ES3015000T3

ES3015000T3 - Methods for upregulating immune responses using combinations of anti-rgmb and anti-pd-1 agents

Info

Publication number: ES3015000T3
Application number: ES15867409T
Authority: ES
Inventors: Gordon Freeman; Yanping Xiao
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2025-04-28
Anticipated expiration: 2035-12-07
Also published as: AU2015360903A1; WO2016094273A1; EP3229837A1; EP3229837B1; US11220545B2; AU2015360903B2; EP3229837A4; US20220033502A1; CA2968352A1; US12139535B2; US20180002422A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para regular positivamente las respuestas inmunes utilizando combinaciones de agentes anti-RGMb y anti-PD-1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para estimular la respuesta inmunitaria mediante combinaciones de agentes anti-RGMB y anti-PD-1 Antecedentes de la Invención

[0001] Puntos de control inmunitarios, como CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, 2B4, ICOS, HVEM, PD-L2, CD160, gp49B, PIR-B, receptores de la familia KIR, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3, BTLA, SIRPalpha (CD47), CD48, 2B4 (CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, butirofilinas, A2aR y muchos más, regulan negativamente la progresión de la respuesta inmunitaria basándose en interacciones complejas y combinatorias entre numerosas entradas. Diferentes puntos de control inmunitario actúan en contextos diferentes para suprimir las respuestas inmunitarias en trastornos diferentes, de modo que interferir con cualquier punto de control inmunitario específico puede no alterar significativamente una respuesta inmunitaria a un trastorno específico. Aunque se han logrado algunos avances en la determinación de las intervenciones a las que pueden dirigirse determinados nodos del sistema regulador de los puntos de control inmunitarios para mejorar el tratamiento de los trastornos para los que se desea una mayor respuesta inmunológica, en la actualidad no es posible identificar interacciones específicas que tengan una eficacia terapéutica anticancerosa significativa, por ejemplo sinérgica. En consecuencia, existe una gran necesidad en la técnica de definir combinaciones específicas de puntos de control inmunitarios útiles para tratar trastornos que se beneficiarían de un aumento de las respuestas inmunológicas.

0002] Y.Xiao et al., Molecular Immunology, vol. 48, n° 11,21. Abril de 2014, páginas 1292-959 (XP055234934) describe anticuerpos anti-RGMb y anti-PD-L2 con capacidades específicas para antagomizar la unión a sus objetivos.

[0003] Spencer C. Liang et al., European Journal of Immunology, vol. 33, n.° 10, páginas 2706-2716 (XP055466758) divulga anticuerpos monoclonales PD-1.

[0004] El documento WO2014/022759A1 divulga el anticuerpo monoclonal RGMb 307.9D1 y sugiere combinaciones de anti-PD-1 con anticuerpos RGMb para tratar el cáncer, incluido el cáncer colorrectal.

[0005] El documento US2010/055102 A1 describe combinaciones de anticuerpos PD-1 y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer.

[0006] El documento US2010/151492A1 divulga anticuerpos bloqueadores de PD-L1 para el tratamiento del cáncer.

[0007] Dahan Rony et al., Cancer Cell, Cell Press, US, vol. 28, no. 3, 14. September 2015, pages 282-295 (XP029268952) describen las diferencias entre la unión al FcR de los isotipos de IgG entre especies y su actividad antitumoral. Se ha descubierto que los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 son FcgammaRindependientes in vivo, a menos que tengan una capacidad de unión a FcgammaR que compense su actividad antitumoral.

[0008] Song Elizabeth et al., Journal of Leukocyte Biology, vol. 48, n° 6, 1 de diciembre de 1990, páginas 524-530 (XO055939697) describen las preferencias de unión a FCgammaR de los isotipos IgG de ratón, humano y rata. La ADCC mediada por IgG2a de rata fue fuerte utilizando células NK de rata pero muy débil utilizando células NK humanas.

[0009] Ninguno de los documentos del estado de la técnica mencionados anteriormente divulga ni sugiere la invención actual.

Resumen de la Invención

[0010] La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la inhibición selectiva o el bloqueo de la expresión o actividad de RGMb yPD-1 es útil para aumentar la respuesta inmunitaria y tratar así afecciones que se beneficiarían de la regulación de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, infecciones y cánceres, como el cáncer colorrectal). La presente invención se define mediante las reclamaciones adjuntas. Otros aspectos y formas de realización fuera del alcance de las reclamaciones tienen únicamente fines ilustrativos. En un aspecto, la invención se dirige a una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de agentes para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal mediante el aumento de una respuesta inmune de las células inmunes en un sujeto, que comprende un primer agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 y bloquea la interacción entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, y un segundo agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a RGMb y bloquea la interacción entre RGMb y PD-L2 y entre RGMb y una BMP.

[0011] En otro aspecto, la invención se dirige a un kit que comprende un primer agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 y bloquea la interacción entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PDL2, y un segundo agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a RGMb y bloquea la interacción entre RGMb y PD-L2 y entre RGMb y un BMP, e instrucciones para el uso de los agentes primero y segundo en el tratamiento del cáncer colorrectal en el sujeto.

[0012] En el presente documento se describen numerosas realizaciones que pueden aplicarse a cualquier aspecto de la presente invención o realización de la misma. Por ejemplo, los aspectos descritos a continuación y que no forman parte necesariamente de la invención reivindicada es que, en una realización, el al menos un agente es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, o fragmento de unión a antígeno del mismo, selectivo tanto para RGMb como para PD-1. En otra realización, el al menos un agente es una combinación de agentes que comprende un primer agente que inhibe selectivamente o bloquea la expresión o actividad de RGMb y un segundo agente que inhibe selectivamente o bloquea la expresión o actividad de PD-1. En otra realización adicional, el primer agente es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína RGMb, y en el que dicho segundo agente es un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína PD-1. En otra realización más, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es murino, quimérico, humanizado, compuesto o humano. En otra realización, el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, está marcado detectablemente, comprende un dominio efector, comprende un dominio Fc, y/o se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, y diacuerpos. En otra realización adicional, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente biológico, una toxina o un isótopo radiactivo). En otra realización más, el al menos un agente se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo bloqueante que se une a RGMb, una forma no activante de RGMb, una forma soluble de RGMb, una forma soluble de un socio de unión natural de RGMb, una proteína de fusión de RGMb, una molécula de ácido nucleico que bloquea la transcripción o traducción de RGMb, un antagonista de RGMb de molécula pequeña, un anticuerpo bloqueante que reconoce PD-1, una forma no activante de PD-1, una forma soluble de PD-1, una forma soluble de un socio de unión natural de PD-1, una proteína de fusión de PD-1, una molécula de ácido nucleico que bloquea la transcripción o traducción de PD-1 y un antagonista de PD-1 de molécula pequeña. En otra realización, el anticuerpo bloqueante que se une a RGMb se selecciona del grupo que consiste en 1) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre un BMP y RGMb sin bloquear la interacción entre PD-L2 y RGMb, 2) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre NEO1 y RGMb sin bloquear la interacción entre PD-L2 y RGMb, 3) anticuerpos anti-RGMb que bloquean tanto la interacción BMP/RGMb como la interacción NEO1/RGMb y sin bloquear la interacción entre PD-L2 y RGMb, 4) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre un BMP y RGMb y bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb, 5) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre NEO1 y RGMb y bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb, y 6) anticuerpos anti-RGMb que bloquean tanto la interacción BMP/RGMb como la interacción NEO1/RGMb y además bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb. En otra realización adicional, el anticuerpo bloqueante que se une a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-PD-1 que bloquean la interacción entre PD-1 y PD-L1 sin bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L2; anticuerpos anti-PD-1 que bloquean la interacción entre PD-1 y PDL2 sin bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L1; y anticuerpos anti-PD-1 que bloquean tanto la interacción entre PD-1 y PD-L1 como la interacción entre PD-L1 y PD-L2.

[0013] En otra realización, la condición es un cáncer, como el cáncer colorrectal. En otra realización adicional, el sujeto es un mamífero, como un modelo animal de la enfermedad o un ser humano.

[0014] En otro aspecto, se proporciona un kit para tratar a un sujeto que tiene una condición que se beneficiaría de la regulación ascendente de una respuesta inmunitaria que comprende al menos un agente que inhibe o bloquea selectivamente la expresión o actividad tanto deRGMb como dePD-1 .

[0015] En una realización, el al menos un agente es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, selectivo tanto para RGMb como para PD-1. En otra realización, el al menos un agente es una combinación de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína RGMb, y un segundo anticuerpo del agente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína PD-1. En otra realización adicional, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es murino, quimérico, humanizado, compuesto o humano. En otra realización más, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, está marcado detectablemente, comprende un dominio efector, comprende un dominio Fc, y/o se selecciona del grupo que consiste en Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, rIgG, sdAb, sdFv, y fragmentos de diabodies. En otra realización, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se conjuga con un agente citotóxico. En otra realización adicional, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente biológico, una toxina y un isótopo radiactivo. En otra realización más, el anticuerpo que se une a RGMb se selecciona del grupo que consiste en 1) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre aBMPy RGMb sin bloquear la interacción entrePD-L2 y RGMb, 2) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre NEO1 y RGMb sin bloquear la interacción entre PD-L2 y RGMb, 3) anticuerpos anti-RGMb que bloquean tanto la interacción BMP/RGMb como la interacción NEO1/RGMb y sin bloquear la interacción entre PD-L2 y RGMb, 4) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre BMP y RGMb y bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb, 5) anticuerpos anti-RGMb que bloquean la interacción entre NEO1 y RGMb y bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb, y 6) anticuerpos anti-RGMb que bloquean tanto la interacción BMP/RGMb como la interacción NEO1/RGMb y además bloquean la interacción entre PD-L2 y RGMb. En otra realización, el anticuerpo bloqueante que se une a PD-1 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-PD-1 que bloquean la interacción entre PD-1 y PD-L1 sin bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L2; anticuerpos anti-PD-1 que bloquean la interacción entre PD-1 y PDL2 sin bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L1; y anticuerpos anti-PD-1 que bloquean tanto la interacción entre PD-1 y PD-L1 como la interacción entre PD-L1 y PD-L2.

[0016] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Breve descripción de los dibujos

[0017]

La Figura 1 incluye 7 paneles, identificados como paneles A, B, C, D, E, F y G, que muestran la eficacia antitumoral del bloqueo único y combinado de RGMb y PD-1. El panel A muestra el protocolo experimental utilizado para estudiar el modelo de ratón singénico CT26. Los ratones BALB/c fueron inyectados con la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 por vía subcutánea en la pata izquierda el día 0. Los ratones fueron tratados con los anticuerpos monoclonales (mAb) indicados los días 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23. Los paneles B-F muestran las eficacias antitumorales de los mAbs RGMb y PD-1, solos y en combinación, como indica el volumen tumoral (paneles B-E) y la supervivencia (panel F). El panel G muestra los resultados del análisis de supervivencia con datos agrupados de 3 experimentos, n = 19 (control mAb); n = 35 (PD-1 mAb); n = 34 (PD-1+RMGb mAb); p = 0,03 (PD-1 mAb frente a PD-1 RMGb mAs); y el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon.

La Figura 2 incluye 2 paneles, identificados como paneles A y B, que muestran la memoria inmunitaria antitumoral en supervivientes a largo plazo. Se implantaron células tumorales CT26 en ratones y se trataron como en la Figura 1. Los supervivientes a largo plazo fueron desafiados el día 60 con células TCE26. Todos los ratones sobrevivieron y fueron desafiados de nuevo el día 130 con células TCE26 o con RENCA. Los ratones que sobrevivieron a esta nueva provocación fueron desafiados el día 175 con células 4T1, como indican las flechas. Los 7 de 20 ratones que sobrevivieron al tratamiento con el mAbPD-1 fueron desafiados con el tumor como se indica (panel A). Los 10 de 20 ratones que sobrevivieron al tratamiento con PD-1 mAb más RGMb mAb fueron desafiados con tumor como se indica (panel B).

La Figura 3 incluye 2 paneles, identificados como paneles A y B, que muestran la expresión de RGMb, PD-L2, PD-1 y PD-L1 en las células inmunitarias infiltrantes del tumor CT26. El panel A muestra el protocolo experimental utilizado en las Figuras 3 y 5. Los ratones BALB/c fueron inyectados s.c. con células CT26 en la pata izquierda el día 0. Los ratones fueron tratados con los mAbs indicados en los días 2, 5, 8, 11 y 14. El día 17, se aislaron las células de los tumores CT26 y se analizaron mediante citometría de flujo. El panel B muestra los resultados de los análisis FACS de ratones tratados con control de isotipo. Se determinó la expresión de RGMb, PD-L2, PD-1 y PD-L1 en macrófagos infiltrantes tumorales (CD45+F4/80+), células dendríticas (CD45+CD11c+) y células T CD8+ (CD45+CD3+CD8+). Se muestra un ratón representativo (n = 5).

La Figura 4 incluye 2 paneles, identificados como paneles A y B, que muestran la expresión de la superficie celular de RGMb, PD-L2, PD-1 y PD-L1 en células CT26 in vitro e in vivo. El panel A muestra los resultados de la línea celular CT26 in vitro analizada por FACS para la expresión de las proteínas indicadas.El panel B muestra los resultados de la línea celular CT26 in vivo (células CD45- del tumor tratado con control de isotipo el día 17) analizada por FACS para la expresión de las proteínas indicadas.

La Figura 5 incluye 8 paneles, identificados como paneles A, B, C, D, E, F, G y H, muestran la expresión de PD-L2 e IL-4 en ratones CT26 tratados conPD-1 oPD-1 más mAbs RGMb. Células de ratones tratados como se describe en el panel A de la figura 3. El panel A muestra histogramas representativos de la expresión de PD-L2 en macrófagos infiltrantes de tumores (CD45+F4/80+) tras los tratamientos indicados. El panel B muestra una representación gráfica de los datos del panel A. IFM: intensidad media de la fluorescencia; AIFM= IFM de la tinción diana menos IFM de la tinción de control del isotipo. Los paneles C-E muestran la expresión de ARNm de IL-4, IL-13 e IL-12 en células totales aisladas del tumor CT26 con los tratamientos de anticuerpos indicados. Para los paneles B-E, se indica la media de cada grupo; n=5; *, p <0,05; y prueba no paramétrica de Kruskai-Wallis para comparaciones múltiples. Los paneles F-H muestran una correlación entre el tamaño del tumor y la expresión de ARNm de IL-4 en células aisladas del tumor CT26 el día 17 tras los tratamientos con los anticuerpos indicados mediante un análisis de regresión lineal (n = 5).

La Figura 6 incluye 2 paneles, identificados como panelesAyB, que muestran que la expresión de PD-1 en células T CD8+ infiltrantes de tumores disminuye tras el tratamiento con mAb PD-1. El panel A muestra la expresión de PD-1 en células CD45+ CD3+ CD8+ infiltrantes de tumores de ratones tras el tratamiento indicado se analizó por citometría de flujo con PD-1 mAb clon RPMI-30 el día 17 como en la Figura 3. El mAb de tratamiento PD-1 fue el clon 29F.1A12. El mAb PD-1 de tratamiento fue el clon 29F.1A12. El panel B muestra los resultados del bloqueo por el mAb de PD-1 clon 29F.1A12 de la unión a PD-1 del mAb de PD-1 clon RPM1-30 conjugado con PE. Se preincubaron 300 células transfectadas con PD-1 con las concentraciones indicadas de PD-1 mAb clon 29F.1A12, PD-1 mAb clon 332.5E12, o control de isotipo, luego se tiñeron con PE conjugado con PD-1 mAb clon RPM1-30 y se analizaron por citometría de flujo. También se muestra la tinción con el control del isotipo (IgG-PE).

Descripción detallada de la Invención

[0018] Las proteínas de punto de control inmunitario se reconocen cada vez más como inmunomoduladores importantes cuya expresión y/o actividad inhibe las respuestas inmunitarias deseadas. Sin embargo, diferentes puntos de control inmunitario actúan en contextos diferentes para suprimir las respuestas inmunitarias en trastornos diferentes, de modo que interferir con cualquier punto de control inmunitario específico puede no alterar significativamente una respuesta inmunitaria a un trastorno específico. Por ejemplo, el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en el mundo occidental y es el tercer cáncer más común diagnosticado en los Estados Unidos.El CCR humano parece responder mal al bloqueo con anticuerpos de la muerte programada-1 (PD-1) o del ligando PD-1 1 (PD-L1) en los ensayos clínicos.

[0019] La molécula de guía repulsiva b (RGMb) es un receptor del ligando 2 de PD-1 (PD-L2) (Xiao et al. (2014) J. Exp. Med. 211:943-959). RGMb, también conocido como DRAGON, se identificó originalmente en el sistema nervioso (Severyn et al. (2009) Biochem. J. 422:393-403). Es miembro de la familia RGM, formada por RGMa, RGMb y RGMc/hemojuvelina (Severyn et al. (2009) Biochem. J. 422:393-403). Las RGM son proteínas de membrana ancladas al glicosilfosfatidilinositol (gpi) que se unen a las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y a la neogenina (Conrad et al. (2010) Mol. Cell. Neurosci. 43:222-231). El bloqueo con anticuerpos de la interacción RGMb-PD-L2 perjudicó notablemente el desarrollo de la tolerancia respiratoria (Xiao et al. (2014) J. Exp. Med. 211:943-959). El bloqueo de RGMb también podría romper la tolerancia inmunitaria en el microenvío tumoral. Como se describe en el presente documento, se investigó si combinaciones específicas de puntos de control inmunitarios son activas en la regulación del CCR y si la inhibición o el bloqueo combinatorios de dichos puntos de control inmunitarios podrían aumentar las respuestas inmunitarias, como las respuestas inmunitarias contra el CCR, para tratar así el CCR. Por ejemplo, se determinó el efecto inmunoterapéutico del bloqueo por anticuerpos de RGMb en el modelo de CCR CT26 de ratón singénico. El bloqueo único de RGMb no mostró ningún efecto sobre la supervivencia. Sin embargo, el bloqueo combinado con anticuerpos de RGMb y PD-1 aumentó la supervivencia, en comparación con el bloqueo de PD-1 solo (44% frente a 26% de supervivencia a largo plazo). Los sobrevivientes estaban libres de tumores y seguían estándolo tras una nueva provocación tumoral, lo que indica el desarrollo de memoria inmunológica. Los sobrevivientes a largo plazo (>6 meses) no mostraron efectos adversos. Se detectó la expresión de RGMb en la superficie celular de los macrófagos infiltrantes de tumores y las células dendríticas. La expresión de PD-L2 aumentó en los macrófagos infiltrantes de tumores tras el tratamiento con PD-1 mAb y se asoció con un mayor nivel de ARNm de IL-4, que se correlaciona con un menor volumen tumoral. Los resultados aquí descritos indican la inmunoterapia de combinación de puntos de control para el CCR y otros tipos de cáncer, especialmente cuando el bloqueo de PD-1 tiene cierta eficacia y/o puede ser insuficiente.

I. Definiciones

[0020] Los artículos “un” y “uno” se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

[0021] La "cantidad" de un marcador, por ejemplo, expresión o número de copias de un marcador, o nivel de proteína de un marcador, en un sujeto es "significativamente" mayor o menor que la cantidad normal de un marcador, si la cantidad del marcador es mayor o menor, respectivamente, que el nivel normal en una cantidad mayor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar la cantidad, y preferiblemente al menos dos veces, y más preferiblemente tres, cuatro, cinco, diez o más veces esa cantidad.Alternativamente, la cantidad del marcador en el sujeto puede considerarse "significativamente" mayor o menor que la cantidad normal si la cantidad es al menos unas dos, y preferiblemente al menos unas tres, cuatro o cinco veces, mayor o menor, respectivamente, que la cantidad normal del marcador.

[0022] El término "nivel alterado de expresión" de un marcador se refiere a un nivel de expresión o número de copias de un marcador en una muestra de prueba, por ejemplo, una muestra derivada de un sujeto que padece cáncer, que es mayor o menor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión o el número de copias, y es preferiblemente al menos dos veces, y más preferiblemente tres, cuatro, cinco o diez o más veces el nivel de expresión o número de copias del marcador o región cromosómica en una muestra de control (por ejemplo, muestra de un sujeto sano que no padezca la enfermedad asociada) y, preferiblemente, el nivel de expresión o número de copias medio del marcador o región cromosómica en varias muestras de control. El nivel alterado de expresión es mayor o menor que el error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión o el número de copias, y es preferiblemente al menos dos veces, y más preferiblemente tres, cuatro, cinco o diez o más veces el nivel de expresión o el número de copias del marcador en una muestra de control (por ejemplo, muestra de un sujeto sano que no tiene la enfermedad asociada) y preferiblemente, el nivel medio de expresión o el número de copias del marcador en varias muestras de control.

[0023] El término "actividad alterada" de un marcador se refiere a una actividad de un marcador que está aumentada 0 disminuida en un estado de enfermedad, por ejemplo, en una muestra de cáncer, en comparación con la actividad del marcador en una muestra normal, de control. La actividad alterada de un marcador puede ser el resultado de, por ejemplo, una expresión alterada del marcador, un nivel proteico alterado del marcador, una estructura alterada del marcador o, por ejemplo, una interacción alterada con otras proteínas implicadas en la misma vía o en una vía diferente a la del marcador, o una interacción alterada con activadores o inhibidores transcripcionales.

[0024] A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" abarcan ampliamente las formas de anticuerpos que se producen de forma natural (por ejemplo. IgG, IgA, IgM, IgE) y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos, así como fragmentos y derivados de todos los anteriores, cuyos fragmentos y derivados tienen al menos un sitio de unión antigénica.

[0025] El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, también incluye una "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"). El término "porción de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que mantienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, polipéptido RGMb o fragmento del mismo y/o polipéptido PD-1 o fragmento del mismo). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser desempeñada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa.Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región aislada determinante de la complementariedad (CDR). Los mAbs bivalentes también pueden constar de 2 dominios IgV de 1 especificidad y un IgV de la segunda especificidad, de modo que el anticuerpo es bivalente (por ejemplo, se une a 2 cosas pero puede tener 2 copias de una de las especificidades de unión). Estos anticuerpos pueden fabricarse colocando dos IgV en paralelo en un lado del anticuerpo. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite fabricarlos como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar polipéptidos monovalentes (conocidos como Fv de cadena única (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Osbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778). Dichos anticuerpos de cadena simple también se incluyen en el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Cualquiera de las secuencias VH y VL de scFv específicos puede unirse al ADNc o a secuencias genómicas de la región constante de la inmunoglobulina humana, con el fin de generar vectores de expresión que codifiquen polipéptidos IgG completos u otros isotipos. El VH y el VL también pueden utilizarse en la generación de Fab, Fv u otros fragmentos de inmunoglobulinas utilizando la química de proteínas o la tecnología del ADN recombinante. También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena simple, como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, obligando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

[0026] Aún más, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede formar parte de polipéptidos de inmunoadhesión más grandes, formados por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Ejemplos de tales polipéptidos de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer un polipéptido scFv tetramérico (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para fabricar polipéptidos scFv bivalentes y biotinilados (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, los anticuerpos, las porciones de anticuerpos y los polipéptidos de inmunoadhesión pueden obtenerse mediante técnicas estándar de ADN recombinante, como se describe en el presente documento. Como se describe más adelante, el término "anticuerpo" incluye formas de inmunoglobulinas modificadas genéticamente o de otro modo, como intracuerpos, péptidos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos bispecifcos, dianticuerpos, trianticuerpos, tetranticuerpos, di-scFv en paralelo, tri-scFv en paralelo). El término fragmento de anticuerpo funcional también incluye fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, incluidos, entre otros, fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos variables de cadena única (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanobody y similares).

[0027] Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogénicos, alogénicos o singénicos; o formas modificadas de los mismos (por ejemplo, humanizados, quiméricos, etc.). Los anticuerpos también pueden ser totalmente humanos. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se unen de forma específica o sustancialmente específica a los polipéptidos RGMb y/o PD-1 o fragmentos de los mismos. También pueden ser selectivos para dichos antígenos, de modo que pueden distinguirlos de antígenos estrechamente relacionados, como otros miembros de la familia B7. Los términos "anticuerpos monoclonales" y "composición de anticuerpos monoclonales", tal como se utilizan aquí, se refieren a una población de polipéptidos de anticuerpos que contienen sólo una especie de sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular de un antígeno, mientras que el término "anticuerpos policlonales" y "composición de anticuerpos policlonales" se refieren a una población de polipéptidos de anticuerpos que contienen múltiples especies de sitios de unión a antígeno capaces de interactuar con un antígeno particular. Una composición de anticuerpos monoclonales suele mostrar una única afinidad de unión para un antígeno concreto con el que inmunorreacciona.

[0028] Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce al menos una actividad biológica del antígeno o antígenos a los que se une. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RGMb o anti-PD-1 se une a RGMb o PD-1, respectivamente, e inhibe la capacidad de RGMb de, por ejemplo, unirse a PD-L2, e inhibe la capacidad de PD-1 de, por ejemplo, unirse aPD-L1,PD-L2, o tanto a PD-L1 como a PD-L2. En ciertas realizaciones, los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas o fragmentos de los mismos descritos en el presente documento inhiben sustancial o completamente una actividad biológica determinada del antígeno o antígenos.

[0029] El término "fluido corporal" se refiere a fluidos que son excretados o secretados por el cuerpo, así como a fluidos que normalmente no lo son (por ej. líquido amniótico, humor acuoso, bilis, sangre y plasma sanguíneo, líquido cefalorraquídeo, cerumen y cerilla, líquido de cowper o líquido preeyaculatorio, quilo, quimo, heces, eyaculado femenino, líquido intersticial, líquido intracelular, linfa, menstruación, leche materna, moco, líquido pleural, líquido peritoneal, pus, saliva, sebo, semen, suero, sudor, líquido sinovial, lágrimas, orina, lubricación vaginal, humor vítreo, vómito).

[0030] El término "anticuerpo biespecífico" o "anticuerpo multiespecífico" se refiere a un anticuerpo que reconoce más de un epítopo. Dichos anticuerpos son útiles para dirigirse a diferentes proteínas utilizando el mismo agente. Los métodos para fabricar dichos anticuerpos son bien conocidos en el arte (véase, al menos, la patente estadounidense 5.798.229; la patente estadounidense 5.989.830; y Holliger et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1126-1136).

[0031] Los términos "cáncer" o "tumor" o "trastorno hiperproliferativo" se refieren a la presencia de células que poseen características típicas de las células cancerígenas, como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, rápida tasa de crecimiento y proliferación, y ciertos rasgos morfológicos característicos. Las células cancerosas suelen presentarse en forma de tumor, pero dichas células pueden existir solas dentro de un animal, o puede tratarse de una célula cancerosa no tumorigénica, como una célula leucémica. Los cánceres incluyen, entre otros, el cáncer de células B, como, por ejemplo, el mieloma múltiple, la macroglobulinemia de Waldenstrom, las enfermedades de cadena pesada, como, por ejemplo, la enfermedad de cadena alfa, la enfermedad de cadena gamma y la enfermedad de cadena mu, la gammapatía monoclonal benigna y la amiloidosis inmunocítica, los melanomas, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer de bronquios, el cáncer colorrectal, el cáncer de próstata, el cáncer de páncreas, el cáncer de estómago, el cáncer de ovario y el cáncer de vejiga urinaria, cáncer de cerebro o de sistema nervioso central, cáncer de sistema nervioso periférico, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero o de endometrio, cáncer de cavidad oral o de faringe, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de testículo, cáncer de vías biliares, cáncer de intestino delgado o de apéndice, cáncer de glándula salival, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula suprarrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, cáncer de tejidos hematológicos y similares. Otros ejemplos no limitantes de tipos de cáncer aplicables a los métodos abarcados por la presente invención incluyen sarcomas y carcinomas humanos, p. ej, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, cáncer de hígado, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer óseo, tumor cerebral, cáncer testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma de células pequeñas de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, p. ej. g., leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia); leucemia crónica (leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de cadenas pesadas. En algunas realizaciones, los cánceres son de naturaleza epitelial e incluyen, entre otros, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon, cánceres ginecológicos, cáncer renal, cáncer de laringe, cáncer de pulmón, cáncer oral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de piel. En otras realizaciones, el cáncer es de mama, próstata, pulmón o colon. En otras realizaciones, el cáncer epitelial es un cáncer de pulmón no microcítico, un carcinoma de células renales no papilar, un carcinoma cervical, un carcinoma ovárico (por ejemplo, un carcinoma ovárico seroso) o un carcinoma de mama. Los cánceres epiteliales pueden caracterizarse de varias otras formas, entre otras, seroso, endometrioide, mucinoso, de células claras, de Brenner o indiferenciado.

[0032] El término "control" se refiere a cualquier estándar de referencia adecuado para proporcionar una comparación con los productos de expresión de la muestra de ensayo. En una realización, el control comprende la obtención de una "muestra de control" a partir de la cual se detectan los niveles de producto de expresión y se comparan con los niveles de producto de expresión de la muestra problema. Dicha muestra de control puede comprender cualquier muestra adecuada, incluyendo pero sin limitarse a una muestra de un paciente con cáncer de control (puede ser una muestra almacenada o una medición de muestra previa) con un resultado conocido; tejido o células normales aisladas de un sujeto, como un paciente normal o el paciente con cáncer, células/tejidos primarios cultivados aislados de un sujeto como un sujeto normal o el paciente con cáncer, células/tejidos normales adyacentes obtenidos del mismo órgano o localización corporal del paciente con cáncer, una muestra de tejido o célula aislada de un sujeto normal, o células/tejidos primarios obtenidos de un depósito. En otra realización preferida, el control puede comprender un nivel de producto de expresión estándar de referencia de cualquier fuente adecuada, incluyendo pero sin limitarse a genes de mantenimiento de la casa, un rango de nivel de producto de expresión de tejido normal (u otra muestra de control previamente analizada), un rango de nivel de producto de expresión previamente determinado dentro de una muestra de prueba de un grupo de pacientes, o un conjunto de pacientes con un resultado determinado (por ejemplo, supervivencia durante uno, dos, tres, cuatro años, etc.) o que reciben un tratamiento determinado (por ejemplo, terapia oncológica estándar). Los expertos en la materia entenderán que dichas muestras de control y niveles de producto de expresión estándar de referencia pueden utilizarse en combinación como controles en los métodos de la presente invención. En una realización, el control puede comprender una muestra de células/tejidos normales o no cancerosos. En otra realización preferida, el control puede comprender un nivel de expresión para un conjunto de pacientes, como un conjunto de pacientes con cáncer, o para un conjunto de pacientes con cáncer que reciben un determinado tratamiento, o para un conjunto de pacientes con un resultado frente a otro resultado. En el primer caso, el nivel del producto de expresión específico de cada paciente puede asignarse a un nivel percentil de expresión, o expresarse como superior o inferior a la media o promedio del nivel de expresión estándar de referencia. En otra realización preferida, el control puede comprender células normales, células de pacientes tratados con quimioterapia combinada y células de pacientes con cáncer benigno. En otra realización, el control también puede comprender un valor medido, por ejemplo, el nivel medio de expresión de un gen particular en una población comparado con el nivel de expresión de un gen de mantenimiento de la casa en la misma población. Dicha población puede estar formada por sujetos normales, pacientes con cáncer que no han recibido ningún tratamiento (es decir, que no han recibido ningún tratamiento), pacientes con cáncer que reciben el tratamiento estándar o pacientes con cáncer benigno. En otra realización preferida, el control comprende una transformación de la relación de los niveles de los productos de expresión, que incluye pero no se limita a determinar una relación de los niveles de los productos de expresión de dos genes en la muestra de ensayo y compararla con cualquier relación adecuada de los mismos dos genes en un estándar de referencia; determinar los niveles de los productos de expresión de los dos o más genes en la muestra de ensayo y determinar una diferencia en los niveles de los productos de expresión en cualquier control adecuado; y determinar los niveles de los productos de expresión de los dos o más genes en la muestra de ensayo, normalizando su expresión con la expresión de los genes de mantenimiento de la casa en la muestra de ensayo, y comparando con cualquier control adecuado. En realizaciones particularmente preferidas, el control comprende una muestra de control que es del mismo linaje y/o tipo que la muestra problema. En otra realización, el control puede comprender niveles de productos de expresión agrupados como percentiles dentro de o basados en un conjunto de muestras de pacientes, como todos los pacientes con cáncer. En una realización, se establece un nivel de producto de expresión de control en el que los niveles más altos o más bajos de producto de expresión relativos a, por ejemplo, un percentil particular, se utilizan como base para predecir el resultado. En otra realización preferida, se establece un nivel de producto de expresión de control utilizando niveles de producto de expresión de pacientes de control de cáncer con un resultado conocido, y los niveles de producto de expresión de la muestra problema se comparan con el nivel de producto de expresión de control como base para predecir el resultado. Como demuestran los datos que figuran a continuación, los métodos de la invención no se limitan al uso de un punto de corte específico para comparar el nivel de expresión del producto en la muestra de ensayo con el control.

