIN del macrófago inducido por FcvRNb, el macrófago inducido por FcvRI y los macrófagos generados en ausencia de inmunoglobulina que se describían en la técnica anterior.
Como la estimulación del receptor de superficie celular CD16 es crucial para la diferenciación en el fenotipo Mreg-bc deseado, el procedimiento de la invención incluye la incubación de los monocitos con un ligando CD16 en la etapa (b). El ligando que se une al receptor será preferiblemente una inmunoglobulina humana o no humana, y más preferiblemente una inmunoglobulina humana, o un fragmento de la misma. El fragmento de inmunoglobulina puede ser, por ejemplo, un fragmento Fc de una inmunoglobulina. La inmunoglobulina o el fragmento de inmunoglobulina se añade preferentemente a un medio de cultivo sin suero. Alternativamente, pueden utilizarse proteínas recombinantes que comprendan una secuencia de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina, como una secuencia de una inmunoglobulina humana. En otra realización, se utiliza un anticuerpo no humano o humano o un fragmento del mismo que se une específicamente a CD16 a través de su dominio de reconocimiento de antígeno para promover la diferenciación Mreg-bc. En otra realización, se utilizan pequeñas moléculas para estimular la vía de señalización CD16 para promover la diferenciación Mreg-bc.
En una realización preferente, el medio utilizado para generar las células Mreg-bc contiene 1-20% de suero humano o cantidades equivalentes de ciertos componentes de suero, tales como inmunoglobulina. Más preferiblemente, el medio se complementa con un 10% de suero. Si se utilizan medios que contienen suero para llevar a cabo el procedimiento de la invención, los medios comprenden entre un 5-15%, preferiblemente un 10%, de suero humano. Se prefiere especialmente un medio que contenga un 10% de suero AB humano. Dicho de otro modo, se prefiere que el suero se añada en una concentración de aproximadamente 0,01 a 10 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1 mg/ml, y más preferiblemente de aproximadamente 1 mg/ml. Pueden utilizarse concentraciones ligeramente inferiores cuando se emplean inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas como ligandos de CD16. Pueden utilizarse concentraciones sustancialmente inferiores si la inmunoglobulina u otros ligandos CD16 se inmovilizan en superficies de cultivo de tejidos, perlas u otras matrices físicas. Se prefiere además que el suero humano, como el suero AB, proceda de donantes varones. Cuando se utilice suero de donantes femeninas, debe procurarse que las donantes no utilicen anticonceptivos de progesterona o progesterona-estrógeno. Se prefiere además que dicho medio no contenga anticuerpos contra los monocitos o las células Mreg-be o cualquier forma intermedia, incluidos los anticuerpos contra las moléculas principales de histocompatibilidad.
También se encontró que los antibióticos en el medio de cultivo no tenían ningún efecto mensurable sobre la viabilidad, rendimiento, fenotipo o función supresora de las Mregs-bc producidas por el procedimiento de la invención. En consecuencia, se prefiere que el medio utilizado en la etapa (b) del procedimiento de la invención no contenga ningún antibiótico.
Cuando las células Mregs-bc se destinan a su uso en aplicaciones terapéuticas en las que se desea la inducción de angiogénesis (véase más adelante), el medio utilizado para cultivar los monocitos en la etapa (b) del procedimiento de la invención puede comprender, además de M-CSF y el ligando CD16, un ligando del receptor tipo Toll (TLR), como el lipolisacárido (LPS), el lípido monofosforil A (MPLA) o la proteína High Mobility Group Box 1 (HMGB1) para potenciar la producción de factores angiogénicos como VEGF-A. El ligando TLR puede añadirse al medio de cultivo en un intervalo de concentración de 1000 ng/ml a 1 |jg/ml, preferentemente entre 50-500 ng/ml, como 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml o 400 ng/ml. En los casos en los que se añada más de un ligando TLR, la concentración global de estos ligandos debe estar en el intervalo citado anteriormente. El ligando TLR puede añadirse en cualquier fase del procedimiento de producción. Puede estar presente en el medio inicial que se utiliza para cultivar los monocitos, es decir, en el día 0 del cultivo, o puede añadirse en una fase posterior, por ejemplo, en los días 5, 6 o 7 del cultivo. Preferiblemente, el ligando TLR se añade simultáneamente con la adición del IFN-<y>.
Según la invención, el procedimiento para preparar las células Mreg-bc incluye el cultivo de los monocitos en presencia de M-CSF y el ligando CD16 en una bolsa permeable al gas. Una vez suspendidos los monocitos en un medio adecuado, las suspensiones celulares se transfieren a bolsas de plástico permeables al gas para su cultivo y diferenciación. Las bolsas para el cultivo celular están disponibles en diferentes proveedores, por ejemplo en Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemania), Thermo Fisher Scientific (Schwerte, Alemania) o Merck (Darmstadt, Alemania). Las bolsas estarán hechas de un material plástico que permita la fijación de las células cultivadas a la superficie interior de la bolsa de cultivo. Se prefieren las bolsas de poliolefina o polietileno.
Las bolsas se diseñarán preferentemente para permitir una densidad de chapado celular de 1-2 * 10<6>monocitos por cm<2>de superficie de cultivo interna. Esto significa que una suspensión celular que contiene 180 * 10<6>monocitos se cultiva preferentemente en una bolsa que tiene una superficie interna de al menos 90 cm<2>y no más de 180 cm<2>. La densidad óptima de células en suspensión se sitúa preferentemente entre aproximadamente 1 * 10<5>células/ml y 1 * 10<7>células/ml, y más preferentemente 1 * 10<6>células/ml. La relación entre el volumen de la suspensión celular y el volumen de la bolsa es de al menos 1,0, preferiblemente 0,2 y más preferiblemente 0,06 para minimizar la cantidad de medio a partir del cual se deben concentrar las Mregs-bc al final del cultivo. Esto significa que una bolsa de cultivo de 3L se llenará con 1L de suspensión celular o menos, preferiblemente 600 ml o menos, y más preferiblemente 180 ml o menos. En una realización preferente del procedimiento de la invención, el volumen de las bolsas utilizadas para cultivar los monocitos en el medio que ha sido suplementado con M-CSF y el ligando CD16 es de al menos 3 L.
Después de que los monocitos se hayan transferido a las bolsas de cultivo, las células se incuban en las bolsas en presencia de M-CSF y el ligando CD16, por ejemplo suero humano o inmunoglobulinas humanas, durante al menos 5 días antes de la estimulación con IFN-y. Tal y como se utiliza aquí, un periodo de cultivo de "1 día" se refiere a 24 horas de cultivo. Por consiguiente, un periodo de cultivo de "al menos 3 días" se refiere a 72 horas de cultivo o más. El período óptimo de estimulación con IFN-y es de al menos 12 horas, preferiblemente 18 horas, y más preferiblemente 24 horas. De acuerdo con la invención, el periodo total de cultivo, es decir, el periodo de tiempo desde la introducción de los monocitos en las bolsas de cultivo hasta la recolección de las Mregs-bc es de al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días o al menos 8 días. Dicho de otro modo, el período total de cultivo oscila entre 5 y 8 días, preferiblemente entre 6 y 8 días, más preferiblemente 7 días. Los monocitos de las bolsas de cultivo se incuban en condiciones que permiten su crecimiento y diferenciación en células Mreg-bc. Las condiciones generales para el cultivo de monocitos o macrófagos son conocidas por una persona que trabaje en el campo del cultivo celular.
Por ejemplo, las bolsas que contienen las suspensiones pueden transferirse a una cámara de incubación que permite la selección de condiciones definidas de temperatura, humedad y CO<2>. Condiciones adecuadas una temperatura en la gama de 30-40°C, preferentemente entre 32°-38°C, y más preferentemente entre 37-38°C, por ejemplo 37°C. La humedad utilizada para el cultivo suele estar comprendida entre el 30 y el 70%, preferiblemente entre el 40 y el 60%, y más preferiblemente entre el 50 y el 60%, por ejemplo el 60% de humedad. La cámara de incubación puede incluir hasta un 10% de CO<2>. Se prefiere particularmente un contenido de hasta el 5% de CO<2>, hasta el 4% de CO<2>, hasta el 3% de CO<2>, hasta el 2% de CO<2>, o hasta el 1% de CO<2>. Durante la incubación, las bolsas se colocan preferentemente en posición horizontal sobre un estante de la cámara de incubación.
Los monocitos en las bolsas son preferentemente agitados suavemente de forma intermitente para permitir su fijación semiadherente a la hoja inferior de la bolsa de cultivo. Se prefiere que las bolsas se inviertan al menos una vez dentro del período total de cultivo para permitir su adherencia a la hoja opuesta de la bolsa. En otra realización, la bolsa se invierte al menos dos veces durante todo el periodo de cultivo. En otra realización, la bolsa se invierte al menos tres o cuatro veces durante el periodo total de cultivo. En otra realización, la bolsa se invierte cada 24 horas durante todo el periodo de cultivo. En otra realización, la bolsa se invierte cada 36 horas durante todo el periodo de cultivo. En otra realización, la bolsa se invierte cada 48 horas durante todo el periodo de cultivo.
En la etapa (c) del procedimiento de la invención, las células se ponen en contacto con la citocina interferón gamma (IFN-y). La citoquina es conocida en la técnica por alterar la transcripción de más de 30 genes, produciendo así una variedad de respuestas fisiológicas y celulares. Las proteínas IFN-y se han aislado de diferentes especies y pueden adquirirse a distintos fabricantes. La elección del IFN-<y>utilizado en el procedimiento de la invención dependerá del origen de los monocitos que se sometan al procedimiento de la invención. Por ejemplo, si se diferencian monocitos humanos a Mregs-bc mediante el procedimiento descrito en el presente documento, el IFN-y añadido será IFN-y humano, preferiblemente IFN-<y>humano recombinante. Del mismo modo, si se utilizan monocitos porcinos en el procedimiento de diferenciación, el IFN-<y>añadido al medio será de origen porcino. En una realización particularmente preferente de la invención, el IFN-<y>es<i>FN-<y>humano, más preferiblemente IFN-<y>humano recombinante.
