ES3036124T3 - Millifluidic device for advanced cultures of biological agents - Google Patents

Millifluidic device for advanced cultures of biological agents

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ES3036124T3
ES3036124T3 ES20781074T ES20781074T ES3036124T3 ES 3036124 T3 ES3036124 T3 ES 3036124T3 ES 20781074 T ES20781074 T ES 20781074T ES 20781074 T ES20781074 T ES 20781074T ES 3036124 T3 ES3036124 T3 ES 3036124T3
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Carmen Giordano
Manuela Teresa Raimondi
Luca Izzo
Matteo Lagana'
Diego Albani
Paola Petrini
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Politecnico di Milano
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Abstract

Dispositivo milifluídico para cultivos de agentes biológicos que comprende: un cuerpo principal (11) con al menos un orificio (40) cerrado en su parte inferior; un separador (35); una membrana (36) fijada a dicho separador (35); un tapón (15) que cierra dicho orificio (40); dicho separador (35) está diseñado para colocarse en dicho orificio (40); dicho separador (35) es extraíble de dicho orificio (40); dicha membrana (36) divide dicho orificio (40) en una semicámara superior y una semicámara inferior; un par de tubos (25) para perfundir dicha semicámara inferior; un par de tubos (26) para perfundir dicha semicámara superior; un primer portaobjetos (22) situado centralmente sobre dicho tapón (15); un segundo portaobjetos (42) situado centralmente sobre dicho orificio (40). un cuerpo cilíndrico (41) se eleva desde dicho primer orificio (40) y dicha segunda corredera (42) se coloca sobre la parte superior de dicho cuerpo cilíndrico (41); dicho cuerpo cilíndrico (41) tiene un segundo orificio (43), coaxial a dicho cuerpo cilíndrico (41). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos
La presente invención se refiere a un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos. Existen dispositivos para cultivos celulares, tales como, biorreactores modulares que presentan cámaras de perfusión separadas en las que cada cámara es independiente y está aislada de otras como un circuito de perfusión, pero al mismo tiempo, pueden conectarse por derivación. Estas cámaras son ópticamente accesibles y permiten la inspección del cultivo celular por microscopía óptica estándar y confocal, tanto en luz blanca, en contraste de fase y luz fluorescente.
Un dispositivo, mencionado anteriormente, se describe en la solicitud de patente WO2017/199121 a nombre del mismo solicitante.
En el documento WO2017/091718, se describe otro dispositivo similar.
La finalidad de la presente invención es la de proporcionar un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos que presente una mayor modularidad que los de la técnica conocida.
Otra finalidad es la de proporcionar un dispositivo que permite una mayor facilidad de uso.
Otra finalidad es la de proporcionar un dispositivo que sea simple de fabricar.
Según la presente invención, estas finalidades y otras se consiguen todavía por un dispositivo milifluídico para cultivos de agentes biológicos según la reivindicación 1.
Otras características de la invención se describen en las reivindicaciones subordinadas.
Las ventajas de esta solución en comparación con las soluciones de la técnica conocida son numerosas.
La invención consiste en un dispositivo de sellado para el cultivo perfundido de células o bacterias tanto en suspensión como adhesión, en 2D o 3D para producir soluciones perfundidas que contienen partes derivadas de células (por ejemplo micro/nanovesículas), o moléculas biológicas (por ejemplo, proteína o ADN aislado) o incluso compuestos químicos bioactivos (por ejemplo, fármacos).
El dispositivo consiste en un sistema huésped formado de diferentes cámaras de cultivo/dilución independientes unas de otras, que pueden extraerse y están realizadas con diferentes diámetros/medidas. La extractabilidad permite una siembra celular sencilla en ambos lados de la membrana y la posibilidad de reutilizar el cuerpo del dispositivo sustituyendo las cámaras de cultivo utilizadas por nuevas cámaras y esterilizando de nuevo el cultivo resultante.
Las cámaras alojan una membrana que las separa en dos semicámaras, de un tipo permeable o semipermeable con diferente porosidad o de tipo no permeable, compuesta por diferentes materiales, tales como policarbonato, PET, PVC, TEFLÓN, PDMS, acetato de celulosa, poliéster, poliestireno, nailon y otros.
Las dos semicámaras pueden interconectarse o ser independientes una de otra eligiendo apropiadamente el material y la porosidad de las membranas.
