ES3036044T3 - Prebiotic for treating disorders associated with disturbed composition or functionality of the intestinal microbiome - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición prebiótica para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos asociados con la composición o funcionalidad alterada del microbioma intestinal en un sujeto, comprendiendo dicho uso la administración oral de la composición prebiótica al sujeto, en donde la composición contiene al menos un 0,1 % en peso de materia seca de polisacáridos RG-I originarios de fruta, zanahoria, guisante, achicoria o remolacha azucarera, teniendo dichos polisacáridos RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y teniendo una estructura principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos alfa(1→4)-galacturónico-alfa(1→2)-ramnosa, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en el polisacárido RG-I está dentro del rango de 20:1 a 1:1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Prebiótico para el tratamiento de trastornos asociados con la composición o funcionalidad alterada del microbioma intestinal.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de prebiótico para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos asociados con una composición o funcionalidad alterada del microbioma intestinal en un sujeto, seleccionándose el trastorno entre sobrepeso, obesidad, resistencia a la insulina y disfunción de la barrera intestinal, comprendiendo dicho método la administración oral de una composición de prebiótico al sujeto, conteniendo dicha composición de prebiótico polisacáridos de ramnogalacturonano I (RG-I) originarios de frutas, zanahorias, guisantes, achicoria o remolacha azucarera.

La invención se refiere además a una composición de prebiótico y a una composición simbiótica adecuadas para su uso en el método de tratamiento antes mencionado.

Antecedentes de la invención

La relación entre la microbiota intestinal y la salud humana está cada vez más reconocida. Actualmente está bien establecido que una microbiota intestinal sana es en gran medida responsable de la salud general del huésped.

El huésped humano proporciona hábitat y nutrición a un ecosistema grande y diverso de comunidades microbianas que desempeñan un papel crucial en la digestión, el metabolismo y la modulación de la función inmunitaria, y que tienen un impacto significativo más allá del tracto gastrointestinal. Los cambios en la diversidad y función de esas comunidades están asociados con consecuencias de largo alcance para la salud del huésped y se han vinculado con una serie de trastornos, incluyendo trastornos funcionales del intestino, enfermedades inflamatorias del intestino y otras enfermedades inmunomediadas (enfermedad celíaca, alergias) y afecciones metabólicas (diabetes tipo 2, NASH). La disbiosis (también llamada disbacteriosis) es un término para un desequilibrio o mala adaptación microbiana en el cuerpo o dentro del mismo, como una microbiota deteriorada. Por ejemplo, las comunidades bacterianas que ocupan ciertas áreas superficiales de un huésped, como la microbiota intestinal, la microbiota de la piel o la microbiota vaginal, pueden modificarse/alterarse, y las especies que típicamente dominan pueden quedar subrepresentadas y las especies que típicamente son superadas o contenidas pueden aumentar hasta niveles no deseados. El conjunto de bacterias en dichas comunidades se denomina colectivamente microbiota. La microbiota local junto con otros microorganismos, como levaduras, hongos, virus y parásitos que residen en dichos nichos, se denominan conjuntamente microbioma. La disbiosis no se limita a desequilibrios en la microbiota, sino que puede también implicar a otros microorganismos del microbioma (por ejemplo, virus, arqueas y hongos).

Cuando un microbioma está bien equilibrado, llamado normobiosis, los microorganismos que ocupan un nicho específico forman una comunidad más o menos estable que está bien adaptada a las condiciones locales, tiene las capacidades metabólicas para vivir del sustrato disponible, maneja efectivamente los factores estresantes y la modulación de la disponibilidad del sustrato, y tiene mecanismos reguladores establecidos que contribuyen a la metaestabilidad de la comunidad y contribuyen a la salud a largo plazo de su huésped.

La disbiosis es estudiada más comúnmente como una afección del tracto gastrointestinal, pero puede afectar cualquier cavidad corporal, mucosa y superficies de la piel pobladas por una comunidad microbiana.

La disbiosis se ha asociado con enfermedades del huésped; por ejemplo, la disbiosis intestinal ha sido asociada con la enfermedad inflamatoria intestinal, el síndrome de fatiga crónica, la obesidad, el cáncer, las afecciones cardiometabólicas, la insensibilidad a la insulina, la (pre)diabetes y vaginosis bacteriana y colitis.

La composición y estabilidad de la microbiota están influenciadas por los antecedentes genéticos del huésped, por las condiciones ambientales o factores estresantes que incluyen, por ejemplo, la dieta, el estilo de vida, el uso de medicamentos - por ejemplo, antibióticos -, y la etapa de desarrollo (edad) del huésped. Esto se traduce en una interacción permanente y compleja entre el huésped y los principales componentes del ecosistema microbiano local. Estos componentes incluyen la microbiota, el sistema inmunitario del huésped, la barrera epitelial local y, en el caso del intestino, el sistema nervioso entérico.

La microbiota del neonato es establecida en sí misma desde el nacimiento y fluctúa notablemente durante las primeras semanas y meses de vida, hasta acercarse a la microbiota central del adulto alrededor de los 3-4 años de edad. Esta colonización microbiana progresiva del intestino es clave para la educación y maduración de los sistemas inmunitario y nervioso entéricos del huésped, la barrera y función intestinales y la programación metabólica del huésped, lo que tiene un impacto en el estado de salud a corto plazo y más adelante en la vida y el riesgo de enfermedades. La microbiota neonatal está influenciada por la dieta y la microbiota maternas, por el modo de parto, por la nutrición del lactante (lactancia materna o fórmula infantil) y por las condiciones ambientales circundantes.

Por el contrario, la microbiota central del adulto sano es más estable en el sentido de que cuando se ve perturbada por diversos factores estresantes (por ejemplo, el uso de antibióticos o medicamentos), vuelve cerca a su composición en sujetos sanos, lo que se denomina resiliencia de la microbiota. La pérdida de variabilidad, ausencia o baja abundancia de los microorganismos benéficos y la pérdida de resiliencia, están asociados con las enfermedades.

La microbiota de las personas mayores o de edad avanzada se está distanciando de la de la población adulta sana debido a cambios en la composición que dan lugar a menos diversidad bacteriana, reducción de microorganismos benéficos y resiliencia reducida. Todos estos cambios están asociados a cambios en el estado de salud.

La microbiota está compuesta por una gran variedad de especies que compiten por espacio y recursos/nutrientes, pero que también pueden alimentarse entre sí con sus respectivos productos de fermentación, dando lugar así a consorcios de microorganismos que, en estado saludable, viven en simbiosis con el huésped mamífero. Una alta diversidad microbiana dentro de la microbiota intestinal es considerada beneficiosa para la salud del huésped, ya que la diversidad hace que la microbiota sea más resistente a los factores que perturban la microbiota intestinal (por ejemplo, antibióticos, cambio en la dieta, invasión de nuevas especies). También son importantes los consorcios de microbios, es decir, combinaciones metaestables de diferentes microorganismos que se alimentan de los productos de fermentación de los demás y juntos forman un ecosistema más o menos estable que prospera en un nicho particular, utilizando el sustrato disponible (por ejemplo, el moco, el desprendimiento de células y la dieta).

Las especies microbianas típicas que se encuentran sobre o dentro del cuerpo son en su mayoría beneficiosas o inofensivas. Los patobiontes o incluso patógenos también forman parte de una microbiota “normal” siempre que se mantengan por debajo de un nivel crítico. La microbiota intestinal de los mamíferos lleva a cabo una serie de funciones útiles y necesarias, como ayudar en la digestión, proporcionar energía a partir de los alimentos, proporcionar (micro)nutrientes específicos al huésped, producir metabolitos clave como ácidos grasos de cadena corta y educar (neonatos y lactantes) o mantener (adultos) el sistema inmunitario del huésped. También ayudan a proteger al cuerpo de la entrada de microbios patógenos o compuestos tóxicos.

