ES3034019T3 - Veto cells generated from memory t cells - Google Patents

Abstract

Se describe un método para generar una población aislada de células que no inducen la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo estas células inductoras de tolerancia y/o dotadas de actividad antienfermedad, y capaces de anidar en los ganglios linfáticos tras el trasplante. El método comprende: (a) proporcionar una población de al menos un 70 % de linfocitos T de memoria; (b) poner en contacto la población de linfocitos T de memoria con uno o más antígenos para permitir el enriquecimiento de células reactivas a antígeno; y (c) cultivar las células resultantes del paso (b) en presencia de citocinas para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo Tcm. También se describen las células generadas mediante el método, las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células veto generadas a partir de células T de memoria

La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, se refiere a células veto generadas a partir de células T de memoria y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para su fabricación y al uso de las mismas en trasplante y en tratamiento de enfermedades.

Evidencias acumuladas han mostrado que, en seres humanos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sometidas a empobrecimiento de CD45RA muestran reactividad reducida de injerto contra huésped (GvH). La premisa de este enfoque se refiere a la regulación por disminución de la expresión de CD45RA en células T con experiencia con antígeno, por tanto al empobrecer células CD45RA+, se eliminan células T indiferenciadas al tiempo que se conservan células funcionales con experiencia con antígeno, incluyendo células T de memoria. Por consiguiente, el riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) se reduce notablemente y se potencian el injerto, la reconstitución inmunitaria y el injerto contra leucemia/linfoma (GvL) con respecto a enfoques que usan únicamente trasplante de células madre sometido a empobrecimiento de células T (TCD). Adicionalmente, las células T reguladoras (Treg) también pertenecen a la población CD45RA- y pueden contribuir posiblemente a los efectos tolerogénicos demostrados por esta preparación de células. Este enfoque se basa en estudios preclínicos que demuestran que células T de memoria CD4 de ratón, así como células T CD8 de memoria efectoras, carecen de reactividad de injerto contra huésped (GvH) [Anderson BEet al.J Clin Invest (2003) 112(1):101-8].

Sin embargo, Zhenget al.[Zheng H.et al.Immunol. (2009) 182(10):5938-48] demostraron que células T de memoria central CD8+ (Tcm) mostraron GvHD significativa, aunque algo reducida, en comparación con células T indiferenciadas. Considerando que esta GvHD reducida podía estar asociada con una frecuencia reducida de clones alorreactivos en la combinación de células T de memoria con experiencia con antígeno, Juchemet al.cuestionario además las posibles diferencias intrínsecas entre células T indiferenciadas y de memoria que expresaban niveles similares de un transgén de TCR dirigido contra un péptido antigénico que se expresa de manera ubicua en el receptor [Juchem KWet al.Blood. (2011) 118(23):6209-19]. Este estudio demostró que, aunque las células T de memoria efectoras (Tem) presentan una baja reactividad de GvH, quizás debido a diferentes patrones de direccionamiento y/o la capacidad diferencial de estas células para secretar INFy, Tcm muestran una alta reactividad de GvH, comparable a la de células T indiferenciadas [Juchem KW. (2011), citado anteriormente].

Recientemente, dos estudios principales intentaron usar trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) sometido a empobrecimiento de CD45RA+ en pacientes con leucemia [Bleakley M.et al.J Clin Invest. (2015) 125(7):2677-89; Triplett, B.M.et al.Bone Marrow Transplant. (2015) 50(7):968-977], sin embargo, no se eliminaron completamente las apariciones de GvHD. Esto puede deberse al gran número de células T CD45RA+ administradas por infusión y al hecho de que la fracción sometida a empobrecimiento de CD45RA contenía tanto Tem como Tcm, sin tener en cuenta los datos preclínicos que mostraban claramente que Tcm eran potentes inductores de GvHD.

Anteriormente se ha mostrado que células T CD8+ de memoria central derivadas de donante anti-terceros (Tcm veto) soportan injerto de trasplante de médula ósea sometida a empobrecimiento de células T (TDBMT) alogénico en acondicionamiento reducido no mieloablativo, dando como resultado inducción de tolerancia frene a injertos de órganos de tipo de donante, sin provocar GvHD [Ophir, E.et al.Blood. (2013) 121(7):1220-1228].

Además, se han contemplado diversos enfoques para la generación de células de inducción de tolerancia (por ejemplo, células veto) carentes de reactividad de GvH y el uso de las mismas como tratamiento adyuvante para trasplante de injertos, algunos de los cuales se resumen a continuación.

La publicación PCT n.°WO 2001/49243 da a conocer un método para trasplantar un trasplante derivado de un donante a un receptor, el método comprende las etapas de (a) trasplantar el trasplante en el receptor; y (b) administrar al receptor una dosis que incluye linfocitos T citotóxicos (CTL) anti-terceros no alorreactivos, en el que los CTL anti terceros no alorreactivos se generan dirigiendo linfocitos T del donante contra un antígeno o antígenos de terceros (en ausencia de IL-2 exógena), estando la dosis sustancialmente empobrecida en linfocitos T (por ejemplo, células T CD4+ y/o linfocitos citolíticos naturales CD56+) que pueden desarrollarse para dar CTL alorreactivos, previniendo o mejorando de ese modo tanto el rechazo de injerto por el receptor como la enfermedad de injerto contra huésped.

La publicación PCT n.° WO 2007/023491 da a conocer el uso de células tolerogénicas para reducir o prevenir el rechazo de injerto de un injerto no singénico en un sujeto. Las células T reguladoras tolerogénicas dadas a conocer (por ejemplo, células CD4+CD25+) pueden derivarse de cualquier donante que no es singénico tanto con respecto al sujeto como con respecto al injerto (células tolerogénicas “de tercero”). El injerto (por ejemplo, médula ósea) puede derivarse de cualquier donante de injerto que es alogénico o xenogénico con respecto al sujeto.

La publicación PCT n.°WO 2010/049935 da a conocer una población aislada de células que comprenden células anti terceros que no inducen GvHD que tienen un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células de inducción de tolerancia y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante. Según el documento WO 2010/049935, las células se generan mediante: (a) poner en contacto células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no singénicas con un antígeno o antígenos de terceros en condiciones que permiten la eliminación de células reactivas de GVH (por ejemplo, un cultivo privado de citocinas); y (b) cultivar las células resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en condiciones que permiten la proliferación de células que comprenden el fenotipo de Tcm (por ejemplo, en presencia de IL-7 y/o IL-21).

La publicación PCT n.°WO 2012/032526 da a conocer un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que comprende: (a) trasplantar un injerto de células o tejido no singénico en el sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una población aislada de células que comprenden células anti-terceros que no inducen injerto contra huésped (GvHD) que tienen un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células de inducción de tolerancia y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante. Según el documento WO 2012/032526, las células se generan mediante: (a) poner en contacto PBMC con un antígeno o antígenos de terceros en presencia o ausencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminación de células reactivas de GVH (por ejemplo, cultivar durante 1-5 días); y (b) cultivar las células resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antígenos en condiciones que permiten la proliferación de células que comprenden el fenotipo de Tcm (por ejemplo, adicionalmente en presencia de IL-7).

La publicación PCT n.° WO 2013/035099 da a conocer nuevos métodos de generación de una población aislada de células que comprenden células anti-terceros que tienen un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células de inducción de tolerancia y/o estando dotadas de actividad anti-enfermedad, y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante. Según el documento WO 2013/035099, las células se generan mediante: (a) poner en contacto PBMC con un antígeno o antígenos de terceros en presencia de IL-21 para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (b) cultivar las células resultantes de la etapa (a) en presencia de lL-21, IL-15 e IL-7 en un entorno libre de antígenos para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo de Tcm.

OPHIR ERANet al.,da a conocer “ Induction of tolerance to bone marrow allografts by donor-derived host nonreactive ex vivo-induced central memory CD8 T cells”, BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, Estado Unidos, vol. 115, n.° 10, páginas 2095 - 2104.

MARIE BLEAKLEYet al.,da a conocer “Outcomes of acute leukemia patients transplanted with naive T cell-depleted stem cell grafts”, JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, EE. UU. (08/06/2015), vol. 125, n.° 7, páginas 2677 -2689.

B M TRIPLETTet al.,da a conocer“Rapid memory T-cell reconstitution recapitulating CD45RA-depleted haploidentical transplant graft content in patients with hematologic malignancies”, Bo Ne MARROW TRANSPLANt At ION, GB (09/02/2015), vol. 50, n.° 7, páginas 968 - 977.

HONG ZHENGet al.,da a conocer “Central Memory CD8 T Cells Induce Graft-versus-Host Disease and Mediate Graft-versus-Leukemia”, THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, EE. UU. (04/05/2009), vol. 182, n.° 10, páginas 5938 -5948.

Benny J Chenet al.,da a conocer “Inability of memory T cells to induce graft-versus-host disease is a result of an abortive alloresponse”, URL: http://www.bloodjournal.org/content/109/7/3115, (26/09/2017).

E. OPHIRet al.,da a conocer “Murine anti-third-party central-memory CD8+ T cells promote hematopoietic chimerism under mild conditioning: lymph-node sequestration and deletion of anti-donor T cells”, BLOOD, EE. Uu . (05/12/2012), vol. 121, n.° 7, páginas 1220 - 1228.

Sumario de la invención

La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Algunos aspectos de la divulgación se describen en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo ahora referencia específica a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles particulares mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de aspectos de la divulgación. Con respecto a esto, la descripción tomada junto con los dibujos hace que resulte evidente para los expertos en la técnica cómo pueden ponerse en práctica aspectos de la divulgación.

En los dibujos:

La figura 1 es una ilustración esquemática de un modelo de trasplante de médula ósea sometida a empobrecimiento de células T (TDBMT) en acondicionamiento reducido usando células Tcm veto derivadas de células T de memoria CD44+CD8+ a partir de ratones inmunizados con OVA.

La figura 2A es un gráfico que ilustra que células Tcm veto preparadas a partir de la población entera de células con experiencia con antígeno (CD8+CD44+) tras la inmunización de ratones OT1 con ovoalbúmina inducen tolerancia frente a trasplante de células madre (SCT) alogénico sometido a empobrecimiento de células T (TCD). A ratones Balb/c (H-2d) sometidos a irradiación subletal (5,25 Gy) se les trasplantaron 20 * 106 células de BM de ratones C57BL/6-desnudos (H-2b) con o sin: 5 * 106 células Tcm veto de ratones C57BL/6 alogénicas (H-2b) o 5 * 106 células CD8+CD44+ derivadas de ratones OT-1 inmunizados con OVA. Se analizó el porcentaje de células de donante en sangre periférica 45 días tras el trasplante mediante FACS usando anticuerpos anti-huésped (H-2Dd) anti-donante (H-2Kb).

Las figuras 2B-C son gráficos que ilustran que las células Tcm CD8+CD44+ no inducen GvHD en un modelo murino riguroso. A ratones Balb/c (H-2d) sometidos a irradiación subletal (5 Gy) se les trasplantaron 5*106 o 10*106 células Tcm CD8+CD44+ derivadas de ratones C57BL/6 (H-2b) inmunizados con OVA alogénicas o células CD8+CD44+ recientes. Se usaron células indiferenciadas CD8+CD44' como control positivo para GvHD. (Figura 2B) Cambio en peso promedio durante 62 días tras la transferencia de células. (Figura 2C) El gráfico de supervivencia representa la línea temporal de supervivencia de los ratones en grupos especificados.

La figura 2D es una ilustración esquemática de un modelo de acondicionamiento de intensidad reducida (RIC) para someter a prueba la inducción de tolerancia mediante células Tcm derivadas de células de memoria que se producen de manera natural (por ejemplo, CD44+CD8+anti-OVA).

La figura 2E es un gráfico que ilustra que células Tcm veto preparadas a partir de una población de células de memoria que se producen de manera natural (CD8+CD44+) inducen tolerancia frente a SCT alogénico de TCD. A ratones Balb/c (H-2d) sometidos a irradiación subletal (5 Gy) se les trasplantaron 20 * 106 células de BM de ratones C57BL/6-desnudos (H-2b) con o sin: 5 * 106 células Tcm veto de ratones C57BL/6 alogénicas (H-2b) o 5 * 106 células CD8+CD44+ derivadas de ratones inmunizados con OVA o 5 * 106 células CD8+CD44+ recién aisladas de ratones C57BL/6 alogénicas. Se analizó el porcentaje de células en sangre periférica de donante 55 días tras el trasplante mediante FACS usando anticuerpos anti-huésped (H-2Dd) y anti-donante (H-2Kb).

Las figuras 3A-D son gráficos que ilustran la generación de células Tcm veto CD4'CD56‘ anti-terceros usando péptidos virales. Respondedores CD4'CD56‘ humanos que se establecieron tras el empobrecimiento de células CD4+ y CD56+ a partir de PBMC de donante en el día 0 se cultivaron conjuntamente frente a DC derivadas de donante irradiadas sometidas a pulsos con péptidos virales de VEB, CMV y adenovirus con IL-21 hasta el día 3, con la adición IL-21, IL-15 e IL-7 a partir del día 3-+9. (Figuras 3A-B) Análisis de FACS de fenotipo de Tcm veto de células CD4'CD56‘ respondedoras en el día 0 (figura 3A) y células Tcm antiviral generadas a partir de las mismas en el día 9 de cultivo (figura 3B). (Figuras 3C-D) En el día 9, se recogieron células y se cultivaron frente a PBMC de huésped irradiadas durante 5 días (es decir, cultivo a granel) y después se recogieron y volvieron a estimularse durante 7 días frente a PBMC de huésped irradiadas en análisis de dilución limitante (LDA) en presencia de IL-2 para determinar la inducción de un fenotipo efector. En el día 21, se llevó a cabo un ensayo de destrucción de LDA con S35-metionina frente a ConA-blastocitos de origen de huésped. Tras una reacción de linfocitos mixtos (MLR) de 5 horas, se recogió el sobrenadante a partir de los pocillos y se sometió a recuento radiactivo en un contador p. La figura 3C representa un gráfico del % de cultivos respondedores frente al número de células por cultivo. La figura 3D representa un gráfico de regresión lineal del % de cultivos no respondedores frente al número de células por cultivo. Se calculó la frecuencia (f) de clones anti-huésped en el cultivo específico a partir de la pendiente de regresión lineal.

La figura 4A es una representación esquemática del protocolo para la generación de células Tcm veto humanas CD4' CD56'CD45RA' antivirales derivadas mediante leucaféresis y pruebas de su reactividad anti-huésped.

La figura 4B es una representación esquemática de la generación de células dendríticas maduras humanas cargadas con péptido viral.

Las figuras 5A-B son gráficos que ilustran células Tcm veto antivirales generadas a partir de respondedores CD4' CD56'CD45RA' usando DC autólogas cargadas con péptidos virales como estimulación de tercero. (Figura 5A) Fenotipo de respondedores CD4'CD56‘ en el día 0 y células Tcm en el día 9 (panel derecho). (Figura 5B) Fenotipo de respondedores CD4'CD56'CD45RA' en el día 0 y células Tcm en el día 9 (panel derecho).

La figura 5C es un gráfico que ilustra el análisis de dilución limitante (LDA) de frecuencia de precursores de CTL anti huésped en células Tcm antivirales generadas a partir de fracciones celulares CD4'CD56'CD45RA' y CD4'CD56‘, en comparación con células T CD4'CD56'CD19‘ recientes. En el día 9, una población de control de células CD4'CD56‘ CD19' recientes se clasificó con perlas a partir de células de donante recién descongeladas. Las tres preparaciones de células de tipo de donante (es decir, células CD4'CD56‘ Tcm veto antivirales, CD4'CD56'CD45RA' Tcm veto antivirales y CD4'CD56'CD19‘ recientes) se cultivaron frente a PBMC de huésped irradiadas durante 5 días en el día 9 (es decir, cultivo a granel) y después se recogieron y volvieron a estimularse durante 7 días frente a PBMC de huésped irradiadas en LDA en presencia de IL-2 para determinar la inducción de un fenotipo efector. En el día 21, se llevó a cabo un ensayo de destrucción de LDA con S35-metionina frente a ConA-blastocitos de origen de huésped. Tras una MLR de 5 horas, se recogió el sobrenadante a partir de los pocillos y se sometió a recuento radiactivo en un contador p. Se presenta un gráfico de regresión lineal del % de cultivos no respondedores frente al número de células por cultivo. Se calculó la frecuencia (f) de clones anti-huésped en el cultivo específico a partir de la pendiente de regresión lineal.

La figura 6 es una tabla que resume el empobrecimiento de células T anti-huésped antes y después de la generación de células Tcm veto dirigidas frente a péptidos virales (tal como se lleva a cabo en la figura 4A y las figuras 5A-C). Deben observarse la frecuencia de CTL-p anti-huésped y los niveles de CTL-p anti-huésped totales basándose en el ensayo de LDA (rodeado en un círculo en el gráfico).

La figura 7 es una representación esquemática de un aspecto de un protocolo para la generación de células Tcm veto humanas derivadas de células T de memoria y cultivadas frente a antígenos virales en el contexto de células presentadoras de antígeno autólogas.

La figura 8 es una tabla que resume 10 experimentos en los que se generaron células Tcm veto a partir de células T de memoria mediante el protocolo presentado en la figura 7. Debe observarse que la recuperación celular y la pureza eran muy reproducibles.

Las figuras 9A-H son gráficos que ilustran un análisis de FACS típico de un experimento que muestra la pureza de las células Tcm veto generadas a partir de células T de memoria mediante el protocolo presentado en la figura 7. Las figuras muestran el análisis de FACS de cada etapa presentada en la figura 8 de la siguiente manera: las figuras 9A-B ilustran el análisis de FACS de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes de la purificación; las figuras 9C-D ilustran el análisis de FACS tras la purificación de CD4'CD56_; las figuras 9E-F ilustran el análisis de FACS tras la purificación de CD4'CD56'CD45RA' (es decir enriquecimiento de células CD4'CD56'CD45RO+); las figuras 9G-H ilustran el análisis de FACS de las células Tcm antivirales.

Descripción de aspectos específicos de la divulgación

Las referencias a métodos de tratamiento de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente divulgación, en algunos aspectos de la misma, se refiere a células veto generadas a partir de células T de memoria y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para su fabricación y al uso de las mismas en el trasplante y en el tratamiento de enfermedades.

Los principios y el funcionamiento de la presente divulgación pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos un aspecto de la divulgación en detalle, debe entenderse que la aplicación de la divulgación no se limita necesariamente a los detalles expuestos en la siguiente descripción o mostrados a modo de ejemplo por los ejemplos. La divulgación puede presentar otros aspectos o ponerse en práctica o llevarse a cabo de varias otras maneras. Además, debe entenderse que las expresiones y terminología empleadas en el presente documento son con fines de descripción y no deben considerarse como limitativas.

