ES3028091T3 - Biological processes for the production of aryl sulfates - Google Patents

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ES3028091T3 ES19206920T ES19206920T ES3028091T3 ES 3028091 T3 ES3028091 T3 ES 3028091T3 ES 19206920 T ES19206920 T ES 19206920T ES 19206920 T ES19206920 T ES 19206920T ES 3028091 T3 ES3028091 T3 ES 3028091T3
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Abstract

La presente invención se relaciona en general con el campo de la biotecnología, en lo que respecta a la producción de aril sulfatos mediante polipéptidos o células recombinantes que los contienen. Más concretamente, la presente invención se refiere a polipéptidos con actividad aril sulfotransferasa, a células huésped recombinantes que los expresan y a procesos para la producción de aril sulfatos mediante estos polipéptidos o células huésped recombinantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procesos biológicos para la producción de sulfatos de arilo
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de la biotecnología, ya que se aplica a la producción de sulfatos de arilo usando células recombinantes que comprenden un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa. Más particularmente, la presente invención se refiere a procesos para la producción de sulfatos de arilo que emplean células hospedadoras recombinantes que expresan aril sulfotransferasa heteróloga.
Antecedentes de la invención
Una gama de compuestos fenólicos son de gran interés para la industria biotecnológica, ya que son componentes básicos para los compuestos poliméricos. Los ejemplos de dichos compuestos fenólicos incluyen ácido p-cumárico (pHCA) u otros ácidos hidroxicinámicos que forman la base de muchos metabolitos secundarios, incluyendo flavonoides y estilbenos. Sin embargo, muchos de estos compuestos fenólicos son tóxicos para los organismos productores y, por lo tanto, limitan la productividad durante la fermentación. Por lo tanto, existe la necesidad de procesos de producción a gran escala, y especialmente procesos de producción biológicos a gran escala que permitan una productividad mejorada.
Por otra parte, una gama de compuestos fenólicos, y especialmente aquellos utilizados como medicamentos o aditivos alimentarios como resveratrol o vainillina, muestran poca solubilidad en agua, lo que dificulta que el cuerpo absorba estos compuestos. Por lo tanto, también es necesario proporcionar dichos compuestos fenólicos en una forma que mejore la solubilidad y, por lo tanto, la biodisponibilidad, preferentemente mediante el uso de procesos biológicos de producción a gran escala.
El documento JP 2012165676 A divulga métodos para preparar un conjugado de sulfato mediante células de levadura transformadas con un gen SULT humano y cultivadas en presencia de sulfato de amonio, glucosa y una sustancia que ha de unirse que comprende principalmente sistemas de anillos condensados.
Van Der Horstet al. Advanced Synthesis and Catalysis,Vol. 354, N.° 18 (2012) y Wilsonet al. Archives of Biochemnistry and Biophysics,Vol. 428, N.° 1 (2004) divulgan que las aril sulfotransferasasin vitrocatalizan la sulfatación de dopamina, tiramina y otros compuestos.
Sumario de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un método para la producción a gran escala de sulfatos de arilo. Además, un objeto es proporcionar un proceso biológico para la producción a gran escala de fenoles. Los inventores han desarrollado un proceso biológico que resuelve ambos objetos.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado que comprende:
poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico o un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa;
en donde el compuesto fenólico está representado por la fórmula general (I):
y el precursor de un compuesto fenólico es un compuesto de Fórmula general (pl):
en donde al menos uno de Ri, R2, R3, R4 y R5 son un grupo hidroxilo (-OH);
en donde R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR7, -OCOR7, -NR7R8, -COR7, -COOR7, -SR7, -OSO3R7, -OCSR7, -POR7R8, alquilo, al alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo;
en donde R6 es -COOR7 o p-hidroxifenilo, en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; o en donde R6 es p-hidroxifenilo y cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo; y
en donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria o levadura.
En una realización, cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo, y R6 es p-hidroxifenilo.
En otra realización, R4 es hidroxilo.
En otra realización más, cada uno de R1, R2 y R5 es hidrógeno.
En otra realización, R1 es hidrógeno; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C1-6 y alcoxi C1-6, con la condición de que al menos uno de R2, R3 y R4 sea hidroxilo (-OH); R5 es hidrógeno y R6 es COOH.
En otra realización, cada uno de R1, R2, R4 y R5 es hidrógeno, R3 es hidroxilo (-OH) y R6 es COOH.
En un aspecto adicional la presente invención proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, el método comprende sulfatar un compuesto fenólico, como ácido p-cumárico, usando una primera célula hospedadora recombinante que es una bacteria o una levadura. Particularmente, el proceso implica el uso de una primera célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido heterólogo que tiene actividad
aril sulfotransferasa, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1);
b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el
85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el
96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1); o
c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15,
1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
En una realización, el polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa
1A1.
En otra realización, la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria. En otra realización, la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria de la especieEscherichia coli.
En otra realización, la primera célula hospedadora recombinante es una levadura.
En otra realización, la primera célula hospedadora recombinante comprende además un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
En otra realización, el medio se pone en contacto adicionalmente con una segunda célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Mapa de plásmido para la expresión de SULT1A1 deRattus norvegicusenEscherichia coli.
Figura 2: Mapa del plásmido para la sobreexpresión de cysDNC enE. coli.
Figura 3: Mapa del plásmido para la sobreexpresión de cysDNCQ enE. coli.
Figura 4: Mapa del plásmido para la expresión de RmXAL deRhodotorula mucilaginosa/Rhodotorula rubraenE. coli.
Figura 5: Toxicidad de productos no sulfatados o sulfatados.
Figura 6: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoníaco-liasa RsTAL deRhodobacter sphaeroidesenE. coli.
Figura 7: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoníaco-liasa FjTAL deFlavobacterium johnsoniaeenE. coli.
Figura 8: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoníaco-liasa RcTAL deRhodobacter capsulatusenE. coli.
Figura 9: Mapa del plásmido para la expresión de SULT1A1 deRattus norvegicusenSaccharomyces cerevisiae(gen nativo).
Figura 10: Mapa del plásmido para la expresión de SULT1A1 deRattus norvegicusenSaccharomyces cerevisiae(gen optimizado con codón).
Descripción detallada
A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en los campos de bioquímica, genética y biología molecular.
Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o el ensayo de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en el presente documento. En caso de conflicto entre las publicaciones, solicitudes de patente y otras referencias citadas, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, un cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran entre las técnicas de la materia. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo,Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Biblioteca del Congreso, EE. UU.);Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Tercera edición, (Sambrooket al.,2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press);Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed., 1984); Mulliset al.Pat. de los EE. UU. N.° 4.683.195;Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984);Transcription And Translation(B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984);Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); la serie,Methods In ENZYMOLOGY(J. Abelson y M. Simon, redactores jefe, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, Vol. 154 y 155 (Wuet al.eds.) y vol. 185,"Gene Expression Technology(D. Goeddel, ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); yManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Polipéptidos y células hospedadoras
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención utiliza células hospedadoras recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos que tienen actividad aril sulfotransferasa (EC: 2.8.2.1). Esto los hace particularmente adecuados para la sulfatación de compuestos fenólicos como ácido p-cumárico y sus derivados (por ejemplo, ácido cafeico, ácido ferúlico o ácido sinápico), o resveratrol.
El polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa puede ser una enzima sulfotransferasa 1A1, una enzima sulfotransferasa 1A2, una enzima sulfotransferasa 1A3, una enzima sulfotransferasa 1B1, una enzima sulfotransferasa 1C1, una enzima sulfotransferasa 1C2, una enzima sulfotransferasa 1C4, o una enzima sulfotransferasa 1E1. De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1A1. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1A2. De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1B1. De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C1. De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C2. De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C4. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1E1 (estrógeno sulfotransferasa), como la sulfotransferasa 1E1 deGallus gallus domesticus.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una aril sulfotransferasa de mamífero, como una enzima sulfotransferasa 1A1 de mamífero.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, y tiene actividad aril sulfotransferasa.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, y tiene actividad aril sulfotransferasa.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una aril sulfotransferasa deRattus norvegicuso una variante de la misma. Dicha variante puede tener al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la aril sulfotransferasa deRattus norvegicus.Dicha variante también puede tener una secuencia de aminoácidos de la sulfotransferasa deRattus norvegicus,en donde de 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
Se entiende que los valores anteriores definen generalmente el número total de alteraciones a la aril sulfotransferasa de referencia. Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente supresiones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa puede ser un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1);
b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1); o c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
De acuerdo con determinadas realizaciones, un polipéptido para su uso en la invención es un polipéptido de acuerdo con a). En consecuencia, un polipéptido para su uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, Se Q ID NO: 1). De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. De acuerdo con aún otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. De acuerdo con aún otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. De acuerdo con aún otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con a) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, un polipéptido para su uso en la invención es un polipéptido de acuerdo con b). En consecuencia, un polipéptido para su uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, tal como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, tal como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, tal como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, tal como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, tal como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, tal como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1.
Preferentemente, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa. Más preferentemente, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, Se Q ID NO: 1).
De acuerdo con determinada realización, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con b) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13.
Con actividad aril sulfotransferasa "similar", se entiende que el polipéptido de acuerdo con b) tiene al menos aproximadamente el 10%, tal como al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad aril sulfotransferasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
La actividad aril sulfotransferasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: La actividad aril sulfotransferasa puede determinarse por la reacción de PAPS marcado radiactivamente con azufre, [35S]PAPS, con el sustrato en presencia del polipéptido de interés. Esto se describió anteriormente, por ejemplo, por Hattoriet al. (Biosci Biotechnol Biochem.2008; 72(2):540-7). La reacción tiene lugar en un tampón tal como 250 pl de fosfato de sodio 50 mM pH 6,8 con [35S]PAPS 1 pM (3,7 kBq) con compuesto de aceptación 100 pM durante un período de 30 min a 30 °C. La reacción se detiene mediante la adición de 100 pl de una mezcla 1:1 de acetato de bario 0,1 M e hidróxido de bario. Se añaden 50 pl de sulfato de cinc 0,1 M, seguido de centrifugación a 1.200 * g durante 5 min. Después, se transfieren 300 pl del sobrenadante a un recipiente nuevo y se añaden 50 pl de un volumen igual de hidróxido de bario 0,1 M y sulfato de cinc 0,1 M. Después, la mezcla se centrifuga a 13.000 * g durante 5 min y se mezclan alícuotas de 300 pl del sobrenadante con 2,5 ml de Cleasol I (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La radiactividad se mide después por centelleo.