Los cultivos celulares pueden producirse en uno o ambos lados de la membrana, localizada en la cámara de cultivo. El dispositivo es ópticamente accesible con microscopía óptica estándar y en contraste de fase, tanto recta como invertida, tanto en luz blanca como luz fluorescente, y con microscopía confocal. Por tanto, el dispositivo permite la inspección del cultivo celular en ambas cámaras, utilizando las técnicas de microscopía antes mencionadas sin interrumpir el propio cultivo. La accesibilidad óptica permite que el dispositivo se utilice con cualquier tipo de sensor óptico, por ejemplo un sensor para medir pH, oxígeno, dióxido de carbono y permite medir la concentración de solutos en un disolvente perfundido.
El dispositivo puede fabricarse tanto en ausencia como en presencia de electrodos, que son útiles para medir los parámetros eléctricos relevantes para el comportamiento celular y bacteriano y para estimular eléctricamente los cultivos celulares o bacterianos contenidos en cada cámara de cultivo, en una configuración que no compromete la accesibilidad óptica, garantizando así una amplia superficie en contacto con el contenido de la cámara de cultivo. Los electrodos pueden obtenerse conveniente y económicamente por corte por láser a partir de chapas metálicas adecuadas, por ejemplo, realizadas a partir de acero inoxidable o metales preciosos que presentan un espesor comprendido entre 0.05 y 0.2 mm.
El dispositivo es modular debido a varios aspectos.
a) Geometría de la cámara de cultivo perfundido que puede fabricarse también en diferentes tamaños y puede alojar tanto células como bacterias en suspensión, en una monocapa (2D), en gel (3D) o en medios tridimensionales (3D), ya sean solos o interrelacionados a través de la membrana de separación posicionada en la propia cámara de cultivo.
b) Número de cámaras de perfusión, cada una de ellas independiente de las otras como circuito de perfusión, pero al mismo tiempo, conectables entre sí por derivación.
c) Mecanismo de apertura/cierre, puesto que cada cámara de perfusión presenta su propia cubierta que puede accionarse con independencia de las otras cámaras.
En particular, pueden conectarse varios dispositivos entre sí, creando una plataforma multidispositivo capaz de alojar simultáneamente e interrelacionar entre sí diferentes tipos de cultivos celulares y bacterianos o tipos que contienen derivados celulares/bacterianos, concretamente, moléculas químicamente sintetizadas, en las configuraciones descritas anteriormente, tanto para suspensiones como con células adheridas cultivadas en 2D o 3D.
El dispositivo y la plataforma resultante pueden interrelacionarse con sistemas de cultivo bacteriano líquido, ya sea directamente o a través de un sistema dedicado para producir cultivos bacterianos, tanto en condiciones de cultivo líquido estándar, en suspensión como en 2D, así como cultivados en matrices apropiadas en 3D, con una geometría similar a las cámaras de cultivo del dispositivo.
d) Sistema de soporte de membrana, fácilmente extraíble del dispositivo y manipulable. Esta característica hace posible llevar a cabo operaciones de siembra celular y/o llevar a cabo ensayos y mediciones fuera del dispositivo, con técnicas de rutina establecidas. El sistema de soporte extraíble hace posible también cambiar rápidamente la geometría de las cámaras de perfusión, cambiando simplemente el tipo de alojamiento de membrana utilizado, incluso utilizando insertos comercialmente disponibles que sean estériles y adecuados para cultivos celulares. La ventaja de este sistema altamente modular es que es posible establecer diferentes condiciones experimentales en cada cámara, incluso utilizando el mismo cuerpo de base del dispositivo y/o sin tener que volver a montar toda la configuración experimental.
e) Sistema caracterizado por un doble nivel de juntas de sellado diseñadas para aislar las dos trayectorias fluídicas en ambos lados de la membrana y para impedir la fuga de líquido fuera de la cámara.
f) Sistema de seguridad antielevación para los tapones, que consiste en tornillos u otros medios de fijación, que hacen que el sistema sea operativo incluso a alta presión/altas capacidades. Este sistema garantiza el uso del dispositivo incluso durante largos periodos de tiempo y durante la manipulación frecuente para llevar a cabo inspecciones microscópicas, concretamente, cuando se monta establemente dentro un microscopio provisto de un incubador celular.