Puede añadirse cualquier cantidad de IFN-y que sea eficaz para inducir la expresión de indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) por los monocitos en el cultivo. La cantidad de IFN-y que debe añadirse al cultivo de monocitos está comprendida entre 5-100 ng/ml, más preferiblemente entre 10-80 ng/ml, aún más preferiblemente entre 20-50 ng/ml. Se prefiere especialmente una cantidad de 25 ng de IFN-y por ml de medio de cultivo.
El IFN-<y>puede añadirse al medio simultáneamente con el M-CSF y el ligando CD16, lo que significa que la citoquina puede añadirse, por ejemplo, en el momento en que los monocitos se introducen en las bolsas de cultivo. En tal realización, los monocitos a diferenciar por el procedimiento de la invención se cultivarán en presencia de M-CSF, el ligando CD16 e IFN-<y>durante todo el periodo de cultivo. Sin embargo, se prefiere que el período de cultivo en presencia de IFN-<y>sea considerablemente más corto que el período de cultivo en presencia de M-CSF, lo que significa que el IFN-<y>se añade sólo después de que las células hayan sido cultivadas durante al menos 5 días en presencia de M-CSF Preferiblemente, las células han sido cultivadas durante al menos 6 días en presencia de M-CSF antes de la adición de IFN-<y>. En una realización particularmente preferente, el IFN-<y>se añade después de haber cultivado las células durante 5-6 días en presencia de M-CSF, y el cultivo se continúa durante otras 18-72 horas.
En una realización particularmente preferente de la invención, las células diferenciadas se cosechan en el día 7, por ejemplo, después de 6 días de cultivo de los monocitos en el medio que contiene M-CSF y el ligando CD16 seguido de 18-24 horas de estimulación con IFN-<y>. Cuando se hayan cultivado varias bolsas en paralelo, el contenido de las bolsas podrá mezclarse al final del procedimiento de cultivo. Los macrófagos diferenciados pueden lavarse con un tampón compatible con los macrófagos. Por ejemplo, puede utilizarse solución Ringer o solución salina tamponada con fosfato (PBS), preferiblemente suplementada con un 5% de seroalbúmina humana, para lavar las células mediante el intercambio en serie del tampón por centrifugación y decantación del sobrenadante. Se ha descubierto en el curso de la presente invención que el uso de tripsina no mejora el rendimiento de macrófagos inmunorreguladores. Por lo tanto, se prefiere que la etapa de recolección no incluya la adición de tripsina.
Estas células Mreg-bc pueden transferirse y almacenarse en una bolsa de transfusión, un dispositivo de infusión de vidrio o en otro recipiente de sistema cerrado que permita el transporte de las células al centro de tratamiento o a la cabecera del paciente. Para ello, las células diferenciadas se suspenderán en un medio de conservación adecuado. El medio de conservación puede ser, por ejemplo, una solución de Ringer, que se complementa preferentemente con un 5% de albúmina de suero humano. En una realización particularmente preferente, el medio de conservación es un medio listo para usar que no contiene suero y/o proteínas. Un medio adecuado listo para usar que está disponible comercialmente es HypoThermosol® FRS (Stemcell Technologies SARL, Colonia, Alemania). Preferiblemente, el medio tiene un pH entre 6,5 y 8,0, más preferiblemente entre 7,0 y 7,5, como 7,4. La solución celular debe almacenarse a 4°C para minimizar el consumo de energía y la adhesión celular. Alternativamente, las células Mreg-bc pueden resuspenderse en una solución de criopreservación y almacenarse congeladas hasta su uso final.
La estabilidad fenotípica y funcional de las células macrófagas diferenciadas de la invención depende de la elección del excipiente y de la temperatura de almacenamiento. Cuando se resuspenden en solución Ringer suplementada con albúmina de suero humano, los macrófagos de la invención son estables a 20°C a 25°C durante un máximo de 24 horas después de la recolección celular. Cuando se resuspenden en HypoThermosol® FRS, los macrófagos se pueden almacenar a 2-8 °C, preferiblemente 4 °C, durante al menos 72 horas después de la recolección de células.. Cuando se requieren periodos de almacenamiento más largos, las células pueden someterse a congelación o criopreservación. En general, se observó que las células de la invención son estables en su fenotipo inmunosupresor. Un tratamiento con mediadores proinflamatorios, por ejemplo lipopolisacárido, no les lleva a desarrollar un fenotipo estimulador.
El procedimiento para preparar células Mreg-bc de la invención puede automatizarse de acuerdo con procedimientos comunes, por ejemplo usando una plataforma conforme a GMP que ofrece soluciones integradas que agilizan los flujos de trabajo de procesamiento celular. El procedimiento tiene lugar preferentemente en un "sistema cerrado" que aprovecha los desechables cerrados, la personalización opcional de los juegos de tubos, tampones y reactivos, las múltiples líneas de entrada con filtros estériles, la línea de salida para controles opcionales durante el procedimiento y los requisitos de sala blanca sustancialmente reducidos. Por ejemplo, la plataforma puede comprender un sistema de separación celular que permita separar los monocitos de la fracción de glóbulos blancos. El sistema de separación celular debe ser capaz de separar monocitos a partir de un volumen inicial de 100-1000 ml de aphere-sado o de sangre periférica completa. A continuación, los monocitos contenidos en las fracciones de leucocitos mononucleares aisladas pueden aislarse, por ejemplo mediante perlas magnéticas, que se unen a las células CD14+. A continuación, estas células se cultivan en un medio de cultivo adecuado. La plataforma permite suministrar medios, factores de crecimiento y/o citoquinas al cultivo celular a través de múltiples puertos de entrada. Al final del procedimiento de cultivo, las células se lavan automáticamente, se recogen y se transfieren a bolsas de suministro estériles adecuadas. Se puede utilizar una selladora de tubos personalizada que permita el sellado estéril de tubos de PVC y EVA. El producto celular puede llevar un código de barras y todo el procedimiento de fabricación puede supervisarse en línea con fines de control de calidad.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un tipo novedoso de célula Mreg, denominado célula Mreg-bc, que es obtenible por el procedimiento del primer aspecto de la invención. Las células proporcionadas por la invención son macrófagos humanos derivados de monocitos y, como tales, expresan marcadores leucocitarios comunes y marcadores de linaje de macrófagos, en particular CD45, CD11b, CD33 y HLA-DR. Las Mregs se distinguen de los monocitos, de un panel de macrófagos de comparación (es decir (es decir, macrófagos en reposo, M1, M2a, M2b y M2c) y DC derivadas de monocitos por una constelación de marcadores de linaje y activación, a saber, CD14-</bajo>CD16<-/baj°>CD80<"/baj°>CD86<+>CD85h<+>CD258<+>(véase la Figura 2A). CD85h se expresa en Mregs y monocitos, pero su expresión se pierde en macrófagos en reposo, macrófagos M1, macrófagos M2a, macrófagos M2b (estimulados con complejo Ig), macrófagos M2c (tratados con dexametasona) y células dendríticas derivadas de monocitos. CD258 se expresa en Mregs y macrófagos M2b, pero no en monocitos, macrófagos en reposo, macrófagos M1, macrófagos M2a, macrófagos M2c (tratados con dexametasona) y células dendríticas derivadas de monocitos.
Comparando Mregs-bc, es decir, células cultivadas en bolsas, con Mregs cultivadas en condiciones por lo demás idénticas en matraces, las Mregs-bc expresan consistentemente niveles más bajos de CD14, CD16 y CD80 que las células cultivadas en matraces. Las Mregs-bc expresaron sistemáticamente niveles más altos de CD85h y CD258 que las Mregs cultivadas en matraz. Las Mregs-bc pueden distinguirse de las que han sido cultivadas en matraces por la expresión de los marcadores Clec-9a, CD10 y CD103 (ver Figura 2B). Alternativamente, en contraste con las Mregs comunes, las Mregs-bc no expresan (o expresan sólo en cantidades bajas) los marcadores CD38, CD209 y Syndecan-3 (ver Figura 2C). Característicamente, todas las Mregs humanas, ya sean cultivadas en bolsa o en matraz, expresan niveles relativamente altos de DHRS9, una retinol deshidrogenasa de la familia SDR de las retinol deshidrogenasas (ver Figura 3). Las células Mreg humanas individuales, cultivadas en bolsa o en matraz, expresan de forma concomitante tanto la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) como la arginasa-1 (Arg1), lo que no se observa en otros tipos de macrófagos derivados de monocitos descritos en el estado de la técnica (véase la Fig. 4).
Por consiguiente, la invención proporciona una célula Mreg-bc obtenible mediante el procedimiento de la invención descrito anteriormente que no expresa uno o más de los marcadores CD38, CD209 y Syndecan-3 (o expresa estos marcadores sólo a un nivel bajo). En este caso, una célula es negativa para un marcador de superficie concreto si su intensidad de fluorescencia medida por citometría de flujo es inferior a la intensidad de fluorescencia del percentil 99 de una muestra correspondiente teñida con control de isotipo. Preferiblemente, las células Mreg-bc de la invención son negativas para CD209. Además, las células Mreg-bc son negativas para CD38 o expresan niveles bajos de CD38. Durante la generación de células Mreg-bc, la población inicial de monocitos regula a la baja la expresión de CD38 en la superficie celular. La regulación a la baja de CD38 durante el desarrollo de Mregs-bc puede expresarse como el porcentaje de expresión de CD38 en Mregs-bc en el día 7 en comparación con los monocitos en el día 0 (d0) de cultivo. La expresión de CD38 es proporcional a la diferencia en la intensidad media de fluorescencia entre una célula teñida con control de isotipo y la señal específica de CD38. Por lo tanto, % de regulación a la baja = 100 - 100 * (CD38<d7>- Iso<d7>)/(CD38<d0>- Iso<d0>), siendo cD38<d7>la señal específica en el día 7; Iso<d7>es la señal de control de isotipo en el día 7; CD38<d0>es la señal específica en el día 0; Iso<d0>es la señal de control de isotipo en el día 0. La regulación a la baja de CD38 por las células Mregs-bc puede determinarse convenientemente utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo. Según una realización preferente, la expresión de CD38 por la célula Mreg-bc está regulada a la baja en más del 50% en relación con la expresión inicial de CD38 por los monocitos en el día 0 de cultivo, más preferiblemente en más del 60%, en más del 70%, en más del 80%, en más del 90%, en más del 95% o en más del 99%.