Como alternativa, la actividad de una sulfotransferasa puede detectarse mediante la medición directa del producto mediante métodos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida en combinación con espectrometría de masas (LC-MS).
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el polipéptido heterólogo recombinante es un polipéptido de acuerdo con c). En consecuencia, un polipéptido heterólogo recombinante puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, Se Q ID NO: 1), en donde 1 o más, tales como 2 o más, 3 o superior, 4 o superior, 5 o superior, 6 o superior, 7 o superior, 8 o superior, 9 o superior, 10 o superior, 11 o superior, 12 o superior, 13 o superior, 14 o superior, 15 o superior, 16 o superior, 17 o superior, 18 o superior, 19 o superior, 20 o superior, 25 o superior, 30 o superior, 35 o superior, 40 o superior, 45 o superior, 50 o superior, 60 o superior, 70 o superior, 80 o superior, 90 o superior, 100 o superior, 110 o superior, 120 o superior, 130 o superior, 140 o más, o 150 o más, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 150, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 140, de aproximadamente 1 a aproximadamente 130, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120, de aproximadamente 1 a aproximadamente 110, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, Se Q ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 30, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 25, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 150, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 140, de aproximadamente 1 a aproximadamente 130, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120, de aproximadamente 1 a aproximadamente 110, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ Id NO: 1, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con c) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
Se entiende que los valores anteriores generalmente definen el número total de alteraciones al polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente supresiones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.
Preferentemente, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa. Más preferentemente, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, Se Q ID NO: 1).
De acuerdo con determinada realización, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con c) tiene actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13.
Con actividad aril sulfotransferasa "similar" se entiende que el polipéptido de acuerdo con c) tiene al menos aproximadamente el 10%, tal como al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad aril sulfotransferasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
La actividad aril sulfotransferasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: La actividad aril sulfotransferasa puede determinarse por la reacción de PAPS marcado radiactivamente con azufre, [35S]PAPS, con el sustrato en presencia del polipéptido de interés. Esto se describió anteriormente, por ejemplo, por Hattoriet al. (Biosci Biotechnol Biochem.2008; 72(2):540-7). La reacción tiene lugar en un tampón tal como 250 pl de fosfato de sodio 50 mM pH 6,8 con [35S]PAPS 1 pM (3,7 kBq) con compuesto de aceptación 100 pM durante un período de 30 min a 30 °C. La reacción se detiene mediante la adición de 100 pl de una mezcla 1:1 de acetato de bario 0,1 M e hidróxido de bario. Se añaden 50 pl de sulfato de cinc 0,1 M, seguido de centrifugación a 1.200 * g durante 5 min. Después, se transfieren 300 pl del sobrenadante a un recipiente nuevo y se añaden 50 pl de un volumen igual de hidróxido de bario 0,1 M y sulfato de cinc 0,1 M. Después, la mezcla se centrifuga a 13.000 * g durante 5 min y se mezclan alícuotas de 300 pl del sobrenadante con 2,5 ml de Cleasol I (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La radiactividad se mide después por centelleo.
Como alternativa, la actividad de una sulfotransferasa puede detectarse mediante la medición directa del producto mediante métodos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida en combinación con espectrometría de masas (LC-MS).
La presente invención contempla la producción de un compuesto fenólico sulfatado a partir de un precursor del mismo que tiene la fórmula general (p-I) como se describe con más detalle a continuación. En este caso, puede ser adecuado emplear un polipéptido adicional (por ejemplo, segundo) que tenga actividad tirosina amoníaco liasa.
En una realización, dicha primera célula hospedadora recombinante comprende además un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
En otra realización, el proceso comprende además poner en contacto el medio con una segunda célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
Dicho polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa puede ser un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14);
e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14); o
f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
De acuerdo con determinadas realizaciones, un polipéptido adicional útil en la invención es un polipéptido de acuerdo con d). En consecuencia, un polipéptido útil en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en S<e>Q ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15. De acuerdo con aún otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 18. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22. De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con d) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 23.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, un polipéptido adicional útil en la invención es un polipéptido de acuerdo con e). En consecuencia, un polipéptido útil en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, tal como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, tal como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). De acuerdo con otras realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, tal como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).
De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, tal como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, tal como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, tal como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14.
Preferentemente, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa. Más preferentemente, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, Se Q ID NO: 14).
De acuerdo con determinada realización, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 18. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con e) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 23. Por actividad tirosina amoníaco liasa "similar" se entiende que el polipéptido de acuerdo con e) tiene al menos aproximadamente el 10 %, tal como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad amoníaco liasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).
La actividad tirosina amoníaco liasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: Se realizan ensayos enzimáticos en volúmenes de 200 pl en pocillos en una placa de 96 pocillos transparente a UV, siguiendo el aumento de absorbancia a 315 nm (pHCA) usando espectrofotometría o HPLC con detección UV. Las mezclas de reacción contienen 2 pg de proteína purificada y se inician añadiendo tirosina 1 mM o 6 mM después del equilibrio a 30 °C. La actividad enzimática se calcula como U/g, donde U se define como sustrato pmol convertido por minuto. Los controles negativos no contienen proteínas purificadas. Las constantes cinéticas Km y vmáx se determinan a partir de ensayos que contienen tirosina de 1,56 pM a 200 pM.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, un polipéptido adicional útil en la invención es un polipéptido de acuerdo con f). En consecuencia, un polipéptido útil en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 o más, tales como 2 o más, 3 o superior, 4 o superior, 5 o superior, 6 o superior, 7 o superior, 8 o superior, 9 o superior, 10 o superior, 11 o superior, 12 o superior, 13 o superior, 14 o superior, 15 o superior, 16 o superior, 17 o superior, 18 o superior, 19 o superior, 20 o superior, 25 o superior, 30 o superior, 35 o superior, 40 o superior, 45 o superior, 50 o superior, 60 o superior, 70 o superior, 80 o superior, 90 o superior, 100 o superior, 110 o superior, 120 0 superior, 130 o superior, 140 o más, o 150 o más, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 150, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 140, de aproximadamente 1 a aproximadamente 130, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120, de aproximadamente 1 a aproximadamente 110, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID N<o>: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, Se Q ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 30, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 25, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
De acuerdo con realizaciones particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 150, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 140, de aproximadamente 1 a aproximadamente 130, de aproximadamente 1 a aproximadamente 120, de aproximadamente 1 a aproximadamente 110, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 1 a aproximadamente 90, de aproximadamente 1 a aproximadamente 80, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, un polipéptido de acuerdo con f) comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
Se entiende que los valores anteriores generalmente definen el número total de alteraciones al polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente supresiones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.
Preferentemente, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa. Más preferentemente, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 ( por ejemplo, S<e>Q ID NO: 14). De acuerdo con determinada realización, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 17. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 18. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 21. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22. De acuerdo con determinadas otras realizaciones, un polipéptido de acuerdo con f) tiene actividad tirosina amoníaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 23. Por actividad tirosina amoníaco liasa "similar" se entiende que el polipéptido de acuerdo con f) tiene al menos aproximadamente el 10 %, tal como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad amoníaco liasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).
La actividad tirosina amoníaco liasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: Se realizan ensayos enzimáticos en volúmenes de 200 pl en pocillos en una placa de 96 pocillos transparente a UV, siguiendo el aumento de absorbancia a 315 nm (pHCA) usando espectrofotometría o HPLC con detección UV. Las mezclas de reacción contienen 2 pg de proteína purificada y se inician añadiendo tirosina 1 mM o 6 mM después del equilibrio a 30 °C. La actividad enzimática se calcula como U/g, donde U se define como sustrato pmol convertido por minuto. Los controles negativos no contienen proteínas purificadas. Las constantes cinéticas Km y vmáx se determinan a partir de ensayos que contienen tirosina de 1,56 pM a 200 pM.
En la presente invención además se contempla el uso de un polipéptido adicional (por ejemplo, tercero) que tiene actividad fenilalanina amoníaco liasa, como una fenilalanina amoníaco liasa (EC 4.3.1.24).
Los polipéptidos pueden emplearse según la invención en forma aislada, como en forma purificada. Los polipéptidos, por ejemplo, pueden ser expresados por una célula hospedadora recombinante, y después purificados. Las técnicas y medios para la purificación de polipéptidos producidos por una célula hospedadora recombinante se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, para facilitar la purificación, un motivo de aminoácido que comprende varios restos de histidina, tal como al menos 6, puede insertarse en el extremo C- o N-terminal del polipéptido. Un ejemplo no limitante de dicho motivo de aminoácido se proporciona en SEQ ID NO: 24. Diversos kits de purificación para polipéptidos marcados con histidina están disponibles en fuentes comerciales como Qiagen, Hilden, Alemania; Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.; Bio-Rad, Hercules, CA, USA y otros.
Como alternativa, los polipéptidos pueden sintetizarse químicamente. Las técnicas para la síntesis química de péptidos se conocen bien e incluyen síntesis en fase líquida y síntesis en fase sólida.
Los polipéptidos también pueden emplearse según la invención como parte de una célula hospedadora recombinante. Dichas células hospedadoras recombinantes se describen con más detalles a continuación.
Se entiende que los detalles proporcionados en el presente documento con respecto a los polipéptidos se aplican a todos los aspectos de la invención.