El dispositivo puede utilizarse para investigación y análisis de moléculas bioactivas dentro de los campos biológico, médico, bioquímico y químico, farmacológico y toxicológico. En general, el dispositivo puede aplicarse a todas aquellas situaciones, conocidas o todavía desconocidas, caracterizado por la necesidad de inspeccionar ópticamente y/o estimular eléctricamente y/o medir eléctricamente parámetros biológicos después de las interacciones entre dos líquidos (iguales o diferentes) que perfunde dos lados de una membrana (o las superficies de un septo no poroso) y que contienen materiales biológicos viables derivados de sistemas vitales o aquellos de naturaleza química en cuya membrana o septo puede ubicarse o no un tercer elemento (adherido o extendido).
Las características y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada de una forma de realización práctica de la misma, ilustrada a título de ejemplo no limitativo en los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva superior, según la presente invención;
La figura 2 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva desde abajo, según la presente invención;
La figura 3 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos sin tapones en una vista en perspectiva superior según la presente invención;
La figura 4 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, sin tapones y sin separadores, en una vista en perspectiva superior según la presente invención;
La figura 5 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos en una vista en perspectiva y en sección según la presente invención;
La figura 6 muestra en una vista en sección una cámara de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos según la presente invención;
La figura 7 muestra un tapón de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos en una vista en perspectiva superior según la presente invención;
La figura 8 muestra un tapón de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos en una vista en perspectiva desde abajo, según la presente invención;
La figura 9 muestra un separador de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva y en sección, según la presente invención;
La figura 10 muestra un primer electrodo de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos según la presente invención;
La figura 11 muestra un segundo electrodo de un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos según la presente invención;
La figura 12 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva y en sección según una primera variante de la presente invención;
La figura 13 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva y en sección, según una segunda variante de la presente invención;
La figura 14 muestra un dispositivo milifluídico para cultivos avanzados de agentes biológicos, en una vista en perspectiva y en sección, según una tercera variante de la presente invención.
Haciendo referencia a las figuras adjuntas, un dispositivo 10 para cultivo celular según la presente invención comprende un cuerpo principal de forma rectangular 11, con dimensiones totales planas de modo que pueda alojarse en un soporte deslizante para microscopía estándar y confocal (por ejemplo: longitud comprendida entre 60 mm y 80 mm, anchura entre 20 y 30 mm, preferentemente longitud 68 mm, anchura 25 mm).
El cuerpo principal 11, tal como se muestra, comprende tres cámaras 12, 13 y 14, con un circuito hidráulico independiente.
El número de cámaras puede variar de una a varias según las necesidades.
Las tres cámaras 12, 13 y 14 están provistas cada una de un tapón 15 ovalado y alargado que alcanza los bordes del cuerpo 11. Los rebajes 16 están dispuestos en el borde del cuerpo 11 en el que los extremos de tapón 15 están posicionados a fin de tener una guía para el posicionamiento correcto de los propios tapones 15.
Los tapones 15 comprenden preferentemente dos orificios pasantes 17 colocados en los extremos a fin de fijarlos firmemente en el cuerpo 11 por medio de tornillos. Alternativamente, pueden utilizarse otros medios para fijar los tapones 15 al cuerpo 11, tales como, por ejemplo, ganchos o sistemas de presión.
Los tapones 15 presentan un componente superior sustancialmente plano 20 y un componente inferior de forma cilíndrica 21.
Una corredera de forma preferentemente circular 22 está fijada en el componente superior y central al tapón 15, lo que permite una visión completa del interior de la cámara para uso con microscopios.
Una junta de sellado tórica 23 está dispuesta externamente al componente inferior 21.
Debajo del cuerpo 11, pueden verse dos pares de tubos para cada cámara, los cuales sobresalen perpendicularmente al cuerpo 11 y, más específicamente, salen de un agrandamiento inferior 24 del cuerpo 11 que proporciona espacio para las cámaras 12-14.
Un par de tubos internos 25, con un tubo de entrada y un tubo de salida, para una primera semicámara (que se definirá a continuación) y un par de tubos externos 26 con un tubo de entrada y un tubo de salida para una segunda semicámara.
Los orificios roscados 30 pueden verse en el cuerpo 11 que corresponden a los orificios 17 para fijar los tapones 15 sobre el cuerpo 11 por medio de tornillos 27.
Una vez que se retiran los tapones 15, pueden verse los separadores 35 que permiten que cada una de las cámaras 12-14 se dividan en dos semicámaras.
Los separadores 35 presentan un hueco de forma cilíndrica abierto en el fondo y cerrado en la parte superior por una membrana 36 para configurar una forma de vaso dado la vuelta cerrado en la parte superior por la membrana 36.
