ES2994374T3 - Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof - Google Patents

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Abstract

Se describen conjugados de moléculas de anticuerpo y fármaco (ADC) que se unen específicamente a lipopolisacáridos (LPS). Los conjugados de moléculas de anticuerpo y fármaco se pueden utilizar para tratar, prevenir y/o diagnosticar infecciones bacterianas y trastornos relacionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados molécula de anticuerpo-fármaco y usos de los mismos
Una amplia variedad de bacterias pueden provocar infecciones que llevan a enfermedades de leves a graves. Las infecciones bacterianas a menudo se tratan con antibióticos. Sin embargo, la aparición de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos ha complicado el tratamiento de las infecciones. Las infecciones resistentes a los antibióticos provocan a menudo mayor discapacidad y muerte en comparación con las infecciones fácilmente tratables con antibióticos. De acuerdo con los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), cada año en los Estados Unidos, por lo menos 2 millones de personas contraen infecciones graves por bacterias resistentes a uno o más de los antibióticos diseñados para tratar esas infecciones. Por lo menos 23.000 personas mueren cada año como consecuencia directa de estas infecciones resistentes a los antibióticos. Estas estimaciones se basan en suposiciones conservadoras y son probablemente estimaciones mínimas. Es posible que mueran más pacientes por otras afecciones que se complicaron con una infección bacteriana. Cuando las opciones de tratamiento antibiótico de primera línea y luego de segunda línea se ven limitadas por la resistencia o no están disponibles, los profesionales sanitarios se ven obligados a usar antibióticos que pueden ser más tóxicos para el paciente y, con frecuencia, más caros y menos eficaces. En muchos casos, las infecciones resistentes a los antibióticos requieren tratamientos prolongados o más costosos, prolongan las estancias hospitalarias y hacen necesarias más visitas al médico y un mayor uso de los servicios sanitarios.
El uso de antibióticos es uno de los factores más importantes que llevan a la resistencia a los antibióticos en todo el mundo. Los antibióticos se encuentran entre los fármacos más recetados en medicina humana. Sin embargo, de acuerdo con los CDC, hasta el 50% de todos los antibióticos recetados a las personas no son necesarios o no son óptimamente eficaces según lo prescrito. Los antibióticos también se usan comúnmente en animales de abasto para prevenir, controlar y tratar enfermedades, y para favorecer el crecimiento de los animales destinados a la producción de alimentos. Las cepas de bacterias resistentes pueden propagarse de persona a persona, o a partir de fuentes no humanas en el medio ambiente, incluyendo los alimentos.
Hay una necesidad de desarrollar nuevos enfoques para tratar, prevenir y diagnosticar infecciones bacterianas.
La US 2015/344524 describe derivados de apidaecina modificados como péptidos antibióticos.
La US 2011/117621 describe la modificación específica del sitio de proteínas mediante la incorporación de una etiqueta de aldehído. La WO 2012/097333 describe polipéptidos de inmunoglobulina marcados con aldehído y su uso.
La WO 2017/083515 describe conjugados molécula de anticuerpo-fármaco que se unen específicamente a lipopolisacáridos.
SUMARIO
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción debe interpretarse como una referencia a los conjugados anticuerpo-fármaco o composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
La divulgación proporciona, por lo menos en parte, moléculas de anticuerpo o conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que se unen a bacterias, por ejemplo, bacterias Gram negativas, por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS) en la membrana externa de bacterias Gram negativas, y que comprenden propiedades funcionales y estructurales divulgadas en la presente. En una realización, el ADC comprende un péptido antimicrobiano acoplado específicamente (por ejemplo, conjugado) a una molécula de anticuerpo anti-LPS. En una realización, el ADC comprende una pluralidad de péptidos antimicrobianos, cada uno acoplado específicamente (por ejemplo, conjugado) a una molécula de anticuerpo anti-LPS. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a una región central del LPS. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a un componente monosacárido (por ejemplo, heptosa) del LPS dePseudomonas aeruginosa.En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une al residuo HepI fosforilado (por ejemplo, hiperfosforilado o bifosforilado) del LPS de núcleo (por ejemplo, enPseudomonas aeruginosa).En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a, inhibe y/o reduce la viabilidad de una o más bacterias, por ejemplo, bacterias Gram negativas, de diferentes géneros, especies y/o subespecies. Las moléculas de anticuerpo se describen en lasTablas 1 y 8de la presente.A veces, el ADC comprende una molécula de anticuerpo que se selecciona de lasTablas 1 u 8.Aveces, la molécula de anticuerpo o ADC comprende una o más regiones variables de cadena pesada y/o una o más regiones variables de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo o ADC comprende una o más CDR de cadena pesada y/o una o más CDR de cadena ligera descritas en laTabla 1 u 8.A veces, el ADC comprende un péptido antimicrobiano. Los péptidos antimicrobianos se describen en la presente, por ejemplo, en lasTablas 3 o 6A-6B,o en lasFIGS. 4,15A-15B, o 36. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que en una realización, la conjugación de una molécula de anticuerpo con un péptido antimicrobiano puede mejorar una o más propiedades de la molécula de anticuerpo y/o péptido antimicrobiano, por ejemplo, mejorar la capacidad de un péptido antimicrobiano para inhibir, o reducir la viabilidad, de una o más bacterias, por ejemplo, una o más bacterias Gram-negativas, de diferentes géneros, especies y/o subespecies. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos, vectores de expresión, células huésped, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), kits y métodos para elaborar las moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos. Las moléculas de anticuerpos, ADC y péptidos antimicrobianos divulgados en la presente pueden usarse (solos o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar infecciones bacterianas o trastornos relacionados, por ejemplo, provocados por o asociados con bacterias Gram negativas (por ejemplo,Pseudomonas,por ejemplo,Pseudomonas aeruginosa).
Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona un conjugado de molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), en donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa modificado.
En una realización, el motivo de sulfatasa modificado tiene la fórmula:
X1(FGly')X2Z2XaZa
donde FGly' tiene la fórmula:
en donde J<1>es el péptido antimicrobiano acoplado covalentemente;
cada L<1>es una fracción divalente seleccionada independientemente entre alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, alquinileno, alquinileno, arileno, arileno sustituido, cicloalquileno, cicloalquileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, heterocicleno, heterocicleno sustituido, acilo, amido, aciloxi, uretanileno, tioéster, sulfonilo, sulfonamida, éster de sulfonilo, -O-, -S-, -NH- y amina sustituida;
n es un número seleccionado entre cero y 40;
Z<2>es un residuo de prolina o alanina;
X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa está en un extremo N-terminal del polipéptido, X<1>está presente;
X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y
Z<3>es un aminoácido básico.
En una realización, la molécula de anticuerpo presenta el péptido antimicrobiano acoplado covalentemente en una superficie accesible al solvente cuando está en estado plegado.
En una realización, el motivo de sulfatasa modificado es un motivo de sulfatasa modificado heterólogo. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado comprende o consiste en 12 o menos(porejemplo, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, o 6 o menos) residuos de aminoácidos.
En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en el ADC en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, o un lazo accesible por solvente de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en una cadena pesada (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3). En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en un extremo terminal (por ejemplo, el extremo C-terminal) de la región constante de la cadena pesada. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región de la región constante de cadena pesada distinta de un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de cadena pesada. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en una cadena ligera (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en una región constante de una cadena ligera. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado está localizado en un extremo terminla (por ejemplo, el extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región de la región constante de la cadena ligera distinta de un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera.
En una realización, el ADC comprende una pluralidad de motivos de sulfatasa modificados. En una realización, el ADC comprende dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más) motivos de sulfatasa modificados. En una realización, el ADC comprende tres o más (por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8 o más) motivos de sulfatasa modificados. En una realización, el ADC comprende cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8 o más) motivos de sulfatasa modificados. En una realización, el ADC comprende cuatro motivos de sulfatasa modificados.
En una realización, los motivos de sulfatasa modificados están localizados en el ADC en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, o un lazo accesible por solvente de la molécula de anticuerpo. En una realización, los motivos de sulfatasa modificados están localizados en una cadena pesada (o un fragmento de la misma), una cadena ligera (o un fragmento de la misma), o ambas, de la molécula de anticuerpo. En una realización, los motivos de sulfatasa modificados están localizados en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una o más de CH1, CH2 o CH3), una región constante de la cadena ligera, o ambas. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC comprende dos o más cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC comprende dos o más cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada cadena pesada comprendiendo dos motivos de sulfatasa modificados (por ejemplo, uno en CH1 y uno en CH3, uno en CH1 y uno en CH2, o uno en CH2 y uno en CH3).
En una realización, los motivos de sulfatasa modificados se proporcionan como un concatámero que comprende motivos de sulfatasa modificados separados por un conector flexible.
En una realización, Z<3>es arginina (R). En una realización, X<1>, cuando está presente, X<2>, y X<3>son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado. En una realización, X<1>, cuando está presente, es L, M, V, S o T. En una realización, X<2>y X<3>son cada uno independientemente S, T, A, V, G, o C. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado tiene la fórmula: L(FGly')TPSR (SEQ ID NO: 168).