El trasplante de médula ósea (BM) ofrece un tratamiento curativo para muchos pacientes con neoplasias hematológicas y otros trastornos (por ejemplo, enfermedades hematológicas, insuficiencia orgánica). Además, BM puede trasplantarse conjuntamente con varios otros órganos (por ejemplo, injerto de riñón o hígado del mismo donante de órganos) con el fin de aumentar el éxito del trasplante mediante inducción de quimerismo. Sin embargo, el injerto de BM contiene células T de donante que responden a los antígenos de huésped (Ag) y provocan enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) multiorgánica. El problema de GvHD, que es casi sistemáticamente mortal en tales entornos, puede prevenirse mediante trasplante de médula ósea sometida a empobrecimiento de células T (TDBMT). Sin embargo, el beneficio de la prevención de GvHD puede contrarrestarse por una tasa de rechazo de injerto notablemente aumentada.

Un enfoque para superar el rechazo de TDBMT alogénico empleó diversas preparaciones de células veto tal como se enseña por las publicaciones PCT n.osWO 2001/49243, WO 2007/023491, WO 2010/049935, WO 2012/032526 y WO 2013/035099. Sin embargo, el rechazo de injerto y GvHD todavía suponen una preocupación principal en la terapia celular adoptiva, especialmente en entornos alogénicos.

Al poner en práctica la presente divulgación, los presentes inventores han descubierto una población mejorada de células veto que también comprenden una actividad anti-enfermedad (por ejemplo, actividad antiviral) sin inducir una reacción de injerto contra huésped (GvH). Estas células novedosas se generan empobreciendo clones alorreactivos a partir de células T de memoria mediante activación de antígeno.

Tal como se muestra a continuación en el presente documento y en la siguiente sección de ejemplos, los presentes inventores han proporcionado nuevos métodos de generación de células veto para aplicaciones sin coincidencia de HLA (por ejemplo, alogénicas) empezando a partir de células T de memoria. Específicamente, tal como se muestra en la figura 1, los presentes inventores usaron un modelo de ratón para la generación de células Tcm veto a partir de células T de memoria que se producen de manera natural. Las células Tcm generadas a partir de células T de memoria indujeron tolerancia en un modelo de trasplante de médula ósea sometida a empobrecimiento de células T (TDBMT) en acondicionamiento reducido, sin una reactividad de injerto contra huésped (figura 2A), y mostraron una notable potenciación de quimerismo tras un protocolo de acondicionamiento de intensidad reducida (figura 2E). Sin embargo, se mostró que las células de memoria CD8+CD44+ recientes (que no se sometieron a activación de antígeno) indujeron mortalidad significativa y pérdida de peso debido a GvHD (figuras 2B-C).

A continuación, se usaron antígenos virales para generar células Tcm veto humanas a partir de una población de células CD4"CD56". Tal como se ilustra en las figuras 3A-B, las células cultivadas en presencia de antígenos virales, presentados en células dendríticas autólogas, comprendían el 93% de fenotipo de Tcm (células CD62+CD45RO+) 9 días desde el comienzo del cultivo. Además, estas células Tcm proporcionaron un empobrecimiento de dos log de clones alorreactivos frente a huésped en comparación con células CD4'CD56‘ recientes (figuras 3C-D y tabla 2, a continuación). Después se generaron células veto a partir de células de memoria humanas sometiendo en primer lugar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas a partir de un donante de células, a empobrecimiento de células CD4+, CD56+ y CD45RA+ (figura 4A). Por consiguiente, la población restante de células comprendía células T CD8+ de memoria de donante. Se cultivaron conjuntamente las células T CD8+ de memoria con células dendríticas (del mismo donante de células), en el que las células dendríticas se han manipulado para expresar un antígeno (por ejemplo, cóctel de antígenos virales que incluye VEB, CMV y adenovirus). Durante los 3 primeros días, se complementó el cultivo celular con IL-21, y después desde el día 3, se añadieron IL-21, IL-15 e IL-7 al cultivo hasta el día 9. La población resultante de células comprendía un fenotipo de Tcm y no ejercía ninguna reactividad anti-huésped (tal como se ilustra en las figuras 5A-C y 6).

Tomado en conjunto, el empobrecimiento de clones alorreactivos en una combinación de memoria de células T mediante activación de antígeno (por ejemplo, usando antígenos virales, antígenos tumorales) puede resolver el problema de GvHD residual que queda en la combinación de células T de memoria. Además, estos resultados sugieren que la preparación novedosa de células veto generadas a partir de células de memoria puede usarse en terapia celular para la inducción de tolerancia a trasplante, libre de complicaciones de GvHD, así como para tratamiento de enfermedad (por ejemplo, para aplicaciones antivirales o anticancerosas).

Por tanto, según un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de generación de una población aislada de células que no inducen enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) que comprenden un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células de inducción de tolerancia y/o estando dotadas de actividad anti-enfermedad, y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante, comprendiendo el método: (a) proporcionar una población de al menos el 70 % de células T de memoria; (b) poner en contacto la población de células T de memoria con un antígeno o antígenos para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (c) cultivar las células resultantes de la etapa (b) en presencia de citocinas para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la población aislada de células que no inducen GvHD.

La expresión “población aislada de células” tal como se usa en el presente documento se refiere a células que se han aislado a partir de su entorno natural (por ejemplo, el cuerpo humano).

El término “no enfermedad de injerto contra huésped” o “no GvHD” tal como se usa en el presente documento se refiere a tener una reactividad de inducción de injerto contra huésped (GvH) sustancialmente reducida o ausente. Por tanto, las células de la presente divulgación se generan para no provocar significativamente enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) tal como se demuestra mediante supervivencia, peso y aspecto global del sujeto sometido a trasplante 30-120 días tras el trasplante. Un experto en la técnica conoce bien métodos de evaluación de un sujeto para determinar GvHD reducida.

Según un aspecto, las células de la presente divulgación tienen reactividad reducida al menos al 10 %, al menos al 20 %, al menos al 30 %, al menos al 40 %, al menos al 50 %, al menos al 55 %, al menos al 60 %, al menos al 65 %, al menos al 70 %, al menos al 75 %, al menos al 80 %, al menos al 85 %, al menos al 90 %, al menos al 95 % o incluso al 100 % frente a un huésped con respecto a células no generadas según las presentes enseñanzas.

La expresión “fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm)” tal como se usa en el presente documento se refiere a un subconjunto de células T citotóxicas que se dirigen a los ganglios linfáticos. Las células que tienen el fenotipo de Tcm, en seres humanos, comprenden normalmente una firma CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA'. Se apreciará que las células Tcm pueden expresar todos los marcadores de firma en una única célula o pueden expresar únicamente parte de los marcadores de firma en una única célula. La determinación de un fenotipo celular puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o marcado con ELISA de captura.

Según un aspecto, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o incluso el 100 % de la población aislada de células tienen la firma de células Tcm.

Según un aspecto específico, aproximadamente el 20-40 %, aproximadamente el 30-50 %, aproximadamente el 40 60 %, aproximadamente el 50-70 %, aproximadamente el 60-80 %, aproximadamente el 70-90 %, aproximadamente el 80-100 %, o aproximadamente el 90-100 % de la población aislada de células tienen una firma de células Tcm.

La población aislada de células que no inducen GvHD de la divulgación también se denominan en el presente documento “células Tcm”.

Tal como se menciona, las células Tcm se dirigen normalmente a los ganglios linfáticos tras el trasplante. Según algunos aspectos, la población aislada de células de la presente divulgación pueden dirigirse a cualquiera de los ganglios linfáticos tras el trasplante, tales como, por ejemplo, los ganglios linfáticos periféricos y los ganglios linfáticos mesentéricos. La naturaleza de direccionamiento de estas células les permite ejercer su efecto de veto de una manera rápida y eficiente.

La población aislada de células Tcm de la presente divulgación son células de inducción de tolerancia.

La expresión “células de inducción de tolerancia” tal como se usa en el presente documento se refiere a células que provocan una sensibilidad reducida de las células del receptor (por ejemplo, células T del receptor) cuando entran en contacto con las células del receptor en comparación con la sensibilidad de las células del receptor en ausencia de células de inducción de tolerancia administradas. Las células de inducción de tolerancia incluyen células veto (es decir, células T que conducen a la apoptosis de células T del huésped al entrar en contacto con las mismas) tal como se describió anteriormente en las publicaciones PCT n.osWO 2001/049243 y WO 2002/102971.

El término “actividad veto” se refiere a células inmunitarias (por ejemplo, células T derivada de donante) que conducen a la inactivación de células T de receptor anti-donante tras el reconocimiento y la unión a las células veto. Según un aspecto, la inactivación da como resultado la apoptosis de las células T de receptor anti-donante.

Adicional o alternativamente, la población aislada de células Tcm de la presente divulgación comprenden actividad anti-enfermedad.

El término “actividad anti-enfermedad” se refiere a la función de las células Tcm contra una célula enfermada. La actividad anti-enfermedad puede ser directamente contra una célula enfermada, por ejemplo capacidad de destrucción de la célula enfermada. La actividad puede deberse a destrucción independiente de TCR mediada por unión a LFA1-I/CAM1 [Ardittiet al.,Blood (2005) 105(8):3365-71, publicación electrónica del 6 de julio de 2004]. Adicional o alternativamente, la actividad anti-enfermedad puede ser indirecta, por ejemplo mediante activación de otros tipos de células (por ejemplo, células T CD4+, células B, monocitos, macrófagos, células NK) que conduce a la muerte de la célula enfermada (por ejemplo, mediante destrucción, apoptosis o mediante secreción de otros factores, por ejemplo, anticuerpos, citocinas, etc.).

Una célula enfermada puede comprender, por ejemplo, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacteria, una célula cancerosa [por ejemplo, célula de un tumor sólido o célula de leucemia/linfoma, también denominada en el presente documento actividad de injerto contra leucemia (GVL) de las células Tcm], una célula asociada con una enfermedad autoinmunitaria, una célula asociada con una respuesta alérgica, o una célula alterada debido a estrés, radiación o edad.

Según algunos aspectos, las células Tcm de la presente divulgación pueden ser células no modificadas genéticamente o células modificadas genéticamente (por ejemplo, células que se han modificado por ingeniería genética para expresar o no expresar genes, marcadores o péptidos específicos o para secretar o no secretar citocinas específicas). Cualquier método conocido en la técnica puede implementarse para modificar por ingeniería genética las células, tal como mediante inactivación del/de los gen(es) relevante(s) o mediante inserción de un ARN antisentido que interfiere con la expresión de polipéptido (véase, por ejemplo, el documento WO/2000/039294).

Según algunos aspectos de la divulgación, se proporciona un método de generación de la población aislada de células, comprendiendo el método (a) proporcionar una población de células T de memoria; (b) poner en contacto la población de células T de memoria con un antígeno o antígenos para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (c) cultivar las células resultantes de la etapa (b) en presencia de citocinas para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm).

El término “células T de memoria” tal como se usa en el presente documento se refiere a un subconjunto de linfocitos T que han encontrado anteriormente y han respondido a un antígeno, también denominadas células T con experiencia con antígeno.

Según un aspecto, las células T de memoria comprenden al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 %, o incluso el 100 % de la población de células.

Según un aspecto, las células T de memoria comprenden células T citotóxicas que expresan un marcador de CD8 (es decir, células T CD8+).

Según otro aspecto, las células T de memoria comprenden un fenotipo CD8+CD45RO+.

Según otro aspecto, las células T de memoria comprenden un fenotipo CD8+CD45RA-.

Según otro aspecto, las células T de memoria comprenden un fenotipo CD8+CD45RO+CD45RA-.

La selección de células T CD8+ de memoria puede realizarse mediante selección de células que expresan conjuntamente CD8+ y CD45RA- y/o células que expresan conjuntamente CD8+ y CD45RO+ y puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, tal como mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, tal como mediante el uso de perlas de MACS, clasificador de FACS y/o marcado con ELISA de captura).

La selección de células T CD8+ de memoria puede realizarse adicionalmente mediante selección de células T efectoras y células T de memoria central, expresando estas últimas, por ejemplo, CD62L, CCR7, CD27 y/o CD28.

Según un aspecto, se obtienen células T de memoria a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Según un aspecto, se obtienen células T de memoria a partir de un tejido linfoide, tal como a partir de ganglios linfáticos o bazo.

Con el fin de obtener una población de células que comprende una alta pureza de células T de memoria (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50-70 % de células T de memoria) o con el fin de aumentar el número de células T de memoria, pueden someterse PBMC a empobrecimiento de células indiferenciadas, por ejemplo células CD45RA+, de células adherentes (por ejemplo, monocitos, macrófagos), de células CD4+ (por ejemplo, células T cooperadoras), de células CD56+ (por ejemplo, células NK) o cualquier otra célula que no comprende un fenotipo de células T memoria.

El empobrecimiento de células T indiferenciadas (por ejemplo, expresión de células CD45RA+), células CD4+ y/o CD56+ puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, tal como mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, tal como mediante el uso de perlas de MACS, clasificador de FACS y/o marcado con ELISA de captura).

El empobrecimiento de células adherentes puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo cultivando las PBMC en una placa de cultivo celular (por ejemplo, durante 2-6 horas) y recogiendo las células no adherentes.

Según un aspecto, las células T de memoria carecen de células CD45RA+.

Según un aspecto, las células T de memoria carecen de células CD4+ y/o CD56+.

Con el fin de empobrecer clones alorreactivos a partir de la combinación de células T de memoria, se ponen las células T de memoria en contacto con un antígeno o antígenos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “antígeno o antígenos” se refiere a una molécula soluble o no soluble (tal como asociada con membrana) que puede inducir una respuesta inmunitaria.

Por ejemplo, un antígeno o antígenos pueden ser células enteras (por ejemplo, células vivas o muertas), fracciones celulares (por ejemplo, células sometidas a lisis), antígenos celulares (por ejemplo, antígenos de superficie celular), un extracto de proteínas, una proteína purificada o un péptido sintético. Por ejemplo, un antígeno o antígenos de algún aspecto de la divulgación incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna (por ejemplo, antígenos tumorales), antígenos asociados con una enfermedad autoinmunitaria (es decir, antígenos autoinmunitarios), antígenos asociados con una reacción alérgica (es decir, antígenos alérgicos), antígenos de virus (es decir, antígenos virales), antígenos de bacterias (es decir, antígenos bacterianos) o antígenos de hongos (por ejemplo, antígenos fúngicos).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos es de un organismo infeccioso (por ejemplo, organismo viral, bacteriano, fúngico) que normalmente afecta a sujetos inmunocomprometidos, tales como pacientes de trasplante. Los organismos infecciosos a modo de ejemplo que pueden afectar a pacientes inmunocomprometidos incluyen, pero no se limitan a, virus tales como parvovirus (por ejemplo, parvovirus B19), rotavirus, virus varicela-zóster (VZV), virus del herpes simple (VHS), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB), poliomavirus (por ejemplo, virus BK); bacterias tales como Spneumoniae, P aeruginosa, Legionella pneumophila, L monocytogenes,especies deNocardia,especies deMycobacterium, S aureus,especies deNocardia, P aeruginosa,especies deSerratia, Chromobacterium,estreptococos,Burkholderia, Mycobacterium(por ejemplo, complejo deMycobacterium avium-intracellulare),bacterias encapsuladas tal como Spneumoniae, H influenzaeyN meningitidis;hongos tal comoP jiroveci, Candida,yAspergillus;y parásitos tales como especies deToxoplasma, CryptosporidiumyStrongyloides.

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno viral, tal como, pero sin limitarse a, un antígeno de virus de Epstein-Barr (VEB), adenovirus (Adv), citomegalovirus (CMV), virus del resfriado, virus de la gripe, virus de la hepatitis A, B y C, herpes simple, VIH, influenza, encefalitis japonesa, sarampión, poliomielitis, rabia, sincitial respiratorio, rubeola, viruela, varicela-zóster, rotavirus, virus del Nilo occidental, poliomavirus (por ejemplo, virus BK) o virus de Zika.

Como ejemplos particulares adicionales de antígenos virales, los antígenos de adenovirus incluyen, pero no se limitan a, pentona de Adv o hexona de Adv; los antígenos de CMV incluyen, pero no se limitan a, licoproteína B de la envuelta, IE-1 de CMV y pp65 de CMV; los antígenos de VEB incluyen, pero no se limitan a, LMP2 de VEB, BZLF1 de VEB, EBNA1 de VEB, P18 de VEB, y P23 de VEB; los antígenos de hepatitis incluyen, pero no se limitan a, las proteínas S, M, y L de virus de la hepatitis B, el antígeno pre-S de virus de la hepatitis B, Hb Ca G DELTA, HBE de v Hb , ARN de virus de la hepatitis C, NS3 de VHC y NS4 de VHC; los antígenos de virus del herpes simple incluyen, pero no se limitan a, proteínas tempranas inmediatas y glicoproteína D; los antígenos de VIH incluyen, pero no se limitan a, productos génicos de los genes de gag, pol, y env tales como gp32 de VIH, gp41 de VIH, gp120 de VIH, gp160 de VIH, P17/24 de VIH, P24 de VIH, P55 GAG de VIH, P66 POL de VIH, TAT de VIH, GP36 de VIH, la proteína Nef y transcriptasa inversa; los antígenos de influenza incluyen, pero no se limitan a, hemaglutinina y neuraminidasa; los antígenos de virus de la encefalitis japonesa incluyen, pero no se limitan a, proteínas E, ME, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A y el 80 % de E; los antígenos del sarampión incluyen, pero no se limitan a, la proteína de fusión de virus del sarampión; los antígenos de la rabia incluyen, pero no se limitan a, glicoproteína de la rabia y nucleoproteína de la rabia; los antígenos de virus sincitial respiratorio incluyen, pero no se limitan a, la proteína de fusión de VSR y la proteína M2; los antígenos de rotavirus incluyen, pero no se limitan a, VP7sc; los antígenos de la rubeola incluyen, pero no se limitan a, proteínas E1 y E2; y los antígenos del virus de varicela-zóster incluyen, pero no se limitan a, gpl y gpll.

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno bacteriano, tal como, pero sin limitarse a, un antígeno de ántrax; bacilos gram-negativos, clamidia, difteria,Haemophilus influenza, Helicobacter pylori,malaria,Mycobacterium tuberculosis,toxina pertussis, neumococos,Rickettsia,estafilococos, estreptococos y tétanos.

Como ejemplos particulares adicionales de antígenos bacterianos, los antígenos de ántrax incluyen, pero no se limitan a, antígeno protector de ántrax; los antígenos de bacilos gram-negativos incluyen, pero no se limitan a, lipopolisacáridos; los antígenos deHaemophilus influenzaincluyen, pero no se limitan a, polisacáridos capsular; los antígenos de difteria incluyen, pero no se limitan a, toxina diftérica; los antígenos deMycobacterium tuberculosisincluyen, pero no se limitan a, ácido micólico, proteína de choque térmico 65 (HSP65), la proteína secretada mayor de 30 kDa y antígeno 85A; los antígenos de toxina pertussis incluyen, pero no se limitan a, hemaglutinina, pertactina, FIM2, FIM3 y adenilato ciclasa; los antígenos de neumococos incluyen, pero no se limitan a, neumolisina y polisacáridos capsulares de neumococos; los antígenos deRickettsiaincluyen, pero no se limitan a, rompA; los antígenos de estreptococos incluyen, pero no se limitan a, proteínas M; y los antígenos del tétanos incluyen, pero no se limitan a, toxina del tétanos.