De forma similar, durante la generación de células Mreg-bc, la población inicial de monocitos adquiere un bajo nivel de expresión de Syndecan-3 en la superficie celular, mientras que las células Mreg cultivadas en matraces adquieren un mayor nivel de expresión de Syndecan-3 en la superficie celular. Por lo tanto, las células Mreg-bc diferenciadas obtenidas a partir del procedimiento de la invención no expresan el marcador Syndecan-3 o sólo lo expresan a un nivel comparativamente bajo. La expresión de Syndecan-3 por las células Mreg-bc puede expresarse en relación con la expresión de Syndecan-3 en Mregs cultivadas en matraz. La expresión de Syndecan-3 es proporcional a la diferencia en la intensidad media de fluorescencia entre una célula teñida con un control del isotipo y la señal específica de Syndecan-3. Por lo tanto, % de expresión = (Syndecan-3<Mreg-bc>- Iso<Mreg-bc>)/(Syndecan-3<f rasco>- Iso<frasco>), donde Syndecan-3<Mreg-bc>es la señal específica de las células Mreg-bc teñidas con Syndecan-3 el día 7; Iso<Mreg-bc>es la señal de las células Mreg-bc teñidas con el control del isotipo el día 7; Syndecan-3<flask>es la señal específica de las células Mreg cultivadas en matraz teñidas con Syndecan-3 el día 7; Iso<flask>es la señal de las células Mreg cultivadas en matraz teñidas con el control del isotipo el día 7. La expresión relativa de Syndecan-3 por las células Mregs-bc y las Mregs cultivadas en matraz puede determinarse convenientemente utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo. Según una realización preferente, la expresión relativa de Syndecan-3 por la célula Mreg-bc en comparación con las Mregs cultivadas en matraz (expresada como % de expresión) es inferior al 50%, más preferiblemente inferior al 40%, inferior al 30%, inferior al 20%, inferior al 15%, inferior al 10%, inferior al 5% o inferior al 1%.
Preferiblemente, las células Mreg-bc de la invención expresan al menos uno de los marcadores CD85h y CD258, más preferiblemente ambos marcadores. La célula Mreg-bc expresa preferentemente uno o más de los marcadores Clec-9a, CD103 y CD10. Dicho de otro modo, la invención proporciona una célula Mreg-bc que expresa uno o más de los marcadores Clec-9, CD103 y CD10. Preferiblemente, dicha célula expresa al menos uno de los marcadores CD85h y CD258, más preferiblemente ambos marcadores. La célula Mreg-bc preferiblemente no expresa además uno o más de los marcadores CD38, CD209 y Syndecan-3 (o expresa uno o más de estos marcadores sólo a un nivel comparativamente bajo). En una realización particularmente preferente, la célula Mreg-bc aquí proporcionada no expresa los marcadores CD38, CD209 y Syndecan-3, y al mismo tiempo expresa los marcadores CD85h, CD258, Clec-9, CD103 y CD10. Por lo tanto, las células Mreg-bc proporcionadas por el procedimiento de la invención son macrófagos que pueden describirse mediante uno de los siguientes patrones de marcadores:
(1) . CD45+, CD85h+, CD38'/low;
(2) . CD45+, CD85h+, CD209'/low;
(3) . CD45+, CD85h+, Syndecan 3'/baj°;
(4) . CD45+, CD258+, CD38'/low;
(5) . CD45+, CD258+, CD209'/low;
(6) . CD45+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(7) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD38'/low;
(8) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD209'/low;
(9) . CD45+, CD85h+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(10) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD38'/low, CD209'/low;
(11) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(12) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(13) . CD45+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(14) . CD33+, CD85h+, CD38'/low;
(15) . CD33+, CD85h+, CD209'/low;
(16) . CD33+, CD85h+, Syndecan 3'/baj°;
(17) . CD33+, CD258+, CD38'/low;
(18) . CD33+, CD258+, CD209'/low;
(19) . CD33+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(20) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD38'/low;
(21) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD209'/low;
(22) . CD33+, CD85h+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(23) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD38'/low, CD209'/low;
(24) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(25) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(26) . CD33+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(27) . CD11b+, CD85h+, CD38'/low;
(28) . CD11b+, CD85h+, CD209'/low;
(29) . CD11b+, CD85h+, Syndecan 3'/baj°;
(30) . CD11b+, CD258+, CD38'/low;
(31) . CD11b+, CD258+, CD209'/low;
(32) . CD11b+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(33) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/low;
(34) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD209'/low;
(35) . CD11b+, CD85h+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(36) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/low, CD209'/low;
(37) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(38) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(39) . CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(40) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD38'/low;
(41) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD209'/low;
(42) . CD45+, CD11b+, CD85h+, Syndecan 3'/baj°;
(43) . CD45+, CD11b+, CD258+, CD38'/low;
(44) . CD45+, CD11b+, CD258+, CD209'/low;
(45) . CD45+, CD11b+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(46) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/low;
(47) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD209'/low;
(48) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, Syndecan 3'/baj°;
(49) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/low, CD209'/low;
(50) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(51) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
(52) . CD45+ CD11b+ CD85h+ CD258+ CD209'/baj° Clec-9a+
(53) . CD45+, CD11b+, CD85h+, CD258+, CD38'/baj°, CD209'/baj°, Syndecan 3'/baj°;
Es particularmente preferido que la célula Mreg-bc no exprese CD34 o no lo haga en una medida significativa. El CD34 es un marcador de células madre hematopoyéticas y células progenitoras utilizado habitualmente en hematología clínica. Se prefiere que menos del 30% de las células Mreg-bc obtenidas por el procedimiento de la invención expresen CD34 después de 7 días de cultivo, más preferiblemente menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, o menos del 1%. En una realización de la invención, las células macrófagas de la invención se derivan de un sujeto humano, es decir, son de origen humano.
El perfil de marcadores de la célula Mreg-bc puede determinarse convenientemente utilizando procedimientos de citometría de flujo estándar. En la bibliografía se han descrito ampliamente procedimientos y reactivos útiles para determinar los marcadores de superficie de las células. Preferentemente, el fenotipo marcador de las células Mreg-bc de la invención se determina como se describe en la parte del Ejemplo.
Se descubrió en el presente documento que la transición de monocitos a macrófagos reguladores se produce gradualmente. Durante la generación de células, la población inicial de monocitos CD14+ sufre una pérdida gradual de la expresión de CD14 en la superficie celular. Por lo tanto, en otra realización preferente, la célula Mreg-bc diferenciada obtenida mediante el procedimiento de la invención no expresa, o lo hace de forma poco significativa, el marcador CD14, que es característico del linaje monocítico. La regulación a la baja de CD14 durante el desarrollo de Mregs-bc puede expresarse como el porcentaje de expresión de CD14 en Mregs-bc en el día 7 en comparación con los monocitos en el día 0 de cultivo. La expresión de CD14 es proporcional a la diferencia de intensidad de fluorescencia entre una célula teñida con control de isotipo y la señal específica de CD14. Por lo tanto, % de regulación a la baja = 100 - 100 * (CD14d7 - Isod7)/(CD14do - Isodo) donde: CD14d7 es la señal específica en el día 7; Isod7 es la señal de control del isotipo en el día 7; CD14d0 es la señal específica en el día 0; Isod0 es la señal de control del isotipo en el día 0. La regulación a la baja de CD14 por las células Mregs-bc puede determinarse convenientemente utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo. Se prefiere que durante el proceso de diferenciación de monocitos a Mreg-bc, la expresión de CD14 se regule a la baja en más del 25%, preferiblemente en más del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y más preferiblemente en más del 95%.
Las células Mreg-bc son particularmente adecuadas para ser utilizadas con fines terapéuticos, como se explica con más detalle a continuación. En concepto, la terapia Mreg-bc es una terapia de ganancia de función, lo que significa que la administración de células Mreg-bc con funciones inmunosupresoras, antiinflamatorias o reparadoras de tejidos complementará una deficiencia de esas funciones celulares en el receptor. Aplicando dosis convenientemente grandes, será posible restablecer o superar dichas actividades en el receptor. En modelos de trasplante y autoinmunes, el tratamiento con Mreg-bc tiene un efecto terapéutico que persiste más allá de su propia vida en el receptor. Este efecto duradero puede explicarse por el impacto del tratamiento con Mreg-bc sobre las células T receptoras. La administración de células Mreg-bc puede influir en las respuestas de las células T receptoras de tres formas complementarias.
(a) Las células Mreg-bc interactúan directamente con las células T receptoras, lo que provoca la eliminación específica de células T o su conversión en células T reguladoras inducidas activadas (iTregs).
(b) Las células Mreg-bc alteran el comportamiento de las células dendríticas receptoras mediante la interacción directa o la liberación de mediadores antiinflamatorios. Una función importante de las células Mreg-bc puede ser morir en un entorno adecuadamente autoacondicionado y ceder antígenos a las células dendríticas receptoras que, a su vez, suprimen específicamente las células T receptoras.
(c) Las células Mreg-bc ejercen una supresión activa o pasiva no específica mediante la liberación de mediadores solubles que pueden actuar directamente o ejercer efectos a través de las células mielomonocíticas receptoras.