La presente divulgación también proporciona células hospedadoras recombinantes que comprenden (por ejemplo, expresan) uno o más polipéptidos como se detallan en el presente documento, que son útiles en el proceso de la presente invención. Generalmente, los polipéptidos útiles en la invención serán heterólogos para las células hospedadoras, lo que significa que los polipéptidos normalmente no se encuentran ni se fabrican (es decir, se expresan) en las células hospedadoras, pero derivan de una especie diferente.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa. De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1);
b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1); o
c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
Una célula hospedadora recombinante utilizada de acuerdo con la presente invención puede comprender un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa. De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante de acuerdo con la divulgación comprende un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:
d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14);
e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14); o
f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante comprende un primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y un segundo polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa. De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante comprende un primer polipéptido heterólogo seleccionado de los polipéptidos de acuerdo con los puntos a) a c) como se detalla en el presente documento y un segundo polipéptido heterólogo seleccionado de los polipéptidos de acuerdo con los puntos e) a f) como se detalla en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones más particulares, una célula hospedadora recombinante comprende un primer polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1;
b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1; o
c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, en donde de 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados; y
un segundo polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:
d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14;
e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14; o
f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en donde de 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, suprimidos y/o insertados.
Como alternativa, el primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa puede estar comprendido por una primera célula hospedadora recombinante y el segundo polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa puede estar comprendido por una segunda célula hospedadora recombinante.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante comprende un primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y un polipéptido heterólogo adicional (por ejemplo, tercero) que tiene actividad fenilalanina amoníaco liasa.
Como alternativa, el primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa puede estar comprendido por una primera célula hospedadora recombinante y el polipéptido heterólogo adicional (por ejemplo, tercero) que tiene actividad fenilalanina amoníaco liasa puede estar comprendido por una célula hospedadora recombinante adicional (por ejemplo, tercera). Dicha célula hospedadora recombinante adicional puede ser una célula hospedadora recombinante que también comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
Las células hospedadoras recombinantes útiles para la presente invención pueden producirse a partir de cualquier organismo hospedador adecuado que sea bacteria o levadura.
Las células hospedadoras bacterianas se seleccionan de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los ejemplos no limitantes para las células hospedadoras bacterianas Gram negativas incluyen especies del géneroEscherichia,Erwinia,KlebsiellayCitrobacter.Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras bacterianas Gram-positivas incluyen especies del géneroBacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, StreptococcusyCellulomonas.
De acuerdo con determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una bacteria, que puede ser una bacteria del géneroBacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Geobacillus, Thermoanaerobacterium, Streptococcus, Pseudomonas, Streptomyces, Escherichia, Shigella, Acinetobacter, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Kluyvera, Serratia, Cedecea, Morganella, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, ProteusoYersinia.
De acuerdo con realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroBacillus.Los ejemplos no limitantes de una bacteria del géneroBacillussonBacillus subtitlis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformisyBacillus mojavensis.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esBacillus subtitlis.De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esBacillus licheniformis.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroLactococcus.Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroLactococcusesLactococcus lactis.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esLactococcus lactis.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroCorynebacterium. Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroCorynebacteriumesCorynebacterium glutamicum. De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esCorynebacterium glutamicum.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroStreptomyces.Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroStreptomycessonStreptomyces lividans, Streptomyces coelicoloroStreptomyces griseus.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esStreptomyces lividans.De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esStreptomyces coelicolor.De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esStreptomyces griseus.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroPseudomonas.Un ejemplo no limitativo de una bacteria del géneroPseudomonasesPseudomonas putida.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esPseudomonas putida.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroGeobacillus.Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroGeobacillusesGeobacillus thermoglucosidasiusyGeobacillus stearothermophilus.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esGeobacillus thermoglucosidasius.De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esGeobacillus stearothermophilus.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroThermoanaerobacterium.Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroPseudomonasesThermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esThermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.
De acuerdo con otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroEscherichia.Un ejemplo no limitante de una bacteria del géneroEscherichiaesEscherichia coli.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esEscherichia coli.
Las células hospedadoras de levadura pueden derivarse de, por ejemplo,Saccharomyces, Pichia, Schizosacharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Pachyosolen, Kluyveromyces, Debaryomyces, Yarrowia, Candida, Cryptococcus, Komagataella, Lipomyces, Rhodospiridium, RhodotorulaoTrichosporon.
De acuerdo con determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una levadura, que puede ser una levadura del géneroSaccharomyces, Pichia, Schizosacharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Pachyosolen, Kluyveromyces, Debaryomyces, Yarrowia, Candida, Cryptococcus, Komagataella, Lipomyces, Rhodospiridium, RhodotorulaoTrichosporon.
De acuerdo con realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una levadura del géneroSaccharomyces.Un ejemplo no limitante de una levadura del géneroSaccharomycesesSaccharomyces cerevisiae.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esSaccharomyces cerevisiae.
De acuerdo con realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una levadura del géneroPichia.Los ejemplos no limitantes de una levadura del géneroPichiasonPichia pastorisyPichia kudriavzevii.De acuerdo con realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esPichia pastoris.De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante esPichia kudriavzevii.
Generalmente, una célula hospedadora recombinante útil en la invención se ha modificado genéticamente para expresar uno o más polipéptidos como se detallan en el presente documento, lo que significa que una o más moléculas de ácido nucleico exógenas, tales como moléculas de ADN, que comprenden una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicho polipéptido o polipéptidos se han introducido en la célula hospedadora. Los expertos en la materia conocen técnicas para introducir moléculas de ácido nucleico exógeno, como una molécula de<a>D<n>, en las diversas células hospedadoras e incluyen transformación (por ejemplo, choque térmico o transformación natural), transfección, conjugación, electroporación, microinyección y bombardeo de micropartículas.
En consecuencia, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se detalla en el presente documento.
Para facilitar la expresión del polipéptido en la célula hospedadora, la molécula exógena de ácido nucleico puede comprender elementos reguladores adecuados, como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido.
Los promotores útiles de acuerdo con la invención son cualquier promotor conocido que sea funcional en una célula hospedadora dada para provocar la producción de una molécula de ARNm. La persona experta conoce muchos de estos promotores. Dichos promotores incluyen promotores normalmente asociados con otros genes y/o promotores aislados de cualquier bacteria, levadura, hongos, alga o célula vegetal. Los expertos en la materia de la biología molecular conocen generalmente el uso de promotores para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase Sambrooket al., Molecular cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989. El promotor empleado puede ser inducible. El término "inducible" usado en el contexto de un promotor significa que el promotor solo dirige la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente si hay un estímulo presente, como un cambio de temperatura o la presencia de una sustancia química ("inductor químico"). Como se usa en el presente documento, "inducción química" de acuerdo con la presente invención se refiere a la aplicación física de una sustancia exógena o endógena (incluyendo macromoléculas, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos) a una célula hospedadora. Esto tiene el efecto de hacer que el promotor diana presente en la célula hospedadora aumente la velocidad de transcripción. Como alternativa, el promotor empleado puede ser constitutivo. El término "constitutivo" utilizado en el contexto de un promotor significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente en ausencia de estímulo (como choque térmico, productos químicos, etc.).
Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en bacterias, comoBacillus subtilis, Lactococcus lactisoEscherichia coli,incluyen promotores constitutivos e inducibles, tales como el promotor T7, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; promotor de fosfatasa alcalina (phoA), un sistema de promotor de triptófano (trp), promotor de tetraciclina, promotor del fago lambda, promotores de proteínas ribosómicos; y promotores híbridos, tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos y sintéticos.
Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en levadura, comoSaccharomyces cerevisiae,incluyen promotor de xilosa, promotores GAL1 y GAL10, promotor TEF1 y promotor pgkl.
Además de un promotor, la molécula de ácido nucleico exógena puede comprender además al menos un elemento regulador seleccionado entre una región 5' no traducida (UTR 5') y una región 3' no traducida (UTR 3'). Los expertos conocen bien muchas de estos UTR 5' y UTR 3' procedentes de procariotas y eucariotas. Dichos elementos reguladores incluyen UTR 5' y UTR 3' normalmente asociados con otros genes, y/o UTR 5' y UTR 3' aislados de cualquier bacteria, levadura, hongos, alga o célula vegetal.
Si la célula hospedadora es un organismo procariota, el UTR 5' generalmente contiene un sitio de unión a ribosomas (RBS), también conocido como la secuencia Shine Dalgarno, que generalmente tiene 3-10 pares de bases cadena arriba del codón de inicio. Por otro lado, si la célula hospedadora es un organismo eucariota, el UTR 5' generalmente contiene la secuencia consenso de Kozak. Una UTR 5' eucariótica también puede contener elementos reguladores que actúan en cis.
La molécula de ácido nucleico exógena puede ser un vector o parte de un vector, tal como un vector de expresión. Normalmente, dicho vector permanece extracromosómico dentro de la célula hospedadora, lo que significa que se encuentra fuera del núcleo o región nucleoide de la célula hospedadora.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención no expresa una aril sulfotransferasa dependiente de PAPS endógena.
La presente invención también contempla que la molécula de ácido nucleico exógeno esté integrada de manera estable en el genoma de la célula hospedadora. Medios para una integración estable en el genoma de una célula hospedadora, por ejemplo, por recombinación homóloga, son bien conocidos por la persona experta.
La reacción de sulfatación depende del suministro de sulfato de 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS) o transferencia desde otro compuesto sulfatado. Los inventores demostraron que la reacción de sulfatación puede potenciarse mejorando el suministro de PAPS (5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina) y, además, mediante la eliminación del producto 5'-fosfato de 3'-fosfoadenosina (PAP). El suministro mejorado se obtiene por desregulación, mutación o sobreexpresión de enzimas que aumentan la concentración de PAPS o también reducen la concentración de PAP. Esto se ejemplifica en el Ejemplo 2, donde una producción aumentada de ácido zostérico enEscherichia colise obtiene aumentando la expresión de los genes cysD, cysN y cysC que son responsables de la producción de PAPS. Sin quedar unido a una teoría específica, se cree que un resto adenililo (AMP) de ATP se transfiere al sulfato para formar sulfato activado, o APS (5'-fosfosulfato de adenosina). Esta reacción extremadamente desfavorable está relacionada cinéticamente y energéticamente a la hidrólisis de GTP por la enzima ATP sulfurilasa, que se compone de dos tipos de subunidades: una adenilil transferasa (cysD) y una GTPasa (cysN). APS después se fosforila en el 3'-hidroxilo para formar PAPS (5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina) en una reacción catalizada por APS cinasa, que está codificado por cysC. Además, los inventores mejoraron aún más la producción de ácido zostérico al aumentar la expresión del gen cysQ que codifica una PAP fosfatasa que es responsable de la eliminación de PAP.