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno de bacteria superresistente (por ejemplo, bacterias resistentes a múltiples fármacos). Los ejemplos de bacterias superresistentes incluyen, pero no se limitan a,Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa,yEnterobacteriaceae(incluyendoEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.).

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno fúngico. Los ejemplos de hongos incluyen, pero no se limitan a, cándida, coccidiodes, criptococos, histoplasma, leishmania, plasmodio, protozoos, parásitos, esquistosomas, tiñas, toxoplasma, yTrypanosoma cruzi.

Como ejemplos particulares adicionales de antígenos fúngicos, los antígenos de coccidiodes incluyen, pero no se limitan a, antígenos de esférulas; los antígenos de criptococos incluyen, pero no se limitan a, polisacáridos capsulares; los antígenos de histoplasma incluyen, pero no se limitan a, proteína de choque térmico 60 (HSP60); los antígenos de leishmania incluyen, pero no se limitan a, gp63 y lipofosfoglicano; los antígenos dePlasmodium falciparumincluyen, pero no se limitan a, antígenos de superficie de merozoítos, antígenos de superficie de esporozoítos, antígenos de circumsporozoítos, antígenos de superficie de gametocitos/gametos, protozoos y otros antígenos de parásitos incluyendo antígeno en estadio de sangre pf 155/RESA; los antígenos de esquistosomas incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa y paramiosina; los antígenos fúngicos de la tiña incluyen, pero no se limitan a, tricofitina; los antígenos de toxoplasma incluyen, pero no se limitan a, SAG-1 y p30; y los antígenos deTrypanosoma cruziincluyen, pero no se limitan a, antígeno de 75-77 kDa y antígeno de 56 kDa.

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno expresado por células asociadas con un estado alérgico o autoinmunitario no deseado. Los estados autoinmunitarios a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, asma alérgico, alopecia areata, anemia, úlcera aftosa, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica), asma, tiroiditis autoinmunitaria, conjuntivitis, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso cutáneo, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), diabetes, diabetes mellitus, eritema nudoso leproso, queratoconjuntivitis, esclerosis múltiple, miastenia grave, psoriasis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, incluyendo queratoconjuntivitis seca consecuencia de síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerosa, vaginitis y granulomatosis de Wegener.

Los ejemplos de antígenos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, ácido glutámico descarboxilasa 65 (GAD 65), ADN nativo, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica de mielina, componentes de receptor de acetilcolina, tiroglobulina, y el receptor de hormona estimulante del tiroides (TSH).

Los ejemplos de antígenos alérgicos incluyen, pero no se limitan a, antígenos del polen tales como antígenos del polen del cedro japonés, antígenos del polen de la ambrosía, antígenos del polen de raigrás, antígenos derivados de animales (tales como antígenos de ácaros del polvo y antígenos felinos), antígenos de histocompatibilidad, y penicilina y otros fármacos terapéuticos.

Según un aspecto, el antígeno es un antígeno (o parte del mismo, por ejemplo epítopo de antígeno) expresado por células tumorales. Según un aspecto, el antígeno (o parte del mismo) se deriva de una proteína expresada en un tejido hematopoyético (por ejemplo, neoplasia maligna hematopoyética tal como antígeno de leucemia) o expresada en un tumor sólido (por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer gastrointestinal, etc.).

Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, A33, BAGE, Bcl-2, antígeno de maduración de células B (BCMA), BCR-ABL, p-catenina, antígenos de cáncer de testículos (CTA por ejemplo MAGE-1, MAGE-A2/A3 y NY-ESO-1), CA l25, CA 19-9, CA 50, CA 27,29 (BR 27,29), CA 15-3, CD5, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD37, CD45, CD123, CEA, c-Met, CS-1, ciclina B1, DAGE, EBNA, EGFR, ELA2, efrina B2, receptor de estrógenos, FAP, ferritina, proteína de unión a folato, GAGE, G250/CA IX, GD-2, GM2, gp75, gp100 (Pmel 17), HA-1, HA-2, HER-2/neu, HM1,24, HPV E6, HPV E7, hTERT, Ki-67, LRP, mesotelina, antígeno asociado a cáncer de tupo mucina (MCA), MUC1, p53, PR1, PRAME, PRTN3, RHAMM (CD168), WT-1. Se proporcionan antígenos tumorales adicionales en Molldrem J. Biology of Blood and Marrow Transplant (2006) 12:13-18; Alatrash G. y Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50; Renkvistet al.,Cancer Immunol Immunother (2001) 50:3-15; van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun (2013), www.cancerimmunity.org/peptide/; Rittenhouse, Manderino, and Hass, Laboratory Medicine (1985) 16(9) 556-560.

A continuación se presenta una lista de antígenos tumorales que pueden usarse según las enseñanzas de algunos aspectos de la divulgación.

Tabla 1 - lista de antígenos tumorales

Según un aspecto, el antígeno comprende un antígeno (por ejemplo, antígeno viral, bacteriano o tumoral).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos comprenden dos o más antígenos (por ejemplo, una mezcla de antígenos de un grupo de antígenos, por ejemplo antígenos virales, antígenos tumorales, etc.; o una mezcla de antígenos de diferentes grupos de antígenos, por ejemplo antígenos virales y bacterianos, antígenos virales y tumorales, antígenos virales y autoinmunitarios, antígenos tumorales y autoinmunitarios, o antígenos autoinmunitarios y alérgicos).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos comprenden dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos (por ejemplo, en una única formulación o en varias formulaciones).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos comprenden dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos tumorales (por ejemplo, en una única formulación o en varias formulaciones).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos comprenden dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos virales (por ejemplo, en una única formulación o en varias formulaciones).

Según un aspecto particular, el antígeno o antígenos comprenden tres antígenos virales, por ejemplo péptido de VEB, péptido de CMV y péptido de Adv.

Según un aspecto particular, el antígeno o antígenos comprenden dos o más de LMP2 de VEB, BZLF1 de VEB, EBNA1 de<v>E<b>, pp65 de CMV, IE-1 de CMV, pentona de Adv y hexona de Adv (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o los siete antígenos).

Según un aspecto particular, el antígeno o antígenos comprenden una mezcla de mezclas de péptidos que son bibliotecas de péptidos solapantes (por ejemplo, 15 meros que se solapan en 11 aminoácidos) que abarcan toda la secuencia de proteína de tres virus: CMV, VEB, y Adeno (tales mezclas de péptidos pueden adquirirse comercialmente, por ejemplo, de JPT Technologies, Berlín, Alemania).

Según otro aspecto particular, el antígeno o antígenos comprenden una mezcla de siete mezclas de péptidos que abarcan LMP2 de VEB, BZLF1 de VEB, EBNA1 de VEB, pp65 de CMV, IE-1 de CMV, pentona de Adv y hexona de Adv a una concentración de, por ejemplo, 100 ng/péptido o 700 ng/mezcla de los siete péptidos.

Según un aspecto particular, los antígenos virales comprenden además un antígeno o antígenos bacterianos.

Con el fin de estimular una respuesta inmunitaria de las células T de memoria, pueden usarse antígenos estimulantes adicionales tales como, pero sin limitarse a, ovoalbúmina, DNP (dinitrofenilo), KLH (hemocianina de lapa californiana).

Según un aspecto, el antígeno o antígenos es un “antígeno o antígenos de tercero” es decir un antígeno o antígenos solubles o no solubles (tal como asociados con membrana) que no están presentes ni en el donante ni en el receptor. Por ejemplo, un antígeno de tercero puede ser una célula de tercero.

Las células de terceros pueden ser o bien alogénicas o bien xenogénicas con respecto al donante y receptor (explicado en más detalle a continuación en el presente documento). En el caso de células de terceros alogénicas, tales células tienen antígenos de HLA diferentes de los del donante pero que no presentan reactividad cruzada con los antígenos de HLA del receptor, de tal manera que las células anti-terceros generadas contra tales células no son reactivas contra antígenos de receptor o trasplante.

Según un aspecto de la presente divulgación, las células de terceros alogénicas o xenogénicas son células estimulantes seleccionadas del grupo que consiste en células purificadas a partir de linfocitos de sangre periférica (PBL), bazo o ganglios linfáticos, PBL movilizadas por citocinas, células presentadoras de antígenos (APC) expandidasin vitro,células dendríticas (DC) expandidasin vitroy células presentadoras de antígeno artificiales.

Los antígenos de la divulgación pueden presentarse sobre las superficies celulares, virales, fúngicas o bacterianas o derivarse y/o purificarse a partir de las mismas. Adicionalmente, un antígeno viral, fúngico o bacteriano puede presentarse en una célula infectada o un antígeno celular puede presentarse en un vehículo artificial (por ejemplo, liposoma) o en una célula presentadora de antígeno artificial (por ejemplo, línea celular transfectada con el antígeno o antígenos). Por tanto, pueden presentarse antígenos virales, bacterianos o fúngicos por células infectadas con los mismos o hacerse de otro modo que expresen péptidos virales/bacterianos/fúngicos. De manera similar, pueden presentarse antígenos tumorales, antígenos autoinmunitarios o antígenos alérgicos por células que se hace que expresen estas proteínas.

Usar células, células infectadas con virus, células infectadas con bacterias, células que presentan péptidos virales o células que presentan péptidos bacterianos como antígenos es particularmente ventajoso dado que tales antígenos incluyen una diversa matriz de determinantes antigénicos y, como tal, dirigen la formación de células Tcm de una población diversa, que pueden servir adicionalmente para una reconstitución más rápida de células T en casos en los que se requiere tal reconstitución, por ejemplo, tras un procedimiento de quimioterapia o irradiación letal o subletal (tal como se comenta en detalle a continuación) o para combatir enfermedades (tal como se comenta en detalle a continuación).

Por tanto, pueden usarse células presentadoras de antígeno (autólogas o no autólogas, tal como se comenta a continuación), líneas celulares, vehículos artificiales (tales como un liposoma) o células presentadoras de antígeno artificiales (por ejemplo, línea celular leucemia o de fibroblastos transfectada con el antígeno o antígenos), para presentar péptidos sintéticos cortos fusionados o cargados con las mismas o para presentar extractos de proteína o proteínas purificadas. Tales péptidos cortos, extractos de proteína o proteínas purificadas pueden ser péptidos derivados de antígenos virales, bacterianos, fúngicos, tumorales, autoinmunitarios o alérgicos o péptidos que representan cualquier otro antígeno.

Puede usarse software dedicado para analizar secuencias de antígenos virales, bacterianos, fúngicos, tumorales, autoinmunitarios o alérgicos para identificar péptidos cortos inmunogénicos, es decir, péptidos que pueden presentarse en el contexto de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o clase II de MHC.

Además, los vehículos artificiales o APC artificiales de la presente divulgación pueden modificarse por ingeniería para presentar MHC sin someterse a pulsos con un péptido exógeno. Por tanto, según un aspecto, la APC artificial comprende células tumorales K562 transfectadas con un determinante de MHC (por ejemplo, autólogas con respecto a la célula T de memoria) y una molécula coestimulante [tal como se describió anteriormente, por ejemplo, por Suhoski MMet al.,Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8], o fibroblastos transfectados con los mismos.

Según un aspecto, el antígeno o antígenos se presentan por células presentadoras de antígeno (por ejemplo, DC) autólogas con respecto a las células T de memoria, por ejemplo del mismo origen (por ejemplo, del mismo donante), con el fin de permitir el reconocimiento de células T de memoria en el contexto de clase I de MHC o clase II de MHC.

Según un aspecto, el antígeno o antígenos se presentan por células presentadoras de antígeno genéticamente modificadas o células presentadoras de antígeno artificiales que presentan antígenos de MHC (también denominado antígeno leucocitario humano (HLA)) reconocibles por las células T de memoria.

Según un aspecto, las células presentadoras de antígeno comprenden células humanas.

Según un aspecto, las células presentadoras de antígeno comprenden células dendríticas (DC).

Según un aspecto, las células presentadoras de antígeno comprenden células dendríticas maduras.

Según un aspecto, las células presentadoras de antígeno comprenden células dendríticas irradiadas.

Por tanto, según un aspecto, las DC se irradian con aproximadamente 5-10 Gy, aproximadamente 10-20 Gy, aproximadamente 20-30 Gy, aproximadamente 20-40 Gy, aproximadamente 20-50 Gy, aproximadamente 10-50 Gy. Según un aspecto específico, las DC se irradian con aproximadamente 10-50 Gy (por ejemplo, 30 Gy).

En la técnica se conocen métodos de uso de células dendríticas como APC. Por tanto, como ejemplo no limitativo, pueden obtenerse células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de un donante de células [por ejemplo, a partir del mismo donante de células que las células T de memoria]. Se siembran PBMC en una placa de cultivo y se incuban durante 1-5 horas (por ejemplo, 3 horas) a 37°C al 5 % de CO2/O2 usando medio de células DC (por ejemplo, medio Cellgro DC) complementado con suero humano (por ejemplo, el 1 % de suero humano) y penicilina/estreptomicina (por ejemplo, el 1 % de penicilina/estreptomicina). Se descartan las células sobrenadantes (que comprenden células T), y se incuban adicionalmente las células restantes (es decir, células adherentes) durante 48-96 horas (por ejemplo, 72 horas) en las mismas condiciones de cultivo con la adición de las citocinas GM-CSF (por ejemplo, 800-1600 UI/ml) e IL-4 (por ejemplo, 750 UI/ml) (disponibles, por ejemplo, de Peprotech, Hamburgo, Alemania). De dos a cuatro días (por ejemplo, tres días) después, se recogen las células flotantes (es decir, comprenden principalmente células dendríticas inmaduras) y se siembran con citocinas para la maduración de DC, por ejemplo GM-CSf (por ejemplo, 800 UI/ml), IL-4 (por ejemplo, 750 UI/ml), LPS (por ejemplo, deE. coliO55:B5, por ejemplo, a 40 ng/ml) e IFN-y (por ejemplo, 200 UI/ml) (disponibles, por ejemplo, de Peprotech, Hamburgo, Alemania), y se incuban durante la noche. Al día siguiente, pueden descartarse las células no adherentes, y pueden retirarse suavemente las DC maduras adherentes usando, por ejemplo, PBS fría que comprende, por ejemplo, EDTA 2 mM y HS al 1 %, tras la incubación sobre hielo durante 10-60 minutos (por ejemplo, 30 minutos), obteniendo de ese modo células grandes que consisten en DC maduras.

Con el fin de presentar el antígeno o antígenos sobre APC (por ejemplo, DC maduras), el antígeno o antígenos se cultivan conjuntamente con las APC (por ejemplo, DC) durante aproximadamente de 30 minutos a 3 horas (por ejemplo, 1 hora) a 37°C al 5 % de CO2/O2. Por ejemplo, pueden cargarse DC con un cóctel de mezclas de péptidos (péptidos virales) mediante incubación durante aproximadamente 1 hora a 37°C al 5 % de CO2/O2. Entonces, las APC cargadas con antígeno (por ejemplo, DC) están listas para usarse para la generación de células Tcm a partir de la población de células T de memoria según algunos aspectos de la divulgación.

Las células Tcm de la presente divulgación se generan normalmente poniendo en contacto en primer lugar una población de células T de memoria con un antígeno o antígenos (tal como se describió anteriormente) en un cultivo complementado con IL-21 (por ejemplo, en un cultivo por lo demás libre de citocinas, es decir, sin la adición de ninguna citocina adicional). Esta etapa se lleva a cabo normalmente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, 12-96 horas, 12-120 horas, aproximadamente 24-36 horas, aproximadamente 24-48 horas, aproximadamente 24-72 horas, aproximadamente 36-48 horas, aproximadamente 36 72 horas, aproximadamente 48-72 horas, aproximadamente 48-96 horas, aproximadamente 48-120 horas, 0,5-1 días, 0,5-2 días, 0,5-3 días, 0,5-5 días, 1-2 días, 1-3 días, 1-5 días, 1-7 días, 1-10 días, 2-3 días, 2-4 días, 2-5 días, 2-6 días, 2-8 días, 3-4 días, 3-5 días, 3-7 días, 4-5 días, 4-8 días, 5-7 días, 6-8 días o 8-10 días o y permite el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno.

Según un aspecto específico, la puesta en contacto de una población de células T de memoria con un antígeno o antígenos (tal como se describió anteriormente) en un cultivo complementado con IL-21 (cultivo por lo demás libre de citocinas) se realiza durante 1-5 días (por ejemplo, 3 días).

La puesta en contacto de una población de células T de memoria con un antígeno o antígenos (tal como se describió anteriormente) en un cultivo complementado con IL-21 se lleva a cabo normalmente en presencia de aproximadamente 0,001-3000 UI/ml, 0,01-3000 UI/ml, 0,1-3000 UI/ml, 1-3000 UI/ml, 10-3000 UI/ml, 100-3000 UI/ml, 1000-3000 UI/ml, 0,001-1000 UI/ml, 0,01-1000 UI/ml, 0,1-1000 UI/ml, 1-1000 UI/ml, 10-1000 UI/ml, 100-1000 UI/ml, 250-1000 UI/ml, 500-1000 UI/ml, 750-1000 UI/ml, 10-500 UI/ml, 50-500 UI/ml, 100-500 UI/ml, 250-500 UI/ml, 100-250 UI/ml, 0,1-100 UI/ml, 1-100 UI/ml, 10-100 UI/ml, 30-100 UI/ml, 50-100 UI/ml, 1-50 UI/ml, 10-50 UI/ml, 20-50 UI/ml, 30-50 UI/ml, 1-30 UI/ml, 10-30 UI/ml, 20-30 UI/ml, 10-20 UI/ml, 0,1-10 UI/ml, o 1-10 UI/ml IL-21. Según un aspecto específico, la concentración de IL-21 es de 50-500 UI/ml (por ejemplo, 100 UI/ml).

Según un aspecto específico, la puesta en contacto de una población de células T de memoria con un antígeno o antígenos se realiza en un cultivo libre de citocinas (por ejemplo, complementado únicamente con IL-21), una condición de cultivo de este tipo permite la supervivencia y el enriquecimiento únicamente de las células que experimentan estimulación y activación por el antígeno o antígenos (es decir, de células reactivas frente a antígeno) ya que estas células secretan citocinas (por ejemplo, IL-2) que permiten su supervivencia (todas las demás células mueren en estas condiciones de cultivo).

Normalmente la razón de antígeno o antígenos (por ejemplo, presentados en APC tales como células dendríticas sometidas a pulsos con antígenos) con respecto a células T de memoria es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:10 tal como aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:8 o aproximadamente 1:10. Según un aspecto específico, la razón de antígeno o antígenos (por ejemplo, presentados en APC) con respecto a células T de memoria es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:8 (por ejemplo, 1:5).