[0033] El término "cáncer colorrectal", tal como se utiliza en el presente documento, incluye el cáncer de las células del tracto intestinal por debajo del intestino delgado (por ejemplo, el intestino grueso (colon), incluidos el ciego, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide y el recto). Además, tal como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer colorrectal" también incluye el cáncer de las células del duodeno y del intestino delgado (yeyuno e íleon). El cáncer colorrectal también incluye las enfermedades neoplásicas que implican la proliferación de un único clon de células del colon e incluye el adenocarcinoma y el carcinoma de colon, ya sea en un sitio primario o metastásico.

[0034] El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más diagnosticado y ocupa el segundo lugar en mortalidad por cáncer. Un extenso análisis genético y genómico del CCR humano ha descubierto mutaciones de la línea germinal y somáticas relevantes para la biología del CCR y la transformación maligna (Fearon et al. (1990) Cell 61, 759-767). Estas mutaciones se han vinculado a estadios bien definidos de la enfermedad, desde la proliferación aberrante de criptas o las lesiones hiperplásicas hasta los adenomas benignos, el carcinoma in situ y, por último, la enfermedad invasiva y metastásica, estableciendo así un paradigma genético para el inicio y la progresión del cáncer. La inestabilidad genética y genómica son catalizadores de la carcinogénesis de colon (Lengauer et al. (1998) Nature 396:643-649). El CCR puede presentar dos perfiles genómicos distintos que se han denominado (i) neoplasia de inestabilidad cromosómica (NIC), caracterizada por aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas rampantes impulsadas en parte por la disfunción de los telómeros (Artandi et al. (2000) Nature 406:641-645; Fodde et al. (2001) Nat. Rev. Cancer 1:55-67; Maser y DePinho (2002) Science 297:565-569; Rudolph et al. (2001) Nat. Genet. 28:155-159) y aberraciones mitóticas (Lengauer et al. (1998) Nature 396:643-649) y (ii) neoplasia por inestabilidad de microsatélites (MIN), caracterizada por cariotipos casi diploides con alteraciones a nivel de nucleótidos debidas a mutaciones en genes de reparación de emparejamientos erróneos (MMR) (Fishel et al. (1993) Cell 75:1027-1038; Ilyas et al.(1999)Eur. J. Cancer 35:335-351; Modrich (1991)Annu. Rev. Genet. 25:229-253;Parsons et al. (1995) Science 268:738-740; Parsons et al. (1993) Cell 75:1227-1236). Las mutaciones MMR en la línea germinal son lesiones altamente penetrantes que impulsan el fenotipo MIN en los cánceres colorrectales hereditarios no polipósicos, y representan el 1-5% de los casos de CCR (de la Chapelle (2004) Nat. Rev. Cancer 4:7-7; Lynch y de la Chapelle (1999) J. Med. Rev. Cancer 4:769-780; Lynch y de la Chapelle (1999) J. Med. Genet. 36:801-818; Umar et al. (2004) Nat. Rev. Cancer 4:153-158). Aunque CIN y MIN son mecánicamente distintas, sus consecuencias genómicas y genéticas enfatizan el requisito de mecanismos mutadores dominantes para conducir a las células epiteliales intestinales hacia un umbral de cambios oncogénicos necesarios para la transformación maligna.

[0035] Se ha identificado y validado funcionalmente un número creciente de mutaciones genéticas en la patogénesis del CCR. Las alteraciones somáticas están presentes en el CCA en más del 70% de los casos esporádicos no familiares y parecen contribuir a la inestabilidad genómica e inducir la expresión de c-myc y ciclina D1 (Fodde et al. (2001) Nat. Rev. Cancer 1:55-67). Rev. Cancer 1:55-67), mientras que las mutaciones activadoras de p-catenina representan un medio alternativo de desregulación de la vía WNT en el CCR (Morin (1997) Science 275:1787-1790). Las mutaciones de K-Ras se producen al principio de la progresión neoplásica y están presentes en aproximadamente el 50% de los adenomas de gran tamaño (Fearon y Gruber (2001) Molecular abnormalities in colon and rectal cancer, ed., ed., 1997). J. Mendelsohm, P.H., M. Israel y L. Liotta, W.B. Saunders, Filadelfia). La serina/treonina cinasa BRAF y la lípido cinasa PIK3CA están mutadas en el 5-18% y el 28% de los CCR esporádicos, respectivamente (Samuels et al. (2004) Science 304:554; Davies et al. (2002) Nature 417:949-954; Rajagopalan et al. (2002) Nature 418:934; Yuen et al. (2002) Cancer Res. 62:6451-6455). Las mutaciones de BRAF y K-ras se excluyen mutuamente en el CCR, lo que sugiere un solapamiento de las actividades oncogénicas (Davies et al. (2002) Nature 417:949-954; Rajagopalan et al. (2002) Nature 418:934). Las mutaciones asociadas a la progresión del CCR, concretamente la transición de adenoma a carcinoma, se dirigen a las vías TP53 y TGF-p (Markowitz et al. (2002) Cancer Cell 1:233-236). Más del 50% de los CCR albergan mutaciones que inactivan el TP53 (Fearon y Gruber (2001) Molecular abnormalities in colon and rectal cancer, ed. (2001). J. Mendelsohm, P.H., M. Israel y L. Liotta, W.B. Saunders, Filadelfia) y el 30% de los casos poseen mutaciones del TGFp-RII (Markowitz (2000) Biochim. Biophys. Acta 1470:M13-M20; Markowitz et al. (1995) Science 268:1336-1338). Los cánceres MIN inactivan sistemáticamente el TGFp-RII mediante mutaciones de cambio de marco, mientras que los cánceres CIN se dirigen a la vía a través de mutaciones somáticas inactivadoras en el dominio quinasa del TGFp-RII (15%) o en los componentes de señalización descendentes de la vía, incluidos los factores de transcripción SMAD4 (15%) o SMAD2 (5%) (Markowitz (2000) Biochim. Biophys. Acta 1470:M13-M20). En algunas realizaciones, el cáncer colorrectal es un cáncer colorrectal inestable por microsatélites (MSI) (Llosa et al. (2014) Cancer Disc. CD-14-0863; publicado en línea el 30 de octubre de 2014). La MSI representa aproximadamente el 15% de los CCR esporádicos y alrededor del 5-6A de los CCR en estadio IV. La MSI está causada por el silenciamiento epigenético o la mutación de los genes de reparación de los errores de emparejamiento del ADN y suele presentarse en estadios más bajos que el CCR del subconjunto de microsatélites estables (MSS). Las MSI expresan en alto grado puntos de control inmunitarios, como PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 e IDO. En otras realizaciones, el cáncer colorrectal es un CCR MSS.

[0036] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "región codificante" se refiere a las regiones de una secuencia de nucleótidos que comprenden codones que se traducen en residuos de aminoácidos, mientras que el término "región no codificante" se refiere a las regiones de una secuencia de nucleótidos que no se traducen en aminoácidos (por ejemplo, las regiones no traducidas 5' y 3').

[0037] Tal como se utiliza aquí, el término "complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos cadenas de ácido nucleico o entre dos regiones de la misma cadena de ácido nucleico. Se sabe que un residuo de adenina de una primera región de ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un residuo de una segunda región de ácido nucleico que es antiparalela a la primera región si el residuo es timina o uracilo.Del mismo modo, se sabe que un residuo de citosina de una primera cadena de ácido nucleico es capaz de formar pares de bases con un residuo de una segunda cadena de ácido nucleico que es antiparalela a la primera cadena si el residuo es guanina. Una primera región de un ácido nucleico es complementaria de una segunda región del mismo ácido nucleico o de otro diferente si, cuando las dos regiones están dispuestas de forma antiparalela, al menos un residuo nucleotídico de la primera región es capaz de formar un apareamiento de bases con un residuo de la segunda región. Preferiblemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, por lo que, cuando la primera y la segunda porciones están dispuestas de forma antiparalela, al menos aproximadamente el 50%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% de los residuos nucleotídicos de la primera porción son capaces de emparejarse con residuos nucleotídicos de la segunda porción. Más preferiblemente, todos los residuos nucleotídicos de la primera porción son capaces de formar pares de bases con residuos nucleotídicos de la segunda porción.

[0038] Como se usa aquí, el término "determinar un régimen de tratamiento adecuado para el sujeto" se toma para significar la determinación de un régimen de tratamiento (es decir, una terapia única o una combinación de terapias diferentes que se usan para la prevención y/o tratamiento del cáncer en el sujeto) para un sujeto que se inicia, modifica y/o termina basado o esencialmente basado o al menos parcialmente basado en los resultados del análisis según la presente invención. Un ejemplo es iniciar una terapia adyuvante tras la cirugía cuyo propósito es disminuir el riesgo de recurrencia, otro sería modificar la dosis de una quimioterapia concreta. La determinación puede basarse, además de en los resultados del análisis según la presente invención, en características personales del sujeto a tratar. En la mayoría de los casos, la determinación real del régimen de tratamiento adecuado para el sujeto correrá a cargo del médico o facultativo que le atienda.

[0039] “Homólogo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la similitud de la secuencia de nucleótidos entre dos regiones de la misma cadena de ácido nucleico o entre regiones de dos cadenas de ácido nucleico diferentes. Cuando una posición de residuo de nucleótido en ambas regiones está ocupada por el mismo residuo de nucleótido, entonces las regiones son homólogas en esa posición.Una primera región es homóloga a una segunda región si al menos una posición de residuo de nucleótido de cada región está ocupada por el mismo residuo. La homología entre dos regiones se expresa en términos de la proporción de posiciones de residuos nucleotídicos de las dos regiones que están ocupadas por el mismo residuo nucleotídico. A modo de ejemplo, una región que tiene la secuencia nucleotídica 5-ATTGCC-3' y una región que tiene la secuencia nucleotídica 5-TATGGC-3' comparten un 50% de homología. Preferiblemente, la primera región comprende una primera porción y la segunda región comprende una segunda porción, por lo que al menos aproximadamente el 50%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95% de las posiciones de residuos nucleotídicos de cada una de las porciones están ocupadas por el mismo residuo nucleotídico. Más preferiblemente, todas las posiciones de residuos nucleotídicos de cada una de las porciones están ocupadas por el mismo residuo nucleotídico.

[0040] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico de la invención, como un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan indistintamente en el presente documento. Debe entenderse que estos términos se refieren no sólo a la célula en cuestión, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias medioambientales, es posible que dicha progenie no sea idéntica a la célula progenitora, pero aún así se incluye en el ámbito del término tal y como se utiliza en el presente documento.

[0041] El término "anticuerpo humanizado", tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos fabricados por una célula no humana que tiene regiones variables y constantes que han sido alteradas para parecerse más a los anticuerpos que serían fabricados por una célula humana. Por ejemplo, alterando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo no humano para incorporar aminoácidos que se encuentran en las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o sitio-específica in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR. El término "anticuerpo humanizado", tal como se utiliza en el presente documento, también incluye anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como el ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “célula inmunitaria” se refiere a las células que desempeñan un papel en la respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias son de origen hematopoyético e incluyen linfocitos, como las células B y T; células asesinas naturales; células mieloides, como monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.

[0043] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "respuesta inmunitaria" incluye respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o células B. Las respuestas inmunitarias ejemplares incluyen respuestas de células T, por ejemplo, producción de citocinas y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se efectúan indirectamente mediante la activación de células T, por ejemplo, la producción de anticuerpos (respuestas humorales) y la activación de células que responden a citocinas, por ejemplo, macrófagos.

[0044] Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operable con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

[0045] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inhibir' se refiere a cualquier disminución de, por ejemplo, una acción, función o interacción particular. Por ejemplo, el cáncer se "inhibe" si al menos un síntoma del cáncer se reduce, ralentiza o retrasa. Como se utiliza en el presente documento, el cáncer también se “inhibe” si la recurrencia o metástasis del cáncer se reduce, ralentiza o retrasa.

[0046] El término "interacción", cuando se refiere a una interacción entre dos moléculas, se refiere al contacto físico (por ejemplo, unión) de las moléculas entre sí. Generalmente, dicha interacción da lugar a una actividad (que produce un efecto biológico) de una o ambas de dichas moléculas. La actividad puede ser una actividad directa de una o ambas moléculas (por ejemplo, transducción de señales). Alternativamente, se puede impedir que una o ambas moléculas de la interacción unan su ligando y, por tanto, se mantengan inactivas con respecto a la actividad de unión del ligando (por ejemplo, la unión de su ligando y la activación o inhibición de la coestimulación). Inhibir una interacción de este tipo tiene como resultado la interrupción de la actividad de una o más moléculas implicadas en la interacción. Potenciar dicha interacción es prolongar o aumentar la probabilidad de dicho contacto físico, y prolongar o aumentar la probabilidad de dicha actividad.

[0047] Por "anticuerpo aislado" se entiende un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido RGMb o a un fragmento del mismo, o al polipéptido PD-1 o a un fragmento del mismo, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de dicho polipéptido o fragmento del mismo). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.

[0048] Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína aislada" se refiere a una proteína que está sustancialmente libre de otras proteínas, material celular, medio de separación y medio de cultivo cuando se aísla de células o se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva el anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones, en las que las composiciones de la invención están separadas de los componentes celulares de las células de las que están aisladas o producidas recombinantemente. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de tener menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (por peso seco) de material celular. Cuando se produce recombinantemente un anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión o fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento biológicamente activo del mismo, también es preferible que esté sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, que el medio de cultivo represente menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación proteica.

[0049] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "KD" se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. La afinidad de unión de los anticuerpos de la invención divulgada puede medirse o determinarse mediante ensayos estándar anticuerpo-antígeno, por ejemplo, ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos estándar como ELISA o RIA.

[0051] Un "kit" es cualquier fabricación (por ejemplo, un paquete o contenedor) que comprenda al menos un reactivo, por ejemplo, una sonda o molécula pequeña, para detectar y/o afectar específicamente la expresión de un marcador de la invención. El kit puede promocionarse, distribuirse o venderse como una unidad para llevar a cabo los métodos de la presente invención. El kit puede comprender uno o más reactivos necesarios para expresar una composición útil en los métodos de la presente invención. En ciertas realizaciones, el kit puede comprender además un estándar de referencia, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína que no afecta ni regula las vías de señalización que controlan el crecimiento, la división, la migración, la supervivencia o la apoptosis celular. Un experto en la materia puede imaginar muchas proteínas de control de este tipo, incluidas, entre otras, etiquetas moleculares comunes (p. ej., proteína fosforescente verde y betagalactosidasa), proteínas no clasificadas en ninguna de las vías que abarcan el crecimiento, la división, la migración, la supervivencia o la apoptosis celulares según la referencia GeneOntology, o proteínas de mantenimiento ubicuas. Los reactivos del kit pueden suministrarse en envases individuales o como mezclas de dos o más reactivos en un único envase. Además, puede incluirse material didáctico que describa el uso de las composiciones del kit.

[0052] Un "marcador" es un gen cuyo nivel de expresión alterado en un tejido o célula con respecto a su nivel de expresión en un tejido o célula normal o sano se asocia a un estado de enfermedad, como el cáncer. Un "ácido nucleico marcador" es un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADNc) codificado por o correspondiente a un marcador de la invención. Dichos ácidos nucleicos marcadores incluyen ADN (por ejemplo, ADNc) que comprende la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos expuestas en el Listado de Secuencias o el complemento de dicha secuencia. Los ácidos nucleicos marcadores también incluyen ARN que comprenden la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos expuestas en el Listado de Secuencias o el complemento de dicha secuencia, en el que todos los residuos de timidina se sustituyen por residuos de uridina. Una "proteína marcadora" es una proteína codificada por o correspondiente a un marcador de la invención. Una proteína marcadora comprende la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias establecidas en el Listado de Secuencias. Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente.

[0053] El término "terapia neoadyuvante" se refiere a un tratamiento administrado antes del tratamiento primario. Algunos ejemplos de terapia neoadyuvante pueden ser la quimioterapia, la radioterapia y la terapia hormonal. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de mama, la terapia neoadyuvante puede permitir a las pacientes con cáncer de mama de gran tamaño someterse a una cirugía conservadora de la mama.

[0054] El nivel "normal" de expresión o actividad de un marcador es el nivel de expresión o actividad del marcador en células de un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, no afectado por un trastorno de interés, como un cáncer. Una "sobreexpresión" o "nivel de expresión significativamente superior" de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de ensayo que es superior al error estándar del ensayo empleado para evaluar la expresión, y es preferiblemente de al menos un 10%, y más preferiblemente de 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces o más que la actividad o el nivel de expresión del marcador en una muestra de control (por ejemplo, muestra de un sujeto sano que no padece la enfermedad asociada al marcador) y, preferiblemente, el nivel de expresión medio del marcador en varias muestras de control. Un "nivel de expresión significativamente inferior" de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de ensayo que es al menos del 10%, y más preferiblemente 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2.5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces o más bajo que el nivel de expresión del marcador en una muestra de control (por ejemplo, muestra de un sujeto sano que no padece la enfermedad asociada al marcador) y, preferiblemente, el nivel de expresión medio del marcador en varias muestras de control.

[0055] Los términos «prevenir», "previniendo", «prevención», "tratamiento profiláctico" y similares se refieren a reducir la probabilidad de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, que no tiene, pero está en riesgo de o es susceptible de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.

[0056] El término "sonda" se refiere a cualquier molécula capaz de unirse selectivamente a una molécula diana específica, por ejemplo, una transcripción de nucleótidos o una proteína codificada por o correspondiente a un marcador. Las sondas pueden ser sintetizadas por un experto en la materia o derivadas de preparaciones biológicas adecuadas. A efectos de detección de la molécula objetivo, las sondas pueden diseñarse específicamente para ser marcadas, tal como se describe en el presente documento. Ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas.

[0057] El término “prognosis” incluye una predicción del curso probable y el resultado del cáncer o la probabilidad de recuperación de la enfermedad. En algunas realizaciones, el uso de algoritmos estadísticos proporciona un pronóstico del cáncer en un individuo. Por ejemplo, el pronóstico puede ser la cirugía, el desarrollo de un subtipo clínico de cáncer (por ejemplo, cánceres hematológicos, como el mieloma múltiple), el desarrollo de uno o más factores clínicos, el desarrollo de cáncer intestinal o la recuperación de la enfermedad.

[0058] El término "respuesta a la terapia de puntos de control antiinmunitarios" o "resultado de la terapia" se refiere a cualquier respuesta de una afección de interés (p. ej., cáncer) a una terapia, preferiblemente a un cambio en la masa y/o el volumen del tumor tras el inicio de la quimioterapia neoadyuvante o adyuvante. La respuesta al trastorno hiperproliferativo puede evaluarse, por ejemplo, en relación con la eficacia o en una situación neoadyuvante o adyuvante, en la que el tamaño de un tumor tras una intervención sistémica puede compararse con el tamaño y las dimensiones iniciales medidos mediante TC, PET, mamografía, ecografía o palpación. La respuesta también puede evaluarse mediante la medición del calibre o el examen patológico del tumor tras la biopsia o la resección quirúrgica en el caso de los cánceres sólidos. Las respuestas pueden registrarse de forma cuantitativa, como el cambio porcentual en el volumen tumoral, o de forma cualitativa, como "respuesta patológica completa" (pCR), "remisión clínica completa" (cCR), "remisión clínica parcial" (cPR), "enfermedad clínica estable" (cSD), "enfermedad clínica progresiva" (cPD) u otros criterios cualitativos. La evaluación de la respuesta al trastorno hiperproliferativo puede realizarse poco después del inicio de la terapia neoadyuvante o adyuvante, por ejemplo, al cabo de unas horas, días, semanas o, preferiblemente, al cabo de unos meses. Un criterio de valoración típico para evaluar la respuesta es la finalización de la quimioterapia neoadyuvante o la extirpación quirúrgica de las células tumorales residuales y/o del lecho tumoral. Esto suele ocurrir tres meses después del inicio de la terapia neoadyuvante. En algunas realizaciones, la eficacia clínica de los tratamientos terapéuticos aquí descritos puede determinarse midiendo la tasa de beneficio clínico (TBC). La tasa de beneficio clínico se mide determinando la suma del porcentaje de pacientes en remisión completa (RC), el número de pacientes en remisión parcial (RP) y el número de pacientes con enfermedad estable (EE) en un punto temporal de al menos 6 meses desde el final del tratamiento. La abreviatura de esta fórmula es TBC=RC+RP+EE a lo largo de 6 meses. En algunas realizaciones, el TBC para un régimen oncoterapéutico particular es de al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o más. En otras realizaciones, el porcentaje de pacientes que están en RC, RP y/o DS en cualquier combinación durante al menos 30 días, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses, 36 meses, 60 meses o más es de al menos el 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o más. En algunas realizaciones, el porcentaje es del 100% en dicho periodo de tiempo. Los criterios adicionales para evaluar la respuesta a las terapias contra el cáncer están relacionados con la "supervivencia", que incluye todo lo siguiente: supervivencia hasta la mortalidad, también conocida como supervivencia global (en la que dicha mortalidad puede ser independiente de la causa o relacionada con el tumor); "supervivencia libre de recidiva" (en la que el término recidiva incluirá tanto la recidiva localizada como la recidiva a distancia); supervivencia libre de metástasis; supervivencia libre de enfermedad (en la que el término enfermedad incluirá el cáncer y las enfermedades asociadas al mismo). La duración de dicha supervivencia puede calcularse por referencia a un punto inicial definido (por ejemplo, el momento del diagnóstico o el inicio del tratamiento) y un punto final (por ejemplo, la muerte, la recidiva o la metástasis). Además, los criterios de eficacia del tratamiento pueden ampliarse para incluir la respuesta a la quimioterapia, la probabilidad de supervivencia, la probabilidad de metástasis en un periodo de tiempo determinado y la probabilidad de recidiva tumoral. Por ejemplo, para determinar los valores umbral adecuados, se puede administrar un régimen terapéutico contra el cáncer concreto a una población de sujetos y correlacionar el resultado con el número de copias, el nivel de expresión, el nivel de actividad, etc. de un marcador determinado antes de la administración de cualquier terapia contra el cáncer. La medida del resultado puede ser la respuesta patológica a la terapia administrada en el contexto neoadyuvante. Alternativamente, las medidas de resultados, como la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad, pueden ser monitorizadas durante un periodo de tiempo para los sujetos que siguen la terapia contra el cáncer para los que se conocen los valores de medición. En ciertas realizaciones, se administran las mismas dosis de agentes terapéuticos contra el cáncer a cada sujeto. En las realizaciones relacionadas, las dosis administradas son dosis estándar conocidas en la técnica para agentes terapéuticos contra el cáncer. El periodo de tiempo durante el cual se monitorea a los sujetos puede variar. Por ejemplo, los sujetos pueden ser monitoreados durante al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 meses.Los valores umbral de los biomarcadores que se correlacionan con el resultado de una terapia contra el cáncer pueden determinarse utilizando métodos como los descritos en la secciónEjemplos.Los resultados también pueden medirse en términos de “relación de peligro” (la relación entre las tasas de mortalidad de un grupo de pacientes y otro; proporciona la probabilidad de muerte en un momento determinado), "supervivencia global" (SG) y/o "supervivencia sin progresión". En ciertas realizaciones, el pronóstico comprende la probabilidad de supervivencia global a 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o cualquier otro momento adecuado. El significado asociado con el pronóstico de mal resultado en todos los aspectos de la presente invención se mide mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la significación puede medirse con el cálculo de la razón de oportunidades. En otra forma de realización, la importancia se mide en porcentaje. En una realización, un riesgo significativo de mal resultado se mide como una odds ratio de 0,8 o menos o al menos aproximadamente 1,2, incluyendo pero no limitándose a: 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0 y 40,0. En una realización posterior, un aumento o reducción significativa del riesgo es de al menos un 20%, incluyendo pero no limitándose a un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y 98%. En una realización posterior, un aumento significativo del riesgo es de al menos un 50%. Así, la presente invención proporciona además métodos para tomar una decisión de tratamiento para un paciente de cáncer, que comprenden llevar a cabo los métodos para pronosticar un paciente de cáncer según los diferentes aspectos y realizaciones de la presente invención, y luego sopesar los resultados a la luz de otros factores de riesgo clínicos y patológicos conocidos, para determinar un curso de tratamiento para el paciente de cáncer. Por ejemplo, un paciente de cáncer que, según los métodos de la invención, tiene un riesgo mayor de mal resultado con el tratamiento de quimioterapia combinada, puede ser tratado con terapias más agresivas, incluyendo pero no limitándose a radioterapia, trasplante de células madre de sangre periférica, trasplante de médula ósea, o terapias novedosas o experimentales en investigación clínica.

[0059] El término "resistencia" se refiere a una resistencia adquirida o natural de una muestra de cáncer o un mamífero a una terapia contra el cáncer (es decir, no responder o tener una respuesta reducida o limitada al tratamiento terapéutico), como tener una respuesta reducida a un tratamiento terapéutico en un 25% o más, por ejemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más, a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más. La reducción de la respuesta puede medirse comparando con la misma muestra de cáncer o mamífero antes de que se adquiera la resistencia, o comparando con una muestra de cáncer diferente o un mamífero que se sabe que no tiene resistencia al tratamiento terapéutico.La resistencia atípica adquirida a la quimioterapia se denomina “resistencia multifármaco”. La resistencia multifármaco puede estar mediada por la glicoproteína P o por otros mecanismos, o puede producirse cuando un mamífero se infecta con un microorganismo resistente a múltiples fármacos o con una combinación de microorganismos. La determinación de la resistencia a un tratamiento terapéutico es rutinaria en el arte y dentro de la habilidad de un clínico ordinariamente experto, por ejemplo, puede medirse mediante ensayos proliferativos celulares y ensayos de muerte celular como los descritos aquí como "sensibilizantes". En algunas realizaciones, el término "revierte la resistencia" significa que el uso de un segundo agente en combinación con un tratamiento primario contra el cáncer (por ejemplo, quimioterapia o radioterapia) es capaz de producir una disminución significativa del volumen tumoral a un nivel de significación estadística (por ejemplo, p<0,05) en comparación con el volumen tumoral de un tumor no tratado en el caso de que el tratamiento primario del cáncer (por ejemplo, quimioterapia o radioterapia) por sí solo no pueda producir una disminución estadísticamente significativa del volumen tumoral en comparación con el volumen tumoral de un tumor no tratado. Esto se aplica generalmente a las mediciones del volumen tumoral realizadas en un momento en el que el tumor no tratado está creciendo de forma rítmica.

[0060] Un "agente de interferencia de ARN", tal como se utiliza en el presente documento, se define como cualquier agente que interfiere o inhibe la expresión de un gen diana, por ejemplo, un marcador de la invención, mediante ARN de interferencia (ARNi). Tales agentes de interferencia de ARN incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que incluyen moléculas de ARN homólogas al gen diana, por ejemplo, un marcador de la invención, o un fragmento del mismo, ARN de interferencia corto (siARN), y moléculas pequeñas que interfieren o inhiben la expresión de un gen diana por interferencia de ARN (ARNi).

[0061] El "ARN de interferencia (ARNi)" es un proceso evolutivamente conservado por el que la expresión o introducción de ARN de una secuencia idéntica o muy similar a un gen diana provoca la degradación específica de la secuencia o el silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) específico del ARN mensajero (ARNm) transcrito a partir de ese gen diana (véase Coburn y Cullen (2002) J. Virol. 76(18):9225), inhibiendo así la expresión del gen diana. En una realización, el ARN es ARN de doble cadena (ARNdc). Este proceso se ha descrito en plantas, invertebrados y células de mamíferos. En la naturaleza, el ARNi se inicia por la endonucleasa Dicer, que promueve la escisión procesiva de ARNdc largo en fragmentos de doble cadena denominados ARNsi. Los ARNsi se incorporan a un complejo proteico que reconoce y escinde los ARNm objetivo. El ARNi también puede iniciarse introduciendo moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ARNsi sintéticos o agentes de interferencia de ARN, para inhibir o silenciar la expresión de genes diana. Tal como se utiliza en el presente documento, la "inhibición de la expresión del gen diana" o la "inhibición de la expresión del gen marcador" incluye cualquier disminución de la expresión o de la actividad proteica o del nivel del gen objetivo (por ejemplo, un gen marcador de la invención) o de la proteína codificada por el gen objetivo, por ejemplo, una proteína marcadora de la invención. La disminución puede ser de al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más en comparación con la expresión de un gen diana o la actividad o nivel de la proteína codificada por un gen diana que no ha sido objeto de un agente de interferencia de ARN.