Por lo tanto, para mejorar aún más la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, una célula hospedadora recombinante útil en la presente invención puede modificarse adicionalmente para tener una expresión de proteína aumentada de una ATP sulfurilasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación; puede modificarse adicionalmente para tener una expresión de proteína aumentada de una APS cinasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación; y/o puede modificarse adicionalmente para tener una expresión de proteína aumentada de una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación. Por "expresión de proteína aumentada" se entiende que la cantidad de la proteína respectiva producida por la célula hospedadora modificada de este modo aumenta en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación. Más particularmente, por "aumentar la expresión" se entiende que la cantidad de proteína respectiva producida por la célula hospedadora modificada de este modo aumenta en al menos el 10 %, tal como al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, al menos el 500 %, al menos el 600 %, al menos el 700 %, al menos el 800 %, al menos aproximadamente el 900 %, al menos aproximadamente el 1000 %, al menos aproximadamente el 2000 %, al menos aproximadamente el 3000 %, al menos aproximadamente el 4000 %, al menos aproximadamente el 5000 %, al menos aproximadamente el 6000 %, al menos aproximadamente el 7000 %, al menos aproximadamente el 8000 %, al menos aproximadamente el 9000 % o al menos aproximadamente el 10000 %, comparado con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación. La cantidad de proteína en una célula dada puede determinarse mediante cualquier técnica de cuantificación adecuada conocida en la técnica, tales como ELISA, Inmunohistoquímica o transferencia de Western.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención se ha modificado adicionalmente para que tenga una expresión de proteína aumentada de una ATP sulfurilasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención se ha modificado adicionalmente para que tenga una expresión de proteína aumentada de una APS cinasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación.
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención se ha modificado adicionalmente para que tenga una expresión de proteína aumentada de una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no porta dicha modificación.
Mediante cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la materia se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas. Por ejemplo, se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas aumentando el número de copias del gen o genes que codifican la proteína respectiva (por ejemplo, ATP sulfurilasa, APS cinasa y/o PAP fosfatasa) en la célula hospedadora, como mediante el uso (por ejemplo, la introducción en la célula hospedadora) de vectores que comprenden el gen o genes unidos operativamente a un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas mediante la integración de al menos una segunda copia del gen o genes que codifican la proteína respectiva en el genoma de la célula hospedadora. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas aumentando la fuerza del promotor o los promotores unidos operativamente al gen o genes. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas modificando el sitio de unión al ribosoma en la molécula de ARNm que codifica la proteína respectiva (por ejemplo, ATP sulfurilasa, APS cinasa y/o PAP fosfatasa). Al modificar la secuencia del sitio de unión al ribosoma se puede aumentar la velocidad de inicio de la traducción, aumentando de este modo la eficiencia de la traducción.
Los genes que codifican ATP sulfurilasa para usar de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, los genes cysD y cysN deEscherichia coli(que codifica SEQ ID NO: 25 y 26, respectivamente). Los genes que codifican ATP sulfurilasa alternativos incluyen el gen de ATP sulfurilasa ASAL deArabidopsis thaliana(N.° de acceso de GenBank U40715, Loganet al.(1996)J Biol Chem271: 12227); el gen ATP-sulfurilasa de la cepaAllium(N.° AF21154 de Registro en GenBank); el gen ATP sulfurilasa deLotus japonicus(N.° AW164083 de Registro en GenBank); el gen met3-1 ATP sulfurilasa deArabidopsis thaliana(N.° X792l0 de Registro en GenBank).
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican una ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26 o iv) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25 y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 25, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.
Un gen codificante alternativo de ATP sulfurilasa para usar de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET3 deSaccharomyces cerevisiae(que codifica SEQ ID NO: 68).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.
Un gen codificante de ATP sulfurilasa alternativo para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen que codifica ATP sulfurilasa deBacillus subtilis(que codifica SEQ ID NO: 73).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 73 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 73.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.
Para facilitar la expresión de los polipéptidos en la célula hospedadora, la molécula de ácido nucleico exógeno puede comprender elementos reguladores adecuados, tales como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está unido operativamente a las secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos.
Un gen que codifica APS cinasa para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen cysC deEscherichia coli(que codifica SEQ ID NO: 27).
En determinados casos, se ha demostrado que un único polipéptido posee actividad ATP sulfurilasa y actividad 5'-adenililsulfato cinasa. Por ejemplo, se ha aislado un gen que codifica ATP sulfurilasa/APS cinasa de fuentes de ratón (N.° de acceso de GenBank U34883, Liet al.(1995)J Biol Chem)70: 1945) y humanas (N.° de acceso de GenBank AF033026, Yanagisawa (1998)Biosci Biotechnol Biochem62: 1037). Otros ejemplos de dicha enzima bifuncional incluyen enzimas 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato sintasa (PAPSS) de rata(Rattus norvegicus)(SEQ ID NO: 71 o 72).
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 27 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 27.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
Un gen codificante alternativo de APS cinasa para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET14 deSaccharomyces cerevisiae(que codifica SEQ ID NO: 69).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 69 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 69.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
Un gen codificante alternativo de APS cinasa para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen codificante de APS cinasa deBacillus subtilis(que codifica SEQ ID NO: 74).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad APS cinasa.
Como alternativa, puede usarse un polipéptido que tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa, tal como una 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato sintasa (PAPSS). De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato sintasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 71 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 71.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido tiene tanto actividad ATP sulfurilasa como actividad APS cinasa.
Para facilitar la expresión del polipéptido en la célula hospedadora, la molécula exógena de ácido nucleico puede comprender elementos reguladores adecuados, como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido.
Un gen que codifica PAP fosfatasa para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen cysQ deEscherichia coli(que codifica SEQ ID NO: 28).
De acuerdo con determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
Un gen que codifica PAP fosfatasa alternativa para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET22 deSaccharomyces cerevisiae(que codifica SEQ ID NO: 70).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
Un gen codificante de PAP fosfatasa alternativo para su uso de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, el gen codificante de PAP fosfatasa deBacillus subtilits(que codifica SEQ ID NO: 75).
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 75 o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido de acuerdo con ii) tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 75.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
De acuerdo con realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante útil en la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (tal como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, tal como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.
Para facilitar la expresión del polipéptido en la célula hospedadora, la molécula exógena de ácido nucleico puede comprender elementos reguladores adecuados, como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido.
Se entiende que los detalles proporcionados en el presente documento con respecto a una célula hospedadora recombinante se aplican a otros aspectos de la invención, en particular a los procesos y usos de acuerdo con la invención, que se describen con más detalle a continuación.
Métodos y usos
El medio empleado en el proceso de la presente invención puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedadora en cuestión, y puede estar compuesto de acuerdo con los principios de la técnica anterior. El medio generalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de la célula hospedadora respectiva, como fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas. Los medios adecuados, por ejemplo, medios mínimos o complejos, están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse de acuerdo con las recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El medio convencional no limitante bien conocido por la persona experta incluye el caldo Luria Bertani (l B), Caldo Sabouraud Dextrosa (SD), caldo MS, Levadura Peptona Dextrosa, Bm MY, GMMY, o caldo de extracto de levadura y malta (YM), que están disponibles en el mercado. Un ejemplo no limitante de medios adecuados para cultivar células bacterianas, como células deB. subtilis, L. lactisoE. coli,incluyendo medios mínimos y medios enriquecidos como caldo Luria (LB), medios M9, medios M17, medios SA, medios MOPS, Caldo Terrific, y T y otros. Los medios adecuados para cultivo de células eucariotas, las células de levadura, son RPMI 1640, MEM, DMEM, los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según lo requiera la célula hospedadora particular que se cultiva. El medio para cultivar células eucariotas también puede ser cualquier tipo de medio mínimo, como medio mínimo de levadura.
El sustrato de carbono fermentable puede ser cualquier sustrato de carbono adecuado conocido en la técnica, y en particular cualquier sustrato de carbono usado comúnmente en el cultivo y/o fermentación de microorganismos. Los ejemplos no limitantes de sustratos de carbono fermentables adecuados incluyen carbohidratos (por ejemplo, azúcares C5 como arabinosa o xilosa, o azúcares C6 como glucosa), glicerol, glicerina, acetato, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, metanol, metano, aceites, grasas animales, aceites animales, aceites vegetales, ácidos grasos, lípidos, fosfolípidos, glicerolípidos, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, fuentes de carbono renovables, polipéptidos (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, peptona, casaminoácidos o cualquier combinación de dos o más de los anteriores.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el sustrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en azúcares
C5 (como arabinosa o xilosa), azúcares C6 (como glucosa o fructosa), lactosa, sacarosa, glicerol, glicerina, acetato, licor de maíz fermentado, extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, peptona, casaminoácidos o combinaciones de los mismos.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el medio comprende glucosa.
De acuerdo con determinadas otras realizaciones, el medio comprende glicerol.
De acuerdo con determinadas otras realizaciones, el medio comprende acetato.
También se contempla usar almidón como sustrato de carbono. Dependiendo del microorganismo utilizado, el metabolismo del almidón puede requerir el suplemento de beta-glucosidasa, como la beta-glucosidasa deNeurospora crassa,al medio. Como alternativa, una célula hospedadora de recombinación de acuerdo con la divulgación puede modificarse genéticamente adicionalmente para expresar una beta-glucosidasa, como la beta-glucosidasa deNeurospora crassa.
Cuando se emplea un sustrato de carbono fermentable, es posible que la célula hospedadora recombinante produzca el compuesto fenólico o un precursor del mismo directamente a partir de dicho sustrato de carbono primario.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el proceso comprende además:
(ii) cultivar la primera célula hospedadora recombinante en condiciones adecuadas para la producción del compuesto
fenólico sulfatado correspondiente.
El experto en la materia conoce bien las condiciones adecuadas para cultivar la célula hospedadora respectiva.
Normalmente, la célula hospedadora recombinante se cultiva a una temperatura que varía de aproximadamente 23 a aproximadamente 60 °C, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C, tal como a aproximadamente
37 °C. El pH del medio puede variar de pH 1,0 a pH 14,0, tal como de aproximadamente pH 1 a aproximadamente pH
2, de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 11, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10, o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9,5, por ejemplo a pH 6,0, pH 7,0, pH. 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, pH 9,5, pH 10,0, pH 10,5 o pH 11,0.