A continuación, se cultivan las células T de memoria resultantes (es decir, tras el cultivo con IL-21) en presencia de IL-21, IL-15 y/o IL-7 en un entorno libre de antígenos (es decir, sin la adición de un antígeno o antígenos) para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo de Tcm. Esta etapa se lleva a cabo normalmente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, aproximadamente 12 96 horas, aproximadamente 12-120 horas, aproximadamente 12-240 horas, 24-36 horas, 24-48 horas, aproximadamente 24-72 horas, 24-96 horas, 24-120 horas, 24-240 horas, aproximadamente 48-72 horas, aproximadamente 48-120 horas, aproximadamente 48-240 horas, aproximadamente 96-240 horas, aproximadamente 120-144 horas, aproximadamente 120-240 horas, aproximadamente 144-240 horas, 0,5-1 días, 0,5-2 días, 0,5-3 días, 0,5-5 días, 0,5-10 días, 1-2 días, 1-3 días, 1-4 días, 1-6 días, 1-8 días, 1-10 días, 1-15 días, 2-3 días, 2-4 días, 2-5 días, 2-6 días, 2-8 días, 2-10 días, 4-5 días, 4-6 días, 4-8 días, 4-10 días, 5-6 días, 5-7 días, 5-8 días, 5-10 días, 5-15 días, 6-7 días, 6-8 días, 6-10 días, 7-8 días, 7-9 días, 7-10 días, 7-13 días, 7-15 días, 8-10 días, 10-12 días, 10-14 días, 12-14 días, 14-16 días, 14-18 días, 16-18 días o 18-20 días. Según un aspecto específico, las células T de memoria resultantes (es decir, tras el cultivo con IL-21) se cultivan en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un entorno libre de antígenos durante aproximadamente 4-8 días (por ejemplo, 6 días).

Esta etapa se lleva a cabo normalmente en presencia de IL-21 a una concentración de aproximadamente 0,001-3000 UI/ml, 0,01-3000 UI/ml, 0,1-3000 UI/ml, 1-3000 UI/ml, 10-3000 UI/ml, 100-3000 UI/ml, 1000-3000 UI/ml, 0,001-1000 UI/ml, 0,01-1000 UI/ml, 0,1-1000 UI/ml, 1-1000 UI/ml, 10-1000 UI/ml, 100-1000 UI/ml, 250-1000 UI/ml, 500-1000 UI/ml, 750-1000 UI/ml, 10-500 UI/ml, 50-500 UI/ml, 100-500 UI/ml, 250-500 UI/ml, 100-250 UI/ml, 0,1-100 UI/ml, 1-100 UI/ml, 10-100 UI/ml, 30-100 UI/ml, 50-100 UI/ml, 1-50 UI/ml, 10-50 UI/ml, 20-50 UI/ml, 30-50 UI/ml, 1-30 UI/ml, 10-30 UI/ml, 20-30 UI/ml, 10-20 UI/ml, 0,1-10 UI/ml, o 1-10 UI/ml IL-21. Según un aspecto específico, la concentración de IL-21 es de 50-500 UI/ml (por ejemplo, 100 UI/ml).

Esta etapa se lleva a cabo adicionalmente en presencia de IL-15 a una concentración de aproximadamente 0,001 3000 UI/ml, 0,01-3000 UI/ml, 0,1-3000 UI/ml, 1-3000 UI/ml, 10-3000 UI/ml, 100-3000 UI/ml, 125-3000 UI/ml, 1000 3000 UI/ml, 0,001-1000 UI/ml, 0,01-1000 UI/ml, 0,1-1000 UI/ml, 1-1000 UI/ml, 10-1000 UI/ml, 100-1000 UI/ml, 125 1000 UI/ml, 250-1000 UI/ml, 500-1000 UI/ml, 750-1000 UI/ml, 10-500 UI/ml, 50-500 UI/ml, 100-500 UI/ml, 125 500 UI/ml, 250-500 UI/ml, 250-500 UI/ml, 125-250 UI/ml, 100-250 UI/ml, 0,1-100 UI/ml, 1-100 UI/ml, 10-100 UI/ml, 30 100 UI/ml, 50-100 UI/ml, 1-50 UI/ml, 10-50 UI/ml, 20-50 UI/ml, 30-50 UI/ml, 1-30 UI/ml, 10-30 UI/ml, 20-30 UI/ml, 10 20 UI/ml, 0,1-10 UI/ml, o 1-10 UI/ml IL-15. Según un aspecto específico la concentración de IL-15 es de 50-500 UI/ml (por ejemplo, 125 UI/ml).

Esta etapa se lleva a cabo adicionalmente en presencia de IL-7 a una concentración de aproximadamente 0,001-3000 UI/ml, 0,01-3000 UI/ml, 0,1-3000 UI/ml, 1-3000 UI/ml, 10-3000 UI/ml, 30-3000 UI/ml, 100-3000 UI/ml, 1000-3000 UI/ml, 0,001-1000 UI/ml, 0,01-1000 UI/ml, 0,1-1000 UI/ml, 1-1000 UI/ml, 10-1000 UI/ml, 30-1000 UI/ml, 100-1000 UI/ml, 250 1000 UI/ml, 500-1000 UI/ml, 750-1000 UI/ml, 10-500 UI/ml, 30-500 UI/ml, 50-500 UI/ml, 100-500 UI/ml, 250-500 UI/ml, 100-250 UI/ml, 0,1-100 UI/ml, 1-100 UI/ml, 10-100 UI/ml, 30-100 UI/ml, 50-100 UI/ml, 1-50 UI/ml, 10-50 UI/ml, 20-50 UI/ml, 30-50 UI/ml, 1-30 UI/ml, 10-30 UI/ml, 20-30 UI/ml, 10-20 UI/ml, 0,1-10 UI/ml, o 1-10 UI/ml IL-7. Según un aspecto específico la concentración de IL-7 es de 1-100 UI/ml (30 UI/ml).

Se apreciará que puede estar presente antígeno o antígenos residuales en el cultivo celular tras el cultivo con IL-21 (es decir, en la etapa de proliferación de Tcm que comprende, por ejemplo, la adición de IL-21, IL-15 e IL-7) y por tanto un entorno libre de antígenos se refiere a un cultivo celular sin la adición de antígeno o antígenos complementarios.

Una etapa adicional que puede llevarse a cabo según las presentes enseñanzas incluye cultivar las células T de memoria resultantes (es decir, tras el cultivo con IL-21) con un antígeno o antígenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 (es decir, antes de generar un entorno libre de antígenos). Esta etapa se lleva a cabo normalmente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 24 36 horas, aproximadamente 24-72 horas, aproximadamente 48-72 horas, 1-2 días, 2-3 días, 1-3 días, 2-4 días, 1 5 días o 2-5 días, y se realiza a las mismas dosis de IL-21, IL-15 e IL-7 indicadas anteriormente. Según un aspecto específico, el cultivo de las células de memoria con un antígeno o antígenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 se lleva a cabo durante de 12 horas a 4 días (por ejemplo, 1-2 días). Según un aspecto, el periodo de tiempo total para generar las células Tcm es de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11o 12 días (por ejemplo, 9 días).

Una etapa adicional que puede llevarse a cabo según las presentes enseñanzas incluye la selección y retirada de células activadas. Una etapa de selección de este tipo ayuda a la retirada de posibles células T reactivas frente a huésped.

El aislamiento de células activadas puede llevarse a cabo en un enfoque en dos etapas. En la primera etapa, se seleccionan células activadas antes de cultivar las células en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7. Esta primera etapa se lleva a cabo normalmente tras la puesta en contacto inicial de las células T de memoria con un antígeno o antígenos en presencia de IL-21. Este procedimiento de selección escoge únicamente las células que se activaron mediante antígeno o antígenos (por ejemplo, marcadores de activación expresa tal como se describe a continuación) y normalmente se realiza aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 24-36 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 36-48 horas, aproximadamente 12-48 horas, aproximadamente 48-60 horas, aproximadamente 12-60 horas, aproximadamente 60-72 horas, aproximadamente 12-72 horas, aproximadamente 72 84 horas, aproximadamente 12-84 horas, aproximadamente 84-96 horas, aproximadamente 12-96 horas, tras la puesta en contacto inicial de las células T de memoria con un antígeno o antígenos. Según un aspecto específico, el procedimiento de selección se realiza aproximadamente 12-24 horas (por ejemplo, 14 horas) tras la puesta en contacto inicial de las células T de memoria con un antígeno o antígenos.

El aislamiento de células activadas puede realizarse mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, tal como mediante el uso de perlas de MACS, clasificador de FACS y/o marcado con ELISA de captura) y puede realizarse hacia cualquier marcador de activación incluyendo marcadores de superficie celular tales como, pero sin limitarse a, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 o marcadores que no son de superficie celular tales como, pero sin limitarse a, IFN-y e IL-2. El aislamiento de células activadas también puede realizarse mediante purificación basada en morfología (por ejemplo, aislando células grandes) usando cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, mediante FACS). Normalmente, las células activadas también se seleccionan para determinar la de células c D8+. Además, puede usarse cualquier combinación de los métodos anteriores para aislar de manera eficiente células activadas.

Según un aspecto de la presente divulgación, la selección de células activadas se realiza mediante selección de células CD137+ y/o CD25+.

La segunda etapa de aislamiento de células activadas se lleva a cabo normalmente al final del cultivo (es decir, tras cultivaren un entorno libre de antígenos con IL-21, IL-15 e IL-7). Esta etapa empobrece células alorreactivas mediante empobrecimiento de las células que se activaron tras la puesta en contacto de los linfocitos T de memoria central (Tcm) con células presentadoras de antígeno de huésped irradiadas (APC, por ejemplo células dendríticas). Tal como se mencionó anteriormente, el aislamiento de células activadas puede realizarse mediante purificación basada en afinidad (por ejemplo, tal como mediante el uso de perlas de MACS, clasificador de FACS y/o marcado con ELISA de captura) y puede realizarse hacia cualquier marcador de activación incluyendo marcadores de superficie celular tales como, pero sin limitarse a, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 o marcadores que no son de superficie celular tales como, pero sin limitarse a, IFN-y e IL-2.

Según un aspecto de la presente divulgación, el empobrecimiento de las células alorreactivas se realiza mediante empobrecimiento de células CD137+ y/o CD25+.

Según un aspecto de la presente divulgación, el empobrecimiento de las células alorreactivas se realiza cultivando las células Tcm con células presentadoras de antígeno de huésped irradiadas (APC, por ejemplo células dendríticas) durante, por ejemplo, 12-24 horas (por ejemplo, 16 horas), aproximadamente 6-9 días (por ejemplo, en el día 8) desde el comienzo del cultivo (es decir, siendo el día 0 el primer día de cultivo de las células T de memoria con un antígeno o antígenos).

Según un aspecto, el aislamiento de células activadas se lleva a cabo únicamente mediante el uso de la primera etapa tal como se comentó anteriormente.

Según otro aspecto, el aislamiento de células activadas se lleva a cabo únicamente mediante el uso de la segunda etapa tal como se comentó anteriormente.

Según un aspecto, las células que no inducen GvHD que tienen un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm) de la divulgación no se producen de manera natural y no son un producto de la naturaleza. Estas células se producen normalmente mediante manipulaciónex vivo(es decir, exposición a un antígeno o antígenos en presencia de citocinas específicas).

Según un aspecto de la divulgación, se proporciona un método de generación de una población aislada de células que no inducen GvHD que comprenden un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células veto y/o estando dotadas de actividad anti-enfermedad, y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante, comprendiendo el método: (a) tratar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no adherentes con un agente que puede empobrecer células CD4+, CD56+ y CD45RA+ para obtener una población de células T de memoria que comprende un fenotipo CD45RA'CD8+; (b) poner en contacto la población de células T de memoria con un antígeno o antígenos en presencia de IL-21 para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (c) cultivar las células resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 y/o IL-7 para permitir la proliferación de células que comprenden un fenotipo de Tcm, generando de ese modo la población aislada de células que no inducen GvHD.

Según un aspecto de la divulgación, se proporciona un método de generación de una población aislada de células que no inducen GvHD que comprenden un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo las células células veto y/o estando dotadas de actividad anti-enfermedad, y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante, comprendiendo el método: (a) tratar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no adherentes con un agente que puede empobrecer células CD4+, CD56+ y CD45RA+ para obtener una población de células T de memoria que comprende un fenotipo CD45RA'CD8+; (b) poner en contacto la población de células T de memoria con un antígeno o antígenos virales en presencia de IL-21 para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (c) cultivar las células resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 y/o IL-7 para permitir la proliferación de células que comprenden el fenotipo de Tcm, generando de ese modo la población aislada de células que no inducen GvHD.

Según un aspecto, con el fin de obtener células T de memoria específicas para un antígeno o antígenos, el/los antígeno(s) (por ejemplo, antígeno tumoral, antígeno viral) se administra(n) al donante de células T de memoria antes de obtener células T de memoria a partir del mismo (por ejemplo, antes de proporcionar la población de al menos el 70 % de células T de memoria). Puede emplearse cualquier método de inmunizar a un donante de células frente a un antígeno con el fin de provocar una respuesta inmunogénica (por ejemplo, generación de células T de memoria).

El antígeno puede administrarse tal cual o como parte de una composición que comprende un adyuvante (por ejemplo, adyuvante completo de Freund (CFA) o adyuvante incompleto de Freund (IFA)). Según un aspecto, el antígeno se administra a un donante de células T de memoria una vez. Según un aspecto, el donante de células T de memoria recibe al menos una administración adicional (por ejemplo, refuerzo) del antígeno (por ejemplo, 2, 3, 4 o más administraciones). Una administración adicional de este tipo puede realizarse 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 21, 30 días o más tras la primera administración del antígeno.

Métodos adicionales de inmunización de un sujeto frente a un antígeno tumoral que pueden usarse con algunos aspectos de la divulgación (por ejemplo, vacunas basadas en células tales como vacunas de DC específicas de péptido, vacunas de DC frente a epítopos no definidos, uso de DC derivadas de leucemia para vacunación, plataforma GVAX®) se describen en Alatrash G. y Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50.

Con el fin de enriquecer adicionalmente las células T de memoria frente a un(os) antígeno(s) particular(es) y empobrecer clones alorreactivos a partir de la combinación de células T de memoria, las células T de memoria pueden ponerse adicionalmente en contacto con el mismo antígeno o antígenos (por ejemplo, el mismo antígeno que se administra al donante de células), tal como se describió anteriormente en el presente documento.

Los protocolos anteriormente descritos se usan normalmente para aplicaciones no singénicas y por tanto las células T de memoria o PBMC usadas son normalmente alogénicas con respecto a un sujeto (por ejemplo, de un donante alogénico). Asimismo, en casos en los que aplicaciones xenogénicas pueden resultar beneficiosas, las células T de memoria o PBMC usadas pueden ser de origen xenogénico tal como se comenta a continuación.

Sin embargo, en casos en los que aplicaciones singénicas pueden ser beneficiosas, las células T de memoria o PBMC usadas pueden ser autólogas con respecto a un sujeto (por ejemplo, del sujeto). Tales determinaciones están dentro de las capacidades de un experto en la técnica, especialmente a la vista de la divulgación proporcionada.

Por tanto, tal como se menciona, las células T de memoria o PBMC pueden ser singénicas o no singénicas con respecto a un sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, el término células “singénicas” se refiere a células que son esencialmente idénticas desde el punto de vista genético al sujeto o esencialmente todos los linfocitos del sujeto. Los ejemplos de células singénicas incluyen células derivadas del sujeto (también denominadas en la técnica “autólogas”), de un clon del sujeto, o de un gemelo idéntico del sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, el término células “no singénicas” se refiere a células que no son esencialmente idénticas desde el punto de vista genético al sujeto o esencialmente todos los linfocitos del sujeto, tales como células alogénicas o células xenogénicas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “alogénicas” se refiere a células que se derivan de un donante que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con respecto al sujeto. Normalmente, mamíferos gemelos no cigóticos, no consanguíneos, de la misma especie son alogénicos entre sí. Se apreciará que una célula alogénica puede ser idéntica con respecto a HLA, parcialmente idéntica con respecto a HLA o no idéntica con respecto a HLA (es decir, que presenta uno o más determinantes de HLA diferentes) con respecto al sujeto.

Según un aspecto, el donante de células es un ser humano.

Tal como se usa en el presente documento, el término “xenogénica” se refiere a una célula que expresa sustancialmente antígenos de una especie diferente con respecto a la especie de una proporción sustancial de los linfocitos del sujeto. Normalmente, mamíferos no consanguíneos de especies diferentes son xenogénicos entre sí.

La presente divulgación prevé que las células xenogénicas se derivan de una variedad de especies. Por tanto, según un aspecto, las células pueden derivarse de cualquier mamífero. Los orígenes de especies adecuados para las células comprenden los principales primates y animales domésticos o de ganadería. Tales animales incluyen, pero no se limitan a, porcinos (por ejemplo, cerdos), bovinos (por ejemplo, vacas), equinos (por ejemplo, caballos), ovinos (por ejemplo, cabras, ovejas), felinos (por ejemplo,Felis domestica),caninos (por ejemplo,Canis domestica),roedores (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas, jerbos, hámsteres), y primates (por ejemplo, chimpancés, macacos cangrejeros, macacos, titís).

Las células de origen xenogénico (por ejemplo, origen porcino) se obtienen preferiblemente de una fuente que se sabe que está libre de zoonosis, tales como retrovirus endógenos porcinos. De manera similar, las células o tejidos derivados de ser humano se obtienen preferiblemente de fuentes sustancialmente libres de patógenos.

Por tanto, la fuente de las células T de memoria o PBMC se determinará con respecto al uso previsto de las células (véanse más detalles a continuación en el presente documento) y está dentro de las capacidades de un experto en la técnica, especialmente a la vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

El uso de células veto es especialmente beneficioso en situaciones en las que hay necesidad de eliminar rechazo de injerto o superar enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), tal como en trasplante de células o tejidos alogénicos o xenogénicos.

Tal como se mencionó anteriormente, las células veto de la divulgación están dotadas además de actividad anti enfermedad y por tanto son beneficiosas en situaciones en las que un sujeto, por ejemplo sujeto sometido a trasplante, tiene una enfermedad o estado (por ejemplo, enfermedad o estado maligno, viral, bacteriano, fúngico, autoinmunitario o alérgico), antes o después del trasplante (por ejemplo, antes de establecerse la reconstitución inmunitaria).

Por tanto, según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células que no inducen GvHD de algunos aspectos de la divulgación (es decir células Tcm), tratando de ese modo la enfermedad en el sujeto.