La membrana 36 separa la semicámara superior de la semicámara inferior.
La membrana 36 puede colocarse (encolarse) en la parte superior de los separadores 35 como se muestra en las figuras 3 y 9, pero puede colocarse en posiciones dentro del separador 35 como se muestra en las figuras 5 y 6, particularmente a una distancia predefinida de la parte superior del separador 35.
En particular, si la membrana 36 se coloca en la parte superior de los separadores 35, la semicámara superior es de 0.3 mm de altura. En el caso de otro posicionamiento de la membrana 36, se hace un separador 35 formado por dos partes que presentan alturas preestablecidas. La membrana 36 se encola en la parte inferior del separador y seguidamente se encola la parte superior del separador, posicionando así la membrana a la altura deseada y obteniendo las dos semicámaras que presentan alturas predefinidas.
El posicionamiento de la membrana 36 permite aumentar o disminuir el volumen de la semicámara superior y, en consecuencia, reducir o aumentar el volumen de la semicámara inferior.
Una junta de sellado tórica 37 está ubicada dentro de los separadores 35, preferentemente en una posición separada de la membrana 36.
Cuando se retiran los separadores 35, las zonas predispuestas para las cámaras pueden verse en el cuerpo 11. Para cada cámara 12-14, hay un orificio 40 en el cuerpo 11 cerrado en la parte inferior. En el centro del orificio 40 y coaxialmente a este, sobresale un cuerpo cilíndrico 41. Una corredera preferentemente circular 42 está colocada en la parte superior del cuerpo cilíndrico 41, lo que permite una vista completa del interior de la cámara, para uso con microscopios.
La corredera 42 puede omitirse si los materiales utilizados hacen que el dispositivo sea transparente.
El interior del cuerpo cilíndrico 41 es hueco y forma un orificio 43 coaxial al cuerpo cilíndrico 41 que está abierto en la parte inferior y cerrado en la parte superior por la corredera 42.
El orificio 43 permite que haya menos material en la trayectoria óptica de los microscopios, permitiendo así una mejor vista del interior de las semicámaras.
El separador 35, que incluye la membrana 36, se pone en su lugar por encima del cuerpo cilíndrico 41.
El separador 35 puede extraerse solamente de su sitio abriendo el tapón 15 y retirándolo, y puede ponerse de nuevo en su sitio insertándolo encima del cuerpo cilíndrico 41.
Los pares de tubos 25 y 26 están alineados lateralmente con el orificio 43 y transversalmente al cuerpo 11. El dispositivo comprende preferentemente dos electrodos eléctricamente conductores, uno para cada semicámara. Los electrodos pueden utilizarse tanto para medir parámetros eléctricos como para estimular eléctricamente los cultivos contenidos en cada cámara de cultivo, tal como, por ejemplo, para medir la resistencia transepitelial/transendotelial para determinar el comienzo de corrientes iónicas que pasan a través de membranas celulares, útiles para estudios fisiológicos y neurobiológicos o para inducir la contracción de tejido, útil para simular contracciones musculares tales como peristalsis.
Un electrodo 50 para la semicámara inferior presenta un cuerpo principal en forma de corona circular 51 con dos barras 52 que se extienden desde el cuerpo circular 51 y están mirando hacia abajo para conexión eléctrica. El electrodo 50 se coloca encima del cuerpo cilíndrico 41 y el cuerpo circular 51 es externo a la corredera 42 y en la zona de la semicámara inferior. Las dos barras 52 sobresalen en la parte inferior del cuerpo 11 (agrandamiento 24).
Un electrodo 55 para la semicámara superior presenta un cuerpo en forma de corona circular principal 56 y presenta algunas barras 57 para facilitar el posicionamiento y una barra 58 más larga que las previas para la conexión eléctrica que se extienden desde el cuerpo circular.
El electrodo 55 está ubicado en un alojamiento sobre el tapón 15, y el cuerpo circular 56 es externo a la corredera 22 y está por debajo de esta, de modo que esté posicionado en la zona de la semicámara superior.
Los electrodos 50 y 55 presentan un cuerpo en forma de corona circular principal, por tanto con un orificio central, lo que no compromete la accesibilidad óptica.