[0062] El término "muestra" utilizado para detectar o determinar la presencia o el nivel de al menos un biomarcador suele ser sangre total, plasma, suero, saliva, orina, heces (p. ej., heces fecales), lágrimas y cualquier otro fluido corporal (p. ej., como se ha descrito anteriormente en la definición de "fluidos corporales"), o una muestra de tejido (p. ej., biopsia) como una muestra de intestino delgado, colon o tejido de resección quirúrgica. En ciertos casos, el método de la presente invención comprende además obtener la muestra del individuo antes de detectar o determinar la presencia o el nivel de al menos un marcador en la muestra.

[0063] El término "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afnidad (KD) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor cuando se determina mediante la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento de ensayo BIACORE® utilizando un antígeno de interés como analito y el anticuerpo como ligando, y se une al antígeno predeterminado con una afnidad que es al menos de 1.1-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 1,9-, 2,0-, 2,5-, 3,0-, 3,5-, 4,0-, 4,5-, 5,0-, 6,0-, 7,0-, 8,0-, 9,0-, o 10,0-veces o más que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan indistintamente en el presente documento con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". La unión selectiva es un término relativo que se refiere a la capacidad de un anticuerpo para discriminar la unión de un antígeno respecto a otro.

[0064] El término "sensibilizar" significa alterar las células cancerosas o tumorales de manera que permitan un tratamiento más eficaz del cáncer asociado con una terapia oncológica (por ejemplo, quimioterapéutica o radioterapia). En algunas realizaciones, las células normales no se ven afectadas hasta el punto de que la terapia contra el cáncer (por ejemplo, quimioterapia o radioterapia) lesione indebidamente a las células normales. La sensibilidad aumentada o reducida a un tratamiento terapéutico se mide de acuerdo con un método conocido en la técnica para el tratamiento particular y los métodos descritos a continuación, incluidos, entre otros, los ensayos de proliferación celular (Tanigawa N, Kern D H, Kikasa Y, Morton D L, Cancer Res 1982; 42., 2159-2164): 2159-2164), ensayos de muerte celular (Weisenthal L M,Shoemaker R H, Marsden JA, Dill PL, Baker J A, MoranE M, Cancer Res 1984; 94: 161-173;WeisenthalL M, Lippman M E, CancerTreat Rep 1985; 69: 615-632;WeisenthalL M, In:KaspersGJ L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432; Weisenthal L M, Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90). La sensibilidad o resistencia también puede medirse en animales midiendo la reducción del tamaño del tumor durante un periodo de tiempo, por ejemplo, 6 meses en humanos y 4-6 semanas en ratones. Una composición o un método sensibiliza la respuesta a un tratamiento terapéutico si el aumento de la sensibilidad al tratamiento o la reducción de la resistencia es del 25% o más, por ejemplo, del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más, a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces o más, en comparación con la sensibilidad al tratamiento o la resistencia en ausencia de dicha composición o método. La determinación de la sensibilidad o resistencia a un tratamiento terapéutico es rutinaria en la técnica y está dentro de la habilidad de un clínico normalmente experto. Debe entenderse que cualquier método descrito aquí para mejorar la eficacia de una terapia contra el cáncer puede aplicarse igualmente a métodos para sensibilizar células hiperproliferativas o cancerosas (por ejemplo, células resistentes) a la terapia contra el cáncer.

[0065] El "ARN de interferencia corto" (ARNsi), también denominado en el presente documento "ARN de interferencia pequeño" se define como un agente que funciona para inhibir la expresión de un gen diana, por ejemplo, mediante ARNi. Un ARNsi puede sintetizarse químicamente, puede producirse por transcripción in vitro o puede producirse dentro de una célula huésped. En una realización, el ARNsi es una molécula de ARN de doble cadena (ARNdc) de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 28 nucleótidos, más preferiblemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente de aproximadamente 19, 20, 21 o 22 nucleótidos de longitud, y puede contener un saliente 3' y/o 5' en cada cadena con una longitud de aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos. La longitud del voladizo es independiente entre los dos ramales, es decir, la longitud del voladizo en un ramal no depende de la longitud del voladizo en el segundo ramal. Preferiblemente, el ARNsi es capaz de promover la interferencia de ARN mediante la degradación o el silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) específico del ARN mensajero (ARNm) objetivo. En otra realización, un ARNsi es un ARN de horquilla pequeña (también llamado bucle de vástago) (ARNhc). En una realización, estos ARNhc se componen de una cadena corta (por ejemplo, 19-25 nucleótidos) antisentido, seguida de un bucle de 5-9 nucleótidos, y la cadena análoga en sentido. Alternativamente, la cadena sentido puede preceder a la estructura de bucle de nucleótidos y la cadena antisentido puede seguirla. Estos ARNhc pueden estar contenidos en plásmidos, retrovirus y lentivirus y expresarse, por ejemplo, a partir del promotor U6 de la pol III u otro promotor (véase, por ejemplo, Stewart, et al. (2003) RNA Apr; 9(4):493-501). Los agentes de interferencia de ARN, por ejemplo, moléculas de ARNsi, pueden administrarse a un sujeto que tenga o corra el riesgo de tener cáncer, para inhibir la expresión de un gen marcador de la invención, por ejemplo, un gen marcador que esté sobreexpresado en el cáncer (como los marcadores enumerados en la Tabla 3) y, de ese modo, tratar, prevenir o inhibir el cáncer en el sujeto.

[0066] El término "molécula pequeña" es un término de la técnica e incluye moléculas que tienen menos de aproximadamente 1000 pesos moleculares o menos de aproximadamente 500 pesos moleculares. En una realización, las moléculas pequeñas no comprenden exclusivamente enlaces peptídicos. En otra realización, las moléculas pequeñas no son oligoméricas. Algunos ejemplos de compuestos de moléculas pequeñas cuya actividad puede examinarse son, entre otros, péptidos, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, policétidos) (Cane et al. 1998. Science 282:63) y bibliotecas de extractos de productos naturales. En otra realización, los compuestos son pequeños compuestos orgánicos no peptídicos. En otra realización, una molécula pequeña no es biosintética.

[0067] Tal como se utiliza en el presente documento, “sujeto” se refiere a cualquier animal, mamífero o ser humano sano, o a cualquier animal, mamífero o ser humano afectado por un trastorno de interés como el cáncer, por ejemplo, carcinomas colorrectales, de pulmón, de ovario, de páncreas, de hígado, de mama, de próstata y/o de colon. El término “paciente” es intercambiable con “sujeto”.

[0068] La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión en las que la proteína está separada de precursores químicos u otras sustancias químicas que intervienen en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o no anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión, aún más preferiblemente menos del 10% de precursores químicos o productos químicos no anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión, y más preferiblemente menos del 5% de precursores químicos o productos químicos no anticuerpo, polipéptido, péptido o proteína de fusión.

[0069] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "supervivencia" incluye todo lo siguiente: supervivencia hasta la mortalidad, también conocida como supervivencia global (en la que dicha mortalidad puede ser independiente de la causa o relacionada con el tumor); "supervivencia libre de recurrencia" (en la que el término recurrencia incluirá tanto la recurrencia localizada como la recurrencia a distancia); supervivencia libre de metástasis; supervivencia libre de enfermedad (en la que el término enfermedad incluirá el cáncer y las enfermedades asociadas al mismo). La duración de dicha supervivencia puede calcularse por referencia a un punto inicial definido (por ejemplo, el momento del diagnóstico o el inicio del tratamiento) y un punto final (por ejemplo, la muerte, la recidiva o la metástasis). Además, los criterios de eficacia del tratamiento pueden ampliarse para incluir la respuesta a la quimioterapia, la probabilidad de supervivencia, la probabilidad de metástasis en un periodo de tiempo determinado y la probabilidad de recidiva tumoral.

[0070] El término "efecto sinérgico" se refiere al efecto combinado de dos o más agentes anticancerígenos puede ser mayor que la suma de los efectos separados de los agentes anticancerígenos o solos. En algunas realizaciones, puede proporcionar una eficacia similar a la monoterapia, pero con otras mejoras inesperadas en relación con la monoterapia, como la reducción de los efectos secundarios no deseados.

[0071] El término "célula T" incluye las células T CD4+ y las células T CD8+. El término célula T también incluye tanto las células T de tipo T ayudante 1 como las células T de tipo T ayudante 2. El término "célula presentadora de antígeno" incluye células presentadoras de antígeno profesionales (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans), así como otras células presentadoras de antígeno (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, y oligodendrocitos).

[0072] El término "efecto terapéutico" se refiere a un efecto local o sistémico en animales, particularmente mamíferos, y más particularmente humanos, causado por una sustancia farmacológicamente activa. Por lo tanto, el término designa cualquier sustancia destinada al diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades o a la mejora del desarrollo físico o mental y de las condiciones deseables en un animal o un ser humano. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" significa aquella cantidad de dicha sustancia que produce algún efecto local o sistémico deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto dependerá de su índice terapéutico, solubilidad y similares. Por ejemplo, ciertos compuestos descubiertos por los métodos de la presente invención pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a dicho tratamiento.

[0073] Los términos “cantidad terapéuticamente efectiva” y “cantidad efectiva”, tal como se utilizan en el presente documento, significan la cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es efectiva para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una subpoblación de células de un animal con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos sujetos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 y la ED50. Se prefieren las composiciones que presentan grandes índices terapéuticos. En algunas realizaciones, la DL50 (dosis letal) puede medirse y puede ser, por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más reducida para el agente en relación con la no administración del agente. Del mismo modo, la ED50 (es decir, la concentración que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) puede medirse y puede ser, por ejemplo, al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más aumentada para el agente en relación con la no administración del agente. Asimismo, de forma similar, puede medirse la IC50 (es decir, la concentración que alcanza un efecto citotóxico o citostático semimáximo sobre las células cancerosas) y puede ser, por ejemplo, al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% o más aumentada para el agente en relación con la no administración del agente. En algunas realizaciones, el crecimiento de células cancerosas en un ensayo puede inhibirse al menos en un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso 100%. En otra realización, se puede lograr al menos una disminución del 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso del 100% en una neoplasia maligna sólida.

[0074] Un promotor "tejido-específico" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula humana viva sustancialmente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

[0075] Un "polinucleótido transcrito" o "transcrito nucleotídico" es un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm, ARNhn, un ADNc o un análogo de dicho ARN o ADNc) que es complementario u homólogo con la totalidad o una parte de un ARNm maduro producido por la transcripción de un marcador de la invención y el procesamiento postranscripcional normal (e.p. ej. empalme), en su caso, del transcrito de ARN, y transcripción inversa del transcrito de ARN.

[0076] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "falta de respuesta" o "tolerancia" incluye la refractividad de las células inmunitarias a la estimulación, por ejemplo, la estimulación a través de un receptor activador o una citoquina. La falta de respuesta puede producirse, por ejemplo, por la exposición a inmunosupresores o a dosis elevadas de antígeno. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anergia" o "tolerancia" incluye la refractividad a la estimulación mediada por receptores activadores. Dicha refractividad suele ser antígeno-específica y persiste tras cesar la exposición al antígeno tolerante. Por ejemplo, la anergia en las células T (en contraposición a la falta de respuesta) se caracteriza por la falta de producción de citoquinas, por ejemplo, IL-2. La anergia de células T se produce cuando las células T se exponen al antígeno y reciben una primera señal (un receptor de células T o una señal mediada por CD-3) en ausencia de una segunda señal (una señal coestimuladora). En estas condiciones, la reexposición de las células al mismo antígeno (incluso si la reexposición se produce en presencia de un polipéptido costimulador) tiene como resultado la no producción de citocinas y, por tanto, la no proliferación. Sin embargo, las células T anérgicas pueden proliferar si se cultivan con citoquinas (por ejemplo, IL-2). Por ejemplo, la anergia de las células T también puede observarse por la falta de producción de IL-2 por los linfocitos T medida por ELISA o por un ensayo de proliferación utilizando una línea celular indicadora. Alternativamente, puede utilizarse una construcción de gen informador. Por ejemplo, las células T anérgicas no consiguen iniciar la transcripción del gen IL-2 inducida por un promotor heterólogo bajo el control del potenciador 5' del gen IL-2 o por un multímero de la secuencia AP1 que puede encontrarse dentro del potenciador (Kang et al. (1992) Science 257:1134).

[0077] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episomales de mamíferos) se integran en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la misma y, por tanto, se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" o simplemente "vectores de expresión ". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen adoptar la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

[0078] Existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoácidos de una proteína concreta y las secuencias de nucleótidos que pueden codificar la proteína, tal y como se define en el código genético (que se muestra a continuación). Asimismo, existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico concreto y la secuencia de aminoácidos codificada por dicho ácido nucleico, tal y como se define en el código genético.

CÓDIGO GENÉTICO

Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT

Arginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT

Asparagina (Asn, N) AAC, AAT

Ácido aspártico (Asp, D) GAC, GAT

Cisteína (Cys, C) TGC, TGT

Ácido glutámico (Glu, E) GAA, GAG

Glutamina (Gln, Q) CAA, CAG

Glicina (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT

Histidina (His, H) CAC, CAT

Isoleucina (Ile, I) ATA, ATC, ATT

Leucina (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG

Lisina (Lys, K) AAA, AAG

Metionina (Met, M) ATG

Fenilalanina (Phe, F) TTC, TTT

Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT

Serina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT

Treonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT

Triptofano (Trp, W) TGG

Tirosina (Tyr, Y) TAC, TAT

Valina (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT

Señal de terminación (end) TAA, TAG, TGA

[0079] Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia, en virtud de la cual, para la mayoría de los aminoácidos utilizados para fabricar proteínas, puede emplearse más de un triplete de nucleótidos codificantes (ilustrado anteriormente). Por lo tanto, varias secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar una secuencia de aminoácidos determinada. Dichas secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes, ya que dan lugar a la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos (aunque determinados organismos pueden traducir algunas secuencias con mayor eficacia que otras). Además, ocasionalmente, puede encontrarse una variante metilada de una purina o pirimidina en una secuencia de nucleótidos determinada. Estas metilaciones no afectan a la relación de codificación entre el codón trinucleotídico y el aminoácido correspondiente.

[0080] En vista de lo anterior, la secuencia de nucleótidos de un ADN o ARN que codifica para una proteína de fusión o polipéptido de la invención (o cualquier porción del mismo) puede utilizarse para derivar la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión o polipéptido, utilizando el código genético para traducir el ADN o ARN en una secuencia de aminoácidos. De igual forma, para una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido de fusión, las secuencias de nucleótidos correspondientes que pueden codificar la proteína o polipéptido de fusión pueden deducirse del código genético (que, debido a su redundancia, producirá múltiples secuencias de ácidos nucleicos para cualquier secuencia de aminoácidos dada). Así, debe considerarse que la descripción y/o divulgación en el presente documento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido de fusión incluye también la descripción y/o divulgación de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos. Del mismo modo, debe considerarse que la descripción y/o divulgación de una proteína de fusión o secuencia aminoacídica polipeptídica en el presente documento también incluye la descripción y/o divulgación de todas las secuencias nucleotídicas posibles que pueden codificar la secuencia aminoacídica.

[0081] Por último, la información sobre secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para los loci y biomarcadores de la presente invención (por ejemplo, los biomarcadores descritos en los Ejemplos) son bien conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles en bases de datos de acceso público, como el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Por ejemplo, a continuación se proporcionan secuencias ejemplares de ácidos nucleicos y aminoácidos derivadas de bases de datos de secuencias y publicaciones de acceso público, entre las que se incluyen, por ejemplo, PCT Publ. WO 2014/022759.

[0082] Por ejemplo, el término "PD-1" se refiere a un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina que funciona como un receptor coinhibitorio que tiene PD-L1 y PD-L2 como ligandos conocidos. PD-1 se identificó previamente utilizando un enfoque basado en la clonación por sustracción para seleccionar genes regulados al alza durante la muerte de células T activadas inducida por el TCR. PD-1 es un miembro de la familia de moléculas CD28/CTLA-4 basado en su capacidad de unirse a PD-L1. Al igual que CTLA-4, PD-1 se induce rápidamente en la superficie de las células T en respuesta a anti-CD3 (Agata et al. 25 (1996) Int. Immunol. 8:765). Sin embargo, a diferencia de CTLA-4, PD-1 también se induce en la superficie de los linfocitos B (en respuesta a anti-IgM). PD-1 también se expresa en un subconjunto de timocitos y células mieloides (Agata et al. (1996) supra; Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8:773).

[0083] Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido de un biomarcador PD-1 humano representativo están disponibles al público en la base de datos GenBank bajo NM_005018.2 y NP_005009.2 y se muestran en la Tabla 1 (véase también Ishida et al. (1992) 20 EMBO J 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; Patente de EE.UU.

5,698,520). La PD-1 tiene una región extracelular que contiene un dominio de la superfamilia de las inmunoglobulinas, un dominio transmembrana y una región intracelular que incluye un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23:704; y Patente de EE.UU. 5.698.520) y un motivo interruptor basado en tirosina inmunorreceptora (ITSM). Estas características también definen una familia más amplia de polipéptidos, denominada receptores inmunoinhibidores, que también incluye gp49B, PIR-B y los receptores inhibidores de la muerte (KIR) (Vivier y Daeron (1997) Immunol. Today 18:286). Se suele suponer que el motivo tirosil fosforilado ITIM e ITSM de estos receptores interactúa con fosfatasas que contienen el dominio SH2, lo que da lugar a señales inhibitorias. Un subconjunto de estos receptores inmunoinhibidores se une a polipéptidos del CMH, por ejemplo los KIR, y CTLA4 se une a B7-1 y B7-2. Se ha propuesto que existe una relación filogenética entre los genes MHC y B7 (Henry et al. (1999) Immunol. Today 20(6):285-8). Las secuencias de ácido nucleico y polipeptídicas de PD-1 ortólogos en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, PD-1 de ratón (NM_008798.2 y NP_032824.1), PD-1 de rata (NM_001106927.1 y NP_001100397.1), PD-1 de perro (XM_543338.3 y XP_543338.3), PD-1 de vaca (NM_001083506.1 y NP_001076975.1), y PD-1 de pollo (XM_422723.3 y XP_422723.2).

[0084] Los polipéptidos PD-1 son receptores inhibitorios capaces de transmitir una señal inhibitoria a una célula inmunitaria para inhibir así la función efectora de la célula inmunitaria, o son capaces de promover la coestimulación (p. ej., por inhibición competitiva) de células inmunitarias, p. ej., cuando están presentes en forma soluble, monomérica. Los miembros preferidos de la familia PD-1 comparten identidad de secuencia con PD-1 y se unen a uno o más miembros de la familia B7, por ejemplo, B7-1,B7-2, ligando de PD-1 y/u otros polipéptidos en células presentadoras de antígeno.

[0085] El término "actividad PD-1" incluye la capacidad de un polipéptido PD-1 de modular una señal inhibitoria en una célula inmunitaria activada, por ejemplo, al enganchar un ligando PD-1 natural en una célula presentadora de antígeno. La modulación de una señal inhibidora en una célula inmunitaria tiene como resultado la modulación de la proliferación y/o la secreción de citocinas por parte de una célula inmunitaria. Por lo tanto, el término “actividad PD-1” incluye la capacidad de un polipéptido PD-1 de unirse a su(s) ligando(s) natural(es), la capacidad de modular las señales coestimuladoras o inhibidoras de las células inmunitarias y la capacidad de modular la respuesta inmunitaria.

[0086] En algunas realizaciones, una afección como el cáncer es sensible al bloqueo de PD-1 solo, pero es significativa o sinérgicamente más sensible cuando se trata con el bloqueo de PD-1 y el bloqueo de RGMb en combinación. Se conocen muchas afecciones que responden al bloqueo de PD-1 solo e incluyen, sin limitación, melanoma (por ejemplo, melanoma avanzado o metastásico), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama HER-2 negativo, cáncer de mama con receptor de estrógenos+/HER-2 y cáncer de mama triple negativo), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma pancreático) y linfoma de Hodgkin, así como cáncer de vejiga, gástrico, de cabeza y cuello, renal, de próstata, ginecológico y hematológico.

[0087] El término "ligando de PD-1" se refiere a socios de unión del receptor PD-1 e incluye tanto PD-L1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027) y PD-L2 (Latchman et al.(2001) Nat. Immunol. 2:261). Existen al menos dos tipos de polipéptidos ligandos de la PD-1 humana. Las proteínas ligando de PD-1 comprenden una secuencia señal y un dominio IgV, un dominio IgC, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta. Tanto PD-L1 (véase Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027 para los datos de secuencia) y PD-L2 (véase Latchman et al. (2001) Nat. Immunol.

2:261 para los datos de la secuencia) son miembros de la familia de polipéptidos B7. Tanto PD-L1 como PD-L2 se expresan en la placenta, el bazo, los ganglios linfáticos, el timo y el corazón. Sólo PD-L2 se expresa en páncreas, pulmón e hígado, mientras que sólo PD-L1 se expresa en hígado fetal. Ambos ligandos PD-1 están regulados al alza en monocitos y células dendríticas activados, aunque la expresión de PD-L1 es más amplia. Por ejemplo, se sabe que PD-L1 se expresa de forma constitutiva y se regula a niveles más altos en células hematopoyéticas murinas (por ejemplo, células T, células B, macrófagos, células dendríticas [CD] y mastocitos derivados de la médula ósea) y células no hematopoyéticas (por ejemplo, endoteliales, epiteliales y musculares), mientras que PD-L2 se expresa induciblemente en CD, macrófagos y mastocitos derivados de la médula ósea (véase Butte et al. (2007) Immunity 27:111).

[0088] Los ligandos de PD-1 comprenden una familia de polipéptidos que tienen ciertas características estructurales y funcionales conservadas. El término "familia", cuando se utiliza para referirse a proteínas o moléculas de ácido nucleico, se refiere a dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común y una homología de secuencia de aminoácidos o nucleótidos suficiente, tal como se define en el presente documento. Estos miembros de la familia pueden ser de origen natural o no natural y pueden proceder de la misma especie o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, así como otras proteínas distintas de origen humano o, alternativamente, puede contener homólogos de origen no humano. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.Los ligandos de PD-1 son miembros de la familia de polipéptidosB7. El término "familia B7" o "polipéptidos B7" utilizado en el presente documento incluye polipéptidos coestimuladores que comparten homología de secuencia con polipéptidos B7, por ejemplo, con B7-1, B7-2, B7h (Swallow et al. (1999) Immunity 11:423), y/o ligandos de PD-1 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Por ejemplo, las secuencias humanas B7-1 y B7-2 comparten aproximadamente un 26% de identidad de aminoácidos cuando se comparan mediante el programa BLAST del NCBI con los parámetros predeterminados (matriz Blosum62 con penalizaciones de brecha fijadas en existencia 11 y extensión 1 (véase el sitio web del NCBI). El término familia B7 también incluye variantes de estos polipéptidos que son capaces de modular la función de las células inmunitarias. La familia de moléculas B7 comparte una serie de regiones conservadas, como los dominios señal, los dominios IgV y los dominios IgC. Los dominios IgV y los dominios IgC son dominios reconocidos como miembros de la superfamilia Ig. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que presentan distintos patrones de plegamiento denominados pliegues Ig. Los pliegues de las Ig están formados por un sándwich de dos láminas p, cada una de ellas compuesta por hebras p antiparalelas de 5-10 aminoácidos con un enlace disulfuro conservado entre las dos láminas en la mayoría, pero no en todos, los dominios IgC de las moléculas Ig, TCR y MHC comparten los mismos tipos de patrones de secuencia y se denominan conjunto C1 dentro de la superfamilia Ig. Otros dominios IgC pertenecen a otros conjuntos. Los dominios IgV también comparten patrones de secuencia y se denominan dominios conjunto V. Los dominios IgV son más largos que los dominios IgC y contienen un par adicional de hebras p.

[0089] Los polipéptidos B7 preferidos son capaces de proporcionar señales coestimuladoras o inhibidoras a las células inmunitarias para, de este modo, promover o inhibir las respuestas de las células inmunitarias. Por ejemplo, los miembros de la familia B7 que se unen a receptores coestimuladores aumentan la activación y proliferación de células T, mientras que los miembros de la familia B7 que se unen a receptores inhibidores reducen la coestimulación. Además, el mismo miembro de la familia B7 puede aumentar o disminuir la coestimulación de las células T Por ejemplo, cuando se une a un receptor coestimulador, el ligando PD-1 puede inducir la coestimulación de células inmunitarias o puede inhibir la coestimulación de células inmunitarias, por ejemplo, cuando está presente en forma soluble. Cuando se unen a un receptor inhibidor, los polipéptidos del ligando PD-1 pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmunitaria. Los miembros preferidos de la familia B7 incluyen B7-1, B7-2, B7h, PD-L1 o PD-L2 y fragmentos solubles o derivados de los mismos. En una realización, los miembros de la familia B7 se unen a uno o más receptores en una célula inmunitaria, por ejemplo, CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 y/u otros receptores, y, dependiendo del receptor, tienen la capacidad de transmitir una señal inhibidora o una señal coestimuladora a una célula inmunitaria, preferiblemente una célula T.

[0090] La modulación de una señal coestimuladora tiene como resultado la modulación de la función efectora de una célula inmunitaria. Por lo tanto, el término "actividad de ligando de PD-1" incluye la capacidad de un polipéptido ligando de PD-1 de unirse a su(s) receptor(es) natural(es) (por ejemplo, PD-1 oB7-1), la capacidad de modular las señales inhibitorias o coestimuladoras de las células inmunitarias y la capacidad de modular la respuesta inmunitaria.

[0091] El término "PD-L1" se refiere a un ligando PD-1 específico. Se han identificado dos formas de moléculas PD-L1 humanas. Una forma es un polipéptido soluble natural de PD-L1, es decir, que tiene un dominio hidrofílico corto y ningún dominio transmembrana, y se denomina en el presente documento PD-L1S (mostrado en la Tabla 1 como NO ID SEC: 4). La segunda forma es un polipéptido asociado a células, es decir, que tiene un dominio transmembrana y citoplasmático, denominado en el presente documento PD-L1M (mostrado en NO ID SEC: 6). Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de biomarcadores PD-L1 humanos representativos con respecto a PDL1M también están a disposición del público en la base de datos GenBank bajo NM_014143.3 y NP_054862.1. Las proteínas PD-L1 comprenden una secuencia señal, un dominio IgV y un dominio IgC. La secuencia de señal de la NO ID SEC: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. La secuencia de señal de la NO ID SEC: 6 se muestra :desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. El dominio IgV de la NO ID SEC: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134 y el dominio IgV de NO ID SEC: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134. El dominio IgC de la NO ID SEC: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227 y el dominio IgC de NO ID SEC: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227. La cola hidrofílica de la PD-L1 ejemplificada en NO ID SEC: 4 comprende una cola hidrofílica mostrada desde aproximadamente el aminoácido 228 hasta aproximadamente el aminoácido 245. El polipéptido PD-L1 ejemplificado en NO ID SEC: 6 comprende un dominio transmembrana que se muestra desde aproximadamente los aminoácidos 239 a aproximadamente el aminoácido 259 de NO ID SEC: 6 y un dominio citoplasmático mostrado desde aproximadamente 30 aminoácidos 260 a aproximadamente aminoácidos 290 de NO ID SEC: 6. Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de PD-L1 en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, PD-L1 de ratón (NM_021893.3 y NP_068693.1), PD-L1 de rata (NM_001191954.1 y NP_001178883.1), PD-L1 de perro (XM_541302.3 y XP_541302.3), PD-L1 de vaca (NM_001163412.1 y NP_001156884.1), y PD-L1 de pollo (XM_424811.3 y XP_424811.3).

[0092] El término "PD-L2" se refiere a otro ligando PD-1 específico. PD-L2 es un miembro de la familia B7 que se expresa en diversas APC, como células dendríticas, macrófagos y mastocitos derivados de la médula ósea (Zhong et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:2405). La PD-L2 expresada por APC es capaz tanto de inhibir la activación de células T a través de la ligadura de PD-1 como de coestimular la activación de células T, a través de un mecanismo independiente de PD-1 (Shin et al. (2005) J. Exp. Med.201:1531). Además, la ligadura de PD-L2 expresada por células dendríticas da lugar a una mayor expresión de citocinas y supervivencia de las células dendríticas (Radhakrishnan et al. (2003) J. Immunol. 37:1827; Nguyen et al. (2002) J. Exp. Med. 196:1393). Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido de biomarcadores humanos representativos dePD-L2 (por ejemplo, NOs ID SEC: 7 y 8) son bien conocidos en la técnica y también están a disposición del público en la base de datos GenBank bajo NM_025239.3 y NP_079515.2. Las proteínas PD-L2 se caracterizan por elementos estructurales comunes. En algunas realizaciones, las proteínas PD-L2 incluyen al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio transmembrana, un dominio IgV, un dominio IgC, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio acitoplasmático. Por ejemplo, los aminoácidos 1-19 de NO ID SEC: 8 comprenden una secuencia señal. Tal como se utiliza en el presente documento, una "secuencia señal" o "péptido señal" sirve para dirigir un polipéptido que contiene dicha secuencia a una bicapa lipídica, y se escinde en polipéptidos secretados y unidos a membrana e incluye un péptido que contiene unos 15 o más aminoácidos que se produce en el extremo N-terminal de polipéptidos secretados y unidos a membrana y que contiene un gran número de residuos de aminoácidos hidrófobos. Por ejemplo, una secuencia señal contiene al menos unos 10-30 residuos de aminoácidos, preferiblemente unos 15- 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente unos 18-20 residuos de aminoácidos, y aún más preferiblemente unos 19 residuos de aminoácidos, y tiene al menos unos 35-65%, preferiblemente unos 38-50%, y más preferiblemente unos 40-45% de residuos de aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, valina, leucina, isoleucina o fenilalanina). En otra realización, los residuos de aminoácidos 220-243 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácidos 201-243 del polipéptido maduro comprenden un dominio transmembrana. Tal como se utiliza aquí, el término "dominio transmembrana" incluye una secuencia de aminoácidos de unos 15 residuos de aminoácidos de longitud que abarca la membrana plasmática. Más preferiblemente, un dominio transmembrana incluye unos 20, 25, 30, 35, 40 o 45 residuos de aminoácidos y abarca la membrana plasmática. Los dominios transmembrana son ricos en residuos hidrófobos y suelen tener una estructura alfa-hélice. En una realización preferida, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana son hidrofóbicos, por ejemplo, leucinas, isoleucinas, tirosinas o triptófanos. Los dominios transmembrana se describen, por ejemplo, en Zagotta, W. N. et al. (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19: 235-263. En otra realización adicional, los residuos de aminoácidos 20-120 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácidos 1-101 del polipéptido maduro comprenden un dominio IgV. Los residuos de aminoácidos 121- 219 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácidos 102 200 del polipéptido maduro comprenden un dominio IgC. Tal como se utilizan en el presente documento, los dominios IgV e IgC se reconocen en la técnica como dominios de miembros de la superfamilia Ig. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que presentan distintos patrones de plegamiento denominados pliegues Ig. Los pliegues de las Ig se componen de un sándwich de dos láminas p, cada una de ellas formada por antiparalelos (3 hebras de 5-10 aminoácidos con un enlace disulfuro conservado entre las dos láminas en la mayoría de los dominios, pero no en todos. Los dominios IgC de las moléculas Ig, TCR y MHC comparten los mismos tipos de patrones de secuencia y se denominan conjunto Cl dentro de la superfamilia Ig. Otros dominios IgC pertenecen a otros conjuntos. Los dominios IgV también comparten patrones de secuencia y se denominan dominios conjunto V. Los dominios IgV son más largos que los dominios C y forman un par adicional de filamentos. En otra realización más, los residuos de aminoácidos 1 219 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácidos 1-200 del polipéptido maduro comprenden un dominio extracelular. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dominio extracelular" representa los aminoácidos N-terminales que se extienden como una cola desde la superficie de una célula. Un dominio extracelular de la presente invención incluye un dominio IgV y un dominio IgC, y puede incluir un dominio péptido señal. En otra realización adicional, los residuos de aminoácidos 244-273 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácidos 225-273 del polipéptido maduro comprenden un dominio citoplásmático. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dominio citoplasmático" representa los aminoácidos C-terminales que se extienden como una cola en el citoplasma de una célula. Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de PD-L2 en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, PD-L2 de ratón (NM_021396.2 y NP_067371.1), PD-L2 de rata (NM_001107582.2 y NP_001101052.2), PD-L2 de perro (XM_847012.2 y XP_852105.2), PD-L2 de vaca (XM_586846.5 y XP_586846.3) y PD-L2 de chimpancé (XM_001140776.2 y XP_001140776.1).