Según otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto que necesita un trasplante de células o tejido, comprendiendo el método: (a) trasplantar un trasplante de células o tejido en el sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células que no inducen GvHD de algunos aspectos de la divulgación (es decir células Tcm), tratando de ese modo al sujeto que necesita el trasplante de células o tejido.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” incluye eliminar, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de un estado, mejorar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de un estado o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de un estado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” o “sujeto que lo necesita” se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano, de sexo masculino o femenino, de cualquier edad, que necesita un trasplante de células o tejido o padece una enfermedad que puede tratarse con las células Tcm. Normalmente, el sujeto necesita trasplante de células o tejido (también denominado en el presente documento receptor) debido a un trastorno o una afección, estado o síndrome patológico o no deseado, o una anomalía física, morfológica o fisiológica que puede someterse a tratamiento mediante trasplante de células o tejido. Más adelante se proporcionan ejemplos de tales trastornos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad de células Tcm eficiente para la tolerización (es decir, efecto veto), efecto anti-enfermedad, efecto anti-tumoral y/o reconstitución inmunitaria sin inducir GvHD. Dado que las células Tcm de la presente divulgación se dirigen a los ganglios linfáticos tras el trasplante, pueden necesitarse cantidades inferiores de células (en comparación con la dosis de células anteriormente usada, véase, por ejemplo, el documento WO 2001/049243) para lograr el/los efecto(s) beneficioso(s) de las células (por ejemplo, tolerización, anti-enfermedad, efecto anti-tumoral y/o reconstitución inmunitaria). Se apreciará que pueden necesitarse niveles inferiores de fármacos inmunosupresores (comentados a continuación) junto con las células Tcm de la presente divulgación (tal como exclusión de rapamicina a partir del protocolo terapéutico).

La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la divulgación, la cantidad terapéuticamente eficaz o dosis puede estimarse inicialmente a partir de ensayosin vitroy de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar una concentración o título deseado. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos.

Por ejemplo, en el caso de trasplante de células, el número de células Tcm administradas por infusión a un receptor debe ser de más de 1 * 104/kg de peso corporal. El número de células Tcm administradas por infusión a un receptor debe estar normalmente en el intervalo de 1 * 103/kg de peso corporal a 1 * 104/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 104/kg de peso corporal a 1 * 105/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 104/kg de peso corporal a 1 * 106/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 104/kg de peso corporal a 10 * 107/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 104/kg de peso corporal a 1 * 108/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 103/kg de peso corporal a 1 * 105/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 104/kg de peso corporal a 1 * 106/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 106/kg de peso corporal a 10 * 107/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 105/kg de peso corporal a 10 * 107/kg de peso corporal, intervalo de 1 * 106/kg de peso corporal a 1 * 108/kg de peso corporal. Según un aspecto específico, el número de células Tcm administradas por infusión a un receptor debe estar en el intervalo de 1 * 105/kg de peso corporal a 10 * 107/kg de peso corporal.

Por tanto, el método de la presente divulgación puede aplicarse para tratar cualquier enfermedad tal como, pero sin limitarse a, una enfermedad maligna, una enfermedad asociada con trasplante de un injerto (por ejemplo, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, enfermedad viral, enfermedad fúngica o una enfermedad bacteriana), una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria y/o una enfermedad o estado alérgico.

Según un aspecto, el sujeto tiene una enfermedad maligna.

Las enfermedades malignas (también denominadas cánceres) que pueden tratarse mediante el método de algunos aspectos de la divulgación pueden ser cualquier tumor sólido o no sólido y/o metástasis tumoral.

Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, sarcoma de tejido blando, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma carcinoide, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, mesotelioma, mieloma múltiple, trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, tumor cerebral). Los estados cancerosos que pueden someterse a tratamiento de la divulgación incluyen cánceres metastásicos.

Según un aspecto, la enfermedad maligna es una neoplasia hematológica. Las neoplasias hematológicas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, leucemia [por ejemplo, linfática aguda, linfoblástica aguda, linfoblástica aguda de células pre-B, leucemia de células T linfoblástica aguda, megacarioblástica aguda, monocítica, mielógena aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de células B, basófila, mieloide crónica, crónica, de células B, eosinófila, de Friend, granulocítica o mielocítica, de células pilosas, linfocítica, megacarioblástica, monocítica, monocítica de macrófagos, mieloblástica, mieloide, mielomonocítica, de células plasmáticas, de células pre-B, promielocítica, subaguda, de células T, neoplásica linfoide, de predisposición a neoplasia mieloide, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL) y leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL)] y linfoma [por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, de Burkitt, cutáneo de células T, histiocítico, linfoblástico, de células T, del timo, de células B, incluyendo de grado bajo/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); de NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado algo; NHL de células no hendidas pequeñas de grado alto; NHL con gran masa tumoral; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom].

Según un aspecto específico, la enfermedad maligna es una leucemia, un linfoma, un mieloma, un melanoma, un sarcoma, un neuroblastoma, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un cáncer de mama, un cáncer de ovarios, un cáncer de esófago, un cáncer de células sinoviales, un cáncer hepático y un cáncer pancreático.

Según un aspecto, el sujeto tiene una enfermedad no maligna.

Según un aspecto, la enfermedad no maligna es una disfunción o fallo orgánico, una enfermedad hematológica, una enfermedad relacionada con injerto, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alérgica, un traumatismo y una lesión.

Enfermedades inflamatorias: incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades inflamatorias agudas.

Enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad

Los ejemplos de hipersensibilidad incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad de tipo I, hipersensibilidad de tipo II, hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por complejo inmunitario, hipersensibilidad mediada por linfocitos T y DTH.

Hipersensibilidad de tipo I o inmediata, tal como asma.

La hipersensibilidad de tipo II incluye, pero no se limita a, enfermedades reumatoides, enfermedades autoinmunitarias reumatoides, artritis reumatoide (Krenn V.et al.,Histol Histopathol, julio de 2000; 15 (3):791), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkelet al.,Arthritis Res, 2001; 3 (3): 189), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunitarias sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Erikson J.et al.,Immunol Res, 1998; 17 (1-2):49), esclerosis, esclerosis sistémica (Renaudineau Y.et al.,Clin Diagn Lab Immunol, marzo de 1999; 6 (2):156); Chan OT.et al.,Immunol Rev, junio de 1999; 169:107), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunitarias glandulares, enfermedades autoinmunitarias pancreáticas, diabetes, diabetes tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract, octubre de 1996; 34, Sup.:S125), enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am, junio de 2000; 29 (2):339), tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol, 15 de diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N.et al.,Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1759); enfermedades reproductoras autoinmunitarias, enfermedades de ovarios, autoinmunidad de ovarios (Garza KM.et al.,J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), esterilidad antiespermatozoides autoinmunitaria (Diekman AB.et al.,Am J Reprod Immunol., marzo de 2000; 43 (3):134), pérdida fetal repetida (Tincani A.et al.,Lupus, 1998; 7, sup. 2:S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunitarias neurológicas, esclerosis múltiple (Cross AH.et al.,J Neuroimmunol, 1 de enero de 2001; 112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L.et al.,J Neural Transm, sup. 1997; 49:77), miastenia grave (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol, 1999; 18 (1-2):83), neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci., mayo de 2000; 7 (3):191), síndrome de Guillain-Barre, neuropatías y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci., abril de 2000; 319 (4):234), enfermedades miasténicas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci., abril de 2000; 319 (4):204), enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásica, síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofias cerebelares, atrofias cerebelares progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Sydenham, síndrome de Gilles de la Tourette, poliendocrinopatías, poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (Paris), enero de 2000; 156 (1):23); neuropatías, neuropatías autoinmunitarias (Nobile-Orazio E.et al.,Electroencephalogr Clin Neurophysiol, sup. 1999; 50:419); neuromiotonía, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A.et al.,Ann N Y Acad Sci., 13 de mayo de 1998; 841:482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias cardiovasculares, aterosclerosis (Matsuura E.et al.,Lupus, 1998; 7, sup. 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus., 1998; 7 sup. 2:S132), trombosis (Tincani A.et al.,Lupus, 1998; 7 sup. 2:S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y síndrome de Kawasaki (Praprotnik S.et al.,Wien Klin Wochenschr, 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660); enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S.et al.,Semin Thromb Hemost., 2000; 26 (2):157); vasculitis, vasculitis de vasos pequeños necrotizante, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis necrotizante focal pauciinmunitaria, glomerulonefritis con semilunas (Noel LH. Ann Med Interne (Paris), mayo de 2000; 151 (3):178); síndrome antifosfolípidos (Flamholz R.et al.,J Clin Apheresis, 1999; 14 (4):171); insuficiencia cardíaca, anticuerpos frente a receptor adrenérgico p de tipo agonista en insuficiencia cardíaca (Wallukat G.et al.,Am J Cardiol., 17 de junio de 1999; 83 (12A):75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int., abril-junio de 1999; 14 (2):114); anemia hemolítica, anemia hemolítica autoinmunitaria (Efremov DG.et al.,Leuk Lymphoma, enero de 1998; 28 (3-4):285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunitarias del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad intestinal inflamatoria crónica (Garcia Herola A.et al.,Gastroenterol Hepatol., enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celiaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah, 16 de enero de 2000; 138 (2):122), enfermedades autoinmunitarias de la musculatura, miositis, miositis autoinmunitaria, síndrome de Sjogren (Feist E.et al.,Int Arch Allergy Immunol, septiembre de 2000; 123 (1):92); enfermedad autoinmunitaria de músculo liso (Zauli D.et al.,Biomed Pharmacother, junio de 1999; 53 (5-6):234), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunitarias hepáticas, hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol, agosto de 2000; 33 (2):326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP.et al.,Eur J Gastroenterol Hepatol., junio de 1999; 11 (6):595).

La hipersensibilidad de tipo IV o mediada por células T incluye, pero no se limita a, enfermedades reumatoides, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA, 18 de enero de 1994; 91 (2):437), enfermedades sistémicas, enfermedades autoinmunitarias sistémicas, lupus eritematoso sistémico (Datta SK., Lupus, 1998; 7 (9):591), enfermedades glandulares, enfermedades autoinmunitarias glandulares, enfermedades pancreáticas, enfermedades autoinmunitarias pancreáticas, diabetes tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol., 8:647); enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Sakata S.et al.,Mol Cell Endocrinol, marzo de 1993; 92 (1):77); enfermedades de ovarios (Garza KM.et al.,J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), prostatitis, prostatitis autoinmunitaria (Alexander RB.et al.,Urology, diciembre de 1997; 50 (6) :893), síndrome poliglandular, síndrome poliglandular autoinmunitario, síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I (Hara T.et al.,Blood., 1 de marzo de 1991; 77 (5):1127), enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunitarias, esclerosis múltiple, neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M.et al.,J Neurol Neurosurg Psychiatry, mayo de 1994; 57 (5):544), miastenia grave (Oshima M.et al.,Eur J Immunol, diciembre de 1990; 20 (12):2563), síndrome de la persona rígida (Hiemstra HS.et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 27 de marzo de 2001; 98 (7) :3988), enfermedades cardiovasculares, autoinmunidad cardíaca en enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E.et al.,J Clin Invest, 15 de octubre de 1996; 98 (8):1709), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (Semple JW.et al.,Blood, 15 de mayo de 1996; 87 (10):4245), autoinmunidad anti-linfocitos T cooperadores (Caporossi AP.et al.,Viral Immunol, 1998; 11 (1):9), anemia hemolítica (Sallah S.et al.,Ann Hematol, marzo de 1997; 74 (3):139), enfermedades hepáticas, enfermedades autoinmunitarias hepáticas, hepatitis, hepatitis activa crónica (Franco A.et al.,Clin Immunol Immunopathol, marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar, cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch), noviembre de 1996; 91 (5):551), enfermedades nefríticas, enfermedades autoinmunitarias nefríticas, nefritis, nefritis intersticial (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, agosto de 1990; 1 (2):140), enfermedades del tejido conjuntivo, enfermedades del oído, enfermedades del tejido conjuntivo autoinmunitarias, enfermedad del oído autoinmunitaria (Yoo TJ.et al.,Cell Immunol, agosto de 1994; 157 (1):249), enfermedad del oído interno (Gloddek B.et al.,Ann N Y Acad Sci, 19 de diciembre de 1997; 830:266), enfermedades de la piel, enfermedades cutáneas, enfermedades dérmicas, enfermedades ampollosas de la piel, pénfigo vulgar, pénfigo ampolloso y pénfigo foliáceo.

Los ejemplos de hipersensibilidad de tipo retardado incluyen, pero no se limitan a, dermatitis de contacto y exantema medicamentoso.

Los ejemplos de tipos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos.

Los ejemplos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T cooperadores incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad mediada por linfocitos Th1 e hipersensibilidad mediada por linfocitos Th2.

Enfermedades autoinmunitarias

Incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculares, enfermedades nefríticas, enfermedades relacionadas con la reproducción, enfermedades del tejido conjuntivo y enfermedades sistémicas.

Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a aterosclerosis (Matsuura E.et al.,Lupus, 1998; 7 sup. 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus, 1998; 7 sup. 2:S132), trombosis (Tincani A.et al.,Lupus, 1998; 7 sup. 2:S107-9), granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S.et al.,Wien Klin Wochenschr, 25 de agosto de 2000; 112 (15-16):660), enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S.et al.,Semin Thromb Hemost., 2000; 26 (2):157), vasculitis de vasos pequeños necrotizante, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis con semilunas y necrotizante focal pauciinmunitaria (Noel LH. Ann Med Interne (Paris), mayo de 2000; 151 (3):178), síndrome antifosfolípidos (Flamholz R.et al.,J Clin Apheresis, 1999; 14 (4):171), insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos (Wallukat G.et al.,Am J Cardiol., 17 de junio de 1999; 83 (12A):75H), púrpura trombocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int., abril-junio de 1999; 14 (2):114; Semple JW.et al.,Blood, 15 de mayo de 1996; 87 (10):4245), anemia hemolítica autoinmunitaria (Efremov DG.et al.,Leuk Lymphoma, enero de 1998; 28 (3-4):285; Sallah S.et al.,Ann Hematol, marzo de 1997; 74 (3):139), autoinmunidad cardíaca en enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E.et al.,J Clin Invest, 15 de octubre de 1996; 98 (8):1709) y autoinmunidad anti-linfocitos T cooperadores (Caporossi AP.et al.,Viral Immunol, 1998; 11 (1):9).

Los ejemplos de enfermedades reumatoides autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide (Krenn V.et al.,Histol Histopathol, julio de 2000; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A, 18 de enero de 1994; 91 (2):437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkelet al.,Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).

Los ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad pancreática, diabetes tipo I, enfermedad tiroidea, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad de ovarios, esterilidad antiespermatozoides autoinmunitaria, prostatitis autoinmunitaria y síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I. Las enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunitarias del páncreas, diabetes tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol., 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract, octubre de 1996; 34 sup.:S125), enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am, junio de 2000; 29 (2):339; Sakata S.et al.,Mol Cell Endocrinol, marzo de 1993; 92 (1):77), tiroiditis autoinmunitaria espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol, 15 de diciembre de 2000; 165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N.et al.,Nippon Rinsho, agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho., agosto de 1999; 57 (8):1759), autoinmunidad de ovarios (Garza KM.et al.,J Reprod Immunol, febrero de 1998; 37 (2):87), esterilidad antiespermatozoides autoinmunitaria (Diekman AB.et al.,Am J Reprod Immunol., marzo de 2000; 43 (3):134), prostatitis autoinmunitaria (Alexander RB.et al.,Urology, diciembre de 1997; 50 (6):893) y síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I (Hara T.et al.,Blood., 1 de marzo de 1991; 77 (5):1127).

Los ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (Garcia Herola A.et al.,Gastroenterol Hepatol., enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celiaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah, 16 de enero de 2000; 138 (2):122), colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.

Los ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades ampollosas de la piel autoinmunitarias, tales como, pero sin limitarse a, pénfigo vulgar, pénfigo ampolloso y pénfigo foliáceo.

Los ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmunitaria (Franco A.et al.,Clin Immunol Immunopathol, marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch), noviembre de 1996; 91 (5):551; Strassburg CP.et al.,Eur J Gastroenterol Hepatol., junio de 1999; 11 (6):595) y hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol, agosto de 2000; 33 (2):326).

Los ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple (Cross AH.et al.,J Neuroimmunol, 1 de enero de 2001; 112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L.et al.,J Neural Transm sup. 1997; 49:77), miastenia grave (Infante AJ. Y Kraig E, Int Rev Immunol, 1999; 18 (1-2):83; Oshima M.et al.,Eur J Immunol, diciembre de 1990; 20 (12):2563), neuropatías, neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci., mayo de 2000; 7 (3):191); síndrome de Guillain-Barre y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci., abril de 2000; 319 (4):234), miastenia, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci., abril de 2000; 319 (4):204); enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplásica y síndrome de la persona rígida (Hiemstra HS.et al.,Proc Natl Acad Sci units S A, 27 de marzo de 2001; 98 (7):3988); síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofias cerebelares progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Sydenham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (Paris), enero de 2000; 156 (1):23); neuropatías autoinmunitarias (Nobile-Orazio E.et al.,Electroencephalogr Clin Neurophysiol, sup. 1999; 50:419); neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A.et al.,Ann N Y Acad Sci., 13 de mayo de 1998; 841:482), neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M.et al.,J Neurol Neurosurg Psychiatry, mayo de 1994; 57 (5):544) y enfermedades neurodegenerativas.

Los ejemplos de enfermedades musculares autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, miositis, miositis autoinmunitaria y síndrome de Sjogren primario (Feist E.et al.,Int Arch Allergy Immunol, septiembre de 2000; 123 (1):92) y enfermedad autoinmunitaria de músculo liso (Zauli D.et al.,Biomed Pharmacother, junio de 1999; 53 (5-6):234).

Los ejemplos de enfermedades nefríticas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, nefritis y nefritis intersticial autoinmunitaria (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol, agosto de 1990; 1 (2):140).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la reproducción incluyen, pero no se limitan a, pérdida fetal repetida (Tincani A.et al.,Lupus, 1998; 7 sup. 2:S107-9).

Los ejemplos de enfermedades del tejido conjuntivo autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunitarias del oído (Yoo TJ.et al.,Cell Immunol, agosto de 1994; 157 (1):249) y enfermedades autoinmunitarias del oído interno (Gloddek B.et al.,Ann N Y Acad Sci, 19 de diciembre de 1997; 830:266).

Los ejemplos de enfermedades sistémicas autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistémico (Erikson J.et al.,Immunol Res 1998; 17 (1-2):49) y esclerosis sistémica (Renaudineau Y.et al.,Clin Diagn Lab Immunol., marzo de 1999; 6 (2):156); Chan OT.et al.,Immunol Rev, junio de 1999; 169:107).

Enfermedades infecciosas

Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades virales, enfermedades bacterianas, enfermedades protozoarias, enfermedades parasíticas, enfermedades fúngicas, enfermedades de micoplasma y enfermedades de priones.