Cada semicámara está sellada y aislada y se comunica con el exterior solo con los pares de tubos 25 y 26. Solo el tipo de membrana 36 determina la permeabilidad entre las dos semicámaras. Por ejemplo, es posible insertar membranas realizadas a partir de policarbonato, PET, PVC, TEFLÓN, PDMS, acetato de celulosa, poliéster, poliestireno, nailon, con una porosidad predefinida.
La junta de sellado interna 37 de los separadores 35 interfiere con la superficie lateral externa del cuerpo cilíndrico 41 y cierra la semicámara inferior, delimitada en la parte superior por la membrana 36, en la parte inferior por la corredera 42 y en los lados por el separador 35.
La junta de sellado externa 23 del tapón 15 interfiere con la superficie lateral interna del orificio 40 y cierra la semicámara superior, delimitada en la parte superior por la corredera 22, en la parte inferior por la membrana 36 y en los lados por el componente inferior 21 del tapón 15 o por el separador 35.
El cuerpo cilíndrico 41, que emerge del orificio 40, forma una base 45, alrededor del cuerpo cilíndrico 41 con una forma de corona circular que actúa como el apoyo de referencia inferior para el tapón 15 (componente inferior 21) y la base del separador 35.
Por tanto, después de abrir el tapón 15 y la extracción del separador 35, cuando tienen que insertarse de nuevo, ambos están posicionados correctamente como en la posición original.
La perfusión de las cámaras tiene lugar a través de los pares de tubos 25 y 26.
La semicámara superior utiliza el par más exterior de tubos 26. Están fijados en un orificio 60 del cuerpo 11 y alcanzan la base 45 y están alineados con la línea en la que el separador 35 y el tapón 15 están dispuestos uno al lado de otro.
Entre el separador 35 y el tapón 15, está predispuesto un paso que alcanza la semicámara superior. Este paso es un par de surcos 61 predispuestos sobre la pared lateral interna del tapón 15 y, para facilitar el flujo interior dentro de la semicámara, el surco continúa también parcialmente en la pared interna superior del tapón 15 hasta que alcanza la corredera 22 y/o el electrodo 55.
Esta trayectoria de fluido puede hacerse convenientemente también por medio de tubos metálicos conectados al tapón y de una sola pieza con el mismo y que están cerca o, mejor aún, se acoplan directamente en el lumen interno de los tubos 26 una vez que se ha ensamblado el dispositivo.
La semicámara inferior utiliza el par más interior de tubos 25. Están fijados en un orificio 65, uno al lado de otro en la pared interna del separador 35 y alcanza un orificio pasante 66, entre el borde externo del separador 35 y la corredera 42
Si está presente el electrodo 50, presenta un biselado 67 en el orificio 66 para permitir que fluya la perfusión.
Los electrodos 50 y 55, realizados a partir de un material eléctricamente conductor, pueden estar presentes o ausentes en el dispositivo según las necesidades.
En una forma de realización del dispositivo, el cuerpo 11 presenta un tamaño de 25 x 68 mm, las semicámaras (superior e inferior) presentan un diámetro medio comprendido entre 5 y 12 mm (preferentemente 10 mm) y una profundidad comprendida entre 0,3 mm y 1,8 mm (preferentemente, 0,3 mm para la semicámara superior y 1,8 mm para la semicámara inferior). En este caso, la membrana 36 se ha colocado encima del separador 35. El dispositivo 10 puede utilizarse para el cultivo de células derivadas de organismos vivos tanto de tipo inmortalizado (es decir, capaz de replicarse indefinidamente en el cultivo) como de tipo primario (es decir, con una capacidad limitada o sin capacidad de replicar en cultivo), tanto en suspensión como en adhesión, en 2D y hospedadas en 3D en medios y matrices poliméricos apropiados. Puede adaptarse también para incubar partes derivadas de células (por ejemplo, microvesículas u orgánulos celulares particulares), así como para bacterias o soluciones que contienen moléculas químicas, incluyendo fármacos.
También puede utilizarse para combinar un cultivo, por ejemplo, neuronas o células endoteliales o bacterias específicas, cultivadas individualmente o en cocultivo, tal como en la microbiota intestinal, en una semicámara, y un cultivo en la otra semicámara, como por ejemplo astrocitos o células sanguíneas o células endoteliales del intestino, con el fin de analizar cómo su interacción es relevante desde el punto de vista fisiológico o patológico.
Según una primera variante de la presente invención, el dispositivo se muestra ahora como un único dispositivo, pero podría estar estructurado, como en el caso anterior, con dos o más dispositivos colocados en un solo cuerpo.