Además de su actividad supresora de células T, las células Mreg-bc de la invención presentan rasgos característicos adicionales que las hacen valiosas para uso terapéutico. Como se muestra en el Ejemplo 6, las células Mreg-bc de la invención secretan cantidades biológicamente relevantes de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF-A) y otros mediadores pro-angiogénicos tras la estimulación con ligandos del receptor tipo Toll (TLR), como el lipolisacárido (LPS), el lípido monofosforil A (MPLA) o la proteína 1 de High Mobility Group Box (HMGB1). En consecuencia, las células Mreg-bc de la invención son adecuadas para tratar enfermedades y afecciones en las que se desea inducir la angiogénesis, como en enfermedades y afecciones isquémicas.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la célula Mreg-bc del segundo aspecto de la invención. La composición farmacéutica comprenderá, como primer componente, una cantidad eficaz de las células Mreg-bc de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, una cantidad eficaz de las células Mreg-bc a administrar al paciente estará comprendida entre aproximadamente 1*104y aproximadamente 1*108/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 1*105y aproximadamente 1*107/kg de peso corporal, y más preferentemente entre aproximadamente 1*106 y aproximadamente 9*106/kg de peso corporal, como aproximadamente 1*106/kg, aproximadamente 2*106/kg, aproximadamente 3*106/kg, aproximadamente 4*106/kg, aproximadamente 5*106/kg, aproximadamente 6*106/kg, aproximadamente 7*106/kg, o aproximadamente 8*106/kg de peso corporal del paciente a tratar.
Aparte de las células, la composición farmacéutica puede comprender otros excipientes, tales como tampones, agentes reguladores del pH, conservantes y similares. La naturaleza y las cantidades de los excipientes incluidos en la composición farmacéutica de la invención dependerán de la vía de administración prevista. En general, son factibles diferentes vías de administración para proporcionar las células Mreg-bc de la invención a un paciente que necesite tratamiento. Preferentemente, la composición farmacéutica de la invención se formulará para administración parenteral, como administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Es particularmente preferible que las células Mreg-bc o una composición que comprenda dichas células o fracciones se administren al paciente por vía intravenosa.
La formulación de las células Mreg-bc de la invención en composiciones farmacéuticas puede lograrse aplicando procedimientos rutinarios conocidos en el campo de la formulación de fármacos. Los procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en los libros de texto habituales. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración intravenosa por inyección o infusión incluyen normalmente soluciones o suspensiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o suspensiones estériles. La composición destinada a la inyección debe ser estéril y fluida para permitir una manipulación cómoda en una jeringa o bolsa de infusión.
La composición debe ser estable en las condiciones de administración y se preserva preferentemente contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos, por ejemplo, incluyendo en la composición parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados pueden comprender solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El portador también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o más de los ingredientes mencionados anteriormente, seguido de filtración estéril. Generalmente, las suspensiones se preparan incorporando el compuesto activo, es decir, las células, en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que producen un polvo de las células más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estérilmente.
La composición destinada a infusión o inyección tendrá un volumen de entre 50 y 500 ml, siendo particularmente preferido un volumen de entre 90 ml y 250 ml, y siendo aún más preferido un volumen de entre 90 ml y 150 ml.
Las células Mreg-bc pueden administrarse a un paciente que necesita tratamiento mediante diferentes regímenes de administración. Por ejemplo, cuando las células o fracciones celulares se administran al paciente mediante infusión intravenosa, la cantidad total de células Mreg-bc o fracciones celulares Mreg-bc a administrar puede suministrarse mediante una o más de una infusión. En una realización preferente, las células Mreg-bc o fracciones celulares se suministran al paciente a través de un equipo de infusión con un filtro de 200 pm. La suspensión que comprende las células Mreg-bc o las fracciones celulares Mreg-bc puede cebarse con NaCl al 0,9%. La suspensión puede administrarse en una infusión única, más preferiblemente una infusión de corta duración en menos de 60 min, por ejemplo en 60 min, 30 min, 20 min o 15 min. Preferiblemente, se utiliza un catéter venoso central para administrar la suspensión de Mreg-bc.
La administración de las células o fracciones celulares Mreg-bc puede ir acompañada de la administración precedente, simultánea o posterior de otros agentes activos. Por ejemplo, cuando las células Mreg-bc o fracciones celulares de la invención se administran para prevenir una respuesta inmunitaria en un paciente que recibe un trasplante de órgano, puede administrarse un fármaco inmunosupresor junto con las células o fracciones celulares de la invención. Los fármacos inmunosupresores que se utilizan habitualmente en el campo de la medicina de trasplantes comprenden, entre otros, la ciclosporina A (CSA), el tacrolimus, la azatioprina (AZA), el micofenolato mofetilo, la rapamicina y los esteroides (STE). Generalmente, la presencia de fármacos inmunosupresores en la sangre del receptor no afecta a la eficacia de las células o fracciones celulares de la invención.
Aunque las células Mreg-bc obtenidas a partir del procedimiento descrito en el primer aspecto de la invención exhiben un fenotipo estable, se recomienda por razones de seguridad que las células Mreg-bc se administren dentro de las 24 horas siguientes a su recolección a partir de los cultivos celulares. Preferiblemente, las células se administran dentro de las 20 horas, dentro de las 16 horas, dentro de las 12 horas, dentro de las 8 horas o dentro de las 4 horas siguientes a la recolección de las células de los cultivos.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a la aplicación terapéutica de células Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o composiciones según el tercer aspecto de la invención. Como se indica en otras partes del presente documento, las células Mreg-bc proporcionadas por la presente invención presentan una serie de propiedades farmacológicas, tales como propiedades inmunosupresoras, inmunorreguladoras, angiogénicas y antiinflamatorias, que las hacen muy adecuadas para ser utilizadas en terapias inmunosupresoras, antiinflamatorias o reparadoras de tejidos. Por ejemplo, las células Mreg-bc inducidas artificialmente de la invención son supresoras de células T y median una eliminación activa de células T activadas. Como tales, las células son muy adecuadas para su uso como terapia inmunosupresora adjunta en una variedad de enfermedades mediadas inmunológicamente, como el trasplante de órganos.
Por consiguiente, en una realización de la invención, una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención se usa en un procedimiento para suprimir el rechazo de trasplante y/o prolongar la supervivencia de trasplante en un sujeto que recibe un trasplante. La invención se refiere así a un procedimiento para suprimir el rechazo del trasplante y/o prolongar la supervivencia del trasplante en un sujeto que recibe un trasplante, que comprende (i) la administración de una cantidad eficaz de una célula Mregbc según el segundo aspecto de la invención, o (ii) la administración de una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención. Preferiblemente, el trasplante es de órganos, tejidos o células. El tipo de órgano a trasplantar no está limitado según la invención, pero será preferentemente un riñón, un hígado, un corazón, un pulmón o un páncreas. Se prefiere especialmente que el órgano que se va a trasplantar al receptor sea un órgano humano.
El Mreg-bc de la presente invención también puede usarse para suprimir el rechazo del trasplante y/o prolongar la supervivencia del trasplante en casos en los que el trasplante es un trasplante de tejido en lugar de un trasplante de órgano. Una vez más, el tejido que se va a trasplantar al receptor no está especialmente limitado. El rechazo de cualquier tejido derivado de un donante alogénico en el receptor puede prevenirse o mejorarse mediante el Mreg-bc de la presente invención. El tejido a trasplantar será preferiblemente un tejido humano, como un tejido intestinal, córnea, piel, tejido compuesto, médula ósea o islotes pancreáticos.
El Mreg-bc preparado según el procedimiento de la invención también puede apoyar el trasplante celular en un receptor mediante la supresión de la respuesta inmunitaria en el receptor. Cuando el trasplante es celular, la naturaleza de la célula a trasplantar no suele estar limitada, pero se prefiere que la célula a trasplantar se seleccione del grupo formado por un trasplante de células madre adultas, un trasplante de hepatocitos aislados o un trasplante de células leucocitarias. Las células Mreg-bc de la invención también son capaces de producir factores solubles que promueven la localización y el injerto de células madre adultas, como la catelicidina. En una realización preferente de esta invención, las células Mreg-bc se utilizan para facilitar el injerto de células madre hematopoyéticas (HSC) tras el trasplante de médula ósea o HSC.
Para suprimir el rechazo del trasplante en el receptor e inducir la aceptación de un trasplante alogénico de órganos, tejidos o células, las células Mreg-bc de la invención o una composición farmacéutica que comprende las células Mregbc puede administrarse por vía intravenosa mediante inyección o infusión, como se ha descrito anteriormente. La inyección o infusión puede administrarse antes o después de la operación. Si las células Mreg-bc se administran preoperatoriamente, se administrarán al receptor al menos una vez, preferiblemente dos veces, y más preferiblemente tres veces antes de la operación. Se prefiere que los Mreg-bc se administren al receptor no antes de una semana antes de la operación, por ejemplo, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días o 1 día antes de la operación. Si las células Mreg-bc se administran en el postoperatorio, una primera administración se realizará preferiblemente en las 24 horas siguientes a la operación, más preferiblemente en las 36 horas, 48 horas, 60 horas o 72 horas siguientes a la operación. Alternativamente, en receptores de trasplantes inmunosuprimidos de forma estable, la terapia Mreg-bc puede administrarse en cualquier momento tras el trasplante. Alternativamente, Mreg-bc puede administrarse a receptores de trasplantes sometidos a rechazo agudo o crónico del trasplante. Las Mregs-bc son entonces capaces de repeler la respuesta de las células T del sistema inmunitario del receptor contra el trasplante y de persistir en el organismo del receptor (especialmente en el bazo, el hígado, los pulmones y la médula ósea) durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para conferir al receptor una aceptación a largo plazo del trasplante.
Cuando se utiliza el Mreg-bc de la invención para suprimir el rechazo del trasplante o prolongar la supervivencia del trasplante en un sujeto que recibe un trasplante, el trasplante será normalmente un trasplante alogénico, es decir, un trasplante que procede de un donante que, aunque genéticamente diferente, pertenece a la misma especie que el receptor. En este caso, las células Mreg-bc se generan a partir de monocitos sanguíneos obtenidos de dicho donante. Los monocitos pueden obtenerse de un donante vivo o muerto. En el caso de un donante fallecido, es decir, una donación de cadáver, el cuerpo del donante se lava normalmente con un medio de perfusión mediante la canalización de la arteria principal con el fin de preservar los órganos. La sangre venosa se extrae del cuerpo y puede recogerse para preparar el Mreg-bc según el procedimiento aquí descrito. Alternativamente, el Mreg-bc también puede prepararse a partir de células mielomononucleares aisladas del bazo del donante. En el caso de la aplicación postoperatoria de las Mreg-bc que se prepararon a partir de un donante fallecido, se puede prevenir un rechazo del órgano trasplantado mediante la administración de inmunosupresores que se utilizan habitualmente con este fin durante el trasplante de órganos.
