ES3036734T3 - Modified cytomegalovirus proteins and stabilized complexes - Google Patents

Abstract

Se describen polipéptidos mutantes del complejo pentámero del citomegalovirus humano (CMVH), sus métodos de producción y su uso en complejos y composiciones proteicas del CMVH. En particular, se describe el uso de polipéptidos modificados del CMVH para estabilizar complejos del CMVH o desenmascarar un epítopo pentámero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de citomegalovirus modificadas y complejos estabilizados

Campo de la invención

La presente invención está en el campo de la vacunación contra citomegalovirus humano (HCMV) y en particular, proporciona polipéptidos de gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A mutantes adecuados para usarse en un complejo de pentámero de HCMV estabilizado y su uso en una composición inmunogénica.

Antecedentes de la invención

El citomegalovirus (CMV) es un género de virus que pertenece a la familia viral conocida comoHerpesviridaeo herpesvirus. La especie que infecta a los humanos se conoce comúnmente como HCMV o herpesvirus humano-5 (HHV-5). Dentro deHerpesviridae,HCMV pertenece a la subfamiliaBetaherpesvirinae,que también incluye citomegalovirus de otros mamíferos.

Aunque se pueden encontrar en todo el cuerpo, las infecciones por HCMV se asocian con frecuencia con las glándulas salivales. HCMV infecta entre 50 % y 80 % de los adultos en los Estados Unidos (40 % en todo el mundo), como se indica por la presencia de anticuerpos en gran parte de la población general. La infección por HCMV suele pasar desapercibida en personas sanas, pero puede ser potencialmente mortal para los inmunocomprometidos, tal como personas infectadas por VIH, receptores de trasplantes de órganos o recién nacidos (Mocarskiet al., Cytomegalovirusin FIELDS VIROLOGY, eds. David M Knipe and Peter M Howley, Philadelphia, Pa., USA: Lippincott Williams and Wilkins, 2006). HCMV es el virus que se transmite con mayor frecuencia a un feto en desarrollo. Después de la infección, HCMV tiene la capacidad de permanecer latente dentro del cuerpo durante toda la vida del hospedador, con reactivaciones ocasionales de la latencia.

HCMV parece tener un gran impacto en los parámetros inmunitarios en la vida posterior y puede contribuir a la morbilidad y mortalidad eventual incrementadas (Simaneket al., Seropositivity to Cytomegalovirus, Inflammation, All-Cause and Cardiovascular Disease-Related Mortality in the United States,2011 PLoSONE 6: e16103).

Hasta la fecha, se han secuenciado los genomas de más de 20 cepas diferentes de HCMV, incluidos aquellos de cepas de laboratorio y productos aislados clínicos. Por ejemplo, se han secuenciado las siguientes cepas de HCMV: Towne (NCBI Geninfo (GI) identificador 239909366), AD169 (GI:219879600), Toledo (GI:290564358) y Merlin (GI:155573956). Las cepas AD169 de HCMV, Towne y Merlin se pueden obtener de la American Type Culture Collection (ATCC VR538, ATCC VR977 y ATCC VR1590, respectivamente).

HCMV contiene un número desconocido de complejos de proteínas de membrana. De las glucoproteínas conocidas en la envoltura viral, gH y gL han surgido como particularmente interesantes debido a su presencia en varios complejos diferentes: gH/gL dimérica, gH/gL/gO trimérica (también conocida como el complejo gCIII) y gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentamérica (esta última proteína también se refiere como pUL131). Se cree que HCMV usa los complejos pentaméricos para ingresar a las células epiteliales y endoteliales por endocitosis y fusión dependiente de pH bajo, pero se cree que ingresa a los fibroblastos por fusión directa en la membrana plasmática en un proceso que implica gH/gL o posiblemente gH/gL/gO. El o los complejos gH/gL y/o gH/gL/gO son suficientes para la infección de fibroblastos, en tanto que el complejo pentamérico se requiere para infectar células endoteliales y epiteliales (Ryckman, BJ, et al.,Characterization of the Human Cytomegalovirus gH/gL/UL128-131 Complex That Mediates Entry into Epithelial and Endothelial Cells,2008 J. Virol. 82: 60-70).

El complejo pentamérico se considera un objetivo importante para la vacunación contra CMV. Los genes virales UL128, UL130 y UL131 son necesarios para entrada endotelial (Hahnet al., Human Cytomegalovirus UL131-128 Genes are Indispensable for Virus Growth in Endothelial Cells and Virus Transfer of Leukocytes,2004 Journal of Virology 78(18): 10023-10033). Las cepas trópicas no endoteliales adaptadas a fibroblastos contienen mutaciones en al menos uno de estos tres genes. La cepa Towne, por ejemplo, contiene una inserción de dos pares de bases que provoca un desplazamiento de marco en el gen UL130, en tanto que AD169 contiene una inserción de un par de bases en el gen UL131. Tanto Towne como AD169 se pueden adaptar para el crecimiento en células endoteliales y en ambos casos, se repararon las mutaciones de desplazamimento de marco en los genes UL130 o UL131.

Geniniet al. (Serum antibody response to the gH/gL/pUL128-131 fve-protein complex of human cytomegalovirus (HCMV) in primary and reactivated HCMVinfections,2011 J. Clin. Vir. 52: 113-118.) divulgan una respuesta de anticuerpos en suero al complejo pentamérico de HCMV en infecciones por HCMV primarias y reactivadas. La respuesta se determinó tanto por inmunofluorescencia indirecta (IFA) como por ELISA, usando células epiteliales fijas o lisadas (ARPE-19) infectadas con uno o más vectores adenovirales, cada uno con un gen de HCMV y en paralelo, con un vector de adenovirus de control. La especificidad de los resultados se determinó por la reactividad de anticuerpos monoclonales neutralizantes humanos que reconocen dos, tres o cuatro proteínas del complejo. En 14 casos de infección primaria, una seroconversión de anticuerpo IgG al producto génico UL128-131 se detectó consistentemente dentro de 2-4 semanas después del inicio de la infección, en tanto que los anticuerpos persistieron durante al menos 12 meses. La respuesta de anticuerpos IgG a los productos génicos UL128-131 fue en general superior a la respuesta a gH y pareció seguir a la respuesta de anticuerpos neutralizantes (como se determinó en células epiteliales). En las infecciones reactivadas, la respuesta de anticuerpos mostró una tendencia que recuerda a una respuesta de refuerzo. Se detectaron anticuerpos IgG en controles adultos sanos seropositivos para HCMV, pero no en individuos seronegativos para HCMV.

Kinzleret al. (Expression and reconstitution of the gH/gL/gO complex of human cytomegalovirus,2002 J. Clin. Vir.

25(Supp.2): 87-95) coexpresaron gH, gL y gO en células de insecto usando un baculovirus recombinante, pero no fueron capaces de producir el complejo tripartito gH/gL/gO. En cambio, solo se detectaron heterodímeros gH/gL, heteromultímeros gH/gL y homomultímeros gO. En contraste, la coexpresión de gH, gL y gO en células de mamífero produjo complejos de alto peso molecular que se asemejan mucho a los complejos gH/gL/gO formados en células infectadas con HCMV. La inmunofluorescencia de superficie celular mostró que estos complejos se expresan y se muestran en la superficie de células transfectadas.

La patente de Estados Unidos Núm. 7,704,510 divulga que pUL131A se requiere para el tropismo de células epiteliales; que pUL128 y pUL130 forman un complejo con gH/gL, que se incorpora en viriones, y que este complejo se requiere para infectar células endoteliales y epiteliales pero no fibroblastos. También, se encontró que los anticuerpos anti-CD46 inhiben la infección por Hc Mv de células epiteliales.

WO 2014/005959 (también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016-0159864) divulga un complejo pentamérico de HCMV purificado que comprende los polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A y su uso en una composición inmunogénica o una vacuna.

WO 2015/181142 divulga un polipéptido gL modificado que favorece la formación del complejo pentamérico (gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A) sobre la formación del complejo dimérico (gH/gL), y un complejo pentamérico que comprende el polipéptido gL modificado.

WO 2016/116904 divulga un polipéptido gL modificado que reduce su escisión por proteasa, y un complejo pentamérico que comprende el polipéptido gL modificado.

Saitoet al. (Cavity-Filling Mutations Enhance Protein Stability by Lowering the Free Energy of Native State,2000 J. Phys. Chem B Vol. 104 (15):3705-3711) reporta que la disminución en el tamaño de cavidad en una proteína incrementa la estabilidad de proteína al disminuir la energía libre de su estado nativo.

Daveyet al. (Prediction of Stable Globular Proteins Using Negative Design with Non-Native Backbone Eensembles, 2015Structure Vol. 23(11):2011 -2021) se refieren al desarrollo de un enfoque de diseño de proteínas computacional negativo para predecir la estabilidad de proteínas.

La base de datos NCBI No. de acceso AKI20832,1 divulga una secuencia de aminoácidos de un polipéptido gH.

La base de datos NCBI No. de acceso Q38M14 divulga una secuencia de aminoácidos de un polipéptido pUL131A.

En general, existe una relación inversa entre la flexibilidad de una proteína de un organismo mesófilo y la termoestabilidad de esa proteína, como se demostró recientemente para la enzima lipasa A del organismo mesófiloBacillus subtilis(ver Rathi et al.,Structural rigidity and protein thermostability in variants of Lipase A from Bacillus subtilis,2015 PLOS ONE 19(7): e0130289; DOI: 10.1371/journal.pone.0130289; 24 pages). La estabilidad incrementada de los antígenos se ha relacionado previamente con una inmunogenicidad mejorada tal como, por ejemplo, para la conformación de prefusión de la proteína de fusión de virus respiratorio sincitial (McLellanet al., Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus,2013 Science 342(6158): 592-598.) y la proteína de unión a factor H deNeisseria meningitidis(fHbp) (Rossiet al., Meningococcal Factor H Binding Protein Vaccine Antigens with Increased Thermal Stability and Decreased Binding of Human Factor H,2016 Infect. Immun. 84(6): 1735-1742.).

Se espera que una termoestabilidad mejorada de un complejo de HCMV tal como el complejo de pentámero tenga las siguientes ventajas:(i) facilitar su preparación y producción, y (ii) tener un impacto en su uso como antígeno, proporcionando una mejor inmunogenicidad. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un complejo de HCMV, específicamente un complejo pentamérico, que tenga una termoestabilidad mejorada para uso adecuado en una composición inmunogénica o una vacuna. Además, se cree que un glucano en proximidad cercana a un epítopo neutralizante en un complejo de HCMV limita la accesibilidad del epítopo. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un complejo de HCMV desglucosilado, específicamente un complejo pentamérico, que tenga epítopos más accesibles (opcionalmente que también tenga una termoestabilidad mejorada) que sea adecuado para uso en una composición inmunogénica o vacuna.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la expresión recombinante de un complejo de pentámero de HCMV estabilizado (complejo gH/gL/UL128/UL130/pUL131A), en donde al menos uno de los polipéptidos es mutante, y su uso en una composición inmunogénica o composición de vacuna. Se pro porcionan métodos para elaborarlos y usarlos.

En un aspecto de la invención, se proporciona un complejo de pentámero de HCMV modificado como se define en las reivindicaciones 1 y 2.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición inmunogénica como se define en la reivindicación 3.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 4.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector de expresión como se define en la reivindicación 5.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una célula hospedadora como se define en la reivindicación 6.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para elaborar un complejo de HCMV modificado como se define en la reivindicación 7.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona la composición inmunogénica de la invención para usarse en la inducción de una respuesta inmunitaria contra citomegalovirus (CMV).

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el complejo de la invención para usarse en la inhibición de la entrada de CMV en la célula.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La figura 1 representa la estructura cristalina del complejo pentamérico de HCMV (pentámero) que comprende gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A (las posiciones de cada uno se muestran por etiquetas). En particular, la figura 1 proporciona dos vistas giradas 180° de una representación de boceto de pentámero. Los enlaces de disulfuro y oligomanosa Asn-enlazada modelada se representan como barras negras.

Figura 2: La figura 2A representa el complejo pentamérico de HCMV que comprende gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A. Se recuadran cinco interfases y se proporcionan subpaneles ampliados para mostrar los detalles de las interacciones con los residuos clave. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas. Las interfases UL130-UL131A, UL128-UL130-UL131A, gL-UL130, gL-UL128 y gH-gL se representan dentro de la figura 2A con representaciones agrandadas de cada una de aquellas interfases mostradas en las figuras 2B-2F, respectivamente. La figura 2B proporciona una vista agrandada del subpanel de la interfase UL130-UL131A de la figura 2A. La figura 2B muestra las hélices a2 y a3 de pUL130, así como los residuos L69, Y113 y N118 de pUL130. La colocación de las hélices a3 de pUL130 se muestra con una flecha. La figura 2B también muestra la hélice a3 de los residuos D66, H69 y L71 de pUL131A y pUL131A. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas. La figura 2C proporciona una vista agrandada del subpanel de la interfase UL128-UL130-UL131A de la figura 2A. La figura 2C muestra las láminas p1, p4, p5 y p6 de las hélices a l y a2 de pUL128, así como los residuos D45, K92 y L103 de pUL128. La figura 2c muestra las láminas p5, p4 y p6 de pUL130 (las posiciones de cada una se muestran con una flecha). La figura 2C también muestra el residuo H209 de pUL130. La figura 2C muestra las hélices a1, a2 y a3 de pUL131A, así como el residuo H35 de pUL131A. Las posiciones de las hélices a l y a2 de pUL131A se muestran con una flecha. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas. La figura 2D proporciona una vista agrandada del subpanel de la interfase gL-UL130 de la figura 2A. La figura 2D muestra las láminas p1 y p2 de gL, así como los residuos L82, Y152, R160, Y162 y R166 de gL. La figura 2D también muestra la hélice a l y la lámina p3 de pUL130, así como los residuos Y56, P58, F59, L60, Y61, p62, P64, P65, R66 y L99 de pUL130. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas. La figura 2E proporciona una vista agrandada del subpanel de la interfase gL-UL128 de la figura 2A. La figura 2E muestra las hélices a4, a3 ya2y las láminas p2 y p1 de gL, así como los residuos L101, L106, L122, V137 y D157 de gL. La figura 2E también muestra la hélice a3 de pUL128, así como los residuos R142, L146, L150, L159, V161 y C162 de pUL128. La figura 2E también muestra el residuo Q97 de pUL130. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas. La figura 2F proporciona una vista agrandada del subpanel de la interfase gH-gL de la figura 2A. La figura 2F muestra las láminas p1, p3, p4 y p5 de gH, así como la hélice a l de gH (la colocación de cada una se muestra con una flecha). La figura 2<f>también muestra el residuo C95 de gH. La figura 2F muestra las láminas p5, p4 y p3 de gL (la colocación de cada una se muestra con una flecha), así como las hélices a l y a6 de gL. La figura 2F también muestra los residuos C47 y C54 de gL. Los disulfuros se muestran como barras negras y los contactos polares se muestran como líneas negras discontinuas.

Figura 3: Las FIGURAS 3A-3C representan la flexibilidad conformacional del complejo de pentámero de HCMV (pentámero). La figura 3A muestra vistas lateral y superior de la superposición basada en gH de la resolución de 4.0 A y 3.0 Á de Fab de pentámero-8I21. La figura 3B muestra una vista lateral de la superposición entre el Fab de pentámero-916 y los complejos Fab de pentámero-8I21 de resolución de 3.0 A. La región en caja se muestra, después de una rotación de 45°, en el subpanel para resaltar la posición del ligador de hélice gH que se cree que actúa como una bisagra para el movimiento de brazo rígido de los UL. La figura 3C muestra la superposición basada en pUL130/pUL131A de los complejos Fab de pentámero-916 y pentámero-8I21 de resolución de 3.0 A.

Figura 4: La figura 4A representa cavidades dentro del complejo pentamérico y ubicaciones en las cuales se pueden hacer mutaciones de estabilización de la presente invención. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas y las ubicaciones de mutación estabilizadora se muestran por puntos (los puntos de la figura 4A representan solo la ubicación, es decir, no hay una relación 1:1 entre el número de puntos en la figura 4A y el número de mutaciones estabilizadoras de esta invención). La figura 4A también identifica la interfase UL y la interfase gH-gL-UL con cajas. La figura 4B proporciona una vista agrandada de la interfase gH-gL-UL de la figura 4A. La figura 4B representa cavidades dentro de la interfase gH-gL-UL. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 4C proporciona una vista agrandada de la interfase UL de la figura 4A. La figura 4C representa cavidades dentro de la interfase UL. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas.

Figura 5: La figura 5A representa el llenado de cavidad dentro de un complejo de pentámero de HCMV debido a la presencia de una mutación estabilizadora. Se muestran cinco mutaciones de relleno de cavidad, cada una dentro de una de las subproteínas de complejo de pentámero pUL128, pUL130, pUL131A, gL y gH. Se proporciona un subpanel para cada una de las cinco mutaciones de relleno de cavidad. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 5B proporciona una vista agrandada del subpanel de mutación de relleno de cavidad UL128 G123W de la figura 5A. La ubicación de la cadena lateral G123W y su presencia dentro de una cavidad se muestra con una flecha. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 5C proporciona una vista agrandada del subpanel de mutación de relleno de cavidad UL130 D165W de la figura 5A. La ubicación de la cadena lateral D165W y su presencia dentro de una cavidad se muestra con una flecha. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 5D proporciona una vista agrandada del subpanel de mutación de relleno de cavidad UL131 G99W de la figura 5A. La ubicación de la cadena lateral G99W y su presencia dentro de una cavidad se muestra con una flecha. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 5E proporciona una vista agrandada del subpanel de mutación de relleno de cavidad gL H177W de la figura 5A. La ubicación de la cadena lateral H177W y su presencia dentro de una cavidad se muestra con una flecha. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas. La figura 5F proporciona una vista agrandada del subpanel de mutación de relleno de cavidad gH A102W de la figura 5A. La ubicación de la cadena lateral A102W y su presencia dentro de una cavidad se muestra con una flecha. Las cavidades se muestran por formas irregulares rellenas con líneas.

Figura 6: La figura 6A representa mutaciones de puente de disulfuro dentro de un complejo de pentámero de HCMV. Se muestran dieciséis mutaciones de puente disulfuro y los ocho enlaces/puentes disulfuro resultantes (residuos de cisteína reticulados) y se numeran (1)-(8). Los enlaces de disulfuro se representan por barras. El subpanel superior de la figura 6A muestra enlaces de disulfuro (1), (2), (3), (4), (7) y (8). El subpanel inferior de la figura 6B muestra enlaces de disulfuro (5) y (6). La figura 6B proporciona una vista agrandada del subpanel superior de la figura 6A. Los enlaces de disulfuro se representan por barras. (1) muestra el enlace intradisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro pUL130 G116C y pUL130 H150C. (2) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro gL G161C y pUL130 P64C. (3) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro pUL130 S178C y pUL131A H64C. (4) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro gL D163C y pUL130 P62C. (7) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro pUL128 R142C y pUL130 E95C. (8) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro gL R166C y pUL130 P62C. La figura 6C proporciona una vista agrandada del subpanel inferior de la figura 6A. Los enlaces de disulfuro se representan por barras. (5) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro gHV109C y gL G224C. (6) muestra el enlace interdisulfuro resultante de las mutaciones de puente de disulfuro gH L111C y gL G218C.

La figura 7 representa las ubicaciones de los cinco epítopos neutralizantes no superpuestos en el pentámero (sitios 1, 2, 3, 4 y 5) con óvalos. La etiqueta en el sitio 4 se muestra como “4/6” para indicar la superposición del sitio 4 sobre el sitio 6 y la etiqueta en el sitio 3 se muestra como “3/7” para indicar la superposición del sitio 3 sobre el sitio 7. La figura 7 representa además los once glucanos en la superficie de pentámero. La ubicación general de cada glucano se designa con un rectángulo. En particular, la cara de la molécula de pentámero como se muestra a la izquierda de la figura 7 identifica diez glucanos (seis glucanos en gH, uno en gL y cuatro en los UL). La otra cara de la molécula de pentámero, que se muestra a la derecha de la figura 7, identifica el un (undécimo) glucano en pUL130 que se ubica adyacente al sitio 2. Los otros glucanos mostrados a la derecha de la figura 7 también se muestran a la izquierda de la figura 7. Dentro de aquellos rectángulos hay esferas que indican átomos de carbono, que indican átomos de nitrógeno, que indican átomos de oxígeno y que indican átomos de hidrógeno.

Descripción detallada

En la presente se revela la estructura cristalina del complejo pentamérico de HCMV elaborado de los polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A en combinación con un fragmento de unión a antígeno (Fab) de anticuerpos monoclonales (mAb). Los inventores analizaron la estructura cristalina y caracterizaron (i) la presencia de pequeñas interfases entre algunos de los dominios del complejo, (ii) la presencia de varias cavidades en las interfases de dominio, y (iii) una flexibilidad o dinámica intrínseca del complejo. Los inventores también caracterizan y describen en la presente modificaciones de polipéptidos (es decir, modificaciones de polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL130 y/o pUL131A) que mejoran la termoestabilidad del complejo pentamérico. En particular, los inventores describen aminoácidos específicos en cada uno de los polipéptidos del complejo pentamérico de HCMV que, cuando se modifican como se describe en la presente, mejoran la termoestabilidad de un complejo que los comprende. Sin desear que se limite por teoría, se cree que una modificación de aminoácido descrita en la presente invención mejora la termoestabilidad de complejo al disminuir la flexibilidad conformacional del complejo. Se cree que esto se presenta debido a que, por ejemplo, (A) un aminoácido mutante (el aminoácido resultante de una mutación estabilizadora descrita en la presente) tiene cadenas laterales más largas que el aminoácido original (el aminoácido que está presente de forma innata dentro de la secuencia de proteína no mutante a la que se hace referencia) y los átomos de las cadenas laterales del aminoácido modificado llenan cavidades enterradas entre interfases de dominio y/o cavidades de núcleo de proteína. De esta manera, la característica estructural de un aminoácido mutante que tiene cadenas laterales largas afecta el llenado de cavidades enterradas entre las interfases de dominio y/o las cavidades de núcleo de proteína y da por resultado una estabilidad de complejo mejorada. Estas mutaciones se pueden referir en la presente como “mutaciones de relleno de cavidad” con el aminoácido mutante resultante referido como un “mutante de relleno de cavidad”. Se cree además que las modificaciones de aminoácidos mejoran la termoestabilidad de complejo al (B) “reempaquetar” el complejo mediante el incremento de los contactos de residuos vecinos y/o el reemplazo de cúmulos desfavorables de residuos cargados dentro de una proteína o entre proteínas. Estas mutaciones se pueden referir en la presente como “mutaciones de reempaquetamiento”, con el aminoácido resultante que se refiere como un “mutante de reempaquetamiento”. Las mutaciones de reempaquetamiento específicas se pueden referir en la presente como “mutaciones hidrófobas” o “mutaciones hidrófilas”, con el aminoácido mutante resultante que se refiere como un “mutante hidrófobo” o “mutante hidrófilo”, respectivamente. De esta manera, la característica estructural de un aminoácido mutante de referencia que es hidrófobo o hidrófilo produce un incremento en los contactos con sus residuos vecinos y/o produce la reducción de cúmulos desfavorables de residuos cargados y da por resultado estabilidad de complejo mejorada. Además, se cree que las modificaciones de aminoácidos mejoran la termoestabilidad de complejo al (C) introducir puentes de disulfuro en todo el complejo. Se cree que esto se presenta debido a que los puentes de disulfuro recién introducidos bloquean (restringen) los polipéptidos y por lo tanto, reducen su dinámica. De esta manera, la característica estructural de un aminoácido mutante que es una cisteína o de otra manera un residuo estructuralmente capaz de formar puentes de disulfuro efectúa la introducción de un puente de disulfuro y da por resultado estabilidad de complejo mejorada. Estas mutaciones se pueden referir en la presente como “mutaciones de puente de disulfuro” con el aminoácido resultante que se refiere como una “mutación de puente de disulfuro”. De esta manera, la presente invención proporciona proteínas de complejo pentamérico de HCMV modificado (gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A) dentro de un complejo pentamérico de HCMV (en donde el uno o más aminoácidos mutantes dan por resultado al menos uno de A-C y por lo tanto, una termoestabilidad de complejo mejorada. A partir de haber analizado la estructura cristalina de complejo de pentámero de HCMV y sus epítopos neutralizantes, los inventores han seleccionado glucanos adicionales que están en proximidad cercana a un epítopo neutralizante y que también se espera que limiten la accesibilidad de sus epítopos de pentámero de HCMV respectivos. Por lo tanto, los inventores esperan que al introducir una o más de las mutaciones de desglucosilación en un complejo pentamérico de HCMV, el o los epítopos correspondientes serán más accesibles en comparación con los de un no mutante. En particular, se cree que remover uno o más de los glucanos identificados “desenmascarará” el epítopo correspondiente e incrementará la antigenicidad. Los inventores proponen específicamente la sustitución de un residuo de asparagina identificado por cualquier aminoácido no de asparagina (por ejemplo, glutamina) usando técnicas conocidas para prevenir la glucosilación N-enlazada en esa ubicación y de esta manera desenmascarar el epítopo correspondiente. De esta manera, la presente invención proporciona proteínas de complejo pentamérico de HCMV modificado (gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A) dentro de un complejo pentamérico de HCMV, en donde el uno o más aminoácidos mutantes dan por resultado desglucosilación. Esta desglucosilación puede desenmascarar un epítopo, haciendo que el epítopo sea más accesible a por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo neutralizante.

Los polipéptidos usados en el complejo de pentámero de HCMV modificado de la invención son mutantes y por lo tanto tienen una estructura distinta en comparación con un polipéptido no mutante (por ejemplo, tipo silvestre o control). De manera similar, por lo tanto, el complejo de pentámero de HCMV modificado de la invención tiene una estructura distinta en comparación con un complejo no mutante (por ejemplo, complejo tipo silvestre o de control) debido a que un complejo de la invención comprende al menos un polipéptido de HCMV gH, gL, UL128, UL130 y pUL131A mutante. Además, el complejo de la invención puede tener una función distinta en comparación con un complejo no mutante (por ejemplo, tipo silvestre o de control) en el que el complejo de la invención tiene una termoestabilidad incrementada en comparación con un complejo no mutante.