Las especies microbianas también excretan muchos tipos diferentes de subproductos de desecho. Al utilizar diferentes mecanismos de eliminación de desechos, en circunstancias normales el cuerpo gestiona efectivamente estos subproductos, con poco o ningún problema. Desafortunadamente, las poblaciones microbianas sobredimensionadas y el predominio inadecuado de especies microbianas, debido a su mayor número, excretan mayores cantidades de estos subproductos. A medida que aumenta la cantidad de subproductos microbianos, los niveles más elevados de subproductos de desecho pueden sobrecargar los mecanismos de eliminación de desechos del cuerpo. Un ejemplo de esto es la formación de amoníaco a partir de la fermentación de proteínas, que puede fermentarse aun más, en compuestos que son perjudiciales para el huésped.

Es el predominio relativo o la subrepresentación de especies microbianas particulares, la baja diversidad y/o la producción alterada de metabolitos microbianos, lo que causa muchos de los síntomas de salud negativos observados en sujetos que padecen disbiosis.

El consumo de probióticos y/o prebióticos puede tener un impacto favorable sobre la microbiota intestinal.

Los probióticos son “microorganismos vivos que, administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del huésped” (definición de la Organización Mundial de la Salud).

Los prebióticos son ingredientes alimentarios no digestibles que afectan beneficiosamente al huésped, al estimular selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o un número limitado de especies microbianas en una comunidad.

La mayoría de los prebióticos conocidos son oligómeros simples de azúcares idénticos (como fructosa, galactosa o arabinosa) unidos por enlaces glucosídicos. Estos estimulan el crecimiento selectivo de especies microbianas que tienen la capacidad metabólica de fermentar (rápidamente) estos sustratos relativamente simples para producir metabolitos beneficios, como los ácidos grasos de cadena corta. Los efectos secundarios típicos del uso de estos sustratos fácilmente fermentables incluyen malestar intestinal, flatulencia y regurgitación. Estos efectos secundarios son causados por la rápida producción fermentativa de gases.

La pectina es un heteropolisacárido estructural que está presente en las paredes celulares primarias de las plantas terrestres.

Los polisacáridos pécticos son un grupo heterogéneo de polisacáridos que comprenden cantidades variables de los siguientes componentes polisacáridos:

(i) homogalacturonano (HG),

(ii) xilogalacturonano (XG),

(iii) apiogalacturonano (AG)

(iv) ramnogalacturonano-I (RG-I), y

(v) ramnogalacturonano-II (RG-II).

La Figura 1 proporciona una representación esquemática de la estructura de los polisacáridos pécticos, incluyendo los 4 componentes polisacáridos mencionados anteriormente. Se observa que los componentes HG, XG y RG-II polisacáridos típicamente representan sólo una fracción menor de polisacáridos pécticos.

Los componentes HG, XG y RG-II polisacáridos comprenden cada uno una columna principal que consiste en una cadena lineal de unidades de monosacárido de ácido D-galacturónico enlazadas por a-(1-4).

Sólo RG-I comprende una columna principal que consiste en una cadena lineal de unidades de disacáridos repetidas: ácido 4)-a-D-galacturónico-(1,2)-a-L-ramnosa-(1. En la Figura 2 se muestra una representación esquemática de la estructura de RG-I.

La composición y la estructura fina del polisacárido péctico varían ampliamente, dependiendo de la fuente vegetal y las condiciones de extracción aplicadas. El dominio de homogalacturonano puede tener una longitud de hasta aproximadamente 100 residuos consecutivos de D-GalA. El dominio de RG-I que contiene las cadenas laterales generalmente se denomina “región ramificada” o “región velluda”, mientras que el dominio de homogalacturonano (entre dos dominios de RG-I) típicamente no está sustituido con oligosacáridos.

Los residuos de GaIA en RG-I están unidos a los residuos Rha a través de las posiciones 1 y 4, mientras que el residuo Rha está unido al residuo de GaIA a través de las posiciones anoméricas y 2-OH. En general, aproximadamente el 20-80% de los residuos de Rha están ramificados en la posición 4-Oh (dependiendo de la fuente vegetal y el método de aislamiento), con cadenas laterales neutras y ácidas. Estas cadenas laterales consisten principalmente en residuos Ara y Gal unidos de diversas maneras y constituyen polímeros conocidos como arabinogalactano I (AG-I) y/o AG-II. El AG I está compuesto por una columna principal de D-Gal unida por beta-(1,4), con sustituciones en 3-OH de grupos alfa-L-arabinosilo; la columna principal Gal puede tener unidades alfa(1,5)-L-Ara intercaladas. El AG-II consiste en galactano altamente ramificado con D-Gal unido por beta(1,3) predominantemente en el interior, con sustituciones de cadenas cortas unidas por (1,6) en el exterior. Este último tiene uniones adicionales de L-Ara enlazadas por (1,3) y/o alfa (1,5). Las cadenas laterales de oligosacáridos pueden ser lineales o ramificadas, y algunas de estas cadenas laterales pueden terminar con residuos de alfa-L-fucósidos, beta-D-glucurónidos y 4-O-metil beta-D-glucuronilo.

Gómez et al.(Prebiotic potential of pectins and pectic oligosaccharides derived from feman pee/ wastes and sugar beet pulp: A comparative evaluation:Journal of Functional Foods, Volumen 20, Enero de 2016, Páginas 108-121) describieron el resultado de un estudio en donde se utilizaron pulpa (SBP) de remolacha azucarera y desechos (LPW) de cáscara de limón, para obtener dos mezclas de oligosacáridos pécticos (denominados SBPOS y LPOS, respectivamente). Se comparó la idoneidad de los oligosacáridos pécticos, las pectinas de SBP y LPW y los FOS comerciales para producir efectos prebióticos mediante fermentaciónin vitroe hibridaciónin situpor fluorescencia, utilizando inóculos fecales humanos y ocho sondas bacterianas diferentes. Las poblaciones conjuntas de bifidobacterias y lactobacilos aumentaron de 19% al 29%, 34% y 32% en cultivos con LPOS, SBPOS y FOS, respectivamente. Los recuentos deFaecalibacteriumyRoseburiatambién aumentaron con todos los sustratos (especialmente con LPOS). Las concentraciones más altas de ácidos orgánicos se observaron en medios que contenían oligosacáridos. De acuerdo con los autores, este trabajo confirma que los oligosacáridos pécticos presentan mejores propiedades prebióticas que las pectinas, y similares o mejores que los FOS.

Chatterjee, et al.(Effect of Fruit Pectin on Growth of Lactic Acid Bacteria,J Prob Health 2016, 4:2) reportan de un estudio en donde se probó el efecto de la pectina extraída de diferentes tipos de desechos de frutas(Musa sp.yCitrus limettay cáscara deCitrullus lanatusy frutos putrefactos deSolanum lycopersicumyPsidium guajava)sobre el crecimiento de Bacterias Ácido Lácticas (LAB) y bifidobacterias(Lactobacillus casei, l. acidophilusyBifidobacterium bifidum).Se observó que la pectina fue capaz de mejorar considerablemente el crecimiento de las bacterias y la acidez titulable. Los autores concluyen que la pectina extraída de los desechos de la fruta puede utilizarse para mejorar el crecimiento de lactobacilos y bifidobacterias.

Babbar, et al.(Pectic oligosaccharides from agricultura/ by-products: production, characterization and health benefits,Crit. Rev. Biotech. 2016; 36(4) 594-606) mencionan que los subproductos agrícolas que contienen pectina son fuentes potenciales de una nueva clase de prebióticos conocidos como oligosacáridos pécticos (POS). La hidrólisis controlada de subproductos agrícolas que contienen pectina como remolacha azucarera, manzana, aceituna y cítricos, mediante tratamiento químico, enzimático e hidrotérmico se pueden utilizar para producir oligogalacturónidos, galactooligosacáridos, oligosacáridos de ramnogalacturonano, etc.

Hoon-kim et al.(Effect of arabinoxylan- and rhamnogalacturonan I-rich polysaccharides isolated from young barley leaf on intestinal immunostimulatory activityJournal of Functional Foods, 2017; 35, 384-390) prepararon cuatro fracciones de polisacáridos de hojas de cebada y compararon la actividad inmunoestimulante intestinalin vitro.Entre las fracciones, una fracción de alto peso molecular preparada mediante extracción (BLE-P) enzimática, mostró potencial para activar la proliferación de células de la médula ósea a través del parche (PP) de Peyer y para estimular la producción de citoquinasin vitro.Se identificó BLE-P como una mezcla de glucuronoarabinoxilano hemicelulósico y ramnogalacturonano I péctico, que representan más del 80%. Posteriormente, se administró BLE-P por vía oral a ratones durante 20 días, para investigar el efecto sobre la actividad inmunoestimulante intestinalin vivo. La administración de BLEP no sólo aumentó la producción de inmunoglobulina A (IgA), sino que también aumentó los niveles de citoquinas relacionadas con IgA, como el factor p de crecimiento transformante y la interleuquina-10.