Tipos específicos de patógenos virales que provocan enfermedades infecciosas que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, circovirus, parvovirus, papovavirus, adenovirus, herpesvirus, iridovirus, poxvirus, hepadnavirus, picornavirus, calicivirus, togavirus, flavivirus, reovirus, ortomixovirus, paramixovirus, rabdovirus, buniavirus, coronavirus, arenavirus y filovirus.

Ejemplos específicos de infecciones virales que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) inducido por virus de inmunodeficiencia humano (VIH), influenza, infección rinoviral, meningitis viral, infección por virus de Epstein-Barr (VEB), infección por virus de la hepatitis A, B o C, sarampión, infección por virus del papiloma/verrugas, infección por citomegalovirus (CMV), infección por virus del herpes simple, fiebre amarilla, infección por virus del Ébola, rabia, adenovirus (Adv), virus del resfriado, virus de la gripe, encefalitis japonesa, poliomielitis, sincitial respiratorio, rubeola, viruela, varicela-zóster, rotavirus, virus del Nilo occidental y virus de Zika.

Ejemplos específicos de infecciones bacterianas que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por ántrax; bacilos gram-negativos, clamidia, difteria,Haemophilus influenza, Helicobacter pylori,malaria,Mycobacterium tuberculosis,toxina pertussis, neumococos,Rickettsia,estafilococos, estreptococos y tétanos.

Ejemplos específicos de infecciones por bacterias superresistentes (por ejemplo, bacterias resistentes a múltiples fármacos) que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, las provocadas porEnterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa,yEnterobacteriaceae(incluyendoEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.).

Ejemplos específicos de infecciones fúngicas que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, las provocadas por cándida, coccidiodes, criptococos, histoplasma, leishmania, plasmodio, protozoos, parásitos, esquistosomas, tiñas, toxoplasma, yTrypanosoma cruzi.

Enfermedades de rechazo de injerto

Según otro aspecto, la enfermedad está asociada con trasplante de un injerto. Los ejemplos de enfermedades asociadas con trasplante de un injerto incluyen, pero no se limitan a, rechazo de injerto, rechazo de injerto crónico, rechazo de injerto subagudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo de injerto agudo, rechazo de aloinjerto, rechazo de xenoinjerto y enfermedad de injerto contra huésped (GVHD).

Enfermedades alérgicas

Los ejemplos de enfermedades alérgicas incluyen, pero no se limitan a, asma, ronchas, urticaria, alergia al polen, alergia a los ácaros del polvo, alergia a veneno, alergia a cosméticos, alergia al látex, alergia química, alergia a fármacos, alergia a picaduras de insectos, alergia a caspa de animales, alergia a plantas punzantes, alergia a hiedra venenosa y alergia alimentaria.

Enfermedad hematológica no maligna

Los ejemplos de enfermedades hematológicas no malignas incluyen, pero no se limitan a, anemia, trastornos de la médula ósea, trombosis de venas profundas/embolia pulmonar, anemia de Diamond-Blackfan, hemocromatosis, hemofilia, trastornos hematológicos inmunitarios, trastornos de metabolismo del hierro, enfermedad drepanocítica, talasemia, trombocitopenia y enfermedad de Von Willebrand.

Con el fin de potenciar la actividad anti-enfermedad de las células Tcm, resulta beneficioso seleccionar un antígeno o antígenos asociados con la enfermedad que va a tratarse y generar células Tcm específicas de antígeno para el tratamiento.

Por tanto, según un aspecto, el método comprende: (a) analizar una muestra biológica de un sujeto para determinar la presencia de un antígeno o antígenos asociados con la enfermedad; (b) generar una población aislada de células que no inducen GvHD según el método de algunos aspectos de la divulgación frente al antígeno o antígenos asociados con la enfermedad para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y (c) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células que no inducen GvHD de (b), tratando de ese modo la enfermedad en el sujeto.

Tal como se usa en el presente documento “una muestra biológica” se refiere a una muestra de líquido o muestra de tejido derivada de un sujeto. Los ejemplos de “muestras biológicas” incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, líquidos linfáticos, biopsia de tejido, y diversas secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche así como glóbulos blancos, tejidos, cultivo celular, por ejemplo, cultivo primario.

En la técnica se conocen métodos de obtención de tales muestras biológicas incluyendo, pero sin limitarse a, procedimientos de extracción de sangre convencionales, recogida de orina, y punción lumbar.

La determinación de la presencia de un antígeno o antígenos en una muestra biológica puede llevarse a cabo usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante serología (pruebas para determinar la presencia de un patógeno), cultivo bacteriano, pruebas de sensibilidad bacteriana, pruebas para hongos, virus, micobacterias (pruebas de AFB) y/o parásitos, electroforesis, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), análisis por inmunotransferencia tipo Western y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Una vez realizado el análisis, se seleccionan el antígeno o antígenos y se generan células Tcm a partir de una población de células T de memoria, tal como se comentó anteriormente, usando el antígeno o antígenos específicos para la enfermedad (por ejemplo, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos bacterianos, etc.) y se administran al sujeto para el tratamiento.

Tal como se comentó anteriormente, las células Tcm de la divulgación están dotadas de actividad veto. Por consiguiente, las células Tcm de la presente divulgación pueden usarse como terapia adyuvante para un trasplante de células o tejido. Dado que las células Tcm de la presente divulgación también están dotadas de actividad anti enfermedad, el método de la presente divulgación puede aplicarse además ventajosamente hacia el tratamiento de una enfermedad en un sujeto al tiempo que se facilita simultáneamente el injerto de un trasplante de células o tejidos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “trasplante de células o tejido” se refiere a una célula corporal (por ejemplo, una única célula o un grupo de células) o tejido (por ejemplo, tejidos/órganos sólidos o tejidos blandos, que pueden trasplantarse total o parcialmente). Los tejidos u órganos a modo de ejemplo que pueden trasplantarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, hígado, páncreas, bazo, riñón, corazón, pulmón, piel, intestino y tejidos linfoides/hematopoyéticos (por ejemplo, ganglio linfático, placas de Peyer, timo o médula ósea). Las células a modo de ejemplo que pueden trasplantarse según las presentes enseñanzas incluyen, pero no se limitan a, células hematopoyéticas inmaduras, incluyendo células madre, células cardíacas, células hepáticas, células pancreáticas, células del bazo, células pulmonares, células cerebrales, células nefríticas, células del intestino, células del ovario, células de la piel (por ejemplo, población aislada de cualquiera de estas células). Además, la presente divulgación también contempla el trasplante de órganos enteros, tales como, por ejemplo, riñón, corazón, hígado o piel.

Dependiendo de la aplicación, el método puede realizarse usando una célula o tejido que es singénico o no singénico con respecto al sujeto.

Según un aspecto de la presente divulgación, tanto el sujeto como el donante son seres humanos.

Dependiendo de la aplicación y las fuentes disponibles, las células o tejidos de la presente divulgación pueden obtenerse a partir de un organismo prenatal, organismo postnatal, un donante adulto o cadavérico. Además, dependiendo de la aplicación necesitada, las células o tejidos pueden estar indiferenciados o modificados genéticamente. Tales determinaciones se encuentran dentro de las habilidades de un experto habitual en la técnica.

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para obtener una célula o tejido (por ejemplo, para trasplante).

El trasplante de la célula o tejido al sujeto puede realizarse de numerosas maneras, dependiendo de diversos parámetros, tales como, por ejemplo, el tipo de célula o tejido; el tipo, estadio o intensidad de la enfermedad del receptor (por ejemplo, fallo orgánico); los parámetros físicos o fisiológicos específicos del sujeto; y/o el desenlace terapéutico deseado.

El trasplante de un trasplante de células o tejido de la presente divulgación puede realizarse trasplantando el trasplante de células o tejido en una cualquiera de diversas ubicaciones anatómicas, dependiendo de la aplicación. El trasplante de células o tejido puede trasplantarse en una ubicación anatómica homotópica (una ubicación anatómica normal para el trasplante), o en una ubicación anatómica ectópica (una ubicación anatómica anómala para el trasplante). Dependiendo de la aplicación, el trasplante de células o tejido puede implantarse ventajosamente bajo la cápsula renal, o en el riñón, la grasa testicular, la hipodermis, el epiplón, la vena porta, el hígado, el bazo, la cavidad cardíaca, el corazón, la cavidad torácica, el pulmón, la piel, el páncreas y/o el espacio intraabdominal.

Por ejemplo, un tejido hepático según las presentes enseñanzas puede trasplantarse en el hígado, la vena porta, la cápsula renal, la hipodermis, el epiplón, el bazo, y el espacio intraabdominal. El trasplante de hígado en diversas ubicaciones anatómicas tales como estas se realiza habitualmente en la técnica para tratar enfermedades que pueden someterse a tratamiento mediante trasplante hepático (por ejemplo, insuficiencia hepática). De manera similar, el trasplante de un tejido pancreático según la presente divulgación puede realizarse ventajosamente trasplantando el tejido en la vena porta, el hígado, el páncreas, la grasa testicular, la hipodermis, el epiplón, un bucle intestinal (la capa subserosa de un bucle U del intestino delgado) y/o el espacio intraabdominal. El trasplante de tejido pancreático puede usarse para tratar enfermedades que pueden someterse a tratamiento mediante trasplante pancreático (por ejemplo, diabetes). Asimismo, el trasplante de tejidos tales como un riñón, un corazón, un pulmón o tejido cutáneo puede llevarse a cabo en cualquier ubicación anatómica descrita anteriormente con el fin de tratar a receptores que padecen, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca, insuficiencia pulmonar o daño de la piel (por ejemplo, quemaduras). En casos en los que se trasplantan células aisladas, tales células pueden administrarse, por ejemplo, por una vía intravenosa, una vía intratraqueal, una vía intraperitoneal o una vía intranasal.

El método de la presente divulgación también puede usarse, por ejemplo, para tratar a un receptor que padece una enfermedad que requiere trasplante de células hematopoyéticas inmaduras.

En este último caso, células hematopoyéticas inmaduras autólogas, alogénicas o xenogénicas (incluyendo células madre) que pueden derivarse, por ejemplo, de médula ósea, sangre periférica movilizada (por ejemplo mediante leucaféresis), hígado fetal, saco vitelino y/o sangre del cordón umbilical del donante, pueden trasplantarse a un receptor que padece una enfermedad. Según un aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras son células hematopoyéticas inmaduras CD34+ sometidas a empobrecimiento de células T. Una enfermedad de este tipo incluye, pero no se limita a, leucemia [por ejemplo, linfática aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoblástica aguda de células pre-B, leucemia linfoblástica aguda de células T, megacarioblástica aguda, monocítica, mielógena aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de células B, basófila, mieloide crónica, crónica, de células B, eosinófila, de Friend, granulocítica o mielocítica, leucemia mielocítica aguda (AML) o leucemia mielocítica crónica (CML), de células pilosas, linfocítica, megacarioblástica, monocítica, monocítica de macrófagos, mieloblástica, mieloide, mielomonocítica, de células plasmáticas, de células pre-B, promielocítica, subaguda, de células T, neoplásica linfoide, de predisposición a neoplasia mieloide, leucemia no linfocítica aguda, leucemia no linfoblástica aguda ANLL), leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL) y leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL)], linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, de células B, Burkitt, cutáneo de células T, histiocítico, linfoblástico, de células T, del tipo), síndrome de inmunodeficiencia combinada severa (SCID), incluyendo adenosina desaminasa (ADA), osteopetrosis, anemia aplásica, enfermedad de Gaucher, talasemia y otras anomalías hematopoyéticas congénitas o genéticamente determinadas.

Se apreciará que las células hematopoyéticas inmaduras autólogas, alogénicas o xenogénicas de la presente divulgación pueden trasplantarse en un receptor usando cualquier método conocido en la técnica para el trasplante de células, tal como, pero sin limitarse a, infusión celular (por ejemplo, i.v.) o mediante una vía intraperitoneal.

Opcionalmente, cuando se trasplanta un trasplante de células o tejido de la presente divulgación en un sujeto que tiene un órgano defectuoso, puede resultar ventajoso extirpar en primer lugar, al menos parcialmente, el órgano con insuficiencia del sujeto para permitir un desarrollo óptimo del trasplante, y una integración estructural/funcional del mismo con la anatomía/fisiología del sujeto.

Según un aspecto, el trasplante de células o tejido se deriva de un donante alogénico. Según un aspecto, el trasplante de células o tejido se deriva de un donante alogénico idéntico con respecto a HLA o de un donante alogénico no idéntico con respecto a HLA. Según un aspecto, el trasplante de células o tejido se deriva de un donante xenogénico.

Según un aspecto, el trasplante de células o tejido y la población aislada de células Tcm se derivan del mismo donante (por ejemplo, no singénico).

Según un aspecto, el trasplante de células o tejido y la población aislada de células Tcm se derivan de donantes diferentes (por ejemplo, no singénicos). Por consiguiente, el trasplante de células o tejido puede ser no singénico con respecto a las células Tcm.

Según un aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células Tcm se derivan del mismo donante (por ejemplo, no singénico).

Según un aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras y la población aislada de células Tcm se derivan de donantes diferentes (por ejemplo, no singénicos). Por consiguiente, las células hematopoyéticas inmaduras pueden no ser singénicas con respecto a las células Tcm.

El método de la presente divulgación también prevé el trasplante conjunto de varios órganos (por ejemplo, tejidos cardíaco y pulmonar) en el caso en el que el sujeto pueda recibir un efecto beneficioso de tal procedimiento.

Según un aspecto, el trasplante conjunto comprende el trasplante de células hematopoyéticas inmaduras y un tejido/órgano sólido o varios órganos/tejidos sólidos.

Según un aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras y el órgano sólido se obtienen del mismo donante.

Según otro aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras y el órgano/tejido u órganos/tejido sólidos se obtienen de donantes diferentes (por ejemplo, no singénicos).

Según un aspecto, las células hematopoyéticas inmaduras se trasplantan antes de, de manera simultánea con, o tras el trasplante del órgano sólido.

Según un aspecto, en primer lugar se induce quimerismo hematopoyético en el sujeto mediante trasplante de células hematopoyéticas inmaduras junto con las células Tcm de la presente divulgación, conduciendo a tolerancia de otros tejidos/órganos trasplantados del mismo donante.

Según un aspecto, las células Tcm de la presente divulgación se usan en sí mismas para la reducción de rechazo de tejidos/órganos trasplantados, órganos trasplantados del mismo donante.

Tras el trasplante del trasplante de células o tejido en el sujeto según las presentes enseñanzas, es aconsejable, según la práctica médica convencional, monitorizar la funcionalidad de crecimiento e inmunocompatabilidad del órgano según una cualquiera de diversas técnicas convencionales en la técnica. Por ejemplo, la funcionalidad de un trasplante de tejido pancreático puede monitorizarse tras el trasplante mediante pruebas de función pancreática convencionales (por ejemplo, análisis de niveles en suero de insulina). Asimismo, un trasplante de tejido hepático puede monitorizarse tras el trasplante mediante pruebas de función hepática convencionales (por ejemplo, análisis de niveles en suero de albúmina, proteína total, ALT, AST y bilirrubina, y análisis de tiempo de coagulación de la sangre). El desarrollo estructural de las células o tejidos puede monitorizarse mediante tomografía computarizada u obtención de imágenes por ultrasonidos.

Dependiendo del contexto de trasplante, con el fin de facilitar el injerto del trasplante de células o tejido, el método puede comprender además ventajosamente acondicionar al sujeto en condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “subletal”, “letal” y “supraletal”, cuando se refieren al acondicionamiento de sujetos de la presente divulgación, se refieren a tratamientos mielotóxicos y/o linfocitotóxicos que, cuando se aplican a una población representativa de los sujetos, respectivamente, son normalmente: no letales frente a esencialmente todos los miembros de la población; letales frente a algunos pero no todos los miembros de la población; o letales esencialmente para todos los miembros de la población en condiciones normales de esterilidad.

Según algunos aspectos de la divulgación, el acondicionamiento subletal, letal o supraletal comprende una irradiación corporal total (TBI), irradiación linfoide total (TLI, es decir, exposición de todos los ganglios linfáticos, el timo y el bazo), irradiación corporal parcial (por ejemplo, exposición específica de los pulmones, riñón, cerebro, etc.), acondicionamiento mieloablativo y/o acondicionamiento no mieloablativo, por ejemplo con diferentes combinaciones incluyendo, pero sin limitarse a, bloqueo coestimulante, agente quimioterápico y/o inmunoterapia con anticuerpos. Según algunos aspectos de la divulgación, el acondicionamiento comprende una combinación de cualquiera de los protocolos de acondicionamiento anteriormente descritos (por ejemplo, agente quimioterápico y TBI, bloqueo coestimulante y agente quimioterápico, inmunoterapia con anticuerpos y agente quimioterápico, etc.).

Según un aspecto, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccional dentro del intervalo de 0,5-1 Gy, 0,5 1,5 Gy, 0,5-2,5 Gy, 0,5-5 Gy, 0,5-7,5 Gy, 0,5-10 Gy, 0,5-15 Gy, 1-1,5 Gy, 1-2 Gy, 1-2,5 Gy, 1-3 Gy, 1-3,5 Gy, 1-4 Gy, 1-4,5 Gy, 1-1,5 Gy, 1-7,5 Gy, 1-10 Gy, 2-3 Gy, 2-4 Gy, 2-5 Gy, 2-6 Gy, 2-7 Gy, 2-8 Gy, 2-9 Gy, 2-10 Gy, 3-4 Gy, 3-5 Gy, 3-6 Gy, 3-7 Gy, 3-8 Gy, 3-9 Gy, 3-10 Gy, 4-5 Gy, 4-6 Gy, 4-7 Gy, 4-8 Gy, 4-9 Gy, 4-10 Gy, 5-6 Gy, 5-7 Gy, 5-8 Gy, 5-9 Gy, 5-10 Gy, 6-7 Gy, 6-8 Gy, 6-9 Gy, 6-10 Gy, 7-8 Gy, 7-9 Gy, 7-10 Gy, 8-9 Gy, 8-10 Gy, 10-12 Gy o 10-15 Gy.

Según un aspecto específico, la TBI comprende una dosis de irradiación única o fraccional dentro del intervalo de 1 7,5 Gy.

Según un aspecto, el acondicionamiento se realiza acondicionando al sujeto en condiciones supraletales, tal como en condiciones mieloablativas.

Alternativamente, el acondicionamiento puede realizarse acondicionando al sujeto en condiciones letales o subletales, tal como acondicionando al sujeto en condiciones mielorreductoras o condiciones no mieloablativas.

Según un aspecto, el acondicionamiento se realiza acondicionando al sujeto con un fármaco mieloablativo (por ejemplo, busulfano o melfalán) o un fármaco no mieloablativo (por ejemplo, ciclofosfamida y/o fludarabina).

Los ejemplos de agentes de acondicionamiento que pueden usarse para acondicionar al sujeto incluyen, sin limitación, irradiación, agentes farmacológicas y células de inducción de tolerancia (tal como se describe en el presente documento).