Por lo tanto, un objeto de la invención es usar polipéptidos de HCMV gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A, como se define en la presente, para formar un complejo pentamérico que tiene una termoestabilidad mejorada y/o epítopos más accesibles. Aunque la presente invención es aplicable a polipéptidos que se originan a partir de cualquier cepa de HCMV, a fin de facilitar su comprensión, cuando se hace referencia a las posiciones de aminoácidos en la presente especificación, la numeración se da en relación con la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos que se originan a partir de la cepa Merlin, a menos que se señale de otro modo. En particular, las posiciones de aminoácido de gH se dan con respecto a la secuencia de gH Merlin SEQ ID NO: 1; las posiciones de aminoácido de gL se dan con respecto a la secuencia de gL Merlin SEQ ID NO: 7; las posiciones de aminoácidos de pUL128 se dan con respecto a la secuencia 13 de pUL128 Merlin; las posiciones de aminoácidos de pUL130 se dan con respecto a la secuencia de pUL130 Merlin SEQ ID NO: 17; las posiciones de aminoácido de pUL131A se dan con respecto a la secuencia de pUL131A Merlin SEQ ID NO: 21; y las posiciones de aminoácido de gO se dan con respecto a la secuencia de gO Merlin SEQ ID NO: 25 a menos que se señale de otro modo. Sin embargo, la descripción de la presente invención no se limita a la cepa Merlin. Usando las enseñanzas de la invención, las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido de cualquier otra cepa de HCMV se pueden determinar fácilmente por aquellos expertos en la técnica al alinear las secuencias de aminoácidos usando algoritmos de alineación y fácilmente disponibles (tal como BLAST, usando configuraciones predeterminadas, ClustalW2, usando configuraciones predeterminadas, o algoritmo divulgado por Corpet(Múltiple Sequence Alignment with Hierarchical Clustering,1998 Nucleic Acids Research 16(22): 10881-10890), usando parámetros predeterminados). Por consiguiente, cuando se hace referencia a un “polipéptido de HCMV”, se va a entender como un polipéptido de HCMV de cualquier cepa (además de la cepa Merlin). El número real de las posiciones de residuos de aminoácidos puede tener que ajustarse para polipéptidos de otras cepas dependiendo de la alineación de secuencia real.

Una ubicación dentro de una secuencia, posición dentro de una secuencia, residuo o aminoácido “que corresponde al residuo ## de SEQ ID NO: ###” o “que corresponde al residuo ## de SEQ ID NO: ###” o “con respecto al residuo ## de SEQ ID NO: ###” o “en la posición que corresponde a “X” de SEQ ID NO: ###” o “en la ubicación que corresponde a la ubicación del residuo ## de SEQ ID NO: ###” o “numerado con respecto al residuo ## de SEQ ID NO: ###” son frases de ejemplo usadas en el sentido de la presente invención para claridad, particularmente dentro de las reivindicaciones, para proporcionar un medio por el cual se identifica una posición particular dentro de una secuencia de aminoácidos. Además, estas frases se usan para abarcar, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que codifican para un polipéptido que tiene la misma función o una función similar que la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: ### pero que tienen una estructura dispar (es decir, el polipéptido abarcado tiene la misma o similar función que la proteína de referencia, pero el polipéptido abarcado y la proteína de referencia tienen diferentes secuencias de aminoácidos). A modo de ejemplo, un polipéptido que comprende una mutación en “el residuo de aminoácido que corresponde a P45 de la secuencia de pUL131A s Eq ID NO: 21” abarcaría al menos un polipéptido que tiene una mutación en P45 de la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 21 (cepa Merlin), un polipéptido que tiene una mutación en P45 de la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 23 (cepa Towne) y una mutación en P49 de la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 24 (cepa AD169) (todas las cuales se subrayan en la siguiente alineación de secuencias múltiples de SEQ ID NO: 21, 23 y 24; los residuos de secuencia señal también se subra an .

Por “complejo pentamérico”, se quiere decir en el sentido de la presente invención un complejo de HCMV que comprende cinco polipéptidos de HCMV diferentes: gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A. Aunque en general se refiere pentámero gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A (o complejo pentamérico que comprende gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A) en la especificación, cada uno de los 5 polipéptidos no necesita ser un polipéptido de longitud completa. El término “complejo pentamérico” también abarca pentámeros formados por fragmentos que forman complejos de polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A.

“Fragmento formador de complejo” de un polipéptido de HCMV se usa en la presente para referirse a cualquier parte o porción del polipéptido que retiene la capacidad de formar un complejo pentamérico con otros polipéptidos de HCMV del complejo. Como se usa en la presente, un “fragmento formador de complejo” de un polipéptido mutante comprende uno o más residuos de aminoácidos mutantes (es decir, el fragmento de una proteína mutante comprende la o las mutaciones). La capacidad para formar un complejo pentamérico de la invención se puede probar al realizar purificación de proteínas y al analizar las proteínas por PAGE no reductor, transferencia Western y/o cromatografía de exclusión por tamaño. Si las proteínas forman parte de un complejo, todas pueden estar presentes en una banda individual en un gel de PAGE nativo y/o estar presentes en un pico individual en un cromatograma de exclusión por tamaño.

“Termo-estabilidad mejorada” o “termoestabilidad mejorada” o “termoestabilidad más alta” o “termoestabilidad incrementada” o simplemente “estabilidad mejorada” o “estabilidad más alta” o “estabilidad incrementada” se usa en la presente para referirse a un complejo (por ejemplo, el complejo pentamérico) que tiene al menos una tasa de despliegue más baja, bajo las mismas condiciones, que el mismo complejo que no comprende ninguna mutación estabilizadora (dicho de otra manera, el complejo se despliega más lentamente que un complejo no mutante bajo las mismas condiciones). “Condiciones”, como se usa en la presente, incluye, por ejemplo, condiciones experimentales y fisiológicas. Se puede especificar que una composición que comprende un complejo estabilizado de la presente invención tiene una vida útil incrementada en comparación con una composición que comprende un complejo no mutante. Ver, por ejemplo, publicación de Estados Unidos Núm. 2011/0229507 A1 Clappet al., Vaccines with Aluminum-Containing Adjuvants: Optimizing Vaccine Efficacy and Thermal Stability,2011 J. Pharm. Sci. 100(2): 388-401, que analiza la estabilidad incrementada mediante adyuvantes y valora la estabilidad de antígeno en condiciones alteradas de pH, hidratación y temperatura; y Rossiet al.,2016 Infect. Immun. 84(6): 1735-1742. La estabilidad en la presente se puede proporcionar por el método de puntuación de estabilidad delta (dStability o dS), que es la diferencia determinada computacionalmente entre la termoestabilidad relativa de una proteína mutante in-silico y la de la proteína tipo silvestre o no mutante correspondiente. Los métodos para determinar dStability se proporcionan en el ejemplo 3 e incluyen, por ejemplo, herramientas conocidas tal como software Molecular Operating Environment (MOE) (REF: Software Molecular Operating Environment (MOE); Chemical Computing Group Inc., disponible en WorldWideWeb(www).chemcomp.com). dS se mide por kcal/mol. Los valores de dS más bajos indican una estabilidad de proteína más alta, los valores de dS inversamente más altos indican una estabilidad de proteína más baja. Se puede especificar que los polipéptidos mutantes usados en la presente invención tienen una termoestabilidad relativa más alta (en kcal/mol) en comparación con un polipéptido no mutante bajo las mismas condiciones experimentales. Se puede especificar además que los polipéptidos mutantes usados en la presente invención tienen un valor dS más bajo que un polipéptido no mutante bajo las mismas condiciones experimentales. Se entenderá a partir de la descripción de la presente invención que un polipéptido mutante que tiene un valor dS más bajo en comparación con un polipéptido no mutante bajo las mismas condiciones experimentales es más estable que el polipéptido no mutante. La mejora de estabilidad se puede valorar usando calorimetría diferencial de barrido (d Sc ), por ejemplo como se analiza en Bruylantset al. (Differential Scanning Calorimetry in Life Sciences: Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design,2005 Curr. Med. Chem. 12: 2011- 2020) y Calorimetry Sciences Corporation's “Characterizing Protein stability by DSC” (Life Sciences Application Note, Doc. No. 20211021306, febrero de 2006) o por fluorimetría diferencial de escaneo (DSF). Un incremento en la estabilidad se puede caracterizar como un incremento de al menos aproximadamente 2 °C en el punto medio de transición térmica (Tm), como se valora por DSC o DSF. Ver, por ejemplo, Thomaset al., Effect of single-point mutations on the stability and immunogenicity of a recombinant ricin A chain subunit vaccine antigen,2013 Hum. Vaccin. Immunother. 9(4): 744-752. Un incremento “significativo” en, o mejora de, termoestabilidad se define como un incremento de al menos aproximadamente 5 °C en la Tm calculada de un complejo (calculada por, por ejemplo, el protocolo proporcionado en el ejemplo 4.7).

“Mutación” se usa en la presente para referirse a una sustitución de un residuo de aminoácido con otro residuo de aminoácido. Con respecto a la secuencia de ácido nucleico, esta sustitución se efectúa mediante una mutación sin sentido dentro del codón correspondiente de la región codificadora (el polipéptido mutante codificado por una secuencia de ácido nucleico mutante se puede referir como una “muteína”). El término “mutación”, como se usa en la presente, también incluye modificaciones que introducen un aminoácido que no se presenta de manera natural o un análogo de aminoácido en un polipéptido. Una “mutación” como se usa en la presentenoincluye una “mutación idéntica”, que es la sustitución de un residuo de aminoácido con un aminoácido natural o producido sintéticamente que tiene la misma estructura química. A modo de ejemplo, la sustitución de alanina en la posición 102 de la secuencia SEQ ID NO: 1 con una alanina (A102A) es una “mutación idéntica” como se usa en la presente yno estádentro del significado de “mutación” en el sentido de la presente invención. Por lo tanto, las mutaciones de la presente invención se pueden aclarar con la condición de que se excluya una mutación idéntica.

“Mutaciones estabilizadoras” o “mutante estabilizador” se usa en la presente para referirse a cualquier mutación en los polipéptidos de HCMV que resulta, tras la formación del complejo pentamérico, en un complejo que tiene una termoestabilidad mejorada, en comparación con un complejo pentamérico formado con los polipéptidos de HCMV que no contienen esta mutación. Las mutaciones estabilizadoras como se usan en la presente abarcan, en particular, mutaciones de relleno de cavidad, mutaciones de reempaquetamiento (que incluyen mutaciones hidrófobas y mutaciones hidrófilas) y mutaciones de puente de disulfuro. Una mutación estabilizadora como se usa en la presente no es perjudicial para el uso de la proteína mutada como un antígeno. En particular, la mutación estabilizadora no prohíbe todos los epítopos que pueden provocar la producción de anticuerpos que pueden unirse a al menos un complejo de HCMV como se describe en la presente y/o anticuerpos que pueden neutralizar los efectos biológicos del complejo de HCMV. Además, una mutación estabilizadora de la presente invención no evita que los polipéptidos mutantes formen un complejo. “Complejo estabilizado” se usa en la presente para referirse a un complejo (por ejemplo, un complejo pentamérico) que comprende al menos un polipéptido que comprende al menos una mutación estabilizadora.

Los términos “aminoácido”, “residuo” y “residuo de aminoácido”, como se usan en la presente, se refieren a un compuesto químico orgánico que contiene al menos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Para claridad, sin embargo, y en particular dentro de las reivindicaciones, el aminoácido presente en una posición particular dentro de una secuencia tipo silvestre o no mutante (por ejemplo, el aminoácido tipo silvestre) se puede referir como un “aminoácido” en tanto que el compuesto presente en esa posición correspondiente dentro de la secuencia mutante (el aminoácido mutante) se puede referir como un “residuo” (es decir, el aminoácido que resulta de una mutación sin sentido se puede referir como un “residuo”).

“No mutante” se usa en la presente para referirse a una molécula (por ejemplo, una secuencia, polipéptido o complejo) que no comprende una mutación estabilizadora o mutación de desglucosilación. De esta manera, el término “no mutante” abarca la estructura “tipo silvestre”, pero también abarca, por ejemplo, un polipéptido tipo silvestre truncado. Por ejemplo, un polipéptido de HCMV gH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 es un polipéptido “no mutante” al menos debido a que está truncado y por lo tanto no tiene estructura de HCMV gH “tipo silvestre”. Además, por ejemplo, un polipéptido de HCMV gL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29 es un polipéptido “no mutante”. Para ser claros, “no mutante” se usa en la presente como una referencia a la estructura y no como una referencia a la función. Un polipéptido no mutante, por ejemplo, se puede describir como que tiene función tipo silvestre (tal como el polipéptido de HCMV gH que comprende SEQ ID NO: 3).

“Mutación de relleno de cavidad” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un primer aminoácido (por ejemplo, un aminoácido tipo silvestre) con un segundo aminoácido en donde el segundo aminoácido tiene una cadena lateral más larga que el primer aminoácido. Dicho de otra manera, una mutación de relleno de cavidad en la presente es la sustitución de un aminoácido con un residuo en donde el residuo tiene una cadena lateral más larga que el aminoácido. Estos residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral larga incluyen: triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

“Mutaciones de reempaquetamiento” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un primer residuo de aminoácido (por ejemplo, un aminoácido tipo silvestre) con un segundo residuo de aminoácido que incrementa la interacción de residuos vecinos en un polipéptido. Las mutaciones de reempaquetamiento incluyen sustituciones de aminoácidos que, por ejemplo, (1) mejoran las interacciones hidrófobas (por ejemplo, a través de aminoácidos hidrófobos) o formación de enlaces de hidrógeno (por ejemplo, a través de aminoácidos polares o cargados (es decir, hidrófilos)), o (2) reducen las interacciones desfavorables o repulsivas de residuos vecinos (por ejemplo, al eliminar cúmulos de residuos cargados de manera similar). Una mutación de reempaquetamiento en el sentido de la presente invención abarca, en particular, mutaciones hidrófobas y mutaciones hidrófilas.

“Mutación hidrófoba” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un primer residuo de aminoácido (por ejemplo, un aminoácido tipo silvestre) con un segundo residuo de aminoácido en donde el segundo aminoácido tiene una cadena lateral hidrófoba. Estos residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrófoba incluyen: triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). La tirosina (Y) también se puede clasificar como hidrófoba.

“Mutación hidrófila” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un primer residuo (por ejemplo, un residuo de aminoácido tipo silvestre) con un segundo aminoácido en donde el segundo aminoácido tiene una cadena lateral hidrófila. “Cadena lateral hidrófila” abarca tanto una sustitución a un aminoácido que tiene una cadena lateral polar como una sustitución a un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada. Se entiende en general en la técnica que las cadenas laterales de aminoácidos polares son hidrófilas pero no están cargadas y las cadenas laterales de aminoácidos cargadas son hidrófilas y están cargadas. Por “mutación polar”, se quiere decir en el sentido de la presente invención la sustitución de un primer residuo de aminoácido (por ejemplo, un aminoácido tipo silvestre) con un segundo residuo de aminoácido en donde el segundo aminoácido tiene una cadena lateral polar. Los residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral polar incluyen: serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N) y glutamina (Q). Por “mutación cargada”, se quiere decir en el sentido de la presente invención la sustitución de un primer residuo de aminoácido (por ejemplo, un aminoácido tipo silvestre) con un segundo residuo de aminoácido en donde el segundo aminoácido tiene una cadena lateral cargada. Los residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral cargada incluyen: arginina (R), ácido glutámico (E), lisina (K), histidina (H) y ácido aspártico (D).

“Mutaciones de puente disulfuro” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un residuo de aminoácido con un residuo de cisteína (C), para formar puentes de disulfuro dentro de un polipéptido o entre polipéptidos. Los puentes disulfuro se forman entre dos residuos y son un “puente intradisulfuro” (formado entre dos residuos dentro del mismo polipéptido) o un “puente interdisulfuro” (formado entre dos residuos, el primer residuo que está dentro de un primer polipéptido y el segundo residuo que está dentro de un segundo polipéptido). Por lo tanto, para incrementar la estabilidad de un complejo de proteínas usando solo mutaciones de puente de disulfuro, las mutaciones de puente de disulfuro se deben introducir en el complejo en pares (múltiplos de 2) en donde cada uno del al menos un par de mutaciones de puente de disulfuro está dentro de una o más de las subproteínas complejas. Se puede especificar que el complejo comprende 2n mutaciones de puente de disulfuro en donde “n” es cualquier número entero positivo que incluye cero. Se puede especificar además que el complejo comprende dos, cuatro, seis, ocho, diez, doce, catorce, dieciséis, dieciocho, veinte, veintidós, veinticuatro, veintiséis, veintiocho, treinta, treinta y dos, treinta y cuatro, treinta y seis, treinta y ocho, cuarenta, cuarenta y dos, cuarenta y cuatro, cuarenta y seis o un múltiplo mayor de 2, mutaciones de puente de disulfuro. Por ejemplo, la presente invención puede abarcar un complejo pentamérico estabilizado que consiste en un par de mutaciones de puente de disulfuro en donde la primera mutación de puente de disulfuro está en el residuo que corresponde a G116C de pUL130 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17 y la segunda mutación de puente de disulfuro está en el residuo que corresponde a H150C de pUL130 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17 (ver tabla 21 más adelante). Además, por ejemplo, la presente invención puede abarcar un complejo pentamérico estabilizado que consiste en un par de mutaciones de puente de disulfuro en donde la primera mutación de puente de disulfuro está en el residuo que corresponde a D163C de gL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 7 y la segunda mutación de puente de disulfuro está en el residuo que corresponde a P62C de pUL130 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17 (ver tabla 21 más adelante). Además, por ejemplo, la presente invención puede incluir un complejo pentamérico estabilizado que consiste en dos pares de mutaciones de puente de disulfuro en donde el primer par de mutaciones de puente de disulfuro consiste en una primera mutación de puente de disulfuro en el residuo que corresponde a D163C de gL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 7 y una segunda mutación de puente de disulfuro en el residuo que corresponde a P62C de pUL130 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 17 y en donde el segundo par de mutaciones de puente de disulfuro consiste en una tercera mutación de puente de disulfuro en el residuo que corresponde a V109C de gH que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 y una cuarta mutación de puente de disulfuro en el residuo que corresponde a G224C de gL que tiene la secuencia SEQ ID NO: 7 (ver tabla 21 más adelante). Para un complejo estabilizado de la presente invención que comprende, por ejemplo, una mutación de reempaquetamiento y una mutación de puente de disulfuro, un experto en la técnica reconocerá que no es necesario especificar un par de mutaciones de puente de disulfuro debido a que la mutación de reempaquetamiento sola puede ser suficiente para efectuar estabilidad incrementada.

“Mutaciones de desglucosilación” se usa en la presente para referirse a la sustitución de un aminoácido de asparagina (por ejemplo, un aminoácido de asparagina tipo silvestre) con un segundo aminoácido que de este modo evita la adición de un glucano a un átomo de nitrógeno de asparagina en esa ubicación de residuo (es decir, evita la glucosilación N-enlazada en esa ubicación). El segundo aminoácido puede ser cualquier residuo no de asparagina. Por lo tanto, se puede especificar que un polipéptido o complejo que comprende una mutación de desglucosilación comprende un residuo de glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) o aspartato (D) donde un polipéptido o complejo no mutante (por ejemplo, tipo silvestre o control), respectivamente, comprende un residuo de asparagina (N). Un polipéptido de HCMV, o fragmento formador de complejo del mismo, o un complejo de HCMV de la presente invención puede comprender una o más mutaciones de desglucosilación o puede comprender unacombinaciónde una o más mutaciones estabilizadoras (es decir, una mutación de relleno de cavidad, reempaquetamiento y/o puente de disulfuro) y una o más mutaciones de desglucosilación.

“Antigenicidad” se usa en la presente para referirse a la capacidad de un antígeno para combinarse con un anticuerpo, por ejemplo, para unirse a un anticuerpo neutralizante. Por lo tanto, un “antigenicidad incrementada” o “antigenicidad mejorada” abarca, por ejemplo, una afinidad de unión incrementada de un anticuerpo neutralizante para el antígeno mutante en comparación con su afinidad de unión para un antígeno no mutante. Se puede proporcionar una afinidad de unión incrementada como un valor de constante de disociación (Kd) disminuido (en nM). Ver en general, por ejemplo, Maet al. Envelope Deglycosylation Enhances Antigenicity of HIV-1 gp41 Epitopesfor Both Broad Neutralizing Antibodies and Their Unmutated Ancestor Antibodies, 2011PLoS Path. 7(9), e1002200.

“Inmunogenicidad” se usa en la presente para referirse a la capacidad de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria. Ver en general, por ejemplo,Ma et al.,2011 PLoS Path. 7(9), e1002200.

Como se usa en la presente divulgación y reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario; es decir, “un” significa “uno o más” a menos que se indique de otro modo.

Los términos “aproximadamente” o “de manera aproximada” significan de manera próxima, alrededor o en las regiones de. Los términos “aproximadamente” o “de manera aproximada” significan además dentro de un intervalo de error contextual aceptable para el valor particular como se determina por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición o el grado de precisión requerido para un propósito particular, por ejemplo, la cantidad de un complejo dentro de los medios. Cuando los términos “aproximadamente” o “de manera aproximada” se usan en conjunto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo al extender los límites por arriba y por debajo de los valores numéricos expuestos. Por ejemplo, “entre aproximadamente 5.5 a 6.5 mg/ml” significa que los límites del intervalo numérico se extienden por debajo de 5.5 y por arriba de 6.5 de tal forma que el valor particular en cuestión logra el mismo resultado funcional que dentro del intervalo. Por ejemplo, “aproximadamente” y “de manera aproximada” pueden significar dentro de desviación estándar de 1 o más de 1, según la práctica en la técnica De manera alternativa, “aproximadamente” y “de manera aproximada” pueden significar un intervalo de hasta 20 %, preferentemente hasta 10 %, más preferentemente hasta 5 % y más preferentemente hasta 1 % de un valor dado.

El término “y/o” como se usa en una frase tal como “A y/o B” se propone que incluya “A y B”, “A o B”, “A” y “B” Del mismo modo, el término “y/o” como se usa en una frase tal como “A, B y/o C” se propone que abarque cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se especifique de otro modo, todas las designaciones “A %-B %”, “A-B %”, “A % a B %”, “A a B %”, “A %-B”, “A % a B” se les da su significado ordinario y habitual. En algunas realizaciones, estas designaciones son sinónimos.

El término “que comprende” abarca “que incluye”, así como “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y. Los términos “que comprende” y “que tiene”, cuando se usan como una frase de transición en la presente, son abiertos, en tanto que el término “que consiste en”, cuando se usa como una frase de transición en la presente, es cerrado (es decir, limitado a lo que se lista y nada más).

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” se puede omitir de la definición de la invención.

Una “cantidad efectiva”, tal como en “una cantidad terapéuticamente efectiva de un antígeno y/o adyuvante”, significa una cantidad suficiente para provocar el efecto o resultado referenciado. Una “cantidad efectiva” se puede determinar empíricamente y de manera rutinaria usando técnicas conocidas en relación con el propósito señalado.

A menos que se señale específicamente, un proceso que comprende un paso para mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezcla. Por lo tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces dos componentes se pueden combinar entre sí, y entonces la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc. De manera similar, en tanto que los pasos de un método se pueden numerar (tal como (1), (2), (3), etc. o (i), (ii), (iii)), la numeración de los pasos no significa que los pasos se deben realizar en ese orden (es decir, el paso 1 entonces paso 2 entonces paso 3, etc.). La palabra “entonces” se puede usar para especificar el orden de los pasos de un método.

“Recombinante”, como se usa en la presente para describir un polinucleótido, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, ARN (incluido ARNm) semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no se asocia con la totalidad o una porción del polinucleótido con el cual se asocia en la naturaleza; y/o (2) se enlaza a un polinucleótido diferente de aquel al cual se enlaza en la naturaleza. El término “recombinante” como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. Cuando una molécula de ácido nucleico se enlaza de manera operativa a otro polinucleótido con el que no se asocia en la naturaleza, la molécula de ácido nucleico se puede referir como “heteróloga” (es decir, la molécula de ácido nucleico es heteróloga a al menos el polinucleótido). De manera similar, cuando un polipéptido está en contacto con o en un complejo con otra proteína con la que no está asociado en la naturaleza, el polipéptido se puede referir como “heterólogo” (es decir, el polipéptido es heterólogo a la proteína). Además, cuando una célula hospedadora comprende una molécula de ácido nucleico o polipéptido que no comprende de manera natural, la molécula de ácido nucleico y el polipéptido se pueden referir como “heterólogos” (es decir, la molécula de ácido nucleico es heteróloga a la célula hospedadora y el polipéptido es heterólogo a la célula hospedadora).

La identidad de secuencia entre secuencias de polipéptidos se determina preferentemente por algoritmo de alineación por pares usando el algoritmo de alineación global Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, AGeneral Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins,1970 J. Mol. Biol. 48(3): 443-453), usando parámetros predeterminados (por ejemplo, con penalización de apertura de separación = 10.0, y con penalización de extensión de separación = 0.5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramientaneedleen el paquete EMBOSS (Riceet al., EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,2000 Trends Genetics 16: 276-277). La identidad de secuencia se debe calcular en toda la longitud de la secuencia de polipéptido.

Polipéptido gH

La glucoproteína H (gH) de HCMV, que se codifica por el gen UL75, es una glucoproteína de virión que es esencial para la infectividad y que se conserva entre los miembros de los alfa-, beta- y gammaherpesvirus.

Se ha reportado la gH de la cepa Merlin de HCMV (NCBI GI:52139248 (que también es NCBI GenBank acceso No. YP_081523.1), SEQ ID n O: 1) consiste en 742 aminoácidos. La gH de la cepa Towne de HCMV (NCBI GI: 138314 que también es NCBI UniProtKB acceso No. P17176.1; SEQ ID NO: 5) también consiste en 742 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). La gH de la cepa AD169 de HCMV se publica como NCBI UniProtKB Acceso No. P12824.1 (en la presente s Eq ID NO: 6). Se ha reportado que gH de HCMV tiene seis sitios de N-glucosilación (en los residuos 55, 62, 67, 192, 641 y 700), y consiste en una secuencia señal hidrófoba en su extremo N-terminal (residuos de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 1), un ectodominio (residuos 24-717 de SEQ ID NO: 1) que sobresale de la célula hacia el espacio extracelular, un dominio TM hidrófobo (residuos 718-736 de SEQ ID NO: 1) y un dominio citoplasmático C-terminal (residuos 737-742 de SEQ ID NO: 1).