El documento US 2014/275233 describe un método para tratar la disbiosis gastrointestinal en un sujeto, que comprende administrar por vía oral al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende tejido vegetal aislado que tiene al menos 0.25 mg de contenido de gliceolina por gramo de tejido vegetal. La soja produce tres fitoalexinas muy similares, llamadas gliceolina I, gliceolina II y gliceolina III, cuando la planta está expuesta a microorganismos del suelo, luz ultravioleta (UV) o metales pesados.

El documento WO 2011/069781 describe un polisacárido capaz de modular la respuesta inmunitaria, obteniéndose dicho polisacárido a partir de plantas de la especie Camellia sinensis, en donde la columna principal del polisacárido comprende dominios alternos de ramnogalacturonano-I y dominios de ácido poligalacturónico unidos por alfa(1,4) o de ácido oligogalacturónico unidos por alfa(1,4), en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosilo en la columna principal del polisacárido varía entre 2.5:1 y 1 :1, y en donde el polisacárido tiene un peso molecular de al menos 70 kDa.

El documento WO 2012/148277 describe una preparación con un contenido de materia seca de al menos 20 % en peso, conteniendo dicha preparación al menos 50% en peso de materia seca de una mezcla de polisacáridos pécticos, incluyendo al menos 20%, calculado en peso de los polisacáridos pécticos, de pectinas de ramnogalacturonano-I con un peso molecular de más de 40 kDa, caracterizándose dicha mezcla de polisacáridos pécticos por:

• un grado de metilación de los residuos de ácido galacturónico no superior al 20%;

• un grado de acetilación de los residuos de ácido galacturónico no superior al 20%;

en donde la preparación no forma un gel cuando se diluye con una solución acuosa de bicarbonato de amonio 50 mM, hasta un contenido de sólidos de 2.5 % en peso. También se describe el uso de esta preparación como medicamento para modular la respuesta inmunitaria.

Resumen de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones.

Los inventores han descubierto inesperadamente que los trastornos asociados con una composición o funcionalidad alteradas del microbioma intestinal, en particular el trastorno metabólico o la disfunción de la barrera intestinal, pueden ser tratados terapéutica o profilácticamente mediante la administración oral de polisacáridos de ramnogalacturonano I (RG-I) procedentes de frutas, zanahoria, guisantes, achicoria o remolacha azucarera, teniendo dichos polisacáridos de RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y teniendo una columna principal que comprende dominios de ramnogalacturonano-I y, opcionalmente, dominios de ácido homogalacturónico unidos por alfa(l,4), en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en dicha columna principal está dentro del intervalo de 20:1 a 1:1. Aunque los inventores no desean atarse por la teoría, se cree que los polisacáridos de RG-I actúan como un prebiótico al promover una alta diversidad microbiana dentro de la microbiota intestinal, al estimular el crecimiento o la actividad de bacterias beneficiosas (por ejemploAkkermansia muciniphilayBifidobacterium spp.)y/o aumentando la resiliencia de la microbiota intestinal frente a alteraciones.

Se ha encontrado además que la fermentación intestinal de los polisacáridos de RG-I da lugar a la formación de ácidos grasos de cadena corta beneficiosos. Sorprendentemente, la conversión fermentativa de los polisacáridos de RG-I en ácidos grasos de cadena corta está acompañada de una producción de gas sustancialmente menor que la observada con prebióticos clásicos como, por ejemplo, la inulina.

De acuerdo con ello, un aspecto de la presente invención se refiere a una composición de prebiótico para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos asociados con una composición o funcionalidad alteradas del microbioma intestinal en un sujeto, seleccionándose el trastorno entre sobrepeso, obesidad, resistencia a la insulina y disfunción de la barrera intestinal, comprendiendo dicho uso la administración oral de la composición de prebiótico al sujeto, en donde la composición contiene al menos 0.1 % en peso de materia seca de polisacáridos de RG-I procedentes de frutas, zanahoria, guisantes, achicoria o remolacha azucarera, teniendo dichos polisacáridos de RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y con una columna principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1-4)-galacturónico-alfa(1-2)-ramnosa, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I está dentro del intervalo de 20:1 a 1:1. Los polisacáridos de RG-I que se emplean de acuerdo con la presente invención pueden aislarse de frutas, zanahoria, guisantes, achicoria o remolacha azucarera mediante extracción acuosa, opcionalmente combinada con tratamiento enzimático (utilizando, por ejemplo, poligalacturonasa).

También se divulga, pero no forma parte de la invención, una composición de prebiótico que comprende:

• al menos 0.1% en peso de materia seca de los polisacáridos de RG-I antes mencionados; y

• al menos 1% en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, oligosacáridos de la leche, goma guar, goma Arábiga o cualquier combinación de los mismos.

Todavía otro aspecto de la invención se refiere a una composición simbiótica que comprende:

• al menos 0.1% en peso de materia seca de los polisacáridos de RG-I; y

• 104 a 1010 ufc/gramo deAkkermansia mudniphila

y/o 106 a 1010 ufc/gramo deBifidobacterium spp.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a una composición de prebiótico para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos, asociados con una composición o funcionalidad alteradas del microbioma intestinal en un sujeto, seleccionándose el trastorno entre sobrepeso, obesidad, resistencia a la insulina y disfunción de la barrera intestinal, comprendiendo dicho uso la administración oral de la composición de prebiótico al sujeto, en donde la composición contiene al menos 0.1% en peso de materia seca de polisacáridos de ramnogalacturonano I (RG-I) procedentes de frutas, zanahorias, guisantes, achicoria o remolacha azucarera, teniendo dichos polisacáridos de RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y con una columna principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1-4)-galacturónico-alfa(1-2)-ramnosa, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I está dentro del intervalo de 20:1 a 1:1.

La terminología "trastornos asociados con la composición o funcionalidad alterada del microbioma intestinal", como se utiliza en este documento, abarca la afección disbiótica intestinal (composición alterada) y los trastornos asociados con la producción fermentativa insuficiente de metabolitos esenciales por parte del microbioma intestinal (funcionalidad alterada). Los ácidos grasos de cadena corta (acetato, propionato y butirato) son un ejemplo de estos metabolitos esenciales.

El término "condición disbiótica intestinal", como se utiliza en este documento, se refiere a una afección que afecta negativamente la salud de un sujeto y que es causada por una desviación significativa de un microbioma intestinal equilibrado (normobiosis).

El término "polisacáridos ramificados", como se utiliza en este documento, se refiere a polisacáridos que comprenden una cadena de columna principal lineal de unidades de monosacáridos unidas entre sí por enlaces glucosídicos, en donde al menos una de las unidades de monosacáridos dentro de la cadena de columna principal lleva una cadena lateral de una o más unidades de monosacáridos unidas glucosídicamente.

Los términos "cadena de columna principal" y "columna principal" son sinónimos.

El término "polisacáridos pécticos", como se utiliza en este documento, se refiere a polisacáridos opcionalmente ramificados que tienen un peso molecular superior a 15 kDa y que comprenden una columna principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1-4)-galacturónico-alfa(1-2)-ramnosa.

El término "tramo", como se utiliza en este documento, se refiere a una secuencia de dos o más monosacáridos unidos glucosídicamente dentro de la columna principal de un polisacárido, excluyendo cualquier cadena lateral que esté unida a él.

El término "dominio", como se utiliza en este documento, se refiere a un tramo más cualquier cadena lateral que esté unida a dicho tramo.