En otra realización, las células Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención se utiliza en un procedimiento de promoción o mantenimiento del injerto o efecto de medicamentos basados en células T reguladoras. Así pues, la invención también se refiere a un procedimiento para promover o mantener el injerto o el efecto de medicamentos basados en células T reguladoras en un sujeto que comprende (i) la administración de una cantidad eficaz de una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención, o (ii) la administración de una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención.
Aparte de las propiedades inmunorreguladoras e inmunosupresoras, las células Mreg-bc de la invención tienen propiedades antiinflamatorias que permiten la abrogación de procesos inmunes inflamatorios crónicos. En consecuencia, las células Mreg-bc proporcionadas en el presente documento también son útiles para tratar enfermedades o trastornos que se caracterizan por un estado inmunitario desregulado o una reacción inflamatoria excesiva, en particular enfermedades inflamatorias crónicas. Tales enfermedades o trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y reacciones de hipersensibilidad.
Así, en otra realización más, la célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención se usa en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una reacción de hipersensibilidad.
Cuando las Mreg-bc se usan para tratar una enfermedad autoinmune, dicha enfermedad puede estar (a) principalmente mediada por células T, (b) principalmente mediada por anticuerpos o (c) principalmente mediada por otros componentes celulares del sistema inmunitario. La enfermedad puede ser una afección autoinmune local o sistémica. El tipo de afecciones autoinmunes a tratar con la terapia Mreg-bc no está limitado según la invención, e incluye el lupus eritematoso sistémico (LES), la esclerodermia, el síndrome de Sjogren, la polimiositis, la dermatomiositis y otras afecciones autoinmunes sistémicas; Artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil y otras artritis inflamatorias; colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias intestinales; hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria y otras enfermedades hepáticas autoinmunes; Vasculitis cutánea de vasos pequeños, granulomatosis con poliangeítis, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, enfermedad de Behget, tromboangeítis obliterante, enfermedad de Kawasaki y otras vasculitis de vasos grandes, medianos o pequeños de etiología autoinmune; Esclerosis múltiple (EM) y trastornos neuroinmunológicos; Diabetes de tipo I, disfunción tiroidea autoinmune, disfunción hipofisaria autoinmune y otros trastornos endocrinológicos autoinmunes; anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica y otros trastornos autoinmunes de la sangre y la médula ósea; psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide y otras afecciones dermatológicas autoinmunes.
Las células Mreg-bc también son eficaces para tratar enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, y enfermedades con un componente inflamatorio fisiopatológicamente significativo. La enfermedad inflamatoria a tratar puede ser local o sistémica. El tipo de enfermedades o afecciones inflamatorias que se benefician del tratamiento con Mreg-bc no está limitado e incluye, entre otras, las enfermedades oclusivas arteriales, como la enfermedad oclusiva arterial periférica (EOAP), la isquemia crítica de las extremidades, la arteriosclerosis, el infarto cerebral, el infarto de miocardio, el infarto renal, el infarto intestinal, la angina de pecho y otras afecciones causadas por oclusión o constricción arterial; angina microvascular, también conocida como síndrome cardíaco X; inflamación sistémica asociada a trastornos metabólicos, incluida la diabetes de tipo II y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad; enfermedades dermatológicas, incluido el eccema. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria a tratar se caracteriza por la inflamación crónica de la íntima de una pared arterial, por ejemplo, infarto de miocardio, ictus, vasculitis por isquemia crítica de las extremidades y DAEP
Cuando se desea el tratamiento de una reacción de hipersensibilidad, la reacción de hipersensibilidad se selecciona preferentemente del grupo de asma, eczema, rinitis alérgica, angioedema, hipersensibilidad a fármacos y mastocitosis.
El tratamiento de la pAOD es particularmente preferido. Se sabe que la DAEP en pacientes que no son aptos para procedimientos de revascularización, debido a la extensión o localización de sus oclusiones arteriales, o a comorbilidades significativas, es una afección gravemente debilitante y prevalente para la que la amputación es la única opción terapéutica. La amputación sigue siendo un tratamiento de último recurso y se asocia a una mortalidad relativamente alta, y sólo una minoría de pacientes recupera posteriormente la movilidad completa. En el curso de la presente invención, se descubrió que las células Mreg-bc obtenidas a partir del procedimiento aquí descrito tienen propiedades angiogénicas. Las Mreg-bc promueven activamente la neovascularización, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos, mediante la expresión basal y estimulada de factores de crecimiento proangiogénicos, como VEGF, FIGF (VEGF-D), PDGFB y<m>D<k>. En particular, las células Mreg-bc producen altos niveles de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tras la estimulación con ligandos TLR4. En particular, se descubrió aquí que las Mreg-bc inducen la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C). Se ha publicado que el VEGF-C es un factor angiogénico que estimula eficazmente la neovascularización in vivo [16].
En una realización, las células Mreg-bc se inyectan por vía intramuscular o subcutánea en una extremidad isquémica. En el tejido isquémico, las células Mreg-bc estarán inevitablemente expuestas a componentes microbianos y componentes tisulares necróticos (por ejemplo, HMGB1) que actúan como agonistas de TLR4. Por lo tanto, Mreg-bc puede utilizarse para promover la regeneración tisular mediante la secreción local de factores de crecimiento proangiogénicos. En otra realización, las células Mreg-bc pueden ser estimuladas ex vivo con ligandos TLR durante el procedimiento de fabricación para asegurar su producción de alto nivel de VEGF. Dichos ligandos TLR pueden incluir, entre otros, el lipopolisacárido (LPS) o el lípido monofosforilo A (MPLA). El pAOD a tratar con el Mreg-bc de la invención puede ser un pAOD de cualquier grado o categoría. Por ejemplo, la pAOD puede ser una pAOD de grado I, categorías 1-4, o pAOD de grado II-IV
Como los Mreg-bc de la invención tienen propiedades angiogénicas, se contempla en el presente documento su uso en otras enfermedades o afecciones que requieren neovascularización. Por lo tanto, la invención también se refiere a la célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención que se utiliza en un procedimiento de inducción de angiogénesis o vasculogénesis en tejidos hipóxicos, promoviendo procesos de reparación tisular participando en la remodelación tisular, regeneración tisular, previniendo o reduciendo la fibrosis, reduciendo el dolor isquémico o evitando la amputación mayor de extremidades. La invención se refiere así a un procedimiento para inducir la angiogénesis o vasculogénesis en tejidos hipóxicos, promover procesos de reparación tisular participando en la remodelación tisular, la regeneración tisular, prevenir o reducir la fibrosis, reducir el dolor isquémico o evitar la amputación de miembros mayores que comprende (i) la administración de una cantidad eficaz de una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención, o (ii) la administración de una composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención.
El tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o reacciones de hipersensibilidad puede lograrse bien con Mreg-bc que se derivan de monocitos que son alogénicos al paciente, como se ha descrito anteriormente en el contexto con aplicaciones de trasplante, o bien con monocitos que son autólogos al paciente que necesita tratamiento. Siempre que sea posible, el tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias o reacciones de hipersensibilidad se realizará con monocitos autólogos. Para ello, el Mregs-bc puede administrarse por vía intravenosa con o sin inyecciones intramusculares locales simultáneas.
En otra realización más, la célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención o la composición farmacéutica según el tercer aspecto de la invención se utiliza como vehículo para administrar terapia génica. La invención se refiere así a un procedimiento de administración de terapia génica que comprende (i) la administración de una cantidad eficaz de una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención que comprende un transgén, o (ii) la administración de una composición farmacéutica que comprende una célula Mreg-bc según el segundo aspecto de la invención que comprende un transgén.
Según un quinto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una célula T inmunorreguladora, dicho procedimiento comprende:
(a) obtención de células T de un sujeto;
(b) cocultivo de las células T con una célula macrófaga inmunorreguladora como se ha descrito anteriormente; (c) obtención de las células T inmunorreguladoras a partir del medio de cultivo.
Como se describe en otra parte del presente documento, las células T que se han co-cultivado con Mregs-bc inhiben la proliferación de células T En consecuencia, las células T inmunorreguladoras obtenidas a partir de los procedimientos anteriores pueden utilizarse, solas o en combinación con las células Mreg-bc de la invención, para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o trastornos tratados en el presente documento. En una primera etapa, se obtienen células T de una muestra de sangre de un sujeto. Las células pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de una muestra de sangre o de un aphere-sado, o de tejidos del sujeto, por ejemplo, de la médula ósea o del bazo. Las células pueden obtenerse por procedimientos convencionales, por ejemplo, en el caso de células de la sangre por venopunción. Las células T utilizadas en el procedimiento anterior serán, por ejemplo, células T CD3+ o subconjuntos de las mismas. Antes de ser co-cultivadas con las células Mreg-be, las células T CD3+ pueden ser purificadas o enriquecidas por procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante separación por microesferas magnéticas o clasificación por citometría de flujo.
A continuación, las células T se ponen en contacto con Mregs-bc de la presente invención. Las células pueden ponerse en contacto en diferentes proporciones Mreg:Treg. Por ejemplo, las fracciones celulares pueden ponerse en contacto en una proporción Mreg:Treg de entre 1:5 y 5:1, preferiblemente de entre 1:2 y 2:1. Más preferiblemente, la proporción Mreg:Treg es de aproximadamente 1:1. Se pueden utilizar diferentes medios para el procedimiento de cocultivo. Los medios pueden ser los descritos anteriormente en relación con el procedimiento para preparar células Mreg-bc. En una realización preferente, el medio es X-vivo 10 de Lonza. El medio puede contener otros aditivos como M-CSF y/o GM-CSF, preferiblemente M-CSF y/o GM-CSF recombinante humano. La cantidad de M-CSF y/o GM-CSF estará en el intervalo mencionado en otras partes del presente documento, por ejemplo, 5-100 ng/ml, preferiblemente 20-25 ng/ml. El medio también puede contener otros aditivos, como Glutamax en una cantidad de 1-5 mM, preferiblemente 2 mM.