En otro aspecto, la divulgación presenta una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehído (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) que comprende un motivo de sulfatasa que tiene una secuencia de aminoácidos de
X<1>Z<1>X<2>Z<2>X<3>Z<3>
donde
Zi es un residuo de cisteína, serina o 2-formilglicina;
Z<2>es un residuo de prolina o alanina;
Xi está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa heteróloga está en un extremo N-terminal del polipéptido marcado con aldehído, X<1>está presente; y
X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y
Z<3>es un aminoácido básico.
En una realización, la molécula de anticuerpo es capaz de presentar un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente en una superficie accesible al solvente cuando está en estado plegado.
En una realización, el motivo de sulfatasa es un motivo de sulfatasa heterólogo. En una realización, el motivo de sulfatasa es un motivo de sulfatasa no modificado. En otra realización, el motivo de sulfatasa es un motivo de sulfatasa modificado. En una realización, el motivo de sulfatasa comprende o consiste en 12 o menos(porejemplo, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, o 6 o menos) residuos de aminoácidos.
En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo o un lazo accesible con solvente de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una cadena pesada (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3). En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en un extremo terminal(por ejemplo, el extremo C-terminal) de la región constante de la cadena pesada. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región de la región constante de cadena pesada distinta de un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de cadena pesada. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una cadena ligera (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región constante de una cadena ligera. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en un extremo terminal (por ejemplo, el extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera. En una realización, el motivo de sulfatasa está localizado en una región de la región constante de la cadena ligera distinta de un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una pluralidad de motivos de sulfatasa. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más) motivos de sulfatasa. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende tres o más (por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8 o más) motivos de sulfatasa modificados. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8 o más) motivos de sulfatasa modificados. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende cuatro motivos de sulfatasa modificados.
En una realización, los motivos de sulfatasa están localizados en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo o un lazo accesible con solvente de la molécula de anticuerpo. En una realización, los motivos de sulfatasa están localizados en una cadena pesada (o un fragmento de la misma), una cadena ligera (o un fragmento de la misma), o ambas, de la molécula de anticuerpo. En una realización, los motivos de sulfatasa están localizados en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una o más de CH1, CH2 o CH3), una región constante de la cadena ligera, o ambas. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende dos o más cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende dos o más cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende dos motivos de sulfatasa modificados (por ejemplo, uno en CH1 y uno en CH3, uno en CH1 y uno en CH2, o uno en CH2 y uno en CH3).
En una realización, los motivos de sulfatasa se proporcionan como un concatámero que comprende motivos de sulfatasa modificados separados por un conector flexible.
En una realización, Z<3>es arginina (R). En una realización, X<1>, cuando está presente, X<2>, y X<3>son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado. En una realización, X<1>, cuando está presente, es L, M, V, S o T. En una realización, X<2>y X<3>son cada uno independientemente S, T, A, V, G, o C. En una realización, el motivo de sulfatasa modificado tiene la fórmula: LCTPSR (SEQ ID NO: 169).
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para producir un ADC que comprende poner en contacto una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehído (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehído descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente) en condiciones que permitan que se produzca una reacción entre un aldehído de la molécula de anticuerpo y un grupo reactivo del péptido antimicrobiano, produciendo de este modo el ADC.
En una realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido comprende un residuo de 2-formilglicina (por ejemplo, FGly' en Z<1>). En una realización, el péptido antimicrobiano comprende un grupo reactivo aminooxi o hidrazida.
En una realización, el método comprende combinar en una mezcla de reacción la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído y el péptido antimicrobiano.
En una realización, el péptido antimicrobiano se pone en contacto con la molécula de anticuerpo, o se proporciona en la mezcla de reacción, en una cantidad suficiente para proporcionar una proporción deseada de péptido antimicrobiano a molécula de anticuerpo. En una realización, la proporción entre el péptido antimicrobiano y la molécula de anticuerpo es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, o más. En una realización, la proporción entre el péptido antimicrobiano y la molécula de anticuerpo es de aproximadamente 4:1.
En una realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído y el péptido antimicrobiano se acoplan mediante la ligamiento Hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS). En otra realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído y el péptido antimicrobiano se acoplan mediante conjugación con oximas e hidrazidas seguido de reducción.
En una realización, el método comprende además aislar (por ejemplo, purificar) el ADC, por ejemplo, a partir de la mezcla de reacción. En una realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído se pliega antes de que la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído se ponga en contacto con el péptido antimicrobiano (por ejemplo, antes de que la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído se combine con el péptido antimicrobiano en la mezcla de reacción).
En un aspecto, la divulgación proporciona un ADC producido por un método descrito en la presente.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende un<a>D<c>que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente) y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa modificado descrito en la presente.
En un aspecto, la divulgación proporciona una mezcla de reacción que comprende un ADC que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano(porejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), en donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa (por ejemplo, un motivo de sulfatasa modificado) descrito en la presente.
En un aspecto, la divulgación presenta un método para tratar o prevenir una infección bacteriana o un trastorno relacionado, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un ADC, o una composición farmacéutica que comprende un ADC, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la infección bacteriana o el trastorno relacionado, en donde el ADC comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), y en donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa modificado descrito en la presente.
En una realización, la infección bacteriana está asociada con una bacteria Gram-negativa. En una realización, la infección bacteriana es una infección porPseudomonas.En una realización, la infección bacteriana está asociada conPseudomonas aeruginosa.
En un aspecto, la divulgación presenta un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehído descrita en la presente.
En un aspecto, la divulgación proporciona un ADC que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), en donde el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo mediante (a) conjugación de lisina (por ejemplo, usando una lisina expuesta a la superficie como grupo reactivo del anticuerpo); (b) disulfuros entre cadenas (por ejemplo, usando disulfuros que unen HC-HC o HC-LC); (c) un aminoácido no nativo (por ejemplo, un aminoácido sustituido con aldehído, azida o alquino); o (d) un polímero biodegradable (por ejemplo, lisina o tiol).
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de (a). En una realización, la molécula de anticuerpo se conjuga directamente con un aminoácido activado en el péptido antimicrobiano. En una realización, una lisina de la molécula de anticuerpo se convierte en un grupo reactivo tiol y la molécula de anticuerpo con el grupo reactivo tiol se liga a un péptido antimicrobiano tiolado. En una realización, una lisina de la molécula de anticuerpo se convierte en un tiol libre y la molécula de anticuerpo con el tiol libre se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de (b). En una realización, los disulfuros entre cadenas de la molécula de anticuerpo se reducen y la molécula de anticuerpo con los disulfuros entre cadenas reducidos se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de (c). En una realización, la molécula de anticuerpo se liga al péptido antimicrobiano mediante química de clic (Kolb et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2001; 40(11):2004-2021; Evans Australian Journal of Chemistry. 2007; 60 (6): 384-395).
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de (d). En una realización, el péptido antimicrobiano se liga a un polímero biodegradable y el polímero se liga a la molécula de anticuerpo.
En una realización, el ADC se proporciona en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica).
En una realización, el ADC o la composición farmacéutica se usa para tratar o prevenir una infección bacteriana (por ejemplo, una infección está asociada con una bacteria Gram-negativa, por ejemplo,Pseudomonas aeruginosa)o un trastorno relacionado en un sujeto.