El término "tramo de ramnogalacturonano-I" o "tramo de RG-I" se refiere a un tramo que consiste en pares de ácido galacturónico (GalA) y ramnosa (Rha), en donde los residuos de GaIA están unidos a los residuos de Rha a través de las posiciones 1 y 4, mientras los residuos de Rha están unidos al residuo de GaIA a través de las posiciones anoméricas y 2-OH, es decir, residuos alfa(1-4)-galacturónicos alfa(1-2)-ramnosa alternados. Los grupos carboxilo de los residuos de ácido galacturónico dentro de los tramos de RG-I pueden estar esterificados. El ácido galacturónico esterificado puede ocurrir en forma de éster metílico o éster acetílico.

El dominio de RG-I puede comprender cadenas laterales como, por ejemplo, cadenas laterales de galactano, arabinano y arabinogalactano.

El término "polisacárido de ramnogalacturonano-I" o "polisacárido de RG-I" se refiere a un polisacárido péctico opcionalmente ramificado que comprende una columna principal que contiene uno o más tramos de ramnogalacturonano-I.

El término "tramo de ácido galacturónico unido por alfa(l,4)" se refiere a un tramo que consiste en residuos de alfa(1-4)-galacturónico.

Además de los dominios de RG-I, los polisacáridos de RG-I de la presente invención pueden contener uno o más de los siguientes dominios:

• homogalacturonano (HG),

• xilogalacturonano (XG),

• apiogalacturonano (AG)

• ramnogalacturonano-II (RG-II).

Los dominios de XG, AG y RG-II representan típicamente sólo una fracción menor de los polisacáridos de RG-I.

Los dominios de HG, dominios de XG, dominios de AG y de RG-II que están opcionalmente presentes en los polisacáridos de RG-I de la presente invención comprenden una columna principal que consiste en una cadena lineal de dos o más ácidos D-galacturónicos enlazados por a-(1-4). Los grupos carboxilo de los residuos de ácido galacturónico dentro de la columna principal de estos dominios pueden estar esterificados. El ácido galacturónico esterificado puede ocurrir en forma de éster metílico o éster acetílico.

Los dominios de HG no contienen ninguna cadena lateral.

La columna principal de los de dominios XG contiene una o más cadenas laterales en forma de D-xilosa.

La columna principal de los dominios de AG contiene una o más cadenas laterales que están compuestas por uno o más residuos de D-apiosa.

La columna principal de RG-II contiene una o más cadenas laterales que no están compuestas exclusivamente de D-xilosa o D-apiosa.

El término "fruto", como se utiliza en este documento, se refiere a la estructura que porta semillas en las plantas con flores.

El término "prebiótico", como se utiliza en este documento, se refiere a sustancias que inducen selectivamente el crecimiento o la actividad de microorganismos que contribuyen al bienestar de su huésped.

El término "probiótico", como se utiliza en este documento, se refiere a microorganismos que, cuando se administran por vía oral en cantidades adecuadas, proporcionan un beneficio para la salud. Estos microorganismos se seleccionan entre microorganismos viables, microorganismos no viables, fragmentos de microorganismos y combinaciones de los mismos.

El término "simbiótico" se refiere a una composición que contiene una combinación de (a) uno o más prebióticos y (b) uno o más probióticos.

La concentración de diferentes polisacáridos y su composición de monosacáridos puede ser determinada mediante técnicas analíticas conocidas por la persona experta. Después de la hidrólisis ácida, se puede determinar adecuadamente la composición de monosacáridos mediante Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento combinada con Detección Amperométrica de Pulso (HPAEC-PAD).

La distribución del tamaño molecular puede ser determinada mediante Cromatografía de Alto Rendimiento de Exclusión por Tamaño utilizando detección del índice de refracción (IR) (concentración), detección de dispersión de luz (detección de masa molecular), detección UV (indicativa de la presencia de proteínas) y detección de presión diferencial (detección de viscosidad intrínseca).

Los métodos analíticos mencionados anteriormente se describen en: Analytical Biochemistry vol. 207, entrega 1, 1992, pág. 176 (para análisis de azúcar neutro) y en Mol. Nutr. Food Res., vol 61, entrega 1, 2017, 1600243 (para el análisis del ácido galacturónico y la distribución del tamaño molecular).

Todos los porcentajes mencionados en este documento, a menos que se indique de otro modo, se refieren al porcentaje en peso.

El sujeto al que se administra por vía oral la composición que contiene polisacáridos de RG-I de la presente invención es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un sujeto humano. De acuerdo con una realización preferida, el sujeto humano es un bebé (< 4 años) que todavía está desarrollando su microbiota adulta central o una persona mayor (>50 años) en riesgo de perder la diversidad y resiliencia de su microbiota adulta central.

La administración oral, en el contexto del presente método de tratamiento, abarca la autoadministración.

De acuerdo con una realización preferida, el sujeto que recibe la composición que contiene polisacáridos de RG-I administrada oralmente, padece o está en riesgo de padecer un trastorno metabólico. Lo más preferible, el sujeto padece un trastorno metabólico.

Los trastornos metabólicos que pueden tratarse con éxito (terapéutica o profilácticamente) mediante el presente tratamiento incluyen sobrepeso, obesidad o resistencia a la insulina.

El presente tratamiento es especialmente adecuado para el tratamiento terapéutico o profiláctico del sobrepeso u obesidad y resistencia a la insulina.

De acuerdo con otra realización preferida, el sujeto padece o está en riesgo de padecer disfunción de la barrera intestinal. Más preferiblemente, el sujeto padece disfunción de la barrera intestinal.

La barrera intestinal, o barrera mucosa intestinal, se refiere a la propiedad de la mucosa intestinal que asegura la contención adecuada de contenidos luminales indeseables dentro del intestino mientras preserva la capacidad de absorber nutrientes. La separación que proporciona entre el cuerpo y el contenido luminal del intestino evita la transferencia no controlada del contenido luminal hacia el cuerpo. Su función en la protección de los tejidos mucosos y del sistema circulatorio de la exposición frente a patógenos proinflamatorios, toxinas y antígenos es vital para el mantenimiento de la salud y el bienestar. La disfunción de la barrera intestinal se ha relacionado con numerosas afecciones de salud como: alergias alimentarias, infecciones microbianas, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, diabetes y choque séptico.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la composición de prebiótico es utilizada para tratar terapéutica o profilácticamente la afección disbiótica intestinal. El sujeto que recibe tratamiento de una afección disbiótica intestinal de acuerdo con la presente invención, es preferiblemente un sujeto que padece o está en riesgo de padecer una afección disbiótica intestinal patógena, más preferiblemente un sujeto que padece dicha afección disbiótica intestinal patógena. Aquí "patógeno" significa que la afección es capaz de causar o agravar una enfermedad.

De acuerdo con otra realización preferida, la composición de prebiótico se utiliza para aumentar la producción fermentativa intestinal de ácidos grasos de cadena corta.

Los polisacáridos de RG-I que se emplean de acuerdo con la presente invención se originan preferiblemente de una fuente vegetal seleccionada entre manzana, pimiento morrón, arándano, zanahoria, cítricos, uva, guisante, achicoria, remolacha azucarera y aceitunas, ocra y combinaciones de los mismos. Aun más preferiblemente, los polisacáridos de RG-I provienen de una fuente vegetal seleccionada entre manzana (por ejemplo, hollejo de manzana), pimiento morrón, zanahoria, cáscara de cítricos, uva, achicoria, remolacha azucarera (por ejemplo, pulpa de remolacha azucarera), aceituna (por ejemplo, pulpa de aceituna), ocra y combinaciones de las mismas. Lo más preferible es que los polisacáridos de RG-I provengan de la zanahoria o la manzana.

Los polisacáridos de RG-I son incorporados preferiblemente a la composición de prebiótico en forma de un aislado de polisacárido péctico enriquecido en polisacáridos de RG-I. De acuerdo con ello, en una realización particularmente preferida, los polisacáridos de RG-I representan al menos 20 % en peso, más preferiblemente al menos 40 % en peso, incluso más preferiblemente al menos 50 % en peso y lo más preferiblemente al menos 60 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en la composición de prebiótico.

Los polisacáridos de RG-I tienen una columna principal que comprende tramos de ramnogalacturonano-I y, opcionalmente, tramos de ácido homogalacturónico unidos por alfa(1,4). La relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I está dentro del intervalo de 20:1 a 1:1. Preferiblemente, la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I varía de 15:1 a 1:1, más preferiblemente de 12:1 a 1:1, incluso más preferiblemente de 10:1 a 1:1, lo más preferiblemente de 9:1 a 1:1.