En este caso, el dispositivo único 70 tiene un cuerpo sustancialmente circular 71, y comprende un separador extraíble 72, formado por un disco circular en cuya parte inferior está fijada una membrana 73 que divide el cuerpo 71 en dos semicámaras, una superior y una inferior. El separador 72, cuando se inserta en el cuerpo 71, se apoya en un borde dispuesto en el propio cuerpo 71.
Los canales de perfusión 74 y 75, creados en el interior del cuerpo 71, acceden a las dos semicámaras por los lados y son paralelos a la membrana. Los tubos de conexión (no mostrados) pueden aplicarse posiblemente a los canales 74 y 75.
El dispositivo 70 puede utilizarse de forma independiente o puede utilizarse en combinación con el dispositivo 10.
En particular, es posible cultivar en el dispositivo 70 un cultivo bacteriano ubicado en una semicámara, alimentada por un fermentador o por un cultivo bacteriano en un contenedor adecuado, potencialmente también conectado a un dispositivo que permita la mezcla de bacterias en una matriz polimérica que simule, por ejemplo, el moco intestinal en el caso de cultivos bacterianos en 3D; el secretoma resultante, es decir, el conjunto de moléculas producidas por el cultivo resultante, se transfiere a través de la membrana hacia la otra semicámara y se envía a una o más cámaras del dispositivo 10 para verificar el impacto de las moléculas producidas sobre órganos particulares y sistemas biológicos, en condiciones fisiológicas o patológicas, incluyendo, a modo de ejemplo pero sin limitarse a ello: endotelio intestinal; hígado; sistema inmunológico; barrera hematoencefálica; cerebro. En este caso se utiliza una membrana porosa con una escisión molecular que permite el paso de sustancias pero no de células (típicamente 0,1 micrómetros entre bacterias y secretoma, y 0,4 para las otras semicámaras que alojan cultivos celulares).
Según una segunda variante de la presente invención, la perfusión de la semicámara inferior se realiza como se describe anteriormente, a partir de los tubos 82 que provienen desde abajo y están colocados en el interior del dispositivo, mientras que la perfusión de la semicámara superior se lleva a cabo mediante los tubos 83 ubicados en el tapón 84. Las semicámaras están separadas por la membrana 81, soportada por un pequeño elemento cilíndrico 80, que también puede ser de un tipo ya disponible comercialmente. Por ejemplo, es posible utilizar cámaras compatibles con insertos de cultivo celular de tipo Transwell, producidos por Greiner Bio-One International GmbH, tanto con membranas translúcidas como transparentes.
Según una tercera variante de la presente invención, la perfusión de la semicámara inferior tiene lugar por medio de unos tubos 90 ubicados debajo del dispositivo, la perfusión de la semicámara superior tiene lugar por medio de unos tubos 91 colocados en el tapón, y las dos semicámaras están separadas por un separador 92 que soporta una membrana 93.
Todos los componentes están fabricados a partir materiales plásticos y elastoméricos, y están diseñados para ser producidos mediante moldeo por inyección de materiales plásticos u otro procedimiento de fabricación que pueda aplicarse a escala industrial.
Los materiales, así como las dimensiones y formas utilizadas, pueden ser de cualquier tipo, de acuerdo con las necesidades y el estado de la técnica. Por ejemplo, las cámaras y todos los elementos conectados se han fabricado con forma circular, pero nada impide que se realicen en otras formas, tales como cuadradas u ovaladas.