Los ejemplos de agentes farmacológicos incluyen fármacos mielotóxicos, fármacos linfocitotóxicos y fármacos inmunosupresores (comentados en detalle más adelante).

Los ejemplos de fármacos mielotóxicos incluyen, sin limitación, busulfano, dimetilmilerano, melfalán y tiotepa.

Adicional o alternativamente, el método puede comprender además acondicionar al sujeto con una pauta inmunosupresora antes de, de manera simultánea con, o tras el trasplante del trasplante de células o tejido.

Los ejemplos de tipos adecuados de pautas inmunosupresoras incluyen administración de fármacos inmunosupresores, poblaciones de célula de inducción de tolerancia (por ejemplo, células Tcm, tal como se describió en detalle anteriormente en el presente documento), y/o irradiación inmunosupresora.

Se proporciona una amplia guía para seleccionar y administrar pautas inmunosupresoras adecuadas para trasplante en la bibliografía de la técnica (por ejemplo, véase: Kirkpatrick CH. yRowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM.et al.,1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE.et al.,1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA.et al.,1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM.et al.,1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F.et al.,1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J.et al.1998. Lancet 351, 623).

Preferiblemente, la pauta inmunosupresora consiste en administrar al menos un agente inmunosupresor al sujeto.

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, tacrolimus (también denominado FK-506 o fujimicina, nombres comerciales: Prograf, Advagraf, Protopic), micofenolato de mofetilo, micofenolato de sodio, prednisona, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNF.alfa., un agente biológico que selecciona como diana una citocina inflamatoria, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero no se limitan a, ácido salicílico de acetilo, salicilato de colina-magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimús) y análogos de rapamicina (tales como CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes pueden administrarse de manera individual o en combinación.

Independientemente del tipo de trasplante, para evitar rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra huésped, el método de la presente divulgación usa las células Tcm novedosas (tal como se describieron en detalle anteriormente en el presente documento).

Según el método de la presente divulgación, estas células Tcm se administran de manera simultánea con, antes de, o tras el trasplante del trasplante de células o tejido.

Las células Tcm pueden administrarse mediante cualquier método conocido en la técnica para trasplante de células, tal como, pero sin limitarse a, infusión de células (por ejemplo, intravenosa) o mediante una vía intraperitoneal.

Las células Tcm de algunos aspectos de la divulgación pueden administrarse a un organismo en sí mismas, o en una composición farmacéutica en la que se mezclan con portadores o excipientes adecuados.

Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En el presente documento, el término “principio activo” se refiere a las células Tcm responsables del efecto biológico.

A continuación en el presente documento, las expresiones “portador fisiológicamente aceptable” y “portador farmacéuticamente aceptable” que pueden usarse de manera intercambiable se refieren a un portador o un diluyente que no provocan irritación significativa en un organismo y no eliminan la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado. Se incluye un adyuvante en estas expresiones.

En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de fármacos en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intracardíacas, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria común, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.

Los enfoques convencionales para administración de fármacos en el sistema nervioso central (CNS) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteína de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene afinidad por una molécula de superficie de células endoteliales en combinación con un agente que en sí mismo no puede atravesar la BBB) en un intento por aprovechar una de las rutas de transporte endógenas de la BBB; estrategias farmacológicas diseñadas para aumentar la solubilidad de lípidos de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes solubles en agua con portadores de lípidos o colesterol); y la perturbación transitoria de la integridad de la BBB mediante perturbación hiperosmótica (resultante de la infusión de una disolución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos inherentes asociados con un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación inherente en los sistemas de transporte endógenos, efectos secundarios biológicos posiblemente indeseados asociados con la administración sistémica de una molécula quimérica compuesta por un motivo de portador que puede ser activo fuera del CNS, y el posible riesgo de daño cerebral dentro de regiones del cerebro en las que se perturba la BBB, lo cual hace que sea un método de administración subóptimo.

Alternativamente, puede administrarse la composición farmacéutica de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de algunos aspectos de la divulgación pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, pulverización, proceso de emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Por tanto, las composiciones farmacéuticas para su uso según algunos aspectos de la divulgación pueden formularse de una manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares, que facilitan el procesamiento de los principios activos para dar preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Para inyección, los principios activos de la composición farmacéutica pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank, disolución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosa, se usan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera que va a penetrarse. Tales agentes de penetración se conocen generalmente en la técnica.

Para administración oral, la composición farmacéutica puede formularse fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten formular la composición farmacéutica como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente. Pueden producirse preparaciones farmacológicas para uso oral usando un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir agentes auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Se proporcionan recubrimientos adecuados a núcleos de grageas. Con este fin, pueden usarse disoluciones concentradas de azúcar que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o disolvente mezclas. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras realizadas de gelatina así como cápsulas blandas selladas realizadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la vía de administración elegida.

Para administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para administración mediante inhalación nasal, los principios activos para su uso según algunos aspectos de la divulgación se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para su uso en un dispensador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones para inyección basadas en agua o aceite apropiadas. Los vehículos o disolventes lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, disolución estéril basada en agua libre de pirógenos, antes de su uso.

La composición farmacéutica de algunos aspectos de la divulgación también puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de algunos aspectos de la divulgación incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito previsto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de principios activos (células Tcm) eficaz para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de un trastorno (por ejemplo, enfermedad maligna o no maligna) o prolongar la supervivencia del sujeto que está tratándose.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación usada en los métodos de la divulgación, la cantidad terapéuticamente eficaz o dosis puede estimarse inicialmente a partir de ensayosin vitroy de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los principios activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionalesin vitro,en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos a partir de estos ensayosin vitroy de cultivo celular y estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración usada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden elegirse por el médico individual a la vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl,et al.,1975, en “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, capítulo 1, pág. 1).

La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar amplios niveles del principio activo que son suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración eficaz mínima, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero puede estimarse a partir de datosin vitro.Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de características individuales y la vía de administración. Pueden usarse ensayos de detección para determinar concentraciones en plasma.

Dependiendo de la intensidad y capacidad de respuesta del estado que está tratándose, la dosificación puede ser de una única o una pluralidad de administraciones, durando un ciclo de tratamiento desde varios días hasta varias semanas o hasta que se produce la cura o se logra la disminución del estado patológico.

Dependiendo de la intensidad y capacidad de respuesta del estado que está tratándose, la dosificación puede ser de una única o una pluralidad de administraciones, durando un ciclo de tratamiento desde varios días hasta varias semanas o hasta que se produce la cura o se logra la disminución del estado patológico.

La cantidad de una composición que va a administrarse dependerá, evidentemente, del sujeto que está tratándose, la intensidad de la dolencia, la manera de administración, el criterio del médico encargado, etc.

Si se desea, las composiciones de algunos aspectos de la divulgación pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, lámina de metal o plástico, tal como un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. El envase o dispensador también puede ir acompañado de un aviso asociado con el recipiente en una forma recomendada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración para uso humano o veterinario. Tal aviso puede ser, por ejemplo, un etiquetado aprobado por la Food and Drug Administration de los EE. UU. para fármacos de venta con receta o un prospecto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la divulgación formulada en un portador farmacéutico compatible también pueden prepararse, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado indicado, tal como se detalló de manera adicional anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ±10 %.

Los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero sin limitarse a”.

El término “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

El término “que consiste esencialmente en” significa que la composición, método o estructura puede incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los componentes, etapas y/o partes adicionales no alteran sustancialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicado.

Tal como se usa en el presente documento, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, diversos aspectos de esta divulgación pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la divulgación. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha dado a conocer específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como desde 1 hasta 6 ha dado a conocer específicamente subintervalos tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 5, desde 2 hasta 4, desde 2 hasta 6, desde 3 hasta 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente del alcance del intervalo.

Siempre que se indica un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número mencionado (fraccional o integral) dentro de ese intervalo indicado. Las expresiones “que oscila/oscila entre” un primer número indicado y un segundo número indicado y “que oscila/oscila desde” un primer número indicado “hasta” un segundo número indicado se usan en el presente documento de manera intercambiable y se pretende que incluyan el primer y segundo números indicados y todos los números fraccionales e integrales entre los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada incluyendo, pero sin limitarse a, las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, por expertos de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Se aprecia que determinadas características de la divulgación, que, por claridad, se describen en el contexto de aspectos independientes, también pueden proporcionarse en combinación en un único aspecto. A la inversa, diversas características de la divulgación, que, por brevedad, se describen en el contexto de un único aspecto, también pueden proporcionarse de manera independiente o en cualquier combinación secundaria adecuada o según resulte adecuado en cualquier otro aspecto descrito de la divulgación. Determinadas características descritas en el contexto de diversos aspectos no deben considerarse características esenciales de esos aspectos, a menos que el aspecto no sea operativo sin esos elementos.

Diversos aspectos y aspectos de la presente divulgación tal como se expusieron anteriormente en el presente documento y tal como se reivindican en la sección de reivindicaciones más adelante encuentran respaldo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la divulgación de una manera no limitativa.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio usados en la presente divulgación incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrooket al.,(1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubelet al.,“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watsonet al.,“Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birrenet al.(eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías tal como se exponen en las patentes estadounidenses n.os 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stiteset al.(eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton &Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “ Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshaket al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos en las mismas se conocen bien en la técnica y se proporcionan por conveniencia para el lector.

Materiales generales y procedimientos experimentales

Animales

Se obtuvieron ratones BALB/c, FVB, C57BL/6 y BALB/c-desnudos hembra de 6 a 12 semanas de edad de Harlan Laboratories. Se criaron ratones congénicos B6.SJL, C57BL/6-Tg(CAG-OVA)916Jen/J (ratones que expresan OVA) y ratones OT1 (que expresan un TCR transgénico (Tg) diseñado para reconocer los residuos 257-264 de ovoalbúmina (OVA) en el contexto de H2Kb MHC-I) y OT1/Rag-/CD45.1 en el centro de animales del instituto Weizmann. Se mantuvieron todos los ratones en jaulas (5 animales en cada jaula) y se alimentaron con comida estéril y agua ácida. El Comité institucional para el cuidado y uso de animales del Instituto de ciencias Weizmann aprobó estos estudios.

Generación de células veto a partir de células T de memoria murinas

Se usaron ratones OT1 que expresan un TCR transgénico (Tg) diseñado para reconocer los residuos 257-264 de ovoalbúmina (OVA) en el contexto de H2Kb MHC-I. Estos ratones sirvieron como donantes de células Tcm veto. Antes de la recogida de estas células T OT1 CD8, se inmunizaron los ratones con péptido de OVA mezclado con adyuvante completo de Freund (CFA) y se les administró un refuerzo de inmunización 14 días tras la exposición inicial usando péptido de OVA adyuvante incompleto de Freund (IFA). De siete a catorce días tras la inmunización, se sacrificaron los ratones, se extirparon sus bazos y ganglios linfáticos y se trituraron, y se usó clasificación con perlas magnéticas para aislar las células de memoria (CD8+CD44+) a partir de la combinación de células CD8+ generales. Se sometió la población resultante a estimulación de tercero mediante cultivo conjunto con esplenocitos irradiados generados a partir de bazos de ratones que expresaban OVA, con privación de citocinas. Sesenta horas tras el inicio del cultivo conjunto, se añadió hIL-15 (10 ng/ml) al cultivo con el fin de empujar las células a expresar un fenotipo de tipo Tcm tal como se describe a continuación para Tcm de tipo natural (WT), es decir las células Tcm veto anteriormente descritas, que se preparan a partir de bazo entero o células mononucleares de sangre periférica tal como se confirmó anteriormente [Ophir, E. (2013), citado anteriormente]).

Generación de células dendríticas cargadas con péptido viral

Se prepararon células dendríticas (DC) humanas cargadas con péptido viral tal como se ilustra en la figura 4B. En resumen, se sembraron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donante en una placa de cultivo y se incubaron durante 3 horas a 37°C al 5 % de CO2/O2. Se descartaron las células sobrenadantes (que comprendían células T) y se incubaron adicionalmente las células adheridas durante 72 horas con la adición de las citocinas IL-4 y GM-CSF (en las mismas condiciones de cultivo). Tres días después, se recogieron las células flotantes (células dendríticas inmaduras), se sembraron y se incubaron durante la noche con las siguientes citocinas INF-y, IL-4, GM-CSF y LPS para la maduración de las DC. En el día 4, se desprendieron las células adheridas (DC maduras, es decir mDC) cargadas con un cóctel de péptidos virales y se incubaron durante 1 hora a 37°C. El cóctel viral comprende 7 mezclas de péptidos de VEB, CMV y adenovirus (Adv). Las mezclas de péptidos son 15 meros que se solapan en 11 aminoácidos de toda la secuencia de proteína del antígeno de interés adquiridas de JPT Technologies (Berlín, Alemania). Se usaron mezclas de péptidos que abarcaban VEB (LMP2, BZLF1, EBNA1), Adv (pentona, hexona) y CMV (pp65, IE-1). Después se irradiaron con 30 Gy las mDC humanas cargadas con péptido viral y se añadieron a la fracción de células T tal como se comenta a continuación.

Generación de células Tcm humanas anti-terceros usando péptidos virales

Se generaron células veto humanas anti-terceros sometiendo en primer lugar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas a partir de un donante de células, a empobrecimiento de células CD4+ y CD56+ (usando clasificación celular magnética usando perlas magnéticas obtenidas de Milteni Biotec).

Se cultivó conjuntamente la población restante de células con células dendríticas irradiadas (30 Gy) (del mismo donante de células), en el que las células dendríticas se han sometido a pulsos para expresar un antígeno de tercero (por ejemplo, cóctel de antígenos virales que incluye VEB, CMV y adenovirus). Durante los 3 primeros días de cultivo, se complementaron las células únicamente con IL-21, después desde el día 3 se añadieron IL-21, IL-15 e IL-7 al cultivo hasta el día 9.

Generación de células Tcm veto humanas a partir de células T de memoria usando péptidos virales

Se generaron células veto a partir de células de memoria humanas sometiendo en primer lugar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas a partir de un donante de células, a empobrecimiento de células CD4+, CD56+ y CD45RA+ (usando clasificación celular magnética usando perlas magnéticas obtenidas de Milteni Biotec). La población restante de células comprendía células T de memoria CD8+CD45RO+. A continuación, se cultivaron conjuntamente las células T de memoria CD8+CD45RO+ con células dendríticas irradiadas (30 Gy) (del mismo donante de células), en el que las células dendríticas se han sometido a pulsos para expresar un antígeno (por ejemplo, cóctel de antígenos virales que incluye VEB, CMV y adenovirus). Durante los 3 primeros días de cultivo, se complementaron las células únicamente con IL-21, después desde el día 3 se añadieron IL-21, IL-15 e IL-7 al cultivo hasta el día 9.

Generación de células Tcm veto humanas a partir de células T de memoria usando péptidos tumorales

Se generan células veto a partir de células de memoria humanas inmunizando en primer lugar al donante de células con un péptido tumoral (por ejemplo, BCR-ABL, ELA2, G250/anhidrasa carbónica IX, HA-1, HA-2, hTERT, MAGE-1, MUC1, n Y-ESO-1, PRa Me , PR1, PRTN3, RHAMM y WT-1, o combinaciones de los mismos, tal como se comenta en Molldrem J. Biology of Blood and Marrow Transplant (2006) 12:13-18; Alatrash G. y Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50) con adyuvante completo de Freund (CFA) y administrando un refuerzo de inmunización 14 días después de la exposición inicial usando el péptido tumoral adyuvante incompleto de Freund (IFA). A continuación, se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se someten a empobrecimiento de células CD4+, CD56+ y CD45RA+ (usando clasificación celular magnética usando perlas magnéticas obtenidas de Milteni Biotec). La población restante de células comprende células T de memoria CD8+CD45RO+. A continuación, se cultivan conjuntamente las células T de memoria CD8+CD45RO+ con células dendríticas irradiadas (30 Gy) (del mismo donante de células), en el que las células dendríticas se han sometido a pulsos para expresar el antígeno tumoral. Durante los 3 primeros días de cultivo, se complementan las células únicamente con IL-21, y después desde el día 3 se añaden IL-21, IL-15 e IL-7 al cultivo hasta el día 9.

Análisis por citometría de flujo

Se realizó un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) usando un dispositivo FACScanto II de Becton Dickinson, para determinar el nivel de pureza y fenotipo de las células Tcm que se generaron, es decir CD8+CD45RO+CD62L+ y CD4'CD56'CD45RA'. Se tiñeron las células en dos paneles con los siguientes anticuerpos marcados:

Panel 1: CD8- isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD45RO- ficoeritrina (PE), CD62L- aloficocianina (APC), CD56-APC-Cy7, CD3-violeta brillante 711, CD16-PE-Cy7 y 7AAD-PerCp.

Panel 2: CD3- violeta brillante 711, CD8-FITC, CD45RA- PE-Cy7, CD45RO-APC- Cy7, CD20-PE y 7AAD-PerCp.

Análisis de dilución limitante (LDA) y ensayo de destrucción de 35S-metionina

Con el fin de evaluar la frecuencia de células reactivas anti-huésped residuales dentro de los cultivos de Tcm anti terceros generados a partir de PBMC en diferentes fases de purificación, tales como CD4'CD56‘ (es decir, células CD8+ enriquecidas) o CD4'CD56'CD45RA' (es decir, células de memoria), se realizó un análisis de dilución limitante (LDA) en comparación con células CD4'CD56'CD19‘ recientes (que sirvieron de control positivo alogénico). Se cultivaron las tres preparaciones de células sometidas a prueba frente a PBMC de huésped irradiadas en un cultivo de MLR durante 5 días (es decir, cultivo a granel) para permitir la inducción de actividad anti-huésped. Tras 5 días, se recogieron células efectoras a partir del cultivo de MLR y se separaron en Ficoll. Se sembraron las células efectoras en placas en diferentes diluciones (intervalo de 1 a 40.000 células por pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos (16 repeticiones por número de entrada). También se añadieron a cada pocillo agentes estimulantes de huésped irradiados (30 Gy) que se usaron en el MLR a granel. Se usaron los cultivos de dilución limitante para permitir la titulación del criterio de valoración de señal anti-huésped y se mantuvieron durante 7 días en presencia de IL-2 para determinar la amplificación de la señal de efectores.

Tras 7 días, se midió la actividad citotóxica en un ensayo convencional de 5 horas frente a células marcadas con 35S-metionina. En resumen, blastocitos preparados con concanavalina A (Sigma, St Louis, MO) del huésped que se usaron como células diana, se marcaron con 35S-metionina y se sembraron juntos con las diversas diluciones de las células efectoras inducidas sometidas a prueba. Tras una incubación de 5 horas, se calculó la radioactividad media en los sobrenadantes de 16 muestras repetidas, y se calculó el porcentaje de lisis específica mediante la siguiente ecuación: 100 x (liberación experimental media - liberación espontánea media)/(liberación total media - liberación espontánea media). El nivel de 35S-metionina liberada por células diana representa el nivel de destrucción que representa el nivel de actividad anti-huésped.