Preferiblemente, los residuos de ramnosa representan 3-50%, más preferiblemente 5-50% y lo más preferiblemente 10-50% de los residuos de monosacáridos en la columna principal de los polisacáridos de RG-I.

Típicamente, los residuos de ramnosa suelen representar 3-50%, más preferiblemente 3.5-40% y, lo más preferiblemente, 4-35% de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos de RG-I. Es decir, incluyendo los residuos de monosacáridos que están contenidos en las cadenas laterales.

Los residuos de ácido galacturónico representan típicamente 50-97%, más preferiblemente 50-95% y lo más preferiblemente 50-90% de los residuos de monosacáridos en la columna principal de los polisacáridos de RG-I.

Los residuos de ácido galacturónico representan típicamente 10-80%, más preferiblemente 15-70% y, lo más preferiblemente, 20-65% de todos los residuos de monosacáridos contenidos en los polisacáridos de RG-I. Es decir, incluyendo los residuos de monosacáridos que están contenidos en las cadenas laterales.

Los polisacáridos de RG-I tienen típicamente un peso molecular de al menos 20 kDa. Preferiblemente, los polisacáridos de RG-I tienen un peso molecular entre 25 kDa y 2,000 kDa, más preferiblemente entre 30 kDa y 1,500 kDa, incluso más preferiblemente entre 35 kDa y 1,200 kDa, lo más preferiblemente entre 40 kDa y 1,000 kDa.

El peso molecular promedio de los polisacáridos de RG-I que están contenidos en la presente composición excede preferiblemente 30 kDa, más preferiblemente excede 40 kDa y lo más preferiblemente excede 60 kDa.

Preferiblemente, menos del 85% de los residuos de ácido galacturónico en los polisacáridos de RG-I están esterificados en forma de éster metílico. Más preferiblemente, los polisacáridos de RG-I tienen un grado de esterificación de entre 0% y 70%, más preferiblemente entre 0% y 60%, incluso más preferiblemente entre 0% y 55%, lo más preferiblemente entre 0% y 50%.

Preferiblemente, 0-95% de los residuos de ácido galacturónico en los polisacáridos de RG-I están esterificados en forma de éster acetílico. Más preferiblemente, los polisacáridos de RG-I tienen un grado de esterificación de entre 5% y 90%, más preferiblemente entre 7% y 50%, lo más preferiblemente entre 8% y 30%.

La columna principal de los polisacáridos de RG-I consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa. Si los polisacáridos de RG-I comprenden una o más cadenas laterales, el polisacárido puede contener además residuos de arabinosa y/o galactosa. Además, las cadenas laterales del polisacárido RG-I pueden proporcionar cantidades menores de residuos de los monómeros fucosa, glucosa, ácido glucurónico, xilosa y/o ácido urónico. La una o más cadenas laterales se seleccionan preferiblemente entre cadenas laterales de galactano, cadenas laterales de arabinano y cadenas laterales de arabinogalactano.

La cadena lateral de arabinano comprende al menos uno o más residuos de arabinosa unidos por alfa(1,5) y está sustituida en la posición 4-OH de un residuo de ramnosa en el dominio de RG-I. La cadena lateral de arabinano puede ser lineal o ramificada. En el caso de que la cadena lateral sea lineal, la cadena lateral consta de residuos de arabinosa unidos por alfa(1,5). En caso de que la cadena lateral de arabinano sea una cadena lateral ramificada, uno o más residuos de alfa-arabinosa están unidos al 2-OH y/o 3-OH de las arabinosas unidas por alfa(1,5). La longitud de la cadena lateral de arabinano (expresada como número de unidades monoméricas) está preferiblemente entre 1 y 100 unidades monoméricas, más preferiblemente entre 1 y 50 unidades, incluso más preferiblemente entre 1 y 30 unidades.

La cadena lateral de galactano comprende al menos uno o más residuos de galactosa unidos por beta(1,4) y está sustituida en la posición 4-OH de un residuo de ramnosa en el dominio RG-I.

Preferiblemente, la cadena lateral de galactano es sustancialmente lineal (no ramificada), es decir, menos del 10 % molar de residuos de galactosa dentro de la cadena son residuos de galactosa unidos por beta(1,3) o por beta(1,6), preferiblemente menos del 5 % molar, preferiblemente menos del 2 % molar, preferiblemente menos del 1 % molar. La longitud de la cadena lateral de galactano está preferiblemente entre 1 y 100 unidades de monómero, más preferiblemente entre 1 y 50 unidades, incluso más preferiblemente entre 1 y 30 unidades.

La cadena lateral de arabinogalactano está sustituida en la posición 4-OH de un residuo de ramnosa en el dominio de RG-I y puede ser un arabinogalactano tipo I (AGI) o un arabinogalactano tipo II (AGII). El AGI está compuesto por una columna principal (1-4)-p-D-Galp en la que pueden ocurrir sustituciones por unidades Galp monoméricas en la posiciónO-6o en la O-3. El<a>G<i>está sustituido además con residuos a-L-Araf-p y/o con cadenas laterales cortas (1-5)-a-L-Araf. El AGII está compuesto por una columna principal de a(1-3)-p-D-Galp decorada con cadenas secundarias de (1-6)-p-D-Galp, que están arabinosiladas.

Preferiblemente, la relación molar de residuos de arabinosa a residuos de ramnosa en el polisacárido RG-I no excede 30:1, más preferiblemente no excede 15:1, incluso más preferiblemente no excede 8:1 y lo más preferiblemente no excede 5:1.

La relación molar de residuos de galactosa a residuos de ramnosa en el polisacárido RG-I preferiblemente no excede 30:1, más preferiblemente no excede 15:1, incluso más preferiblemente no excede 8:1 y lo más preferiblemente no excede 5:1.

De acuerdo con una realización preferida, al menos 20% de los residuos de ramnosa en los tramos de RG-I está sustituido en la posición 4-O<h>. Más preferiblemente, al menos el 30%, incluso más preferiblemente al menos el 40%, lo más preferiblemente al menos el 45% de estos residuos de ramnosa está sustituido en la posición 4-OH. Preferiblemente, como máximo el 90%, más preferiblemente como máximo el 80% de estos residuos de ramnosa está sustituido en la posición 4-OH.

La composición de prebiótico para uso en el presente método contiene preferiblemente al menos 0.2%, más preferiblemente 0.3-10% y lo más preferiblemente 0.4-5% en peso de materia seca de los polisacáridos de RG-I como se define en este documento.

La composición de prebiótico para uso en el presente método contiene ventajosamente uno o más prebióticos, además de los polisacáridos de RG-I. Preferiblemente, la composición contiene al menos 1% en peso de materia seca, más preferiblemente al menos 3% en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, oligosacáridos de la leche, goma guar y goma Arábiga.

Se cree que los polisacáridos de RG-I son particularmente efectivos en el presente método de tratamiento, si ya no están enredados en la matriz del material de la pared celular. Por consiguiente, en una realización particularmente preferida, la composición que contiene polisacáridos de RG-I de la presente invención contiene al menos 0.05% en peso de materia seca, más preferiblemente al menos 0.1% en peso de materia seca, incluso más preferiblemente al menos 0.2% en peso de materia seca y lo más preferiblemente al menos 0.3% en peso de materia seca, de polisacáridos de RG-I fácilmente solubles en agua. La concentración de polisacáridos de RG-I fácilmente solubles en agua en la composición que contiene polisacáridos de RG-I puede ser determinada combinando 100 ml de agua desmineralizada (20°C) con una cantidad suficiente de la composición que contiene polisacáridos de RG-I, para proporcionar 2.5 gramos de materia seca, seguido de agitación durante 5 minutos y filtración sobre un filtro de 100 pm. Los polisacáridos de RG del filtrado son polisacáridos de RG-I fácilmente solubles en agua.

De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, la presente composición se administra por vía oral al sujeto durante un período de al menos 2 días, en una cantidad que proporciona al menos 1 mg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día. Más preferiblemente, la cantidad de al menos 4 mg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día, incluso más preferido al menos 15 mg/kg de peso corporal por día, lo más preferido al menos 20-100 mg/kg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día, es proporcionada durante un período de al menos 7 días, lo más preferiblemente durante un período de al menos 14 días, alimentando la composición que contiene los polisacáridos de RG-I.