El proceso puede comprender además recuperar el compuesto fenólico sulfatado. El compuesto fenólico sulfatado puede recuperarse mediante un método convencional para aislar y purificar compuestos químicos de un medio. Los procedimientos de purificación bien conocidos incluyen métodos de centrifugación o filtración, precipitación y cromatográficos tales como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, etc.
Además se proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, el método comprende sulfatar un compuesto fenólico, como ácido p-cumárico, usando un polipéptido que tiene actividad
aril sulfotransferasa como se detalla en el presente documento.
El experto en la materia conoce bien las condiciones adecuadas para la reacción de sulfatación. Normalmente, la reacción de sulfatación tiene lugar a una temperatura que varía de aproximadamente 23 a aproximadamente 60 °C, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C, tal como a aproximadamente 37 °C. La reacción de desaminación puede tener lugar a un pH que varía de pH 1,0 a pH 14,0, tal como de aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 11, tal como de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10, o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9,5, por ejemplo a pH 6,0, pH 7,0, pH. 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, pH 9,5, pH 10,0, pH 10,5 o pH 11,0.
Para la finalidad de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, debe entenderse que los compuestos fenólicos incluyen aquellos compuestos en donde un grupo hidroxilo está directamente unido a un átomo de carbono bencenoide, y qué compuestos pueden contener o no otros grupos sustituyentes. Esto se define en la Fórmula (I):
en donde al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 son un grupo hidroxilo (-OH);
en donde R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR7, -OCOR7, -NR7R8, -COR7, -COOR7, -SR7, -OSO3R7, -OCSR7, -POR7R8, alquilo, al alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo;
en donde R6 es -COOR7 o p-hidroxifenilo, en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; o
en donde R6 es p-hidroxifenilo y cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo.
Los ejemplos específicos de compuestos de Fórmula I incluyen, pero sin limitación, reservatrol, o-, ácido m y pcumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido sinápico, curcumina, ácido rosmarínico, alcohol sinapílico, alcohol coniferílico y ácido salvianólico.
Un precursor de un compuesto fenólico de acuerdo con la fórmula I puede ser un compuesto representado por la fórmula general (p-I):
en donde al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 son un grupo hidroxilo (-OH);
en donde R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR7, -OCOR7, -NR7R8, -COR7, -COOR7, -SR7, -OSO3R7, -OCSR7, -POR7R8, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R6 es -COOR7 o p-hidroxifenilo, en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; o
en donde R6 es p-hidroxifenilo y cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo.
Dicho precursor puede convertirse en el compuesto fenólico por una célula hospedadora recombinante de acuerdo con la divulgación, que comprende un polipéptido que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
Dicho polipéptido eliminará el amoníaco del precursor de Fórmula (p-I) bajo la formación de la molécula correspondiente de Fórmula I. Preferentemente, el precursor p-I es el isómero L.
De acuerdo con determinadas realizaciones, R6 es -COOR7.
De acuerdo con determinadas realizaciones, R7 es hidrógeno.
De acuerdo con determinadas realizaciones, R2 es hidroxilo (-OH).
De acuerdo con determinadas realizaciones, R3 es hidroxilo (-OH).
De acuerdo con determinadas realizaciones, R4 es hidroxilo (-OH).
De acuerdo con determinadas realizaciones, cada uno de R1, R2, R4 y R5 es hidrógeno.
De acuerdo con ciertos modos de realización, cada uno de R1, R2 y R5 es hidrógeno.
De acuerdo con realizaciones particulares, el compuesto fenólico es ácido p-cumárico (Fórmula I: R1=H, R2=H, R3 = OH, R4=H, R5= H, Ra=COOH).
De acuerdo con otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es el ácido cafeico (Fórmula I: R1=H, R2=H, R3 = OH, R4 = OH, R5= H, Ra=COOH).
De acuerdo con otras realizaciones particulares, el ácido fenólico es ácido ferúlico (Fórmula I: Ri=H, R2=OCH3, R3 = OH, R4=H, R5= H, Ra=COOH).
De acuerdo con otras realizaciones particulares, el ácido fenólico es ácido sinápico (Fórmula I: R1=H, R2=OCH3, R3 = OH, R4=OCH3, R5= H, Ra=COOH).
De acuerdo con otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es resveratrol (Fórmula I: R1=H, R2 = OH, R3=H, R4 = OH, R5= H, R6=p-hidroxifenilo).
De acuerdo con otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es vainillina (Fórmula II: R1=H, R2=H, R3 = OH, R4 = OCH3, R5= H, R6= H).
De acuerdo con determinadas realizaciones, el compuesto fenólico es un ácido hidroxicinámico.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el compuesto fenólico es un compuesto representado por la fórmula general (I), en donde R1 es hidrógeno; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C1-6 y alcoxi C1-6, con la condición de que al menos uno de R2, R3 y R4 sea hidroxilo (-OH); R5 es hidrógeno y R6 es COOH.
De acuerdo con determinadas realizaciones, el precursor de un compuesto fenólico como se emplea en la etapa (i"') es un compuesto de la Fórmula general (p-I), en donde R1 es hidrógeno; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C1-6 y alcoxi C1-6, con la condición de que al menos uno de R2, R3 y R4 sea hidroxilo (-OH); R5 es hidrógeno y R6 es COOH.
De acuerdo con determinada realización, el compuesto fenólico sulfatado obtenido de acuerdo con la presente invención es el ácido zostérico.
Las moléculas donantes de sulfato adecuadas metabolizadas por un polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa son bien conocidas por un experto en la materia. Los ejemplos no limitantes incluyen 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS), sulfato de para-nitrofenilo (pNPS) y sulfato de 4-metilumbeliferilo (MUS). Dichas moléculas donantes de sulfato pueden emplearse para facilitar la sulfatación de compuestos fenólicos de acuerdo con la invención.
El medio empleado para cultivar la célula hospedadora recombinante puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedadora en cuestión, y puede formarse de acuerdo con los principios de la técnica anterior. El medio generalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de la célula hospedadora respectiva, como fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas, como sales de sulfato. Los medios adecuados, por ejemplo, medios mínimos o complejos, están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse de acuerdo con las recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El medio convencional no limitante bien conocido por la persona experta incluye el caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrosa (SD), caldo MS, Levadura Peptona Dextrosa, BMMY, GMMY, o caldo de extracto de levadura y malta (YM), que están disponibles en el mercado. Un ejemplo no limitante de medios adecuados para cultivar células bacterianas, como células deB. subtilis, L. lactisoE. cotí,incluyendo medios mínimos y medios enriquecidos como caldo Luria (LB), medios M9, medios M17, medios SA, medios MOPS, Caldo Terrific, YT y otros. Los medios adecuados para cultivo de células eucariotas, las células de levadura, son RPMI 1640, MEM, DMEM, los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según lo requiera la célula hospedadora particular que se cultiva. El medio para cultivar células eucariotas también puede ser cualquier tipo de medio mínimo, como medio mínimo de levadura.
Determinadas definiciones
La "actividad aril sulfotransferasa", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la transferencia de un grupo sulfato de una molécula donante a una molécula aceptora de arilo.
La "actividad tirosina amoníaco liasa", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la conversión de L-tirosina en ácido p-cumárico.
La "actividad fenilalanina amoníaco liasa", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico.
"ATP sulfurilasa", como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: ATP sulfato = difosfato 5'-fosfosulfato de adenosina (APS).
"APS cinasa", como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: ATP 5'-fosfosulfato de adenosina (APS) = ADP 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS).
"PAP fosfatasa", como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: 5'-fosfato de 3'-fosfoadenosina (PAP) H2O = AMP fosfato.
"Polipéptido" o "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para indicar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Dentro de esta definición se incluyen D- y L-aminoácidos y mezclas de D- y L-aminoácidos.
"Ácido nucleico" o "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento para indicar un polímero de al menos dos unidades de monómero de ácido nucleico o bases (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timina) unidos covalentemente por un enlace fosfodiéster, independientemente de la longitud o la modificación de base.
"Recombinante" o "no natural" cuando se usa con referencia a, por ejemplo, una célula hospedadora, ácido nucleico o polipéptido, se refiere a un material, o un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que ha sido modificado de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza, o es idéntico a los mismos pero producido o derivado de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando técnicas recombinantes. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, células hospedadoras recombinantes que expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o que expresan genes nativos que de otro modo se expresan a un nivel diferente.
"Sustitución" o "sustituido" se refiere a la modificación del polipéptido reemplazando un resto de aminoácido con otro, por ejemplo, el reemplazo de un resto de arginina con un resto de glutamina en una secuencia de polipéptidos es una sustitución de aminoácidos.
"Sustitución conservadora" se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido con un resto diferente que tiene una cadena lateral similar, y por lo tanto generalmente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos dentro de la misma clase de aminoácidos o similar. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede estar sustituido con otro aminoácido alifático, por ejemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina; un aminoácido con cadena lateral hidroxilo está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral hidroxilo, por ejemplo, serina y treonina; un aminoácido que tiene una cadena lateral aromática se sustituye con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina; un aminoácido con una cadena lateral básica se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral básica, por ejemplo, lisina y arginina; un aminoácido con una cadena lateral ácida se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral ácida, por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico; y un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se reemplaza con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente.
"Sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en un polipéptido con un aminoácido con propiedades de cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden usar aminoácidos entre, en lugar de dentro de, los grupos definidos y afectan (a) la estructura del esqueleto del péptido en el área de la sustitución (por ejemplo, prolina por glicina) (b) la carga o hidrofobia, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservativa de ejemplo puede ser un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido con un aminoácido pequeño; y un aminoácido hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.
"Supresión" o "suprimido" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos en el polipéptido de referencia. Las supresiones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta el 10 % del número total de aminoácidos, o hasta el 20 % del número total de aminoácidos que forman el polipéptido mientras retienen la actividad enzimática y/o retienen las propiedades mejoradas de una enzima modificada por ingeniería genética. Las supresiones pueden dirigirse a las porciones internas y/o porciones terminales del polipéptido, en diversas realizaciones, la supresión puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinuo.