Para calcular la frecuencia a partir de la lectura del cultivo de dilución limitante, se usó la siguiente ecuación: lny= -fx+lna (que representa el término de orden cero de la distribución de Poisson), en la que y es el porcentaje de cultivos que no responden, x es el número de células que responden por cultivo, f es la frecuencia de precursores que responden, ya es la ordenada en el origen teóricamente igual al 100 %. La media más 3 desviaciones estándar de los 16 pocillos que contienen las células diana solas se determinó como el valor de corte para la radioactividad de fondo. Los pocillos experimentales se puntuaron como positivos para la lisis cuando superaron el valor de corte. El porcentaje de cultivos que respondían se definió calculando el porcentaje de cultivos positivos. La frecuencia (f) y el error estándar (EE) de CTL-p se determinaron a partir de la pendiente de la línea trazada usando análisis de regresión lineal de los datos.

Análisis de ELISpot de IFN-y

Se usó el ensayo de inmunotransferencia por puntos ligado a enzimas (ELISpot), un inmunoensayo altamente sensible que mide la frecuencia de células secretoras de citocinas a nivel de células individuales. Específicamente, se usó un ensayo ELISpot de INF-y(interferón-gamma) para evaluar la frecuencia de células reactivas anti-huésped residuales dentro de los cultivos de Tcm anti-terceros, dado que IFN-yse produce principalmente por células T activadas y células NK.

En resumen, las superficies de membrana en una placa de microtitulación de membrana de PVDF de 96 pocillos se recubrieron con un anticuerpo de captura (anticuerpo purificado anti-INF-yhumano) que se une a un epítopo específico de la citocina (IFN-y) que está sometiéndose a ensayo. Durante 16 horas de MLR y etapa de estimulación, se sembraron diversas diluciones (a un intervalo de 1 a 40.000 células por pocillo) de las células sometidas a prueba en los pocillos de la placa junto con agentes estimulantes anti-huésped irradiados. Estos formaron una monocapa sobre la superficie de membrana del pocillo. A medida que se activan las células específicas anti-huésped, liberan IFN-y, que se captura directamente sobre la superficie de membrana por el anticuerpo inmovilizado. Por tanto, el IFN-yse “captura” en la zona que rodea directamente a la célula secretora, antes de que tenga ocasión de difundirse al interior de los medios de cultivo, o degradarse mediante proteasas y unirse a receptores en células vecinas. Etapas de detección posteriores visualizan el IFN-yinmovilizado como inmunotransferencia por puntos. Tras lavar los pocillos para retirar células, residuos y componentes de medios, se añadió un anticuerpo biotinilado específico para IFN-yhumano a los pocillos. Este anticuerpo es reactivo con un epítopo diferenciado de la citocina IFN-yy, por tanto, se emplea para detectar la citocina capturada. Tras un lavado para retirar cualquier anticuerpo biotinilado no unido, se visualizó la citocina detectada usando estreptavidina conjugada con una enzima peroxidasa del rábano (HRP) y un sustrato de precipitación (por ejemplo, AEC, BCIP/NBT). El producto final de color (un punto rojo, para HRP) normalmente representa una célula productora de IFN-yindividual. Normalmente se cuentan los puntos manualmente (por ejemplo, con un microscopio de disección) o usando un lector automatizado para capturar las imágenes de micropocillo y analizar el número y tamaño de puntos.

Ejemplo 1

Las células T de memoria CD8 transgénicas con respecto a TCR expandidas frente a su antígeno relacionado potencian notablemente el injerto de BM sometida a empobrecimiento de células T completamente alogénica

La posibilidad de que las células T de memoria puedan estar asociadas con un riesgo reducido de GvHD se ha debatido a lo largo de la última década. En principio, la combinación de memoria está enriquecida con clones antivirales y, por tanto, puede contener un nivel reducido de células T alorreactivas. Sin embargo, muy recientemente, dos estudios principales que intentaron usar HSCT sometido a empobrecimiento de CD45RA+ en pacientes con leucemia notificaron un nivel significativo de GvHD, incluso cuando usaron profilaxis para GvHD tras el trasplante [Bleakley M.et al.J Clin Invest. (2015) 125(7):2677-89; Triplett, B.M.et al.Bone Marrow Transplant. (2015) 50(7):968-977]. Por tanto, el empobrecimiento de clones alorreactivos a partir de la combinación de memoria de células T mediante activación de células T anti-terceros y expansión puede resolver el problema de GvHD residual que permanece tras el empobrecimiento de células CD45RA. Además, el uso de péptidos de antígenos virales comunes como estimulación de terceros puede crear posiblemente células Tcm veto que tanto presentan alorreactividad empobrecida como están dotadas de actividad antiviral.

Para ello, los presentes inventores han modificado el protocolo anterior para la generación de células Tcm veto anti terceros, estableciendo estimulación usando péptidos específicos contra los cuales se dirige el TCR de la combinación de células T de memoria existente. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos de prueba de concepto en modelos murinos, usando ratones OT1 que expresan un TCR transgénico (Tg) diseñado para reconocer los residuos 257-264 de ovoalbúmina (OVA) en el contexto de H2Kb MHC-I. Estos ratones sirvieron como donantes de células Tcm veto. Antes de la recogida de estas células T OT1 CD8, se inmunizaron los ratones con péptido de OVA mezclado con adyuvante completo de Freund (CFA) y se les administró un refuerzo de inmunización 14 días tras la exposición inicial usando péptido de OVA adyuvante incompleto de Freund (IFA) (véase la ilustración en la figura 1). De siete a catorce días tras la inmunización, se sacrificaron los ratones, se extirparon sus bazos y ganglios linfáticos y se trituraron, y se usó clasificación con perlas magnéticas para aislar las células de memoria (CD8+CD44+) a partir de la combinación de células CD8+ generales. Se sometió la población resultante a estimulación de tercero mediante cultivo conjunto con esplenocitos irradiados generados a partir de bazos de ratones que expresaban OVA, con privación de citocinas. Sesenta horas tras el inicio del cultivo conjunto, se añadió hIL-15 (10 ng/ml) al cultivo con el fin de empujar las a expresar un fenotipo de tipo Tcm tal como se describió anteriormente para Tcm WT (es decir, células Tcm “regulares”, tal como se comenta a continuación).

Tal como se muestra en la figura 2A, células Tcm OT-1 preparadas a partir de una población inicial de células de memoria (CD8+CD44+) podían potenciar el injerto de trasplante de médula ósea sometida a empobrecimiento de células T alogénico, de manera similar al quimerismo inducido por células Tcm anti-terceros “regulares” (es decir, las células Tcm veto anteriormente descritas, que se preparan a partir de bazo entero o células mononucleares de sangre periférica tal como se confirmó anteriormente [Ophir, E. (2013), citado anteriormente]). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran fuertemente que las células Tcm derivadas de CD8+CD44+ expandidas frente péptidos relacionados pueden inducir de hecho tolerancia, sin ejercer GvHD.

Ejemplo 2

Las células Tcm veto generadas a partir de células T de memoria CD8 ofrecen una notable actividad veto con riesgo reducido de GVHD

A continuación, los presentes inventores intentaron obtener células Tcm a partir de células T CD8 de memoria B6-WT tras la inmunización con OVA. Para ello, tras la inmunización de ratones C57BL/6, se clasificaron magnéticamente células T de memoria CD8+CD44+ y se sometieron al mismo protocolo para la generación de Tcm usando agentes estimulantes todo de OVA. Inicialmente, los presentes inventores querían someter a prueba la capacidad de estas células Tcm CD8+CD44+ para inducir GvHD, en comparación con la de la población inicial de CD8+CD44+ que se usaron anteriormente en la clínica. Se esperaba que las células Tcm CD8+CD44+ presentarían empobrecimiento de clones alorreactivos debido a la estimulación antigénica usando péptido de OVA, que activa selectivamente tan sólo los clones de células T que presentan un TCR relevante.

De hecho, se mostró que las células Tcm CD8+CD44+ no inducen síntomas de GvHD marcados en modelos de animales, mientras que las células de memoria recientes CD8+CD44+ que no se sometieron a activación de terceros indujeron una letalidad y pérdida de peso significativas debido a GvHD (figuras 2B-C). A continuación, los presentes inventores querían evaluar si estas células podían inducir tolerancia en el modelo de acondicionamiento de intensidad reducida (RIC) (ilustrado en la figura 2D). Tal como puede observarse en la figura 2E, las células Tcm CD8+CD44+ mostraron una notable potenciación de quimerismo tras el trasplante de BM de ratones C57BL-desnudos en receptores Balb/c acondicionados con TBI de 5 Gy.

Ejemplo 3

Generación de células Tcm humanas anti-terceros usando antígenos virales

Los presentes inventores han desarrollado anteriormente un protocolo para la generación de células Tcm veto anti terceros derivadas de ser humano a partir de una población inicial de células CD4'CD56‘ con un riesgo mínimo de GvHD, usando un enfoque de clasificación magnética en dos etapas para el empobrecimiento de la alorreactividad. Este protocolo se desarrolló usando tres donantes de células, en los que el donante tercero se seleccionó para garantizar que ninguno de sus alelos de clase I de HLA se compartía con los alelos de clase I de HLA del huésped, con el propósito de prevenir GvHD.

En los experimentos actuales, de manera similar a lo descrito anteriormente para los experimentos de prueba de concepto murinos, los presentes inventores aprovecharon el uso de células de memoria CD8 que se producen de manera natural como material de partida para la preparación de células Tcm veto, ya que se ha notificado que estas células tienen una propensión reducida a la inducción de GvHD en comparación con células indiferenciadas. Esta opción se ha vuelto recientemente una realidad con la liberación de perlas magnéticas de CD45RA de calidad de BPF para el empobrecimiento de células T indiferenciadas. Tal como se describió anteriormente y en la sección de “campo y antecedentes” anteriormente en el presente documento, el enfoque de administrar por infusión células CD45RA' se ha sometido a prueba en dos ensayos clínicos en pacientes con leucemia [Bleakley M.et al.(2015) citado anteriormente; Triplett, B.M.et al.(2015) citado anteriormente], sin embargo, no se previno GvHD con algunos pacientes que mostraron formas intensas de GvHD aunque se trataran con supresión inmunitaria tras el trasplante. Estos datos condujeron a los presentes inventores a evaluar la posibilidad de que la estimulación de células T CD8 sometidas a empobrecimiento de CD45RA' frente a antígenos específicos pueden empobrecer completamente estas células con respecto a toda la reactividad de GvH. Dado que el TCR de la mayoría de las células en esta combinación de memoria se dirigen frente a antígenos virales y bacterianos comunes y, por tanto, es de manera natural menos probable que sean alorreactivos frente al huésped, los presentes inventores plantearon la teoría de que podían usarse de manera conveniente péptidos virales de antígeno (por ejemplo, CMV, VEB y adenovirus) cargados en DC de donante (es decir, del mismo donante de células que las células Tcm) como agentes estimulantes. Usando este enfoque, puede obtenerse el beneficio de una posible actividad antiviral de estas células además de su actividad veto, lo cual es un atributo particularmente atractivo para establecer un trasplante en el que la reactivación viral es un acontecimiento perjudicial habitual.

Para abordar esta suposición, se inició un experimento preliminar en el que se usaron las mismas condiciones de cultivo células Tcm veto excepto porque la estimulación frente a un antígeno se realizó frente a DC de donante sometidas a pulsos con mezclas de péptidos virales de tres virus prominentes (VEB, CMV y adenovirus), en lugar de un tercer donante diferente con respecto a HLA para DC de tercero. Debe observarse que este experimento se inició a partir de la población CD4'CD56‘ anteriormente descrita (es decir, no se retiraron las células CD45RA+). Tal como puede observarse en las figuras 3A-3B, las células Tcm veto crecieron bien en respuesta a esta estimulación antiviral, mostrando una expansión de 10 veces en el día 9, mostrando un alto porcentaje (93,2 %) de las células un fenotipo de Tcm veto.

La reactividad anti-huésped analizada mediante análisis de dilución limitante (LDA) se muestra en las figuras 3C-D y los parámetros relevantes se resumen en la tabla 2, a continuación. Los resultados mostraron que este método proporcionó un empobrecimiento de dos log de clones alorreactivos frente a huésped, de manera similar a los resultados anteriores usando activación de tercero “regular” frente a un donante de HLA diferente. Estos resultados se corroboraron adicionalmente mediante análisis de ELISpot de IFNy (llevado a cabo tras el cultivo a granel) en el que, tras la activación de huésped, células recientes (CD4'CD56'CD19‘) produjeron aproximadamente 25.000 puntos/106 células T, no pudo detectarse ningún punto en el cultivo de células Tcm veto (datos no mostrados).

Tabla 2: empobrecimiento de células T anti-huésped antes y después de la generación de células Tcm veto dirigidas frente a péptidos virales

Ejemplo 4

Generación de células veto humanas a partir de células T de memoria usando antígenos virales

A continuación, los presentes inventores sometieron a prueba la reactividad de células Tcm que se hicieron crecer a partir de una población sometida a empobrecimiento de CD45RA- activada frente a antígenos virales presentados en DC de donante (es decir, del mismo donante de células que las células Tcm) (tal como se ilustra en las figuras 4A y 4B).

La reactividad de células Tcm veto que se hicieron crecer a partir de esta población inicial (células CD4'CD56'CD45RA' ) se sometió a prueba usando el ensayo de destrucción de LDA. Tal como resulta evidente a partir de los resultados, queda claro que las células veto generada a partir de células de memoria no ejercen ninguna reactividad anti-huésped (figuras 5A-C y figura 6).

Tomados en conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que el enfoque de anti-péptidos virales como agentes estimulantes puede aplicarse a una población inicial de células que responden que se someten a empobrecimiento de CD45RA (por ejemplo, células CD4'CD56'CD45RA'), conocidas por su propensión a GvHD relativamente baja. Tal como se muestra, esta población de célula puede diluirse adicionalmente de clones anti-huésped supuestos con la estimulación antiviral, lo cual puede proporcionar una preparación de células extremadamente segura, libre de GvHD.

Ejemplo 5

Generación de células veto humanas a partir de células T de memoria usando antígenos no virales

Los presentes inventores generan células veto a partir de una población inicial de células de memoria (células CD45RA-) estimuladas frente a péptidos no virales incluyendo péptidos identificados con cáncer (por ejemplo, tumor sólido o neoplasia hematopoyética).

Tal como se describió anteriormente, se generan células veto sometiendo células T de memoria (es decir, población sometida a empobrecimiento de CD45RA-) obtenidas a partir de un donante frente a antígenos tumorales presentados en DC de donante.

Alternativamente, se generan células veto inmunizando en primer lugar al donante de células con un péptido tumoral (tal como se comentó en la sección de “materiales generales y procedimientos experimentales” anterior) con adyuvante completo de Freund (CFA) y administrando un refuerzo de inmunización 14 días tras la exposición inicial usando el péptido tumoral adyuvante incompleto de Freund (IFA). A continuación, se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir del sujeto y se someten a empobrecimiento de células CD4+CD56+CD45RA+. Se cultiva conjuntamente la población restante de células (es decir, células T de memoria CD8+CD45RO+) con antígenos tumorales presentados en DC de donante.

Estas células pueden usarse además para la eliminación terapéutica de células de cáncer residuales.Ejemplo 6

Protocolo de buenas prácticas de fabricación (BPF) para la generación a gran escala de células T veto CD8 de memoria central antivirales (Tcm)

Los presentes inventores han repetido satisfactoriamente el protocolo para la generación de células veto humanas a partir de células T de memoria usando antígenos virales presentados en células presentadoras de antígeno autólogas 10 veces (figura 7). Tal como puede observarse en las figuras 8 y 9A-H, la recuperación celular y la pureza del protocolo novedoso fueron muy reproducibles.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i .Un método de generación de una población aislada de células que no inducen GvHD que comprenden un fenotipo de linfocitos T de memoria central (Tcm), siendo dichas células células de inducción de tolerancia y estando dotadas de actividad antiviral, y pudiendo dirigirse a los ganglios linfáticos tras el trasplante, comprendiendo el método:

   (a) tratar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un agente que puede empobrecer células CD4+, CD56+ y CD45RA+, o con un agente que puede seleccionar células CD45RO+, CD8+, para obtener una población de células que comprenden células T que comprende al menos aproximadamente el 50-70 % de células T de memoria que comprenden un fenotipo CD45Ro CD45RA'CD8+;

   (b) poner en contacto dicha población de células resultante de la etapa (a) con células dendríticas del mismo donante que dichas células T de memoria cargadas con al menos un antígeno viral seleccionado del grupo que consiste en péptido de virus de Epstein-Barr (VEB), un péptido de citomegalovirus (CMV) y un péptido de adenovirus (Adv) en un cultivo libre de citocinas complementado con IL-21 durante 2 - 5 días para permitir el enriquecimiento de células reactivas frente a antígeno; y

   (c) cultivar dichas células resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un entorno libre de antígenos durante 4 - 10 días para permitir la proliferación de células que comprenden dicho fenotipo de Tcm, generando de ese modo la población aislada de células que no inducen GvHD.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno viral comprende la totalidad de dicho péptido de VEB, péptido de CMV y péptido de Adv.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en el que dicho al menos un antígeno viral comprende tres péptidos de VEB, dos péptidos de CMV y dos péptidos de adenovirus (Adv).
4. 4. El método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno viral se selecciona del grupo que consiste en LMP2 de VEB, BZLF1 de VEB, EBNA1 de VEB, pp65 de CMV, IE-1 de CMV, pentona de Adv y hexona de Adv.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno viral comprende LMP2 de VEB, BZLF1 de VEB, EBNA1 de VEB, pp65 de CMV, IE-1 de CMV, pentona de Adv y hexona de Adv.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un antígeno viral comprende bibliotecas de péptidos solapantes que abarcan toda la secuencia de proteína de CMV, VEB y Adv.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en el que:

   (i) dicha puesta en contacto de dicha población de células T con dicho al menos un antígeno en presencia de dicha IL-21 se realiza durante 3 días;

   y

   (ii) dicho cultivo de dichas células resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 se realiza durante 6-10 días.
8. 8. El método según la reivindicación 1, en el que dicha población de células T se somete a empobrecimiento de células T CD4+, células NK CD56+ y/o células T indiferenciadas CD45RA+.
9. 9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho periodo de tiempo total para generar las células que no inducen GvHD es de 10 días.
10. 10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho método se realizaex vivo.
11. 11. El método según la reivindicación 1,

    que comprende además empobrecer células alorreactivas a partir de dichas células que comprenden dicho fenotipo de Tcm tras la etapa (c), y opcionalmente en el que dicho empobrecimiento de dichas células alorreactivas se realiza mediante empobrecimiento de células CD137+ y/o CD25+ tras poner en contacto dichas células que comprenden dicho fenotipo de Tcm con células presentadoras de antígeno (APC) de huésped.
12. 12.El método según la reivindicación 1, en el que dichas células que tienen dicho fenotipo de Tcm comprenden una firma CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA- CD45RO+.