El ectodominio de gH corresponde a la porción de gH que carece de TM hidrófoba. La ubicación y longitud del ectodominio se puede predecir con base en la alineación por pares de una secuencia dada a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, al alinear la secuencia de aminoácidos de un polipéptido gH de interés a SEQ ID NO: 1 y al identificar la secuencia que se alinea a los residuos 24-717 de SEQ ID NO: 1. De manera similar, las ubicaciones de los dominios TM y C-terminal se pueden predecir al alinear la secuencia de aminoácidos de un polipéptido gH de interés a SEQ ID NO: 1 y al identificar las secuencias que se alinean a los residuos 718-736 y 737-742 de SEQ ID NO: 1, respectivamente. De manera alternativa, la ubicación y longitud del ectodominio, la secuencia señal y el dominio TM se puede predecir con base en el análisis computacional de la hidrofobicidad a lo largo de la longitud de una secuencia de proteína gH dada. La secuencia señal y el dominio TM tienen los niveles más altos de hidrofobicidad y estas dos regiones flanquean el ectodominio, que es menos hidrófobo. La ausencia de un dominio TM significa que el polipéptido modificado no puede residir dentro de una bicapa lipídica. El polipéptido gH puede carecer del dominio TM natural de longitud completa; de manera alternativa, puede retener una porción del dominio TM natural, pero no lo suficiente para permitir que la proteína resida en una bicapa lipídica. Por lo tanto, el polipéptido puede contener hasta 10 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) del dominio TM de gH natural.

Habitualmente, la secuencia señal N-terminal de polipéptidos gH se escinde por una peptidasa señal de célula hospedadora para producir proteínas gH maduras. El polipéptido gH de HCMV del complejo de HCMV modificado de la invención puede carecer de una secuencia señal N-terminal. Un ejemplo de polipéptido gH de HCMV que carece de la secuencia N-terminal es SEQ SEQ ID NO: 2. Este polipéptido gH de HCMV que carece de la secuencia N-terminal puede carecer además del dominio transmembrana (Tm ) y el dominio C-terminal. La expresión de la secuencia génica UL75 de longitud completa dificulta la purificación de complejos solubles que comprenden gH. En cambio, los complejos que comprenden gH se pueden purificar a alto rendimiento y pureza al omitir al menos una porción del dominio TM de gH. Por ejemplo, las construcciones que codifican solo para la secuencia señal N-terminal y el ectodominio de gH (o una mayoría del ectodominio gH), pero no el dominio TM se puede usar para expresar una forma de gH que se purifica fácilmente (ver, por ejemplo, WO 2014/005959, también publicado como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016-0159864). Estas construcciones pueden codificar para la mayoría (por ejemplo, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) del ectodominio de gH, pero ninguno o solo una pequeña porción del dominio TM. Los polipéptidos gH del complejo de HCMV modificado de la invención pueden incluir la totalidad del ectodominio de gH o una forma truncada del ectodominio de gH (tal como el polipéptido gH que consiste en SEQ ID NO: 3 o 4 que no comprenden los residuos 716 o 717 del ectodominio de SEQ ID NO: 1 y tampoco comprenden los dominios TM o C-terminal). Estas formas truncadas del ectodominio pueden carecer de entre 1 y 20 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos de aminoácidos) en sus extremos N-terminal y/o C-terminal con respecto a una proteína gH de HCMV de longitud completa. De manera alternativa, los polipéptidos gH de HCMV del complejo de HCMV modificado de la presente invención pueden carecer de la secuencia señal N-terminal, el dominio T<m>y el dominio C-terminal. Un ejemplo de un polipéptido de gH de HCMV adecuado para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención es SEQ ID NO: 3, que tiene un ectodominio truncado, carece del dominio transmembrana (TM) y carece del dominio citoplasmático C-terminal de la secuencia de gH SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3 consiste en los residuos de aminoácidos 1-715 de SEQ ID NO: 1. Un ejemplo alternativo de una proteína gH adecuada para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención es SEQ ID NO: 4, que carece de la secuencia señal N-terminal, tiene un ectodominio truncado, carece del dominio TM y carece del dominio C-terminal de la secuencia de gH SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 4 consiste en los residuos de aminoácidos 24-715 de SEQ ID NO: 1.

Como se muestra en los ejemplos, los polipéptidos gH se glucosilan (comprenden glucanos mediante glucosilación N-enlazada) en seis residuos de asparagina: N55, N62, N67, N192, N641 y N700 numerados con respecto a la secuencia de aminoácidos de gH SEQ ID NO: 1. Un polipéptido gH de HCMV adecuado para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención, o fragmento formador de complejo del mismo, puede comprender una mutación de desglucosilación en una o más de las asparaginas ubicadas en los residuos 55, 62, 67, 192, 641 y 700 numerados con respecto a SEQ ID NO: 1. La mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) o aspartato (D). En particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T) o alanina (A). Además, en particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q).

Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden contener residuos de aminoácidos adicionales, tal como extensiones N-terminales o C-terminales. Estas extensiones pueden incluir una o más etiquetas, que pueden facilitar la detección (por ejemplo, una etiqueta de epítopo para la detección mediante anticuerpos monoclonales) y/o purificación (por ejemplo, una etiqueta de polihistidina para permitir la purificación en una resina quelante de níquel) de la proteína gH. Por ejemplo, las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender un ectodominio gH truncado fusionado a una extensión C-terminal (ver, por ejemplo, WO 2014/005959, también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016-0159864).

Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 1, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 1. Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 2, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 2. Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 3, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 3. Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 4, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 4. Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 5, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 5. Las proteínas gH adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 6, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 6. Proteínas gH adecuadas o fragmentos de las mismas: (i) pueden dimerizarse con gL de HCMV; (ii) formar parte del complejo gH/gL/gO trimérico; (iii) formar parte del complejo gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentamérico; (iv) comprender al menos un epítopo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y/o (v) pueden provocar anticuerposin vivoque reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de HCMV. Un fragmento formador de complejo de ejemplo de gH puede comprender los residuos Arg1 a Leu125 de SEQ ID NO: 2 que, cuando están en complejo con gL de longitud completa (tal vez usando el extremo C-terminal flexible de gL como ligador), pUL128 de longitud completa, pUL130 de longitud completa y pUL131A de longitud completa; pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7.

Los polipéptidos gH de HCMV, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender una o más mutaciones estabilizadoras, adecuadamente, una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de lo mismo. Cualquiera de los polipéptidos gH que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o cualquier polipéptido gH que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 pueden comprender adecuadamente cualquiera de una o más mutaciones estabilizadoras como se identifican y definen en la presente. Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gH de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gH de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gH de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención.

Como se detalla adicionalmente en el ejemplo 3 y se ilustra en las figuras 2A-2F, los presentes inventores identificaron, en la estructura cristalina del complejo pentamérico, algunas cavidades en la interfase gH/gL/UL. Por lo tanto, se espera que cualquier mutación de relleno de cavidad, cuyo propósito sea llenar las cavidades observadas en la interfase en el polipéptido gH de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de reempaquetamiento, tal como cualquier mutación hidrófoba, o cualquier mutación hidrófila, cuyo propósito sea incrementar el contacto de los residuos vecinos en el polipéptido gH de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de puente de disulfuro, cuyo propósito sea introducir puentes intradisulfuro en el polipéptido gH de HCMV y/o puentes interdisulfuro entre el polipéptido gH de HCMV y cualquiera de los otros componentes del complejo (por ejemplo, polipéptido gL de HCMV, pUL128 de HCMV, pUL130 de HCMV o pUL131A de HCMV del complejo pentamérico de HCMV), contribuya de manera ventajosa a que el complejo tenga una termoestabilidad mejorada.

La identificación de residuos de aminoácidos relevantes, en el polipéptido gH de HCMV, para mutar para relleno de cavidades y/o reempaquetamiento y/o puentes de disulfuro se puede realizar, por ejemplo, tanto por inspección visual de la estructura tridimensional con la ayuda de software de gráficos moleculares, o al usar cualquier método de mutagénesisin-silicoapropiado. Por ejemplo, software, tal como Molecular Operating Environment (MOE) (editado por Chemical Computing Group Inc.) permite un análisis sistemático de secuencias de aminoácidos para identificar regiones específicas en el polipéptido o aminoácidos específicos, mutación de lo cual se predice para mejorar la termoestabilidad.

Los residuos de aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV se proporcionan en la tabla 1, usando la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 1 solo como referencia. Mutaciones en posiciones similares en otros polipéptidos gH de HCMV, tal como, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o polipéptidos gH que se originan a partir de cepas de HCMV diferentes de la cepa Merlin, también se pueden contemplar. Está dentro de las capacidades de la persona experta determinar estas posiciones similares en otros polipéptidos gH de HCMV. Las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido de HCMV dado se pueden determinar al alinear las secuencias de aminoácidos usando alineación y algoritmos fácilmente disponibles y conocidos (tal como BLAST o ClustalW2). El número real de la posición de aminoácidos puede tener que ajustarse para otros polipéptidos gH de HCMV dependiendo de la alineación de secuencia real.

Tabla 1A

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para rellenar cavidades son A102, A372, A352 o L257 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 102, 372, 352 y 257 de s Eq ID NO: 1 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para mutaciones hidrófobas son H252, K404, R255, E355, H480, s 601 o R405, de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácidos en las posiciones 252, 404, 255, 355, 480, 601 y 405 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para mutaciones hidrófilas son G358 o H275 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R) y ácido glutámico (E). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a G358 y H275 de SEQ ID NO: 1 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R) y ácido glutámico (E). Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para mutaciones polares son G358 o H275 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N) y glutamina (Q). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a G358 y H275 de SEQ ID NO: 1 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N) y glutamina (Q). Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para mutaciones cargadas son G358 o H275 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con el residuo de aminoácido arginina (R) o ácido glutámico (E). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a G358 y H275 de SEQ ID NO: 1 con el aminoácido arginina (R) o ácido glutámico (E).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para mutaciones de puente de disulfuro son V109 o L111 de la secuencia expuesta en SEQ<i>D NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. Por consiguiente, los polipéptidos de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución del residuo que corresponde a V109 de SEQ ID NO: 1 con una cisteína (C) o del residuo que corresponde a L111 de SEQ ID NO: 1 con una cisteína (C), adecuadamente, ambas.

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos gH de HCMV para desglucosilación son N55, N62, N67, N192, N641 y N700 de la secuencia expuesta en<s>E<q>ID NO: 1, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 55, 62, 67, 192, 641 y 700 de SEQ ID NO: 1 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D).

Tabla 1B________________________________________________________________________________________ Los polipéptidos gH de HCMV modificados pueden comprender, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, uno o más de:___________________________________________________________________________A102W, A102F, A102Y, A102L, A372W, A372F, A372Y, A372L, A352W, A352F, A352Y, A352L, L257W, L257F, L257Y, L257L,

H252W, H252F, H252M, H252C, H252A, H252L, H252I, H252V, H252P, H252Y, K404W, K404F, K404M, K404C, K404A, K404L, K404I, K404V, K404P, K404Y, R255W, R255F, R255M, R255C, R255A, R255L, R255I, R255V, R255P, R255Y, E355W, E355F, E355M, E355C, E355A, E355L, E355I, E355V, E355P, E355Y, H480W, H480F, H480M, H480C, H480A, H480L, H480I, H480V, H480P, H480Y, S601W, S601F, S601M, S601C, S601A, S601L, S601I, S601V, S601P, S601Y, R405W, R405F, R405M, R405C, R405A, R405L, R405I, R405V, R405P, R405Y,

G358S, G358T, G358C, G358Y, G358N, G358Q, G358R, G358E, G358K, G358H, G358D, H275S, H275T, H275C, H275Y, H275N, H275Q, H275R, H275E, H275K, H275H, H275D,

V109C, L111C,

N55Q, N55S, N55T, N55A, N55E, N55D, N62Q, N62S, N62T, N62A, N62E, N62D, N67Q, N67S, N67T, N67A, N67E, N67D, N192Q, N192S, N192T, N192A, N192E, N192D, N641Q, N641S, N641T, N641A, N641E, N641D, N700Q, N700S, N700T, N700A, N700E y N700D.______________________________________________

Polipéptido gL

Se cree que la glucoproteína L (gL) de HCMV, que se codifica por el gen UL115, es esencial para la replicación viral. Todas las propiedades funcionales conocidas de gL están directamente asociadas con su dimerización con gH. El complejo gL/gH se requiere para la fusión de las membranas viral y plasmática que conduce a la entrada de virus en la célula hospedadora. gL de la cepa Merlin de HCMV (NCBI GI:39842115 (que también es NCBI GenBank acceso No. AAR31659.1), SEQ ID NO: 7) y la cepa Towne de HCMV (NCBI GI:239909463 que también es NCBI GenBank acceso No.<a>C<s>32410.1; S<e>Q ID<n>O: 11 en la presente) se ha reportado que tiene 278 aminoácidos de longitud. gL de la cepa AD169 de HCMV (NCBI GI: 2506510 que también es NCBI UniProtKB acceso No. P16832.2; SEQ ID NO: 12 en la presente) se ha reportado que tiene 278 aminoácidos de longitud, incluye una secuencia señal en su extremo N-terminal (residuos de aminoácidos 1-35), tiene dos sitios de N-glucosilación (en los residuos 74 y 114) y carece de un dominio TM (Rigoutsoset al., In silico patternbased analysis of the human cytomegalovirus genome,2003 J. of Virology 77: 4326-44). La secuenciación del gen gL de longitud completa de 22 a 39 productos aislados clínicos, así como cepas AD169, Towne y Toledo de laboratorio, reveló menos de 2 % de variación en las secuencias de aminoácidos entre los productos aislados (Rasmussenet al., The Genes Codifying the gCIII Complex of Human Cytomegalovirus Exist in Highly Diverse Combinations in Clinical Isolates,2002 J. of Virology 76: 10841-10888). Habitualmente, la secuencia señal N-terminal de proteínas gL se escinde por una peptidasa señal de célula hospedadora para producir polipéptidos gL maduros. Los polipéptidos gL para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden carecer de una secuencia señal N-terminal. Un ejemplo de polipéptido gL de HCMV que carece de la secuencia N-terminal es SEQ SEQ ID NO: 8, que consiste en los residuos de aminoácidos 31-278 de SEQ ID NO: 7. Un ejemplo de un polipéptido gL adecuado para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención puede ser SEQ ID NO: 9 o 10, que comprenden una mutación LSG en lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa, en donde la mutación reduce la escisión de proteasa. Un ejemplo alternativo de un polipéptido gL adecuado para usarse en la invención de complejo de HCMV modificado puede ser SEQ ID NO: 29 o 30, que comprenden una mutación IDG en lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa, en donde la mutación reduce la escisión de proteasa.

Como se muestra en los ejemplos, los polipéptidos gL se glucosilan (comprenden glucanos mediante glucosilación N-enlazada) en un residuo de asparagina,<n>74 numerado con respecto a la secuencia de aminoácidos de gL SEQ ID NO: 7. Un polipéptido gL de HCMV, o fragmento formador de complejo del mismo, para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención puede comprender una mutación de desglucosilación en el residuo 74 numerado con respecto a la secuencia de gL SEQ ID NO: 7. La mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) o aspartato (D). En particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T) o alanina (A). En una realización, la mutación de desglucosilación es glutamina (Q).

Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 7, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 7. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 8, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 8. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 9, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 9. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 10, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 10. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 11, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 11. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 12, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 12. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 29, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 29. Las proteínas gL adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 30, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 30. Proteínas gL adecuadas o fragmentos de las mismas: (i) pueden dimerizarse con gH de HCMV; (ii) formar parte del complejo gH/gL/gO trimérico; (iii) formar parte del complejo gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentamérico; (iv) comprender al menos un epítopo de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 29 o 30 y/o (v) pueden provocar anticuerposin vivoque reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de HCMV. Un fragmento formador de complejos de ejemplo de gL puede comprender los residuos Thr76 a Tyrl69 de SEQ ID NO: 7 que, cuando están en complejo con pUL128 de longitud completa, pUL130 de longitud completa y pUL131A de longitud completa (es decir, gH no está presente); pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7.

Los polipéptidos gL de HCMV, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender una o más mutaciones estabilizadoras, adecuadamente, una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de lo mismo. Cualquiera de los polipéptidos gL que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30, o cualquier polipéptido gL que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID<n>O: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30, o fragmentos formadores de complejos de los mismos, pueden comprender adecuadamente cualquiera de una o más mutaciones estabilizadoras como se identifican y definen en la presente. Por consiguiente, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 8, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 10, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 29, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos gL de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 30, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención.

Como se detalla adicionalmente en el ejemplo 3 y se ilustra en las figuras 2A-2F, los presentes inventores identificaron, en la estructura cristalina del complejo pentamérico, algunas cavidades en la interfase gH/gL/UL. Por lo tanto, se espera que cualquier mutación de relleno de cavidad, cuyo propósito sea llenar las cavidades observadas en la interfase en el polipéptido gL de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de reempaquetamiento, tal como cualquier mutación hidrófoba, o cualquier mutación hidrófila, cuyo propósito sea incrementar el contacto de los residuos vecinos en el polipéptido gL de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de puente de disulfuro, cuyo propósito sea introducir puentes intradisulfuro en el polipéptido gL de HCMV y/o puentes interdisulfuro entre el polipéptido gL de HCMV y cualquier otro componente del complejo (por ejemplo, polipéptido gH de HCMV, pUL128 de HCMV, pUL130 de HCMV o pUL131A de HCMV del complejo pentamérico de HCMV), contribuya de manera ventajosa a que el complejo tenga una termoestabilidad mejorada.

La identificación de residuos de aminoácidos relevantes, en el polipéptido gL de HCMV, para mutar para relleno de cavidades y/o reempaquetamiento y/o puentes de disulfuro se puede realizar, por ejemplo, tanto por inspección visual de la estructura tridimensional con la ayuda de software de gráficos moleculares, o al usar cualquier método de mutagénesisin-silicoapropiado. Por ejemplo, software, tal como Molecular Operating Environment (MOE) (editado por Chemical Computing Group Inc.) permite un análisis sistemático de secuencias de aminoácidos para identificar regiones específicas en el polipéptido o aminoácidos específicos, mutación de lo cual se predice para mejorar la termoestabilidad.

Los residuos de aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gL de HCMV se proporcionan en la tabla 2, usando la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 7 solo como referencia. Mutaciones en posiciones similares en otros polipéptidos gL de HCMV, tal como, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID No : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID No : 29 o SEQ ID NO: 30, o polipéptidos gL que se originan a partir de cepas de HCMV diferentes de la cepa Merlin, también se pueden contemplar. Está dentro de las capacidades de la persona experta determinar estas posiciones similares en otros polipéptidos gL de HCMV. Las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido gL de HCMV dado se pueden determinar al alinear las secuencias de aminoácidos usando alineación y algoritmos fácilmente disponibles y conocidos (tal como BLAST o ClustalW2). El número real de la posición de aminoácidos puede tener que ajustarse para otros polipéptidos gL de HCMV dependiendo de la alineación de secuencia real.

Por consiguiente, un aminoácido que se puede mutar en polipéptidos gL de HCMV para desglucosilación es N74 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, o en una posición correspondiente en polipéptidos gL de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de este residuo de aminoácido puede consistir en sustituirlo con un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D). Por consiguiente, los polipéptidos gL de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición que corresponde a 74 de SEQ ID NO: 7 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D).

Tabla 2A

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos gL de HCMV para rellenar cavidades son H177, G224, G140. G145, D146, G218, L119, C233 o P272 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, o en una posición correspondiente en polipéptidos gL de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L). Por consiguiente, los polipéptidos gL de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 177, 224, 140, 145, 146, 218, 119, 233 y 272 de SEQ ID NO: 7 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gL de HCMV para mutaciones hidrófobas son H267, H236, H245, G161 o C233, de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, o en una posición correspondiente en polipéptidos gL de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). Por consiguiente, los polipéptidos gL de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 267, 236, 245, 161 y 233 de SEQ ID NO: 7 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos gL de HCMV para mutaciones de puente de disulfuro son G161, D163,<g>224,<g>218, R166, G140, R160 o A150, de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 7, o en una posición correspondiente en polipéptidos gL de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. Por consiguiente, los polipéptidos gL de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: G161C, D163C, G224C, G218C, R166C, G140C, R160C, A150C y combinaciones de lo mismo.

Tabla 2B________________________________________________________________________________________ Los polipéptidos gL de HCMV modificados pueden comprender, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 7, uno o más de:________________________________________________________________________________H177W, H177F, H177Y, H177L, G224W, G224F, G224Y, G224L, G140W, G140F, G140Y, G140L, G145W, G145F, G145Y, G145L, D146W, D146F, D146Y, D146L, G218W, G218F, G218Y, G218L, L119W, L119F, L119Y, L119L, C233W, C233F, C233Y, C233L, P272W, P272F, P272Y, P272L,

H267W, H267F, H267M, H267C, H267A, H267L, H267I, H267V, H267P, H267Y, H236W, H236F, H236M, H236C, H236A, H236L, H236I, H236V, H236P, H236Y, H245W, H245F, H245M, H245C, H245A, H245L, H245I, H245V, H245P, H245Y, G161W, G161F, G161M, G161C, G161A, G161L, G161I, G161V, G161P, G161Y, C233W, C233F, C233M, C233C, C233A, C233L, C233I, C233V, C233P, C233Y, G161C, D163C, G224C, G218C, R166C, G140C, R160C, A150C,

________ N74Q, N74S, N74T, N74A, N74E y N74D.___________________________________________________

Polipéptido pUL128

Se ha reportado pUL128 (o simplemente “UL128”) de la cepa Merlin de HCMV (NCBI GI: 39842124 (que también es NCBI GenBank acceso No. AAR31668.1), SEQ ID NO: 13) consiste en 130 aminoácidos y contiene una sustitución de un (1) nucleótido que provoca la terminación prematura. La pUL128 de la cepas Towne de HCMV (NCBI GI:39841882 (que también es NCBI GenBank acceso No. AAR31451.1), SEQ ID NO: 15) y AD169 (NCBI GI:59803078 (que también es NCBI UniProtKB acceso No. P16837.2), SEQ ID NO: 16) se ha reportado que consiste en 171 aminoácidos. Debido a la terminación prematura de SEQ ID NO: 13, 15 y 17 solo comparten 75 % de identidad sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 13. Se predice que pUL128 tiene una secuencia de señal N-terminal, que se ubica en los residuos 1-27 de SEQ ID NO: 13, pero se predice que carece de un dominio TM. Habitualmente, la secuencia señal N-terminal de polipéptidos pUL128 se escinde por una peptidasa señal de célula hospedadora para producir polipéptidos pUL128 maduros. Los polipéptidos pUL128 para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden carecer de una secuencia señal N-terminal. Un ejemplo de polipéptido pUL128 de HCMV que carece de la secuencia N-terminal es SEQ SEQ ID NO: 14, que consiste en los residuos de aminoácidos 28-130 de SEQ ID NO: 13.

Las proteínas pUL128 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 13, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 13. Las proteínas pUL128 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a<s>E<q>ID NO: 14, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 14. Las proteínas pUL128 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 15, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 15. Las proteínas pUL128 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 16, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 16. Proteínas pUL128 adecuadas o fragmentos de las mismas: (i) pueden formar parte del complejo gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentamérico, (ii) comprender al menos un epítopo de SEQ ID NO: 13, 14, 15 o 16 y/o (iii) pueden provocar anticuerposin vivoque reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de HCMV.

Los polipéptidos pUL128 de HCMV, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender una o más mutaciones estabilizadoras, adecuadamente, una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de lo mismo. Cualquiera de los polipéptidos pUL128 que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o<s>E<q>ID N<o>: 16, o cualquier polipéptido pUL128 que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, o fragmentos formadores de complejos de los mismos, pueden comprender adecuadamente cualquiera de una o más mutaciones estabilizadoras como se identifican y definen en la presente. Por consiguiente, los polipéptidos pUL128 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 13, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL128 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 14, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL128 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado. De manera alternativa, los polipéptidos pUL128 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 16, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención.

Como se detalla adicionalmente en el ejemplo 3 y se ilustra en las figuras 2A-2F, los presentes inventores identificaron, en la estructura cristalina del complejo pentamérico, algunas cavidades en la interfase gH/gL/UL. Por lo tanto, se espera que cualquier mutación de relleno de cavidad, cuyo propósito sea llenar las cavidades observadas en la interfase en el polipéptido pUL128 de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de reempaquetamiento, tal como cualquier mutación hidrófoba, o cualquier mutación hidrófila, cuyo propósito sea incrementar el contacto de los residuos vecinos en el polipéptido pUL128 de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo, que tiene una termoestabilidad mejorada. De manera similar, se espera que cualquier mutación de puente de disulfuro, cuyo propósito sea introducir puentes intradisulfuro en el polipéptido pUL128 de HCMV y/o puentes interdisulfuro entre el polipéptido pUL128 de HCMV y cualquiera de los otros componentes del complejo (por ejemplo, polipéptido gH de HCMV, gL de HCMV, pUL130 de HCMV o pUL131A de HCMV del complejo pentamérico de HCMV), contribuya de manera ventajosa a que el complejo tenga una termoestabilidad mejorada.

La identificación de residuos de aminoácidos relevantes, en el polipéptido pUL128 de HCMV, para mutar para relleno de cavidades y/o reempaquetamiento y/o puentes de disulfuro se puede realizar, por ejemplo, tanto por inspección visual de la estructura tridimensional con la ayuda de software de gráficos moleculares, o al usar cualquier método de mutagénesisin-silicoapropiado. Estos métodos se conocen por la persona experta. Por ejemplo, software, tal como Molecular Operating Environment (MOE) (editado por Chemical Computing Group Inc.) permite un análisis sistemático de secuencias de aminoácidos para identificar regiones específicas en el polipéptido o aminoácidos específicos, mutación de lo cual se predice para mejorar la termoestabilidad.

Los residuos de aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL128 de HCMV se proporcionan en la tabla 3, usando la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 13 solo como referencia. Mutaciones en posiciones similares en otros polipéptidos pUL128 de HCMV, tal como, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia como se expone en Se Q ID NO: 14, o polipéptidos gL que se originan a partir de cepas de HCMV diferentes de la cepa Merlin, tal como SEQ ID NO: 15 o<s>E<q>ID NO: 16, también se pueden contemplar. Está dentro de las capacidades de la persona experta determinar estas posiciones similares en otros polipéptidos pUL128 de HCMV. Las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido pUL128 de HCM<v>dado se pueden determinar al alinear las secuencias de aminoácidos usando alineación y algoritmos fácilmente disponibles y conocidos (tal como BLAST o ClustalW2). El número real de la posición de aminoácidos puede tener que ajustarse para otros polipéptidos pUL128 de HCMV dependiendo de la alineación de secuencia real.