Un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC), por ejemplo, un ADC que comprende una molécula de anticuerpo descrita en la presente y un péptido antimicrobiano (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), puede tener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o todas) de las propiedades siguientes:
a) Se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias deEnterobacteriaceae(por ejemplo,Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, SalmonellaoCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentes), una o más bacterias dePseudomonas,una o más bacterias deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas) con alta afinidad, por ejemplo con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente aproximadamente 10 nM, y más típicamente, aproximadamente 10-0,01 nM, aproximadamente 5 0,01 nM, aproximadamente 3-0,05 nM, aproximadamente 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo, menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, o 0,01 nM,
b) Se une al lipopolisacárido (LPS) con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente aproximadamente 10 nM, y más típicamente, aproximadamente 10-0,01 nM, aproximadamente 5-0,01 nM, aproximadamente 3-0,05 nM, aproximadamente 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo, menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 o 0,01 nM, c) Inhibe una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas descritas en la presente), por ejemplo, según se determina midiendo la concentración inhibitoria mínima (MIC) del ADC, por ejemplo, mediante un método descrito en la presente,
d) Inhibe una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas descritas en la presente) con una MCI inferior en comparación con el péptido antimicrobiano solo, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1.000 veces menor M<i>C, por ejemplo, en una base molar, por ejemplo, como se mide mediante un método descrito en la presente,
e) Reduce la viabilidad de una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas descritas en la presente), por ejemplo, según se determina midiendo la concentración bactericida mínima (MBC), por ejemplo, mediante un método descrito en la presente,
f) Reduce la viabilidad de una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas descritas en la presente) con una MBC inferior en comparación con el péptido antimicrobiano solo, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1.000 veces MBC menor, por ejemplo, en una base molar, por ejemplo, según lo medido por un método descrito en la presente,
g) Muestra una actividad opsonofagocítica (OPA), por ejemplo, determinada por un ensayo OPA, por ejemplo, como se describe en la presente,
h) Se une específicamente a un epítopo del LPS, por ejemplo, el mismo epítopo o uno similar al epítopo reconocido por una molécula de anticuerpo descrita en la Tabla 1 u 8, por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
i) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo descrita en las Tablas 1 u 8, por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
j) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una ADC que comprende una molécula de anticuerpo descrita en las Tablas 1 u 8, por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
k) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8,por ejemplo, una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
l) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que un ADC que comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8,por ejemplo, una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
m) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8,por ejemplo una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (dos o tres) CDR de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
n) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que un ADC que comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena ligera descritas en laTabla 1 u 8,por ejemplo una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (dos o tres) CDR de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
o) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en laTabla 1 u 8,
p) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que un ADC que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en laTabla 1 u 8,
q) Inhibe, por ejemplo, inhibe competitivamente, la unión de una segunda molécula de anticuerpo a una bacteria Gram-negativa, LPS, o ambas, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8, por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
r) Inhibe, por ejemplo, inhibe competitivamente, la unión de un segundo ADC que comprende una segunda molécula de anticuerpo a una bacteria Gram-negativa, LPS, o ambos, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
s) Se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto que una segunda molécula de anticuerpo, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
t) Se une al mismo epítopo o a un epítopo solapado con un segundo ADC que comprende una segunda molécula de anticuerpo, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
u) Compite en la unión con una segunda molécula de anticuerpo frente a una bacteria Gram negativa, LPS, o ambos, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, v) Compite por la unión con un segundo ADC que comprende un segundo ADC contra una bacteria Gram-negativa, LPS, o ambos, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
w) Tiene una o más propiedades biológicas de una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
x) Tiene una o más propiedades biológicas de un ADC que comprende una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
y) Tiene una o más propiedades farmacocinéticas de ADC que comprende una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
z) Reduce la viabilidad de las bacterias Gram negativas de un primer género, especie o subespecie (por ejemplo, Pseudomonas) con alta selectividad, en comparación con la reducción de la viabilidad de las bacterias Gram negativas de un segundo género, especie o subespecie (por ejemplo,E. coli, Klebsiella spp.,o ambas), por ejemplo, por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces más de % de eliminación, por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de eliminación microbiana mixta descrito en la presente,
aa) Se une a una o más cepas deP. aeruginosa(por ejemplo, una o más cepas deP. aeruginosadescritas en laTabla 7)con alta afinidad, por ejemplo, con una avidez EC<50>de aproximadamente 200 pM o menos, por ejemplo, de menos de aproximadamente 150 pM o menos, aproximadamente 120 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 80 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, o aproximadamente 40 pM o menos, por ejemplo, entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 120 pM, entre aproximadamente 50 pM y 110 pM, entre aproximadamente 60 pM y 100 pM, entre aproximadamente 40 pM y 80 pM, o entre 80 pM y 120 pM, o
bb) Inhibe una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas descritas en la presente, por ejemplo,P. aeruginosa) in vivo,por ejemplo, una reducción de por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 o más veces en la carga bacteriana, por ejemplo, como se determina usando un modelo animal, por ejemplo, un modelo de neumonía aguda murina descrito en la presente.
Una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en la presente, puede tener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o todas) de las siguientes propiedades:
a) Se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies y/o subespecies (por ejemplo, una o más bacterias deEnterobacteriaceae(por ejemplo,Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, SalmonellaoCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentesj, una o más bacterias dePseudomonas,una o más bacterias deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas) con alta afinidad, por ejemplo con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente aproximadamente 10 nM, y más típicamente, aproximadamente 10-0,01 nM, aproximadamente 5 0,01 nM, aproximadamente 3-0,05 nM, aproximadamente 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo, de menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, o 0,01 nM,
b) Se une al lipopolisacárido (LPS) con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente aproximadamente 10 nM, y más típicamente, aproximadamente 10-0,01 nM, aproximadamente 5-0,01 nM, aproximadamente 3-0,05 nM, aproximadamente 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 o 0,01 nM, c) Muestra una actividad de opsonofagocitosis (OPA), por ejemplo, determinada por un ensayo de OPA, por ejemplo, como se describe en la presente,
d) Se une específicamente a un epítopo del LPS, por ejemplo, el mismo epítopo o uno similar al epítopo reconocido por una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
e) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo descrita en lasTablas 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
f) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una ADC que comprende una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
g) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8,por ejemplo, una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
h) muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena ligera descritas en lasTablas 1 u 8,por ejemplo una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de cadena pesada y/o una o más (dos o tres) CDR de cadena ligera de mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6,
i) Muestra la misma afinidad o especificidad de unión, o ambas, o similares que una molécula de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en laTabla 1 u 8,
j) Inhibe, por ejemplo, inhibe competitivamente, la unión de una segunda molécula de anticuerpo a una bacteria Gram-negativa, LPS, o ambos, donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001(por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
k) Se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto que una segunda molécula de anticuerpo, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
l) Compite en la unión con una segunda molécula de anticuerpo frente a una bacteria Gram negativa, LPS, o ambos, en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, m) Tiene una o más propiedades biológicas de una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
n) Tiene una o más propiedades biológicas de una molécula de anticuerpo elegida de laTabla 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6,
o) Tiene una o más propiedades farmacocinéticas de una molécula de anticuerpo elegida de lastablas 1 u 8,por ejemplo, mAb001 (por ejemplo, un mAb001 humanizado), A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o p) Se une a una o más cepas deP. aeruginosa(por ejemplo, una o más cepas deP. aeruginosadescritas en laTabla 7)con alta afinidad, por ejemplo, con una avidez EC<50>de aproximadamente 200 pM o menos, por ejemplo, de menos de aproximadamente 150 pM o menos, aproximadamente 120 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 80 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, o aproximadamente 40 pM o menos, por ejemplo, entre aproximadamente 40 pM y aproximadamente 120 pM, entre aproximadamente 50 pM y 110 pM, entre aproximadamente 60 pM y 100 pM, entre aproximadamente 40 pM y 80 pM, o entre 80 pM y 120 pM.
En un aspecto, la divulgación presenta un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende a) una molécula de anticuerpo que se une al lipopolisacárido (LPS) y b) un péptido antimicrobiano.
En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a una región pentasacárida de núcleo del LPS. En una realización, la región pentasacárida de núcleo comprende uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo y uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep. En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo, o a uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep, o a cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el ADC o molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, y HCDR3), y la región variable de cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3),
en donde la región variable de la cadena pesada comprende: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108; una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146; y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107, y
en donde la región variable de la cadena ligera comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138; una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142; y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112.
En una realización, el ADC o molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, y HCDR3), y la región variable de cadena ligera comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3),
en donde la región variable de la cadena pesada comprende: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105; una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106; y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107, y
en donde la región variable de la cadena ligera comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138; una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142; y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 112.
En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende además uno o más marcos de región variable de cadena pesada o ligera humanos o derivados de humanos.
A veces, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 103 o 115-118). En una realización, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 103 o 115-118).
A veces, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 104 o 119-137). En una realización, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de la SEQ ID NOS: 104 o 119-137).
A veces, la molécula de ADC o anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 103 o 115-118), y en donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 104 o 119-137).
A veces, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 103 o 115-118) y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 o mAb001 humanizado (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 104 o 119-137).
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo comprende o consiste en dos regiones variables de cadena pesada y dos regiones variables de cadena ligera. En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo comprende un Fab, un F(ab')2, un Fv o un fragmento Fv de cadena simple (scFv).
En una realización, el ADC o molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, o ambas. En una realización, el ADC o molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, la molécula de anticuerpo no es una molécula de anticuerpo de IgM. En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera de una cadena ligera kappa o lambda.
En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo monoclonal. En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo humanizada. En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo aislada. En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo sintética.
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une a una o más bacterias, por ejemplo, una o más bacterias Gram-negativas, por ejemplo, de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas.
En una realización, la una o más bacterias Gram-negativas se seleccionan de una especiede Enterobacteriaceae(por ejemplo, una especie deKlebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia,oCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentej, una especie dePseudomonas,una especie deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une a uno o más de:Klebsiella pneumonia(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobactercancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacterhormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia coliATCC 25922,Escherichia coliATCC 35401, oEscherichia coliATCC 43895),Escherichia fergusonii, Salmonella choleraesuis, Salmonella choleraesuissubsp.indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuissubsp.arizonae, Salmonella choleraesuissubsp.diarizonae, Salmonella choleraesuissubsp.houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacterbraakii,Citrobacterwerkmanii,Citrobacterfreundii,Citrobacteryoungae,Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une aPseudomonas aeruginosa.
En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a una cepa dePseudomonas aeruginosaresistente (por ejemplo, resistente a uno o más antibióticos descritos en la presente). En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a una cepa mutantede Pseudomonas aeruginosa.En una realización, la cepade Pseudomonas aeruginosatiene una mutación en un gen wapQ. En una realización, la cepa dePseudomonas aeruginosatiene una mutación en un gen galU.
En una realización, una o más bacterias son una o más bacterias resistentes a los antibióticos, por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas resistentes a múltiples fármacos.