De acuerdo con otra realización preferida, la composición que contiene polisacáridos de RG-I es administrada por vía oral al sujeto durante un período de al menos 21 días, para proporcionar los polisacáridos de RG-I en una cantidad de al menos 4 mg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día, más preferiblemente 15-300 mg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día.

Se ha encontrado que la composición de prebiótico de la presente invención es capaz de inducir el crecimiento de microorganismos intestinales de los que se cree proporcionan beneficios para la salud, en particularAkkermansia mudniphilayBifidobacterium spp.De acuerdo con ello, en otra realización preferida, la composición que contiene polisacáridos de RG-I es capaz de inducir el crecimiento o la actividad deAkkermansia muciniphilay/oBifidobacterium spp.en la microbiota intestinal del sujeto. Lo más preferible es que la composición sea capaz de inducir el crecimiento o la actividad deAkkermansia muciniphiladentro de la microbiota intestinal del sujeto.

Se encontró que la composición de prebiótico de la presente invención es capaz de inducir la producción de ácidos grasos de cadena corta por la microbiota intestinal, mientras que esto se acompaña de una producción sustancialmente menor de gas, en comparación con los prebióticos clásicos como la inulina. De acuerdo con ello, en otra realización preferida, la composición que contiene polisacáridos de RG-I es capaz de mejorar la producción fermentativa intestinal de ácidos grasos de cadena corta con efectos secundarios reducidos, tales como malestar intestinal, flatulencia y regurgitación, asociados con la producción rápida de gases.

De acuerdo con una realización particularmente preferida la composición se selecciona entre una bebida, una unidad de dosificación oral, un polvo, una barra y un producto para untar.

Típicamente, la bebida es un líquido. Preferiblemente, la bebida contiene al menos 80%en peso, más preferiblemente al menos 85 % en peso de agua. La bebida contiene preferiblemente al menos 1.5 g/l, más preferiblemente al menos 3 g/l y lo más preferiblemente 5-200 g/l de los polisacáridos de RG-I.

La unidad de dosificación oral es preferiblemente una cápsula o un comprimido tableta. La unidad de dosificación oral preferiblemente tiene un peso en el intervalo de 50 a 1500 miligramos, más preferiblemente de 100 a 800 miligramos. La unidad de dosificación oral contiene típicamente al menos 1 % en peso, más preferiblemente al menos 20 % en peso y lo más preferiblemente 40-90 % en peso de los polisacáridos de RG-I.

La composición en la forma de un polvo es preferiblemente un polvo soluble en agua que se puede utilizar para preparar una bebida. Típicamente, el polvo contiene al menos 0.5 % en peso, más preferiblemente al menos 5 % en peso y lo más preferiblemente 10-75 % en peso de los polisacáridos de RG-I.

La composición en la forma de una barra preferiblemente es una barra, preferiblemente una barra que tiene un peso en el intervalo de 10 a 200 gramos, más preferiblemente de 25 a 100 gramos. La barra contiene típicamente al menos 0.1 % en peso, más preferiblemente al menos 0.5 % en peso y lo más preferiblemente 1-20 % en peso de los polisacáridos de RG-I.

La composición en la forma de un producto para untar es preferiblemente una emulsión de agua en aceite, preferiblemente una emulsión de agua en aceite que comprende 20-90 % en peso de una fase grasa y 10-80 % en peso de una fase acuosa. El producto para untar contiene preferiblemente al menos 0.3 % en peso, más preferiblemente al menos 1-10 % en peso y lo más preferiblemente 1.5-16 % en peso de los polisacáridos de RG-I.

También se divulga una composición de prebiótico que comprende:

• al menos 0.1 % en peso de materia seca de los polisacáridos de RG-I tal como se definió anteriormente en este documento; y

• al menos 1%, preferiblemente al menos 3% en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, oligosacáridos de la leche, goma guar y goma Arábiga.

Aún más preferiblemente, el producto contiene al menos 1% en peso de materia seca, más preferiblemente al menos 3% en peso de materia seca de uno o más prebióticos seleccionados entre lactulosa, inulina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos y oligosacáridos de la leche. Las realizaciones preferidas de la composición de prebiótico son las mismas que las descritas en este documento anteriormente, en relación con la composición de prebiótico para su uso en el presente método de tratamiento.

Todavía otro aspecto de la invención se refiere a una composición simbiótica que comprende:

• al menos 0.1% en peso de materia seca de los polisacáridos de RG-I, tal como se definió anteriormente en este documento; y

• 104 a 1010 ufc/gramo deAkkermansia mudniphila

y/o 106 a 1010 ufc/gramo deBifidobacterium spp.

Las realizaciones preferidas de la composición simbiótica son las mismas que las descritas en este documento anteriormente, en relación con la composición de prebiótico para su uso en el presente método de tratamiento. La una o más cepas microbianas probióticas en la composición simbiótica son preferiblemente cepas microbianas vivas, más preferiblemente cepas bacterianas vivas.

La composición simbiótica contiene preferiblemente la una o más cepas microbianas probióticas en una concentración de 104 a 1010 ufc, o su equivalente en caso de que las cepas microbianas probióticas se apliquen en forma no viable. Más preferiblemente, la composición simbiótica contiene la una o más cepas microbianas probióticas en una concentración de 105 a 109 ufc, o su equivalente.

LaAkkermansia muciniphilaestá contenida preferiblemente en la composición de probiótico en una concentración de 105 a 1010 ufc/gramo, más preferiblemente de 106 a 109 ufc/gramo.

ElBifidobacterium spp.está contenido preferiblemente en la composición de probiótico en una concentración de 106 a 1010 ufc/gramo, más preferiblemente de 107 a 109 ufc/gramo .

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se aisló una fracción de polisacárido RG-I del polvo de pimiento morrón seco (Paprika Mild 80-100 Atsa Steamtr- Felix Reverte S.A.) a escala de planta piloto utilizando el procedimiento que se describe a continuación.

El material de pimiento morrón (100 kg) se lavó tres veces bajo un suave lavado con etanol acuoso al 80%, es decir, dos veces a 80°C durante 2 horas y luego durante la noche a temperatura ambiente; cada vez utilizando 12.5% (p/v), para retirar el material soluble en etanol. Se recuperó el residuo insoluble en etanol cada vez mediante centrifugación (1000 G durante 10 min). Se secó el residuo insoluble en etanol obtenido después de los 3 ciclos de lavado y se le sometió a extracción dos veces con 1000 L de agua caliente a una temperatura de 95°C durante 90 minutos. Cada vez, se conservó el sobrenadante después de la centrifugación a 1000 G durante 10 minutos. Se filtró posteriormente el sobrenadante recolectado, a través de una tela y se ultrafiltró utilizando membranas de corte de peso molecular de 2 kDa para retirar el material de peso molecular pequeño. Se obtuvo un extracto seco enriquecido en RG-I, mediante liofilización del retentado, produciendo aproximadamente 5 kg de extracto seco de polisacárido enriquecido en RG-I.

Caracterización del extracto enriquecido en polisacárido de RG-I

Distribución de masa molecular:

La distribución de la masa molecular de las muestras de polisacáridos fue determinada mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño de Alto Rendimiento utilizando detección del índice de refracción (IR) (concentración), detección de dispersión de luz (detección de masa molecular), detección UV (indicativa de la presencia de proteínas) y detección de presión diferencial (detección de viscosidad intrínseca). Se utilizaron estándares de masa molecular de pululano para la calibración.