Las células se co-cultivarán durante 1-8 días, preferiblemente durante al menos 3 días, al menos 4 días, o al menos 5 días. Tras el periodo de cultivo predeterminado, las células T pueden volver a aislarse por procedimientos convencionales, por ejemplo enriqueciendo las células para CD4+ CD25+ TIGIT+ FoxP3+ Tregs. Si es necesario, las células pueden seguir formulándose hasta convertirse en productos farmacéuticos. También se divulga en el presente documento un procedimiento para detectar células macrófagas inmunorreguladoras, que comprende
(a) Proporcionar una muestra que comprenda células macrófagas;
(b) detectar en dicha muestra la presencia de la proteína DHRS9 y/o la expresión del gen DHRS9;
donde la presencia de la proteína DHRS9 y/o la expresión del gen DHRS9 indica que la muestra comprende células macrófagas inmunorreguladoras.
El procedimiento puede usarse para discriminar entre células macrófagas inmunorreguladoras (Mregs) y macrófagos en otros estados de activación, tales como macrófagos derivados de monocitos (M9), incluyendo M9 en reposo, M9 estimulados con LPS IFNy, M9 estimulados con IL-4 y M9 estimulados con inmunoglobulina (Ig). Dado que la expresión de DHRS9 sólo se encontró en Mregs, este marcador puede utilizarse para identificar Mregs en una población heterogénea de macrófagos, por ejemplo, una población que comprende Mregs y al menos uno de los siguientes tipos de macrófagos: M9 en reposo, M9 estimulados con LPS IFN<y>, M9 estimulados con IL-4 y M9 estimulados con inmunoglobulina (Ig). La detección del marcador DHRS9 puede lograrse mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos estándar contra el polipéptido DHRS9 o fragmentos del mismo. La expresión de DHRS9 puede detectarse mediante PCR, RT-PCR, PCR en tiempo real y otros procedimientos rutinarios.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para aislar células macrófagas inmunorreguladoras a partir de una población heterogénea de macrófagos, que comprende
(a) proporcionar una población heterogénea de macrófagos;
(b) aislar células de macrófagos inmunorreguladores por su afinidad a moléculas que se unen específicamente a la proteína DHRS9.
Por ejemplo, en una realización, las células macrófagas inmunorreguladoras dentro de la población heterogénea de macrófagos pueden aislarse uniéndose a anticuerpos dirigidos contra DHRS9. Dichos anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal. En una realización preferente, los anticuerpos anti-DHRS9 pueden inmovilizarse en una fase sólida, como el fondo de un pocillo de una placa de microtitulación. La población de macrófagos se incuba en el pocillo para permitir la unión de los anticuerpos anti-DHRS9 a la DHRS9 que está presente en la superficie de las células macrófagas inmunorreguladoras. Tras lavar los macrófagos no unidos, se obtiene una población homogénea de células macrófagas inmunorreguladoras. En otra realización, los anticuerpos anti-DHRS9 pueden inmovilizarse en la superficie de perlas magnéticas. Las perlas se incuban con la población de macrófagos para permitir la unión de los anticuerpos a DHRS9. Tras separar las microesferas de la solución que contiene la población de macrófagos, se obtiene una población homogénea de células macrófagas inmunorreguladoras.
Por consiguiente, también se divulga en el presente documento el uso de una molécula que se une específicamente a DHRS9, en particular un anticuerpo anti-DHRS9, para la detección o aislamiento de células macrófagas inmunorreguladoras.
Ejemplos
Las células Mreg-bc se fabricaron de acuerdo con los principios GMP vigentes para la producción de medicamentos estériles. En cada etapa del procedimiento se presta atención a que los productos, materiales y equipos estén protegidos contra la contaminación y las impurezas.
Ejemplo 1: Preparación de las células Mregs-be
Donantes humanos sanos fueron sometidos a leucaféresis para recoger células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se utilizan como material de partida para la generación de Mreg-bc. Todos los donantes fueron sometidos a pruebas de detección de marcadores de enfermedad relevantes, incluidas las enfermedades infecciosas, no más de 30 días antes de la leucaféresis. El día de la leucaféresis se volvió a examinar a los donantes para detectar los mismos marcadores de enfermedad. La leucaféresis se realizó con el dispositivo Terumo BCT Cobe Spectra o equivalente.
Los monocitos CD14+ se aislaron del producto de leucaféresis utilizando el sistema Miltenyi CliniMACS<®>de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el producto de la leucaféresis se transfirió a una bolsa que se llenó con tampón PBS/EDTA que contenía 0,5% de seroalbúmina humana (HSA). Las células se lavaron una vez antes de marcarlas con el reactivo CliniMACS® CD14 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.. La suspensión celular marcada se conectó a un juego de tubos estériles y se instaló en el dispositivo CliniMACS<®>para aislar los monocitos CD14+ mediante separación magnética. La fracción de monocitos CD14+ aislada positivamente se lavó con medio de cultivo para eliminar el tampón de separación CliniMACS<®>.
La densidad de monocitos se ajustó entonces a 10<6>células/ml en medio de cultivo celular. Se tomaron monocitos CD14+ para su análisis por citometría de flujo como control durante el procedimiento. El número de células para los cálculos relacionados con el procedimiento se determinó mediante un contador de sangre automatizado utilizando el parámetro WBC como número total de leucocitos. La viabilidad de todos los tipos celulares se evaluó mediante citometría de flujo.
Los monocitos CD14+ aislados se volvieron a suspender a una densidad de 10<6>células/ml en medio RPMI que se había suplementado con 10% de suero AB humano exclusivamente masculino (agrupado e inactivado por calor), 2 mM de GlutaMAX<™>y 25 ng/ml de factor estimulante de colonias de monocitos humanos recombinante (M-CSF).
Esta suspensión de monocitos se distribuyó en bolsas de diferenciación celular Miltenyi<®>, de tal manera que cada bolsa se sembró con 1 * 10<6>células/cm<2>de superficie interna. Para el cultivo, las bolsas de diferenciación se colocaron planas en estantes dentro de una incubadora que se ajustó a 36-38°C, 5 ± 1% de CO<2>, s 60% de humedad. Se dejó que los monocitos precipitaran en la hoja inferior de las bolsas de cultivo a lo largo de 1 día. El día 1, se invirtieron las bolsas para permitir que los monocitos se adhirieran a la hoja opuesta. Los cultivos se mantuvieron en la incubadora durante otros 5 días.
Para inducir la diferenciación final de los monocitos en Mregs-bc e inducir la expresión de indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), se estimularon los monocitos mediante la adición de 25 ng/ml de IFN-<y>. Tras la adición de IFN-y, las bolsas de diferenciación se invirtieron otra vez. A continuación, las bolsas se incubaron durante otras 18-24 h a 36-38°C, 5 ± 1% de CO<2>, ^ 60% de humedad.
En el día 7, se cosecharon las Mregs-bc diferenciadas. Las células de todas las bolsas de cultivo paralelas se agruparon y lavaron antes de los análisis fenotípicos y funcionales.
Ejemplo 2: Caracterización fenotípica de Mregs-be
Se analizó en detalle el fenotipo de Mregs-be obtenido a partir del procedimiento del Ejemplo 1. En cultivo, los macrófagos presentan una morfología distintiva, adoptando las células una morfología epitelioide teselada para formar monocapas casi confluentes (véase la Figura 6A). Los macrófagos individuales son células grandes, densamente granulares, con un cuerpo central prominente y una fina falda citoplasmática, que se extiende simétricamente por la superficie del vaso de cultivo. El examen ultraestructural de los macrófagos mediante microscopía electrónica de transmisión confirma la impresión de una célula grande y aplanada adherida muy estrechamente a la superficie subyacente (véase la figura 6B). En la mayoría de los aspectos, el aspecto ultraestructural de los macrófagos es el típico de un macrófago activado: los procedimientos se extienden desde el perímetro exterior y la superficie superior de las células; los núcleos parecen activos con abundante cromatina fina; y, el citoplasma contiene numerosas vesículas endocíticas, inclusiones lipídicas y un retículo endoplásmico liso prominente.
El fenotipo de superficie celular de las células Mreg-bc se caracterizó mediante citometría de flujo. Para preparar las células Mreg-be para el análisis por citometría de flujo, se cosecharon las células y se lavaron una vez en DPBS libre de Ca2+/Mg2+ antes de resuspenderlas a 1-5 * 105 células/100 pl en DPBS libre de Ca2+/Mg2+ que contenía 1% de BSA, 0,02% de NaN3y 10% de bloque FcR (Miltenyi).02% NaN3, y 10% de bloqueo FcR (Miltenyi). A continuación, las muestras se incubaron a 4 °C durante 15 min. Los anticuerpos conjugados con fluorocromo se obtuvieron de diferentes fabricantes y se aplicaron a las suspensiones celulares; las muestras se agitaron en vórtex antes de incubarlas a 4 °C durante 20 min en la oscuridad. Tras añadir 10 pl de 7-AAD, cada muestra se agitó brevemente en un vórtex y se incubó durante otros 10 minutos a 4 °C en la oscuridad. Posteriormente, las muestras se lavaron dos veces en DPBS sin Ca2+/Mg2+ y se resuspendieron para el análisis. Para realzar las señales de Clec-9a se utilizaron reactivos FASER (Miltenyi) en 2 rondas según las instrucciones del fabricante. Para la tinción intracelular, las células se tiñeron primero para los antígenos de la superficie celular como se ha descrito anteriormente, y después se fijaron y permeabilizaron utilizando un Conjunto de tampones de fijación y permeabilización intracelular (eBioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se resuspendieron en tampón de permeabilización que contenía un 10% de bloque FcR y se incubaron durante 15 min a 4°C en la oscuridad. Se aplicaron anticuerpos conjugados con fluorocromos a las suspensiones celulares y las muestras se agitaron brevemente en vórtex antes de incubarlas a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces en tampón de permeabilización y se resuspendieron para el análisis. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo Canto II (BD Biosciences, Alemania) y se analizaron con el software FlowJo 7.6 (TreeStar, EE.UU.) o Kaluza 1.1 (Beckman Coulter, Alemania).