En una realización, la una o más bacterias resistentes a los antibióticos se seleccionan entre Pseudomonas (por ejemplo,P. aeruginosa),Enterobacteriaceae (por ejemplo,Klebsiella pneumoniaoE. coli),o Acinetobacter (por ejemplo,A. baumannii).
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une a uno o más de:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo,P. aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo,N. gonorrhoaeaeresistente a fármacos),Salmonella(por ejemplo,Salmonellaresistente a fármacos),Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos), una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL) oMycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M. tuberculosisresistente a fármacos).
En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o todas) las cepas deP. aeruginosade laTabla 7.En otra realización, el ADC o la molécula de anticuerpo se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, o todas) las cepas deP. aeruginosaresistente a múltiples fármacos de laTabla 7.
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une al LPS con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd que es inferior a aproximadamente 10 nM, por ejemplo, medido por un método ELISA.
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une al LPS con una Koff más lenta de 1x10-4, 5x10-5, o 1x10-5s-1. En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une al LPS con una Kon más rápida de 1x104, 5x104, 1x105, o 5x105 M-1s-1.
En una realización, la molécula de anticuerpo tiene actividad opsonofagocítica, por ejemplo, como se determina mediante un ensayo OPA, por ejemplo, como se describe en la presente.
En una realización, la molécula de ADC o anticuerpo se une a un epítopo que comprende uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo y/o uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep en LPS.
En una realización, a) la molécula de anticuerpo que se une al lipopolisacárido (LPS) está acoplada (por ejemplo, fusionada) a b) el péptido antimicrobiano.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la región variable de cadena pesada está acoplada (por ejemplo, fusionada) al péptido antimicrobiano. En una realización, la región variable de cadena pesada es N-terminal al péptido antimicrobiano. En otra realización, la región variable de cadena pesada es C-terminal al péptido antimicrobiano. En una realización, la VH se fusiona con el péptido antimicrobiano para formar un polipéptido de fusión, por ejemplo, codificado por un marco de lectura abierto.
En una realización, la región variable de cadena pesada se acopla (por ejemplo, se fusiona) al péptido antimicrobiano indirectamente, por ejemplo, en donde el extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada se acopla (por ejemplo, se fusiona) al extremo N-terminal del péptido antimicrobiano a través de una región constante, un conector, o ambos.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena ligera se acopla (por ejemplo, fusiona) al péptido antimicrobiano. En una realización, la región variable de cadena ligera es N-terminal al péptido antimicrobiano. En otra realización, la región variable de la cadena pesada es C-terminal al péptido antimicrobiano. En una realización, la VL se fusiona con el péptido antimicrobiano para formar un polipéptido de fusión, por ejemplo, codificado por un marco de lectura abierto.
En una realización, la región variable de la cadena ligera se acopla (por ejemplo, fusiona) al péptido antimicrobiano indirectamente, por ejemplo, en donde el extremo C-terminal de la región variable de la cadena ligera se acopla (por ejemplo, fusiona) al extremo N-terminal del péptido antimicrobiano a través de una región constante, un conector, o ambos.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de sortasa que comprende una secuencia de reconocimiento de sortasa. Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la sortasa puede tener la secuencia de aminoácidos de LPXTG (por ejemplo, para la sortasa A deStaphylococcus aureus)(SEQ ID NO: 160) o LPXTA (por ejemplo, para la sortasa A deStreptococcus pyogenes)(SEQ ID NO: 161), en donde X puede ser cualquier residuo de aminoácido. En una realización, la secuencia de reconocimiento de la sortasa es LPETG (SEQ ID NO: 162). La secuencia aceptora de la sortasa puede contener secuencia o secuencias adicionales distintas de la secuencia de reconocimiento de la sortasa. En una realización, la secuencia aceptora de la sortasa comprende además una secuencia conectora, por ejemplo, una repetición en tándem de secuencias conectoras de péptidos de glicina-serina (por ejemplo, (GS<)15>(SEQ ID NO: 157)). En una realización, una cadena pesada de la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de sortasa, por ejemplo, en el extremo C-terminal. En una realización, una cadena ligera de la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, en el extremo C-terminal.
En una realización, una cadena pesada de la molécula de anticuerpo comprende una primera secuencia aceptora de la sortasa y una cadena ligera de la molécula de anticuerpo comprende una segunda secuencia aceptora de la sortasa. En una realización, la secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, la primera secuencia de reconocimiento de la sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de (GS)6LPETGGG (s Eq ID NO: 24). En otra realización, la secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, la segunda secuencia aceptora de la sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de P(G<4>S)<2>LPETGGSG (<s>E<q>ID NO: 26).
En una realización, el ADC comprende una secuencia conectora, una secuencia de reconocimiento de sortasa, o ambas, como se describe en laFIG.37. En una realización, el ADC comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En una realización, cada una de las cadenas pesadas del ADC comprende una secuencia conectora, una secuencia de reconocimiento de sortasa, o ambas, como se describe en laFIG. 37.En una realización, cada una de las cadenas ligeras del ADC comprende una secuencia conectora, una secuencia de reconocimiento de la sortasa, o ambas, como se describe en laFlG. 37.
En una realización, el ADC comprende dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más) péptidos antimicrobianos. En una realización, el ADC comprende cuatro péptidos antimicrobianos. En una realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son idénticos o sustancialmente idénticos. En una realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son diferentes. Por ejemplo, una pluralidad de péptidos antimicrobianos pueden acoplarse (por ejemplo, fusionarse) a la molécula de anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada (o una parte de la misma), una cadena ligera (o una parte de la misma), o ambas).
En una realización, el ADC comprende dos o más (por ejemplo, tres o cuatro) péptidos antimicrobianos idénticos, o sustancialmente idénticos, cada uno de los cuales está acoplado (por ejemplo, fusionado) a una región variable de cadena pesada, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante, un conector, o ambos. En una realización, el ADC comprende dos o más (por ejemplo, tres o cuatro) péptidos antimicrobianos idénticos, o sustancialmente idénticos, cada uno de los cuales está acoplado (por ejemplo, fusionado) a una región variable de cadena ligera, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante, un conector, o ambos. En una realización, el ADC comprende dos péptidos antimicrobianos idénticos, o sustancialmente idénticos, cada uno de los cuales está acoplado (por ejemplo, fusionado) a una región variable de cadena pesada, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante, un conector, o ambos. En una realización, el ADC comprende dos péptidos antimicrobianos idénticos, o sustancialmente idénticos, cada uno de los cuales está acoplado (por ejemplo, fusionado) a una región variable de cadena ligera, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante, un conector, o ambos. En una realización, el ADC comprende por lo menos cuatro péptidos antimicrobianos idénticos, o sustancialmente idénticos. En una realización, la ADC o molécula de anticuerpo comprende dos regiones variables de cadena pesada y dos regiones variables de cadena ligera, y cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera está acoplada (por ejemplo, fusionada) con por lo menos un péptido antimicrobiano, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante, un conector o ambos.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo mediante conjugación enzimática (por ejemplo, una reacción de sortasa). En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo mediante conjugación química.
En una realización, el ADC es más eficaz para inhibir, por ejemplo, inhibir el crecimiento, virulencia o infectividad de una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que el péptido antimicrobiano o la molécula de anticuerpo solos, por ejemplo, con una concentración inhibitoria mínima (MIC) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces menor, a la MIC del péptido antimicrobiano solo.
En una realización, el ADC es más eficaz para reducir la viabilidad de, por ejemplo, matar, una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que el péptido antimicrobiano o la molécula de anticuerpo solos, por ejemplo, con una concentración bactericida mínima (MBC) menor, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces menor, a la MIC del péptido antimicrobiano solo.
En una realización, el ADC tiene actividad de opsonofagocitosis (por ejemplo, se fagocita cuando se une al receptor Fc (FcR) de un neutrófilo), por ejemplo, como se determina mediante un ensayo OPA, por ejemplo, como se describe en la presente.
En una realización, el ADC no inhibe, por ejemplo, no inhibe el crecimiento, virulencia o infectividad de una bacteria Gram-positiva (por ejemplo, una bacteria Gram-positiva descrita en la presente), por ejemplo, que tenga una concentración inhibitoria mínima (MIC) para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa) que sea menor, por ejemplo, por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces menor, que una MIC para una bacteria Gram positiva (por ejemplo, una bacteria Gram positiva).
En una realización, el ADC no reduce la viabilidad de, por ejemplo, no mata, una bacteria Gram-positiva (por ejemplo, una bacteria Gram-positiva descrita en la presente), por ejemplo, que tiene una concentración bactericida mínima (MBC) para una bacteria Gram-negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces menor, que una MBC para una bacteria Gram positiva (por ejemplo, una bacteria Gram positiva). En una realización, la bacteria Gram-positiva esStaphylococcus aureus.
En una realización, el ADC no altera, o no altera significativamente el microbioma (por ejemplo, no altera el microbioma).