Composición de monosacáridos:

Se disolvieron las muestras de polisacáridos en ácido trifluoroacético acuoso 0.5 M y se hidrolizaron a 120°C durante 2 horas. Luego se neutralizaron las muestras con NaOH y se mantuvieron congeladas hasta su análisis mediante cromatografía (HPAEC) de intercambio aniónico de alto pH, utilizando detección amperométrica pulsada (PAD). Se determinó el ácido urónico en las muestras utilizando el ensayo colorimétrico de mhidroxidifenilo (Achmed & Labavitch, J. Food Biochem, 1978, 361)) automatizado en un autoanalizador (skalar)

Grado de esterificación

Se trataron las muestras de polisacáridos con hidróxido de sodio (0.25 M, 5 hr, 20°C) y luego se neutralizaron. El metanol liberado fue medido como absorbancia a 420 nm, después de la incubación con alcohol oxidasa combinada con reactivo de desarrollo (acetilacetona y ácido acético en acetato de amonio 2M). Se determinó el ácido acético liberado, utilizando el kit de ensayo de ácido acético K-ACETAF (Megazyme). Se utilizó como estándar pectina de remolacha azucarera con un grado conocido de metilación y acetilación. El grado de esterificación se expresa como cantidad molar de metanol y ácido acético liberado como porcentaje de la cantidad de ácido urónico.

Las características moleculares de la fracción de polisacárido de RG-I se muestran en las Tablas 1a y 1b.

Tabla 1a

Tabla 1b

Relaciones Moleculares Pimiento rojo

Ejemplo 2

Ratones hembra C57BL/6 de seis semanas de edad, libres de patógenos específicos, recibieronad libitumagua potable esterilizada y una dieta semisintética irradiada AIN-93G (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede, Países Bajos) con 30 mmol/kg de calcio (grupo no infectado e infectado) o el mismo alimento suplementado con 1% (p/p) de extracto enriquecido en RG-I de pimiento morrón.

Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento y alojados con 3 ratones por jaula durante 2 semanas y luego individualmente durante otra semana. La composición de la dieta AIN-93G está descrita por Reeves et al.(AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet.J Nutr (1993)123: 1939-1951).

Se recogieron heces antes de la intervención dietética en la línea base del estudio y después de 3 semanas de la intervención dietética. Se extrajo el ADN genómico de muestras fecales siguiendo el protocolo del fabricante (Zymo research). Se sometió el ADNg aislado a identificación microbiana mediante secuenciación del gen ARNr 16S. Se utilizaron cebadores específicos para amplificar por PCR la región genómica de interés, como las regiones V3-V4 o la V4 hipervariable del gen ARNr 16S. Se generaron las lecturas de secuencia de extremos emparejados utilizando el sistema IIlumina MiSeq. Se generaron los archivos de secuencia FASTQ utilizando el canal Casava IIlumina versión 1.8.3. La evaluación de calidad inicial se basó en la filtración IIlumina Chastity. Posteriormente, se retiraron las lecturas que contenían la señal de control PhiX, utilizando un protocolo de filtración interno (Baseclear). Además, se recortaron las lecturas que contenían adaptadores (parciales) (hasta una longitud de lectura mínima de 50pb). La segunda evaluación de calidad se basó en las lecturas restantes utilizando la herramienta de control de calidad FASTQC versión 0.10.0.

Secuenciación de ADN bacteriano

Se analizaron los datos de IIlumina Miseq con un flujo de trabajo que emplea el canal Quantitative lnsights lnto Microbial Ecology (QIIME, v8) (Caporaso et al.,QIIME allows analysis of high- throughput community sequencing data,Nature Methods (2010), 7(5), 335-336 y Edgar,Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST,Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), (2010), 26(19), 2460-2461. Los datos fueron desmultiplexados y filtrados para códigos de barras no coincidentes y fragmentos pequeños (>50nt). Se realizó la selección de o Tu de referencia abierta en QIIME utilizando la base de datos Silva 111 y se detectaron las quimeras mediante USEARCH y se filtraron de los OTUs. A partir de los OTUs filtrados se generó un archivo de bioma y un archivo de árbol filogenético, utilizando nuevamente la base de datos Silva 111. Se generaron más resultados a través de QIIME, como lecturas filtradas por muestra, mediciones de diversidad de árboles completos PD y distribuciones taxonómicas de nivel 1 a 6 con abundancias relativas.

Impacto del extracto de polisacárido enriquecido en RG-I en la composición microbiana

Se sometieron muestras fecales individuales de 12 ratones por grupo a secuenciación de ARNr 16S con Ilumina para obtener más información sobre la composición microbiana. Se obtuvieron entre 26x103 y 79x104 lecturas por muestra. Los resultados se muestran en las tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2

* denota significancia frente a la línea base de RG-I

Tabla 3

* denota significancia frente a la línea base de RG-I

Tabla 4

* denota significancia frente a la línea base de RG-I

A nivel de filo, la adición de extracto de polisacárido enriquecido en RG-I en la dieta aumentó significativamente la abundancia deActinobacteriayVerrucomicrobia,mientras queBacteroidetesyProteobacteriadisminuyeron en su abundancia (> 0.5 % de abundancias; Wilcoxon, P<0.05), lo que resultó en una mayor relación deFirmicutes / Bacteroidetes.

A nivel de género, el análisis de redundancia indicó que la adición de extracto de polisacárido enriquecido en RG-I en la dieta tuvo un impacto significativo en la composición microbiana (P<0.05; permutación de Monte Carlo). La inclusión de extracto de polisacárido enriquecido en RG-I en la dieta produjo una mayor abundancia deBifidobacterium (Phylum Actinobacteria), Allobaculum (Phylum Firmicutes), Akkermansia (Phylum Verrucomicrobia)y el grupo de bacterias No Asignadas.

Ejemplo 3

Los polisacáridos no digestibles son digeridos principalmente en el intestino grueso humano por la microbiota intestinal. Esto puede conducir al crecimiento de bacterias beneficiosas para la salud, bajar el pH, aumentar la resistencia a los patógenos intestinales y modular la actividad metabólica de la microbiota. Los carbohidratos funcionales (prebióticos) beneficiosos promoverán la producción de metabolitos beneficiosos para la salud, como los ácidos grasos de cadena corta (SCFA, es decir, acetato, propionato y butirato) al tiempo que reduce la producción de metabolitos no deseados del metabolismo proteico, como los SCFA ramificados y el amoníaco. Se probaron extractos de polisacáridos derivados de plantas para determinar su impacto en la actividad metabólica de la microbiota utilizando un modelo de incubación de colonias a corto plazo establecido.

Al comienzo de la incubación, se introdujo un medio de colon base empobrecido en azúcar, que contenía nutrientes presentes en el colon (por ejemplo, glicanos derivados del huésped, como la mucina) en botellas de penicilina de 70 mL, que ya contenían los extractos de prueba (concentración final de 5 g/L). Se sellaron con tapones de goma las botellas y se obtuvo la anaerobiosis mediante purga con N2. Posteriormente, se preparó un inóculo fecal humano mezclando una muestra fecal recién recolectada con amortiguador anaeróbico de fosfato. Luego de la homogeneización y retiro de partículas mediante centrifugación (2 min, 500 g), se añadió el inóculo fecal a las diferentes botellas. En este punto se inició la incubación durante un periodo de 48h durante el cual se controló la temperatura a 37 °C y se aseguró una mezcla continua mediante un agitador (90 rpm).

Se tomaron muestras después de 6, 24 y 48 h de incubación para el análisis de pH (Senseline F410; Prosense, Oosterhout, Países Bajos), presión de gas (indicador de presión portátil CPH6200; Wika, Echt, Países Bajos) y SCFA. Los SCFA, es decir acetato, propionato, butirato y SCFA ramificados (isobutirato, isovalerato e isocaproato), se midieron como lo describen De Weirdt et al(Human faecal microbiota display variable patterns of glycerol metabolism,FEMS Microbiol. Ecol. 2010, 74, 601-611.).

El medio de colon empobrecido en azúcar y la lnulina, un prebiótico bien conocido (Beneo, DP >23, ~100% inulina), fueron utilizados como referencia negativa y positiva, respectivamente.

La muestra A fue producida a partir de polvo de pimiento morrón (Paprika poeder, Natural Spices Mijdrecht, Países Bajos) mediante extracción acuosa (10% p/p, 2hr 90 °C), centrifugación para retirar residuos no solubles, filtración (corte de 40 kDa) para retirar moléculas pequeñas y secado para obtener un polvo.