[0093] El término "actividad de PD-L2", "actividad biológica de PD-L2" o "actividad funcional de PD-L2" se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de PD-L2 sobre una célula o tejido sensible a PD-L2, o sobre un compañero de unión del polipéptido de PD-L2, según se determine in vivo o in vitro, de acuerdo con técnicas estándar. En una realización, una actividad de PD-L2 es una actividad directa, como una asociación con un socio de unión de PD-L2. Tal como se utiliza en el presente documento, una "molécula objetivo" o "pareja de unión" es una molécula con la que un polipéptido PD-L2 se une o interactúa en la naturaleza, de tal forma que se consigue la función mediada por PD-L2. En una realización ejemplar, una molécula diana de PD-L2 es el receptor RGMb. Alternativamente, una actividad de PD-L2 es una actividad indirecta, como una actividad de señalización celular mediada por la interacción del polipéptido PD-L2 con su pareja de unión natural (es decir, macromolécula de interacción fisiológicamente relevante implicada en una función inmunitaria u otra función biológicamente relevante), por ejemplo, RGMb. Las actividades biológicas de PD-L2 se describen en el presente documento. Por ejemplo, los polipéptidos PD-L2 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades: 1) se unen a y/o modulan la actividad del receptor RGMb, PD-1 u otros socios naturales de unión de PD-L2, 2) modulan la señalización intra o intercelular, 3) modulan la activación de células inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, y 4) modulan la respuesta inmunitaria de un organismo, por ejemplo, un ratón o un organismo humano.

[0094] El término "RGMb" o "DRAGON" se refiere a un miembro de la familia de moléculas guía repulsivas anclado a glucosilfosfatidilinositol (GPI), que consta de RGMa, RGMb y RGMc/hemojuvelina (Severyn et al. (2009) Biochem J.

422:393-403). Las RGM son proteínas de membrana ancladas al glicosilfosfatidilinositol (gpi) que no señalizan directamente sino que actúan como correceptores, que modulan la actividad de los receptores de señalización mediante la unión de proteínas morfogénicas óseas (BMP) y neogenina (Conrad et al. (2010) Mol. Cell Neurosci.

43:222-231). RGMb se une directamente a BMP-2 o BMP-4, que a su vez se unen a receptores de tipo Ire (ALK1,ALK2,ALK3, yALK6) y a receptores de tipo II (BMPRII,ActRlla yActRllb)(Corradini et al. (2009) Cytokine Growth Factor Rev. 20:389-398 y Yoshioka et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:749-759). Los RGM coordinan la utilización de receptores BMP específicos (Corradini et al. (2009) Cytokine Growth Factor Rev. 20:389-398). La función de las RGM se describió originalmente en el sistema nervioso en desarrollo, donde regulan la motilidad y la adhesión de las neuronas y son fundamentales en el desarrollo embrionario (Samad et al. (2004) J. Neurosci. 24:2027-2036 y Matsunaga et al. (2004) Nat. Cell Biol. 6:749-755). Además, la expresión de RGMb se observa en macrófagos y otras células del sistema inmunitario (Xia et al. (2010) J. Immunol. 186:1369-1376). La función de la RGMb en el sistema inmunitario apenas está empezando a emerger (Galligan et al. (2007) J. Immunol. 143:2714-2722 y Xia et al. (2010) J. Immunol. 186:1369-1376). Por ejemplo, hasta ahora no se conocía la relación de la señalización RGMb-BMP-neogenina en la mediación de los trastornos respiratorios o que la modulación de dicha señalización pudiera tratar eficazmente dichos trastornos respiratorios, especialmente en la fase efector.

[0095] Los correceptores como RGMb a menudo tienen grandes dominios extracelulares con múltiples motivos que les permiten unirse a varios ligandos diferentes. Se ha demostrado que RGMb se une a neogenina (Bell et al. (2013) Science 341:77-80 y Conrad et al. (2009) Mol. Cell Neurosci. 43:222-231), proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (Samad et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:14122-14129 y Xia et al. (2010) J. Am. Soc. Nephrol. 21:666-677) y, más recientemente, el ligando de muerte programada 2 (PD-L2). Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido de biomarcadores RGMb humanos representativos (por ejemplo, NOs ID SEC: 9 y 10) son bien conocidos en la técnica y también están a disposición del público en la base de datos GenBank bajo NM_001012761.2 y NP_001012779.2. Las proteínas RGMb se caracterizan por elementos estructurales comunes. En algunas realizaciones, las proteínas RGMb comprenden dominios conservados con homología a muesca-3, fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinasa tipo II beta, proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina-2, trombospondina, precursor de efrina tipo receptor 3 ySlit-2, todos los cuales se sabe que influyen en la guía axonal, el crecimiento de neuritas y otras funciones de desarrollo neuronal. El C-terminal de RGMb también contiene un dominio hidrofóbico indicativo de un anclaje GPI extracelular de 21 aminoácidos. Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de la RGMb en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, la RGMb de ratón (NM_178615.3 y NP_848730.2), RGMb de chimpancé (XM_517848.3 y XP_517848.2), RGMb de vaca (XM_002689413.1 yXP_002689459.1), RGMb de pollo (XM_42860.3 yXP_424860.3) y RGMb de cebra (NM_001001727.1 y NP_001001727.1).

[0096] Aparte de su papel en la inmunomodulación a través de la interacción RGMb-PD-L2, RGMb también es fisiológicamente relevante para la "vía de señalización RGMb-NEO1-BMP", que se refiere a una de las vías de señalización intracelular activada por la unión de los factores BMP a los correceptores RGMb y NEO1. Sin estar limitado por la teoría, se cree que la vía de señalización RGMbNEO1-BMP señala según un modelo en el que RGMb forma un supercomplejo de señalización de receptores BMP-BMP-RGMb-Neogenina (supercomplejo BBRN). RGMb se une directamente a BMP-2 o BMP-4 como socios naturales de unión, que se unen a receptores BMP de tipo I (BMPR1a, BMPR1b, ACVR1, ACVRL1) y reclutan receptores BMP de tipo II (BMPR2, ACVR2a, ACVR2b) (Corradini et al. (2009) Cytokine Growth Factor Rev. 20:389-398 y Yoshioka et al. (2012) Eur. J. Immunol. 42:749-759). A continuación, los receptores de BMP de tipo II fosforilan a los receptores de BMP de tipo I, que fosforilan a Simad 1/5/8 o a la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) p38 y a la proteína cinasa regulada por señales extracelulares (ERK), lo que conduce a la transcripción del gen diana aguas abajo (Corradini et al. (2009) Cytokine Growth Factor Rev. 20:389-398 y Xia et al. (2010) J. Immunol. 186:1369-1376). Los RGM facilitan la utilización de ACVR2a por BMP-2/4. En ausencia de un RGM, BMP-2/4 utiliza preferentemente BMPR2 (Corradini et al. (2009) Cytokine Growth Factor Rev. 20:389-398). RGMb también puede señalar a través de neogenina como socio de unión natural y efector aguas abajo Rho, desencadenando la reordenación del citoesqueleto (Bell et al. (2013) Science 341:77-80 y Conrad et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:16423-16433). PD-L2 puede interactuar con este supercomplejo BBRN uniéndose a RGMb, y modular estas vías de señalización. Por ejemplo, la unión de PD-L2 a PD-1 provoca la fosforilación en tirosina del dominio citoplasmático de PD-1, el reclutamiento de tirosina fosfatasas, en particular SHP-2, y la atenuación de las señales del receptor de antígeno. Así, PD-L2 puede participar en tres importantes circuitos de señalización, las vías de señalización PD-1, BMP y neogenina, uniéndose a PD-1 o RGMb. En algunas realizaciones, la vía de señalización RGMb-NEO1-BMP se limita a subconjuntos de biomoléculas dentro de la vía, como RGMb, NEO1, BMP2 y BMP4, o incluso biomoléculas individuales dentro de la vía, como RGMb. Los agentes ejemplares útiles para inhibir la vía de señalización RGMb-NEO1-BMP, u otros biomarcadores descritos en el presente documento, incluyen anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, ligandos naturales, y derivados de ligandos naturales, que pueden unirse y/o inactivar o inhibir proteínas diana, o fragmentos de las mismas; así como ARN de interferencia, antisentido, aptámeros de ácidos nucleicos, etc. que pueden regular a la baja la expresión y/o actividad de ácidos nucleicos diana, o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, se puede utilizar un único agente o una combinación de agentes para interrumpir la señalización del supercomplejo BBRN. Inhibidores ejemplares de la vía de señalización RGMb-NEO1-BMP también son bien conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a inhibidores de BMP, tales como inhibidores de BMP2 y BMP4 incluyen nogina, crodina, Cer1, DAN, WISE (USAG-1), SOST (Extodina), y Gremlina, así como anticuerpos, ácidos nucleicos, y dominios extracelulares de receptores BMP tales como dominios extracelulares de activina soluble. Del mismo modo, se contemplan anticuerpos que se unen a RGMb y/o neogenina para bloquear la interacción con sus socios de unión naturales, así como el uso de dichos socios de unión naturales, o fragmentos solubles de los mismos.

[0097] El término "neogenina" se refiere a un gen que codifica la proteína NEO1. Se conocen al menos tres variantes de empalme de la neogenina humana. La secuencia de ácido nucleico de la variante de transcripción 1 está disponible como NM_002499.3, que codifica la isoforma 1 que está disponible como NP_002490.2. La variante de transcripción 2 (NM_001172623.1) carece de un exón en la región codificante en relación con la variante de transcripción 1, que codifica una isoforma más corta que la isoforma 1 (NP_001166094.1). La variante de transcripción 3 (NM_001172624.1) también carece de un exón dentro del marco en la región codificante en relación con la variante de transcripción 1, que codifica una isoforma que es más corta que la isoforma 1 (NP_001166095.1). Las proteínas neogeninas se caracterizan por elementos estructurales comunes. En algunas realizaciones, las proteínas neogenina comprenden cuatro dominios N-terminales de tipo inmunoglobulina, seis dominios fbronectina tipo III, un dominio transmembrana y un dominio C-terminal interno que comparte homología con el gen candidato a supresor tumoral, suprimido en cáncer colorrectal (DCC). Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de neogenina en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, neogenina de ratón (NM_008684.2, NP_032710.2, NM_001042752.1 y NP_001036217.1), neogenina de chimpancé (XM_510660.3, XP_510660.3, XM_003314752.1, XP_003314800.1, XM_003314751.1 y XP_003314799.1), neogenina de mono (NM_00121500.1 y NP_001248429.1), neogenina de perro (XM_005638577.1, XP_005638634.1, XM_005638581.1, XP_005638638.1, XM_005638578.1, XP_005638635.1, XM_005638579.1, XP_005638636.1, XM_005638580.1, XP_005638637.1, XM_544760.4, XP_544760.2, XM_003433937.2, XP_003433985.1, XM_003433936.2 y XP_003433984.1), neogenina de vaca (XM_005211431.1, XP_005211488.1, XM_005211432.1, XP_005211489.1, XM_002690492.3, XP_002690538.1, XM_003586508.2, XP_003586556.1, XM_005211433.1, XP_005211490.1, XM_003586507.2 y XP_003586555.1), neogenina de rata (XM_006243186.1 y XP_006243248.1), neogenina de pollo (XM_004943656.1, XP_004943713.1, XM_004943654.1, XP_004943711.1, XM_004943655.1, XP_004943712.1, XM_413704.4, XP_413704.4, XM_004943657.1, y XP_004943714.1), y neogenina de cebra (NM_173218.1 y NP_775325.1).

[0098] El término "BMP" se refiere a una familia con más de 20 miembros relacionados con la familia del factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) (Bragdon et al. (2011) Cell Signal. 23:609-620 y Yoshioka et al.(2012) Eur. J. Immunol. 42:749-759). La señalización se inicia cuando un ligando de BMP se une a complejos de dos receptores de serina/treonina quinasa de tipo I y dos de tipo II. Los receptores de tipo II constitutivamente activos fosforilan a los receptores de tipo I, que fosforilan a las proteínas Smad. La subfamilia BMP señala a través de un conjunto de Smads activadas por el receptor (Smad1, Smad5 y Smad8), mientras que la subfamilia TGF-p señala a través de otro conjunto (Smad2 y Smad3). Las Smads fosforiladas activadas por el receptor forman complejos heteroméricos con el mediador común Smad4, y los complejos Smad se translocan al núcleo, donde modulan la transcripción génica. La regulación de esta vía se produce a múltiples niveles con el fin de generar especificidad y afinar estas señales. Un mecanismo regulador clave es la promoción o inhibición de la unión del ligando por los coreceptores. Los miembros de la familia RGM RGMa y RGMb (DRAGON) son los primeros correceptores descritos para la subfamilia BMP Tanto el RGMa como el RGMb se unen selectivamente a los ligandos BMP-2 y BMP-4, interactúan con los receptores BMP y potencian las respuestas celulares a los ligandos BMP (Samad et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:14122-14129; Babitt et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:29820-29827 (2005); y Shi et al. (2003) Cell 113:685-700).

[0099] Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de biomarcadores BMP2 humanos representativos (por ejemplo, NOs ID SEC: 13 y 14) son bien conocidas en la técnica y también están disponibles al público en la base de datos theGenBank bajo NM_001012761.2 y NP_001012779.2 (preproteína en los residuos 1-396, péptido señal en los residuos 1-23, proproteína en los residuos 24-396, y el péptido maduro en los residuos 283-396). Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de BMP2 en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, BMP2 de ratón (NM_007553.3 y NP_031579.2 con preproteína en los residuos 1-394, péptido señal en los residuos 1-23, proproteína en los residuos 24-394, y el péptido maduro en los residuos 281-394), BMP2 de chimpancé (XM_514508.2 y XP_514508.2), BMP2 de mono (XM_001115987.1 y XP_001115987.1), BMP2 de perro (XM_534351.4 y XP_534351.2), BMP2 de vaca (NM_001099141.1 y NP_001092611.1), BMP2 de rata (NM_017178.1 y NP_058874.1), BMP2 de pollo (NM_204358.1 y NP_989689.1) y BMP2 de cebra (NM_131360.1 y NP_571435.1).

[0100] Se conocen al menos tres variantes de empalme de la BMP4 humana. La secuencia de ácido nucleico de la variante de transcripción 1 está disponible como NM_001202.4. La variante de transcripción 2 (NM_130850.2) y la variante 3 (NM_130851.2) difieren de la variante de transcripción 1 únicamente en la región 5' no traducida (5' UTR), de modo que las tres variantes codifican la misma proteína (NP_001193.2, NP_570911.2 y NP_570912.2) (preproteína en los residuos 1-408, péptido señal en los residuos 1-24, proproteína en los residuos 36-275 y, en algunas realizaciones, el péptido maduro en los residuos 308-408). Además, las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de los ortólogos de BMP4 en organismos distintos de los humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, BMP4 de ratón (NM_007554.2 y NP_031580. 2 con preproteína en los residuos 1-408, péptido señal en los residuos 1-19, proproteína en los residuos 36-276 y, en algunas realizaciones, el péptido maduro en los residuos 308-408), BMP4 de chimpancé (XM_509954.3, XP_509954. 3, XM_003314329.1, XP_003314377.1, XM_003314330.1 y XP_003314378.1), BMP4 de mono (XM_001084801.2, XP_001084801.1, XM_001084680.2, XP_001084680.1, XM_002805069.1, XP_002805115.1, XM_001084317. 1 y XP_001084317.1), BMP4 de perro (NM_001287170.1 y NP_001274099.1), BMP4 de vaca (NM_001045877.1 y NP_001039342.1), BMP4 de rata (NM_012827.2 y NP_036959.2) y BMP4 de cebra (NM_131342.2 y NP_571417.1).

Tabla 1

NO ID SEC: 1 Secuencia de ADNc de PD-1 humano

��

a r g a q c g tq agg g cc rgg oqc a a t gae age ggo acc t a c la i K i t S e r Val Val Arg A la Arg Arg Aan Aap S e r Si y T hr T y r 110 115 120

qog gco ■ t c t o e o t q ■gee r o e ■ag gcq cag n t c naa ?»9 a g e Leu Al$ Pr:> T.ye A le Gln H e Lys Glu S e r

120 115

g t g a c a q^g aga agg gca g aa g tg ccc aca.

V a l T hr S l u Arg Arg A la <31 u V al Pro T h r

n o n i15 n

gee ; a c e r e ¿ g e c ; ; t e a r o e agg t e a g e e g g r cag r t ; c aa a r o e r g A la Ule t r o 5a r L'rc S e r 1‘r o Arg Ser A la Gly Gln Pbe Gln T hr Leu.

155 160 165

g rg g t t g g t g t c g tg g g c ggo i:-tg e rg ggo ago o tg g tg o tg o r a g r o Val Val Gl V Val V al G ly Gly Lru Leu Gly l e í Leu V al Leu leu. Val iioUS i so IBb

;gg g e e gca ega ggg a c a a r a gga Arg A la A la Arg G ly T h r l i o Gly

1 SO 1 S5 200

;g u a c c g g ; c a g ro o ; r g a eg gag g a e c c c t e a gee g rg c c t Arg T hr Gly Gln ? r o Leu Lya Glu Asp Pro S e r A la Val P ío

205210 215

t e t g t g g*ic t a tgg9gee t . t - CA^- 5?CCÍ oeg S e r V al Asp T yr Gly Glu Leu Aap Ph* Glsi<7 i ;j>Arg Glu I*ys 220 325 25 D

gag c c c c c c g tg c c c - g t g t c cct. g¿g cag acg gag t a t g e e Glu P ro P ro Val P ro Cya Val P ro Glu Gln T'br Glu T yr Ala 235 243 245

<bc>:<i>: att gtc tte cct age■59*¡3t99:1':ACC tea tcc ccc gee cgc^■aB I" Thr lie Val Phe Pro Ser Gly Hat Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg

250 255 260 205

q q q Cea q c t ¿jar: <J<<7>C c c t cq q a q t q e e c a g e t c a q q c e t g ag g a t S07

Gly Sfir Al4 Aíf>GlyFtO At<JSet AlA (41ti Pr[i L*U AlíJ PlOGlU Ss[>

270 2 V.5 280

■gqs Ga-c tgc tet tgg gc-c ctt t gac-rggcti cc11ggreac cngrgttatg cag £?21G ly Hi 5 Cys £ c i T r p P ro Leu

285

NO ID SEC: 2 Secuencia de Aminoácido de PD-L1 Humano

210 215 220

Glu Leu Aíp PlneGlr. Trp Arg Glu Lys Tlnr Pro GluPro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cyí val ProGluGlu Thr GiuTyr Ala Thr lie Val Fhí Pro 5*1 Gly

245 250 255

MeU Gly TlnrSer Ser Pro AlaAte AtgGly Set Ala Asp G".y ProArg

¿SO 2$5 270

Ser Ala GluPro Lou Arg Pro GiuAspGly Fiia Cys Sor Trp Pro Ion

275 230 235

NO ID SEC: 3 Secuencia ácida del ADNc de PD-L1S humano

gct-tcccgag ■gctcc-vcacc agccgcgcct ct<gtc cget t t?ca<gggcatc ccagaiaag 53 arga 99atai ttr gct gtc ata ttc atg acc tac tgg cat ttg ctg 106 líet Arg H e Fhe Ala val ?he lie Fíie Mee. Thr Tyr Tlfi HÍS Leu Leu.

: s 10 15

SlK' gca ttc act g Le acg gtt ecc aag gac el u tat gLg gta gng tat 154

Lys Asp Leu T y r v a l v a 1 G‘- U Tyv

25 30

a a a t t c c t a g t a g a a a a a ■:aa t í a 202 t i l y S e r Asr. Mat T h r l i e u l e Cys Lya P h e P r o v a l<g>L<j>L ya Glri L eu 35 40 05

g a c ■ctg g c t g c a C t a uLL g t c LaL Lgy g a a ■.r L y g a g gii L a u g í i l t a t L 250 A s p LSU A l a A l a L eu l i e V a l T y r T 1 p O l e Mat G lu A s p L y s A<sm>l i e 50 55 60

■i LL t a a t t t g l g cn L g g a L-H g a a g a c 5 t g a . ig yLL c a g c a l . agL a g e l i e C l r . P h c V a l E-Iit 01 y O l e G lu A s p L eu Lya V a l G ln H i s S e r S e r 65 10 75 30 t a c a g a c a g 391 r c e c g g c t g t t g a a g g a c c a g e t c t c c c c g g g a a a t 046 T y r A t g S lr : .Ai g A l a A r g L eu Lrru. Lya A s p G ln L eu S e r L eu C-Iy As:i 05 50 55 g c t g c a c t : c a g a t e a t a g a t g t g a a a t t g c a g g a t g c a999 979t a c 354 A l a A l a L eu Gil". l i a T h r A s p V a l Lya L eu Gil". A s p A l a G l y V a l T y r IDO 1 U5 110 c g c t g c a t g a t e a g e t a t g g t g g t g t c g a c t a c a a g c g a a t t a c t Q79 442 A rgC'J*Mee l i e S e r T y r G ly G ly A l a A s p T y r L y s A r g H e T h r V a l 115 120 125

a a a g L c » n t9 «c e a t a c a . i c a a a a L c a . i c c « a a g a al,L L tg y t L g t g 4?3 i y s V a l Asr. A l a P ie . T y r Asi: Lys l i e Asr. G ln A r g H e L eu V a l V a l 130 135 i 10

g a l C e a g L c u c c Le L g u c a L g a u cL g a t a LgL c a g g eL 9¡T9 y g e L uc 536 A s p P r o V a l T h r 2 c r O l e H i s O l e L e e T h r Cya G ln A l a G l u G l y T y r 145 150 155 160 e c t a a g g 4 a g l .c H eL-9Pa ::a a g e a g 1- e s e c a l . C3.1 g t c c t g agL 5fif. P r o l y 3 A l a G l u V a l l i e T r p T h r S e r S c r A s p H i s G ln Vn i L eu S e r 105 170 175 g g t a aqa c c a c c a c c a t e a a t t c c a a g a g a g a g g a g a a g c t t t t c a a t 634 Gl y :.ya Th r T h r T h r T h r flsr. 5 a r i .ys A rg G1 U Gl u T.ya T.e.j P h e R sn IDO 105 150 g t g a c c a g e a : a c t g a g a a t c a a c a t a a t a a t t a a t g a g a t t t t c t a c £32 V a l T b r S e r T h r L e e A r g H e Aar. T h r T h r T h r Asr. Gl'.J H e Ph.e 'i' y 1

1 35 2Ü0 205

L y c ■acL t t t n g g a g a L ia g a L CC L y a g g a u a a c Ca L ^^ca geL g a a L tg 730 C ys T h r P h e A r g A r g L e e A ap P r o O l e O l e Asi: H i s T h r A l a S l u L eu 2 10 215

g t t a t e c t A 991 a n L i t t t t g a a L 9 L-1 Lee a L L a a a a t a t g t c t a n c a 77 0 V a l r i o P r o 01 y Asr. H e L eu A s e V a l S e r l i e Lys H e Cvo L eu T h r 225 230 2 35 240 C t g t e nCCKa g e a c c r .^ g e a t g a t . g t e t q r C í t a t e a t a g t c a t t c a g r g a t r g r t 033 Leu. S e r P í o S e r T h r

245

gaataaatga atgaatgaa t aacactatgt ttacaaaata tatcctaatc cctoacctoc 303 attcatccaa accatattg t taettaataa aeatteagta gatatttstg gaataaaaaa 333 aaaaaaaaaa aaaaa 363 NO ID SEC: 4 Secuencia de aminoácidos de PD-L1S humano

Met A rg l i e Fhe ALa Val Fhe l i e Fhe Mer T h r T y r T r p H i s Leu Leu 1 5 10 15 As-n A la File T h r Val T h r Val F r o Lya A ip Leu T y r V a l V a l Glu T yr ¿Ü 35 30 ' G ly S e r Arr. Mer l a r l i e Glu Oye Lya Plae P r o V a l Glu Lya Glu Leu 35i0 ¿5

Aar- l e u A l a A l a Leu l i e V a l T y r T r p G lu Met G lu Aap Lya Asn l i e 50 55 60 '

L io Glr. Phe V a l H i s G ly Glu G lu A ip Leu Lys V a l G_n H i s Gor Gor

ó 5 70 75 00 T y r Arg Glr. Arg A l a Arg Leu Leu Lys Arp Glr. Leu S e r l e u G ly Asn B5 30 55 A la A.l a T.er 51 n 71 e T hr Ai p V al T.ya Leu 61 n Asp A l a Gly Val T y r 100 135 110

Arg Cyr Mee l i e S e r T y r G ly G ly A l a A ip T y r Lys A rg l i e T hr V a l 115 120 125

i y iv a l A¿r. A la P r o T y r Asr. Lya l i e Airt G l r .Arg l i e Leu v a l v a l 130 135 n o

Aatí P ro V a l l i a r S e r Glu HÍ3 Glu Leu T hr Gys G l r A l a Glu Gly T yr145150 155 160 Pro l y<3>A la Glu V a l l i e T r p T h r S o r S o r A ip H is 01 n V a l Leu S e r 155 170 175 51yl y e T h r T hr T h r T hr Air. S e r Lya Arq( Glu Glu L ys Leu Pire Asn 180 155 190

V al T h r S e r T h r Leu Arg l i o Aír. T h r T h r T h r A s r Glu l i o Pho T yr 195 230 235

cy$ Th r Phe Ai r Ai<:t>T.ÍU A ip P ro ül ¡i 0111 Air- T ' i í T h r A la Glu Leu2L0215 220

V al l i e P ro Gly Asr. l i e Leu Air. V a l S e r I l e Lys l i eCys Leu T hr 325 230 235 2^.0 Leu S e r P ro S o r T h r

245

NO ID SEC: 5 Secuencia de ADNc de PD-L1M humano

c g a g g c t c c g c a c c a g c c g c c c t t c t g t c c g c c t g c a c g g c a t t c c a g a a a g a t g a g g M* L Ar g 1 a t a e t t g c t g t c t t t a t a t t c a t g a c c t a c t g g c a t t t g c t g a a c g c a 106 H e Phe Aid Val Phe Ti e Plie Mét- T h r Tyr T rp Hi 3<T .fi'.J>Leu Asm A la 0 10 13

e t c a c t e t c a c c g t t e t c a a c g a c c t a t a t g t g g t a g ag t a t g g t a g e 154 Phe T h r Val T hr Val P ro Lya A íp Lílü T yr Vsl Val G" .j T yr G ly ■Ttrí 20 25 10

a a t a t g a t a a t e g a a t g c a a a t t c c e a g t a g a a a a a c a a t t a g a c c t g 202 Aa-n H a t T h r L ia e l e C y e Lya Phe P ro Val Glu Lya □ 1: i Leu Asp Leu 35 40 45<5>: g c t g c a c t a a t e g t c t a t t g g g aa a t g gag g a t a a g a a c a t t a t t c a a 253 Al a A la T.ÍL T l e V al T y r T rp Gl e Me t Gl e Asp T.ya Asn l i e l i e Glu 556065 e t c ■Itg c a t gga g ag g a a g a c c t g a a g g t t c a g c a t a g t a g e t a c a g a 29D Phe Valí Hl S Gl y e l e e l e<A s p>Leu Lyd v a l G ln ni s S e rSKIT yr Arg 70 75 00 cag a g g g e e cgg c t g t t g a a g g a c c a g e t c t c c c t g g g a a a t g c t g c a 34 6 Gl<n.>A r g A la Arg Lee Lee Lya Asp O le Lee S e r Leu Gl y Aan A la A la $5 30 h3

e t c ■cag a t e a t a g a t g t g a a a t t g c a g g a t g c agjg g t g t a c c g c t g c 394 :,eu Gl r. T h r A-‘¡p Va 1 T.ya T.fit Gl r. Asp A id Gl V Va 1 T yr Arg Cys 100 105 l i ó

a t g a t e a g e cae g g t 5-4t g e e g a c t a c a a g c g a a t t a c t g^g a a a g t c 442 Met L ia S e r Ty r e l y Gly A la Asp T y t Lya A rg l i e T h r V al Lya V al 1 L5 120 125 i i : a a t g e e c e a t a c a a c a a a a t e a a c c a a a g a a t t t t g g t t 9^g g a t ■tea 45: flan fl.l a PEO Tv r ftsr. Lya Abr Gl r. A rg l i e T.e-e Va L Va 1. Aep F re 135 140 14.5 g t c a c c t e t g a a c a t g a a c t g a c a t g t c a g g c t gag g g c t a c c c c a a g 53D Val T hr s e r Gl u en s e l e T.ee T hr Cys Gl r. Al a Gl e Gl y T yr F re T.ya 150 135 160 ■gee g a a g t c a t e t g g a t a a g e a g t g a c c a t c a a g t c c t g a g t g g t a a g 50 5