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en un péptido antimicrobiano alfahelicoidal, por ejemplo, un péptido que comprende giros donde los residuos i e i+4 están en la misma cara.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de homología con, una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67 80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. A veces, el péptido antimicrobiano comprende un grupo carboxamida (por ejemplo, un grupo funcional carboxamida C-terminal).
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más D-aminoácidos. En otra realización, por lo menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de los residuos de aminoácidos del péptido antimicrobiano son D-aminoácidos.
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende un primer residuo de cisteína y un segundo residuo de cisteína, y en donde el primer residuo de cisteína está reticulado con el segundo residuo de cisteína.
En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido antimicrobiano de amplio espectro, por ejemplo, que tiene actividad antimicrobiana contra 2, 3 o todas las siguientes: por lo menos una especiede Enterobacteriaceae(por ejemplo, una o más especiesde Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, YersiniaoCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentes), por lo menos una especie dePseudomonas,o por lo menos una especie deAcinetobacter.
En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido antimicrobiano de amplio espectro, por ejemplo, que tiene actividad antimicrobiana contra 2, 3, 4, 5, 6, o todas las siguientes: por lo menos una especie deKlebsiella,por lo menos una especie deEnterobacter,por lo menos una especie deShigella,por lo menos una especie deEscherichia,por lo menos una especie deSalmonella,por lo menos una especie deYersinia,o por lo menos una especie deCitrobacter.
En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración inhibitoria mínima (MIC) de menos de 100 |jg/ml, por ejemplo, menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, o 5 jg/ml, para una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,Pseudomonas aeruginosaATCC27853), o ambas.
En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración bactericida mínima (MBC) de menos de 100 jg/ml, por ejemplo, de menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, o 5 jg/ml, para una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922),Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosaATCC27853), o ambas.
En una realización, el péptido antimicrobiano tiene actividad hemolítica baja, por ejemplo, tiene una concentración lítica parcial (PLC) a la relación MIC para una bacteria Gram-negativa (por ejemplo, una bacteria Gramnegativa descrita en la presente) que es mayor de 4:1 (por ejemplo, mayor de 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1), por ejemplo, según se determina por un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo MIC, respectivamente. En una realización, la PLC es la concentración (por ejemplo, la concentración mínima) que produce la lisis del 50% de los glóbulos rojos.
En una realización, el péptido antimicrobiano tiene baja actividad hemolítica, por ejemplo, tiene una relación de concentración lítica parcial (P<l>C) a MIC para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que es mayor de 4:1 (por ejemplo, mayor de 8:1,<1 6>:<1>, 24:1 o 32:1), por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo de MIC, respectivamente. En una realización, la MLC es la concentración (por ejemplo, la concentración mínima) que produce la lisis del 100% de los eritrocitos.
En un aspecto, la divulgación presenta una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un ADC descrito en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la divulgación presenta un método para tratar o prevenir una infección bacteriana o un trastorno relacionado, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un ADC descrito en la presente, o una composición farmacéutica descrita en la presente, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la infección bacteriana o el trastorno relacionado.
En una realización, la infección bacteriana es una infección bacteriana Gram-negativa. En una realización, el trastorno está provocado por, o asociado con, una infección bacteriana Gram-negativa.
En una realización, el ADC se administra a una dosis de 0,1-100 mg/kg, por ejemplo, 0,1-50 mg/kg o 1-10 mg/kg, por ejemplo, 1-5 o 5-10 mg/kg. En una realización, el ADC se administra por vía intravenosa, subcutánea, intranasal o por inhalación.
En una realización, el ADC se administra antes del inicio de un síntoma asociado con la infección bacteriana o trastorno relacionado. En una realización, el ADC se administra al inicio o después del inicio de un síntoma asociado con la infección bacteriana o trastorno relacionado.
En una realización, el sujeto tiene una o más de neumonía (por ejemplo, neumonía adquirida en la comunidad, neumonía bacteriana asociada al ventilador (VABP), y neumonía bacteriana adquirida en el hospital (HABP)), una infección del tracto urinario (UTI), septicemia, meningitis, diarrea (por ejemplo, diarrea del viajero), una infección de tejidos blandos, una infección cutánea, bacteriemia, una infección del sistema respiratorio (por ejemplo, una infección del tracto respiratorio inferior), endocarditis, una infección intraabdominal, artritis séptica, osteomielitis, una infección del SNC, una infección oftálmica, colecistitis, colangitis, meningitis (por ejemplo, meningitis neonatal), fiebre tifoidea, intoxicación alimentaria, gastroenteritis, fiebre entérica, shigelosis, infección del torrente sanguíneo, sepsis intraabdominal, absceso cerebral, meningitis, sepsis (por ejemplo, sepsis neonatal), infección articular, infección ósea, infección gastrointestinal o infección de heridas. En una realización, el sujeto tiene un sistema inmunitario debilitado. En una realización, el sujeto padece fibrosis quística. En una realización, el sujeto sufre quemaduras.
En una realización, la infección bacteriana es una infección nosocomial o una infección hospitalaria. En una realización, el trastorno relacionado con la infección bacteriana se asocia con una infección nosocomial o una infección hospitalaria.
En una realización, el sujeto es un humano o un animal. En una realización, el sujeto es un paciente inmunocomprometido, por ejemplo, un sujeto que tiene una infección por VIH o SIDA, cáncer, trasplante de órganos sólidos, trasplante de células madre, anemia falciforme o asplenia, una inmunodeficiencia congénita, una enfermedad inflamatoria crónica, un implante coclear, desnutrición o una fuga de líquido cefalorraquídeo. En una realización, el sujeto es un profesional sanitario.
En una realización, el sujeto tiene 18 años o menos, por ejemplo, 15 años o menos, 12 años o menos, 9 años o menos, 6 años o menos, o 3 años o menos. En una realización, el sujeto tiene por lo menos 60 años, por ejemplo, por lo menos 65 años, por lo menos 70 años, por lo menos 75 años o por lo menos 80 años.
En una realización, el método comprende además administrar al sujeto un segundo agente o terapia antimicrobiana, por ejemplo, un antibiótico o terapia fágica.
En una realización, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en un aminoglucósido (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, paromomicina, estreptomicina o espectinomicina), una ansamicina (por ejemplo, geldanamicina, herbimicina o rifaximina), un carbacefeno (por ejemplo, loracarbef), un carbapenémico (por ejemplo, ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina, o meropenem), una cefalosporina (cefadroxil, cefazolina, cefalotina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandole, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona (por ejemplo, en combinación con sulbactam), cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, ceftarolina fosamil o ceftobiprol), un glicopéptido (por ejemplo, teicoplanina, vancomicina, telavancina, dalbavancina u oritavancina), una lincosamida (por ejemplo, clindamicina o lincomicina), lipopéptido (por ejemplo, daptomicina), un macrólido (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina o espiramicina), un monobactámico (por ejemplo, aztreonam), un nitrofurano (por ejemplo, furazolidona o nitrofurantoína), una oxazolidinona (por ejemplo, linezolid, posizolid, radezolid, torezolid), una penicilina (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina g, penicilina v, piperacilina, penicilina g, temocilina o ticarcilina), una combinación de penicilinas (por ejemplo, amoxicilina/clavulanato, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam, o ticarcilina/clavulanato), un polipéptido (por ejemplo, bacitracina, colistina o polimixina b), una quinolona/fluoroquinolona (por ejemplo, ciprofloxacino, enoxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, trovafloxacino, grepafloxacino, esparfloxacino o temafloxacino), una sulfonamida (por ejemplo, mafenida, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de plata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprima-sulfametoxazol (cotrimoxazol) o sulfonamidocrioidina), una tetraciclina (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina o tetraciclina), un fármaco contra micobacterias (por ejemplo, clofazimina, dapsona, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, pirazinamida, rifampicina, rifabutina, rifapentina o estreptomicina), u otros (por ejemplo, arsfenamina, cloranfenicol, fosfomicina, ácido fusídico, metronidazol, mupirocina, platensimicina, quinupristina/dalfopristina, tianfenicol, tigeciclina, tinidazol o trimetoprima).
En una realización, el antibiótico se selecciona entre levofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, ceftriaxona, ofloxacina, amikacina, tobramicina, aztreonam o imipenem/cilastatina. En otra realización, el antibiótico es colistina o meropenem.
En una realización, el segundo agente o terapia antimicrobiana se administra antes de que se administre el ADC, concurrentemente con la administración del ADC, o después de que se haya administrado el ADC.
Cuando se administran en combinación, el ADC, el agente adicional (por ejemplo, un segundo o tercer agente), o todos, pueden administrarse en una cantidad o dosis que es mayor, menor o igual que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En una realización, la cantidad o dosificación administrada del ADC, el agente adicional (por ejemplo, un segundo o tercer agente), o todos ellos, es menor (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40% o por lo menos un 50%) que la cantidad o dosificación de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En otra realización, la cantidad o dosificación del ADC, del agente adicional (por ejemplo, un segundo o tercer agente), o de todos ellos, que produce un efecto deseado (por ejemplo, la inhibición del crecimiento bacteriano o el tratamiento de una infección bacteriana) es menor (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40% o por lo menos un 50% menor).