"Inserción" o "insertado" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos al polipéptido de referencia. Las inserciones pueden comprender la adición de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos. Las inserciones pueden estar en las porciones internas del polipéptido, o en el extremo carboxi o amino. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido de referencia.
"Célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula viva o microorganismo que es capaz de reproducir su material genético y junto con el material genético recombinante que se ha introducido en él, por ejemplo, mediante transformación heteróloga.
"Expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido (por ejemplo, enzima codificada) que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Como se usa en el presente documento, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ácido nucleico bicatenario en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión". Determinados otros vectores son capaces de facilitar la inserción de una molécula de ácido nucleico exógena en el genoma de una célula hospedadora. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de transformación". En general, los vectores de utilidad en las técnicas de ácido nucleico recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de un vector. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles en el mercado.
Como se usa en el presente documento, "promotor" se refiere a una secuencia de ADN, generalmente cadena arriba (5') de la región codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante proporcionando sitios de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa y otros factores que pueden ser necesarios para el inicio de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la secuencia de ácido nucleico de interés. Un "promotor funcional en una célula hospedadora" se refiere a un "promotor" que es capaz de soportar el inicio de la transcripción en dicha célula, causando la producción de una molécula de ARNm.
Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite actuar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control. Una secuencia promotora está "unidad operativamente" a un gen cuando está suficientemente cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen para regular la transcripción del gen.
"Porcentaje de identidad de secuencia", "% de identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" se usan en el presente documento para referirse a comparaciones entre una secuencia de aminoácidos y una secuencia de aminoácidos de referencia. El "% de identificación de secuencia", como se usa en el presente documento, se calcula a partir de las dos secuencias de aminoácidos de la siguiente manera: Las secuencias se alinean usando la Versión 9 del GAP (programa de alineación global) del Genetic Computing Group, usando la matriz BLOSUM62 predeterminada (véase a continuación) con una penalización de apertura de hueco de -12 (para el primer nulo de un hueco) y una penalización de extensión de hueco de -4 (por cada nulo adicional en el hueco). Después de la alineación, el porcentaje de identidad se calcula expresando el número de coincidencias como un porcentaje del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia.
Se utiliza la siguiente matriz BLOSUM62:
"Secuencia de referencia" o "secuencia de aminoácidos de referencia" se refiere a una secuencia definida con la que se compara otra secuencia. En el contexto de la presente invención, una secuencia de aminoácidos de referencia puede ser una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23.
Los radicales /grupos alifáticos, como se menciona en el presente documento, están opcionalmente mono- o polisustituidos y pueden ser ramificados o no ramificados, saturados o insaturados. Los grupos alifáticos insaturados, como se definen en el presente documento, incluyen radicales alquilo, alquenilo y alquinilo. Los radicales alifáticos preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, vinilo (etenilo), etinilo, propilo, n-propilo, isopropilo, alilo (2-propenilo), 1 -propinilo, metiletilo, butilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butil butenilo, butinilo, 1 -metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, pentilo, n-pentilo, 1,1 -dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo,
2,2-dimetilpropilo, hexilo, 1 -metilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo y n-decilo. Son sustituyentes preferidos para radicales alifáticos, de acuerdo con la presente invención, un grupo alquilo C1-4, un grupo alcoxi C1-6 lineal o ramificado,
F, Cl, I, Br, CF3, CH2F, CHF2, CN, OH, SH, NH2, oxo, (C=O)R', SR', SOR', SO2R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C1-6 lineal o ramificado.
"Alquilo", "radical alquilo" o grupo como se usa en el presente documento significa hidrocarburos saturados, hidrocarburos lineales o ramificados, que pueden estar sin sustituir o mono o polisustituidos. Por lo tanto, se entiende que el alquilo insaturado incluye grupos alquenilo y alquinilo, como por ejemplo -CH=CH-CH3 o -CEC-CH3, mientras que el alquilo saturado incluye por ejemplo, -CH3y -CH2-CH3. "alquilo C1-12" incluye alquilo C1-2, alquilo C1-3, alquilo C1-4 y alquilo C1-5, alquilo C1-6, alquilo C1-7, alquilo C1-8, alquilo C1-9, alquilo C1-10 y alquilo C1.11. En estos radicales, alquilo
C1-2 representa alquilo C1 o C2, alquilo C1-3 representa alquilo C1, C2 o C3, alquilo C1.4 representa alquilo C1, C2, C3 o
C4, alquilo C1.5 representa alquilo C1, C2, C3, C4 o C5, alquilo C1.6 representa alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6, etc. Los radicales alquilo pueden ser metilo, etilo, vinilo (etenilo), propilo, alilo (2-propenilo), 1 -propinilo, metiletilo, butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, pentilo, 1,1 -dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2,2-dimetilpropilo, hexilo, 1-metilpentilo, si se sustituye también CHF2, CF3 o CH2OH etc. Estos radicales alquilo, alquenilo o alquinilo pueden estar opcionalmente mono- o polisustituidos por sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C1-4, un grupo alcoxi C1-6 lineal o ramificado, F, Cl, I, Br, CF3, CH2F, CHF2, CN, OH, SH, NH2, (C=O)R', SR', SOR', SO2R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente grupo alquilo
C1-6 lineal o ramificado.
"Arilo" o "radical arilo", como se entienden en el presente documento, significan sistemas de anillo con al menos un anillo aromático pero sin heteroátomos incluso en solo uno de los anillos. Estos radicales arilo pueden estar opcionalmente mono- o polisustituidos por sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C1-4, un grupo alcoxi C1-6 lineal o ramificado, un grupo fenilo opcionalmente al menos mono-sustituido, F, Cl, I, Br, CF3, CH2F, CHF2, CN, OH, SH, NH2, oxo, (C=O)R', SR', SOR', SO2R', N(C=O)-OR', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C1-6 lineal o ramificado. Los ejemplos preferentes de radicales arilo incluyen, pero sin limitación, radicales fenilo, naftilo, fluorantenilo, fluorenilo, tetralinilo o indanilo o antracenilo, que opcionalmente pueden estar mono- o polisustituidos, si no se define lo contrario.
"Alquil-arilo" o "radical alquil-arilo", como se usan en el presente documento, comprenden una cadena de alquilo lineal o ramificada, opcionalmente al menos monosustituida, que está unida a un grupo arilo, como se ha definido anteriormente. Un radical alquil-arilo preferente es un grupo bencilo, en donde la cadena de alquilo está opcionalmente ramificada o sustituida. Son sustituyentes preferidos para radicales alquil-arilo, de acuerdo con la presente invención,
F, Cl, Br, I, NH2, SH, OH, SO2, CF3, carboxi, amido, ciano, carbamilo, nitro, fenilo, bencilo, -SO2NH2, alquilo C1-6 y/o alcoxi C1-6.
"Heteroarilo" o "radical heteroarilo", como se usan en el presente documento, se entiende que significan sistemas de anillos heterocíclicos que tienen al menos un anillo aromático y pueden contener opcionalmente uno o más heteroátomos del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y/o azufre y pueden estar opcionalmente mono o polisustituidos con sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C1-4, un grupo alcoxi C1-6 lineal o ramificado, F, Cl, I, Br, CF3, CH2F, CHF2, CN, OH, SH, NH2, oxo, (C=O)R', SR', SOR', SO2R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C1-6 lineal o ramificado. Los ejemplos preferentes de heteroarilos incluyen, pero sin limitación, furano, benzofurano, tiofeno, benzotiofeno, pirrol, piridina, pirimidina, piridazina, pirazina, quinolina, isoquinolina, ftalazina, benzo-1,2,5-tiadiazol, benzotiazol, indol, benzotriazol, benzodioxolano, benzodioxano, bencimidazol, carbazol y quinazolina.
"Alcoxi", "radical alcoxi" o grupo como se usa en el presente documento significa un "alquilo" singular unido a oxígeno.
"Alcoxi C W incluye alcoxi C1-2, alcoxi C1-3, alcoxi C1-4 y alcoxi C1-5, así como alcoxi C2-3, alcoxi C2-4, alcoxi C2-5, alcoxi
C3-4, alcoxi C3-5, y alcoxi C4-5. En estos radicales, alcoxi C1-2 representa alcoxi C1 o C2, alcoxi C1-3 representa alcoxi
C1, C2 o C3, alquilo C1.4 representa alcoxi C1, C2, C3 o C4, alcoxi C1.5 representa alcoxi C1, representa alcoxi C1, C2, C3, C4, C5 o C6. Los radicales alcoxi pueden ser metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentiloxi o hexiloxi.
La expresión "precursor de un compuesto fenólico" se refiere a cualquier compuesto que pueda convertirse en un compuesto fenólico por las células hospedadoras como se describe en el presente documento.
Cuando se indique un límite numérico o un intervalo en el presente documento, se incluyen los puntos extremos. Además, todos los valores y sub intervalos dentro de un límite numérico o intervalo se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.
Habiendo descrito de manera general la presente invención, se puede obtener una mayor comprensión haciendo referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Producción de ácido zostérico enE. coli
Una gama de aril sulfotransferasas que incluye SULT1A1 deRattus norvegicus(SEQ ID NO: 1), SULT1A1 deHomo sapiens(SEQ ID NO: 2), SULT1A1 deEquus caballus(SEQ ID NO: 3), SULT1A1 deSus scrofa domesticus(SEQ ID<n>O: 4), SULT1A1 deCanis lupus familiaris(SEQ ID<n>O: 5) y SULT1E1 deGallus gallus domesticus(SEQ<i>D NO: 6) se expresaron enEscherichia coli.Los genes respectivos que codifican SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 y 6 se clonaron y se amplificaron a partir de ADNc de tejido hepático (Zyagen) mediante PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla 1. Se optimizaron los codones de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica SEQ ID NO: 2 para la expresión enEscherichia coli(GeneArt, Life Technologies) y se amplificó por PCR usando los cebadores de la Tabla 1. El plásmido pETDuet-1 se digirió con endonucleasas de restricción ncol ysall.Los productos de PCR se clonaron individualmente en el plásmido pETDuet-1 usando la reacción de Gibson (New England Biolabs). Los plásmidos resultantes se transformaron en BL21 (DE3) pLysS (Life Technologies). La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del plásmido que codifica SULT1A1 deRattus norvegicus(SEQ ID NO: 1).