Tabla 3A

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos pUL128 de HCMV para rellenar cavidades son G123, V77, L103 o Q119 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 13, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL128 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L). Por consiguiente, los polipéptidos pUL128 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 123, 77, 103 y 119 de SEQ ID NO: 13 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL128 de HCMV para mutaciones hidrófobas son G145, H90 o G112 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 13, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL128 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). Por consiguiente, los polipéptidos pUL128 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 145, 90 y 112 de SEQ ID NO: 13 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL128 de HCMV para mutaciones de puente de disulfuro son R142, N99, Y98, A124, G126, L159, D45, V88, M48, G107, R51, D106 o S83 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 13, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL128 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. Por consiguiente, los polipéptidos pUL128 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: R142C, N99C, Y98C, A124C, G126C, L159C, D45C, V88C, M48C, G107C, R51C, D106C, S83C y combinaciones de lo mismo.

Tabla 3B_______________________________________________________________________________

Los polipéptidos pUL128 de HCMV modificados pueden comprender, con respecto a la secue

ID NO: 13, uno o más de:_______________________________________________________________

G123W, G123F, G123Y, G123L, V77W, V77F, V77Y, V77L, L103W, L103F, L103Y, L103L

Q119F, Q119Y, Q119L,

G145W, G145F, G145M, G145C, G145A, G145L, G145I, G145V, G145P, G145Y, H90W, H9

H90C, H90A, H90L, H90I, H90V, H90P, H90Y, G112W, G112F, G112M, G112C, G112A, G112L, G11 G112P, G112Y,

________ R142C, N99C, Y98C, A124C, G126C, L159C, D45C, V88C, M48C, G107C, R51C, D106C y

Polipéptido pUL130

pUL130 (o simplemente “UL130”) es el gen central y el más grande (214 codones) del locus UL131A-128 de HCMV. La secuencia de pUL130 de la cepa Merlin de HCMV está públicamente disponible (NCBI GI: 39842125 (que también es NCBI GenBank acceso No. AAR31669.1) y SEQ Id NO: 17 en la presente. La secuencia de pUL130 de la cepa Towne de HCMV está públicamente disponible (NCBI GI:239909473 (que también es NCBI ACS32420.1) y SEQ ID NO: 19 en la presente). Del mismo modo, la secuencia de pUL130 de la cepa AD169 de HCMV está públicamente disponible (NCBI UniprotKB Acceso No. P16772 y SEQ<i>D NIO: 20 en la presente). Las secuencias de pUL130 Merlin y Towne consisten en 214 y 229 aminoácidos, respectivamente. Secuencia de pUL130 Merlin SEQ ID NO: 17 comprende una secuencia señal N-terminal de 25 aminoácidos de longitud en los residuos 1-25 que precede a una proteína hidrófila que contiene dos posibles sitios de glucosilación N-enlazados (Asn85 y Asn118) dentro de un supuesto dominio de quimiocina (aminoácidos 46 a 120) y un sitio de N-glucosilación adicional (Asn201) cerca del extremo de una región C-terminal única. Se predice que pUL130 carece de un dominio TM.

Habitualmente, la secuencia señal N-terminal de polipéptidos pUL130 se escinde por una peptidasa señal de célula hospedadora para producir proteínas pUL130 maduras. Los polipéptidos pUL130 para usarse en la invención pueden carecer de una secuencia señal N-terminal. Un ejemplo de polipéptido pUL130 de HCMV que carece de la secuencia N-terminal es SEQ SEQ ID NO: 18, que consiste en los residuos de aminoácidos 26-214 de SEQ ID NO: 17.

Como se muestra en los ejemplos, los polipéptidos pUL130 se glucosilan (comprenden glucanos mediante glucosilación N-enlazada) en tres residuos de asparagina: N85, N118 y N201 numerados con respecto a la secuencia de aminoácidos de pUL130 SEQ ID NO: 17. Un polipéptido pUL130 de HCMV, o fragmento formador de complejo del mismo, para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención puede comprender una mutación de desglucosilación en una o más de las asparaginas ubicadas en los residuos 85, 118 y 201 numerados con respecto a la secuencia de pUL130 SEQ ID NO: 17. La mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) o aspartato (D). En particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T) o alanina (A). Además, en particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q).

Las proteínas pUL130 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 17, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 17. Las proteínas pUL130 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 18, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 18. Las proteínas pUL130 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 19, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 19. Las proteínas pUL130 adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 20, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 20. Proteínas pUL130 adecuadas o fragmentos de las mismas: (i) pueden formar un complejo gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentamérico; (ii) comprender al menos un epítopo de SEQ ID NO: 17, 18, 19 o 20; y/o (iii) pueden provocar anticuerposin vivoque reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de HCMV. Un fragmento formador de complejos de ejemplo de pUL130 puede comprender los residuos Thr45 a Val214 de SEQ ID NO: 17 que, cuando están en complejo con pUL131A de longitud completa (es decir, ninguno de gH, gL o pUL128 están presentes); pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7. De manera alternativa, un fragmento formador de complejos de pUL130 puede comprender los residuos Thr45 a Val214 de SEQ ID NO: 17 que, cuando están en complejo con un fragmento formador de complejos de pUL131A que comprende los residuos Gln19 a Asn129 de SEQ ID NO: 21 (es decir, ninguno de gH, gL o pUL128 están presentes); pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7.

Los polipéptidos pUL130 de HCMV, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender una o más mutaciones estabilizadoras, adecuadamente, una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de lo mismo. Cualquiera de los polipéptidos pUL130 que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o<s>E<q>ID N<o>: 20, o cualquier polipéptido pUL130 que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20, o fragmentos formadores de complejos de los mismos, pueden comprender adecuadamente cualquiera de una o más mutaciones estabilizadoras como se identifican y definen en la presente. Por consiguiente, los polipéptidos pUL130 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL130 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 18, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL130 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 19, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL130 de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 20, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención.

Como se detalla adicionalmente en el ejemplo 3 y se ilustra en las figuras 2A-2F, los presentes inventores identificaron, en la estructura cristalina del complejo pentamérico, algunas cavidades en la interfase gH/gL/UL. Por lo tanto, se espera que cualquier mutación de relleno de cavidad, cuyo propósito sea llenar las cavidades observadas en la interfase en el polipéptido pUL130 de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de reempaquetamiento, tal como cualquier mutación hidrófoba, o cualquier mutación hidrófila, cuyo propósito sea incrementar el contacto de los residuos vecinos en el polipéptido pUL130 de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de puente de disulfuro, cuyo propósito sea introducir puentes intradisulfuro en el polipéptido pUL130 de HCMV y/o puentes interdisulfuro entre el polipéptido gH de HCMV y cualquiera de los otros componentes del complejo (por ejemplo, polipéptido gH de HCMV, gL de HCMV, pUL128 de HCMV o pUL131A de HCMV del complejo pentamérico de HCMV), contribuya de manera ventajosa a que el complejo tenga una termoestabilidad mejorada.

La identificación de residuos de aminoácidos relevantes, en el polipéptido pUL130 de HCMV, para mutar para relleno de cavidades y/o reempaquetamiento y/o puentes de disulfuro se puede realizar, por ejemplo, tanto por inspección visual de la estructura tridimensional con la ayuda de software de gráficos moleculares, o al usar cualquier método de mutagénesisin-silicoapropiado. Estos métodos se conocen por la persona experta. Por ejemplo, software, tal como Molecular Operating Environment (MOE) (editado por Chemical Computing Group Inc.) permite un análisis sistemático de secuencias de aminoácidos para identificar regiones específicas en el polipéptido o aminoácidos específicos, mutación de lo cual se predice para mejorar la termoestabilidad.

Los residuos de aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL130 de HCMV se proporcionan en la tabla 4, usando la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 17 solo como referencia. Mutaciones en posiciones similares en otros polipéptidos pUL130 de HCMV, tal como, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, o polipéptidos pUL130 que se originan a partir de cepas de HCMV diferentes de la cepa Merlin, también se pueden contemplar. Está dentro de las capacidades de la persona experta determinar estas posiciones similares en otros polipéptidos pUL130 de HCMV. Las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido pUL130 de HCM<v>dado se pueden determinar al alinear las secuencias de aminoácidos usando alineación y algoritmos fácilmente disponibles y conocidos (tal como BLAST o ClustalW2). El número real de la posición de aminoácidos puede tener que ajustarse para otros polipéptidos pUL130 de HCMV dependiendo de la alineación de secuencia real.

Tabla 4A

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos pUL130 de HCMV para rellenar cavidades son D165 o H209 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL130 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L). Por consiguiente, los polipéptidos pUL130 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 165 y 209 de SEQ ID NO: 17 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL130 de HCMV para mutaciones hidrófobas son G116, G135, H150 o H209 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL130 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). Por consiguiente, los polipéptidos pUL130 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a G116, G135, H150 y H209 de SEQ ID NO: 17 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL130 de HCMV para mutaciones de puente de disulfuro son G116, H150, P64, S178, P62, E95, Y204, N211, I213, Y56 o T167 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL130 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. Por consiguiente, los polipéptidos pUL130 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: G116C, H150C, P64C, S178C, P62C, E95C, Y204C, N21 IC, I213C, Y56C, T167C y combinaciones de lo mismo.

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos pUL130 de HCMV para desglucosilación son N85, N118 y N201 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL130 de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D). Por consiguiente, los polipéptidos pUL130 de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 85, 118 y 201 de SEQ ID NO: 17 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D).

Tabla 4B________________________________________________________________________________________ Los polipéptidos pUL130 de HCMV modificados pueden comprender, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 17, uno o más de:________________________________________________________________________________ D165W, D165F, D165Y, D165L, H209W, H209F, H209Y, H209L,________________________________

Polipéptido pUL131A

Se requiere la función pUL131A para la replicación de HCMV no solo en células endoteliales sino también en células epiteliales. La pUL131A de la cepas Merlin de HCMV (NCBI GI:39842126 (que también es NCBI GenBank acceso No. AAR31670.1), SEQ ID NO: 21) y Towne (NCBI GI:239909474 (que también es NCBI GenBank acceso No. ACS32421.1), SEQ ID NO: 23) y AD169 (NCBI GI:219879712 (que también es NCBI GenBank acceso No. DAA06452.1), s Eq ID NO: 24) se ha reportado que consiste en 129, 129 y 76 aminoácidos, respectivamente. pUL131A contiene una secuencia de señal N-terminal, que se ubica en los residuos 1-18 de SEQ ID NO: 21, y carece de un dominio TM. Se ha reportado que la UL131A de la cepa AD169 contiene una inserción de un (1) par de bases, que provoca un desplazamiento de marco (Wang and Shenk,Human Cytomegalovirus ULI 31 Open Reading Frame Is Required for Epitelial Cell Tropism,2005 J. Virol. 79: 10330-10338). SEQ ID NO: 21 es 96 % idéntica a SEQ ID NO: 24 sobre los 28 aminoácidos N-terminales, pero es solo 36 % idéntica a SEQ ID NO: 24 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 21 debido al desplazamiento de marco en el gen AD169 UL131A.

Habitualmente, la secuencia señal N-terminal de polipéptidos pUL131A se escinde por una peptidasa señal de célula hospedadora para producir proteínas pUL131A maduras. Los polipéptidos pUL131A para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden carecer de una secuencia señal N-terminal. Un ejemplo de polipéptido pUL131A de HCMV que carece de la secuencia N-terminal es SEQ SEQ ID NO: 22, que consiste en los residuos de aminoácidos 19-129 de SEQ ID NO: 21.

Como se muestra en los ejemplos, los polipéptidos pUL131A se glucosilan (comprenden glucanos mediante glucosilación N-enlazada) en el residuo de asparagina N81 numerado con respecto a la secuencia de aminoácidos de gH SEQ ID NO: 21. Un polipéptido pUL131A de HCMV, o fragmento formador de complejo del mismo, para usarse en el complejo de h Cm V modificado de la invención puede comprender una mutación de desglucosilación en la asparagina ubicada en el residuo 81 numerado con respecto a la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 21. La mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) o aspartato (D). En particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q), serina (S), treonina (T) o alanina (A). Además, en particular, la mutación de desglucosilación puede ser glutamina (Q).

Las proteínas pUL131A adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 21, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 21. Las proteínas pUL131A adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 22, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 22. Las proteínas pUL131A adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 23, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 23. Las proteínas pUL131A adecuadas para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 24, tal como al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia mencionada en SEQ ID NO: 24. Proteínas pUL131A adecuadas: (i) pueden formar complejos gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A pentaméricos; (ii) comprender al menos un epítopo de SEQ ID NO: 21, 22, 23 o 24; y/o (iii) pueden provocar anticuerposin vivoque reaccionan inmunológicamente de forma cruzada con un virión de HCMV. Un fragmento formador de complejos de ejemplo de pUL131A puede comprender los residuos Gln19 a Asn129 de SEQ ID NO: 21 que, cuando están en complejo con pUL130 de longitud completa (es decir, ninguno de gH, gL o pUL128 están presentes); pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7. De manera alternativa, un fragmento formador de complejos de pUL131A puede comprender los residuos Gln19 a Asn129 de SEQ ID NO: 21 que, cuando están en complejo con un fragmento formador de complejos de pUL130 que comprende los residuos Thr45 a Val214 de SEQ ID NO: 17 (es decir, ninguno de gH, gL o pUL128 están presentes); pueden formar un complejo de pentámero de HCMV truncado que, sin embargo, mantiene los cinco sitios de epítopo conformacional descritos en la figura 7.

Los polipéptidos pUL131A de HCMV, adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender una o más mutaciones estabilizadoras, adecuadamente, una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de lo mismo. Cualquiera de los polipéptidos pUL131A que tienen la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o S<e>Q ID NO: 24, o cualquier polipéptido pUL131A que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, S<e>Q ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, o fragmentos formadores de complejos de los mismos, pueden comprender adecuadamente cualquiera de una o más mutaciones estabilizadoras como se identifican y definen en la presente. Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL131A de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 22, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, el polipéptido pUL131A de HCMV que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 23, o fragmentos formadores de complejo de lo mismo, y comprende una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos es adecuado para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. De manera alternativa, los polipéptidos pUL131A de HCMV que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 24, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, y que comprenden una o más mutaciones de relleno de cavidad, una o más mutaciones hidrófobas, una o más mutaciones hidrófilas, una o más mutaciones de puente de disulfuro, o cualquier combinación de uno o más de los mismos son adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención.

Como se detalla adicionalmente en el ejemplo 3 y se ilustra en las figuras 2A-2F, los presentes inventores identificaron, en la estructura cristalina del complejo pentamérico, algunas cavidades en la interfase gH/gL/UL. Por lo tanto, se espera que cualquier mutación de relleno de cavidad, cuyo propósito sea llenar las cavidades observadas en la interfase en el polipéptido pUL131A de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de reempaquetamiento, tal como cualquier mutación hidrófoba, o cualquier mutación hidrófila, cuyo propósito sea incrementar el contacto de los residuos vecinos en el polipéptido pUL131A de HCMV, contribuya de manera ventajosa a la estabilidad del complejo, cuando se asocia con los otros componentes del complejo. De manera similar, se espera que cualquier mutación de puente de disulfuro, cuyo propósito sea introducir puentes intradisulfuro en el polipéptido pUL131A de HCMV y/o puentes interdisulfuro entre el polipéptido gH de HCMV y cualquiera de los otros componentes del complejo (por ejemplo, polipéptido gH de HCMV, gL de HCMV, pUL128 de HCMV o pUL130 de Hc MV del complejo pentamérico de HCm V), contribuya de manera ventajosa a que el complejo tenga una termoestabilidad mejorada.

La identificación de residuos de aminoácidos relevantes, en el polipéptido pUL131A de HCMV, para mutar para relleno de cavidades y/o reempaquetamiento y/o puentes de disulfuro se puede realizar, por ejemplo, tanto por inspección visual de la estructura tridimensional con la ayuda de software de gráficos moleculares, o al usar cualquier método de mutagénesisin-silicoapropiado. Estos métodos se conocen por la persona experta. Por ejemplo, software, tal como Molecular Operating Environment (MOE) (editado por Chemical Computing Group Inc.) permite un análisis sistemático de secuencias de aminoácidos para identificar regiones específicas en el polipéptido o aminoácidos específicos, mutación de lo cual se predice para mejorar la termoestabilidad.

Los residuos de aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV se proporcionan en la tabla 5, usando la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 21 solo como referencia. Mutaciones en posiciones similares en otros polipéptidos pUL131A de HCMV, tal como, por ejemplo, polipéptidos que tienen la secuencia como se expone en s Eq ID n O: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ iD NO: 24, o polipéptidos pUL131A que se originan a partir de cepas de HCMV diferentes de la cepa Merlin, también se pueden contemplar. Está dentro de las capacidades de la persona experta determinar estas posiciones similares en otros polipéptidos pUL131A de HCMV. Las posiciones de aminoácidos comparables en un polipéptido pUL131A de HCMV dado se pueden determinar al alinear las secuencias de aminoácidos usando alineación y algoritmos fácilmente disponibles y conocidos (tal como BLAST o ClustalW2). El número real de la posición de aminoácidos puede tener que ajustarse para otros polipéptidos pUL130 de HCMV dependiendo de la alineación de secuencia real.

Tabla 5A________________________________________________________________________________________

Polipéptidos pUL131A de HCMV mutante

_____________(posiciones proporcionadas con respecto a SEQ ID NO: 21)_____________________

Por consiguiente, los aminoácidos que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para rellenar cavidades son G99, S86 o S90 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL131A de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L). Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 99, 86 o 90 de SEQ ID NO: 21 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), tirosina (Y) y leucina (L).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para mutaciones hidrófobas son H69, H35, H64, D38, V85, Y52 o A67, de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos pUL131A de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de estos residuos de aminoácidos puede consistir en sustituir cualquiera de ellos y/o más de uno de ellos, posiblemente todos ellos, con residuos de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P). Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en las posiciones que corresponden a 69, 35, 64, 38, 85, 52 y 67 de SEQ ID NO: 21 con aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en triptófano (W), fenilalanina (F), metionina (M), cisteína (C), alanina (A), leucina (L), isoleucina (I), valina (V) y prolina (P).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para mutaciones hidrófilas es R118 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de este residuo de aminoácido puede consistir en sustituirlo por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R) y ácido glutámico (E). Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición que corresponde a R118 de SEQ ID NO: 21 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R) y ácido glutámico (E). Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para mutaciones polares es R118 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de este residuo de aminoácido puede consistir en sustituirlo por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N) y glutamina (Q). Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición R118 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), treonina (T), cisteína (C), tirosina (Y), asparagina (N) y glutamina (Q). Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para mutaciones cargadas es R118 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de este residuo de aminoácido puede consistir en sustituirlo por arginina (R) o ácido glutámico (E). Por consiguiente, los polipéptidos gH de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición que corresponde a R118 de SEQ ID NO: 21 con el aminoácido arginina (R) o ácido glutámico (E).

Los aminoácidos de ejemplo no limitantes adecuados que se pueden mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para mutaciones de puente de disulfuro son H64 o W37 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. Por consiguiente, los polipéptidos de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución del residuo que corresponde a H64 de SEQ ID NO: 21 con una cisteína (C) o del residuo que corresponde a W37 de SEQ ID NO: 21 con una cisteína (C), adecuadamente, ambas.

Por consiguiente, un aminoácido que se puede mutar en polipéptidos pUL131A de HCMV para desglucosilación es N81 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 21, o en una posición correspondiente en polipéptidos gH de HCMV que se originan de diferentes cepas de HCMV. De manera adecuada, la mutación de este residuo de aminoácido puede consistir en sustituirlo con un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D). Por consiguiente, los polipéptidos pUL131A de HCMV adecuados para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención pueden comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición 81 de SEQ ID NO: 21 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), alanina (A), glutamato (E) y aspartato (D).

Tabla 5B________________________________________________________________________________________ Los polipéptidos pUL131A de HCMV modificados pueden comprender, con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 21, uno o más de:________________________________________________________________________G99W, G99F, G99Y, G99L, S86W, S86F, S86Y, S86L, S90W, S90F, S90Y, S90L,

H69W, H69F, H69M, H69C, H69A, H69L, H69I, H69V, H69P, H69Y, H35W, H35F, H35M, H35C, H35A, H35L, H35I, H35V, H35P, H35Y, H64W, H64F, H64M, H64C, H64A, H64L, H64I, H64V, H64P, H64Y, D38W, D38F, D38M, D38C, D38A, D38L, D38I, D38V, D38P, D38Y, V85W, V85F, V85M, V85C, V85A, V85L, V85I, V85V, V85P, V85Y, Y52W, Y52F, Y52M, Y52C, Y52A, Y52L, Y52I, Y52V, Y52P, Y52Y, A67W, A67F, A67M, A67C, A67A, A67L, A67I, A67V, A67P, A67Y,

R118S, R118T, R118C, R118Y, R118N, R118Q, R118R, R118E, R118K, R118H, R118D,

H64C, W37C,

________ N81Q, N81A, N81T, N81A, N81E y N81D.___________________________________________________

Complejos

En la presente se describe un complejo pentamérico que comprende los polipéptidos de HCMV mutados, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, descritos en la presente. Estos complejos pueden incluir, por ejemplo, (i) cualquiera de los polipéptidos gH de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones estabilizadoras, (ii) cualquiera de los polipéptidos gL de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones estabilizadoras, (iii) cualquiera de los polipéptidos pUL128 de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones estabilizadoras, (iv) cualquiera de los polipéptidos pUL130 de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones estabilizadoras, y (v) cualquiera de los polipéptidos pUL131A de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones estabilizadoras. Estos complejos pueden incluir además, por ejemplo, (vi) cualquiera de las mutaciones de desglucosilación gH, gL, pUL130 y pUL131A de HCMV anteriores.

En la presente se describe un complejo pentamérico que comprende los polipéptidos de HCMV mutados, o fragmentos formadores de complejo de los mismos, descritos en la presente. Estos complejos incluyen, por ejemplo, (i) cualquiera de los polipéptidos gH de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones de desglucosilación, (ii) cualquiera de los polipéptidos gL de HCMV anteriores que comprenden una mutación de desglucosilación, (iii) cualquiera de los polipéptidos pUL130 de HCMV anteriores que comprenden una o más mutaciones de desglucosilación, y (iv) cualquiera de los polipéptidos pUL131A de HCMV anteriores que comprenden una mutación de desglucosilación. Estos complejos pueden incluir además, por ejemplo, (vi) cualquiera de las mutaciones estabilizadoras gH, gL, pUL130 y pUL131A de HCMV anteriores.

Composiciones

En la presente se describe una composición que comprende un complejo que tiene al menos un polipéptido mutante, o un fragmento formador de complejo mutante del mismo, en donde el polipéptido mutante o fragmento mutante es al menos uno de HCMV gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A y en donde el polipéptido mutante o fragmento mutante comprende al menos una mutación estabilizadora. En la presente se describe además una composición que comprende un complejo que tiene al menos un polipéptido mutante, o un fragmento formador de complejo mutante del mismo, en donde el polipéptido mutante o fragmento mutante es al menos uno de gH, gL, pUL 130 y pUL131A de HCMV y en donde el polipéptido mutante o fragmento mutante comprende al menos una mutación de desglucosilación. La composición de la presente invención es una composición inmunogénica. La composición de la presente invención puede ser una composición de vacuna. Estas composiciones se pueden usar para producir anticuerpos en un mamífero (por ejemplo, un humano, murino, conejillo de indias o macaco).

Además de sus antígenos, las composiciones inmunogénicas de la invención típicamente pueden incluir un “componente no antigénico” que, como se usa con respecto a la presente invención, puede ser un adyuvante o un portador farmacéuticamente aceptable. Un análisis exhaustivo de estos portadores está disponible enRemington: The Science and Practice of Pharmacy.Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos neutralizantes. Los portadores adecuados son habitualmente macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa, trehalosa, lactosa y agregados lipídicos (tal como gotas de aceite o liposomas). La solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, estéril y libre de pirógenos es un portador habitual. Estos portadores se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. El componente no antigénico puede ser un diluyente, tal como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, un componente no antigénico puede ser sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH y similares. Los componentes no antigénicos pueden incluir un antimicrobiano, en particular cuando se envasan en formato de dosis múltiple. Los componentes no antigénicos de la invención incluyen detergentes, por ejemplo, un TWEENMR (polisorbato), tal como TWEEN80MR. Los detergentes en general están presentes en niveles bajos, por ejemplo, <0.01 %. Los componentes no antigénicos pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Es habitual una concentración de 1.0 ± 2 mg/ml de NaCl. Los componentes no antigénicos de la invención pueden incluir un amortiguador, tal como un amortiguador de fosfato. Los componentes no antigénicos pueden incluir un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), por ejemplo, a alrededor de 15-30 mg/ml (por ejemplo, 25 mg/ml).

El pH de la composición está usualmente entre 6 y 8, y más adecuadamente entre 6.5 y 7.5 (por ejemplo, aproximadamente 7). El pH estable se puede mantener por el uso de un amortiguador, por ejemplo, un amortiguador Tris, un amortiguador de citrato, un amortiguador de fosfato o un amortiguador de histidina. Por lo tanto, una composición en general incluirá un amortiguador. Una composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Una composición comprende una cantidad inmunológicamente efectiva del o de los antígenos a los que se hace referencia. Una “cantidad inmunológicamente efectiva” es una cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es efectiva para provocar una respuesta de anticuerpos contra el antígeno. Esta cantidad puede variar dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, su edad, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. El contenido de antígeno de las composiciones de la invención en general se expresará en términos de la masa de proteína por dosis. Una dosis de 10-500 pg (por ejemplo, 50 pg) por antígeno puede ser útil. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un adyuvante inmunológico.

Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano, en particular cuando se envasan en formato de dosis múltiple. Los antimicrobianos como tiomersal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en vacunas, pero se prefiere usar un conservador libre de mercurio o ningún conservador en absoluto. Las composiciones pueden comprender detergente, por ejemplo, un polisorbato, tal como polisorbato 80. Los detergentes en general están presentes en niveles bajos, por ejemplo, <0.01 %. Las composiciones pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10+2 mg/ml de NaCl es habitual, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.

Las composiciones de la invención en general se administrarán directamente a un sujeto. La administración directa se puede lograr por inyección parenteral (por ejemplo, de manera subcutánea, de manera intraperitoneal, de manera intravenosa, de manera intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido) o mediante cualquier otra vía adecuada. Se prefiere la administración intramuscular, por ejemplo, en el muslo o la parte superior del brazo. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero de manera alternativa se puede usar una inyección sin aguja.

Las composiciones de la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir enfermedades) o terapéuticas (es decir, para reducir o eliminar los síntomas de una enfermedad).