En una realización, la administración del ADC y el segundo agente antimicrobiano o terapia da como resultado un efecto sinérgico, por ejemplo, en la inhibición (por ejemplo, eliminación) de una bacteria descrita en la presente, por ejemplo,P. aeruginosa.Por ejemplo, cuando el a Dc se usa a aproximadamente el 50% de su concentración mínima de inhibición (MIC), la MIC del segundo agente antimicrobiano se reduce por lo menos 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces.
Un método para inhibir o reducir una infección bacteriana (por ejemplo, una infección bacteriana Gramnegativa), comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, en una muestra) o un sujeto que lo necesite con un ADC descrito en la presente, o una composición farmacéutica descrita en la presente, en una cantidad eficaz para inhibir o reducir la infección bacteriana.
A veces, el ADC se pone en contacto con la célula o el sujetoin vitro, ex vivooin vivo.
En un aspecto, la divulgación presenta un ADC descrito en la presente para su uso en el tratamiento o prevención de una infección bacteriana (por ejemplo, una infección bacteriana Gram-negativa) o un trastorno relacionado descrito en la presente.
Un ADC descrito en la presente puede usarse en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una infección bacteriana (por ejemplo, una infección bacteriana Gram-negativa) o un trastorno relacionado descrito en la presente.
La divulgación presenta un kit que comprende un ADC descrito en la presente o una composición farmacéutica descrita en la presente.
Aveces, el kit comprende además instrucciones de uso del ADC o de la composición farmacéutica.
La divulgación presenta un recipiente que comprende un ADC descrito en la presente o una composición farmacéutica descrita en la presente.
La divulgación presenta una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada) que codifica un ADC descrito en la presente, por ejemplo, una VH, una VL; o ambas, o una cadena pesada, una cadena ligera, o ambas, de una molécula de anticuerpo descrita en la presente, acoplada (por ejemplo, fusionada) a un péptido antimicrobiano, como se describe en la presente.
Las moléculas de ácido nucleico divulgadas en la presente comprenden una secuencia de nucleótidos descrita en la Tabla 2, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 81-93 o 113-114.
La divulgación presenta un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente.
La divulgación presenta una célula (por ejemplo, una célula aislada) que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente o un vector descrito en la presente.
La divulgación presenta un método para producir un ADC descrito en la presente, el método comprendiendo cultivar una célula descrita en la presente en condiciones que permitan la producción de un ADC, produciendo de este modo el ADC descrito en la presente.
En un aspecto, la divulgación presenta un método para producir un ADC descrito en la presente, el método comprendiendo poner en contacto una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en la presente) con un péptido (por ejemplo, un péptido que comprende un péptido antimicrobiano descrito en la presente, y opcionalmente, una secuencia donante de sortasa), en presencia de una sortasa, en condiciones que permitan que se produzca una reacción mediada por sortasa, produciendo de este modo el ADC.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de sortasa, por ejemplo, una secuencia aceptora de sortasa descrita en la presente. En una realización, una cadena pesada de la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de sortasa, por ejemplo, en el extremo C-terminal. En una realización, una cadena ligera de la molécula de anticuerpo comprende una secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, en el extremo C-terminal. En una realización, la secuencia aceptora de sortasa comprende además una secuencia conectora, por ejemplo, una repetición en tándem de secuencias conectoras de péptidos de glicina-serina.
En una realización, una cadena pesada de la molécula de anticuerpo comprende una primera secuencia aceptora de la sortasa y una cadena ligera de la molécula de anticuerpo comprende una segunda secuencia aceptora de la sortasa. En una realización, la secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, la primera secuencia de reconocimiento de la sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de (g S)<6>LPETGg G (s Eq ID NO: 24). En otra realización, la secuencia aceptora de la sortasa, por ejemplo, la segunda secuencia aceptora de la sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de P(G<4>S)<2>LPETGGSG (s Eq ID NO: 26).
A veces, el péptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%,<9 6>%, 97%, 98%, 99%, o 100% de homología con, una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende un grupo carboxamida (por ejemplo, un grupo funcional carboxamida C-terminal).
En una realización, se ponen en contacto 1,5 mg/ml de molécula de anticuerpo con 20 equivalentes molares de péptido donante de sortasa por secuencia aceptora de sortasa, y 1 equivalente molar de sortasa por 75 equivalentes molares de secuencia aceptora de sortasa. En una realización, el contacto se lleva a cabo en presencia de 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,5), y 10 mM CaCh. En una realización, el contacto se lleva a cabo a 18°C a 37°C, por ejemplo, a 25°C, por ejemplo, durante de 2 a 48 horas, por ejemplo, de 18 a 24 horas, por ejemplo, 20 horas. En una realización, la sortasa es una sortasa A pentamutante.
En una realización, comprende además detectar la reacción mediada por sortasa, por ejemplo, por espectrometría de masas Q-TOF. En una realización, comprende además purificar el ADC, por ejemplo, por electroforesis en gel.
La divulgación presenta una mezcla de reacción que comprende:
(i) una sortasa, por ejemplo, una sortasa descrita en la presente, y
(ii) una molécula de anticuerpo descrita en la presente, un péptido antimicrobiano descrito en la presente, o ambos.
En un aspecto, la divulgación presenta una molécula de anticuerpo descrita en la presente.
En un aspecto, la divulgación presenta una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada) que codifica una molécula de anticuerpo descrita en la presente, por ejemplo, una VH, una VL, o ambas; o una cadena pesada, una cadena ligera, o ambas, de la molécula de anticuerpo descrita en la presente.
La divulgación presenta un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo descrita en la presente.
La divulgación presenta una célula (por ejemplo, una célula aislada) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo descrita en la presente o un vector descrito en la presente.
La divulgación presenta un método de producción de una molécula de anticuerpo descrita en la presente, el método comprendiendo cultivar una célula descrita en la presente en condiciones que permitan la producción de una molécula de anticuerpo, produciendo de este modo la molécula de anticuerpo descrita en la presente.
La divulgación presenta un péptido antimicrobiano (por ejemplo, un péptido antimicrobiano aislado o sintético) descrito en la presente.
La divulgación presenta una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada) que codifica un péptido antimicrobiano descrito en la presente.
La divulgación presenta un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido antimicrobiano descrito en la presente.
La divulgación presenta una célula (por ejemplo, una célula aislada) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido antimicrobiano descrito en la presente o un vector de descrito en la presente.
La divulgación presenta un método de producción de un péptido antimicrobiano descrito en la presente, el método comprendiendo cultivar una célula descrita en la presente en condiciones que permitan la producción de un péptido antimicrobiano, produciendo de este modo el péptido antimicrobiano descrito en la presente.
La divulgación presenta una molécula de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o sustancialmente al mismo epítopo, que una molécula de anticuerpo descrita en la presente.
La divulgación presenta un ADC que comprende: a) una molécula de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o sustancialmente al mismo epítopo, que una molécula de anticuerpo descrita en la presente; y b) un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente.
La divulgación presenta una molécula de anticuerpo que compite por la unión con una molécula de anticuerpo descrita en la presente.
La divulgación presenta un ADC que comprende: a) una molécula de anticuerpo que compite por la unión con una molécula de anticuerpo descrita en la presente; y b) un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente.
La divulgación contempla todas las combinaciones de uno o más de los aspectos y/o realizaciones anteriores, así como combinaciones con una o más de las realizaciones expuestas en la descripción detallada y los ejemplos.
Otras características, objetos y ventajas de las composiciones y métodos descritos en la presente serán evidentes de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Con la presente se proporcionan Figuras y Tablas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
LaFIG. 1representa la composición y estructura de los pentasacáridos del núcleo de varias bacterias Gram negativas ejemplares.
LaFIG. 2representa la unión del anticuerpo 3E7 aE. coli(Eco) yK. pneumoniae(Kpn) determinada por ELISA. LaFIG. 3representa la unión del anticuerpo A001-25 a E.coli(Eco) yK. pneumoniae(Kpn) determinada por ELISA.
LaFIG. 4representa el proceso de reticulación de un péptido alfa-helicoidal ejemplar (SEQ ID NO: 158).
LaFIG. 5representa la lectura de un ensayo MIC ejemplar.
LaFIG. 6representa la caracterización por espectrometría de masas de los productos de ligación de Sortasa usando QTof. Todas las muestras se redujeron con DTT antes del análisis. Parte superior: La cadena pesada marcada con Sortasa a 52.201 corresponde al peso molecular teórico basado en la secuencia peptídica; Parte inferior: El producto de la reacción ligado con Sortasa representa una señal fuerte a 55002 que corresponde al peso molecular teórico del constructo ligado.
LaFIG. 7representa la unión del anticuerpo 2C7 a cepas representativas deE. coli(Eco),K. pneumoniae(Kpn) y S.typhimurium(Sty).
LaFIG. 8representa la unión del anticuerpo 3D6 a cepas representativas deE. coli(Eco),K. pneumoniae(Kpn) yS. typhimurium(Sty).
LaFIG. 9representa la unión del anticuerpo 3E7 a cepas representativas deE. coli(Eco),K. pneumoniae(Kpn) yS. typhimurium(Sty).