T l 1: D ri i n n r l nzim r ^ r l n i n ril lf r n f r s
Las cepas se cultivaron en medio mínimo M9 que contenía glucosa como fuente de carbono e IPTG 0,1 mM para la inducción de la expresión génica, así como ácido p-cumárico 0,1 mM (pHCA). Después de cuatro días de crecimiento, las muestras se extrajeron por filtración y se analizaron por HPLC.
La concentración de ácido p-cumárico (pHCA) y ácido zostérico en el sobrenadante se cuantificó mediante alto rendimiento (HPLC) y se comparó con los patrones químicos. La HPLC se realizó en una configuración Thermo usando una columna HS-F5 y fases móviles: formiato de amonio 5 mM pH 4,0 (A) y acetonitrilo (B) a 1,5 ml min-1, usando un gradiente de elución que comienza en B al 5 %. 0,5 min después de la inyección a 7 min, la fracción de B aumentó linealmente del 5 % al 60 %, y entre 9,5 min y 9,6 min la fracción de B disminuyó de nuevo al 5 %, y permaneció allí hasta 12 min. El pHCA y el ácido zostérico se cuantificaron midiendo la absorbancia a 277 nm.
La Tabla 2 muestra el pHCA restante y el ácido zostérico producido en los medios de cultivo. El ácido zostérico se formó con una aril sulfotransferasa heteróloga expresada en un microorganismo ejemplificado porE. colisuministrado con el sustrato.
Tabla 2: Producción de ácido zostérico enE. colia partir de pHCA a través de la expresión heteróloga de sulfotransferasas.
Ejemplo 2 - Aumento de la producción de ácido zostérico enE. coli
La adición de grupos sulfatados a las dianas depende del suministro de la molécula donante 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS). Se examinó si se podría aumentar la producción de ácido zostérico sobreexpresando enzimas que proporcionan PAPS y una enzima que elimina el producto 5'-fosfato de 3'-Fosfoadenosina(PAP).
Tabla 3: Clon i n nzim im li n l iv i n lf limin i n de productos.
EnE. coli,los genes cysD y cysN codifican las dos subunidades de ATP sulfurilasa (EC: 2.7.7.4), cysC codifica APS cinasa (EC: 2.7.1.25) y cysQ codifica una PAP fosfatasa.
El grupo cysDNC se amplificó por PCR con ADN cromosómico MG1655 deE. coliusando los cebadores que se muestran en la tabla 3. El plásmido pRSFDuet-1 (Life Technologies) se digirió por las endonucleasas de restricción Ndel y Bglll. El grupo génico se insertó en el plásmido digerido usando la reacción de Gibson (New England Biolabs). La Figura 2 muestra el plásmido resultante. Para la expresión combinada de cysDNC y cysQ en un operón artificial, cysDNCQ, las dos partes se amplificaron mediante PCR con ADN cromosómico MG1655 deE. coliusando los cebadores que se muestran en la Tabla 3. De nuevo, las partes se insertaron en el plásmido digerido. La Figura 3 muestra los plásmidos resultantes. El plásmido que expresa SULT1A1 deHomo sapiens(SEQ ID NO: 2) del ejemplo 1 se cotransformó en células BL21(DE3)pLysS deE. coli(Life Technologies) con el plásmido que expresa cysDNC o cysDNCQ.
Las células se cultivaron como en el Ejemplo 1 y los sobrenadantes se analizaron para la formación del producto como en el ejemplo 1. La cepa que expresa SULT1A1 en combinación con cysDNCQ también se cultivó sin adición de IPTIG para inducción. La Tabla 4 muestra las concentraciones de pHCA y ácido zostérico.
Tabla 4: Concentraciones de pHCA y ácido zostérico en medios de cultivo conE. colique expresa una aril sulfotransferasa en combinación con c sDNC c sQ.
Esto muestra que una mayor cantidad de pHCA se transforma en ácido zostérico cuando aumenta la expresión de proteína de cysDNC. Aún se forma más ácido zostérico cuando la expresión de proteína cysQ aumenta adicionalmente.
Ejemplo 3 - Puede formarse un producto sulfatadoin vivomediante la coexpresión de una vía heteróloga y una aril sulfotransferasa
La producción de un producto sulfatado se puede lograr biológicamente mediante la expresión de aril sulfotransferasa como se muestra en el ejemplo 1. El sustrato para sulfatación también puede estar formado por un organismo biológico, y en este caso se mostrará para un organismo que expresa una vía heteróloga que conduce a un compuesto fenólico y que expresa una sulfotransferasa que actúa sobre el compuesto fenólico.
La enzima RmXAL deRhodotorula mucilaginosa/Rhodotorula rubra(SEQ ID NO: 20) tiene actividad tirosina amoníaco liasa, catalizando de este modo la desaminación no oxidativa del aminoácido tirosina, liberando ácido p-cumárico (pHCA) y amoníaco. Los codones del gen que codifica RmXAL se optimizaron usando algoritmos convencionales para la expresión enE. colidisponibles en GeneArt (Life Technologies) y se amplificaron por PCR usando los cebadores mostrados en la tabla 5 e insertados en el vector pCDFDuet-1 (Novagen/Life Technologies), que habían sido digeridos por las enzimas de restricción Ndel y Bglll, usando la reacción de Gibson (New England Biolabs). La Figura 4 proporciona una imagen del plásmido que expresa RmXAL.
Tabla 5: Ce oníacoliasa
El plásmido resultante se cotransformó en células BL21(DE3)pLysS deE. coli(Life Technologies) solas o junto con el plásmido que expresa SULT1A1 deHomo sapiens(ejemplo 1). Las cepas resultantes se cultivaron en medios M9 con glucosa como fuente de carbono, con IPTG 0,1 mM para la inducción de la expresión génica. Para análisis de formación del producto se tomaron muestras como se describió anteriormente (ejemplo 1). La Tabla 6 muestra las concentraciones resultantes de pHCA y ácido zostérico. RmXAL permitió la producción de pHCA sin adición de ningún sustrato, proporcionando de este modo una vía heteróloga desde el metabolismo normal de las células a un producto heterólogo. La expresión adicional de una aril sulfotransferasa, ejemplificada por SULT1A1 deHomo sapiens,permitió la conversiónin vivode pHCA a ácido zostérico. Por lo tanto, una aril sulfotransferasa puede actuar sobre un compuesto producidoin vivoy las células pueden liberar el producto sulfatado resultante al medio.
Tabla 6: Concentraciones de pHCA y ácido zostérico en medios de cultivo conE. colique expresa una aril sulfotransferasa en combinación con una tirosina amoníaco liasa.
Ejemplo 4 - Disminución de la toxicidad del producto sulfatado
Se cultivó MG1655 deE. colien medios mínimos M9 químicamente definidos con glucosa al 0,2 % como fuente de carbono sin adición adicional o con las adiciones de ácido p-cumárico (pHCA) 10 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM o 40 mM, o con 20 mM o 40 mM del éster de sulfato de pHCA (ácido zostérico). Todas las preparaciones de medios se habían ajustado a pH 7. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 250 rpm en un agitador orbital. Las tasas de crecimiento se examinaron siguiendo la densidad óptica a 600 nm. Las tasas de crecimiento resultantes en la fase de crecimiento exponencial se muestran en la Figura 5. Los cuadrados rellenos representan tasas de crecimiento en medios con pHCA. Los cuadrados abiertos representan tasas de crecimiento en medios con ácido zostérico. Y el círculo representa la tasa de crecimiento en los medios sin ninguna de estas adiciones. Es evidente que la presencia de pHCA es tóxica para las células, mientras que el éster sulfato, ácido zostérico es mucho menor.
Ejemplo 5 - Suministroin vivode precursor de producto sulfatado
El sustrato que es sujeto de sulfatación puede suministrarse al medio vacío de dichos precursores o puede ser proporcionado por microorganismos en el medio. En este caso se demuestra que el ácido p-cumárico que se sulfata para generar ácido zostérico, puede producirsein vivomediante la expresión de una tirosina amoníaco-liasa.
Los genes que codifican las tirosina amoníaco-liasas RcTAL (deRhodobacter capsulatus;SEQ ID NO: 48), RsTAL (deRhodobactersphaeroides;SEQ ID NO: 17) y FjTAL (deFlavobacterium johnsoniae;SEQ ID NO: 14) se clonaron en vectores de expresión como sigue. Los genes (SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente) se optimizaron paraE. coliy se sintetizaron mediante GeneArt, se amplificaron por PCR usando los oligonucleótidos que se muestran en la tabla a continuación, y se clonaron en pCDFDuet-1 (Novagen): El plásmido se digirió conNdelyBgllly se purificó en gel. Los genes se insertaron mediante ensamblaje isotérmico usando Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) y se transformaron en DH5a químicamente competente (cepa de laboratorio) o NEB5a (New England Biolabs), seleccionando la resistencia a espectinomicina 50 |jg ml-1 en medio LB. Los plásmidos resultantes pCBJ215 (RsTAL), pCBJ228 (FjTAL) y pCBJ297 (RcTAL) (Figuras 6 a 8, respectivamente) se cotransformaron mediante electroporación en la cepa de expresión deE. coliBL21(DE3) (Invitrogen/Life Technologies) junto con un plásmido a base de pETDuet-1 que expresa SULT1A1 de rata (Ejemplo 1). Los cultivos de transformación se sembraron en LB que contenía espectinomicina 50 jg ml-1 y ampicilina 100 jg ml-1. También se fabricó una cepa de control que portaba pCDFDuet-1.