Sistemas de expresión

En la presente se describe un proceso para expresar el o los polipéptidos de HCMV mutantes para usarse en el complejo de HCMV modificado de la invención. Los sistemas de expresión adecuados para usarse en la presente invención se describen con detalle en, por ejemplo, Doyle(High Throughput Protein Expression and Purification: Methods and Protocolsin METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Doyle ed., 2008). Se puede usar un sistema o vector que es adecuado para mantener, propagar y expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el hospedador requerido. La secuencia de nucleótidos apropiada se puede insertar en un sistema de expresión por, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook (J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000). En general, el gen codificador se puede colocar bajo el control de un elemento de control tal como un promotor y opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN que codifica para el péptido deseado se transcribe en ARN en la célula hospedadora transformada.

Los ejemplos de sistemas de expresión adecuados incluyen, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episómicos y derivados de virus, que incluyen, por ejemplo, vectores derivados de: plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, virus tal como baculovirus, papovavirus tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, o combinaciones de los mismos, tal como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, que incluyen cósmidos y fagémidos. Los cromosomas artificiales humanos (HAC) también se pueden emplear para administrar fragmentos de ADN más grandes que los que se pueden contener y expresar en un plásmido. Los sistemas de expresión adecuados incluyen microorganismos tal como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, plásmido o cósmido recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas o transfectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Los sistemas de traducción sin células también se pueden emplear para producir las proteínas para usarse en la invención. Las proteínas para usarse en la invención se pueden producir en células eucariotas, tal como células de mamífero.

Los polipéptidos recombinantes se pueden expresar de manera transitoria o de manera estable. Preferentemente, las proteínas recombinantes se expresan de forma estable. Por ejemplo, las líneas de células que expresan de forma estable el péptido de interés se pueden transfectar usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector separado. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan de manera exitosa las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de forma estable se pueden hacer proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.

Las líneas de células de mamífero disponibles como hospedadores (o células hospedadoras) para expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) que incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, de riñón de hámster bebé (BHK), de riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, de riñón embrionario humano (HEK) 293, de melanoma de Bowes y de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias líneas de células diferentes. La expresión en células de mamífero es preferible debido a que las proteínas que se producen tendrán patrones de glucosilación de mamífero auténticos y por lo tanto, poseerán epítopos que están presentes en partículas de HCMV infecciosas. Por consiguiente, la producción de complejos de proteínas de membrana de la invención en células de mamífero conducirá a la producción de anticuerpos que son capaces de unirse a partículas de HCMV que se presentan de manera natural durante la infección.

En el sistema de baculovirus, los materiales para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (el kit "MaxBac"). Estas técnicas se describen completamente en Summerset al.(Summers and Smith,A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987). Las células hospedadoras particularmente adecuadas para usarse en este sistema incluyen células de insecto tal comoDrosophilaS2 (es decir, por infección por baculovirus recombinante de células S2 deDrosophilatransfectadas de manera estable) y células Sf9 deSpodoptera.Las proteínas para usarse en la invención pueden no producirse en células de insecto. Hay muchos cultivos de células vegetales y sistemas de expresión genética de plantas completas conocidos en la técnica. Los ejemplos de sistemas de expresión genética de células vegetales adecuados incluyen aquellos descritos en la patente de Estados Unidos 5,693,506; patente de Estados Unidos 5,659,122; patente de Estados Unidos 5,608,143. En particular, se pueden utilizar todas las plantas a partir de las cuales se pueden aislar y cultivar protoplastos para dar plantas regeneradas completas, de tal forma que se recuperan plantas completas que contienen el gen transferido. Prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados, incluido pero no limitado a todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, frutas y otros árboles, legumbres y verduras.

Los ejemplos de sistemas de expresión procariota incluyen aquellos que usanestreptococos, estafilococos, E. coli, StreptomycesyBacillus subtiliscomo células hospedadoras.

Los ejemplos de sistemas de expresión fúngicos incluyen aquellos que usan levadura (por ejemplo, S.cerevisiae)yAspergilluscomo células hospedadoras.

Las células HEK293 son adecuadas para la expresión transitoria de las proteínas de HCMV para usarse en la invención debido a su alta transfectabilidad por diferentes técnicas, que incluyen los métodos de fosfato de calcio y polietilenimina (PEI). Una línea de células útil de HEK293 es una que expresa la proteína EBNA1 de EBV, tal como 293-6E (Loignonet al., Stable high volumetric production of glycosylated human recombinant IFNalpha2b in HEK293 cells,2008 BMC Biotechnology 8:65). Se ha mostrado que las células HEK293 transformadas secretan altos niveles de los complejos de proteínas de la invención en el medio de crecimiento, permitiendo de este modo la purificación de estos scomplejos de proteínas directamente del medio de crecimiento.

Las células CHO son hospedadores de mamífero particularmente adecuados para la producción industrial de las proteínas de HCMV para usarse en la invención para usarse como inmunógenos o antígenos debido a que permiten la expresión génica estable a largo plazo y altos rendimientos de proteínas.

El o los polipéptidos o complejos mutantes de HCMV de la invención se pueden secretar a partir de las células en las que se expresan. De manera alternativa, el polipéptido mutante o complejo mutante de la invención no se puede secretar. EnE. coli,por ejemplo, las proteínas no secretadas se pueden acumular en cuerpos de inclusión. Los métodos para purificar proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión se conocen bien en la técnica.

La transfección se puede llevar a cabo por una variedad de métodos que incluyen el uso de fosfato de calcio, electroporación o al mezclar un lípido catiónico con el material para producir liposomas que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

Moléculas de ácido nucleico

En la presente se describe una molécula de ácido nucleico recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos gH de HCMV mutados, los polipéptidos gL de HCMV mutados, los polipéptidos pUL128 de HCMV mutados, los polipéptidos pUL130 de HCMV mutados y/o los polipéptidos pUL131A de H<c>MV mutados como se describe en la presente. Las moléculas de ácido nucleico recombinante pueden estar dentro de un vector (por ejemplo, un vector de expresión) y se pueden enlazar de manera operativa a uno o más elementos de control (por ejemplo, un promotor y/o un intensificador). Un ejemplo del ácido nucleico recombinante puede ser una molécula individual que codifica para un polipéptido gL como se describe en la presente, un polipéptido gH como se describe en la presente, un polipéptido pUL128 como se describe en la presente, un polipéptido pUL130 como se describe en la presente y un polipéptido pUL131A como se describe en la presente. Un ejemplo adicional del ácido nucleico recombinante puede ser una molécula individual que codifica para un polipéptido gL como se describe en la presente y un polipéptido gH como se describe en la presente. En la presente se describe además una pluralidad de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican para uno o más polipéptidos mutados de la invención. Por ejemplo, dos moléculas de ácido nucleico: la primera molécula que codifica para un polipéptido gH como se describe en la presente y un polipéptido gL como se describe en la presente, y la segunda molécula que codifica para una proteína pUL128 como se describe en la presente, una proteína pUL130 como se describe en la presente y un polipéptido pUL131A como se describe en la presente. De manera alternativa, tres moléculas de ácido nucleico: una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gL como se describe en la presente; una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gH como se describe en la presente; y una tercera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una o más proteínas de HCMV adicionales tal como gO, pUL128, pUL130 o pUL131A. De manera alternativa, cinco moléculas de ácido nucleico: una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gL como se describe en la presente; una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gH como se describe en la presente; una tercera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína pUL128 como se describe en la presente; una cuarta molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína pUL130 como se describe en la presente; y una quinta molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína pUL131A como se describe en la presente. Las moléculas de ácido nucleico recombinante (a) pueden no ser una molécula de ARN autorreplicante; (b) pueden no ser uno o más replicones de alfavirus; (c) pueden no codificar para ninguna proteína no estructural de alfavirus, tal como NSP1,<n>S<p>2, NSP3 y NSP4; (d) pueden no contener un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), tal como EMCV o EV71; y/o (e) pueden no contener un sitio 2A viral, tal como FMDV. Por lo tanto, las secuencias que codifican para cada polipéptido individual en un complejo pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico individual, o distribuidas entre dos o más moléculas de ácido nucleico.

En la presente se describe una pluralidad de ácidos nucleicos recombinantes que comprenden: (i) una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gL como se describe en la presente, (ii) una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína gH como se describe en la presente, (iii) una tercera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína pUL128 como se describe en la presente, (iv) una cuarta molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína pUL130 como se describe en la presente y (v) una quinta molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una pUL131A como se describe en la presente. Ver, por ejemplo, WO 2014/005959 (también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016-0159864. Esta primera, segunda, tercera, cuarta y/o quinta molécula o moléculas de ácido nucleico recombinante: (a) pueden no ser una molécula de ARN autorreplicante; (b) pueden no ser uno o más replicones de alfavirus; (b) pueden no codificar para ninguna proteína no estructural de alfavirus, tal como NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4; (c) pueden no contener un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), tal como EMCV o EV71; y/o (d) pueden no contener un sitio 2A viral, tal como FMDV.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína gH como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a S<e>Q ID NO: 1 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 1. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína gH como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 3 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 3. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína gL como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 7 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 7. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína gL como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 9 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 9. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína gL como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 29 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 29. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína pUL128 como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 13 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 13. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína pUL130 como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 17 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 17. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína pUL131A como se describe en la presente pueden tener diferentes grados de identidad a SEQ ID NO: 21 tal como al menos 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad a la secuencia de SEQ ID NO: 21.

Las moléculas de ácido nucleico recombinante como se describen en la presente pueden comprender ADN, opcionalmente incluidos intrones, y/o ADNc. Algunos genes se expresan de manera más eficiente cuando hay intrones presentes. Los genes genómicos UL128 y UL131A consisten cada uno en dos exones, en tanto que UL130 no contiene ningún intrón. La molécula de ácido nucleico recombinante como se describe en la presente puede comprender ácido ribonucleico (ARN), que incluye ARNm, con la condición de que la molécula de ARN de la presente invención (a) no sea una molécula de<a>R<n>autorreplicante; (b) no sea uno o más replicones de alfavirus; (c) no codifique para ninguna proteína no estructural de alfavirus, tal como NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4; (d) no contenga un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), tal como EMCV o EV71; y/o (e) no contenga un sitio 2A viral, tal como FMDV. Las moléculas de ácido nucleico como se describen en la presente pueden comprender secuencias de polinucleótidos (ADN o ARN) que se han optimizado por codones para expresión dentro de una célula hospedadora, por ejemplo, optimizado por codones para expresión dentro de una célula hospedadora bacteriana o de mamífero.

En la presente se describen vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico como se describen en la presente . Un vector de esta invención puede ser un vector de expresión que comprende promotores y terminadores adecuados para la expresión dentro de una célula hospedadora. Estos promotores y terminadores se han descrito, por ejemplo, en la publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2015/0322115 y 2015/0359879. Estas moléculas de ácido nucleico recombinante pueden ser plásmidos, o se pueden incorporar en el genoma de una célula. Los promotores en estos vectores pueden ser promotores de HCMV o promotores no de HCMV (ver, por ejemplo, publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2015/0322115 y 2015/0359879).

Los procedimientos de ejemplo suficientes para guiar a un experto en la técnica a través de la producción de ácidos nucleicos de HCMV recombinantes de la invención se pueden encontrar en Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates, 1992 (y complementos a 2003); y Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed., Wiley & Sons, 1999.

En la presente se describe un proceso para expresar un complejo de HCMV modificado que comprende uno o más polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL13 y/o pUL131A de HCMV mutados como se describe en la presente, al introducir una o más moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican para uno o más polipéptidos mutados en un sistema de expresión; expresar la una o más moléculas de ácido nucleico en el sistema de expresión; y purificar el complejo de HCMV. De manera adecuada, este proceso puede comprender transfectar células con una primera construcción de ácido nucleico que codifica para: polipéptidos gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A de HCMV mutados como se describe en la presente. De manera alternativa, este proceso puede comprender transfectar células con una primera construcción de ácido nucleico que codifica para un polipéptido gH de HCMV como se describe en la presente, una segunda construcción de ácido nucleico que codifica para un polipéptido gL de HCMV como se describe en la presente; y una o más terceras construcciones de ácido nucleico que codifican para una o más glucoproteínas de HCMV adicionales como se describe en la presente. De manera alternativa, este proceso puede comprender transfectar células con una primera construcción de ácido nucleico que codifica para un polipéptido gH como se describe en la presente y un polipéptido gL como se describe en la presente; y una segunda construcción de ácido nucleico que codifica para un polipéptido pUL128 de HCMV, pUL130 de HCM<v>y pUL131A de HCMV como se describe en la presente. Este complejo de HCMV se puede expresar en una célula de mamífero. Este complejo de proteína de membrana de HCMV aislado se puede purificar opcionalmente.

Células

En la presente también se describe una célula que expresa una molécula de ácido nucleico o una pluralidad de moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente, en donde la célula puede no comprender el genoma de HCMV completo. Esta célula se puede transformar de forma estable con esta molécula de ácido nucleico o pluralidad de moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente. De manera adecuada, esta célula puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula 293-6E (ver WO 2014/005959, también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016/0159864) o una célula CHO (ver WO 2016/116904).

En la presente también se describe una célula que produce un complejo como se describe en la presente, en donde la célula puede no (i) contener un genoma de HCMV, y/o (ii) producir viriones de HCMV, y/o (iii) expresar cualquier proteína de HCMV sin envoltura. Idealmente, la célula carece de uno de (i), (ii) o (iii); adecuadamente, puede carecer de dos; más adecuadamente, puede carecer de los tres de (i), (ii) y (iii). Por lo tanto, la célula, como se describe en la presente, puede no contener el genoma de HCMV y/o puede no producir viriones de HCMV y/o puede no expresar ninguna proteína de HCMV sin envoltura.

Aislam iento y purificación de complejos

Los complejos como se describen en la presente se pueden preparar y usar en forma aislada. El término “aislado”, como se usa en la presente, significa removido de su ambiente natural. Por lo tanto, un “complejo de proteína de membrana de HCMV aislado” no abarca el complejo de proteína de membrana de HCMV en la superficie de células infectadas por HCMV o dentro de un virión de HCMv infeccioso o unido a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo). Usando los métodos de expresión descritos en los ejemplos y por ejemplo, WO 2014/005959 (también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016/0159864, y WO 2016/116904), los complejos como se describe en la presente se pueden producir con altos rendimientos. Por ejemplo, en procesos que implican células en crecimiento de la invención en medio de crecimiento, el complejo de proteína de la invención puede acumularse a un nivel de más de 0.4 mg por litro de medio de crecimiento (por ejemplo, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 o 5 mg por litro de medio de crecimiento o más).

En la presente se describen procesos para purificar complejos de membrana de HCMV como se describe en la presente. Estos procesos pueden permitir la producción del complejo de proteína de membrana de HCMV a una pureza de >85 %, >86 %, >87 %, >88 %, >89 %, >90 %, >91 %, >92 %, >93 %, >94 % o >95 % de la proteína total en masa, como se determina por electroforesis en gel. Estos altos niveles de pureza hacen que los complejos sean adecuados para usarse como un inmunógeno en aplicaciones de diagnóstico o como un antígeno en formulaciones de vacuna. El complejo de proteína de membrana de HCMV como se describe en la presente se puede preparar a diferentes niveles de pureza, por ejemplo, al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de la proteína total en masa, es decir, el complejo conforma al menos 80 % de la masa proteinácea total en una composición. La composición puede estar libre de poliacrilamida.

De manera adecuada, esta purificación puede comprender uno o más pasos cromatográficos. El uno o más pasos cromatográficos pueden comprender cromatografía de afinidad, tal como cromatografía de afinidad de Ni2+ y/o cromatografía de exclusión por tamaño. De manera alternativa, esto uno o más pasos cromatográficos pueden comprender cromatografía de intercambio iónico. Ver, por ejemplo, WO 2014/005959 (también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2016/0159864); WO 2016/116904; y WO2015/181142. Por lo tanto, un polipéptido como se describe en la presente puede comprender una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de afinidad tal como una etiqueta estrep, etiqueta myc, etiqueta de polihistidina o combinaciones de las mismas) para, por ejemplo, el aislamiento del polipéptido(verKimpleet al., OverView of Affinity Tags forProtein Purification, 2015Curr. Protoc. Protein. Sci. 73: Unit-9.9, doi: 10.1002/0471140864,ps0909s73, que resume etiquetas conocidas y su uso para aplicaciones de biotecnología).

Adyuvantes

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender un adyuvante además del antígeno. Los adyuvantes son “componentes no antigénicos” usados en vacunas a fin de mejorar y modular la respuesta inmunitaria al antígeno. Sin embargo, los adyuvantes pueden dar por resultado reactogenicidad incrementada. Los adyuvantes pueden incluir (pero no se limitan a) AS01, emulsiones de aceite en agua (por ejemplo MF59 y AS03), liposomas, saponinas, agonistas de TLR2, agonistas de TLR3, agonistas de TUR4, agonistas de TUR5, agonistas de TUR6, agonistas de TUR7, agonistas de TUR8, agonistas de TUR9, sales de aluminio, nanopartículas, micropartículas, ISCOMS, fluoruro de calcio y compuestos orgánicos o combinaciones de los mismos. Ver, por ejemplo, publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2015/0093431 y WO2011/027222 (también publicada como publicación de preconcesión de Estados Unidos Núm. 2012/0237546). La composición inmunogénica de la invención puede comprender un antígeno y un adyuvante en donde el adyuvante es AS01, una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, MF59 y AS03 y sus subtipos respectivos que incluyen los subtipos B y E), una sal de aluminio (por ejemplo, fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio), una saponina (por ejemplo, QS21), un agonista de receptores tipo Toll (TLRa) (por ejemplo, TLR4a y TLR7a) o una combinación de los mismos (por ejemplo, Alum-TLR7a (Buonsanti et al.,Novel adjuvant Alum-Tlr7a significantly potentiates immune response to glycoconjugate vaccines,2016 Sci. Rep. 6:29063 (DOI: 10.1038/srep29063)). Por “agonista de TLR” se quiere decir un componente que es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una vía de señalización de TLR, ya sea como un ligando directo o indirectamente a través de la generación de ligando endógeno o exógeno (Sabroeet al, Toll-like Receptors in Health and Disease: Complex Questions Remain,2003 J. Immunol. 171(4): 1630-1635). Un agonista de TLR4, por ejemplo, es capaz de provocar una respuesta de señalización a través de una vía de señalización de TLR-4. Un ejemplo adecuado de un agonista de TLR-4 es un lipopolisacárido, adecuadamente un derivado no tóxico del lípido A, en particular monofosforil lípido A o más en particular monofosforil lípido A 3-desacilado (3D - MPL). Los adyuvantes descritos en la presente se pueden combinar con cualquiera de los antígenos descritos en la presente.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Expresión del complejo pentamérico en células de mamífero

La expresión de pentámero tipo silvestre o etiquetado con selenometionina (SeMet) se llevó a cabo en células 293GnTi' a través de transfección transitoria o estable de dos vectores, con un vector que codifica para gH y gL (que tiene las secuencias SEQ ID NO: 3 y 7, respectivamente), y el otro que codifica para pUL128, pUL130 y pUL131A (que tiene las secuencias SEQ ID NO: 13, 17 y 21, respectivamente) estrategia de dos vectores como se describe en Hofmann et al.(Expression of the Human Cytomegalovirus Pentamer Complex for Vaccine use in a CHO System,2015 Biotech. & Bioeng. 112(12): 2505-2515).

Para la expresión de Fab anti-Pentámero, el fragmento Fab de cadena pesada y la cadena ligera de longitud completa se clonaron cada uno en el vector de expresión pRS5a de mamífero (Novartis AG). Una doble etiqueta Strep escindible estuvo presente en el extremo C-terminal del Fab de cadena pesada. El Fab anti-pentámero se expresó transitoriamente en células 293Expi (Invitrogen Inc.) usando el kit de transfección Expifectamine 293 (ThermoFisher) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante al transfectar los dos vectores que codifican para el fragmento Fab de la cadena pesada y la cadena ligera de longitud completa del anticuerpo en una relación 1:1.

Ejemplo 2 - Purificación del complejo pentamérico

Para la purificación de pentámero, el medio de expresión se cargó directamente en una columna StrepTrap HP (GE Lifesciences) y la proteína se eluyó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante usando Tris 0.1M pH 8.0, NaCl 150 mM y destiobiotina 2.5 mM en el amortiguador de elución (IBA Lifesciences). El producto eluido se incubó con proteasa TEV (ThermoFisher) durante la noche a 4 °C. La muestra se diluyó 3 veces con Hepes 20 mM pH 7 para reducir la concentración de sal total a 50 mM antes de cargarla en una columna MonoS 10/30 (GE Lifesciences) para cromatografía de intercambio iónico. La proteína se eluyó de la columna con un gradiente lineal de NaCl 0 a 1 M en 10 volúmenes de columna. La proteína se concentró y se cargó en una columna Superose 6 10/300 y el pico eluido se concentró a más de 1 mg/ml.

Para la purificación de Fab, el medio de expresión se concentró 10 veces y el amortiguador se intercambió en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 150 mM y EDTA 1 mM usando un sistema de filtración de flujo tangencial (Millipore) con un corte de 10 kDa. La muestra se cargó posteriormente en una columna StrepTrap HP y se eluyó de manera similar a la purificación de pentámero descrita anteriormente. La etiqueta Strep se escindió usando proteasa PreScission (GE Lifesciences) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El Fab escindido entonces se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño sobre una columna S200 (GE Lifesciences) equilibrada con amortiguador que contenía Tris 25 mM pH 8.0 y NaCl 150 mM.

Para la purificación del complejo pentámero-Fab para la cristalización, el pentámero eluido de la columna MonoS se incubó con un exceso molar de 2 veces de Fab purificado y se incubó durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. La muestra se cargó posteriormente en una columna Superóse 6 10/300 para separar el complejo pentámero-Fab del exceso de Fab. Las fracciones picos se mezclaron y concentraron a >5 mg/mL.

Ejemplo 3 - Cristalización del complejo pentamérico

Para los experimentos de cristalización, el pentámero tipo silvestre purificado o etiquetado con selenometiona (SeMet) se desglucosiló usando Endo Hf (New England Biolabs), de acuerdo con los lineamientos del fabricante, antes de la formación de complejos con Fab. Se obtuvieron aciertos de cristal iniciales para un complejo entre pentámero y el fragmento de unión a antígeno (Fab) de anticuerpo monoclonal (mAb) 8121 y 916 (Macagnoet al.(2010 J. Virol. 84:1005-1013), y estos aparecieron como microcristales pequeños en una gota que contiene 0.1 pl de proteína y 0.1 pl de etanol al 20 %, Tris 0.1 M pH 8.5 a 20 °C. El etanol se reemplazó con el isopropanol menos volátil en experimentos posteriores, y se usó benzamidina como aditivo (del examen de aditivos de Hampton Research) para optimizar esta condición de cristalización. Los mejores cristales para los cristales Fab WT o SeMet-Pentámero-8121 se obtuvieron usando un depósito que contiene PEG400 al 10 % (p/v), isopropanol al 10 %, benzamidina al 2 % (p/v) y Tris 0.1 M pH 8.2. Los impactos de cristal para pentámero en complejo con el 9I6 Fab se obtuvieron inicialmente en MES 0.1 M pH 6.5 y 15 % (p/v) de éter metílico de PEG 500. Estos cristales se optimizaron para crecimiento con diferentes aditivos. El mejor cristal de difracción se obtuvo usando un depósito que contenía 10 % (p/v) de éter metílico de PEG 500, MES 0.1 M pH 6.2 y fenol 10 pM.

3.1 Resultados - Estructura cristalina

La estructura de pentámero adopta una forma helicoidal de 180 A de longitud y 30-80 A en cruzamiento(figura 1).

La parte gH/gL del complejo tiene una organización y estructura de dominio similar a otros gH/gL de herpesvirus, con cuatro dominios gH (D-I a D-IV) apilados uno encima del otro y el más N-terminal (D-I) coplegado con gL. Las cadenas de polipéptidos de los UL están altamente interconectadas y forman un subcomplejo suavemente curvado que se une a una extensión en el extremo N-terminal gL. El análisis de la superficie de pentámero revela 11 sitios de glucosilación N-enlazados: 6 en gH, 1 en gL y los 4 restantes en los UL.

Aunque las comparaciones estructurales revelan una estrecha similitud de gH de HCMV con gH del virus yherpesvirus de Epstein Barr (EBV), la gH de HCMV adopta una forma de bota, que recuerda al virus a-herpesvirus Varicela Zoster (VZV) y al virus Herpes Simple-2 (HSV-2) gH/gL, en lugar de la conformación tipo varilla de gH/gL de EBV. Una diferencia significativa entre gH de EBV y HCMV es la presencia en la última de tres p- hebras N-terminales adicionales que interactúan con residuos de gH.

Los UL forman un dominio de núcleo central flanqueado en extremos opuestos por dos pequeños dominios globulares(figuras 1 y 2A-2F).El dominio de núcleo se forma por el extremo C-terminal de pUL130 y pUL131A, ambos compuestos por a-hélices N-terminales seguidas por 3 p-hebras de longitud similar(figuras 2A-2F).Las hebras se ensamblan en una lámina p antiparalela grande y bastante plana cubierta en una cara por hélices. El extremo N-terminal de UL128 forma un dominio globular ubicado en la punta del pentámero, con los primeros 80 residuos que adoptan un pliegue de quimiocina de CC, en tanto que el extremo C-terminal de UL128 se ancla a gH/gL por un ligador de 50 A de largo, y una hélice terminal que se acopla en un surco hidrófobo formado por hélices 3a y hebras 2p de gL.

10P3 (sitio 4) y 15D8 (sitio 1) se unen a la superficie cóncava de los UL, y 10F7 (sitio 2) se une en la otra cara del pentámero a lo largo de la lámina p de UL130/UL131A.

Las 916 CDR entran en contacto tanto con UL128 (residuos 47-52 en el dominio de quimiocina y residuos 92-93 y 106-109 en a2p4p5p6) como con UL131A (residuos 23-24 y 27-31). El epítopo es consistente con los datos de NS-EM publicados y los estudios de mapeo que sugieren que los anticuerpos de sitio 5 requieren los tres UL para la unión, probablemente debido al coplegamiento de UL130 y UL131A.

La característica principal del complejo de pentámero-Fab 8I21 es la interacción entre la HCDR3 larga del Fab y el dominio de quimiocina UL130. Arg104 y Trp105, en la punta de HCDR3, sobresalen en una grieta compuesta por residuos hidrófobos y polares de la hélice UL130-a1 N-terminal y la lámina p de UL130/gL que establecen enlaces H con UL130 Ser47 y gL Asp156, respectivamente. La mutación de HCDR3 Trp105 a alanina dio por resultado una disminución de más de 150 veces en la afinidad de unión consistente con su papel prominente en la interacción. Varias otras interacciones estabilizan el complejo que incluyen enlaces de hidrógeno entre el grupo guanidinio de HCDR3 Arg107 y el grupo hidroxilo de UL130 Tyr46, y enlaces de H entre oxígenos de carbonilo de cadena principal de HCDR3 y las cadenas laterales de LCDR3 Trp94 y Trp97.