LaFIG. 10representa la unión del anticuerpo 3G1 a cepas representativas deE. coli(Eco),K. pneumoniae(Kpn) y S.typhimurium(Sty).
LaFIG. 11Arepresenta el % de eliminación dePseudomonas, E. coliyKlebsiella spp.en un ensayo de eliminación microbiana mixta usando un ADC ejemplar a 8 pg/ml.
LaFIG. 11Brepresenta el % de eliminación dePseudomonas, E. coliyKlebsiella spp.en un ensayo de eliminación microbiana mixta usando solo un anticuerpo ejemplar a 125 pg/ml.
LaFIG. 11Crepresenta el % de eliminación dePseudomonas, E. coliyKlebsiella spp.en un ensayo de eliminación microbiana mixta usando solo un péptido ejemplar a 0,3 pg/ml.
LaFIG. 11Drepresenta el % de eliminación dePseudomonas, E. coliyKlebsiella spp.en un ensayo mixto de eliminación microbiana usando una combinación de anticuerpo a 125 pg/ml y péptido a 0,3 pg/ml.
LaFIG. 12representa la unión de un ADC ejemplar a cepas deP. aeruginosa.
LaFIG. 13representa la unión de un ADC ejemplar a una superficie bacteriana.
LaFIG. 14representa la reducción de la carga bacteriana en el pulmón en un modelo murino de neumonía aguda. LaFIG. 15Arepresenta la estabilidad sérica de un PGA ejemplar sin grapado. LaFIG. 15Adivulga la SEQ ID NO: 101.
LaFIG. 15Brepresenta la estabilidad sérica de un PGA ejemplar con grapado. LaFIG.15Bdivulga la SEQ ID NO: 159.
LaFIG. 15Crepresenta la diferencia en la estabilidad sérica entre una carga útil no optimizada y una carga útil optimizada.
LaFIG. 16representa el efecto del anticuerpo mAb001 sobre la señal de endotoxina (LPSde Pseudomonas)medida mediante un ensayo colorimétrico basado en células.
LaFIG. 17representa la actividad de eliminación selectiva de un ADC ejemplar contraPseudomonas.
LaFIG. 18Arepresenta la reducción de la carga bacteriana en el pulmón por un ADC ejemplar en un modelo murino de neumonía aguda (brazo de estudio de coadministración).
LaFIG. 18Brepresenta la reducción de la carga bacteriana en el pulmón por un ADC ejemplar en un modelo murino de neumonía aguda (brazo de estudio intranasal).
LaFIG. 19representa la biodisponibilidad de un ADC ejemplar.
LaFIG. 20representa la estabilidad de un péptido antimicrobiano ejemplar que contiene L-aminoácidos en suero humano.
LaFIG. 21representa la estabilidad de un péptido antimicrobiano ejemplar que contiene D-aminoácidos en suero humano.
LaFIG. 22representa el LPS deP. aeruginosa.Los glicanos de núcleo están muy conservados en todos los serotipos. La unidad marcada con un círculo es la diana de una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar (mAb001).
LaFIG. 23representa los glicanos sintéticos para los experimentos de unión.
LaFIG. 24representa los resultados del análisis Octet de la unión anticuerpo-glicano.
LaFIG. 25representa la cuantificación de las afinidades de unión.
LaFIG. 26representa enfoquesin silico,químicos y analíticos para la identificación de epítopos.
LaFIG. 27representa un método de conjugación ejemplar y la química relacionada.
LaFIG. 28representa la unión (veces de cambio) de una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar a aislados clínicos.
LaFIG. 29representa el epítopo de una molécula de anticuerpo ejemplar (mAb001). Como mínimo, el centro del epítopo incluye Heptosa I. El anticuerpo también puede hacer contacto con unidades de sacáridos adyacentes. LaFIG. 30representa las interacciones entre los glicanos fosforilados (Hep2,4,6-PO4) y tres residuos de Arginina (R100, R101 y R103) en una molécula de anticuerpo ejemplar (mAb001).
LaFIG. 31Arepresenta la unión de una molécula de anticuerpo ejemplar (mAb001) a cepas deP. aeruginosade tipo salvaje (PA01 y Pae 27853) y mutantes (Pae galU y Pae wapQ).
LaFIG. 31Brepresenta la unión de un ADC ejemplar (mAb001-P297) a cepas deP. aeruginosade tipo salvaje (PA01 y Pae 27853) y mutantes (Pae galU y Pae wapQ).
LaFIG. 32Arepresenta la unión de la molécula de anticuerpo ejemplar (mAb001) a FcyRIIa, como se representa en el ensayo Octet.
LaFIG. 32Brepresenta la unión de la molécula de anticuerpo ejemplar (mAb001) a C1q mediante ELISA.
LaFIG. 33representa los resultados del dicroísmo circular (CD) para (L)-P297 y (D)-P297.
LaFIG. 34Arepresenta las concentraciones inhibitorias mínimas para la colistina en presencia de diferentes concentraciones de un AMP ejemplar ((D)-P297).
LaFIG. 34Brepresenta las concentraciones inhibitorias mínimas de meropenem en presencia de diferentes concentraciones de un AMP ejemplar ((D)-P297).
LaFIG. 35Arepresenta la actividad de alteración de membrana de un AMP ejemplar ((D)-P297) según se representa en el ensayo de fuga de liposomas de calceína.
LaFIG. 35Brepresenta una comparación de las actividades de alteración de membrana entre AMP ejemplares ((D)-P297 y (L)-P297), molécula de anticuerpo (mAb001) y ADC (mAb001-(D)-P297), como se representa mediante ensayo de fuga de liposomas de calceína.
LaFIG. 36representa análogos de (D)-P297 ejemplares. La Figura divulga las SEQ ID NOS: 156 y 246-256, respectivamente, en orden de aparición.
LaFIG. 37representa un esquema ejemplar del ligamiento por sortasa de carga o cargas peptídicas sobre molécula de anticuerpo para producir A<d>C. La Figura divulga las SEQ ID NOS: 257-261, respectivamente, en orden de aparición. "(GS)<15>" se divulga como la SEQ ID NO: 157.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS
LaTabla 1representa las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH), las regiones variables de cadena ligera (VL), las CDR de cadena pesada (HCDR) y las CDR de cadena ligera (LCDR) de las moléculas de anticuerpo ejemplares. Se muestran las CDR de cadena pesada y ligera definidas de acuerdo con el sistema de Chothia y el sistema de Kabat.
LaTabla 2representa las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de las moléculas de anticuerpos ejemplares.
LaTabla 3representa las secuencias de aminoácidos de los péptidos antimicrobianos ejemplares.
LaTabla 4representa valores ejemplares de compuestos de control de MIC.
LaTabla 5representa la actividadin vitrodirigida de ADC, molécula de anticuerpo y péptido ejemplares.
LaTabla 6Arepresenta las actividades inhibidora y hemolítica de péptidos antimicrobianos ejemplares.
LaTabla 6Brepresenta las relaciones estructura-actividad de los AMP ejemplares.
LaTabla 6Crepresenta una comparación entre dos péptidos ejemplares.
LaTabla 7representa la avidez de unión de un ADC ejemplar aP. aeruginosa(EC50).
LaTabla 8representa las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (VH), las regiones variables de cadena ligera (VL), las CDR de cadena pesada (HCDR) y las CDR de cadena ligera (LCDR) de moléculas de anticuerpos humanizados ejemplares. Se muestran las CDR de cadena pesada y ligera definidas de acuerdo con el sistema de Chothia y el sistema de Kabat.
LaTabla 9representa la actividad de eliminación microbiana de ADC ejemplares frente a cepas deP. aeruginosa.LaTabla 10representa la actividad de eliminación microbiana de ADC ejemplares frente a cepas MDR.
LaTabla 11representa un resumen de las determinaciones de la tasa de resistencia para los PAM ejemplares. LaTabla 12Arepresenta una comparación de una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar (mAb001) con líneas germinales humanas.
LaTabla 12Brepresenta las características de capacidad de desarrollo de una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar (mAb001).
LaTabla 13representa el efecto de los D-aminoácidos y los L-aminoácidos sobre las actividades de AMP.
LaTabla 14representa la actividad de eliminación microbiana de (D)-P297 en suero.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente se divulgan moléculas de anticuerpo y conjugados de molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que se unen a bacterias, por ejemplo, bacterias Gram negativas, por ejemplo, lipopolisacáridos en la membrana externa de bacterias Gram negativas, con alta afinidad y especificidad. Los ADC divulgados en la presente pueden incluir una molécula de anticuerpo y un péptido antimicrobiano (AMP). Ventajosamente, en comparación con los péptidos antimicrobianos solos, varios de los ADC descritos en la presente tienen una capacidad mejorada para inhibir o reducir la viabilidad de una o más bacterias (por ejemplo, bacterias Gram negativas) de diferentes géneros, especies y/o subespecies. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo, ADC y péptidos antimicrobianos, vectores de expresión, células huésped, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), kits y métodos para fabricar las moléculas de anticuerpo, ADC y péptidos antimicrobianos. Las moléculas de anticuerpos, los ADC, los péptidos antimicrobianos y las composiciones farmacéuticas divulgados en la presente pueden usarse (solos o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar infecciones bacterianas o trastornos y afecciones relacionados, por ejemplo, provocados por bacterias Gram negativas.