Cebadores:
Las cepas que albergaban plásmidos recombinantes se precultivaron en medio líquido 2xYT con ampicilina 100 jg ml-1 y espectinomicina 50 jg ml-1 y se incubaron a 37 °C y 250 rpm durante la noche. Al día siguiente, cada cultivo previo se transfirió a 5 ml de medio mínimo M9 con glucosa al 0,2 %, tirosina 2 mM e IPTG 1 mM para la inducción de la expresión. Los cultivos se colocaron en una incubadora a 37 °C con agitación a 250 rpm durante la noche. Después, los sobrenadantes se recogieron por centrifugación dos veces y se aplicaron a análisis por HPLC como se describe en el ejemplo 1, y los títulos de ácido p-cumarico (pHCA) y ácido zostérico (ZA) se cuantificaron usando patrones químicos y se presentan en la tabla a continuación.
En este caso, es evidente que el ácido zostérico se forma cuando hay un suministro de ácido p-cumárico exógeno o si las células son capaces de producir ácido p-cumárico. En conclusión, puede formarse un producto sulfatado a partir de una molécula precursora no sulfatada, cuando esto se producein vivo.
Además, los datos muestran sorprendentemente que el empleo de la tirosina amoníaco-liasa deFlavobacterium johnsoniae(FjTAL; SEQ ID NO: 14) da como resultado un mayor suministro de molécula precursora no sulfatada (en este caso: ácido p-cumárico), que a su vez conduce a un mayor rendimiento de producto sulfatado (en este caso: ácido zostérico) en comparación con otras tirosina amoníaco-liasas.
Ejemplo 6 - Producción de productos sulfatados en otros hospedadores
Se ha demostrado que el ácido zostérico puede producirsein vivoenEscherichia colimediante la expresión de una aril sulfotransferasa. Para demostrar que la reacción es posible en otros microorganismos, en este caso se demuestra que la levaduraSaccharomyces cerevisiaetambién puede usarse como hospedador para la producción.
El gen que codifica la aril sulfotransferasa SULT1A (Ejemplo 1) se clonó después de un promotor TEF1 en un plásmido episómico con un origen de replicación de 2 micrómetros como sigue. El gen se amplificó por PCR usando los cebadores CBJP633 y CBJP634. Como alternativa, se optimizaron los codones del gen paraE. coliy el gen se sintetizó mediante GeneArt y se amplificó mediante los cebadores CBJP635 y CBJP636. El promotor TEF1 (Jensenetal.,2014,FEMS Yeast Res14: 238-248) se amplificó mediante PCR usando los cebadores PTEF1_dir y PTEF1_inv. El plásmido pCfB132 (Jensenet al.,citado anteriormente) se digirió por las enzimas de restricción AsiSI y Nt.Bsml. Los tres fragmentos - plásmido, promotor TEF1 y gen que codifica SULT1A1 - se ensamblaron usando un procedimiento de clonación por escisión de uracilo, dando como resultado los plásmidos pCBJ283 y pCBJ284 (Figuras 9 y 10, respectivamente, que posteriormente se transformó en la cepa CEN.PK102-5B deSaccharomyces cerevisiaeseleccionando para crecimiento en placas de medios sintéticos que carecen de uracilo. También se fabricó una cepa de control por transformación de pCfB132 en CEN.PK102-5B.
Cebadores:
Las cepas se cultivaron en medio Delft modificado (Jensenet al.,citado anteriormente) con histidina 20 mg/ml y leucina 60 mg/ml y ácido p-cumárico 10 mM durante la noche a 30 °C con aireación. El sobrenadante se aisló y examinó por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. La tabla a continuación muestra que el ácido zostérico (ZA) fue producido por la cepa que expresa SULT1A1 y no por la cepa de control que carece de una sulfotransferasa.
Es evidente que el ácido zostérico se forma solo cuando se expresa una sulfotransferasa en la levadura, y que el gen que lo codifica puede ser natural o codificado por un gen sintético con un codón específico de optimización. En conclusión, las reacciones de sulfatación se muestran catalizadas por sulfotransferasas enE. colitambién se catalizan cuando las sulfotransferasas se expresan en otros organismos, como se demuestra en este caso para la levadura S.cerevisiae.La eficacia de la producción puede verse afectada por medios tales como el uso de codón de los genes que codifican la sulfotransferasa. Por lo tanto las levaduras que expresan sulfotransferasas pueden ser capaces de desintoxicar compuestos aromáticos como ácido p-cumárico y formar productos sulfatados como ácido zostérico.
Ejemplo 7 - Una gama de compuestos son sustratos para la sulfataciónin vivo
Aquí se muestra que la expresión de una aril sulfotransferasa puede ser capaz de convertir varios sustratos. Algunos de estos son inhibidores que se pueden encontrar en el hidrolizado de biomasa utilizado como sustrato para crecimiento celular y producción en biotecnología. Los compuestos también incluyen algunos que son de interés biotecnológico como productos de un cultivo celular o son algunos cuyo éster sulfato es de interés económico.
Se examinaron diferentes sulfotransferasas para determinar sus especificidades de sustrato contra tres sustratos. Se probaron las sulfotransferasas mencionadas en el ejemplo 1, así como otras adicionales. Los genes que las codifican se clonaron como se describe en el ejemplo 1 usando los cebadores que se muestran en la tabla a continuación de las bibliotecas de ADNc de los organismos respectivos, excepto para el SULT1A1 de rata(Rattus norvegicus)con codones optimizados paraE. coli(descrito anteriormente). Los vectores resultantes se transformaron en BL21(DE3)pLysS.
Cebadores:
continuación
Las cepas resultantes se cultivaron en medio M9 que contenía pHCA 100 jM , resveratrol 95 jM o kaempferol 87 jM . Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37 °C, 300 rpm. Al día siguiente, los sobrenadantes se aislaron y se examinaron por HPLC como se describe en el ejemplo 1. BL21(DE3)pLysS se usaron como cepa de control y no convirtieron los sustratos.
La tabla muestra el porcentaje de conversión de los diferentes sustratos por las células que expresan las diferentes sulfotransferasas. Los resultados muestran que varias sulfotransferasas y, especialmente, la aril sulfotransferasa de rata(Rattus norvegicus),puede emplearse en la sulfatación de compuestos fenólicos.
Para probar aún más la gama de sustratos que se pueden sulfatar, se usaron cepas que portan plásmidos que expresan SULT1A1 de rata(Rattus norvegicus)y SULT1E1 de pollo(Gallus gallus domesticus)(Ejemplo 1) clonados en el vector de expresión pETDuet-1 y cysDNCQ deE. coliclonado en el vector de expresión pRSFDuet-1 (Ejemplo 2). Los plásmidos se introdujeron en la cepa de expresión BL21(DE3)pLysS deE. colicomo se describió anteriormente, seleccionando transformantes con antibióticos apropiados, en concreto, cloranfenicol 34 jg ml-1 para pLysS, ampicilina 100 jg-m l'1 para vectores basados en pETDuet-1 y kanamicina 100 jg-m l'1 para vectores basados en pRSFDuet-1. La tabla a continuación muestra la combinación de genes sobreexpresados en plásmidos. También se examinó una cepa de control sin un gen de sulfotransferasa o un operón cysDNCQ.
Las cepas se precultivaron en medio 2xYT con antibióticos apropiados. Se usaron 10 j l de estos precultivos para inocular medios M9 con IPTG 1 mM y ninguno o un único sustrato para la sulfatación. Después del crecimiento durante la noche a 37 °C, 300 rpm, los sobrenadantes se extrajeron y se examinaron por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. Los compuestos se detectaron por absorbancia UV. La tabla a continuación muestra el porcentaje de reducción de la concentración en las cepas que expresan sulfotransferasas solas o en combinación con genes cysDNCQ en comparación con la cepa de control.
continuación
En conclusión, una amplia gama de compuestos fenólicos son sustratos para sulfotransferasas. En los ejemplos mostrados, la conversión se ve reforzada por la sobreexpresión de genes cysDNCQ. Algunos de estos compuestos y sus ésteres de sulfato son de interés en biotecnología. Además, algunos de estos compuestos son inhibidores del crecimiento y la función celular y, por lo tanto, la conversión por sulfatación es de interés para su uso en sistemas biológicos.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado que comprende: poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico o un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa; en donde el compuesto fenólico está representado por la fórmula general (I):
    y el precursor de un compuesto fenólico es un compuesto de Fórmula general (pI):
    en donde al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 son un grupo hidroxilo (-OH); en donde R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR7, -0C0R7, -NR7R8, -COR7, -C0OR7, -SR7, -OSO3R7, -OCSR7, -POR7R8, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R6 es -COOR7 o p-hidroxifenilo, en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; o en donde R6 es p-hidroxifenilo y cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo; y en donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria o una levadura.
  2. 2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria.
  3. 3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera célula hospedadora recombinante es una levadura.
  4. 4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroBacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Geobacillus, Thermoanaerobacterium, Streptococcus, Pseudomonas, Streptomyces Escherichia, Shigella, Acinetobacter, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Kluyvera, Serratia, Cedecea, Morganella, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Proteus, or Yersinia; or wherein the first recombinant host cell is a yeast of the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosacharomyces, Zygosaccharomyces, H a n s e n u l a , Pachyosolen, Kluyveromyces, Debaryomyces, Yarrowia, Candida, Cryptococcus, Komagataella, Lipomyces, Rhodospiridium, Rhodotorula, o Trichosporon.
  5. 5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria del géneroEscherichia.
  6. 6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la primera célula hospedadora recombinante es una bacteria de la especieEscherichia coli.
  7. 7. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1A1.
  8. 8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, y tiene actividad aril sulfotransferasa.
  9. 9. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, y tiene actividad aril sulfotransferasa.
  10. 10. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde cada uno de R1, R3 y R5 es hidrógeno, cada uno de R2 y R4 es hidroxilo, y R6 es p-hidroxifenilo.
  11. 11. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde R4 es hidroxilo.
  12. 12. Proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde cada uno de R1, R2y R5 es hidrógeno.
  13. 13. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde R1 es hidrógeno; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C1-6 y alcoxi C1-6, con la condición de que al menos uno de R2, R3 y R4 sea hidroxilo (-OH); R5 es hidrógeno y R6 es COOH.
  14. 14. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde cada uno de R1, R2, R4 y R5 es hidrógeno, R3 es hidroxilo (-OH) y R6 es COOH.
  15. 15. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha primera célula hospedadora recombinante comprende además un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
  16. 16. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho medio se pone en contacto adicionalmente con una segunda célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoníaco liasa.
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