En resumen:

La estructura de pentámeros revela la presencia de pequeñas interfases entre algunos de los dominios, así como la presencia de varias cavidades en las interfases de dominio(figura 2).Se realizó un análisis de los datos de microscopía electrónica de tinción negativa (NS-EM) de complejos de pentámero-nAb (publicado previamente, ver Ciferriet al., Antigenic Characterization of the HCMV gH/gL/gO and Pentamer Cell Entry Complexes Reveals Binding Sites for Potently Neutralizing Human Antibodies,2015 PLOS Path D 01:10.1371/journal.ppat.1005230), datos de intercambio de hidrógeno-deuterio acoplado a espectrometría de masas (HDX-MS) y la superposición de estructuras cristalinas de pentámero resueltas en complejo con dos anticuerpos neutralizantes diferentes. En conjunto, esta información reveló la presencia de flexibilidad intrínseca del complejo de proteína pentámero. Específicamente, los UL experimentan una rotación de cuerpo rígido alrededor de la hélice ligadora gH D-I/D-II, que actúa como una bisagra u “hombro”. Como resultado, los UL pueden moverse como un brazo rígido, con un desplazamiento de hasta 30 A(figura 3).Los datos de HDX-MS también mostraron cómo la unión de anticuerpos a pentámero puede afectar a péptidos ubicados lejos de los epítopos (o las regiones directamente implicadas en la unión de los anticuerpos), lo que sugiere que tras la unión por los anticuerpos, se puede estabilizar el complejo de pentámero.

La estructura de pentámero revelada en la presente muestra que los componentes gH y gL del complejo tienen una estrecha similitud estructural con gH/gL de EBV, en tanto que los UL se caracterizan por un dominio de núcleo a/p flanqueado en extremos opuestos por dominios de quimiocina UL128 y UL130. En particular, la gL de HCMV tiene una extensión N-terminal única, que falta en las gL de EBV y HSV, que forma un sitio de acoplamiento para la hélice a3 C-terminal de UL128 y el dominio de quimiocina UL130.

Los rasgos característicos de la estructura de pentámero incluyen interfases y cavidades relativamente pequeñas entre algunos dominios, lo que sugiere una flexibilidad intrínseca del complejo. Las comparaciones de estructura revelaron grandes rotaciones de cuerpo rígido del dominio D-I gH/gL y el brazo de UL alrededor de la hélice ligadora gH D-I/D-II, lo que dio como resultado un gran desplazamiento de los UL. Aunque el epítopo 8I21 sigue siendo el mismo en el complejo de pentámero-Fab 9I6, se cree que la unión de anticuerpo estabiliza el pentámero en estados conformacionales discretos, pero diferentes. De hecho, las reconstrucciones de partículas individuales revelan una gran rotación de cuerpo rígido de los UL en pentámero unido a Fab 10F7 en comparación con los complejos 8I21 y 9I6 Fab. De acuerdo con esta creencia, el análisis de HDX-MS de complejos de pentámero-Fab muestra que los anticuerpos estabilizan regiones de pentámero distantes de sus epítopos correspondientes. Por lo tanto, la combinación de HDX-MS y datos cristalográficos revela áreas de pentámero donde se pueden introducir mutaciones para generar un complejo más estable (ver, por ejemplo, McLellanet al.,2013 Science 342: 592-598, que muestra una mayor estabilidad de una conformación de prefusión de la proteína de fusión de virus respiratorio sincitial se relacionó con una inmunogenicidad mejorada).

Este análisis estructural de los complejos de pentámero-Fab junto con el análisis de unión celular proporciona nuevos conocimientos sobre el mecanismo de neutralización de HCMV mediada por anticuerpos. Se muestra que el pentámero se une a células epiteliales de pigmento retiniano adulto (ARPE-19) y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), pero no a células MRC-5.

La preincubación de pentámero con mAb 15D8 (sitio 1), 10P3 (sitio 4), 2C12 y 9I6 (sitio 5) o 7113 (sitio 6), inhibió la unión de pentámero a células endoteliales (figura 6A-6C). Por el contrario, los mAb 4N10 y 8I21 (sitios 3 y 7, respectivamente) y 10F7 (sitio 2), no afectaron la unión de pentámero a células. Por lo tanto, los datos sugieren que los anticuerpos específicos de pentámero probablemente neutralizan HCMV a través de la interferencia de múltiples funciones de pentámero durante la infección viral. Los inventores muestran que los anticuerpos que se unen a los residuos de UL128 y UL131A ubicados en la punta del pentámero (9I6, sitio 5), hélice de UL128-a3 (15D8, sitio 1) y cerca del ligador que conecta UL128-a2p4p5p6 a uLl28-a3 (10P3, sitios 4 y 6) evitan la unión de pentámero a las células. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden inhibir la interacción de pentámero con un receptor de superficie celular, ya sea por competencia directa o impedimento estérico, y se cree que los sitios de unión a anticuerpo corresponden al sitio en la superficie del pentámero para la unión a receptor de superficie celular.

Por el contrario, la unión de anticuerpo al codo del brazo de ULs (4N10 y 8I21, sitios 3 y 7 respectivamente) y el lado expuesto a disolvente de la lámina p de UL130/UL131A (10F7, sitio 2) no afectó la unión de pentámero a las células, lo que sugiere un mecanismo de neutralización diferente. 8I21 se une a una superficie cargada positivamente en UL130 con una CDR3 de cadena pesada larga (HCDR3) que sobresale simultáneamente en un surco en el dominio de quimiocina UL130 y entra en contacto con residuos de extremo N-terminal de UL130, ambos de los cuales se implican en la unión a receptor en quimiocinas. Se cree que este sitio en UL130 se une a un correceptor en la superficie celular o en un paso posterior a la entrada. Por lo tanto, los anticuerpos de sitio 2 y sitio 3/7 pueden interferir con estas interacciones y procesos sin afectar la unión de pentámero a las células.

Sin desear que se limite por teoría y con base en las caracterizaciones estructurales y funcionales de mAb neutralizantes, los inventores proponen un mecanismo potencial para la activación mediada por pentámero de la entrada de HCMV. Los inventores sugieren que un receptor celular se uniría a una superficie en la proximidad de UL128 y los epítopos para los anticuerpos neutralizantes de sitio 1 y 4/6. La unión a receptor a su vez puede dar por resultado una rotación de gH/gL D-I mediada por el ligador UL128 y la interacción UL128-a3 con el haz de 3 hélices gL. El reposicionamiento de D-I puede afectar el ancho del surco D-I/La D-II, implicado en la unión de gB en gH/gL de EBV, desencadenando en última instancia la fusión de membrana.

En conclusión, la estructura de pentámero descrita en la presente revela sitios de unión para mAb potentes y ampliamente neutralizantes que sugieren la ubicación de sitios funcionales importantes y dianas para agentes terapéuticos de anticuerpo. Las estructuras también revelan un reposicionamiento dinámico de los UL tras la unión a anticuerpo, lo que sugiere un mecanismo de cambio conformacional inducido por ligando durante la entrada celular. Finalmente, los análisis estructurales, bioquímicos y funcionales basados en células de pentámero de HCMV reportados aquí proporcionan una estructura a nivel atómico para al menos el mecanismo de actividad de pentámero y para el diseño de antígeno.

3.2 Análisis de los glucanos que enmascaran epítopos de pentámero y mutaciones de desglucosilación

Se han identificado previamente siete epítopos neutralizantes (sitios 1 a 7) en el pentámero y se han mapeado ampliamente (ver, por ejemplo, Macagnoet al.,2010 J. Virol. 84: 1005-1013 y patente de Estados Unidos Núm.

9,527,902). Cinco de los sitios no se superponen (sitios 1, 2, 3, 4 y 5), pero el sitio 3 se superpone al sitio 7 y el sitio 4 se superpone al sitio 6. Los anticuerpos que se unen a aquellos siete sitios también se conocen e incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 15D8 que se conoce que se une al sitio 1, el anticuerpo 10F7 que se conoce que se une al sitio 2, el anticuerpo 4N10 que se conoce que se une al sitio 3, el anticuerpo 10P3 que se conoce que se une al sitio 4, los anticuerpos 916 y 2C12 que se conoce que se unen al sitio 5, el anticuerpo 7113 que se conoce que se une al sitio 6 y el anticuerpo 8I21 que se conoce que se une al sitio 7 (ver, por ejemplo, Macagnoet al.,2010 J. Virol. 84: 1005-1013 y patente de Estados Unidos Núm. 9,527,902). Usando la estructura de pentámero obtenida como se describió anteriormente, los presentes inventores caracterizaron los epítopos de sitio 1,4, 5 y 2 con mayor especificidad al mapear primero secuencias de epítopos de pentámero (los residuos de aminoácidos de epítopos neutralizantes en el pentámero) con incorporación de HDX diferencial tras la unión a Fab (se usaron Fab 15D8, 10P3, 2C12 y 10F7 como anticuerpos neutralizantes representativos que se unen a los sitios 1, 4, 5 y 2, respectivamente). En segundo lugar, los inventores inspeccionaron y analizaron manualmente las estructuras de rayos X, los datos de HDX-MS y los resultados de ajuste EM para proponer que la secuencia de epítopo de sitio 1 corresponde a los residuos de pUE128 149-171 numerados con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 13; la secuencia de epítopo de sitio 4 corresponde a los residuos 56-72 y 131-148 de pUL128 numerados con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 13; la secuencia de epítopo de sitio 5 corresponde a los residuos 31-40 y 42-56 de pUL131A numerados con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 21; y que la secuencia de epítopo de sitio 2 corresponde a los residuos 92-122 de pUL131A numerados con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 21. Las ubicaciones de cada una de estas secuencias de epítopos en la superficie de la estructura de pentámero se muestran en la figura 7 (ubicaciones generales designadas con óvalos).

Las ubicaciones generales de once glucanos en la superficie de pentámero también se muestran en la figura 7 (ubicaciones designadas con rectángulos, dentro de aquellos rectángulos hay esferas que indican átomos de carbono, que indican átomos de nitrógeno, que indican átomos de oxígeno y que indican átomos de hidrógeno). Hay diez en una cara del pentámero con seis glucanos en gH, uno en gL y cuatro en los UL(verla cara de pentámero que se muestra en el lado izquierdo de la figura 7). La otra cara del pentámero presenta un glucano en UL130 (que se muestra en el lado derecho de la figura 7, adyacente al sitio 2) y áreas positivamente cargadas con cúmulos de residuos de arginina y lisina expuestos. La estructura de pentámero-Fab 8I21 revela que dos glucanos (aquellos unidos a pUL130-Asn85 y pUL130-Asn118 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 17) flanquean el epítopo 8I21. Con base en la información estructural obtenida y el análisis de los inventores de la misma, los inventores creen que los glucanos UL130-Asn85 y pUL130-Asn118 limitan la accesibilidad del epítopo (es decir, que los glucanos “enmascaran” o “protegen” el epítopo). Por lo tanto, los inventores esperan que la remoción de uno o ambos de estos glucanos hará que el epítopo sea más accesible. En particular, remover un glucano “desenmascarará” el epítopo.

Los inventores han seleccionado glucanos adicionales que están en proximidad cercana a un epítopo neutralizante y que también se espera que limiten la accesibilidad de sus epítopos respectivos: glucanos en gH-Asn55, gH-Asn62, gH-Asn67, gH-Asn192, gH-Asn641 y gH-Asn700 numerados con respecto a SEQ ID NO: 1; en gL-Asn74 numerado con respecto a SEQ ID NO: 7; pUL130-Asn201 (que son además de pUL130-Asn85 y pUL130-118) numerados con respecto a SEQ ID NO: 17; y pUL131A-Asn81 numerado con respecto a SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, los inventores esperan que al remover uno o más de los glucanos listados anteriormente, el o los epítopos correspondientes serán más accesibles. En particular, remover el glucano “desenmascarará” el epítopo. Los inventores proponen específicamente la sustitución de un residuo de asparagina listado anteriormente por cualquier aminoácido no de asparagina (por ejemplo, glutamina) usando técnicas conocidas para prevenir la glucosilación N-enlazada en esa ubicación y de esta manera desenmascarar un epítopo de pentámero. Si una mutación de desglucosilación desenmascara o no un epítopo y/o hace que el epítopo sea más accesible se puede ensayar al comparar la antigenicidad del polipéptido mutante o complejo mutante con la de un polipéptido o complejo no mutante usando técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Zhouet al., Quantification of the Impact of theHIV-1 Glycan Shield on Antibody Elicitation,2017 Cell Reports 19:719-732; y Maet al. Envelope Deglycosylation Enhances Antigenicity of HIV-1 gp41 Epitopes for Both Broad Neutralizing Antibodies and Their Unmutated Ancestor Antibodies,2011 PLoS Path. 7(9), e1002200). La unión mejorada de un anticuerpo neutralizante al epítopo (es decir, antigenicidad incrementada) indica que la mutación de desglucosilación tiene el efecto de desenmascarar el epítopo y/o hacer que el epítopo sea más accesible(Id.).

Con base en la desglucosilación de efecto positivo conocida y el desenmascaramiento resultante de epítopos que ha tenido en la inmunogenicidad de diferentes antígenos, pero sin desear que se limite por teoría, se cree que al desenmascarar un epítopo de pentámero de HCMV mediante las mutaciones de desglucosilación descritas en la presente, el polipéptido de HCMV mutante (o fragmento del mismo) o complejo de HCMV mutante tendrá una inmunogenicidad incrementada en comparación con un polipéptido o complejo no mutante (por ejemplo, tipo silvestre), respectivamente (ver Liuet al., Unmaskng Stem-Specifc Neutralizing Epitopes by Abolishing N-Linked Glycosylation Sites of Influenza Virus Hemagglutinin Proteins for Vaccine Design,2016 J. of Virol. 90(19): 8496 8508; Zhouet a t,2017 Cell Reports 19:719-732; y Maet al.,2011 PLoS Path. 7(9), e1002200). Un incremento en la antigenicidad después de la desglucosilación ha sido una prueba de concepto aceptable para incrementar la inmunogenicidad mediante la desglucosilación (ver, por ejemplo, Maet al.,2011 PLoS Path. 7(9), e1002200).

3.3 Análisis computacional de los aminoácidos implicados en la estabilidad de complejo pentamérico

Además de la inspección manual, los análisis de las estructuras de la sección 3.1 anterior se realizaron usando los programas de gráficos moleculares Pymol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrodinger, LLC, disponible en WorldWideWeb(www).pymol.org) y Crystallographic Object-Oriented Toolkit("Coot")(Emsleyet al.,2010, disponible en WorldWideWeb(www)2.mrc-lmb.cam.ac.uk/Personal/pemsley/coot/). A partir de entonces, el software Molecular Operating Environment (MOE) (REF: Software Molecular Operating Environment (MOE); se usó Chemical Computing Group Inc., disponible en WorldWideWeb(www).chemcomp.com). En particular, las variantes “Escaneo de residuos” y “Secuencia de muestra” del módulo “diseño de proteínas” dentro de MOE se aplicaron a la estructura cristalina compleja pentamérica obtenida como se describe en las secciones anteriores. La simulación de “escaneo de residuos” muta secuencialmente todos o un subconjunto de residuos de la proteína de entrada. “Secuencia de muestra” muta, de forma aleatoria, todos los residuos especificados. Tanto las mutaciones puntuales simples como múltiples se generaron usando MOE.

Además, la variante de “escaneo de disulfuro”in silicodel módulo de diseño de proteínas dentro de MOE se aplicó a la estructura cristalina del complejo pentamérico obtenido como se describe en las secciones anteriores. Con esta herramienta, se analizó el ambiente circundante de un residuo para evaluar la presencia de otros residuos suficientemente cerca para formar un enlace de disulfuro. En términos generales, dos residuos se caracterizaron como suficientemente cerca para formar un enlace de disulfuro si los carbonos p de los dos aminoácidos están dentro de 5 A entre sí. Una vez que se seleccionaron pares de estos residuos, se usó MOE para mutar ambos residuos a cisteína y para caracterizar el impacto resultante en la estabilidad del complejo de proteína.

Los resultados de cada protocolo de MOE se compilaron e inspeccionaron manualmente. Para todos los protocolos de MOE anteriores, el impacto de cada mutación propuesta se calificó para estabilidad usando el método de puntuación de estabilidad delta (indicado como dS y medido como kcal/mol). La dS se define en MOE como la termoestabilidad relativa de una cierta mutación con respecto a la proteína tipo silvestre o no mutante, y los valores más negativos de dS indican mutaciones más estables. Este método de puntuación tiene en cuenta tanto el cambio conformacional tras la mutación como el cambio con respecto al tipo silvestre o no mutante. Además, dS se predice a partir de la diferencia en la estabilidad entre una proteína mutante y su tipo silvestre (o el no mutante) tanto en los estados plegado como desplegado.

Tabla 6: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones estabilizadoras dentro de gH- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de dStability más h l m l .

Tabla 7: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones<estabilizadoras dentro de gL>- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de dStability más h l m l .

Tabla 8: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones<estabilizadoras dentro de UL128>- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de dStability más bajo hasta el más alto).

Tabla 9: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones<estabilizadoras dentro de UL130>- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de dStability más h l m l .

Tabla 10: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones<estabilizadoras dentro de pUL131A>- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de ili m h l m l .

Tabla 11: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones estabilizadoras dentro de gH y gL- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado desde el valor de ili m h l m l .

Tabla 12: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones estabilizadoras tanto dentro de pUL128 como pUL128 e pUL130- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutantel ifi l v l r ili m h l m l .

Tabla 13: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones estabilizadoras tanto dentro de gL como pUL128 e pUL130- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutante(clasificado l v l r ili m h l m l .

Tabla 14: Los datos de dStability de MOE de un complejo pentamérico que comprende mutaciones estabilizadoras tanto dentro de pUL130 como pUL128 e pUL131A- todos los mutantes tienen un valor de dStability negativo y por lo tanto, indican una estabilidad mejorada en comparación con un complejo no mutantel ifi l v l r ili m h l m l .

Ejemplo 4 - Ensayos de estabilización de complejo pentamérico mutante

4.1 Caracterización de la estabilidad del complejo con respecto a al menos gH

Los análisis estructurales de gH revelaron la presencia de varias cavidades enterradas localizadas principalmente en la región N-terminal de gH (cerca de la interfase con gL) y en el extremo C-terminal del ectodominio gH. Con respecto a la secuencia de gH SEQ ID NO: 3, el residuo A102 de gH tipo silvestre (WT) se ubica en una hélice a corta (elaborada de residuos de gH 100-108) que corre paralela a una hélice a de gL (elaborada de residuos de gL 216-234, con respecto a la secuencia de gL SEQ ID NO: 7). El grupo de cadena lateral de metilo (CH3) de gH A102 apunta hacia la interfase con la hélice a de gL, donde está presente una cavidad aparente. Por lo tanto, los inventores sugieren que una mutación de relleno de cavidad de gH A102 puede contribuir a un mejor empaquetamiento dentro de este ambiente de interfase enterrado. Además, se observa que el residuo H480 de gH está parcialmente expuesto en la superficie y por lo tanto, los inventores lo identifican como un sitio objetivo para una mutación de reempaquetamiento para introducir un empaquetamiento más favorable con el ambiente circundante del residuo. Además, en vista de la introducción de dos puentes de disulfuro adicionales en la interfase gH-gL (ver mutaciones V109C (gH)-G224C (gL) y L111C (gH)-G218C (gL) en la tabla 11), los inventores sugieren que esta región se estabilice al introducir una mutación de puente de disulfuro y por lo tanto, se bloqueen juntos de una manera más rígida gH a la hélice a de gL en los residuos 216-234 de gL.

4.2 Caracterización de la estabilidad del complejo con respecto a al menos gL

La localización de cavidades enterradas dentro de gL abarca todas las regiones enterradas del extremo N-terminal a C-terminal. En particular, el residuo H177 de gL (numerado con respecto a la secuencia de gL SEQ ID NO: 7) se ubica centralmente dentro de gL, intercalado entre tres estructuras: un bucle en su lado, un bucle en su parte inferior y una hélice a en la parte superior. La cadena lateral de gL H177 apunta hacia una cavidad que cubre la mayor parte de la región dentro de estos dos bucles. Por lo tanto, los inventores proponen una mutación de H177 en un residuo de relleno de cavidad hidrófobo para estabilizar esta región (es decir, introducir una mutación de relleno de cavidad en gL H177). Del mismo modo, debido a que en el residuo de gL G224 y su entorno circundante, se puede observar una gran cavidad enterrada entre un motivo de hélice-bucle-hélice de gH (residuos de gH que corresponden a 108-122 de SEQ ID NO: 3) y la hélice a de gL (residuos de gL que corresponden a 216 -234 de SEQ ID NO: 7), los inventores proponen introducir una mutación de relleno de cavidad allí (residuo de gL G224) para estabilizar la región. Además, en la interfase entre la región de hélice-bucle-hélice de gH en los residuos 92 101 de gH (numerados con respecto a SEQ ID NO: 3) y la región de hélice-bucle-hélice de gL en aproximadamente los residuos 228-242 de gL (numerados con respecto a SEQ ID NO: 7), hay una cavidad anterior a la cadena lateral de gL C233. Por lo tanto, los inventores proponen introducir una mutación de relleno de cavidad o una mutación hidrófoba en el residuo C233 de gL. Finalmente, la interfase gL-UL130 se elabora de enlaces de hidrógeno de cadena principal y lateral y contactos hidrófobos de cadenas laterales grandes. Con base en parte en los análisis de estructura de esta región, los inventores sugieren la inserción de un enlace de disulfuro en la interfase gL-UL130 mediante una mutación de puente de disulfuro para bloquear estas dos subunidades (por, por ejemplo, una mutación G161C en el residuo gL que corresponde a G161 de SEQ ID NO: 7 con una mutación P64C en el residuo UL130 que corresponde a P64 de SEQ ID NO: 17).

4.3 Caracterización de la estabilidad del complejo con respecto a al menos UL128

El residuo de UL128 que corresponde a G123 de SEQ ID NO: 13 se ubica debajo de una cavidad enterrada significativa y se entierra en un pequeño dominio de 30 residuos en la interfase entre pUL128 y pUL130 y pUL131A. Al menos debido a que el residuo G123 se ubica debajo de una cavidad enterrada significativa, los inventores proponen realizar mutaciones de relleno de cavidad en UL128 G123 para incrementar la estabilidad de complejo. Además, el pequeño residuo de UL128 G145 (numerado con respecto a SEQ ID NO: 13) se ubica en la hélice a C-terminal de UL128 final que se acopla al haz de 3 hélices de gL y, por lo tanto, es un objetivo identificado por el inventor para introducir una mutación de reempaquetamiento para incrementar las interacciones en la interfase gL-UL128 y por lo tanto, incrementar la estabilidad del complejo. Finalmente, debido al ambiente y la disposición tridimensional de los residuos UL128 R142 y UL130 E95 (numerados con respecto a la secuencia de UL128 SEQ ID NO: 13 y secuencia de UL130 SEQ ID NO: 17, respectivamente) a lo largo del ligador de 50 A de longitud que conecta el dominio N-terminal de UL128 a gL, los inventores proponen introducir una mutación de puente de disulfuro R142C de UL128 y E95C de UL130 en el complejo para bloquear UL128 a UL130 y contribuir así a una mayor estabilidad de la región de UL y estabilidad incrementada del complejo en general.

4.4 Caracterización de la estabilidad del complejo con respecto a al menos UL130

En la interfase pUL130-pUL131A, el residuo H209 de pUL130 (numerado con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 17) apunta hacia pUL131A H35 (numerado con respecto a la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 21), con base en lo cual los inventores sugieren que si se protonan, estas histidinas se repelerían entre sí provocando cambios conformacionales o confiriendo flexibilidad a esta región. Por lo tanto, los inventores proponen introducir una mutación de reempaquetamiento en el residuo que corresponde a UL130 H209 para disminuir la flexibilidad de esta región de los UL e incrementar la estabilidad de complejo. Además, se detecta una cavidad enterrada significativa cerca de pUL130 H209 en la que los inventores proponen introducir una o ambas de una mutación de relleno de cavidad y reempaquetado para estabilidad incrementada del complejo. También en la interfase pUL130-pUL131A, el residuo pUL130 que corresponde a H150 de la secuencia SEQ ID NO: 17 apunta hacia pUL131A H69 (numerado con respecto a SEQ ID NO: 21), por lo que los inventores proponen asimismo introducir una mutación de reempaquetamiento en pUL130 H150 para disminuir la flexibilidad de esta región UL e incrementar la estabilidad de complejo.

4.5 Caracterización de la estabilidad del complejo con respecto a al menos pUL131A

En la interfase pUL130-pUL131A (núcleo ap), pUL131A G99 (numerado con respecto a la secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 21) se encuentra en una hebra periférica de la lámina p grande mezclada 130-131 plana, y su átomo de cadena principal C-b (es decir, el primer átomo de carbono de la cadena lateral G99) apunta hacia la región enterrada donde se ubican las hélices pUL130 y pUL131A, así como una gran cavidad enterrada. Los inventores se dirigen a pUL131A G99 para la introducción de una mutación de relleno de cavidad para mejorar la estabilidad de complejo. De manera similar, el residuo S86 de pUL131A (numerado con respecto a la secuencia de pUL131A SEQ ID<n>O: 21) se ubica en una hélice pUL131A y apunta hacia la lámina p mixta pUL130-pUL131A grande plana. Por lo tanto, los inventores proponen introducir una mutación de relleno de cavidad en pUL131A S86 para estabilidad incrementada de complejo. Del mismo modo, el residuo H64 de pUL131A (numerado con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 21) apunta hacia el ambiente enterrado entre el núcleo ap mixto pUL130-pUL131A, por lo que los inventores proponen introducir una mutación de reempaquetamiento (específicamente, una mutación hidrófoba) de pUL131A H64 a, por ejemplo, un residuo más hidrófobo voluminoso (tal como triptófano (W)) para introducir interacciones que incrementan la estabilidad térmica del complejo.