A la G lu Val l i e T rp T hr S e r S e r Aí P HisGln Val l.eu S e r G ly l.ya 165 n : 175

a c c a c c a c c ECC ¿ a t t c c a a g a c a gag geg a a g e t c t t c a a t g t g a c c 634 T h r T h r T hr Til r ASP s e r T .ya Atg Glu GllJ r.ys T.en Phe Asn Va 1 Tli r ISO 153 150

a g e a c a c t g a g a e t c a a c a c a a c a a c t a e t geg a t t t t c t a c t g c a c t C02 Fier T hr T.a-u Arg T ía ASP r h r T h r T hr As n Glu Ti e ? h e T yr Gys T h r 103 200 203 210 t t t a g g a g a t t e g a t c c t geg g a a a a c c e t a c a g c t g a a t t g g t c e t c 730 Phe A tg A tg Leu Asp Pro G lu L-lu As n His T h r f l l a Glu Leu V al l i e 215 120 225 c e a g a a c t a c c t c t g g c a c a t c c t cea a e t g e a a g g a c t c a e t t g g c a 773 P r o G lu Leu P r o Leu a :la H ia t r o E ro Aan G lu f l -g Th r H is Leu V a l 230 235 240 a t t c t g ■cga g e e a t e t t a t t a t g c c t t g g t g t a g en c t g e c o t t c a t e 326 l i e Lee G ly A l e l i e Leu Leu Cys l e u G ly V al A la Leu T hr The l i e 24 5 250 255

t t c cgc t t a a g a a¿ia 909 a g a a t g a t g g a t g t g a a a a a a t g t ggc a t e 074 The A rg Leu A r g Lys G ly Arg t f e t t fe t A sp V al Ly s Lys Cys Gly l i e

260 265 270

e s a g a t n Cd t e * a«<j nmj c a a « g t g a l Ge* c a l t t g0*9 9*9a c g 522 G ln Asp The A an S e r Lya Lys t l n S e r A sp T h r H is Leu Glu Glu T h r 275 ' 2 a : 205 2 í :

t a a t c c a g c a t t g g a a c t c e t g a t c t t c a a g c a g g g a t t e t c a a c c t g t g g t t t a g g g g t ?52 t c a t c g g g g c t g a g c g t g a c a a g a g g a a g g a a t g g g c c c g t g g g a t g c a g g c a a c g t g g g 1042 a c t t a a a g g g c c c a a g c a c t l a a a t g g a s C C tg g q g a a a q c e g a q q a g q a q a e t q e a g a 1102 a a g a t g g a g t c a a a c a g g g a g c c t g g a g g g a g a c c t t g e t a c c t c c a a a t g e e t g a g g g g 1162 c t c a t c g a c g c c t g t g a c a g g g a g a a a g g a t a c t t c t g e a c e a g g a g c c t c c a e g c a e a t 1222 c a t e c a t t g c t c a t c c t a g g a a g e c g g g t t g a g a a t c c c t a a t t t q e q g q t c a g t t c c t g 1202 c a g a a g e g e t C t t t g c C tC C ■actcaftl g e e L ona L L L g L L t t c L g o a t g a u t g a g a g t c l 1342 c a g t g t t g g a a c g g g a c a g t a c t c a c g c a t g a g t t t t t c c t a c t c a t t t t g a g t c t g t g a<1 4 : 2>q q te c t .c t . r .q t c a t q t g o q t g t g qt. t g t g a a t e a t t t t t t t t q a e q e t a t a t t g t e q t a g 1462aLg 1 ' t a c a n ! LLLyLcgeea a n o t a i a c l L g o t g c t l a a t g a t L . g e t e a c a t c t a g t a a 1322 a a c a t g g e g t a t t t g t a a a a a a a an an an a a 1553 NO ID SEC: 6 Secuencia de aminoácidos de PD-L1M humano

H et A rg l i e Che A la v a l i’e e l i e i’e e Meo T e r T y r ’J' rp H is Leu Leu 1 5 10 15

A sn A la ?:ie T h r V al T e r V al P r y Lys A-i p Leu T y r V a l V a l Glu Tyr 20 25 30

G ly S e r Alt. Mee Te r l i e 51 u Cys Lya l e e I r o V a l 51 u Lya Glu Leu 35 40 45

A s ? l e v A la A l a Leu l i e V a . T y r T r p 01 u Meo 51 u Aap Ly= As n l i e 50 55 60

L ie G1 n Pee V a l Ula 51 y 5Lu 5 l u Aap Leu Lya V a l 51 n d í a S e r S e r e s 70 75 00

T yr Arg G ln A rg A la Arg Leu Leu Lys A íp 5Lr. Leu S e r Leu G ly Asn ES 30 35

A la AlAT.ev 31 n 1 Le T h r A ip V a l T.ys T.ÍU Si n A tp A l tG\-JVa 1 T y r

100 10b LIO

Arg Cy = Met l i e S e r T y r 5Ly 51v A la A ip T y r Lya Arg l i eThrV a l

l LA 150 125

l y sv a lASf. A l a P í o T y r ASf. Lys 11* Air: T in A rg 11* Leu V a l V a l

130 135 n o

ASTl P ro Val T b r S e r 5 l u Kis 5 l u Leu T e r Cya Glr. A la Glu Gly T v r

1 Í 5 ISO155160

P ro Lya A la Glu V al l i e T r p T e r S e r S e r Asp K is 51 n V a l Leu S e r

1 e s 170175

G ly iy-s T e r T h r T h r T e r A i r S e r Lya Ai■;01 u 51 u Lya Leu Phe Asn

130 135 L90

V al Til r S e r T h r Leu Arg 1 Le Asr. T e r T e r T e r Asu 51 u l i e L'he T y r

13b 200205

Cya T h r Pee A rg Arg Leu A;: p P r o 5Lu 5Lu Aar.KisT e r A la C lu Leu

2 10 215 220

V al r i ? t o Si u T.eu P r e T.eu Al a Hl a P r e PtO A sn 5 l u Arg T h r H ia

225n o 23b240 l e u v a l l i e Leus iy A la l i e Leu Leu 5ya Leu 51 y V al A la Leu T h r

2452S0255

Phe T p LYS c y *

270

í l y H e Oír. Aap T e r Aar. S e r Lya Lys 51 r. S e r Asp T e r H ia Leu Glu

275 330205

C lu T b r

2 00

NO ID SEC: 7 Secuencia de ADNc de PD-L2 humano

a t e a t e t . t c e t c ct.g c t a a r g r.r.g a g e e r g ga a t t g c a g c t t c a e c a g 43 Met. I ' .e Phe l.eu l.eu 1 ,eu Met l.eurl.eu G lu l.eu G ln l.eu H i s G ln 1 5 10 15

a ta gca g c t t t at t c a c a g t g a c a g t c c c t t a g g a a c t g t a c a t a a t a 05l i e A la A la le uPho T h r v a l T hr v a l PIO L y s G lu LtU T y r l i e l i e 20 25 s ogagQ ñ ~ggc ageaar . g t e a c c C tg g a a t g c a a e t t t . ga<7 a c t . g g a a g e 144 G lu KLa G ly S e r Ase Val T e r l.eu G1 u C ys As n Phe A sp T h r G l y Gei

35 40 45

c a t g u g a a r c : t gga g c a a “ a a r a q c c a g t t t g c a a a a g g t g g a a s e r 151 H i a V a l Asn l e u G ly A la l i e T h r A l a S e r Leu G ln Lya V a l G lu Aa u 53 55 60

g a t a c a t e t c e a c a e c q t g a a a g a g e e a c t t t g c t g gag g a g c a g c t g 140 Asp T h r 1 e r E ro H is A rg G lu A rg A l a T h r Leu l e u G l u G lu G lu L eu 6b 70 7 b 33 c c c c t a a a g g e e t cg t t c c a o a t a c c t c a a g t c c a a g t g a c g g a c : s s f r o L e a t i y L y s A l a s e r Phe<H L S>H e P r o f i l n V a l G lh V a l Arq Asp

65 30 35

g a = g g a c a g t a c c a a t g c a t a a t e a t e t a t 599 g t c g e e t g g g e e t a c 33 E GIu G i y C-IlL T y r Glrt Gys L i e l i e Ii<_> T y r Giy V i l A la T r p A sp T y r LOÓ 1L5 113 a a g t a c C tg a c t c t g a a e g t c a a a g c t t c c t a c a g g a a a a t a a e c a c t 334 T.y» T y r T.fti: T h r T.eu Lys Val l.ys A la s e r T y r Arg i .ya l i e Asr. T h r 115 123 125

<Ca-C>a t e c t a a a g g t t c e a g a a a r a9 - -g e e g t a g ag e t c a c c t g c c a g 432 H i s l i a L í e L ysV a l F i o C l u T h r A sp C lu V a l C l u Leu T h r C ys G lh 130 156 14 0

y r_: L n t a ggL Ea L coL c t g g e e ya j y La. Lee Lgg u v a i tae g Le a g e g l L 430 Al a Til r t i y T y r P r o l e í : A l a G 1M V al S e r T r p P r o Asn Va 1 S e r Val 145 L5F 155 1 60 c c t g e e a a c a c c a g e c a e t c c agg a c c c c t gao g g t o t e t o e c e q g t c 528 P ro A l a Ase T h r S e t H i t S e r Arg T hr P ro Giu G ly Leu T y r Glr. V a l 165 170 175 a c c a g t g t t c t g t i l o o t a a a g t e a e c o c c t g g c a g a a a t t t c a g e t g t 576 T hr 5e i ' v a l _,eu A rg Leu. L y s PIO FIO P i n G i y A rg Asn Phe S i l C ys<L f iÓ>165 103 q t ¡ : t a c t c q a a t a c t c a e q t q a g g g a a c t t a c t t t q q c c a q c a t t q a c 624 V al Phe T r p Asa T h r Hi2V a l Arg G lu Leu T h r L en A la Se r l i e Asp 155 233 2 35

cLL c a a i g L c u g u"_g g a a<C U C>agg a t o t a l c e a a t i t g g c Lg cLL t i l ü 672 Leu C . n S i l C í a Mftt G lu F r u Al g T h r H i s Pee GTli T r p L e u L eu H i í 210215 226

a t t t t c a t e CCC tCC t.CC: a t e a t t q c t t t c a t t t t c a t a c c c a c a g t g 7 20 i 1 e Phe l l e P ro s e r C ys l i e 1 Le A la Phe 1 Le P h e i 1 e A l a T h r Val 225 25C 235 240 a t a g e e c t a a g o a a a c a a o t e t g t c a a a a g c t g t a t t e t t o o a e a g a c 7 68 l i e A l a A tg l y * Glft L eu c y ¿ Glrt L ys L e u T y i S e r 3 e r L y s A sp 245 250 255 a r a a r a a a s a g a c c t e t c a c c a c a a c a a a g a g g g a a 9 t g a a c a c t . q c t BU» T h r TilTLya Arg P r o Val T h r T h í T h r<1>,y s Arg t i c Va 1 Aan $ e r Al ¿

2 SO 255 273 a t e 319 l i e

NO ID SEC: 8 Secuencia de aminoácidos de PD-L2 humano

Me L 11 * Ph* Lo- .i L eu L au M*t Leu S u r Luu G lu L e u G lh H ia G lh 1 5 10 15 r í e A la A l a L eu F h s T h r v a l T hr V a l F ro Lya G l u Leu r y r l i s r í e 20 25 3C G lu H i3 C l y S e r As n v a l T h r Leu G lu Gys Aan Ph* A*p T h r c l y 3 e r 35 40 45

H l a V a l A í h Lo- .1 G ly A l a l i e T h r A la S u r Leu G l n L y s V a l G lu Asn 50 55 eo

Asp T in S e r P r o HÍ3 A rg Gln Arg A la T h r Leu L eu c-lu G lu G ln Leu 65 70 7.5 SO P rn 1 ,e ■.: G ly l.ys A la S e r P h e :h i e 1 l e P ro Gl O v a l Gl u v a l A rq Asp S5 50 35

G lu G ly G ln T y r G1 r. C ys l i e r í e l i e T y r G l y Va L A l a T r p A sp T y r 100 105 110 Lyo T y r L eu T h r L eu Lya V a l L y s A l a ¿ e r T y r A rg L y s l i e Aor. T h r 115 120 125

H la 1 1 * L au LyS v a l P ro G lu T h r ASp G lu V a l G l u Leu T h r C ys G ln 110 1 35 140

A la Tai- G ly T y r E>rc L e u A la G lu V a l S e r T r p P r o Asn V a l Se r V a l 115 150 155 ISO P ro A la Ae n T hr ■Ser H lc S e r A rg T h r P r o G lu G l y L eu T y r G ln V a l i e s 170 175 T hr S e r v a l Lev A rg Leu Lys P r o F ro P r o G l y A rg Asn Phe S e r C ys 180 135 IDO V al Fine T r p Asr. T h r K i s V a l A rg G lu L eu T h r L e u A l a S e r l i e A sp 195 200 20 b

Leu G l n S a r G ln Mu t G lu P r o Al g T h r H l a P r o T h r T r p L e u Leu H ia 210 2 15 220

1 l e Phe l i e P ro S e r Cye H e Lie Al a Phe l i e Phe l i e A le T h r V a l 225 130 135 24 C l i e A l a L eu Arg L y s G lh L eu C y s G ln l y £■ Leu T y r S u r S e r Ly* A sp 24S 2.50 255 T h r r h r l.ys A rg Po ¡1 Val 'I'hq T h r T hr Lys- Avq G 0 u Val A. a r, s e r A la 260 2 65 270 r í e

NO ID SEC: 9 Secuencia del ADNc de la RGMb humano

1 a t g a t a a q g a a g a a g a q q a a quqaaqrjqi-q c c c c c c g g c c c a t g c c g c a g c c a c g g g c c c 61 a g n e c o g e r á o g g o g c o o g c g o o g c o g o o o togoeggagc c í n ^ g a g a c í t g o n t g ga og 121 g g c a r g g g c t t g a g a q c a g c a c r t t c r a g c g c c g u c g c t g o i g z c g c c g a g g t t g a g c a g 191cyzcqcaqecccgqgc:tir:tg ccc c-rjuqucg c t g g a g u h g ctgctqotgctgctqttcagc 24 1 e te g g g c L g u tCCaCgCayg t g a q t g t c a a t a g t c í i g t o t ftatgtogaaiccaqaaatqc 301<a o c i e g g a Ct>tc g tg to o c t g a e t t o t o a o o fcg'Aa c t e t g u-sg Ltgiiogg o t t t g n o t u t 351 g a g t r t r g c a a g g c c r t g c g C g ccC aC g ct g g c t g c a c c c a g c g a a c t i c a a a a g c u r g c 421 c g t q g c a a c c t g g t a t a c c a t t ^ t g c c g t g t t g q g t a t c - aqtgacctcstgagccagagg JS1 f tS tL gL tC tA a q y j tg g a o C c a c a t c e t c t ace*ac:<:[:cg aagLgateca l.:gAt<:.:Lt. y e 541 arurt-ntCSCA gco-nogct gg Agco-ngggaa oao A g g ag ag gggatcagaa OCOÍOCOagt 601 t a c i i t r t r t g t g g c t t g t t t g g a g a t c c t □ a c c t c a g a a c t i t c a a g g a t a a c t i c c a a f ie l a o a t q o a a a q t a g a a q q q q c r t q q i c a c t c a t a q u t a a t a a t7 a 7 C 7 t 7 C a g t t c a a g t g 721 a c a a A C g t íC C t g t g q l . u c e irggai.ctagr. gctaítgctacaaataagatÍ S Í t f t t t a t C 761 L L-uiaagooo a coa t g í g t g L a tag a L c a y aaagtetaot a a g o r g c g a o a g a ; g a í c t g C41 r e g g c o g e c t t r g r g g a t g g c a c e a e c a g t g g t g g g g a c a g e g u 7 g c c n a g n g c o r g c g T P 01 a t cg r g g aa a g g g a g a g t g g o c a c t a t g t g g a g a t g e a e g c c c g c t a t a t a g g g a c c a c a <h51 g r .q f t t tg tq fc q i í :ag : | t . : rgg t c q o t a c c h q accct tejida I r c c g t a ^ g c c t g a a g ñ c c t g l d f l g e e a t g c e e taegaggagagc c a g g a c c L g e a g e t g i g o g t g a a c g g e t g e e e e e c g a g t 1061 g a n o g o n t c g a r g a o g g g o a g g g o c a g g t g tOtgOCEtOC tg g g a o n o n g o c t g o c t c g c 1141 a c c t c o r t g g t g o a g g c c t g g c c t g g o t a c a c a c t g g a g a c t g r c a a c a c t c a a t g 7 ca7121j 1 g a g a a g a t g - r c a g t g a a g g a o E t c t a t t t c c a g t c c t g t g t 77 t c g a c c t g o t e a e r a u t 1 ¡1 í> 1 g g c g a t g e e aa e t t tn e tg ec g e a g c c c A t a g l g c c t t g g íiygatgcgga g g c c t c g t a c 1321 c caa gqiiagq a a o g e t g g c a OEttttCOOO a g o a g t g g o a a t g q g a o t c o c c g r g g a g g c 1351 a g r g a t r t g t ■7 r g i oa g r c i a g g a c t c a c e t g e C t g a t e e C t a t c g z g i t t 7 t g t ag NO ID SEC: 10 Secuencia de aminoácidos de la RGMb humano

Lir.irkkrkrsa ppqpaiz hqp ipatapappp apaptrpawa qnglrampas aaaaaaeveg

61 urspgieppp L i í i l l l L l í s IglLharjdeq qpíiqdEiqüte t-td ívra ltsh ln*<i '-'dq fds

1?1 efoka1raya qotqrt:sitad r g n l v y h e a v '.giidl^is-qrincaltáqptsstnpevthidpc

lííl nyhshagar* hrrgd.qnpps yltcgligdp hlrtftdnfq t ckYega.wp± idnnyLsvqv

211 tnupvvpgas atatnKLtii f kahbectdq fcvyqavtddl paafvdgtts ggdsdakslr

301 ivíi*sgh.yY emharyigt L vfVrqvgryl tlairmpedl aittsyteíqdl qlcvngtpls

361 ariddgqgqv aailghalpr talirqawpgy tletantqch ekmpvkdiyf gsavfdllta

121 gdanitaaali Ealodvcalh p i kdzwhi ip EEgngtprgg sdlavslglt c-lilivtl

II. Métodos de Tratamiento de los Trastornos que se Benefician de las Respuestas Inmunitarias Reguladas al Alza

a. Agentes útiles para Regular las Respuestas Inmunitarias al Alza

[0101] Se demuestra en el presente documento que inhibir o bloquear simultáneamente tanto la función de RGMb como la de PD-1 bloquea sorprendentemente el establecimiento y la progresión de neoplasias malignas (por ejemplo, cáncer colorrectal) en animales. Por lo tanto, los agentes de la presente invención descritos en el presente documento que modulan la expresión o la actividad de RGMb y PD-1, ya sea directa o indirectamente, pueden regular las respuestas inmunitarias al alza.

[0102] Tanto el RGMb como el PD-1 son puntos de control/reguladores inmunitarios. Por lo tanto, en una realización, los agentes que neutralizan la actividad de RGMb y la expresión y/o actividad de PD-1 pueden evitar la señalización inhibidora y regular una respuesta inmunitaria al alza. En otra realización, los agentes que bloquean directamente la interacción entre RGMb y su(s) receptor(es) natural(es), como PD-L2, y PD-1 y su(s) receptor(es) natural(es), como PD-L1 y/o PD-L2 (p. ej., anticuerpos bloqueantes anti-RGMb y anti-PD-1) pueden impedir la señalización inhibidora y regular una respuesta inmunitaria al alza. Alternativamente, los agentes que bloquean indirectamente la interacción entre RGMb y su(s) receptor(es) natural(es), y PD-1 y su(s) receptor(es) natural(es) pueden impedir la señalización inhibitoria y regular una respuesta inmunitaria al alza. Por ejemplo, PD-L1 soluble o PD-L2 soluble, al unirse a un polipéptido PD-1, reducen indirectamente la concentración efectiva de polipéptido PD-1 disponible para unirse a moléculas relacionadas con respuestas inmunitarias inhibidas. Del mismo modo, PD-L2 soluble o BMP solubles, como BMP-2 o BMP-4, al unirse a un polipéptido RGMb reducen indirectamente la concentración efectiva de polipéptido RGMb disponible para unirse a moléculas relacionadas con respuestas inmunitarias inhibidas. Los agentes ejemplares para regular una respuesta inmunitaria al alza incluyen anticuerpos contra RGMb y/o PD-1 que bloquean la interacción entre RGMb y su(s) receptor(es) natural(es), y PD-1 y su(s) receptor(es) natural(es); una forma no activadora de RGMb y/o PD-1 (por ejemplo, un polipéptido negativo dominante), pequeñas moléculas o péptidos que bloquean la interacción entre RGMb y su(s) receptor(es) natural(es), o PD-1 y su(s) receptor(es) natural(es); proteínas de fusión (por ejemplo, la porción extracelular de RGMb o PD-1 fusionada a la porción Fc de un anticuerpo o inmunoglobulina) que se unen a su(s) receptor(es) natural(es); moléculas de ácido nucleico que bloquean la transcripción o traducción de RGMb y/o PD-1; y similares.

[0103] Los agentes adicionales útiles en los métodos de la presente invención incluyen anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, ligandos naturales, y derivados de ligandos naturales, que pueden unirse y/o inactivar o inhibir biomarcadores proteicos de la invención, incluyendo los biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmentos de los mismos; así como ARN de interferencia, antisentido, aptámeros de ácido nucleico, etc. que pueden regular a la baja la expresión y/o actividad de los biomarcadores de la invención, incluidos los biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmentos de los mismos.

[0104] En una realización, moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridan específicamente con o codifican uno o más biomarcadores de la invención, enumerados en la Tabla 1 por ejemplo, o porciones biológicamente activas de los mismos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (es decir, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (es decir, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que naturalmente fagocitan el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas correspondientes a uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o descritos en el presente documento pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que fagocitan naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (es decir, una célula de linfoma). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.

[0105] Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 60%, más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% o más (por ejemplo, alrededor del 98%) homóloga a la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o una parte de los mismos (es decir, 100, 200, 300, 400, 450, 500 o más nucleótidos), puede aislarse utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, se puede aislar un ADNc humano a partir de una línea celular humana utilizando la totalidad o una parte de la molécula de ácido nucleico, o un fragmento de la misma, como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (es decir, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E.F., y Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico que abarque toda o una parte de la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o una secuencia de nucleótidos que sea al menos de aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos de aproximadamente el 60%, más preferiblemente al menos de aproximadamente el 70%, aún más preferiblemente al menos de aproximadamente el 80%, aún más preferiblemente al menos de aproximadamente el 90%, y más preferiblemente al menos un 95% o más homóloga a la secuencia nucleotídica, o fragmento de la misma, puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores oligonucleotídicos diseñados basándose en la secuencia de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento de los mismos, o la secuencia nucleotídica homóloga. Por ejemplo, el ARNm puede aislarse a partir de células musculares (es decir, mediante el procedimiento de extracción con guanidinio-tiocianato de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) y el ADNc puede prepararse utilizando transcriptasa inversa (es decir, transcriptasa inversa Moloney MLV, disponible en Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa AMV, disponible en Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores oligonucleotídicos sintéticos para la amplificación por PCR pueden diseñarse según métodos bien conocidos en la materia. Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados según las técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante análisis de la secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 pueden prepararse mediante técnicas sintéticas estándar, es decir, utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

[0106] Las sondas basadas en las secuencias nucleotídicas de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 pueden utilizarse para detectar o confirmar los transcritos deseados o las secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas u otras homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo de etiqueta unido a ella, es decir, el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Dichas sondas pueden utilizarse como parte de un kit de prueba diagnóstica para identificar células o tejidos que expresen uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, como por ejemplo midiendo un nivel de ácido nucleico de uno o más biomarcadores en una muestra de células de un sujeto, es decir, detectando los niveles de ARNm de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

[0107] También se contemplan moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas correspondientes a uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o porciones de los mismos, de diferentes especies. Por ejemplo, el ADNc de rata o mono puede identificarse basándose en la secuencia de nucleótidos de una secuencia humana y/o de ratón, y dichas secuencias son bien conocidas en la técnica. En una realización, la(s) molécula(s) de ácido nucleico de la invención codifica(n) una proteína o porción de la misma que incluye(n) una secuencia de aminoácidos que es(n) suficientemente homóloga(s) a una secuencia de aminoácidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, de tal manera que la proteína o porción de la misma modula(n) (por ejemplo, mejorar), una o más de las siguientes actividades biológicas: a) unión al biomarcador; b) modulación del número de copias del biomarcador; c) modulación del nivel de expresión del biomarcador; y d) modulación del nivel de actividad del biomarcador.

[0108] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "suficientemente homóloga" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar a un residuo de aminoácido en uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento del mismo) a una secuencia de aminoácidos del biomarcador, o fragmento del mismo, de tal manera que la proteína o porción de la misma modula (por ejemplo, potencie) una o más de las siguientes actividades biológicas: a) unión al biomarcador; b) modulación del número de copias del biomarcador; c) modulación del nivel de expresión del biomarcador; y d) modulación del nivel de actividad del biomarcador.

[0109] En otra realización, la proteína es al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 60%, más preferiblemente al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia completa de aminoácidos del biomarcador, o un fragmento del mismo.

[0110] Las porciones de proteínas codificadas por moléculas de ácido nucleico de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 son preferiblemente porciones biológicamente activas de la proteína. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "porción biológicamente activa" de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 pretende incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, que tiene una o más de las actividades biológicas de la proteína de longitud completa.

[0111] Pueden realizarse ensayos de unión estándar, por ejemplo, inmunoprecipitaciones y ensayos de levadura de dos híbridos, como se describe en el presente documento, o ensayos funcionales, por ejemplo, experimentos de ARNi o sobreexpresión, para determinar la capacidad de la proteína o de un fragmento biológicamente activo de la misma para mantener una actividad biológica de la proteína de longitud completa.

[0112] La invención abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento de la misma debido a degeneración del código genético y codifican así la misma proteína que la codificada por la secuencia de nucleótidos, o fragmento de la misma. En otra realización, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento de los mismos, o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de aminoácidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento de los mismos. En otra realización, un ácido nucléico que codifica un polipéptido consiste en una secuencia de ácido nucléico que codifica una porción de un fragmento de longitud completa de interés que es menor a 195, 190, 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, o 70 aminoácidos en longitud. [0113] Se apreciará por los expertos en la materia que los polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 pueden existir dentro de una población (por ejemplo, una población de mamíferos y/o humana). Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos de una misma población debido a la variación alélica natural. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, preferiblemente una proteína de mamífero, por ejemplo, humana. Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente a una variación del 1-5% en la secuencia de nucleótidos de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1. Todas y cada una de dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes en uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 de otras especies.

[0114] Además de las variantes alélicas de origen natural de la secuencia de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 que pueden existir en la población, el artesano experto apreciará además que los cambios pueden introducirse por mutación en la secuencia de nucleótidos, o fragmento de la misma, dando lugar así a cambios en la secuencia de aminoácidos de los uno o más biomarcadores codificados enumerados en la Tabla 1, sin alterar la capacidad funcional de los uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, en la secuencia, o fragmento de la misma, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que den lugar a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales". Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo salvaje de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 sin alterar la actividad de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1. Sin embargo, otros residuos de aminoácidos (por ejemplo, los que no están conservados o sólo están semiconservados entre el ratón y el ser humano) pueden no ser esenciales para la actividad y, por lo tanto, es probable que se puedan alterar sin alterar la actividad de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

[0115] La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. Preferiblemente, la alineación puede realizarse mediante el método Clustal. Los parámetros de alineación múltiple incluyen Penalización Gap =10, Penalización de longitud Gap = 10. Para las alineaciones de ADN, los parámetros de alineación por pares pueden ser Htuple=2, Penalización Gap=5, Ventana=4 y Diagonal salvada=4. Para los alineamientos de proteínas, los parámetros de alineamiento por pares pueden ser Ktuple=1, Penalización Gap=3, Ventana=5, y Diagonales salvadas=5.

[0116] En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el método de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en línea), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en línea), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de separación de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en línea), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

[0117] Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína homóloga a uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmento de la misma, puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos, o fragmento de la misma, o una secuencia de nucleótidos homóloga de tal manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. Se han definido familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial previsto en uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 se sustituye preferentemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para una actividad descrita en el presente documento para identificar mutantes que retengan la actividad deseada. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente según métodos bien conocidos en la materia y la actividad de la proteína puede determinarse utilizando, por ejemplo, ensayos descritos en el presente documento.

[0118] Los niveles de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 pueden evaluarse mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de una molécula o proteína transcrita. Ejemplos no limitantes de tales métodos incluyen métodos inmunológicos para la detección de proteínas, métodos de purificación de proteínas, ensayos de función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos y métodos de amplificación de ácidos nucleicos.

[0119] En realizaciones preferidas, los niveles de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 se determinan midiendo el transcrito génico (por ejemplo, ARNm), midiendo la cantidad de proteína traducida o midiendo la actividad del producto génico. Los niveles de expresión pueden controlarse de diversas maneras, por ejemplo detectando los niveles de ARNm, los niveles de proteínas o la actividad de las proteínas, cualquiera de los cuales puede medirse mediante técnicas estándar. La detección puede implicar la cuantificación del nivel de expresión génica (por ejemplo, ADN genómico, ADNc, ARNm, proteína o actividad enzimática) o, alternativamente, puede ser una evaluación cualitativa del nivel de expresión génica, en particular en comparación con un nivel de control. El tipo de nivel detectado quedará claro por el contexto.

[0120] En una realización particular, el nivel de expresión de ARNm puede determinarse tanto por formatos in situ como in vitro en una muestra biológica utilizando métodos conocidos en la técnica. El término "muestra biológica" incluye tejidos, células, fluidos biológicos y sus aislados, aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Muchos métodos de detección de la expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitro, cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm puede utilizarse para la purificación de ARN a partir de células (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York 1987-1999). Además, se pueden procesar fácilmente grandes cantidades de muestras de tejido utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un solo paso de Chomczynski (1989, patente estadounidense n° 4.843.155).

[0121] El ARNm aislado puede utilizarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, entre otros, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa y arrays de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm consiste en poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con el ARNm codificado por el gen que se está detectando. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones estrictas con un ARNm o ADN genómico que codifique uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1. En el presente documento se describen otras sondas adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico de la invención. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que se están expresando uno o más biomarcadores de los enumerados en la Tabla 1.

[0122] En un formato, el ARNm se inmoviliza en una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo haciendo pasar el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, como la nitrocelulosa. En un formato alternativo, la(s) sonda(s) se inmoviliza(n) en una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda(s), por ejemplo, en una matriz de chips de genes, por ejemplo, una matriz de chips de genes Affymetrix™. Un experto puede adaptar fácilmente métodos conocidos de detección de ARNm para su uso en la detección del nivel de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

[0123] Un método alternativo para determinar el nivel de expresión de ARNm en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, mediante RT-PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, 1987, Patente de EE.UU. N° 4.683.202), reacción en cadena de ligasa (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189 193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), replicasa Q-Beta (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), replicación en círculo rodante (Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy bajas. Tal como se utilizan en el presente documento, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden unirse a las regiones 5' o 3' de un gen (hebras positiva y negativa, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta intermedia. En general, los cebadores de amplificación tienen entre 10 y 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de entre 50 y 200 nucleótidos de longitud. En condiciones y con reactivos apropiados, dichos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.