Este análisis de citometría de flujo revela que las células Mreg-bc humanas viables de la invención presentan un CD14' /bajo CD209-/baj° CD16-/baj° CD80-./baj° CD86+ CD10+A CD103+A CD38'/low CD85h+ CD258+ Fenotipo Syndecan-3' /low Clec-9a+ (Fig. 2).
Ejemplo 3: Singularidad del fenotipo Mreg
La relación fenotípica de Mregs con macrófagos en otros estados de activación conocidos en la técnica anterior se estableció generando un panel de tipos de macrófagos para comparación con Mregs en términos de morfología, expresión de marcadores de superficie celular, producción de citoquinas y perfiles de expresión génica global. Los Mregs podían distinguirse fácilmente de todos estos otros tipos de macrófagos por su morfología característica (véase la Figura 6C) y por su fenotipo de superficie celular distinto (véase la Figura 6D). En particular, se observó que las Mregs son únicas en la regulación a la baja de CD14 y en su falta de expresión de CD16, TLR2 y CD163 en la superficie celular.
Los Mregs y el panel de macrófagos de comparación también se distinguieron por sus perfiles de producción de citoquinas y quimioquinas. Las Mregs producen constitutivamente sólo pequeñas cantidades de TNF-a e IL-6, y no secretan cantidades detectables de IL-12p40. Los Mregs expresan niveles detectables de TGF-p y altas cantidades de IL-1Ra, pero notablemente menos IL-10 que otros tipos de macrófagos. Este perfil de secreción de citoquinas permanece relativamente estable tras la exposición a IFN-y y LPS.
Para identificar marcadores expresados exclusivamente por Mregs, se generaron Mregs e IFN-Y-M9 según procedimientos descritos previamente [10] a partir de leucocitos de sangre periférica obtenidos como subproducto de la recogida de trombocitos de donantes sanos. Brevemente, se aislaron monocitos CD14+ de PBMC preparadas con Ficoll mediante selección positiva con microperlas anti-CD14 (Miltenyi, Bergisch-Gladbach) y se sembraron en placas Cell+ de 6 pocillos (Sarstedt, Nümbrecht) a 105 células/cm2 en RPMI-1640 (Lonza, Colonia) suplementado con 10% de suero a B humano inactivado por calor (Lonza), 2 mM de Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe), 100 U/mL de penicilina (Lonza), 100 pg/mL de estreptomicina (Lonza), y rhM-CSF (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt) a 25 ng/ml transportado en 0.1% de albúmina humana (CSL-Behring, Hattersheim-am-Main). El día 6 de cultivo, las células se estimularon durante otras 18-24 horas con 25 ng/mL de rhIFN-Y (Chemicon, Billerica, MA). Los macrófagos estimulados con IFN-<y>(IFN-Y-M9) se generaron cultivando monocitos CD14+ en condiciones idénticas a las de los Mregs, salvo que el suero humano se sustituyó por suero de ternera fetal (FCS) inactivado por calor al 10% (Biochrom, Berlín). Los macrófagos (M9) en otros estados de polarización definidos se generaron a partir de monocitos CD14+ aislados positivamente según protocolos adaptados de la bibliografía [12]-[15]. Brevemente, los monocitos se cultivaron durante 7 días a 105 células/cm2 en recipientes de plástico Cell+ (Sarstedt) en medio RPMI con 100U/ml de penicilina, 100 |jg/ml de estreptomicina y 2mM de GlutaMAXTM, complementado de la siguiente manera: M9 en reposo - 20% de FCS más 100 ng/ml de M-CSF durante 7 días; M9 activados por lipopolisacárido (LPS) - 20% de f Cs más 100 ng/ml de M-CSF con adición de 100 ng/ml de LPS (Enzo Life Sciences) y 20 ng/ml de IFN-y el día 6; M9 estimulados por IL-4 - 20% de FCS más 100 ng/ml de M-CSF con adición de 20 ng/ml de IL-4 (R&D Systems) el día 6; M9 estimulado con Ig: 10% FCS más 100 ng/ml M-CSF, células cultivadas en material plástico recubierto previamente con IVIg humano (PrivigenTM, CSL Behring) y con adición de 100 ng/ml LPS el día 6; M9 estimulado con glucocorticoides (GC): 20% FCS más 100 ng/ml M-CSF con adición de 10-7 M de dexametasona (Sigma-Aldrich) el día 6.
Se generó una serie de anticuerpos monoclonales (mAb) vacunando ratones con lisados de Mreg humano. El cribado de estos mAb mediante inmunocitoquímica identificó un clon de mAb (ASOT1) que reaccionaba fuertemente con Mregs, pero no con otros macrófagos derivados de monocitos (M9), incluidos M9 en reposo, M9 estimulados con LPS IFN<y>, M9 estimulados con IL-4 y M9 estimulados con inmunoglobulina (ig) (véase la Figura 3A). Mediante inmunoprecipitación y secuenciación de su antígeno, se demostró que el mAb ASOT1 reconocía DHRS9, una retinol deshidrogenasa poco estudiada de la familia SDR (véase la Figura 3B). La PCR cuantitativa confirmó que la expresión del ARNm de DHRS9 está restringida a las Mregs (Fig. 3C). Un anticuerpo policlonal de conejo generado contra un epítopo N-terminal de DHRS9 reaccionó contra una proteína de aproximadamente 35 kD inmunoprecipitada por ASOT1 (véase la Figura 3D). Dado que un anticuerpo monoclonal disponible en el mercado (clon 3C6) que reconoce la DHRS9 también reaccionó con la misma proteína detectada por el anticuerpo de conejo, puede concluirse con seguridad que tanto el ASOT1 como el anticuerpo policlonal de conejo reconocen la DHRS9. Utilizando este pAb de conejo, se demostró que la expresión de la proteína DHRS9 era exclusiva de las Mregs (Fig. 3E).
Se utilizaron perfiles de expresión de genoma completo para obtener una visión global de la proximidad fenotípica entre Mregs y macrófagos en otros estados de activación. Se realizaron análisis de micromatrices con un panel de nueve tipos de macrófagos de comparación, que se prepararon a partir de tres donantes distintos en paralelo. Se seleccionaron los genes que tenían una expresión diferencial superior a 20 veces entre dos muestras y se agruparon jerárquicamente, lo que reveló que las muestras Mreg eran más similares a las Mreg no tratadas con IFN-y y a las Mreg estimuladas con LPS que cualquier otra muestra de macrófagos. Este patrón de agrupación se mantuvo estable cuando se utilizaron para el análisis todas las sondas con expresión diferencial significativa. Las muestras Mreg eran más similares a los macrófagos M2b estimulados con Ig que a otros tipos de macrófagos, lo que subraya la importancia de la estimulación con Ig en el desarrollo del fenotipo Mreg según el aspecto 1, etapa (c). Los macrófagos en reposo y los macrófagos estimulados con IFN-<y>se agruparon con macrófagos M2a y M2c. Los macrófagos M1 de activación clásica eran más diferentes de los tipos de macrófagos de comparación que los macrófagos de comparación entre sí. A partir de estas observaciones, se puede concluir que las Mregs se encuentran en un estado único de activación y son relativamente refractarias a la repolarización hacia el fenotipo M1 por estimulación con LPS.
Los resultados de la matriz de micromatrices fueron coherentes con los hallazgos de la citometría de flujo en la medida en que CD163, IL-10 y CD14 se encontraron dentro de la lista de genes regulados a la baja que discriminaban a los Mregs de todos los demás macrófagos comparadores. Dentro del conjunto de genes únicamente regulados al alza por las Mregs, CD258 (TNFSF14, LIGHT) y c D85H (ILT1, LILRA2) fueron identificados como marcadores útiles para la identidad de las Mregs. La expresión de CD258 y CD85b por las Mregs, pero no por los macrófagos estimulados con IFN-y, se confirmó mediante citometría de flujo (Fig. 7).
La constelación de CD45+ CD11b+ CD11c+ CD14'/low CD209'/low CD16'/low CD80'/low CD86+ CD10+/- CD103+/- CD38' /low CD85h+CD258+Syndecan-3'/low Clec-9a+DHRS9+y Arg-1+y IDO+ es una definición rigurosa y estable del fenotipo de las Mreg.
Ejemplo 4: Generación de Tregs humanas activadas inducidas periféricamente mediante tratamiento alogénico con Mreg-bc en ratones NOD/SCID/IL2rYnuM.
Las células Mreg-bc de la invención se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Se reconstituyeron ratones inmunodeficientes NOD/SCID/IL2rYnuN (n Sg ) con células T humanas. Estos ratones fueron tratados o no con células Mreg-bc de la invención (véase la Figura 8A). Se recuperaron células T humanas del bazo de ratones receptores a los 5 días del tratamiento con células Mreg-bc. La población de células T en los ratones tratados con Mreg estaba enriquecida para FoxP3+ Tregs y TIGIT+ FoxP3+ Tregs en comparación con los receptores que no fueron tratados con Mregs-bc (ver Figura 8B). Los niveles séricos de IL-10 humana fueron significativamente superiores en los ratones NSG tratados con células Mreg-bc en comparación con los animales no tratados (véase la Figura 8C). Este ejemplo demuestra que las Mregs-bc humanas pueden interactuar directamente con células T humanas alogénicasin vivopara inducir el desarrollo de Treg.
Ejemplo 5: Tratamiento de un receptor de trasplante renal con células Mreg-bc antes de la cirugía
Las células Mreg-bc de la invención se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Las células Mreg-bc se administraron a un posible receptor de trasplante renal de donante vivo de 43 años con insuficiencia renal terminal debida a poliquistosis renal. Las células Mreg-bc se produjeron a partir de monocitos recogidos del padre sano del receptor, de 62 años, que posteriormente donó un riñón a su hijo. El donante y el receptor presentaban discordancias únicas en los loci HLA-A, -B y -DR.