4.6 Mutantes estabilizadores diseñados

Como se indica en las secciones anteriores, los inventores realizaron análisis computacional (resumido anteriormente en el ejemplo 3.3), procesaron esos datos por inspección y manipulación manual (resumido anteriormente en los ejemplos 4.1-4.5) y, por lo tanto, diseñaron mutaciones dentro de gH, gL, pUL128, pUL130 y pUL131A para, cuando están solos o combinados, mejorar la estabilidad de un complejo que los comprende. En tanto que no se desea que se limite por teoría, se cree que la flexibilidad conformacional se reduce y la termoestabilidad general de un complejo se incrementa al (A) rellenar de cavidades enterradas entre interfases de dominio con átomos de aminoácidos elaborados de cadenas laterales más largas que las que se encuentran en la proteína tipo silvestre, al (B) incrementar los contactos de residuos vecinos o el reemplazo de cúmulos desfavorables de residuos cargados, y/o al (C) introducir puentes intra- o interdisulfuro en toda la estructura. Los mutantes diseñados por el inventor de ejemplo para efectuar uno o más de A-C se listan en las tablas 15-21 más adelante.

En tanto que las siguientes tablas se organizan para ejemplificar mutaciones específicas dentro de una subunidad de complejo de pentámero particular, los mutantes diseñados incluyencombinacionesde estas mutaciones (“mutaciones apiladas”, es decir, combinaciones de mutaciones dentro de un polipéptido (por ejemplo, varias mutaciones dentro de gH), así como combinaciones de mutaciones dentro de diferentes polipéptidos (por ejemplo, gH mutante y gL mutante, ambos de los cuales pueden comprender más de una mutación). A modo de ejemplo, un complejo de pentámero de HCMV mutante diseñado por el inventor comprende una cualquiera o más mutaciones listadas en las tablas 20 y 21 más adelante.

Tabla 15:

Tabla 16:

Tabla 17:

Tabla 18:

Tabla 19:

Tabla 20:

En tanto que las tablas anteriores 15-20 ejemplifican mutaciones de puente de disulfuro para la introducción en<una subunidad compleja (por ejemplo, en una de las proteínas de subunidad de complejo de pentámero gH, gL,>pUL128, pUL130 y pUL131A), debido a que los puentes de disulfuro se forman entre dos residuos (dos residuos de cisteína dentro del mismo polipéptido (puente intradisulfuro) o entre dos residuos de cisteína, una cisteína en cada uno de un primer polipéptido y un segundo polipéptido (puente interdisulfuro)), los inventores proporcionan en la tabla 21 más adelante un resumen de mutaciones de puente de disulfuro diseñadascombinadas(numeradas<en la columna más a la izquierda como grupos de mutaciones de puente de disulfuro) para incrementar la>estabilidad de un complejo que las comprende. Las combinaciones de mutaciones de puente de disulfuro proporcionadas en la tabla 21 se pueden apilar (por ejemplo, las mutaciones listadas en el grupo No. 1 se pueden combinar con las mutaciones listadas en el grupo No. 2) o combinar con al menos una mutación de relleno de cavidad y/o mutación de reempaquetamiento listadas en las tablas 15-20 anteriores.

Tabla 21:

4.7 Expresar y purificar un complejo que comprende al menos un muíante diseñado

Un complejo pentamérico de HCMV muestra un despliegue bimodal, que se refleja en que tiene dos valores de punto medio de transición térmica (Tm) (dos picos) en un ensayo de fluorimetría de escaneo diferencial (DSF) (el primer valor de temperatura más bajo se refiere como “Tm1” y el segundo valor de temperatura más alto se refiere como “Tm2”). Una mutación de relleno de cavidad, reempaquetamiento, puente de disulfuro o desglucosilación de la presente invención puede desplazar (es decir, incrementar o disminuir) uno o varios picos de Tm de un complejo. El incremento de un valor de Tm (es decir, el desplazamiento de un pico de Tm hacia la derecha en el gráfico sigmoidal resultante de un ensayo de DSF) se indica con un cambio de temperatura mayor que cero (un cambio de Tm positivo). La disminución de un valor de Tm (es decir, el desplazamiento de un pico de Tm hacia la izquierda) se denota con un cambio de temperatura menor que cero (un desplazamiento de Tm negativo). Para un complejo de pentámero de HCMV, una mutación de la presente invención puede cambiar solo una, o ambas, de Tm1 y Tm2. Para estos experimentos, si una mutación, o combinación de mutaciones, es estabilizadora, neutra o desestabilizadora o no depende del tamaño del cambio de Tm1, cambio de Tm2 o ambos. El incremento de al menos uno de Tm1 y Tm2 por al menos 2 °C en comparación con el control se considera un incremento en la termoestabilidad del complejo de HCMV (es decir, se dice que la mutación o combinación de mutaciones es “estabilizadora” si dan como resultado un cambio de Tm1 o un cambio de Tm2 de al menos 2 °C en comparación con el control). El incremento de al menos uno de Tm1 y Tm2 por al menos 5 °C en comparación con el control se considera un incremento significativo en la termoestabilidad del complejo (es decir, se dice que la mutación o combinación de mutaciones es “significativamente estabilizadora” si dan como resultado un cambio de Tm1 o cambio de Tm2 de al menos 5 °C en comparación con el control). Cuando tanto los valores de cambio de Tm1 como de cambio de Tm2 están entre 2 °C y -2 °C (excluyendo los puntos finales) en comparación con el control, se dice que la mutación o combinación de mutaciones es “neutra”. Cuando al menos uno de los valores de cambio de Tm1 y cambio de Tm2 es -2 °C o menos en comparación con el control, se dice que la mutación o combinación de mutaciones es “desestabilizadora”. En este caso, si el cambio de Tm1, cambio de Tm2, o ambos y/o cualquier efecto sobre la estabilidad no se pudo evaluar debido a, por ejemplo, expresión o cantidad insuficiente de proteína en el ensayo, el mutante o combinación de mutantes se etiquetan como “no concluyente”.

Los complejos pentaméricos de HCMV modificados se expresaron y purificaron como se describe en los ejemplos 1 y 2 anteriores. Cada uno de los complejos pentaméricos de HCMV comprendía al menos un polipéptido de subunidad modificado gH, gL, UL128, UL130 y pUL131A, en donde el polipéptido de subunidad modificado comprendía las mutaciones que se listan en las tablas 22-23. El complejo de pentámero de HCMV mutante purificado se valoró en un ensayo de fluorimetría de escaneo diferencial (DSF), usando un instrumento Nanotemper Prometheus NT.48. La fluorescencia intrínseca de residuos aromáticos, tal como Tyr y Trp, se obtuvo al excitar a 280 nm de longitud de onda y al medir los espectros de emisión a 330 nm (que representan el estado plegado) y 350 nm (que representan el estado desplegado) sobre una rampa de temperatura (25-85 °C). El software del instrumento se usó para trazar el diferencial de la relación de fluorescencia (350 nm/330 nm), y la temperatura correspondiente al punto de inflexión de la curva se tomó como la temperatura de fusión del complejo de pentámero de HCMV mutante (la Tm). La Tm1 y Tm2 de cada complejo de pentámero de HCMV mutante se comparó con la Tm1 o Tm2 correspondiente de un complejo de pentámero de HCMV de control (no mutante). El complejo de control utilizado fue un complejo de pentámero de HCMV que comprende un fragmento que forma complejo de gH y un polipéptido de gL que tiene mutaciones dentro de un sitio de reconocimiento de proteasa (específicamente, el polipéptido de gH comprendía la secuencia SEQ ID NO: 4; el polipéptido gL comprendía la secuencia SEQ ID NO: 10; el polipéptido pUL128 comprendía la secuencia SEQ ID NO: 14; el polipéptido pUL130 comprendía la secuencia SEQ ID NO: 18; y el polipéptido pUL131A comprendía la secuencia SEQ ID NO: 22). Se calculó cualquier cambio (desplazamiento) en Tm1 y/o Tm2 en comparación con el control, si es posible, y se resume en las tablas 22 y 23. Los números de residuo en las tablas 22 y 23 son con respecto a la secuencia de gH SEQ ID NO: 3, secuencia de gL SEQ ID NO: 7, secuencia de pUL128 SEQ ID NO: 13, secuencia de pUL130 SEQ ID NO: 17 y secuencia de pUL131A SEQ ID NO: 21, respectivamente. Un incremento de al menos 5 °C en la Tm calculada se considera un incremento significativo en la termoestabilidad del complejo. Los complejos de pentámero de HCMV mutante estabilizador descritos en las tablas 22 y 23 se ensayaron para la presencia de epítopos conformacionales tipo silvestre usando tecnología de interferometría de biocapa (BLI) y el anticuerpo 10P3. Todos los complejos listados en la tabla 22 y 23 mantienen el epítopo conformacional de complejo de pentámero de HCMV tipo silvestre reconocido por el anticuerpo 10P3.

4.8 Efecto de las mutaciones diseñadas en la estabilidad del complejo pentamérico

En tanto que algunos de los complejos de pentámero de HCMV mutante producidos por estos métodos eran más termoestables que el control, otros eran de efecto neutro o desestabilizadores. Los complejos de pentámero de HCMV mutante que comprenden mutaciones de disulfuro dentro de los polipéptidos gL y pUL130; polipéptidos pUL128 y pUL130; o dentro de solo el polipéptido pUL128 tenían una termoestabilidad incrementada en comparación con el control (tabla 22). Del mismo modo, los complejos de pentámero de HCMV mutante que comprenden una mutación de relleno de cavidad en el polipéptido gL; polipéptido pUL128; o polipéptido pUL131 tuvieron una termoestabilidad incrementada en comparación con el control (tabla 22).

El apilamiento (combinación) de un tipo de mutación (ver columna A de tabla 23) con un segundo tipo de mutación (ver columna B de tabla 23) también se estabilizó (tabla 23). En particular, la combinación de una mutación de relleno de cavidad dentro de gL con mutaciones de puente de disulfuro dentro de pUL128 y pUL130; la combinación de mutaciones de puente de disulfuro dentro de pUL128 y pUL130 con una mutación de desglucosilación dentro de gL; la combinación de una mutación de reempaquetamiento (hidrófila) dentro de gH con mutaciones de puente de disulfuro dentro de pUL128 y pUL130; la combinación de una mutación de reempaquetamiento (hidrófoba) dentro de gL con mutaciones de puente de disulfuro dentro de pUL128 y pUL130; y la combinación de dos mutaciones de reempaquetamiento (hidrófoba) dentro de pUL131 con una mutación de relleno de cavidad dentro de gL fueron todas estabilizadoras (tabla 23).

Sin desear que se limite por teoría, se cree que estas mutaciones de relleno de cavidad, reempaquetamiento y puente de disulfuro mejoran la termoestabilidad del complejo pentamérico de HCMV al optimizar las interacciones locales o disminuir la flexibilidad conformacional. Del mismo modo, se cree que estas mutaciones de desglucosilación hacen que los epítopos de complejo de pentámero de HCMV sean más accesibles.

Tabla 22:

* *

Estabilizadora: Al menos un cambio de Tm es de 2 °C o más

Neutral: Ambos cambios de Tm están entre 2 °C y -2 °C (excluyendo los puntos finales) Desestabilizadora: Al menos un cambio de Tm es de -2 °C o menos

<No concluyente: No se pudieron determinar el o los cambios de Tm y/o el efecto sobre la termoestabilidad>Tabla 23:

* *

Estabilizadora: Al menos un cambio de Tm es de 2 °C o más

Neutral: Ambos cambios de Tm están entre 2 °C y -2 °C (excluyendo los puntos finales) Desestabilizadora: Al menos un cambio de Tm es de -2 °C o menos

5<No concluyente: No se pudieron determinar el o los cambios de Tm y/o el efecto sobre la termoestabilidad>

Explicacion de secuencias

Secuencias de aminoácidos escritas en dirección de extemo N-terminal a extemo C-terminal, secuencias de ácido 10<nucleico escritas en dirección 5' a 3':>

SEQ ID NO: 1 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-23 están subrayados) (NCBI GI No.: 52139248; NCBI acceso No. YP_081523.1).

MRFGLP5YLIILAVCLF5HLL55RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRN5TVVRENA

ISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGE

QPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYV

KITLTEDFFWTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDA

ALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQ

IQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKL

HKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSS

GRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGI

SYPVSTTWGQ5LIITQTDSQTKCELTRNMHTTH3ITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDV

- |5LFALDPYNEVWSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVWDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC

SEQ ID NO: 2 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH de la cepa Merlin de HCMV que carece de la secuencia de señal (es decir, el polipéptido gH maduro). SEQ ID NO: 2 representa los aminoácidos 24 a 742 de SEQ ID NO: 1.

20

RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFA GP LAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVS KDLASYRSFSQQLKAQDS LGEQ PTTVPP PIDLSIPHVWMPPQTT PHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSIDDDTPMLL IFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVD VLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPT AVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSL VHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATV PAALSIL5TMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTK CELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVWSSPRTHYLMLL KNGTVLEVTDWVDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC

SEQ ID NO: 3 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH de la cepa Merlin de HCMV que carece del dominio transmembrana (TM) y el dominio citoplasmático C-terminal, así como los residuos de ectodominio 716 y 717. SEQ<ID NO: 3 consiste en los aminoácidos 1 a 715 de SEQ ID NO: 1 (los residuos de secuencia señal esperados 1-23>están subrayados). Ver WO 2014/005959 (también publicada como publicación de Estados Unidos Núm.

2016/0159864).

MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENA ISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGE QPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYV KITLTEDFFWTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDA ALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQ IQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKL HKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSS GRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGI SYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDV LFALDPYNEVWS SPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVWDATD

SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH maduro de la cepa Merlin de HCMV y que también carece del dominio TM y el dominio citoplasmático C-terminal. SEQ ID NO: 4 consiste en los aminoácidos 24 a 715 de SEQ ID NO: 1.

RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENAISFNFFQSYNQYYVFHMFRCLFA GPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTT PHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSIDDDTPMLL IFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVD VLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPT AVDLAKRALWT PNQITDITS LVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSL VHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATV PAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTK CELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVWSSPRTHYLMLL KNGTVLEVT DVWDATD

SEQ ID NO: 5 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (NCBI GI No.: 138314; NCBI acceso No. P17176.1).

MRPGLPSYLIVLAVCLLSHLLSSRYGAEAISEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENA ISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGE QPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYV KITLTEDFFWTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDA ALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQ IQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKL HKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSS GRRDHSLERLTRLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYWTNQYLIKGI SYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDV LFALDPYNEVWS SPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVWDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC

SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gH de longitud completa de la cepa AD169 de HCMV (NCBI GI No.: 138313; NCBI acceso No. P12824.1).

MRPGLPPYLTVFTVYLLSHLPSQRYGADAASEALDPHAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWREN AISFNFFQSYNQYYWHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLG QQPTTVFPPIDLSIPHVWMPPQTTPHDWKGSHTT5GLHRFHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLMDELRY VKITLTEDFFWTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKAQLNKHSYLKDSDFLD AALDFNYLDLSALLRNS FHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGTEISIPRALDRQAALL QIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPDQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALQ LHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSS SGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYWTNQYLIKG ISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDD VLFALDFYNEWVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVWDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC

SEQ ID NO: 7 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados) (NCBI GI No.: 39842115; NCBI GenBank acceso No. AAR31659.1).

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALIiTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 8 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL maduro de la cepa Merlin de HCMV que carece de la secuencia señal. SEQ ID NO: 8 consiste en los aminoácidos 31 a 278 de SEQ ID NO: 7.

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 9 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV que comprende una mutación de lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados). SEQ ID NO: 9 consiste en SEQ ID NO: 7 y las mutaciones de recorte A96L, N97S y S98G (que también se subrayan). Ver WO2016/116904.

MCRRPDCGFSF5PGPVILLWCCLLLPIV5SAAVSVAPTAAEKVFAECPELTRRCLLGEVFEGDKYE5WLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 10 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL maduro de la cepa Merlin de HCMV que comprende una mutación de lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa. SEQ ID NO: 10 consiste en los residuos 31-278 de SEQ ID NO: 9 (los residuos de recorte mutantes están subrayados). Ver WO2016/116904.

AA-VSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGyLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLFAH 5RYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 11 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (NCBI GI No.:239909463; NCBI GenBank acceso No. ACS32410.1).

MCRRPDCGFSFSPGPVALLWCCLLLPIVSSATVSVAPTVAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNV TRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDG5PA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 12 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL de longitud completa de la cepa AD 169 de HCMV (NCBI GI No.:2506510; NCBI acceso No. P16832.2).

MCRRPDCGFSFSPGPWLLWCCLLLPIVSSVAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNV TRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 13 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL128 de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-27 están subrayados) (NCBI GI No.: 39842124; NCBI GenBank acceso No. AAR31668.1).

MSPKDLTPFLTALWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 14 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL128 maduro de la cepa Merlin de HCMV que carece de la secuencia señal. SEQ ID NO: 14 consiste en los aminoácidos 28 a 171 de SEQ ID NO: 13.

EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLY LEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 15 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL128 de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (NCBI GI No.:39841882; NCBI GenBank acceso No. AAR31451.1).

MS PKNLTP FLTALWLLLGH SRVPRVRAEECC E FINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYS PEKTAEIRG IVTTMTH5LTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMG YMLO

SEQ ID NO: 16 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL128 de longitud completa de la cepa AD169 de HCMV (NCBI GI No.:59803078; NCBI acceso No. P16837.2).

MS PKDLTPFLTTLWL LLGHS RVPRVRAEECC EFINVNH PPERCYDFKMCNRFTVALRC PDGEVCYSF EKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 17 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL130 de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-25 están subrayados) (NCBI GI No.: 39842125; NCBI acceso No. AAR31669.1).

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPW5TLTANQNPSPPWSKLTY5KPHDAATFYCPFLYPSPPR5PLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 18 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL130 maduro de la cepa Merlin de HCMV que carece de la secuencia señal. SEQ ID NO: 18 consiste en los aminoácidos 26-214 de SEQ ID NO: 17.

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 19 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL130 de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-25 están subrayados) (NCBI GI No.: 239909473; NCBI acceso No. ACS32420.1).

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQ RVLTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQEMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTFTPSAPIPISSFEPVAFAGNFE NRAS

SEQ ID NO: 20 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL130 de longitud completa de la cepa AD169 de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-25 están subrayados). (NCBI UniProtKB acceso No. P16772.1)

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPW5TLTANQNPSPPWSKLTY5KPHDAATFYCPFLYP5PPR5PLQF5GFQ QVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPQTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 21 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL131A de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-18 están subrayados) (NCBI GI No.: 39842126; Nc BI acceso No. AAR31670.1).

MRLCRVWLSVCLCAWLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFD VLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAFHARSLEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 22 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL131A maduro de la cepa Merlin de HCMV. SEQ ID NO: 22 consiste en los aminoácidos 19-129 de SEQ ID n O: 21.

QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFR RQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 23 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL131A de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-18 están subrayados) (NCBI GI No.: 239909474; NCBI acceso No. ACS32421.1).

MRLCRVWLSVCLCAWLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFD VLK RINVTEVSLLIS D FRRQNRRGGTNK RTTFNAAGSLAPHARS LEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 24 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido pUL131A de longitud completa de la cepa AD169 de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-18 están subrayados). (NCBI GI No.:219879712; NCBI GenBank acceso No. DAA06452.1).

SEQ ID NO: 25 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gO de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados). (NCBI GI No.:39842082; NCBI GenBank acceso No. AAR31626.1).

MGKKEMIMVKGIPKIMLLISITFLLLSLINCNVLVNSRGTRRSWPYTVLSYRGKEILKKQKEDILKRLMSTSSDG YRFLMYPSQQKFHAIVISMDKFPQDYILAGPIRNDSITHMWFDFYSTQLRKPAKYVYSEYNHTAHKITLRPPPCG TVPSMNCLSEMLNVSKRNDTGEKGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYIGSNKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRN CTRSFYLWAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQALVKEQPQKKNKKSQSTTTPYLSYTTSTAFNVTTNVT YSATAAVTRVATSTTGYRPDSNFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRNEPFCKPDRNRTAVSEFMKNTHVLIRNET PYTIYGTLDMSSLYYNETMSVENETASDNNETTPTSPSTRFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDKIRNFSLQLPAYGNL

T?FE[IRFAAN15TLN5LWWWS £

SEQ ID NO: 26 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gO maduro de la cepa Merlin de HCMV. SEQ ID NO: 26 consiste en los aminoácidos 31-472 de SEQ ID NO: 25.

CNVLVNSRGTRRSWPYTVLSYRGKEILKKQKEDILKRLMSTSSDGYRFLMYPSQQKFHAIVISMDKFPQDYILAG PIRNDSITHMWFDFYSTQLRKPAKYVYSEYNHTAHKITLRPPPCGTVPSMNCLSEMLNVSKRNDTGEKGCGNFTT FNPMFFNVPRWNTKLYIGSNKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTRSFYLVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNT MRKLKRKQALVKEQPQKKNKKSQ5TTTPYLSYTTSTAFNVTTNVTYSATAAVTRVATSTTGYRPDSNFMKSIMAT QLRDLATWVYTTLRYRNEPFCKPDRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNETMSVENETASDNN ETTPTSPSTRFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDKIKNFSLQLPAYGNLTPPEHRRAANLSTLNSLWWWSQ

SEQ ID NO: 27 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gO de longitud completa de la cepa Towne de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados). (NCBI GI No.:239909431; NCBI acceso No. ACS32378.1).

MGRKGEMRGVFNLFFLMSLTFLLFSFINCKIAVARFRVK5QKAKEEERQLKLRILQELASKTGDYYKFFTFPSQQ KLYNITVEMKQFPPNSILAGPIRNHSITHLWFDFHTTQLRKPAKYVYSEYNHTGQKITFRPPSCGTIPSMTCLSE MLWSRRNNTGEENCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYVGPSKVNVDSQTIYFLGLAALLLRYAQRNCTRSFYLVNA MSRNIFRVPKYINSTKLKNTMRKLKRKQAPVKSISKKSRVSTTTPYSSYTSTIFNVSTNVTYSPIVPTRIPTSTI GYRPDENFMKSILTTQLKDLATWVYTTLRYRDEPFCKPNRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYY NDTMPVENETASDNNKTTPTSPSTRFQRTFIDPMWDYLDSLLFLSEIRNFSLQSSTYGNLTPPEHRRAVNLSTLN SLWWWLQ

SEQ ID NO: 28 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gO de longitud completa de la cepa AD169 de HCMV (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados). (NCBI G i No.: 136968; NCBI UniProtKB acceso No. P16750.1).

MGRKEMMVRDVPKMVFLISISFLLVSFINCKVMSKALYNRPWRGLVLSKIGKYKLDQLiKLEILRQLETTISTKYN VSKQPVKNLTMNMTEFPQYYILAGPIQNYSITYLWFDFYSTQLRKPAKYVYSQYNHTAKTITFRPPPCGTVPSMT CLSEMLNVSKRNDTGEQGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYVGPTKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTHSFY LVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQAPVKEQFEKKAKKTQSTTTPYFSYTTSAALNVTTNVTYSITTA ARRVSTSTIAYRPDSSFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRQNPFCEPSRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYG TLDMSSLYYNETMFVEMKTASDSNKTTPTSPSMGFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDEIRNFSLRSPTYVNLTPPEHR RAVNL3TLtJSLWWWLO

SEQ ID NO: 29 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL de longitud completa de la cepa Merlin de HCMV que comprende una mutación de lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa (los residuos de secuencia señal esperados 1-30 están subrayados). SEQ ID NO: 29 consiste en SEQ ID NO: 7 y las mutaciones de recorte A96I, N97D y S98G (que también se subrayan). Ver WO2016/116904.

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEAIDGVLLDEAFIíDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGPGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 30 - Secuencia de aminoácidos del polipéptido gL maduro de la cepa Merlin de HCMV que comprende una mutación de lo que se cree que es un sitio de reconocimiento de proteasa. SEQ ID NO: 30 consiste en los residuos 31-278 de SEQ ID NO: 29 (los residuos de recorte mutantes están subrayados). Ver WO2016/116904.

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLS0LIRYRPVTPEAID6VLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQT RVNLPAHS RYGPOAVDAR

SEQ ID NO: 31 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos gH de longitud completa SEQ ID NO: 1 (la secuencia corresponde a los pares de bases 109224-111452 de NCBI GenBank acceso No. AY446894.2 (codificado en la dirección 3' a 5')).

ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCATCCTCGCCGTCTGTCTCTTCAGCCACCTACTTTCGTCACGATAT GGCGCAGAAGCCGTATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTCACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGC TTCCTGCGTGAAAATACCACCCAGTGTACCTACAACAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCC ATCAGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTCTTTTTGCGGGTCCT CTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCCTGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTAC GCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCCAGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAAGACAGCCTAGGTGAA CAGCCCACCACTGTGCCACCGCCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCAAACCACTCCACAC GGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCACACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGA CACGATCTACTATTCAGCACCGTCACACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTT AAAATAACACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCTGCTTATCTTC GGCCATCTTCCACGCGTACTTTTCAAAGCGCCCTATCAACGCGACAACTTTATACTACGACAAACTGAAAAACAC GAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATCAACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCC GCACTTGACTTCAACTACCTAGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGGATGTACTC AAGAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCCTTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCA GCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCAAGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAA ATACAAGAATTTATGATCACCTGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCACGGCCGTG GACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCACCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATA CT CTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCCC CCAATGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTA CACAAAACGCACCTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCACGCCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCGTCCAC TCCATGCTGGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACGGGCCTCTGTTCATTGGCCGAGCTA TCACACTTTACGCAGTTGTTAGCTCATCCACACCACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGC GGGCGACGCGATCACTCGCTCGAACGCCTCACGCGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCGCTACCGTTCCCGCC GCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTGGAAACCTTCCCCGACCTGTTTTGCTTGCCGCTCGGC GAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCAGTTATATCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATC TCCTACCCTGTCTCCACCACCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAA CTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGTGGCGCTCAACATTTCGCTAGAAAACTGCGCCTTTTGC CAAAGCGCCCTGCTAGAATACGACGACACGCAAGGCGTCATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTC CT TTTCGCCCTGGATCCCTACAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACT CACTACCTCATGCTTTTGAAAAAC GGTACGGTACTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCCACCGACAGTCGTCTCCTCATGATGTCCGTCTACGCG CTATCGGCCATCATCGGCATCTATCTGCTCTACCGCATGCTCAAGACATGCTGA

SEQ ID NO: 32 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos gH SEQ ID NO: 3 (optimizada por codones para expresión en mamíferos)

ATGAGGCCTGGCCTGCCCTCCTACCTGATCATCCTGGCCGTGTGCCTGTTCAGCCACCTGCTGTCCAGCAGATAC GGCGCCGAGGCCGTGAGCGAGCCCCTGGACAAGGCTTTCCACCTGCTGCTGAACACCTACGGCAGACCCATCCGG TTTCTGCGGGAGAACACCACCCAGTGCACCTACAACAGCAGCCTGCGGAACAGCACCGTCGTGAGAGAGAACGCC ATCAGCTTCAACTTTTTCCAGAGCTACAACCAGTACTACGTGTTCCACATGCCCAGATGCCTGTTTGCCGGCCCT CTGGC CGAGCAGTTCCT GAAC CAGGT GGACCT GACCGAGACACT GGAAAGAT ACCAGCAGCGGCT GAATACCTAC GCCCTGGTGTCCAAGGACCTGGCCAGCTACCGGTCCTTTAGCCAGCAGCTCAAGGCTCAGGATAGCCTCGGCGAG CAGCCTACCACCGTGCCCCCTCCCATCGACCTGAGCATCCCCCACGTGTGGATGCCTCCCCAGACCACCCCTCAC GGCTGGACCGAGAGCCACACCACCTCCGGCCTGCACAGACCCCACTTCAACCAGACCTGCATCCTGTTCGACGGC CACGACCTGCTGTTTAGCACCGTGACCCCCTGCCTGCACCAGGGCTTCTACCTGATCGACGAGCTGAGATACGTG AAGATCACCCTGACCGAGGATTTCTTCGTGGTCACCGTGTCCATCGACGACGACACCCCCATGCTGCTGATCTTC GGCCACCTGCCCAGAGTGCTGTTCAAGGCCCCCTACCAGCGGGACAACTTCATCCTGCGGCAGACCGAGAAGCAC GAGCTGCTGGTGCTGGTCAAGAAGGACCAGCTGAACCGGCACTCCTACCTGAAGGACCCCGACTTCCTGGACGCC GCCCTGGACTTCAACTACCTGGACCTGAGCGCCCTGCTGAGAAACAGCTTCCACAGATACGCCGTGGACGTGCTG AAGTCCGGACGGTGCCAGATGCTCGATCGGCGGACCGTGGAGATGGCCTTCGCCTATGCCCTCGCCCTGTTCGCC GCTGCCAGACAGGAAGAGGCTGGCGCCCAGGTGTCAGTGCCCAGAGCCCTGGATAGACAGGCCGCCCTGCTGCAG ATCCAGGAATTCATGATCACCTGCCTGAGCCAGACCCCCCCTAGAACCACCCTGCTGCTGTACCCCACAGCCGTG GATCTGGCCAAGAGGGCCCTGTGGACCCCCAACCAGATCACCGACATCACAAGCCTCGTGCGGCTCGTGTACATC CTGAGCAAGCAGAACCAGCAGCACCTGATCCCCCAGTGGGCCCTGAGACAGATCGCCGACTTCGCCCTGAAGCTG CACAAGACCCATCTGGCCAGCTTTCTGAGCGCCTTCGCCAGGCAGGAACTGTACCTGATGGGCAGCCTGGTCCAC AGCATGCTGGTGCATACCACC GAGCGGCGGGAGATCTTCATCGT GGAGACAGGCCTGTGTAGCCTGGCCGAGCTG TCCCACTTTACCCAGCTGCTGGCCCACCCTCACCACGAGTACCTGAGCGACCTGTACACCCCCTGCAGCAGCAGC GGCAGACGGGACCACAGCCTGGAACGGCTGACCAGACTGTTCCCCGATGCCACCGTGCCTGCTACAGTGCCTGCC GCCCTGTCCATCCTGTCCACCAT GCAGCCCAGCACCCT GGAAAC CTTCCCCGACCTGTTCTGCCTGCCCCTGGGC GAGAGCTTTAGCGCCCTGACCGTGTCCGAGCACGTGTCCTACATCGTGACCAATCAGTACCTGATCAAGGGCATC AGCTACCCCGTGTCCACCACAGTCGTGGGCCAGAGCCTGATCATCACCCAGACCGACAGCCAGACCAAGTGCGAG CTGACCCGGAACATGCACACCACACACAGCATCACCGTGGCCCTGAACATCAGCCTGGAAAACTGCGCTTTCTGT CAGTCTGCCCTGCTGGAATACGACGATACCCAGGGCGTGATCAACATCATGTACATGCACGACAGCGACGACGTG CTGTTCGCCCTGGACCCCTACAACGAGGTGGTGGTGTCCAGCCCCCGGACCCACTACCTGATGCTGCTGAAGAAC GGCACCGTGCT GGAAG1 T GAC C GACGT GGTGGT GGACGC CACCGAC

SEQ ID NO: 33 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos gL de longitud completa SEQ ID NO: 7.

ATGTGCAGACGGCCCGACTGCGGCTTCAGCTTCTCCCCTGGACCCGTGATCCTGCTGTGGTGCTGCCTGCTGCTG CCTATCGTGTCCTCTGCCGCCGTGTCCGTGGCCCCTACCGCTGCTGAGAAGGTGCCCGCCGAGTGCCCTGAGCTG ACCAGACGCTGTCTGCTGGGCGAGGTGTTCGAGGGCGATAAGTACGAGTCCTGGCTGCGGCCCCTGGTGAACGTG ACCGGCAGAGATGGCCCCCTGTCCCAGCTGATCCGGTACAGACCTGTGACCCCCGAGGCCGCCAACTCCGTGCTG CTGGACGAGGCCTTTCTGGACACCCTGGCCCTGCTGTACAACAACCCCGACCAGCTGCGGGCCCTGCTGACCCTG CTGTCTAGCGACACCGCCCCTCGGTGGATGACCGTGATGCGGGGCTACTCTGAGTGCGGCGACGGCTCCCCTGCC GTGTACACCTGTGTGGACGACCTGTGCCGGGGCTACGACCTGACCAGACTGTCCTACGGCCGGTCTATCTTCACA GAGCACGTGCTGGGCTTCGAGCTGGTGCCCCCCTCCCTGTTCAATGTGGTGGTGGCTATCCGGAACGAGGCCACC CGGACCAATAGAGCCGTGCGGCTGCCTGTGTCTACCGCCGCTGCTCCTGAGGGAATCACCCTGTTCTACGGCCTG TACAACGCCGTGAAAGAGTTCTGCCTGAGACACCAGCTGGACCCCCCTCTGCTGCGGCACCTGGACAAGTACTAC GCCGGCCTGCCCCCCGAGCTGAAGCAGACCAGAGTGAACCTGCCCGCCCACAGCAGATACGGCCCCCAGGCTGTG GACGCCAGG

SEQ ID NO: 34 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos LSG gL de longitud completa SEQ ID NO: 9, la ubicación de la mutación LSG está subrayada.

ATGTGCAGACGGCCCGACTGCGGCTTCAGCTTCTCCCCTGGACCCGTGATCCTGCTGTGGTGCTGCCTGCTGCTG CCTATCGTGTCCTCTGCCGCCGTGTCCGTGGCCCCTACCGCTGCTGAGAAGGTGCCCGCCGAGTGCCCTGAGCTG ACCAGACGCTGTCTGCTGGGCGAGGTGTTCGAGGGCGATAAGTACGAGTCCTGGCTGCGGCCCCTGGTGAACGTG ACCGGCAGAGATGGCCCCCTGTCCCAGCTGATCCGGTACAGACCTGTGACCCCCGAGGCCCTGAGCGGCSTGCTG CTGGACGAGGCCTTTCTGGACACCCTGGCCCTGCTGTACAACAACCCCGACCAGCTGCGGGCCCTGCTGACCCTG CTGTCTAGCGACACCGCCCCTCGGTGGATGACCGTGATGCGGGGCTACTCTGAGTGCGGCGACGGCTCCCCTGCC GTGTACACCTGTGTGGACGACCTGTGCCGGGGCTACGACCTGACCAGACTGTCCTACGGCCGGTCTATCTTCACA GAGCACGTGCTGGGCTTCGAGCTGGTGCCCCCCTCCCTGTTCAATGTGGTGGTGGCTATCCGGAACGAGGCCACC CGGACCAATAGAGCCGTGCGGCTGCCTGTGTCTACCGCCGCTGCTCCTGAGGGAATCACCCTGTTCTACGGCCTG TACAACGCCGTGAAAGAGTTCTGCCTGAGACACCAGCTGGACCCCCCTCTGCTGCGGCACCTGGACAAGTACTAC GCCGGCCTGCCCCCCGAGCTGAAGCAGACCAGAGTGAACCTGCCCGCCCACAGCAGATACGGCCCCCAGGCTGTG GACGCCAGG

SEQ ID NO: 35 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos IDG gL de longitud completa SEQ ID NO: 29, la ubicación de la mutación IDG está subrayada.

ATGTGCAGACGGCCCGACTGCGGCTTCAGCTTCTCCCCTGGACCCGTGATCCTGCTGTGGTGCTGCCTGCTGCTG CCTATCGTGTCCTCTGCCGCCGTGTCCGTGGCCCCTACCGCTGCTGAGAAGGTGCCCGCCGAGTGCCCTGAGCTG ACCAGACGCTGTCTGCTGGGCGAGGTGTTCGAGGGCGATAAGTACGAGTCCTGGCTGCGGCCCCTGGTGAACGTG ACCGGCAGAGATGGCCCCCTGTCCCAGCTGATCCGGTACAGACCTGTGACCCCCGAGGCCATCGATGGC3TGCTG CTGGACGAGGCCTTTCTGGACACCCTGGCCCTGCTGTACAACAACCCCGACCAGCTGCGGGCCCTGCTGACCCTG CTGTCTAGCGACACCGCCCCTCGGTGGATGACCGTGATGCGGGGCTACTCTGAGTGCGGCGACGGCTCCCCTGCC GTGTACACCTGTGTGGACGACCTGTGCCGGGGCTACGACCTGACCAGACTGTCCTACGGCCGGTCTATCTTCACA GAGCACGTGCTGGGCTTCGAGCTGGTGCCCCCCTCCCTGTTCAATGTGGTGGTGGCTATCCGGAACGAGGCCACC CGGACCAATAGAGCCGTGCGGCTGCCTGTGTCTACCGCCGCTGCTCCTGAGGGAATCACCCTGTTCTACGGCCTG TACAACGCCGTGAAAGAGTTCTGCCTGAGACACCAGCTGGACCCCCCTCTGCTGCGGCACCTGGACAAGTACTAC GCCGGCCTGCCCCCCGAGCTGAAGCAGACCAGAGTGAACCTGCCCGCCCACAGCAGATACGGCCCCCAGGCTGTG GACGCCAGG

SEQ ID NO: 36 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos pUL128 de longitud completa SEQ ID NO: 13.

ATGTCCCCCAAGGACCTGACCCCCTTCCTGACCACCCTGTGGCTGCTGCTGGGCCACTCTAGGGTGCCCAGAGTG CGGGC CGAAGAGTGCTGCGAGTT TAT CAACGTGAACCACCCCCCCGAGCGGTGCTACGACTTCAAGATGTGCAAC CGGTTCACCGTGGCCCTGCGGTGCCCTGACGGCGAAGTGTGCTACTCCCCCGAAAAGACCGCCGAGATCCGGGGA ATCGTGACCACAATGACCCACTCCCTGACCAGACAGGTGGTGCACAACAAGCTGACCAGCTGCAACTACAACCCC CTGTACCTGGAAGCCGACGGCCGGATCCGCTGCGGCAAAGTGAACGACAAGGCCCAGTACCTGCTGGGCGCTGCC GGCTCTGTGCCCTACCGGTGGATCAACCTGGAATACGACAAGATCACCCGGATCGTGGGCCTGGACCAGTACCTG GAATCCGTGAAGAAGCACAAGCGGCTGGACGTGTGCCGGGCCAAGATGGGCTATATGCTGCAG

SEQ ID NO: 37 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos pUL130 de longitud completa SEQ ID NO: 17.

ATGCTGCGGCTGCTGCTGCGGCACCACTTCCACTGCCTGCTGCTGTGTGCCGTGTGGGCCACCCCTTGTCTGGCC TCCCCGTGGTCCACCCTGACCGCCAACCAGAACCCCAGCCCCCCCTGGTCCAAGCTGACCTACTCCAAGCCTCAC GACGCCGCTACCTTCTACTGCCCCTTCCTGTACCCCTCCCCACCCCGGTCCCCACTGCAGTTCTCCGGCTTCCAG AGAGTGTCCACCGGCCCTGAGTGCCGGAACGAGACACTGTACCTGCTGTACAACCGCGAGGGCCAGACCCTGGTG GAACGGTCCTCCACCTGGGTGAAAAAAGTGATCTGGTATCTGTCCGGCCGGAACCAGACAATCCTGCAGCGGATG CCTCGGACCGCCTCCAAGCCTTCCGACGGCAACGTGCAGATCTCCGTGGAAGATGCCAAGATCTTCGGCGCCCAC ATGGTGCCCAAGCAGACCAAGCTGCTGAGATTCGTGGTGAACGACGGCACCCGCTACCAGATGTGCGTGATGAAG CTGGAATCCTGGGCCCACGTGTTCCGGGACTACTCAGTGAGCTTCCAAGTCCGACTGACCTTCACCGAGGCCAAC AACCAGACCTACACCTTCTGCACCCACCCCAACCTGATCGTG

SEQ ID NO: 38 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos pUL131A de longitud completa SEQ ID NO: 21.

ATGCGGCTGTGCAGAGTGTGGCTGTCCGTGTGCCTGTGCGCCGTGGTGCTGGGCCAGTGCCAGAGAGAGACAGCC GAGAAGAACGACTACTACCGGGTGCCCCACTACTGGGACGCCTGCTCCAGAGCCCTGCCCGACCAGACCCGGTAC AAATACGTGGAACAGCTGGTGGACCTGACCCTGAACTACCACTACGACGCCTCCCACGGCCTGGACAACTTCGAC GTGCTGAAGCGGATCAACGTGACCGAGGTGTCCCTGCTGATCTCCGACTTCCGGCGGCAGAACAGAAGAGGCGGC ACCAACAAGCGGACCACCTTCAACGCCGCTGGCTCCCTGGCCCCTCACGCCCGGTCCCTGGAATTCTCTGTGCGG CTGTTCGCCAAC

SEQ ID NO: 39 - Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos gO de longitud completa SEQ ID NO: 25 (que corresponde a los pares de bases 108848 - 107454 del acceso GenBank No.<AY446894.2).>

ATGGGGAAAAAAGAGATGATAATGGTGAAAGGCATTCCTAAAATTATGCTCCTGATCTCTATAACGTTCTTGCTC CT TTCCCT CATAAATTGTAAT GTATT GGTAAACT CCAGAGGAACAAGAC GT T C CT GGCCGTATAC CGTGCTAT CT TATCGAGGTAAAGAGATTCTGAAGAAACAGAAGGAAGATATCTTAAAACGATTGATGTCTACATCATCTGACGGA TACCGGT T TTT AATGTACCC CAGTCAGCAAAAAT TTGATGCCAT CGTTATTAG CATGGAT AAATTT CCTCAAGAC TACATTTTAGCGGGTCCCATTAGAAATGATAGCATTACCCATATGTGGTTTGACTTTTACAGTACTCAACTCCGA AAACCAGCCAAGTACGTATATTCCGAATATAATCACACGGCCCACAAAATAACGTTACGACCCCCACCTTGCGGC ACAGTGCCTTCTATGAACTGCCTATCCGAAATGTTAAATGTTTCCAAACGCAATGATACCGGCGAAAAAGGTTGC GGTAATT T CACCACGTT TAAT CCTATGT TTTT CAACGTACCACGTT GGAACACAAAACT GTACATAGGTT CCAAC AAAGTCAACGTGGATAGTCAGACAATCTACTTTTTGGGCCTAACCGCCCTACTTTTACGATACGCGCAACGTAAC TGCACTCGCAGTTTCTACCTGGTTAACGCCATGAGCCGAAATTTATTCCGCGTTCCCAAGTATATTAACGGCACC AAGTTGAAAAACACTATGCGAAAACTCAAACGTAAACAAGCGCTTGTCAAAGAACAACCACAAAAAAAGAATAAG AAATCTCAAAGTACTACTACGCCATATCTTTCCTATACAACGTCTACCGCTTTCAACGTCACCACTAACGTGACT TATAGTGCTACCGCTGCTGTAACGCGGGTTGCCACATCTACGACAGGTTATCGTCCTGATAGTAACTTTATGAAA TCCATTATGGCCACGCAGTTAAGAGATCTCGCAACATGGGTATATACTACTCTGCGGTATCGGAATGAACCCTTT TGTAAACCAGACCGTAACCGTACCGCCGTGTCAGAATTTATGAAAAACACGCACGTACTGATTCGTAACGAAACG CCGTACACTATTTATGGCACTCTTGACATGAGCTCCTTATATTACAACGAAACCATGTCCGTGGAAAACGAAACG GCTTCCGATAATAACGAAACTACACCTACGTCACCATCGACGAGGTTTCAGAGAACGTTCATAGATCCCCTATGG GACTATCTAGACTCGCTGCTGTTTCTAGATAAAATCCGTAACTTTAGCCTCCAGTTACCCGCGTATGGAAATCTT ACCCCGCCGGAACACCGCCGGGCTGCAAATCTATCCACCCTCAAT

SEQ ID NO: 40 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gH de HCMV Merlin SEQ ID NO: 3 que comprende además una mutación G358R (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-23 también están subrayados.

MRPGLP5YLII LAVCLF5HLLSSRYGAEAV5EPLDKAFHI.LLNTYGRPIRFLF.ENTTQCTYNSSLRN5TWRENA ISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGE QPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYV KITLTEDFFWTVSIDDDTPMI<j>I<i>IFGHI<j>PRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHEI<i>LVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDA ALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEARAQVSVPRALDRQAALLQ IQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKL HKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSS GRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGI SYPVSTTWGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDV LFALDPYNEVWSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDWVDATD

SEQ ID NO: 41 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gH de HCMV Merlin SEQ ID NO: 4 que comprende además una mutación G358R (subrayada).

RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTWRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFA GPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTT PHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFWTVSIDDDTPMLL IFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVD VLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEARAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPT AVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSL VHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATV PAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTWGQSLIITQTDSQTK CELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVWSSPRTHYLMLL KNGTVL EVT DVWDAT D

SEQ ID NO: 42 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación N74Q (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCRRPDCGFSF5PGPVILLWCCLLLPIV5SAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYE5WLRPLVQV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 43 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación N74Q (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVQVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 44 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación G140F (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIV5SAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYE5WLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRFYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 45 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación G140F (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWKTVMRFYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 46 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación G145L (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLWV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECLDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 47 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación G145L (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECLDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 48 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación A150C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCKRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVtJV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSFC VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 49 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación A150C (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPCVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLC FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPE ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 50 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación R160C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCCGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 51 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación R160C (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCCGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 52 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación R166C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTCLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNWVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 53 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación R166C (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTCLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQTRVNLPAHS RYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 54 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 9 que comprende además una mutación C233V (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-30 también están subrayados.

MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYE5WLRPLVNV TGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPA VYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGL YNAVKEFVLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR

SEQ ID NO: 55 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa gL de HCMV Merlin SEQ ID NO: 10 que comprende además una mutación C233V (subrayada).

AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEALSGVLLDEAF LDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLG FELVPPSLFNVWAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFVLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPP ELKQT RVNLPAHSRYGEQAVDAR

SEQ ID NO: 56 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además mutaciones M48C y G107C (subrayadas). Los residuos de secuencia señal esperados 1 -27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

M5PKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKCCNRFTVALRCPDGEVCY5PEKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADCRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRL DVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 57 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además mutaciones M48C y G107C (subrayadas).

EECCEFINVNHPPERCYDFKCCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLY LEADCRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 58 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además una mutación V77I (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1 -27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

M5PKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IITTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAG5VPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 59 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además una mutación V77I (subrayada).

EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIITTMTHSLTRQWHNKLT5CNYNPLY LEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 60 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además una mutación S83C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

M5PKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IVTTMTHCLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 61 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además una mutación S83C (subrayada).

EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHCLTRQWHNKLTSCNYNPLY LEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 62 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además una mutación Y98C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNCNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ “

SEQ ID NO: 63 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además una mutación Y98C (subrayada).

EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNCNPLY LEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ ”

SEQ ID NO: 64 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además una mutación LI031 (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVMHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYIEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 65 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además una mutación L103I (subrayada).

EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLY IEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 66 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 13 que comprende además una mutación R142C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-27 también están subrayados. Esta secuencia señal difiere de la secuencia señal de SEQ ID NO: 13 en el residuo 12 (doble subrayado).

MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRG IVTTMTHSLTRQWHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITCIVGLDQYL ESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ

SEQ ID NO: 67 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL128 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 14 que comprende además una mutación R142C (subrayada).

SEQ ID NO: 68 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación Y56C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLA5PW5TLTANQNPSPPWSKLTY5KPHDAATFCCPFLYPSPPRSPLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 69 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación Y56C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFCCPFLYPSPPRSPLQF5GFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDYSVS FQVRLTFT EANNQTYT FCTH PNLIV

SEQ ID NO: 70 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación P62C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPOLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYCSPPR5PLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 71 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación P62C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYCSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDYS VSFQVRLT FTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 72 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación P64C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSCPRSPLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNV<q>Y<s>VEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 73 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación P64C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPFWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSCPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 74 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación E95C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQF5GFQ RVSTGPECRNETLYLLYNRCGQTLVERSSTWVKKVTWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 75 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación E95C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNRCGQTLV ERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDYSVS FQVRLTFT EANNQTYT FCTHPNLIV

SEQ ID NO: 76 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación T167C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVPKQTKLLRFWNDGCRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 77 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación T167C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERSSTWVKKVIWYLS GRNQTILQFMP RTAS KPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVP KQTKLLRFWND GCRYQMCVMK LESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 78 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 17 que comprende además una mutación Y204C (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-25 también están subrayados.

MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPW5TLTANQNPSPPWSKLTY5KPHDAATFYCPFLYP5PPR5PLQFSGFQ RVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAH MVP KQTKLLRFWND GTRYQMCVMKL ESWAHVFRDY SVS FQVRLTFTEANNQTCT FCTHPNLIV

SEQ ID NO: 79 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL130 de HCMV Merlin SEQ ID NO: 18 que comprende además una mutación Y204C (subrayada).

SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLV ERS5TWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTA5KP5DGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFWNDGTRYQMCVMK LESWAHVFRDY SVSFQVRLTFTEANNQTCTFCTHPNLIV

SEQ ID NO: 80 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL131A de HCMV Merlin SEQ ID NO: 21 que comprende además mutaciones Y52F y A67V (subrayadas). Los residuos de secuencia señal esperados 1-18 también están subrayados.

MRLCRVWLSVOLCAW L G QCQRETAEKNDYYRVPHYWDAOSRALPDQTRYKFVEQLVDLTLNYHYDVSHGLDNFD VLKRINVTEVSLLIS DFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGS LAPHARSLEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 81 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL131A de HCMV Merlin SEQ ID NO: 22 que comprende además mutaciones Y52F y A67V (subrayadas).

QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKFVEQLVDLTLNYHYDVSHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFR RQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 82 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL131A de HCMV Merlin SEQ ID NO: 21 que comprende además una mutación S86F (subrayada). Los residuos de secuencia señal esperados 1-18 también están subrayados.

MRLCRVWLS VCLCAWLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTIiNYHYDASHGLDNFD VLKRINVTEVFLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHAR5LEFSVRLFAN

SEQ ID NO: 83 - corresponde a la secuencia de aminoácidos de la cepa pUL131A de HCMV Merlin SEQ ID NO: 22 que comprende además una mutación S86F (subrayada).

QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVFLLISDFR RQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. - Un complejo de pentámero de HCMV modificado que comprende:

(a) un polipéptido pUL128 que tiene cisteína (C) en el residuo 142, numerado con respecto a SEQ ID NO: 13, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 95, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17; (b) un polipéptido gL que tiene una fenilalanina (F) en el residuo 140, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7; (c) un polipéptido gL que tiene una leucina (L) en el residuo 145, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7;

(d) un polipéptido gL que tiene una cisteína (C) en el residuo 150, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 64, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17; (e) un polipéptido pUL128 que tiene una cisteína (C) en el residuo 83, numerado con respecto a SEQ ID NO: 13, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 167, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17;

(f) un polipéptido gL que tiene una cisteína (C) en el residuo 160, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 56, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17; (g) un polipéptido gL que tiene una cisteína (C) en el residuo 166, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 62, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17; (h) un polipéptido pUL128 que tiene una cisteína (C) en el residuo 98, numerado con respecto a SEQ ID NO: 13, y un polipéptido de pUL130 que tiene una cisteína (C) en el residuo 204, numerado con respecto a SEQ ID NO: 17;

(i) un polipéptido pUL131 que tiene una fenilalanina (F) en el residuo 86, numerado con respecto a SEQ ID NO: 21;

(j) un polipéptido pUL128 que tiene una cisteína (C) en el residuo 48 y una cisteína (C) en el residuo 107, numerado con respecto a SEQ ID n O: 13;

(k) un polipéptido pUL128 que tiene una isoleucina (I) en el residuo 77, numerado con respecto a SEQ ID NO: 13; (l) un polipéptido pUL128 que tiene una isoleucina (I) en el residuo 103, numerado con respecto a SEQ ID NO: 13; o

(m) combinaciones de los mismos.

2. El complejo de pentámero de HCMV modificado de la reivindicación 1, que comprende:

(1) (a) y uno de:

un polipéptido gL que tiene glutamina (Q) en el residuo 74, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7;

un polipéptido gL que tiene una fenilalanina (F) en el residuo 140, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7; un polipéptido gL que tiene una leucina (L) en el residuo 145, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7;

un polipéptido gL que tiene una valina (V) en el residuo 233, numerado con respecto a SEQ ID NO: 7; y un polipéptido gH que tiene una arginina (R) en el residuo 358, numerado con respecto a SEQ ID NO: 3;

(2) (b) y un polipéptido pUL131 que tiene una fenilalanina (F) en el residuo 52 y una valina (V) en el residuo 67, numerado con respecto a SEQ ID NO: 21; o

(3) (c) y un polipéptido de pUL131 que tiene una fenilalanina (F) en el residuo 52 y una valina (V) en el residuo 67, numerado con respecto a SEQ ID NO: 21.

3. Una composición inmunogénica que comprende el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 y, opcionalmente, un componente no antigénico.

4. Una molécula de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de polinucleótidos enlazadas de manera operativa que codifican juntas para el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4 o el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Un método para elaborar un complejo de HCMV modificado, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 6.

8. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, para uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra citomegalovirus (CMV).

9. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para uso en la inhibición de la entrada de CMV en una célula.