En otra posible forma de realización, el dispositivo está realizado con cámaras individuales, que pueden dividirse para alojar insertos y membranas disponibles comercialmente y ya utilizados en el campo biológico para cultivos celulares. Ambas partes inferior y superior de estas cámaras contienen una empaquetadura adecuada (por ejemplo, una OR) para interactuar con el inserto comercial y garantizar un sellado hidráulico suficiente para poder perfundir los dos lados de la membrana, de acuerdo con la configuración de los canales descrita anteriormente y las posibles combinaciones de dispositivos. Estas cámaras individuales también están provistas de la conexión mediante tornillos u otros medios mecánicos, adecuados para evitar la división de la cámara bajo la presión ejercida por el fluido de perfusión. Estas cámaras individuales son ópticamente accesibles, como se describe anteriormente para otras configuraciones del dispositivo. Estas cámaras individuales pueden insertarse en un alojamiento adecuado que puede contener varias cámaras y puede alojarse en un microscopio adecuado para inspeccionar el cultivo perfundido a través de los accesos ópticos obtenidos en cada cámara. Estas cámaras individuales pueden alojar electrodos, como se describió previamente para las otras configuraciones, y también pueden conectarse fácilmente entre sí o con otros dispositivos milifluídicos o microfluídicos, tanto en configuración en serie como en paralelo.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Dispositivo milifluídico para cultivos de agentes biológicos, que comprende:
un cuerpo principal (11) que comprende por lo menos una cámara (12-14) con un circuito hidráulico independiente, con un primer orificio (40) cerrado en la parte inferior y provisto de un tapón (15);
un separador (35) diseñado para ser colocado en dicho primer orificio (40) y que permite que dicha cámara (12-14) se divida en una semicámara superior y una semicámara inferior;
una membrana (36) fijada a dicho separador (35) para separar dicha semicámara superior de dicha semicámara inferior;
siendo dicho separador (35) extraíble de dicho primer orificio (40) una vez que se retira el tapón (15); un par de tubos (25) para perfundir dicha semicámara inferior;
un par de tubos (26) para perfundir dicha semicámara superior;
una primera corredera (22) colocada concéntricamente sobre dicho tapón (15);
una segunda corredera (42) colocada concéntricamente sobre dicho primer orificio (40);
un cuerpo cilíndrico (41) se eleva coaxialmente desde dicho primer orificio (40) hacia dicha semicámara inferior; dicha segunda corredera (42) está colocada sobre la parte superior de dicho cuerpo cilíndrico (41); dicho primer orificio (40) está cerrado en la parte inferior por dicha segunda corredera (42);
dicho cuerpo cilíndrico (41) presenta un segundo orificio (43), coaxial a dicho cuerpo cilíndrico (41); dichos pares de tubos (25) y (26) están alineados lateralmente con dicho orificio (43) y transversalmente a dicho cuerpo (11);
la semicámara inferior está delimitada en la parte superior por la membrana (36), en la parte inferior por la corredera (42), y en los lados por el separador (35);
la semicámara superior está delimitada en la parte superior por la corredera (22), en la parte inferior por la membrana (36), y en los lados por un componente inferior (21) del tapón (15) o por el separador (35).
2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha membrana (36) es seleccionada de entre una membrana permeable, una impermeable o una semipermeable.
3. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha membrana (36) está realizada a partir de uno o más de los siguientes materiales: policarbonato, PET, PVC, TEFLÓN, PDMS, acetato de celulosa, poliéster, poliestireno, nailon.
4. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha membrana (36) está colocada en la parte superior de dicho separador (35).
5. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha membrana (36) está colocada a una distancia predefinida de la parte superior de dicho separador (35).
6. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende un primer electrodo conductor (50) para dicha semicámara inferior, que presenta un cuerpo principal en forma de corona circular (51), por tanto con un orificio central; el electrodo (50) está colocado encima del cuerpo cilíndrico (41) y el cuerpo en forma de corona (51) es externo a la corredera (42) y está en la zona de la semicámara inferior.
7. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende un segundo electrodo conductor (55) para dicha semicámara superior, que presenta un cuerpo principal en forma de corona circular (56), por tanto con un orificio central; el electrodo (55) está colocado en un alojamiento sobre el tapón (15), y el cuerpo en forma de corona (56) es externo y está por debajo de la corredera (22), de modo que esté posicionado en la zona de la semicámara superior.
8. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha semicámara superior está aislada fluidodinámicamente de dicha semicámara inferior, únicamente el tipo de membrana determina la permeabilidad entre dichas dos semicámaras.
9. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho separador (35) presenta una forma cilindrica hueca abierta en la parte inferior y cerrada en la parte superior por una membrana (36).
10. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho cuerpo cilíndrico (41) presenta una base (45) con un cuerpo en forma de corona circular que actúa como apoyo de referencia inferior tanto para el tapón (15) como para el separador (35).
11. Uso del dispositivo milifluídico para cultivos de agentes biológicos según la reivindicación 1, para el cultivo celular de células inmortalizadas o primarias, o bacterias, tanto en suspensión como en adhesión, en 2D o 3D, para la creación de soluciones perfundidas que contengan partes derivadas de células (por ejemplo, microvesículas u orgánulos), o moléculas biológicas (por ejemplo, proteínas o ADN aislado), o incluso moléculas bioactivas (por ejemplo, fármacos).
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