La muestra B fue producida a partir de hollejo de zanahoria seca, el residuo de la producción de jugo de zanahoria (polvo de fibra de zanahoria, GreendFields, Polonia). La muestra B fue producida por extracción acuosa (10% p/p 2 hr 45 °C) utilizando pectinasa (Pectinex® Ultra Mash, Novozymes), inactivación por calor (90 °C, 10 min), retiro de residuos no solubles por decantación, ultrafiltración (corte de 40kDa) y finalmente secado.

La muestra C fue extraída del polvo de hollejo de manzana (hollejo de manzana, Greendfields, Polonia) de la misma manera que la muestra B.

La muestra D fue producida a partir de polvo de Ocra (Ground Okra, My Foods, Blue mountain peak, Reino Unido) utilizando extracción con agua caliente (10% p/p, 2hr a 90 °C), diálisis contra agua durante varias horas para retirar el material de pequeño peso molecular. Luego el extracto dializado fue liofilizado. La determinación de la composición de monosacáridos de las muestras mencionadas anteriormente se realizó como se describe para el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Los resultados de los experimentos de incubación se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6

Los resultados muestran que todos los cuatro extractos de polisacáridos de RG-I derivados de plantas fueron fermentados fácilmente por la microbiota intestinal.

Todos los extractos de polisacáridos de RG-I aumentaron la producción de SCFA. De hecho, se encontró que todos los extractos aumentaban la producción de SCFA a un nivel similar o superior al nivel observado para la inulina.

Todos los extractos de polisacáridos de RG-I disminuyeron la producción de SCFA ramificados y amoníaco. Sorprendentemente, la producción de gas observada para todos los extractos de polisacáridos de RG-I fue sustancialmente menor que la producción de gas observada para la inulina. La producción excesiva de gases puede provocar malestar intestinal e hinchazón, un efecto secundario no deseado bien descrito de la mayoría de los prebióticos clásicos, incluyendo la inulina.

Ejemplo 4

Se prepara una bebida láctea pasteurizada sobre la base de la receta que se muestra en la tabla 7.

Tabla 7

1 aislado de hollejo de zanahoria seco (véase el Ejemplo 3)

El consumo de 200 ml de esta bebida láctea al día por un humano adulto mejora la salud intestinal y proporciona protección adicional contra el resfriado común y la gripe.

Ejemplo 5

Se prepara una barra nutricional (45 g) sobre la base de la receta que figura en la Tabla 8.

Tabla 8

1 aislado de hollejo de zanahoria seco (véase el Ejemplo 3)

La barra se produce como sigue: se mezclan todos los ingredientes húmedos (jarabe, glicerina, mantequilla de almendras y aromas) a 50° C.

Por separado, se mezclan los ingredientes secos, luego se agrega la pasta húmeda a la mezcla seca y la masa se mezcla durante 2 a 5 minutos bajo alto cizallamiento. La masa es cortada en forma de bloque o barra antes de empacarla.

El consumo de 2 barras al día por parte de un humano adulto mejora la salud intestinal y proporciona protección adicional contra el resfriado común y la gripe.

Ejemplo 6

Se prepara un suplemento dietético en forma de una cápsula que contiene la mezcla seca que se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9

1 aislado de hollejo de zanahoria seco (véase el Ejemplo 3)

Ejemplo 7

Se extrajeron fracciones de polisacárido de RG-I de diferentes materiales de origen para realizar pruebas en el modelo de incubación de colonias a corto plazo descrito en el Ejemplo 3. El medio de colon empobrecido en azúcar y la inulina, un prebiótico bien conocido (Beneo, DP >23, ~100% inulina), fueron utilizados como referencia negativa y positiva, respectivamente.

Se produjo la muestra A a partir de cáscaras de guisantes secas y molidas (ex Cosucra, Warcoing, Bélgica). Se dispersó el polvo en agua desmineralizada (100 g/L) y se le sometió a prehidrólisis enzimática con una alfaamilasa termoestable (Megazyme) a 90°C durante 30 min y a hidrólisis posterior utilizando pectinasa (2 hr 45 °C, 0,2 % v/v de Pectinex® Ultra Mash, Novozymes). Se finalizó la enzimólisis calentando a 100°C durante 10 min, seguido de centrifugación (18.000 g, 10 min) y diálisis extensiva del sobrenadante utilizando una membrana con un corte de 12-14 kDa (Visking, Londres, Reino Unido). Posteriormente el material fue liofilizado. Se produjo la muestra B utilizando el mismo método a partir de pulpa de remolacha azucarera seca y molida (exSuiker Unie, dinteloord, PB), omitiendo sin embargo el paso de preincubación con a-amilasa.

Se produjo la muestra C utilizando el mismo método a partir de pulpa de achicoria seca y molida (exCosucra, Warcoing, Bélgica), omitiendo sin embargo el paso de preincubación con a-amilasa.

Se determinó la composición de monosacáridos de las muestras mencionadas anteriormente, utilizando el método descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10

Los resultados de los experimentos de incubación se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11

Estos resultados muestran que estos diferentes extractos de polisacáridos de RG-I derivados de plantas fueron fermentados fácilmente por la microbiota intestinal.

Todos los extractos de polisacárido de RG-I aumentaron la producción de SCFA. De hecho, se descubrió que todos los extractos aumentaban la producción de SCFA a un nivel similar o superior al nivel observado para la inulina.

Todos los extractos de polisacárido de RG-I disminuyeron la producción de SCFA ramificados y amoníaco en comparación con el control del medio.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de prebiótico para su uso en un método de tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos asociados con una composición o funcionalidad alteradas del microbioma intestinal en un sujeto, seleccionándose el trastorno entre sobrepeso, obesidad, resistencia a la insulina y disfunción de la barrera intestinal, comprendiendo dicho uso la administración oral de la composición de prebiótico al sujeto, en donde la composición contiene al menos 0.1% en peso de materia seca de polisacáridos de ramnogalacturonano I (RG-I) procedentes de frutas, zanahoria, guisantes, achicoria o remolacha azucarera, teniendo dichos polisacáridos de RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y una columna principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1-4)-galacturónico-alfa(1-2) ramnosa, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I están dentro del intervalo de 20:1 a 1:1.

2. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición es ingerida por el sujeto durante un periodo de al menos 3 días, en una cantidad que proporciona al menos 1 mg de polisacáridos de RG-I por kg de peso corporal por día.

3. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los polisacáridos de RG-I representan al menos el 20 % en peso de los polisacáridos pécticos presentes en la composición de prebiótico.

4. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I no supera 15:1, preferiblemente no supera 12:1, más preferiblemente no supera 10:1.

5. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación molar de residuos de arabinosa a residuos de ramnosa en el polisacárido de RG-I no supera 30:1.

6. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación molar de residuos de galactosa a residuos de ramnosa en el polisacárido de RG-I preferiblemente no supera 30:1.

7. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde menos de 85% de los residuos de ácido galacturónico en los polisacáridos de RG-I está esterificado en forma de ésteres metílicos.

8. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los polisacáridos de RG-I proceden de una fuente vegetal seleccionada entre zanahoria, manzana, pimiento morrón, cítricos, arándano, uva, guisante, achicoria, remolacha azucarera, aceituna, ocra y combinaciones de los mismos.

9. Composición de prebiótico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sujeto padece o está en riesgo de padecer un trastorno metabólico.

10. Composición de prebiótico para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el sujeto padece o está en riesgo de padecer disfunción de la barrera intestinal.

11. Una composición simbiótica que comprende:

• al menos un 0.1% en peso de materia seca de polisacáridos de ramnogalacturonano I (RG-I) procedentes de zanahoria o manzana, teniendo dichos polisacáridos de RG-I un peso molecular superior a 15 kDa y una columna principal que consiste en residuos de ácido galacturónico y residuos de ramnosa, estando dichos residuos de ramnosa contenidos en residuos de alfa(1-4)-galacturónico-alfa(1-2)-ramnosa, en donde la relación molar de residuos de ácido galacturónico a residuos de ramnosa en los polisacáridos de RG-I está dentro del intervalo de 20:1 a 1:1; y

• 105 a 1010 ufc/gramo deAkkermansia mudniphilay/o 106 a 1010 ufc/gramo deBifidobacterium spp.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11 o una composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la composición se selecciona entre una bebida, una cápsula, un comprimido, un polvo, una barra y un producto para untar.