[0124] Para los métodos in situ, no es necesario aislar el ARNm de las células antes de la detección. En tales métodos, una muestra de células o tejido se prepara/procesa utilizando métodos histológicos conocidos. A continuación, la muestra se inmoviliza en un soporte, normalmente un portaobjetos de vidrio, y se pone en contacto con una sonda que puede hibridarse con uno o varios biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

[0125] Como alternativa a realizar determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizado de uno o más biomarcadores listados en la Tabla 1. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto mediante la comparación de su expresión con la expresión de un gen no biomarcador, por ejemplo, un gen de mantenimiento que se exprese de forma constitutiva. Entre los genes adecuados para la normalización se incluyen genes de mantenimiento, como el gen de la actina, o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de un sujeto, con otra muestra, por ejemplo, una muestra normal, o entre muestras de diferentes fuentes.

[0126] El nivel o actividad de una proteína correspondiente a uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 también puede detectarse y/o cuantificarse detectando o cuantificando el polipéptido expresado. El polipéptido puede detectarse y cuantificarse por cualquiera de los medios conocidos por los expertos en la materia. Pueden incluir métodos bioquímicos analíticos como la electroforesis, la electroforesis capilar, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía en capa fina (TLC), la cromatografía de hiperdifusión y similares, o diversos métodos inmunológicos como las reacciones de precipitina fluida o en gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencia tipo Western, y similares. Un experto puede adaptar fácilmente métodos conocidos de detección de proteínas/anticuerpos para determinar si las células expresan el biomarcador de interés.

[0127] La presente invención proporciona además formas polipeptídicas solubles, purificadas y/o aisladas de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmentos de los mismos. Además, debe entenderse que todos y cada uno de los atributos de los polipéptidos descritos en el presente documento, como identidades porcentuales, longitudes polipeptídicas, fragmentos polipeptídicos, actividades biológicas, anticuerpos, etc. pueden combinarse en cualquier orden o combinación con respecto a cualquier biomarcador enumerado en la Tabla 1 y combinaciones de los mismos.

[0128] En un aspecto, un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos de longitud completa correspondiente a uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o una secuencia de aminoácidos de longitud completa con 1 a aproximadamente 20 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las descritas en el presente documento también puede ser al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 99,5% idéntica a la secuencia de longitud completa de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, que se describe en el presente documento, bien conocida en la técnica, o un fragmento de la misma. En otro aspecto, la presente invención contempla una composición que comprende un polipéptido aislado correspondiente a uno o más biomarcadores enumerados en el polipéptido de la Tabla 1 y menos de aproximadamente el 25%, o alternativamente el 15%, o alternativamente el 5%, de macromoléculas o polipéptidos biológicos contaminantes.

[0129] La presente invención proporciona además composiciones relacionadas con la producción, detección o caracterización de dichos polipéptidos, o fragmentos de los mismos, tales como ácidos nucleicos, vectores, células huésped y similares. Dichas composiciones pueden servir como compuestos que modulan la expresión y/o actividad de uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1.

[0130] Un polipéptido aislado o un fragmento del mismo (o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido) correspondiente a uno o más biomarcadores de la invención, incluidos los biomarcadores enumerados en la Tabla 1 o fragmentos de los mismos, puede utilizarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a dicho inmunógeno, utilizando técnicas estándar para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales según métodos bien conocidos en la técnica. Un péptido antigénico comprende al menos 8 residuos de aminoácidos y engloba un epítopo presente en la respectiva molécula de longitud completa, de manera que un anticuerpo criado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con la respectiva molécula de longitud completa. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos de aminoácidos. En una realización, dichos epítopos pueden ser específicos para una molécula polipeptídica dada de una especie, como el ratón o el ser humano (es decir, se utiliza como inmunógeno un péptido antigénico que abarca una región de la molécula polipeptídica que no se conserva entre especies; dichos residuos no conservados pueden determinarse utilizando un alineamiento como el que se proporciona en el presente documento).

[0131] En una realización, un anticuerpo se une sustancialmente de forma específica a PD-1 e inhibe o bloquea su función inmunoinhibidora, por ejemplo interrumpiendo su interacción con un ligando inhibidor como PD-L1 y/o PD-L2. En otra realización, un anticuerpo se une de forma sustancialmente específica a RGMb e inhibe o bloquea su función inmunoinhibidora, por ejemplo interrumpiendo su interacción con PD-L2 y/o BMPs, como BMP-2 y/o BMP-4.

[0132] Por ejemplo, un inmunógeno polipeptídico se utiliza típicamente para preparar anticuerpos inmunizando a un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Un animal preferido es un ratón defectuoso en el antígeno objetivo deseado. Por ejemplo, puede utilizarse un ratón PD-1 no modificado si el anticuerpo deseado es un anticuerpo anti-PD-1. Esto da lugar a un espectro más amplio de posibilidades de reconocimiento de anticuerpos, ya que los anticuerpos reactivos a epítopos comunes de ratón y humanos no se eliminan por mecanismos de tolerancia. Una preparación inmunogénica adecuada puede contener, por ejemplo, una molécula expresada recombinantemente o sintetizada químicamente o un fragmento de la misma frente a la que se desea generar la respuesta inmunitaria. El preparado puede incluir además un adyuvante, como el adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulante similar. La inmunización de un sujeto adecuado con un preparado inmunogénico induce una respuesta de anticuerpos policlonales frente al péptido antigénico contenido en el mismo.

[0133] Los anticuerpos policlonales pueden prepararse como se ha descrito anteriormente inmunizando a un sujeto adecuado con un inmunógeno polipeptídico. El título de anticuerpos del polipéptido en el sujeto inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo mediante técnicas estándar, como un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con polipéptido inmovilizado. Si se desea, el anticuerpo dirigido contra el antígeno puede aislarse del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse posteriormente mediante técnicas bien conocidas, como la cromatografía de proteína A, para obtener la fracción IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos son más altos, las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, como la técnica del hibridoma (descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (véase también Brown et al. (1981) J. Immunol.

127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proc. Acad. Sci. 76:2927-31; Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la técnica más reciente del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica del EBV-hibridoma (Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o las técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (véase en general Kenneth, R. H. en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med.

54:387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36). Brevemente, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se analizan para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una al antígeno polipeptídico, preferiblemente de forma específica.

[0134] Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas puede aplicarse con el fin de generar un anticuerpo monoclonal contra uno o más biomarcadores de la invención, incluidos los biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o un fragmento de los mismos (véase, por ejemplo, Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) supra; Lerner (1981) supra; Kenneth (1980) supra). Por otra parte, el trabajador experto ordinario apreciará que hay muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos pueden fabricarse fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular inmortalizada de ratón. Las líneas celulares inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Cualquiera de las líneas celulares de mieloma puede utilizarse como pareja de fusión según las técnicas habituales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Normalmente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG"). A continuación, las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan utilizando el medio HAT, que elimina las células de mieloma no fusionadas y las fusionadas improductivamente (los esplenocitos no fusionados mueren al cabo de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan examinando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma en busca de anticuerpos que se unen a un polipéptido dado, por ejemplo, utilizando un ensayo ELISA estándar.

[0135] Como alternativa a la preparación de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un monoclonal específico para uno de los polipéptidos descritos anteriormente mediante el cribado de una biblioteca combinatoria de inmunoglobulinas recombinantes (por ejemplo, una biblioteca de visualización de fagos de anticuerpos) con el polipéptido apropiado para aislar así los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen al polipéptido. Existen kits comerciales para generar y cribar bibliotecas de visualización de fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, No. de catálogo 27-9400-01; y el Kit de Visualización de Fagos Stratagene SurfZAP™ , No. de catálogo 240612). Además, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos especialmente adecuados para generar y cribar una biblioteca de visualización de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente estadounidense No. 5.223.409; Kang et al. Publicación internacional No. WO 92/18619; Dower et al. Publicación internacional No. WO 91/17271; Winter et al. Publicación internacional No. WO 92/20791; Markland et al. Publicación internacional No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicación internacional No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación internacional No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación internacional No. WO 92/09690; Ladner et al. Publicación internacional No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554.

[0136] Puesto que es bien conocido en la materia que los dominios CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, los anticuerpos monoclonales recombinantes de la presente invención preparados como se ha expuesto anteriormente comprenden preferentemente los CDR3 de cadena pesada y ligera de regiones variables de los anticuerpos descritos en el presente documento y bien conocidos en el arte. Del mismo modo, los anticuerpos pueden comprender además las CDR2 de regiones variables de dichos anticuerpos. Los anticuerpos pueden comprender además las CDR1 de regiones variables de dichos anticuerpos. En otras realizaciones, los anticuerpos pueden incluir cualquier combinación de CDR.

[0137] Las regiones CDR1,2, y/o 3 de los anticuerpos de ingeniería descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) exacta(s) de aminoácidos como las de las regiones variables de la presente invención. Sin embargo, el experto en la materia apreciará que puede ser posible cierta desviación de las secuencias CDR exactas, manteniendo la capacidad del anticuerpo de unirse a una diana deseada, como RGMb y/o PD-1 de forma efectiva (p. ej., modificaciones conservadoras de la secuencia). Por consiguiente, en otra realización, el anticuerpo diseñado puede estar compuesto de una o más CDR que son, por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 99,5% idénticas a una o más CDR de la presente invención descritas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo.

[0138] Las características estructurales de anticuerpos no humanos o humanos (p. ej., un anticuerpo de rata antirratón/antihumano) pueden utilizarse para crear anticuerpos humanos estructuralmente relacionados que conserven al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la presente invención, como la unión a RGMb y/o PD-1. Otra propiedad funcional incluye la inhibición de la unión de los anticuerpos originales conocidos, no humanos o humanos, en un ensayo ELISA de competición.

[0139] En algunas realizaciones, se proporcionan anticuerpos monoclonales capaces de unirse e inhibir/bloquear RGMb y/o PD-1, que comprenden una cadena pesada en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena pesada presentado en el presente documento o disponible públicamente de otro modo.

[0140] Del mismo modo, también se proporcionan anticuerpos monoclonales que unen e inhiben/bloquean RGMb y/o PD-1, que comprenden una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena ligera presentado en el presente documento o disponible públicamente de otro modo.

[0141] Anticuerpos monoclonales capaces de unirse e inhibir/bloquear RGMb y/o PD-1, que comprenden una cadena pesada en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena pesada presentado en el presente documento o disponible públicamente de otro modo; y que comprende una cadena ligera en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena ligera presentadas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo.

[0142] Un experto observará que tal porcentaje de homología es equivalente y puede lograrse introduciendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de una CDR dada. [0143] Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden comprender una cadena pesada, en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las CDR de dominio variable de cadena pesada presentadas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo y una cadena ligera, en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las CDR de dominio variable de cadena ligera presentadas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo.

[0144] Tales anticuerpos monoclonales pueden comprender una cadena ligera, en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en CDR-L1, CDR-L2, y CDR-L3, como se describe en el presente documento; y/o una cadena pesada, en la que el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a RGMb y/o PD-1 humanos comprenden o están formados por CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, como se describe en el presente documento.

[0145] El dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos vH establecida en el presente documento o disponible públicamente de otro modo y/o el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos vk establecida en el presente documento o disponible públicamente de otro modo.

[0146] La presente invención proporciona además fragmentos de dichos anticuerpos monoclonales que incluyen, pero no se limitan a, Fv,Fab,F(ab')2,Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

[0147] También se contemplan otros fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Por ejemplo, se proporcionan cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina individuales, en las que los dominios variables de las mismas comprenden al menos una CDR presentada en el presente documento o disponible públicamente de otro modo. En una realización, la cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena pesada o cadena ligera presentadas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo. En otra realización, una cadena ligera de inmunoglobulina comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% idéntica del grupo de CDR de dominio variable de cadena ligera o cadena pesada presentadas en el presente documento o disponibles públicamente de otro modo.

[0148] En algunas realizaciones, la cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina comprende un dominio variable que comprende al menos uno de los CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3 descritos en el presente documento. Dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina pueden comprender o consistir en al menos una de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. Dichas cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden comprender o consistir en al menos una de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3.

[0149] En otras realizaciones, una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina según la presente invención comprende o consiste en una secuencia de dominio variable vH o vk, respectivamente, proporcionada en el presente documento o disponible públicamente de otro modo.

[0150] La presente invención proporciona además polipéptidos que tienen una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dominio variable vH, dominio variable vk, secuencias CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 descritas en el presente documento.

[0151] Los anticuerpos, inmunoglobulinas y polipéptidos de la invención pueden utilizarse en forma aislada (p. ej., purificada) o contenidos en un vector, como una membrana o vesícula lipídica (p. ej., un liposoma).

[0152] Se contemplan la(s) modificación(es) de la(s) secuencia(s) de aminoácidos de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado simplemente injertando sólo CDRs en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FRs de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión al antígeno se reduce en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios residuos de aminoácidos de la VH y VL del anticuerpo no humano, no sólo en las CDR sino también en las FR, están directa o indirectamente asociados con la actividad de unión al antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes derivados de FRs de la VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión y puede corregirse sustituyendo los aminoácidos por residuos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano.

[0153] Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos descritos en el presente documento, y en las secuencias de ADN que los codifican, y aún así obtener una molécula funcional que codifique un anticuerpo y un polipéptido con características deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad biológica funcional, es posible realizar determinadas sustituciones de aminoácidos en la secuencia de una proteína y, por supuesto, en su secuencia de codificación de ADN, obteniendo sin embargo una proteína con propiedades similares. Así pues, se contempla la posibilidad de introducir diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.

[0154] Al realizar los cambios en las secuencias amino del polipéptido, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos a la hora de conferir una función biológica interactiva a una proteína es de conocimiento general en la materia. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga, a saber: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1.8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (<RTI 3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

[0155] Es conocido en la materia que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar y aún así resultar en una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún así obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente.

[0156] Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

[0157] Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la estabilidad. Por "alterar" se entiende suprimir una o más partes carbohidratadas que se encuentran en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos suele estar N-ligada. “N-ligada” se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-ligados). Otro tipo de modificación covalente consiste en acoplar química o enzimáticamente glucósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga capacidad de glicosilación para la glicosilación N- u O-ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares pueden estar unidos a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Por ejemplo, tales métodos se describen en el documento WO87/05330.

[0158] De forma similar, la eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en el anticuerpo puede realizarse química o enzimáticamente. La deglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento provoca la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacto el anticuerpo. La deglicosilación química está descrita por Sojahr et al. (1987) y por Edge et al. (1981). La escisión enzimática de los restos de carbohidratos en los anticuerpos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas, tal y como describen Thotakura et al. (1987).

[0159] Otras modificaciones pueden implicar la formación de inmunoconjugados. Por ejemplo, en un tipo de modificación covalente, los anticuerpos o las proteínas se unen covalentemente a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en Pat. de EE.UU. No. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.

[0160] La conjugación de anticuerpos u otras proteínas de la presente invención con agentes heterólogos puede hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales incluyendo pero no limitado a N-succinimidil (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bisactivos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, el ácido 1-isotiocianatobencilmetildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (WO 94/11026).

[0161] En otro aspecto, la presente invención presenta anticuerpos conjugados con una fracción terapéutica, como una citotoxina, un fármaco y/o un radioisótopo. Cuando se conjugan con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpos se denominan "inmunotoxinas". La citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, que las mate). Algunos ejemplos son taxol, citocalasinaB, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, así como sus análogos u homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un radioisótopo, por ejemplo, yodo radiactivo, para generar radiofármacos citotóxicos para tratar un trastorno relacionado, como un cáncer.

[0162] Los anticuerpos conjugados, además de su utilidad terapéutica, pueden ser útiles para el diagnóstico o pronóstico para monitorizar los niveles de polipéptidos en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables son diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas son la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la p-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados son la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; Como ejemplos de materiales fosforescentes adecuados cabe citar la umbeliferona, la fuoresceína, el isotiocianato de fuoresceína (FITC), la rodamina, la fuoresceína diclorotriazinilamina, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina (PE); como ejemplo de material luminiscente cabe citar el luminol; como ejemplos de materiales bioluminiscentes cabe citar la luciferasa, la luciferina y la aequorina, y como ejemplos de material radiactivo adecuado cabe citar el 125I, el 131I, el 35S o el 3H.

[0163] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marcado", con respecto al anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) de una sustancia detectable, como un agente radiactivo o un fuoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fuoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al anticuerpo, así como el marcado indirecto del anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable.

[0164] Los conjugados de anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica determinada. La porción terapéutica no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, como la abrina, la ricina A, la exotoxina de Pseudomonas o la toxina diftérica; una proteína como el factor de necrosis tumoral o el interferón gamma.; o, modificadores de la respuesta biológica como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otras citocinas o factores de crecimiento.

[0165] Las técnicas para conjugar dicha fracción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 24356 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 62353 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of AntibodyToxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:11958 (1982).

[0166] En algunas realizaciones, las conjugaciones pueden hacerse utilizando un "enlazador escindible" que facilite la liberación del agente citotóxico o del agente inhibidor del crecimiento en una célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilado o un enlazador que contenga disulfuro (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. No. 5.208.020). Alternativamente, puede fabricarse una proteína de fusión que comprenda el anticuerpo y el agente citotóxico o el agente inhibidor del crecimiento, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifique un péptido enlazador que no destruya las propiedades deseadas del conjugado.

[0167] Además, los anticuerpos polipeptídicos recombinantes, como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones humanas y no humanas, que pueden fabricarse utilizando técnicas estándar de ADN recombinante, están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en Robinson et al. Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et al. Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M. Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de EE.UU. n° 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al.(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214; Winter U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060. Traducción realizada con la versión gratuita del traductor www.DeepL.com/Translator

[0168] Además, los anticuerpos humanizados pueden fabricarse según protocolos estándar como los divulgados en la Patente de EE.UU. 5,565,332. En otra realización, las cadenas de anticuerpos o los miembros del par de unión específicos pueden producirse por recombinación entre vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una fusión de una cadena polipeptídica de un miembro del par de unión específico y un componente de un paquete de visualización genérico replicable y vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una segunda cadena polipeptídica de un miembro del par de unión único utilizando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe en las Patentes de EE.UU. 5,565,332, 5,871,907 o 5,733,743. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de proteínas en una célula también es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBOJ. 9:101-108; Werge, T M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:5075-5079; Chen, S-Y. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Publicación PCT No. WO 94/02610 de Marasco et al.; y Publicación PCT No. WO 95/03832 de Duan et al.).

[0169] Además, podrían fabricarse anticuerpos totalmente humanos contra biomarcadores de la invención, incluidos los biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o fragmentos de los mismos. Se pueden fabricar anticuerpos totalmente humanos en ratones transgénicos para genes de inmunoglobulina humana, por ejemplo, según Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manuel", Cold Spring Harbor Laboratory. Brevemente, los ratones transgénicos son inmunizados con inmunógeno purificado. Se recogen células del bazo y se fusionan con células de mieloma para producir hibridomas. Los hibridomas se seleccionan en función de su capacidad para producir anticuerpos que se unen al inmunógeno. Los anticuerpos totalmente humanos reducirían la inmunogenicidad de dichos anticuerpos en un humano.

[0170] En una realización, un anticuerpo para uso en la presente invención es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de un único polipéptido de anticuerpo. La unión al antígeno puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. En la patente estadounidense 4.474.893 se describen ejemplos de anticuerpos biespecíficos producidos por un hibridoma híbrido o un trioma. Se han construido anticuerpos biespecíficos por medios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314:628, y Perez et al. (1985) Nature 316:354) y tecnología de hibridoma (Staerz y Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453, y Staerz y Bevan (1986) Immunol. Today 7:241). Los anticuerpos biespecíficos también se describen en la Patente de EE.UU. 5,959,084. Los fragmentos de anticuerpos biespecíficos se describen en la Patente de EE.UU.

5,798,229.

[0171] Los agentes biespecíficos también pueden generarse fabricando heterohibridomas mediante la fusión de hibridomas u otras células que fabriquen anticuerpos diferentes, seguida de la identificación de clones que produzcan y coensamblen ambos anticuerpos. También pueden generarse por conjugación química o genética de cadenas completas de inmunoglobulina o porciones de las mismas, como las secuencias Fab y Fv. El componente anticuerpo puede unirse a un polipéptido o a un fragmento del mismo de uno o más biomarcadores de la invención, incluyendo uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1, o un fragmento del mismo. En una realización, el anticuerpo biespecífico podría unirse específicamente tanto a un polipéptido o a un fragmento del mismo como a su(s) compañero(s) natural(es) de unión o a un fragmento(s) del mismo.

[0172] Los agentes moduladores aquí descritos (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, proteínas de fusión o ácidos nucleicos pequeños) pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto in vivo. Las composiciones pueden contener una sola molécula o agente de este tipo o cualquier combinación de agentes descritos en el presente documento. Los "agentes activos únicos" aquí descritos pueden combinarse con otros compuestos farmacológicamente activos ("segundos agentes activos") conocidos en la técnica según los métodos y composiciones aquí proporcionados.

b. Composiciones farmacéuticas

[0173] Los agentes que inhiben o bloquean la expresión y/o actividad de RGMb y PD-1, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos bloqueantes, péptidos, proteínas de fusión o moléculas pequeñas, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Tales composiciones comprenden típicamente el anticuerpo, el péptido, la proteína de fusión o la molécula pequeña y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse a las composiciones compuestos activos suplementarios.

[0174] Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen la parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede presentarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.

[0175] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida hasta el punto de que se pueda jeringar fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, es preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0176] Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estérilmente.

[0177] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden presentarse en cápsulas de gelatina o comprimidos. Para fines de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trozos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse utilizando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, en el que el compuesto en el portador fluido se aplica oralmente y se enjuaga y expectorado o tragado. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, troques y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrador como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

[0178] Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono, o un nebulizador.

[0179] La administración sistémica también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes adecuados a la barrera que se desea permeabilizar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en el arte, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede realizarse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la materia.

[0180] Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para supositorios como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

[0181] En una realización, los agentes moduladores se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de entrega microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como el etilvinilacetato, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones deberían ser evidentes para los expertos en la materia. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) también pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. No. 4,522,811.

[0182] Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La "Forma unitaria de dosificación", tal como se utiliza aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención es dictada por, y directamente dependiente en, las características únicas del compuesto activo, el efecto terapéutico particular para ser logrado, y las limitaciones inherentes en el arte de componer tal un compuesto activo para el tratamiento de individuos.

[0183] La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que presentan grandes índices terapéuticos. Aunque pueden utilizarse compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al lugar del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, de este modo, reducir los efectos secundarios.

[0184] Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y los estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de una gama de dosis para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

[0185] Los agentes moduladores descritos anteriormente pueden administrarse en forma de ácidos nucleicos expresables que codifican dichos agentes. Tales ácidos nucleicos y composiciones en las que están contenidos, también están incluidos en la presente invención. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (véase la patente estadounidense 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de administración génica. Alternativamente, cuando el vector de administración de genes completo pueda producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, el preparado farmacéutico puede incluir una o más células que produzcan el sistema de administración de genes.

[0186] Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con las instrucciones de administración.

c. Métodos Profilácticos

[0187] En un aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir en un sujeto, un cáncer, tal como un cáncer hematológico como el mieloma múltiple, asociado con una respuesta inmune menos que deseable. Los sujetos con riesgo de padecer una enfermedad de este tipo pueden identificarse, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico conocidos en la técnica. La administración de un agente profiláctico puede producirse antes de la manifestación de síntomas asociados a una respuesta inmunitaria no deseada o menos que deseable. El agente o agentes apropiados para el tratamiento (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, proteínas de fusión o pequeñas moléculas) pueden determinarse en función de las indicaciones clínicas e identificarse mediante ensayos de diagnóstico bien conocidos en la técnica, así como los descritos en el presente documento.

d. Métodos Terapéuticos

[0188] Otro aspecto de la invención se refiere a métodos terapéuticos de modulación de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, mediante la inhibición o el bloqueo de la expresión y/o la actividad de RGMb y PD-1.

[0189] Los métodos moduladores de la presente invención implican contactar una célula, tal como una célula inmune con un agente que inhibe o bloquea la expresión y/o actividad de RGMb y PD-1. Más arriba se han descrito ejemplos de agentes útiles en estos métodos. [0275] Estos agentes moduladores pueden administrarse in vitro o ex vivo (por ejemplo, poniendo en contacto la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos útiles para el tratamiento de un individuo aficted con una condición que se beneficiaría de una mayor respuesta inmune, como una infección o un cáncer como el cáncer colorrectal.

[0190] Los agentes que estimulan las respuestas inmunitarias pueden ser en forma de potenciación de una respuesta inmunitaria existente o de provocación de una respuesta inmunitaria inicial. Por lo tanto, mejorar una respuesta inmunitaria utilizando las composiciones y métodos del sujeto es útil para tratar el cáncer, pero también puede ser útil para tratar una enfermedad infecciosa (por ejemplo, bacterias, virus o parásitos), una infección parasitaria y una enfermedad inmunosupresora.

[0191] Trastornos infecciosos ejemplares incluyen enfermedades virales de la piel, tales como Herpes o culebrilla, en cuyo caso tal agente puede ser administrado tópicamente a la piel. Además, las enfermedades víricas sistémicas, como la gripe, el resfriado común y la encefalitis, podrían aliviarse mediante la administración sistémica de dichos agentes. En una realización preferida, los agentes que estimulan la respuesta inmunitaria descritos en el presente documento son útiles para modular el equilibrio arginasa/iNOS durante la infección por Trypanosoma cruzi con el fin de facilitar una respuesta inmunitaria protectora contra el parásito.

[0192] Las respuestas inmunitarias también pueden potenciarse en un paciente infectado mediante un enfoque ex vivo, por ejemplo, extrayendo células inmunitarias del paciente, poniendo en contacto las células inmunitarias in vitro con un agente descrito en el presente documento y reintroduciendo las células inmunitarias estimuladas in vitro en el paciente.

[0193] En ciertos casos, puede ser deseable administrar además otros agentes que aumenten la respuesta inmunitaria, por ejemplo, formas de otros miembros de la familia B7 que transducen señales a través de receptores coestimuladores, con el fin de aumentar aún más la respuesta inmunitaria. Dichos agentes y terapias adicionales se describen más adelante.

[0194] Los agentes que estimulan una respuesta inmune pueden usarse profilácticamente en vacunas contra varios polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos derivados de patógenos). La inmunidad contra un patógeno (por ejemplo, un virus) puede inducirse mediante la vacunación con una proteína vírica junto con un agente que estimule la respuesta inmunitaria, en un adyuvante apropiado.

[0195] En otra realización, la regulación o mejora de una función de respuesta inmune, como se describe aquí, es útil en la inducción de inmunidad tumoral.

[0196] En otra realización, la respuesta inmune puede ser estimulada por los métodos aquí descritos, de tal manera que se supere la tolerancia preexistente, la deleción clonal y/o el agotamiento (por ejemplo, el agotamiento de células T). Por ejemplo, las respuestas inmunitarias contra antígenos contra los que un sujeto no puede montar una respuesta inmunitaria significativa, p. ej., contra un antígeno autólogo, como los antígenos específicos de un tumor, pueden inducirse administrando los agentes apropiados descritos en el presente documento que regulan la respuesta imimune. En una realización, puede coadministrarse un antígeno autólogo, como un antígeno específico de tumor. En otra realización, los agentes en cuestión pueden utilizarse como adyuvantes para potenciar las respuestas a antígenos extraños en el proceso de inmunización activa.

[0197] En una realización, las células inmunitarias se obtienen de un sujeto y se cultivan ex vivo en presencia de un agente como el descrito en el presente documento, para ampliar la población de células inmunitarias y/o mejorar la activación de las células inmunitarias. En una realización posterior, las células inmunitarias se administran a un sujeto. Las células inmunitarias pueden estimularse in vitro, por ejemplo, proporcionando a las células inmunitarias una señal de activación primaria y una señal coestimuladora, como se conoce en la materia. También pueden utilizarse diversos agentes para coestimular la proliferación de células inmunitarias. En una realización, las células inmunitarias se cultivan ex vivo según el método descrito en la solicitud PCT No. WO 94/29436. El polipéptido costimulador puede ser soluble, estar unido a una membrana celular o a una superficie sólida, como una perla.

[0198] En otra realización, los agentes descritos en el presente documento útiles para la regulación de respuestas inmunitarias pueden vincularse o unirse operativamente a toxinas mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, reticulación o mediante técnicas de ADN recombinante. Dichos agentes pueden provocar la destrucción celular de las células deseadas. En una realización, una toxina puede conjugarse con un anticuerpo, como un anticuerpo biespecífico. Dichos anticuerpos son útiles para dirigirse a una población celular específica, por ejemplo, utilizando un marcador que sólo se encuentra en un determinado tipo de célula. La preparación de inmunotoxinas es, en general, bien conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. No. 4.340.535 y EP44167). Se conocen numerosos tipos de enlaces disulfuro que pueden emplearse con éxito para conjugar la fracción de toxina con un polipéptido. En una realización, se prefieren los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está "obstaculizado" estéricamente, debido a su mayor estabilidad in vivo, evitando así la liberación de la fracción de toxina antes de la unión en el lugar de acción. Se conoce una amplia variedad de toxinas que pueden conjugarse con polipéptidos o anticuerpos de la invención. Los ejemplos incluyen: numerosas toxinas útiles derivadas de plantas, hongos o incluso bacterias, que, a modo de ejemplo, incluyen varias toxinas de cadena A, en particular ricina de cadena A, proteínas inactivadoras de ribosomas como saporina o gelonina, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, ribonucleasas, como ribonucleasa placentaria, angiogénica, toxina diftérica y exotoxina de Pseudomonas, etc. Una fracción de toxina preferida para su uso en relación con la invención es la cadena A de toxina que ha sido tratada para modificar o eliminar residuos de carbohidratos, cadena A desglicosilada. (Patente de EE.UU. 5,776,427). La infusión de uno o una combinación de tales agentes citotóxicos (por ejemplo, fusiones de ricina) en un paciente puede provocar la muerte de las células inmunitarias.

[0199] En otra realización, ciertas combinaciones actúan de forma sinérgica en el tratamiento de condiciones que se beneficiarían de la modulación de las respuestas inmunes. Los segundos agentes activos pueden ser moléculas grandes (por ejemplo, proteínas) o pequeñas (por ejemplo, moléculas sintéticas inorgánicas, organometálicas u orgánicas). Por ejemplo, los anticuerpos anti-RGMb y anti-PD-1 pueden combinarse además con otros agentes o terapias útiles para tratar una afección de interés, como la combinación de inhibidores de puntos de control inmunitarios adicionales, como anticuerpos anti-PD-L1, anti-PD-L2, anti-CTLA4, etc., o combinaciones de los mismos.