Se administró un total de 4,75 * 108 Mregs-bc viables mediante infusión venosa central lenta. No se observaron reacciones adversas. En concreto, no hubo indicios de obstrucción vascular pulmonar, sobrecarga cardiaca derecha, reacciones transfusionales, reacciones de hipersensibilidad ni alteraciones bioquímicas. El tratamiento con células Mreg-bc no hizo que el receptor produjera anticuerpos HLA antidonante.
El receptor se encuentra ahora más de 15 meses después del trasplante con una función estable del aloinjerto. El receptor se mantiene actualmente con un régimen inmunosupresor de dosis reducida compuesto por tacrolimus y MMF. Este caso ilustra la viabilidad de administrar células Mreg-bc a un receptor de trasplante renal preoperatorio.
Ejemplo 6: Producción de factores angiogénicos por las células Mreg-bc
Se probó si las células Mreg-bc producen el factor angiogénico VEGF-A tras la estimulación con lípido monofosforilo A (MPLA). El montaje de este experimento se muestra en la figura 9.
En la primera condición de ensayo, se cultivaron Mreg-bc como se describe en el Ejemplo 1 hasta el día 7, incluyendo la estimulación estándar de 25 ng/ml de IFN-y del día 6. El día 7, se cosecharon las células Mreg-bc y se volvieron a colocar en 1 ml de RPMI-1640 1% HABS Pen-Strep 2 mM GlutaMAX a 0,5 * 106 células por pocillo en una placa de 24 pocillos. A continuación, estas células Mreg-bc replicadas se estimularon o no con 1 pg/ml de LPS. Paralelamente, se cosecharon células Mreg-bc y se investigaron por citometría de flujo para CD14, CD10, CD16, CD38, CD80, CD86, CD85h, CD103, CD258, CD209 y Syndecan-3.
En la segunda condición, las células Mreg-bc se estimularon adicionalmente con 100 ng/ml de MPLA el día 6 de cultivo al mismo tiempo que se añadió IFN-<y>. El día 7, las células Mreg-bc cosechadas de la condición 2 se volvieron a implantar y estimular como en la condición 1. Además, las células Mreg-bc de la condición 2 se analizaron mediante citometría de flujo para los marcadores CD14, CD10, CD16, CD38, CD80, CD86, CD85h, CD103, CD258, CD209 y Syndecan-3.
En la tercera condición, las células Mreg-bc se estimularon con 25 ng/ml de IFN-<y>como de costumbre el día 6. El día 7, las células se volvieron a estimular con 100 ng/ml de MPLA durante otras 24 horas. A continuación, se cosecharon las células el día 8 para analizarlas en las condiciones 1 y 2.
La secreción de VEGF-A por las células de las tres condiciones se midió mediante ELISA. El fenotipo de las células de las tres condiciones se comparó mediante citometría de flujo para evaluar la estabilidad del fenotipo de superficie celular definidor de Mreg-bc en las condiciones de prueba.
Resultado: El resultado de la determinación del VEGF-A se representa en la figura 9. Se observó que el tratamiento con 100 ng/ml de MPLA el día 6 o el día 7 aumenta la expresión de VEGF inducida por LPS. A las 24 horas, el tratamiento con 100 ng/ml de MPLA no altera drásticamente el fenotipo Mreg-bc: sólo se observó una leve regulación al alza de la expresión de CD80. Estos ejemplos indican que el tratamiento con MPLA durante el cultivo de Mreg-bc podría ser una forma útil de potenciar la producción de VEGF-A por las células Mreg-bc antes de su aplicación al paciente.
Ejemplo 7: Producción de factores angiogénicos por las células Mreg-bc
Se comprobó si las células Mreg-bc producen factores relacionados con la angiogénesis. Para ello, se aislaron más de 30 * 106 monocitos CD14+/donante de 5 donantes frescos. Se preparó medio (RPMI-1640 10% HABS 2 mM GlutaMax PS 25 ng/ml M-CSF humano recombinante) para bolsas de 5 * 500 ml. Se llenó una bolsa de 500 ml por donante con 30 * 106 monocitos/bolsa. El día 6, todas las bolsas se estimularon con IFN-y. El día 7, se cosecharon y contaron las Mregs.
Posteriormente, se preparó medio Mreg (RPMI-1640 10% HABS 2 mM GlutaMax PS 25 ng/ml M-CSF humano recombinante) para un recultivo. Se añadieron exactamente 15 ml de medio a cada uno de los 8 tubos de 50 ml. Se añadió solución de NaCl o 10 ng/ml de LPS (Enzo) como se indica a continuación y se agitó en vórtex:
Las Mregs se sembraron a 1 * 106 células/pocillo en placas de 24 pocilios. 1 pocilio por condición y donante:
Los cultivos se incubaron durante exactamente 48 horas. Se recogieron y limpiaron los sobrenadantes. Se prepararon 2 alícuotas de > 500 pl. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su análisis mediante ELISA para VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D y TNF-a.
Resultado: El resultado de la prueba ELISA se muestra en la figura 10. Como puede verse en la Figura 10A, las Mregs en combinación con LPS indujeron VEGF-A, VEGF-C y TNF-a, pero no<v>E<g>F-D. En condiciones hiperiónicas, se indujo a las Mregs a expresar V e GF-C, pero no VEGF-A, VEGF-D o TNF-a (Figura 10B).
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar una célula macrófaga inmunorreguladora, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) aislar monocitos CD14 positivos de una muestra de sangre de un sujeto;
(b) cultivar los monocitos en una bolsa de plástico permeable al gas en un medio de cultivo que contenga (i) M-CSF y (ii) un ligando CD16, en el que la concentración de M-CSF está en el intervalo de 5-100 ng/ml;
(c) poner en contacto las células con IFN-y, en el que la concentración de IFN-y está en el intervalo de 5-100 ng/ml; y
(d) obtener la célula macrófaga inmunorreguladora a partir del medio de cultivo,
en el que los monocitos de la etapa b) se cultivan durante al menos 5 días antes de la estimulación con IFN-y.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo en la etapa (b) comprende suero sanguíneo humano, tal como suero AB humano.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración de M-CSF en la etapa (b) está en el intervalo de 20-25 ng/ml.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que los monocitos de la etapa (b) se cultivan durante al menos 6, o durante al menos 7 días antes de la estimulación con IFN-y.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la bolsa de plástico permeable al gas está hecha de poliolefina.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la concentración de IFN-y en la etapa (c) está en el intervalo de 20-25 ng/ml.
7. Célula macrófaga inmunorreguladora, en la que dicha célula
(a) expresa al menos uno de los marcadores CD103, CD10 y Clec-9a; y
(b) en la que la expresión del marcador CD38 está regulada a la baja en más del 70% en relación con la expresión de dicho marcador por los monocitos.
8. Célula macrófaga inmunorreguladora según la reivindicación 7, en la que dicha célula no expresa uno o más de los siguientes marcadores: CD38, CD209 y Syndecan-3.
9. Célula macrófaga inmunorreguladora según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en la que dicha célula expresa además al menos uno de los marcadores CD85h y CD258.
10. Composición farmacéutica que comprende la célula macrófaga inmunorreguladora según cualquiera de las reivindicaciones 7-9.
11. Célula macrófaga inmunorreguladora según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 o composición farmacéutica según la reivindicación 10 para su uso en un procedimiento de
(a) suprimir el rechazo del trasplante y/o prolongar la supervivencia del trasplante en un sujeto que recibe un trasplante, preferiblemente un trasplante alogénico;
(b) tratar o prevenir una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria o una reacción de hipersensibilidad; o
(c) promover los procesos de reparación tisular participando en la remodelación tisular, la regeneración tisular, la angiogénesis, la vasculogénesis o la prevención/limitación de la fibrosis.
12. Célula macrófaga inmunorreguladora o composición farmacéutica para su uso en un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (LES), esclerodermia, síndrome de Sjogren, polimiositis, dermatomiositis y otras afecciones autoinmunes sistémicas; artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil y otras artritis inflamatorias; colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias intestinales; hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria y otras enfermedades hepáticas autoinmunes; vasculitis cutánea de vasos pequeños, granulomatosis con poliangeítis, granulomatosis eosinofílica con poliangeítis, enfermedad de Behget, tromboangeítis obliterante, enfermedad de Kawasaki y otras vasculitis de vasos grandes, medianos o pequeños de etiología autoinmune; Esclerosis múltiple (EM) y trastornos neuroinmunológicos; Diabetes de tipo I, disfunción tiroidea autoinmune, disfunción hipofisaria autoinmune y otros trastornos endocrinológicos autoinmunes; anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica y otros trastornos autoinmunes de la sangre y la médula ósea; psoriasis, pénfigo vulgar, penfigoide y otras afecciones dermatológicas autoinmunes.
13. Célula macrófaga inmunorreguladora o composición farmacéutica para su uso en un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedades oclusivas arteriales, como enfermedad oclusiva arterial periférica (EOAP), isquemia crítica de las extremidades, arteriosclerosis, infarto cerebral, infarto de miocardio, infarto renal, infarto intestinal, angina de pecho y otras afecciones causadas por oclusión o constricción arterial; angina microvascular, también conocida como síndrome cardíaco X; inflamación sistémica asociada a trastornos metabólicos, incluida la diabetes de tipo II y el síndrome metabólico relacionado con la obesidad; enfermedades dermatológicas, incluido el eccema.
14. Célula macrófaga inmunorreguladora o composición farmacéutica para su uso en un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha reacción de hipersensibilidad se selecciona del grupo que consiste en asma, eczema, rinitis alérgica, angioedema, hipersensibilidad a fármacos y mastocitosis.
15. Un procedimiento para preparar una célula T inmunorreguladora, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) obtener células T de un sujeto;
(b) cocultivar las células T con una célula macrófaga inmunorreguladora según cualquiera de las reivindicaciones 7-9;
(c) obtener la célula T inmunorreguladora a partir del medio de cultivo.
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