[0200] En una realización, la inmunoterapia anticancerosa se administra en combinación a los sujetos aquí descritos. El término "inmunoterapia" se refiere a cualquier terapia que actúe dirigiéndose a la modulación de la respuesta inmunitaria (por ejemplo, inducción, potenciación, supresión o reducción de una respuesta inmunitaria). En ciertas realizaciones, se administra inmunoterapia que activa las células T que reconocen neoantígenos (por ejemplo, mutantes que cambian la secuencia de codificación normal de la proteína y que pueden ser procesados por el sistema de presentación de antígenos, unirse al CMH y ser reconocidos como extraños por las células T).

[0201] El término "respuesta inmunitaria" incluye las respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o por células B. Las respuestas inmunitarias ejemplares incluyen respuestas de células T, por ejemplo, producción de citocinas y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se efectúan indirectamente mediante la activación de células T, por ejemplo, la producción de anticuerpos (respuestas humorales) y la activación de células que responden a citocinas, por ejemplo, macrófagos. [0077] El término "inhibir" incluye la disminución, limitación o bloqueo de, por ejemplo, una acción, función o interacción particular. En algunas realizaciones, el cáncer se "inhibe" si al menos un síntoma del cáncer se alivia, termina, ralentiza o previene. Tal como se utiliza aquí, el cáncer también se "inhibe" si la recurrencia o metástasis del cáncer se reduce, ralentiza, retrasa o previene. El término "promover" tiene el significado opuesto.

[0202] El término "agente inmunoterapéutico" puede incluir cualquier molécula, péptido, anticuerpo u otro agente que pueda modular el sistema inmunitario del huésped en respuesta a un antígeno, como el expresado por un tumor o cáncer en el sujeto. Las estrategias inmunoterapéuticas incluyen la administración de vacunas, anticuerpos, citocinas, quimiocinas, así como pequeños inhibidores moleculares, oligonucleótidos antisentido y terapia génica, como se describe más adelante (véase, por ejemplo, Mocellin et al. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51:583-595; Dy et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 2881-2894).

[0203] Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmunitaria se denominan "inmunoterapias de activación". Las inmunoterapias diseñadas para reducir o suprimir una respuesta inmunitaria se denominan "inmunoterapias de supresión". Cualquier agente que se considere que puede tener un efecto sobre el sistema inmunitario de las células cancerosas transplantadas modificadas genéticamente puede analizarse para determinar si el agente es una inmunoterapia y el efecto que una determinada modificación genética tiene sobre la modulación de la respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, la inmunoterapia es específica para células cancerosas. En algunas realizaciones, la inmunoterapia puede ser "no dirigida", lo que se refiere a la administración de agentes que no interactúan selectivamente con las células del sistema inmunitario, pero que modulan la función del sistema inmunitario. Ejemplos representativos de terapias no dirigidas incluyen, sin limitación, quimioterapia, terapia génica y radioterapia.

[0204] La inmunoterapia puede implicar inmunidad pasiva para la protección a corto plazo de un huésped, lograda mediante la administración de anticuerpos preformados dirigidos contra un antígeno de cáncer o antígeno de enfermedad (por ejemplo, administración de un anticuerpo monoclonal, opcionalmente unido a un agente quimioterapéutico o toxina, a un antígeno tumoral). La inmunoterapia también puede centrarse en utilizar los epítopos reconocidos por los linfocitos citotóxicos de las líneas celulares cancerosas. Alternativamente, pueden utilizarse polinucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas de ARN de interferencia, polinucleótidos de triple hélice y similares para modular selectivamente biomoléculas relacionadas con el inicio, la progresión y/o la patología de un tumor o cáncer.

[0205] En una realización, la inmunoterapia comprende inmunoterapias basadas en células adoptivas. Modalidades inmunoterapéuticas basadas en células adoptivas bien conocidas, incluyendo, sin limitación, células tumorales autólogas o alogénicas irradiadas, lisados tumorales o células tumorales apoptóticas, inmunoterapia basada en células presentadoras de antígenos, inmunoterapia basada en células dendríticas, transferencia de células T adoptivas, terapia de células T CAR adoptivas, terapia de potenciación inmunitaria autóloga (AIET), vacunas contra el cáncer y/o células presentadoras de antígenos. Dichas inmunoterapias celulares pueden modificarse aún más para expresar uno o más productos génicos que modulen aún más las respuestas inmunitarias, como la expresión de citoquinas como GM-CSF, y/o para expresar antígenos asociados a tumores (TAA), como Mage-1, gp-100, vacunas de neoantígenos específicas para pacientes y similares.

[0206] En otra realización, la inmunoterapia comprende inmunoterapias no basadas en células. En una realización, se utilizan composiciones que comprenden antígenos con o sin adyuvantes potenciadores de vacunas. Dichas composiciones existen en muchas formas bien conocidas, como composiciones peptídicas, virus oncolíticos, antígenos recombinantes que comprenden proteínas de fusión y similares. En otra realización adicional, se utilizan interleucinas inmunomoduladoras, como IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-17, IL-23 y similares, así como moduladores de las mismas (por ejemplo, anticuerpos bloqueantes o formas más potentes o duraderas). En otra realización, se utilizan citocinas inmunomoduladoras, como interferones, G-CSF, imiquimod, TNFalfa y similares, así como moduladores de las mismas (por ejemplo, anticuerpos bloqueantes o formas más potentes o duraderas). En otra realización, se utilizan quimiocinas inmunomoduladoras, como CCL3, CCL26 y CXCL7, y similares, así como moduladores de las mismas (por ejemplo, anticuerpos bloqueantes o formas más potentes o duraderas). En otra realización, se utilizan moléculas inmunomoduladoras dirigidas a la inmunosupresión, como moduladores de la señalización STAT3, moduladores de la señalización NF kappa B y moduladores del punto de control inmunitario. Los términos "punto de control inmunitario" y "terapia antipunto de control inmunitario" se han descrito anteriormente.

[0207] En otra realización adicional, los fármacos inmunomoduladores, como los inmunocitostáticos, los glucocorticoides, los citostáticos, las inmunofilinas y sus moduladores (por ejemplo, rapamicina, un inhibidor de la calcineurina, tacrolimus, ciclosporina (ciclosporina), pimecrolimus, abetimus, gusperimus, ridaforolimus, everolimus, temsirolimus, zotarolimus, etc.), hidrocortisona (cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triamcinolona, beclometasona, acetato de fudrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (doca) aldosterona, un esteroide no glucocorticoide, un inhibidor de la síntesis de pirimidina, lefunomida, terifunomida, un análogo del ácido fólico, metotrexato, globulina antitimocítica, globulina antilinfocitaria, talidomida, lenalidomida, pentoxifilina, bupropión, curcumina, catequina, un opioide, un inhibidor de IMPDH, ácido micofenólico, miriocina, fngolimod, un inhibidor de NF-xB, raloxifeno, drotrecogina alfa, denosumab, un inhibidor de la cascada de señalización NF-xB, disulfram, olmesartán, ditiocarbamato, un inhibidor del proteasoma, bortezomib, MG132, Prol, NPI-0052, curcumina, genisteína, resveratrol, partenolida, talidomida, lenalidomida, favopiridol, antiinflamatorios no esteroideos (AINE), trióxido de arsénico, dehidroximetilepoxiquinomicina (DHMEQ), I3C(indol-3-carbinol)/DIM(di-indolmetano) (13C/DIM), Bay 11-7082, luteolina, péptido SN-50 permeable a las células, IKBa.-superrepresor, oligodesoxinucleótido (ODN) NFKBdecoy, o un derivado o análogo de cualquiera de ellos. En otra realización más, se utilizan anticuerpos o proteínas inmunomoduladores.Por ejemplo, anticuerpos que se unen a CD40, receptor tipo Toll (TLR), OX40, GITR, CD27, o a 4-1BB, anticuerpos bispecifc de células T, un anticuerpo del receptor anti-IL-2, un anticuerpo anti-CD3, OKT3 (muromonab), otelixizumab, teplizumab, visilizumab, un anticuerpo anti-CD4, clenoliximab, keliximab, zanolimumab, un anticuerpo anti-CD11 a, efalizumab, un anticuerpo anti-CD18, erlizumab, rovelizumab, un anticuerpo anti-CD20, afutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, pascolizumab, rituximab, un anticuerpo anti-CD23, lumiliximab, un anticuerpo anti-CD40, teneliximab, toralizumab, un anticuerpo anti-CD40L, ruplizumab, un anticuerpo anti-CD62L, aselizumab, un anticuerpo anti-CD80, galiximab, un anticuerpo anti-CD147, gavilimomab, un anticuerpo inhibidor del estimulador de linfocitos B (BLyS), belimumab, una proteína de fusión CTLA4-Ig, abatacept, belatacept, un anticuerpo anti-CTLA4, ipilimumab, tremelimumab, un anticuerpo anti-eotaxina 1, bertilimumab, un anticuerpo anti-a4-integrina, natalizumab, un anticuerpo anti-IL-6R, tocilizumab, un anticuerpo anti-LFA-1, odulimomab, un anticuerpo anti-CD25, basiliximab, daclizumab, inolimomab, un anticuerpo anti-CD5, zolimomab, un anticuerpo anti-CD2, siplizumab, nerelimomab, faralimomab, atlizumab, atorolimumab, cedelizumab, dorlimomab aritox, dorlixizumab, fontolizumab, gantenerumab, gomiliximab, lebrilizumab, maslimomab, morolimumab, pexelizumab, reslizumab, rovelizumab, talizumab, telimomab aritox, vapaliximab, vepalimomab, afibercept, alefacept, rilonacept, un antagonista del receptor de IL-1, anakinra, un anticuerpo anti-IL-5, mepolizumab, un inhibidor de IgE, omalizumab, talizumab, un inhibidor de IL12, un inhibidor de IL23, ustekinumab, y similares.

[0208] Los suplementos nutricionales que mejoran las respuestas inmunitarias, como la vitamina A, la vitamina E, la vitamina C y similares, son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Pat. de EE.UU. Nos. 4,981,844 y 5,230,902 y Publ. PCT WO 2004/004483) pueden utilizarse en los métodos aquí descritos.

[0209] Del mismo modo, pueden utilizarse agentes y terapias distintos de la inmunoterapia o en combinación con agentes anti-RGMb y anti-PD-1 para estimular una respuesta inmunitaria y tratar así una afección que se beneficiaría de ello. Por ejemplo, la quimioterapia, la radiación, los modificadores epigenéticos (p. ej., modificadores de la histona deacetilasa (HDAC), modificadores de la metilación, modificadores de la fosforilación y similares), la terapia dirigida y similares son bien conocidos en la materia.

[0210] En una realización, se utiliza quimioterapia. La quimioterapia incluye la administración de un agente quimioterapéutico. Dicho agente quimioterapéutico puede ser, pero no está limitado a, los seleccionados de entre los siguientes grupos de compuestos: compuestos de platino, antibióticos citotóxicos, antimetabolitos, agentes antimitóticos, agentes alquilantes, compuestos de arsénico, inhibidores de la topoisomerasa del ADN, taxanos, análogos de nucleósidos, alcaloides vegetales y toxinas; y derivados sintéticos de los mismos. Los compuestos ejemplares incluyen, entre otros, agentes alquilantes: cisplatino, treosulfán y trofosfamida; alcaloides vegetales: vinblastina, paclitaxel y docetaxol; inhibidores de la topoisomerasa del ADN: tenipósido, crisnatol y mitomicina; antifolatos: metotrexato, ácido micofenólico e hidroxiurea; análogos de la pirimidina: 5-fuorouracilo, doxifuridina y arabinósido de citosina; análogos de las purinas: mercaptopurina y tioguanina; antimetabolitos del ADN: 2'-deoxi-5-fuorouridina, glicinato de afidicolina y pirazoloimidazol; y agentes antimitóticos: halicondrina, colchicina y rizoxina. También pueden utilizarse composiciones que comprendan uno o más agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, FLAG, CHOP). El FLAG se compone de fudarabina, arabinósido de citosina (Ara-C) y G-CSF. El CHOP comprende ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona. En otras realizaciones, se utilizan inhibidores de PARP (p. ej., PARP-1 y/o PARP-2), que son bien conocidos en la técnica (p. ej., Olaparib, ABT-888, BSI-201, BGP-15 (N-Gene Research Laboratories, Inc.); INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals Inc.); PJ34 (Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b); 3-aminobenzamida (Trevigen); 4-amino-1,8-naftalimida; (Trevigen); 6(5H)-fenantridinona (Trevigen); benzamida (Pat. de EE.UU. Re. 36,397); y NU1025 (Bowman et al.). El mecanismo de acción está generalmente relacionado con la capacidad de los inhibidores de PARP para unirse a PARP y disminuir su actividad. La PARP cataliza la conversión de .beta.-nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) en nicotinamida y poli-ADPribosa (PAR). Tanto la poli (ADP-ribosa) como la PARP se han relacionado con la regulación de la transcripción, la proliferación celular, la estabilidad genómica y la carcinogénesis (Bouchard V. J. et.al. Experimental Hematology, Volume 31, Number 6, June 2003, pp. 446-454(9); Herceg Z.; Wang Z.-Q. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Volume 477, Number 1, 2 Jun. 2001, pp. 97-110(14)). La poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) es una molécula clave en la reparación de las roturas de la cadena sencilla del ADN (SSB) (de Murcia J. et al. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94:7303-7307; Schreiber V, Dantzer F, Ame J C, de Murcia G (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7:517-528; Wang Z Q, et al. (1997) Genes Dev 11:2347-2358). La anulación de la reparación de SSB mediante la inhibición de la función PARP1 induce roturas de doble cadena (DSB) en el ADN que pueden desencadenar la letalidad sintética en células cancerosas con reparación DSB defectuosa dirigida por homología (Bryant H E, et al. (2005) Nature 434:913-917; Farmer H, et al. (2005) Nature 434:917-921). Los ejemplos anteriores de agentes quimioterapéuticos son ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Otros ejemplos de agentes quimioterapéuticos y otros agentes anticancerígenos se describen en la Pat. de EE.UU. Publs. 2013/0239239 y 2009/0053224.

[0211] En otra realización, el término "terapia dirigida" se refiere a la administración de agentes que interactúan selectivamente con una biomolécula elegida para tratar el cáncer. Por ejemplo, el bevacizumab (Avastin®) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. Publ. 2013/0121999, WO 2013/083499, y Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599) para inhibir la angiogénesis que acompaña al crecimiento tumoral. En algunos casos, la terapia dirigida puede ser una forma de inmunoterapia dependiendo de si la diana regula la función inmunomoduladora.

[0212] El término "terapia no dirigida" se refiere a la administración de agentes que no interactúan selectivamente con una biomolécula elegida para tratar el cáncer. Ejemplos representativos de terapias no dirigidas incluyen, sin limitación, quimioterapia, terapia génica y radioterapia.

[0213] En otra realización, un paso de linfodepleción previo, concurrente o posterior a la administración de agentes que inhiben o bloquean la expresión y/o actividad de RGMb y PD-1. Los métodos para lograr la linfodepleción en diversas formas y a diversos niveles son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU.

7,138,144). Por ejemplo, el término "linfodepleción transitoria" se refiere a la destrucción de linfocitos y células T, normalmente antes de la inmunoterapia. Esto puede lograrse de varias maneras, incluida la "irradiación subletal", que se refiere a la administración de una o más dosis de radiación que generalmente no es letal para todos los miembros de una población de sujetos a los que se aplica la administración. La linfodepleción transitoria no suele ser mieloablativa, como sería el caso en la linfodepleción completa, de modo que la capacidad hematopoyética o inmunológica del sujeto permanece lo suficientemente intacta como para regenerar las poblaciones de linfocitos y células T destruidas. Por el contrario, la "irradiación letal" se produce cuando la administración es generalmente letal para algunos miembros de la población de sujetos, pero no para todos, y la "irradiación supraletal" se produce cuando la administración es generalmente letal para todos los miembros de la población de sujetos.

[0214] Dependiendo de la aplicación y el propósito, la linfodepleción transitoria o la linfodepleción completa puede ser efectuada, por ejemplo, por cualquier combinación de irradiación, tratamiento con un agente mieloablativo, y/o tratamiento con un agente inmunosupresor, de acuerdo con protocolos estándar. Por ejemplo, los métodos biológicos incluyen, por ejemplo, la administración de células supresoras de la inmunidad o mediante la administración de moléculas biológicas capaces de inhibir la inmunorreactividad, como, por ejemplo, Fas-ligando y CTLA4-Ig. Algunos ejemplos de agentes mieloablativos son el busulfán, el dimetil mileran, el melfalán y la tiotepa. Algunos ejemplos de agentes inmunosupresores son prednisona, metil prednisolona, azatioprina, ciclosporina A, ciclofosfamida, fudarabina, CTLA4-Ig, anticuerpos contra células T, etc.

[0215] En algunas realizaciones, el agotamiento de subconjuntos de linfocitos específicos es útil y puede efectuarse mediante tratamiento con agentes, como anticuerpos, para agotar las poblaciones de células mediadoras del sistema inmunitario, o tratamiento con agentes que agotan preferentemente las poblaciones de células mediadoras del sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Hayakawa et al. (2009) Stem Cells 27:175-182). Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 pueden utilizarse para neutralizar y/o agotar los linfocitos T CD4+ y los linfocitos T CD8+, respectivamente.Del mismo modo, los anticuerpos anti-CDLA-4 pueden usarse para eliminar células T reguladoras, los anticuerpos anti-CD3 pueden usarse para eliminar todas las células T, los anticuerpos anti-B220 y/o anti-CD19 pueden usarse para eliminar todas las células B, los anticuerpos anti-CD11b pueden usarse para eliminar macrófagos, los anticuerpos anti-Ly-6G (Gr-1) pueden usarse para eliminar monocitos y granulocitos, y los anticuerpos anti-NK1.1 pueden usarse para eliminar células Natural Killer (NK).

[0216] Con respecto a la irradiación, una dosis subletal de irradiación está generalmente dentro del rango de 1 a 7,5 Gy de irradiación de cuerpo entero, una dosis letal está generalmente dentro del rango de 7,5 a 9,5 Gy de irradiación de cuerpo entero, y una dosis supraletal está dentro del rango de 9,5 a 16,5 Gy de irradiación de cuerpo entero.

[0217] Dependiendo del propósito y la aplicación, la dosis de irradiación puede administrarse como una dosis única o como una dosis fraccionada. De manera similar, la administración de una o más dosis de irradiación puede realizarse esencialmente en forma exclusiva en la parte del cuerpo o en una porción de la misma, de manera de inducir mieloreducción o mieloablación esencialmente en forma exclusiva en la parte del cuerpo o en la porción de la misma. Como se reconoce ampliamente en la materia, un sujeto puede tolerar como condicionamiento subletal niveles ultraelevados de irradiación selectiva en una parte del cuerpo, como una extremidad, niveles que constituyen un condicionamiento letal o supraletal cuando se utilizan para la irradiación de todo el cuerpo (véanse, por ejemplo, Breitz (2002) Cancer Biother Radiopharm. 17:119; Limit (1997) J. Nucl. Med. 38:1374; y Dritschilo y Sherman (1981) Environ. Health Perspect. 39:59). Dicha irradiación selectiva de la parte del cuerpo, o porción de la misma, puede utilizarse ventajosamente para dirigirse a compartimentos sanguíneos concretos, como ganglios linfáticos específicos, en el tratamiento de cánceres hematopoyéticos.

[0218] La radiación utilizada en radioterapia puede ser radiación ionizante. La radioterapia también puede consistir en rayos gamma, rayos X o haces de protones. Los ejemplos de radioterapia son, pero no están limitados a, la radioterapia de haz externo, la implantación intersticial de radioisótopos (I-125, paladio, iridio), radioisótopos como el estroncio-89, la radioterapia torácica, la radioterapia intraperitonealP-32 y la radioterapia abdominal y pélvica total. Para una visión general de la radioterapia, véase Hellman, Capítulo 16: Principios del tratamiento del cáncer: Radiation Therapy, 6a edición, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Filadelfia. La radioterapia puede administrarse como radiación de haz externo o teleterapia, en la que la radiación se dirige desde una fuente remota. La radioterapia también puede administrarse como terapia interna o braquiterapia, en la que se coloca una fuente radiactiva dentro del cuerpo cerca de las células cancerosas o de una masa tumoral. También se incluye el uso de terapia fotodinámica que comprende la administración de fotosensibilizadores, como la hematoporfirina y sus derivados, Vertoporfn (BPD-MA), ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, demetoxi-hipocrelina A; y 2BA-2-DMHA.

[0219] En otra realización, se utiliza terapia hormonal. Los tratamientos terapéuticos hormonales pueden comprender, por ejemplo, agonistas hormonales, antagonistas hormonales (por ejemplo, futamida, bicalutamida, tamoxifeno, raloxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas LH-RH), inhibidores de la biosíntesis y el procesamiento hormonales, y esteroides (por ejemplo, dexametasona, retinoides, deltoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidrotestosterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, estrógenos, testosterona, progestinas), vitaminasAderivados (por ejemplo, ácido retinoico todo trans (ATRA)); análogos de la vitamina D3; antigestágenos (por ejemplo, mifepristona, onapristona), o antiandrógenos (por ejemplo, acetato de ciproterona).

[0220] En otra realización, se utiliza la hipertermia, un procedimiento en el que el tejido corporal se expone a altas temperaturas (hasta 106°F.). El calor puede ayudar a reducir los tumores dañando las células o privándolas de las sustancias que necesitan para vivir. La terapia de hipertermia puede ser local, regional y de todo el cuerpo, utilizando dispositivos de calentamiento externos e internos. La hipertermia casi siempre se utiliza con otras formas de terapia (por ejemplo, radioterapia, quimioterapia y terapia biológica) para intentar aumentar su eficacia. La hipertermia local se refiere al calor que se aplica a una zona muy pequeña, como un tumor. El área puede calentarse externamente con ondas de alta frecuencia dirigidas a un tumor desde un dispositivo externo al cuerpo. Para lograr el calentamiento interno, se puede utilizar uno de varios tipos de sondas estériles, incluidos cables finos calentados o tubos huecos llenos de agua caliente; antenas de microondas implantadas; y electrodos de radiofrecuencia. En la hipertermia regional, se calienta un órgano o una extremidad. Los imanes y dispositivos que producen alta energía se colocan sobre la región que hay que calentar. En otro enfoque, denominado perfusión, se extrae una parte de la sangre del paciente, se calienta y se bombea (perfunde) a la región que se va a calentar internamente. El calentamiento de todo el cuerpo se utiliza para tratar el cáncer metastásico que se ha extendido por todo el cuerpo. Puede conseguirse utilizando mantas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductivas (como las de las mantas eléctricas) o cámaras térmicas (similares a las grandes incubadoras). La hipertermia no provoca ningún aumento marcado de los efectos secundarios de la radiación ni de las complicaciones. Sin embargo, el calor aplicado directamente sobre la piel puede causar molestias o incluso un dolor local importante en aproximadamente la mitad de los pacientes tratados. También puede causar ampollas, que suelen curarse rápidamente.

[0221] En otra realización adicional, la terapia fotodinámica (también llamada TFD, terapia de fotorradiación, fototerapia o fotoquimioterapia) se utiliza para el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Se basa en el descubrimiento de que ciertas sustancias químicas conocidas como agentes fotosensibilizantes pueden matar organismos unicelulares cuando éstos se exponen a un tipo de luz determinado. La TFD destruye las células cancerosas mediante el uso de una luz láser de frecuencia fxada en combinación con un agente fotosensibilizador. En la TFD, el agente fotosensibilizador se inyecta en el torrente sanguíneo y es absorbido por las células de todo el cuerpo. El agente permanece en las células cancerosas durante más tiempo que en las células normales. Cuando las células cancerosas tratadas se exponen a la luz láser, el agente fotosensibilizador absorbe la luz y produce una forma activa de oxígeno que destruye las células cancerosas tratadas. La exposición a la luz debe programarse cuidadosamente para que se produzca cuando la mayor parte del agente fotosensibilizante haya abandonado las células sanas pero siga presente en las células cancerosas. La luz láser utilizada en la TFD puede dirigirse a través de una fibra óptica (un hilo de vidrio muy fino). La fibra óptica se coloca cerca del cáncer para suministrar la cantidad adecuada de luz. La fibra óptica puede dirigirse a través de un broncoscopio a los pulmones para el tratamiento del cáncer de pulmón o a través de un endoscopio al esófago para el tratamiento del cáncer de esófago. Una ventaja de la TFD es que causa un daño mínimo al tejido sano. Sin embargo, dado que la luz láser que se utiliza actualmente no puede atravesar más de unos 3 centímetros de tejido (algo más de un centímetro y medio), la TFD se emplea principalmente para tratar tumores en la piel o justo debajo de ella, o en el revestimiento de órganos internos. La terapia fotodinámica hace que la piel y los ojos sean sensibles a la luz durante 6 semanas o más después del tratamiento. Se aconseja a los pacientes que eviten la luz solar directa y la luz interior intensa durante al menos 6 semanas. Si los pacientes deben salir al exterior, deben llevar ropa protectora, incluidas gafas de sol. Otros efectos secundarios temporales de la TFD están relacionados con el tratamiento de zonas específicas y pueden incluir tos, dificultad para tragar, dolor abdominal y dolor al respirar o dificultad para respirar. En diciembre de 1995, la Food and Drug Administration (FDA) de EE.UU. aprobó un agente fotosensibilizante llamado porfmer sódico, o Photofrin®, para aliviar los síntomas del cáncer de esófago que está causando una obstrucción y para el cáncer de esófago que no puede tratarse satisfactoriamente sólo con láser. En enero de 1998, la FDA aprobó el porfímero sódico para el tratamiento del cáncer de pulmón precoz de células no pequeñas en pacientes para los que los tratamientos habituales del cáncer de pulmón no son adecuados. El Instituto Nacional del Cáncer y otras instituciones están apoyando ensayos clínicos (estudios de investigación) para evaluar el uso de la terapia fotodinámica en varios tipos de cáncer, incluidos los de vejiga, cerebro, laringe y cavidad oral.

[0222] En otra realización más, la terapia láser se utiliza para aprovechar la luz de alta intensidad para destruir las células cancerosas. Esta técnica se utiliza a menudo para aliviar los síntomas del cáncer, como hemorragias u obstrucciones, especialmente cuando el cáncer no puede curarse con otros tratamientos. También puede utilizarse para tratar el cáncer reduciendo o destruyendo tumores. El término "láser" significa amplificación de la luz por emisión estimulada de radiación. La luz ordinaria, como la de una bombilla, tiene muchas longitudes de onda y se propaga en todas direcciones. En cambio, la luz láser tiene una longitud de onda específica y se concentra en un haz estrecho. Este tipo de luz de alta intensidad contiene mucha energía. Los láseres son muy potentes y pueden utilizarse para cortar acero o dar forma a diamantes. Los láseres también pueden utilizarse para intervenciones quirúrgicas muy precisas, como reparar una retina dañada en el ojo o cortar tejidos (en lugar de un escarpelo). Aunque existen varios tipos de láser, sólo tres se han utilizado ampliamente en medicina: Láser de dióxido de carbono (CO2)-- este tipo de láser puede eliminar capas finas de la superficie de la piel sin penetrar en las capas más profundas. Esta técnica es especialmente útil para tratar tumores que no se han extendido profundamente en la piel y ciertas afecciones precancerosas. Como alternativa a la cirugía tradicional con bisturí, el láser de CO2 también puede cortar la piel. El láser se utiliza de este modo para extirpar cánceres cutáneos. Láser de neodimio: itrio-aluminio-granate (Nd:YAG)-- la luz de este láser puede penetrar más profundamente en el tejido que la luz de los otros tipos de láser, y puede hacer que la sangre se coagule rápidamente. Puede transportarse a través de fibras ópticas a partes menos accesibles del cuerpo. Este tipo de láser se utiliza a veces para tratar cánceres de garganta. Láser de argón-- este láser sólo puede atravesar capas superficiales de tejido, por lo que es útil en dermatología y cirugía ocular. También se utiliza con colorantes sensibles a la luz para tratar tumores en un procedimiento conocido como terapia fotodinámica (TFD). Los láseres tienen varias ventajas sobre las herramientas quirúrgicas estándar, incluyendo: Los láseres son más precisos que los escarpelos. El tejido cercano a la incisión está protegido, ya que hay poco contacto con la piel u otros tejidos circundantes. El calor producido por el láser esteriliza la zona intervenida, reduciendo así el riesgo de infección. Es posible que se necesite menos tiempo de intervención, ya que la precisión del láser permite realizar una incisión más pequeña. El tiempo de cicatrización suele acortarse; como el calor del láser sella los vasos sanguíneos, hay menos hemorragias, hinchazón o cicatrices. La cirugía láser puede ser menos complicada. Por ejemplo, con la fibra óptica, la luz láser puede dirigirse a partes del cuerpo sin hacer una gran incisión. Pueden realizarse más procedimientos en régimen ambulatorio. Los láseres pueden utilizarse de dos formas para tratar el cáncer: reduciendo o destruyendo un tumor con calor, o activando una sustancia química -conocida como agente fotosensibilizador- que destruye las células cancerosas. En la TFD, se retiene en las células cancerosas un agente fotosensibilizador que puede ser estimulado por la luz para provocar una reacción que destruya las células cancerosas. Los láseres de CO2 y Nd:YAG se utilizan para reducir o destruir tumores. Pueden utilizarse con endoscopios, tubos que permiten a los médicos ver determinadas zonas del cuerpo, como la vejiga. La luz de algunos láseres puede transmitirse a través de un endoscopio fexible dotado de fibra óptica. Esto permite a los médicos ver y trabajar en partes del cuerpo a las que de otro modo no se podría llegar salvo mediante cirugía y, por tanto, permite apuntar con mucha precisión el rayo láser. Los láseres también pueden utilizarse con microscopios de baja potencia, lo que ofrece al médico una visión clara de la zona tratada. Utilizados con otros instrumentos, los sistemas láser pueden producir un área de corte de tan sólo 200 micras de diámetro, menos que la anchura de un hilo muy fino. El láser se utiliza para tratar muchos tipos de cáncer. La cirugía láser es un tratamiento estándar para determinados estadios del cáncer de glotis (cuerdas vocales), cuello uterino, piel, pulmón, vagina, vulva y pene. Además de su uso para destruir el cáncer, la cirugía láser también se utiliza para ayudar a aliviar los síntomas causados por el cáncer (cuidados paliativos). Por ejemplo, el láser puede utilizarse para reducir o destruir un tumor que obstruye la tráquea, facilitando así la respiración. También se utiliza a veces para paliar el cáncer colorrectal y anal. La termoterapia intersticial con láser (LITT) es uno de los avances más recientes en la terapia con láser. La LITT utiliza la misma idea que un tratamiento contra el cáncer llamado hipertermia: que el calor puede ayudar a reducir los tumores dañando las células o privándolas de las sustancias que necesitan para vivir. En este tratamiento, los láseres se dirigen a áreas intersticiales (áreas entre órganos) del cuerpo. Luego, la luz láser eleva la temperatura del tumor, lo que daña o destruye las células cancerosas.

e. Administración de Agentes

[0223] Los agentes inmunomoduladores de la invención se administran a los sujetos en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración farmacéutica in vivo, para potenciar las respuestas inmunitarias mediadas por células inmunitarias. Por "forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo" se entiende una forma de administración en la que cualquier efecto tóxico se ve compensado por los efectos terapéuticos. El término "sujeto" incluye a los organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, los mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. La administración de un agente tal como se describe en el presente documento puede realizarse en cualquier forma farmacológica que incluya una cantidad terapéuticamente activa de un agente solo o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

[0224] La administración de una cantidad terapéuticamente activa de la composición terapéutica de la presente invención se define como una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un agente puede variar en función de factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del péptido para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas al día o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

[0225] La inhibición o bloqueo tanto de la expresión y/o actividad de RGMb como de PD-1 puede lograrse mediante terapia combinada con los agentes moduladores descritos en el presente documento. La terapia combinada describe una terapia en la que tanto el RGMb como el PD-1 se inhiben o bloquean simultáneamente. La inhibición o el bloqueo simultáneos pueden lograrse mediante la administración simultánea de los agentes moduladores descritos en el presente documento (por ejemplo, en una forma de dosificación combinada o mediante la administración simultánea de agentes únicos) o mediante la administración de agentes únicos según un programa que dé como resultado cantidades eficaces de cada agente modulador presentes en el paciente al mismo tiempo.

[0226] Los agentes terapéuticos descritos en el presente documento pueden administrarse de manera conveniente, como por inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede recubrirse de un material para protegerlo de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Por ejemplo, para la administración de agentes, por vías distintas a la parenteral, puede ser deseable recubrir el agente con, o coadministrar el agente con, un material para prevenir su inactivación.

[0227] Un agente puede administrarse a un individuo en un portador, diluyente o adyuvante apropiado, coadministrado con inhibidores enzimáticos o en un portador apropiado como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones acuosas bufer. Adyuvante se utiliza en su sentido más amplio e incluye cualquier compuesto inmunoestimulante como el interferón. Los adyuvantes aquí contemplados incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos como el polioxietileno oleil éter y el n-hexadecil polietileno éter. Entre los inhibidores enzimáticos se encuentran el inhibidor de la tripsina pancreática, el diisopropilfluorofosfato (DEEP) y el trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales (Sterna et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

[0228] El agente también puede administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y sus mezclas, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados pueden contener un conservante para evitar la proliferación de microorganismos.

[0229] Las composiciones farmacéuticas de agentes adecuados para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición será preferiblemente estéril y deberá ser fluida hasta el punto de que se pueda jeringar fácilmente. Preferiblemente, será estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conservará frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, es preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol, sorbitol, cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0230] Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando un agente de la invención (por ejemplo, un anticuerpo, péptido, proteína de fusión o molécula pequeña) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo del agente más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estérilmente.

[0231] Cuando el agente está convenientemente protegido, como se ha descrito anteriormente, la proteína puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse a las composiciones compuestos activos suplementarios.

[0232] Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La "Forma unitaria de dosificación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas farmacéuticas de la invención están dictadas por, y dependen directamente de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que debe conseguirse, y (b) las limitaciones inherentes al arte de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

[0233] En una realización, un agente de la invención es un anticuerpo. Tal como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo (es decir, una dosis eficaz) oscila entre aproximadamente 0,001 y 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, 2 y 9 mg/kg, 3 y 8 mg/kg, 4 y 7 mg/kg, o 5 y 6 mg/kg de peso corporal. El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis requerida para tratar efectivamente a un sujeto, incluyendo pero no limitándose a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata a un sujeto con un anticuerpo en un intervalo de entre 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, más preferiblemente entre 3 y 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante 4, 5 o 6 semanas. También se apreciará que la dosis efectiva de anticuerpo utilizada para el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo de un tratamiento concreto. Los resultados de las pruebas diagnósticas pueden dar lugar a cambios en la posología.

III. Kits

[0234] La presente invención también abarca kits para tratar trastornos que se beneficiarían de respuestas inmunitarias reguladas, como infecciones y cánceres como el cáncer colorrectal, utilizando agentes que inhiben o bloquean la expresión y/o actividad de RGMb y PD-1. Por ejemplo, el kit puede comprender un anticuerpo anti-RGMb y un anticuerpo anti-PD-1 envasados en un recipiente adecuado y puede comprender además instrucciones para usar dichos anticuerpos para tratar cánceres en un paciente que los necesite. El kit también puede contener otros componentes, como herramientas de administración como empaquetados en un contenedor separado.

[0235] Esta invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y Métodos para los Ejemplos 2-5

a. Ratones

[0236] Los ratones BALB/cJ de tipo salvaje (WT) se adquirieron en el Jackson Laboratory. Se utilizaron ratones hembra de la misma edad a las 6 semanas. Los protocolos con animales fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Oncológico Dana-Farber y la Facultad de Medicina de Harvard.

b. Línea celular de cáncer y cultivo, edia

[0237] La línea celular de cáncer de colon de ratón CT26, la línea celular de cáncer renal de ratón RENCA y la línea celular de cáncer de mama de ratón 4T1 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en RPMI-1640 (Mediatech) suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor (Invitrogen), 1% de estreptomicina/penicilina, 15pg/ml de gentamicina (Invitrogen) y 1% de glutamax (Invitrogen) a 37°C en un incubador con un 5% de CO2.

c. Modelo de cáncer en ratón y tratamiento con anticuerpos

[0238] Bajo anestesia con isofurano, los ratones BALB/cJ fueron inyectados por vía subcutánea (s.c.) con la línea celular de cáncer de colon de ratón CT26 a razón de 5*10A5 células/ratón en el flanco izquierdo el día 0. A continuación, se trató a los ratones con anticuerpos monoclonales (mAbs) de ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) los días 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23. Los tratamientos con anticuerpos fueron RGMb mAb (307.9D1, IgG2a de rata), PD-1 mAb (29F.1A12, IgG2a de rata), y/o control de isotipo IgG2a de rata (clon 2A3, BioXCell), a 200pg del mAb o mAb indicados por ratón y por inyección, según se indica. Para probar el desarrollo de la memoria inmunológica antitumoral, ratones libres de tumores fueron desafiados (inyectados s.c.) con células de las líneas celulares tumorales CT26, RENCA, o 4T1 a 5*10A5 células/ratón. Específicamente, los ratones libres de tumor fueron desafiados en el día 60 con la línea celular CT26 mediante inyección en el flanco izquierdo, y luego desafiados de nuevo en el día 130 con la línea celular CT26 o la línea celular de cáncer renal RENCA mediante inyección en el flanco derecho. Los ratones que permanecieron libres de tumores tras este primer desafío fueron desafiados el día 175 con la línea celular de cáncer 4T1 mediante inyección en el flanco derecho. Los ratones de control sin tratamiento recibieron la misma inyección. Se monitoreó la supervivencia de los ratones y se midieron dos diámetros perpendiculares de un tumor cada 3 días. El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula,V= L * W2/2 (V: volumen, L: longitud, W: anchura). En algunos experimentos, los ratones fueron tratados con los mAbs indicados los días 2, 5, 8, 11 y 14. El día 17, se aislaron las células de los tumores y se analizaron mediante citometría de flujo y qRT-PCR.

d. Necropsia completa

[0239] A los ratones supervivientes de tumores largos tras el tratamiento con mAb y a los ratones de control emparejados por edad, con la piel anterior y posterior abierta, se les aplicó una solución neutra tamponada de Formalina al 10% (Sigma). La necropsia completa se realizó y analizó en el Centro de Histopatología de Roedores del Centro Oncológico Dana-Farber/Harvard de Boston, MA.

e. Aislamiento celular de tumores

[0240] Los tumores se extirparon de los ratones y se cortaron en trozos diminutos, se digirieron en RPMI 1640 con 5% de FBS, 1mg/ml de colagenasa IV (Sigma) y 200u/ml de DNasa I (Roche) a 37°C durante 1 hora, y luego se trataron con bufer lisador de glóbulos rojos (Sigma).

f. Citometría de flujo

[0241] Las células aisladas de tumores se tiñeron con anticuerpos diana y controles de isotipo utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo. Las células se tiñeron primero con LIVE/DEAD® Fixable Near-IR (Invitrogen) a 1:1000. Tras la preincubación con un mAb de receptor Fc de ratón (2,4G2), se tiñeron las células para detectar marcadores de superficie con múltiples mAbs antimouse conjugados con fluorescencia a 2,5 pg/ml: CD45 (30-F11)-BV605, F4/80 (BM8)-Alex 488, CD11c (N418)-APC, CD11b (M1/70)-PECy7, CD3 (17A2)-BV786, CD4 (RM4-5)-BV650, CD8 (53-6.7)-BV711, CD19 (6D5)-BV510, PD-1 (RPMI-30)-PerCP eFluor710, PDL1 (10F.9G2)-BV421, más RGMb (307.9D1)-PE o PD-L2 (TY-25)-PE. Todos los anticuerpos comerciales se adquirieron a BioLegend, excepto PD-1-PerCP eFluor710, que se compró a eBioscience. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo Fortessa SORP (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el software FlowJo 9.2 (TreeStar).

[0242] Para probar si el clon 29F.1A12 de mAb de PD-1 bloquea la unión del clon RPM1-30 de mAb de PD-1 conjugado con PE a PD-1, se preincubaron 300 células transfectadas con PD-1 con las concentraciones indicadas de clon 29F.1A12 de mAb de PD-1, clon 332.5E12 de mAb de PD-1 o control de isotipo, luego se tiñeron con clon RPM1-30 de mAb de PD-1 conjugado con PE y se analizaron por citometría de flujo. También se incluyó la tinción con control de isotipo (IgG-PE).

g. qRT-PCR

[0243] Se prepararon muestras de ARN total a partir de células de tumores enteros utilizando el mini kit RNeasy (QIAGEN). La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect® (QIAGEN). La qPCR utilizando ensayos de expresión génica TaqMan® para IL-4, IL-13, IL-12 y RPL19 (Applied Biosystems) se llevó a cabo en un sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems). Los cambios de pliegues en comparación con RPL19 se calcularon mediante el método ACt.

h. Análisis estadístico

[0244] Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para realizar curvas de supervivencia y la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para determinar la significación entre las curvas de supervivencia. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para comparar la diferencia en la erradicación del tumor RENCA o el retraso del crecimiento entre los ratones tratados con mAb y los ratones de control sin tratamiento. Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskai-Wallis para comparaciones múltiples para comparar la expresión de PD-L2, así como la expresión de ARNm de IL-4, IL-13 e IL-12 con diferentes tratamientos. Se utilizó un análisis de regresión lineal para analizar la correlación entre el tamaño del tumor y la expresión del ARNm de la IL-4. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPadPrism versión 6.00 para MacOSX, GraphPad Software, La Jolla California EE.UU., graphpad.com. p<0,05 se consideró significativo.

Ejemplo 2: Eficacia antitumoral del bloqueo único y combinado de RGMb y PD-1

[0245] El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tipos de cáncer más comunes y una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer (Edwards et al. (2014) Cancer 120:1290-1314). El CCR parece ser un tipo de cáncer que responde mal al bloqueo con anticuerpos de la muerte programada-1 (PD-1) o del ligando 1 de PD-1 (PD-L1) en ensayos clínicos (Brahmer et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455-2465; Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med.

366:2443-2454). Recientemente, Llosa y sus colegas (Llosa et al.(2014) Cancer Discov. 5:43-51) descubrieron que el subconjunto inestable de microsatélites (MSI) del cáncer colorrectal estaba altamente infltrado con linfocitos T citotóxicos CD8 activados y células Th1 activadas. Además, PD-1, PD-L1, el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), el gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) y la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) estaban altamente regulados en los tumores MSI, y estas cinco moléculas son actualmente objeto de tratamiento clínico. Por lo tanto, el subconjunto MSI del cáncer colorrectal está preparado para ser un candidato especialmente bueno para la inmunoterapia de bloqueo de puntos de control (Xiao y Freeman (2015) Cancer Discov. 5:16-18). La MSI está causada por el silenciamiento epigenético o la mutación de los genes de reparación de los errores de emparejamiento del ADN, pero el CCR con MSI comprende sólo alrededor del 15% de los CCR esporádicos y la mayoría de los CCR familiares, mientras que el CCR estable por microsatélites (MSS) comprende el 85% restante (Smyrk et al.(2001) Cancer 91:2417-2422). La mayoría de los CCR MSI suelen presentar enfermedad en estadios más bajos que los CCR MSS, por lo que el subtipo MSI representa solo el 5-6% de la población de CCR en estadio IV que suele participar en ensayos clínicos (Lochhead et al. (2013) J. Natl. Cancer Inst. 105:1151-1156). Por lo tanto, la mayoría de los pacientes con CCR en ensayos clínicos no responden bien al bloqueo de la vía PD-1 con anticuerpos. Esto deja una gran necesidad de inmunoterapias eficaces en el 95% restante de pacientes con CCR en estadio IV (Xiao y Freeman (2015) Cancer Discov. 5:16-18). La línea celular CT26 de carcinoma de colon es una de las más utilizadas en modelos de cáncer en ratón. Castle et al. demostraron que ninguno de los genes de reparación de emparejamientos erróneos está mutado en CT26 (Castle et al.(2014) BMC Genomics 15:190). Así pues, la línea celular CT26 no es de tipo MSI y es representativa del 95% de los CCR en estadio IV.

[0246] Se utilizó el modelo de cáncer de colon CT26 de ratón singénico para investigar el efecto inmunoterapéutico del bloqueo de anticuerpos de RGMb. Los ratones BALB/c fueron inyectados con células cancerosas CT26 por vía subcutánea (s.c.) en el flanco izquierdo el día 0. Los ratones fueron tratados con los anticuerpos monoclonales (mAb) indicados los días 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23 (Figura 1A). Los datos de volumen tumoral y supervivencia muestran que el bloqueo de RGMb no mostró eficacia antitumoral (Figuras 1B-1F). El bloqueo del anticuerpo PD-1 por sí solo tuvo una eficacia moderada (26% de supervivencia) (Figura 1G). Sin embargo, la combinación del bloqueo del anticuerpo RGMb con el bloqueo del anticuerpo PD-1 aumentó la supervivencia de los ratones en comparación con el bloqueo del anticuerpo PD-1 solo (50% frente a 26%) (Figura 1G). Los supervivientes de los grupos de bloqueo combinado y único estaban libres de tumores (Figuras 1C y 1E).

Ejemplo 3: Memoria inmunitaria antitumoral en supervivientes a largo plazo tratados con bloqueo único y combinado de RGMb y PD-1

[0247] Para probar el desarrollo de la memoria inmunológica antitumoral, ratones libres de tumores fueron desafiados con células tumorales por inyección s.c. en el flanco (Figuras 2A-2B). Los 7 de 20 ratones que sobrevivieron al tratamiento con PD-1 mAb (Figura 2A) y los 10 de 20 ratones que sobrevivieron al tratamiento con PD-1 mAb más RGMb mAb (Figura 2B) fueron desafiados el día 60 con la línea celular CT26. Todos los ratones erradicaron el nuevo tumor para seguir siendo supervivientes libres de tumores.

[0248] Para determinar si esta memoria inmunitaria era específica de los tumores CT26, estos ratones libres de tumores fueron desafiados en el día 130 con una línea celular CT26 o una línea celular de cáncer renal de ratón, RENCA. De nuevo, todos los ratones desafiados con CT26 erradicaron los tumores para ser supervivientes libres de tumores. Sorprendentemente, uno de los cuatro ratones del grupo tratado con PD-1 mAb (Figura 2A) y uno de los cinco ratones del grupo tratado con PD-1 mAb más RGMb mAb (Figura 2B) también erradicaron los tumores RENCA y sobrevivieron sin tumores. Uno de los cuatro ratones del grupo con tratamiento con mAb PD-1 presentó un crecimiento tumoral RENCA muy retardado a partir del día 36 tras el desafío (Figura 2A). Los ratones de control sin tratamiento que recibieron la misma inyección de células RENCA mostraron crecimiento tumoral a partir del día 10, y ninguno de los 17 ratones mostró erradicación tumoral o retraso del crecimiento. La diferencia en la erradicación completa del tumor RENCA o en el retraso del crecimiento tumoral entre estos ratones supervivientes tratados con mAb y los ratones de control sin tratamiento (3/9 frente a 0/17, p=0,0295, prueba Chi-cuadrado) indica que algunos de estos ratones supervivientes tratados con mAb adquirieron inmunidad frente al tumor RENCA a partir de la respuesta inmunológica anti-CT26.

[0249] Para determinar si este fenómeno también se aplicaba a otros tipos de tumores, los 10 supervivientes libres de tumores restantes fueron desafiados en el día 175 con la línea celular de cáncer de mama de ratón 4T1. Ninguno de estos ratones mostró respuestas tumorales anti-4T1, lo que indica que la memoria anti-CT26 no se extendió al tumor 4T1.

[0250] En conjunto, los datos indican que las respuestas de memoria antitumoral desarrolladas a partir del tratamiento con anticuerpos PD-1/RGMb del tumor CT26 hicieron que estos ratones sobrevivieran a largo plazo y fueran resistentes a una nueva provocación con CT26. Además, las respuestas de memoria tienen cierta eficacia contra algunas (RENCA), pero no todas (4T1), otras repruebas tumorales. Dado que es poco probable que RENCA y CT26 compartan mutaciones idénticas que generen un neoantígeno, esto sugiere cierta memoria inmunológica contra un autoantígeno conservado como gp100.

[0251] Los sobrevivientes libres de tumores a largo plazo (>6 meses) no mostraron síntomas manifiestos de eventos adversos. Los sobrevivientes de tumores a largo plazo fueron analizados con necropsias completas, que incluían secciones de todos los órganos. Se analizaron seis ratones con tratamiento con PD-1 mAb o PD-1 mAb más RGMb mAb que sobrevivieron más de 6 meses, así como dos ratones de la misma edad. No se observó infamación ni otras lesiones que sugirieran toxicidad. Se observaron algunas lesiones comunes en ratones viejos, como osteoartritis en la articulación y dilatación del cuerno uterino.

Ejemplo 4: Expresión de RGMb, PD-L2, PD-1 y PD-L1 en células inmunitarias infiltrantes de tumores

[0252] Se analizó la expresión de RGMb, PD-L2, PD-1 y PD-L1 en células de todo el tumor CT26, que incluye células tumorales y células inmunes infiltrantes. Los ratones fueron inyectados s.c. con células CT26 el día 0, y luego tratados con los mAbs indicados los días 2, 5, 8, 11 y 14. El día 17, se aislaron las células de los tumores y se analizaron mediante citometría de flujo multicolor (Figura 3A). Se analizaron las células inmunitarias CD45+ que infiltran el tumor y las células tumorales CD45- de los ratones tratados con mAb de control y, a continuación, se comparó la expresión de superficie entre los ratones con diferentes tratamientos (es decir, control, PD-1 y PD-1 más RGMb mAbs). En el caso de las células inmunitarias CD45+ infiltrantes de tumores procedentes de ratones tratados con mAb de control, se examinó la expresión de marcadores en macrófagos (CD45+F4/80+), células dendríticas (CD45+CD11c+) y células T CD8+ (CD45+CD3+CD8+) (Figura 3B). Se observaron niveles muy elevados de expresión de RGMb en la superficie celular de macrófagos infiltrantes de tumores y células dendríticas. En cambio, en condiciones de reposo fisiológico, la expresión de RGMb en la superficie celular de las células inmunitarias era indetectable (Xiao et al. (2014) J. Exp. Med. 211:943-959). La expresión de PD-L2 era indetectable en macrófagos y linfocitos T CD8+, y apenas detectable en células dendríticas. En consonancia con trabajos anteriores, PD-L1 se expresó principalmente en macrófagos y células dendríticas y fue baja en células T CD8+, mientras que PD-1 se expresó en gran medida en células T CD8+ y no en macrófagos y células dendríticas. Las células CD45- eran la población celular mayoritaria en el tumor CT26 y deberían ser células tumorales CT26. Se determinó que la línea celular CT26 era CD45- y también expresaba altos niveles de RGMb, bajos niveles de PD-L2, y ningún PD-L1 o PD-1 en la superficie celular (Figura 4A). Sin embargo, las células tumorales CD45- de los ratones tratados con mAb de control mostraron niveles más bajos de RGMb y ninguna expresión de PD-L2 en la superficie celular. Como era de esperar, la expresión de PD-L1 estaba muy aumentada y no había expresión de PD-1 en las células tumorales CD45 (Figura 4B). Así pues, los datos de expresión demostraron que en el microenvío tumoral sin inmunoterapia, la superficie celular de RGMb estaba regulada al alza en las células inmunitarias CD45+, pero a la baja en las células tumorales CD45-. PD-L2 se reguló a la baja en las células tumorales CD45. PD-L1 se expresaba en las células inmunitarias CD45+ y estaba altamente regulada en las células tumorales CD45-, mientras que PD-1 se expresaba altamente en las células T CD8+.

Ejemplo 5: Expresión de PD-L2, IL-4 y PD-1 en ratones con tumores tratados con bloqueo único y combinado de RGMb y PD-1

[0253] Entre los grupos de tratamiento con control, PD-1, y PD-1 más RGMb mAbs, la expresión de PD-L2 fue regulada al alza en macrófagos en el día 17 en ratones con tratamiento PD-1 mAb (Figuras 5A-5B), pero no en células dendríticas o células T CD8+. La regulación al alza de la expresión de PD-L2 tras el tratamiento con PD-1 mAb puede explicar la mayor eficacia de PD-1 mAb cuando se combina con RGMb mAb, que puede bloquear la interacción entre RGMb y PD-L2. Con el fin de explorar el mecanismo de regulación de PD-L2, se analizó la expresión de ARNm de citoquinas Th2, que se sabe que regulan la expresión de PD-L2. Como era de esperar, la expresión de ARNm de las citocinas Th2 IL-4 e IL-13, pero no de la citocina Th1 IL-12, aumentó en las células aisladas de los tumores CT26 el día 17 (Figuras 5C-5E). Además, la mayor expresión de ARNm de IL-4 se correlacionó con un menor volumen tumoral en ratones con tratamiento combinado de PD-1 y RGMb mAb, pero no en ratones con tratamiento único de IgG de control o PD-1 mAb (Figuras 5F-5H). Estos datos indican que el tratamiento con PD-1 mAb induce una infamación mediada por Th2 que resulta en una regulación al alza de PD-L2 en algunos ratones que es sensible al bloqueo de RGMb-PD-L2, lo que conduce a una reducción del volumen tumoral.

[0254] La expresión de PD-L1 no mostró cambios significativos en macrófagos infiltrantes de tumores, células dendríticas o células T CD8+ en el día 17 con diferentes tratamientos. Sin embargo, en este estudio (Figura 6A) y en otros estudios realizados se observó una reducción de la expresión de PD-1 en las células T CD8+ infiltrantes del tumor en el día 17 con el tratamiento con mAb PD-1. El mAb PD-1 utilizado para el tratamiento fue el clon 29F.1A12, mientras que el mAb PD-1 utilizado para la citometría de flujo fue el clon RPMI-30. Se ha demostrado que 29F.1A12 y RPMI-30 se unen a epítopos diferentes y sólo se bloquean mínimamente de forma cruzada (Figura 6B). Estos resultados indican que el bloqueo de PD-1, al permitir un mayor nivel de activación celular, también puede tener el efecto de reducir la expresión de PD-1 en las células T CD8+ que penetran en el tumor.

[0255] En base a los resultados descritos anteriormente, el bloqueo combinado de anticuerpos tanto de RGMb como de PD-1 aumentó la supervivencia en el modelo de cáncer de colon CT26 de ratón singénico, en comparación con el bloqueo de PD-1 solo (algún efecto de supervivencia) y el bloqueo de RGMb solo (ningún efecto de supervivencia). Los supervivientes estaban libres de tumores y seguían estándolo después de desafiarlos, lo que indica el desarrollo de memoria inmunológica. La respuesta de memoria inmunológica desarrollada tras el tratamiento con anticuerpos en el tumor CT26 fue eficaz contra el tumor CT26 y no protegió a los ratones de la provocación con el tumor de mama 4T1. Sin embargo, algunos ratones (3/9) mostraron inmunidad efectiva contra el tumor RENCA tras la provocación con células RENCA. Las células CT26 y RENCA pueden compartir algunos antígenos propios comunes. Por lo tanto, la inmunoterapia para un tipo de cáncer puede tener la capacidad de prevenir otro tipo de cáncer que comparta los mismos antígenos.

[0256] Se observó una expresión de RGMb en la superficie celular altamente regulada en macrófagos infiltrantes de tumores y células dendríticas. En cambio, en condiciones fisiológicas de reposo, la expresión de RGMb en la superficie celular de las células inmunitarias era indetectable (Xiao et al.(2014) J.Exp. Med. 211:943-959). También se observó un alto nivel de expresión de RGMb en la superficie celular en la línea celular CT26 (CD45- ), pero la expresión de RGMb se reguló a la baja en las células tumorales CD45- aisladas del tumor CT26. Estudios anteriores han demostrado la expresión de RGMb en varias líneas celulares de cáncer o tejidos cancerosos (Li et al. (2012) Int. J. Oncol. 40:544-550; Li e tal.(2011) Anticancer Res. 31:1703-1711; Li et al.(2012) J. Cell. Biochem. 113:2523-2531; Li et al. (2015) Diagn. Pathol. 10:63; Shi et al. (2015) Oncotarget 6:20540-20554; y Xiao et al. (2014) J. Exp. Med. 211:943-959). En cuanto a la función no inmunitaria de la RGMb en el crecimiento de células tumorales, dos estudios demostraron que la RGMb inhibía el crecimiento del cáncer de baya y de próstata a través de la vía de la BMP (Li et al.(2012)Int. J.Oncol. 40:544-550; Li et al. (2012) J. Cell. Biochem. 113:2523-2531) y un estudio descubrió que la RGMb promovía el crecimiento del CCR a través de la vía de las BMP. Con la interacción entre el tumor y el sistema inmunitario, el sistema inmunitario puede regular a la baja la expresión de RGMb en las células tumorales CT26 y el tumor puede proporcionar señales para regular al alza la expresión de RGMb en las células inmunitarias.

[0257] Además, se descubrió que la expresión de PD-L2 estaba regulada al alza en los macrófagos infiltrantes del tumor después del tratamiento con PD-1 mAb y en asociación con un mayor nivel de ARNm de IL-4, que se correlaciona con un menor volumen tumoral. Estos datos indican que el tratamiento con PD-1 mAb induce una inflamación mediada por Th2 que resulta en una regulación al alza de PD-L2 en los macrófagos. Dado que RGMb también se reguló al alza en macrófagos y células dendríticas infiltrantes de tumores, se cree que la interacción entre RGMb y PD-L2 contribuye a la inmunosupresión en el microenvolvimiento tumoral, de acuerdo con el hallazgo de que la interacción RGMb-PD-L2 promueve notablemente el desarrollo de tolerancia respiratoria (Xiao et al. (2014) J. Exp. Med. 211:943-959). No se observó un aumento de la expresión de Foxp3 en esas células con el tratamiento con mAb PD-1 y estudios adicionales pueden aclarar la implicación de otros mecanismos. La regulación al alza de la expresión de PD-L2 tras el tratamiento con PD-1 mAb ofrece una oportunidad para la interacción de RGMb y PD-L2, lo que puede explicar la mayor eficacia del bloqueo combinado de anticuerpos PD-1 y RGMb.

[0258] Estos resultados indican que la inmunoterapia de combinación de puntos de control inmunitarios que utiliza agentes anti-RGMb y anti-PD-1 para tratar el CCR y otros trastornos, como cánceres e infecciones, especialmente cuando el bloqueo de PD-1 tiene cierta eficacia, es más efectiva. Por ejemplo, la supervivencia de los pacientes con CCR, especialmente los que no responden bien a la inmunoterapia que actúa sobre la vía PD-1, puede mejorar con una combinación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de agentes para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal mediante el aumento de una respuesta inmunitaria de las células inmunitarias en un sujeto, que comprende un primer agente que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 y bloquea la interacción entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, y un segundo agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a RGMb y bloquea la interacción entre RGMb y PD-L2 y entre RGMb y una BMP

2. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de la reclamación 1, en la que dicho primer agente y/o dicho segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es murino, quimérico, humanizado, compuesto o humano.

3. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de la reclamación 1 o 2, en la que dicho primer agente y/o segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que está marcado detectablemente, comprende un dominio efector, comprende un dominio Fc, y/o se selecciona del grupo que consiste en fragmentos de Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, y fragmentos de diacuerpos.

4. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de cualquiera de las reclamaciones 1-3, en la que dicho primer agente y/o dicho segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se conjuga con un agente citotóxico, preferentemente en la que dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente biológico, una toxina y un isótopo radiactivo.

5. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de cualquiera de las reclamaciones 1-4, en la que el anticuerpo bloqueante que se une a RGMb también bloquea la interacción entre NEO1 y RGMb.

6. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprende además la administración de uno o más agentes o terapias adicionales que aumentan la respuesta inmunitaria o tratan la afección.

7. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de la reclamación 6, en la que uno o más agentes o terapias adicionales se seleccionan del grupo que consiste en inmunoterapia, inhibición del punto de control inmunitario, una vacuna, quimioterapia, radiación, modificadores epigenéticos y terapia dirigida.

8. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de cualquiera de las reclamaciones 1-7, en la que el sujeto es un mamífero.

9. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de la reclamación 8, en la que el mamífero es un modelo animal de la condición.

10. La cantidad terapéuticamente efectiva para el uso de la reclamación 8, en la que el mamífero es un ser humano.

11. Un kit que comprende un primer agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 y bloquea la interacción entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, y un segundo agente que es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a RGMb y bloquea la interacción entre RGMb y PDL2 y entre RGMb y una BMP, e instrucciones para el uso del primer y segundo agentes en el tratamiento del cáncer colorrectal en el sujeto.

12. El kit de la reclamación 11, en el que dicho primer agente y/o dicho segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es murino, quimérico, humanizado, compuesto o humano.

13. El kit de la reclamación 11 o 12,

donde dicho primer agente y/o dicho segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que está marcado detectablemente, comprende un dominio efector, comprende un dominio Fc, y/o dicho primer agente y/o dicho segundo agente se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fv, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, rIgG, sdAb, sdFv, y fragmentos de diacuerpos.

14. El kit de cualquiera de las reclamaciones 11-13,

donde dicho primer agente y/o dicho segundo agente es un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se conjuga con un agente citotóxico, preferentemente donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente biológico, una toxina y un isótopo radiactivo.

15. El kit de cualquiera de las reclamaciones 12-14, en el que el anticuerpo que se une a RGMb también bloquea la interacción entre NEO1 y RGMb.