En una realización, los ADC descritos en la presente pueden tener una o más de las siguientes propiedades: (i) es capaz de tratar o prevenir una enfermedad bacteriana en un paciente con una necesidad médica no satisfecha; (ii) es capaz de tratar un género y especie de bacterias causantes de una enfermedad bacteriana; actúa a través de un nuevo mecanismo de acción; (iii) tiene un inhibidor añadido que reduce o neutraliza un mecanismo de resistencia; o (iv) tiene una alteración en la estructura de la molécula que reduce o neutraliza un mecanismo de resistencia.
En una realización, el ADC tiene una actividad de opsonofagocitosis (por ejemplo, a través de una molécula de anticuerpo), una actividad bactericida (por ejemplo, a través de una carga útil, por ejemplo, un péptido antimicrobiano), o ambas. Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que en una realización, el uso de un péptido antimicrobiano en ADC puede lograr uno o más de los siguientes objetivos: una nueva diana con baja resistencia, eficacia sinérgica con menor probabilidad de resistencia espontánea, tratamiento dirigido mejorado o actividad bactericida rápida. En una realización, el ADC se dirige a una región de LPS de núcleo, por ejemplo, para reducir la probabilidad de resistencia provocada por una posible alteración del sitio diana. En otra realización, se usa el grapado peptídi
Definiciones
Como se usan en la presente, los artículos "un" y "uno" se refieren a uno o a más de uno (por ejemplo, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo.
El término "o" se usa en la presente para que signifique, y se usa indistintamente con, el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
"Alrededor de" y "aproximadamente" significarán en general un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error ejemplares están dentro del 20 por ciento (%), típicamente, dentro del 10%, y más típicamente, dentro del 5% de un valor o intervalo de valores dado.
Las composiciones y métodos divulgados en la presente abarcan polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen las secuencias especificadas, o secuencias sustancialmente idénticas o similares a las mismas, por ejemplo, secuencias por lo menos un 85%, 90%, 95% idénticas o superiores a la secuencia especificada.
En el contexto de una secuencia de aminoácidos, el término "sustancialmente idéntica" se usa en la presente para referirse a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de tal manera que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tienen por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada en la presente.
En el contexto de la secuencia de nucleótidos, el término "sustancialmente idéntica" se usa en la presente para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de tal manera que la primera y la segunda secuencias de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio polipeptídico estructural común o una actividad polipeptídica funcional común. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que tienen por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada en la presente.
El término "variante funcional" se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de origen natural, o están codificados por una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica, y son capaces de realizar una o más actividades de la secuencia de origen natural.
Los cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (en la presente los términos se usan indistintamente) se realizan de la siguiente manera.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos para una alineación óptima, y a efectos de comparación pueden descartarse las secuencias no homólogas). En una realización típica, la longitud de una secuencia de referencia alineada a efectos de comparación es de por lo menos el 30%, por ejemplo, por lo menos el 40%, 50%, 60%, por ejemplo, por lo menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), usando o una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En ciertas realizaciones, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto adecuado de parámetros (y el que debería usarse a menos que se especifique lo contrario) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas descritas en la presente pueden usarse como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico como se describe en la presente. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas descritas en la presente. Para obtener alineaciones con huecos con propósitos de comparación, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Consulte www.ncbi.nlm.nih.gov.
Como se usa en la presente, el término "híbrida en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad" describe las condiciones de hibridación y lavado. Orientaciones para realizar las reacciones de hibridación pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En dicha referencia se describen métodos acuosos y no acuosos, pudiendo usarse cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en la presente son las siguientes 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, 0,1% de SDS por lo menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55°C para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, 0,1% de SDS a 65°C; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son 0,5M fosfato sódico, 7% de SDS a 65°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, 1% de SDS a 65°C. Las condiciones de muy alta rigurosidad 4) son condiciones adecuadas y las que deben usarse a menos que se especifique lo contrario.
Se entiende que las moléculas descritas en la presente pueden tener sustituciones adicionales de aminoácidos conservadoras o no esenciales, que no tienen un efecto sustancial sobre sus funciones.
Se pretende que el término "aminoácido" abarque todas las moléculas, ya sean naturales o sintéticas, que incluyan tanto una funcionalidad amino como una funcionalidad de ácido y que puedan incluirse en un polímero de aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos ejemplares incluyen aminoácidos de origen natural; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos que tienen cadenas laterales variantes; y todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" incluye tanto los isómeros ópticos D o L como los peptidomiméticos.
Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" (si es de cadena sencilla) se usan indistintamente en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcado. El polipéptido puede aislarse de fuentes naturales, puede producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota o procariota, o puede ser producto de procedimientos sintéticos.
Los términos "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótidos" y "polinucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El polinucleótido puede ser o de cadena sencilla o de cadena doble, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido). Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, por ejemplo mediante conjugación con un componente de marcado. El ácido nucleico puede ser un polinucleótido recombinante o un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o está enlazado a otro polinucleótido en una disposición no natural.
El término "aislado", como se usa en la presente, se refiere al material que se separa de su entorno original o nativo (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por la intervención humana de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, sí está aislado. Tales polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una composición, y aun así estar aislados en el sentido de que dicho vector o composición no forma parte del entorno en el que se encuentra en la naturaleza.
Como se usa en la presente, el término "tratar", por ejemplo, una infección bacteriana o un trastorno relacionado, significa que un sujeto (por ejemplo, un humano) que tiene una infección bacteriana o un trastorno relacionado, y/o experimenta un síntoma de una infección bacteriana o un trastorno relacionado, padecerá, en una realización, un síntoma menos grave y/o se recuperará más rápidamente cuando se administre una molécula de anticuerpo, un ADC o un péptido antimicrobiano que si nunca se administrara la molécula de anticuerpo, el ADC o el péptido antimicrobiano. En una realización, cuando se trata una infección o un trastorno relacionado, un ensayo para detectar bacterias en el sujeto detectará menos bacterias después de un tratamiento eficaz para la infección o el trastorno. Por ejemplo, un ensayo de diagnóstico que usa una molécula de anticuerpo o ADC, como una molécula de anticuerpo o ADC descritos en la presente, detectará menos bacterias o ninguna en una muestra biológica de un sujeto después de la administración de una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano para el tratamiento eficaz de la infección o trastorno. Para monitorizar el tratamiento en un paciente, para detectar la presencia, por ejemplo, la disminución de la presencia (o ausencia) tras el tratamiento de la infección o trastorno bacteriano en el sujeto también pueden usarse otros ensayos, como la PCR (por ejemplo, qPCR). El tratamiento puede, por ejemplo, aliviar parcial o completamente, mejorar, mitigar, inhibir o reducir la gravedad y/o reducir la incidencia y, opcionalmente, retrasar la aparición de una o más manifestaciones de los efectos o síntomas, características y/o causas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo, una infección bacteriana). En una realización, el tratamiento es de un sujeto que no presenta ciertos signos de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección en cuestión y/o de un sujeto que sólo presenta signos tempranos de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección. En una realización, el tratamiento es de un sujeto que presenta uno o más signos establecidos de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección relevante. En una realización, el tratamiento se aplica a un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece una infección bacteriana o un trastorno relacionado.
Como se usa en la presente, el término "prevenir", por ejemplo, una infección bacteriana, significa que un sujeto (por ejemplo, un humano) tiene menos probabilidades de tener una infección bacteriana si el sujeto recibe la molécula de anticuerpo, el ADC o el péptido antimicrobiano antes de (por ejemplo, 1 día, 2 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 1 mes o más) estar expuesto a las bacterias que provocan la infección.
Como se usa en la presente, el término "concentración inhibitoria mínima" o "MIC" se refiere a la concentración más baja de un agente antimicrobiano, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, que inhibirá el crecimiento (por ejemplo, crecimiento visible) de una bacteria, por ejemplo, después de la incubación (por ejemplo, incubación durante la noche). Los métodos para determinar la concentración inhibitoria mínima o MIC se describen, por ejemplo, en Andrews, J. Antimicrob. Chemother. 2001; 48 Suppl 1:5-16 (Fe de erratas en J. Antimicrob. Chemother. 2002; 49(6): 1049). Por ejemplo, la MIC puede determinarse usando el siguiente procedimiento: preparación de la solución madre del antibiótico, preparación del intervalo de dilución del antibiótico, preparación de las placas de dilución en agar, preparación del inóculo, inoculación, incubación y lectura e interpretación de los resultados. Las MIC también pueden determinarse por dilución en agar o microdilución en caldo, habitualmente siguiendo las directrices de un organismo de referencia como el Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI), la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) o el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). En una realización, la MIC es la concentración más baja de un agente antimicrobiano, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, que inhibe el crecimiento de una bacteria en por lo menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. En una realización, la MIC es la concentración más baja de un agente antimicrobiano, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, que inhibe el crecimiento de una bacteria en por lo menos un 80%. En el Ejemplo 2 también se describe un método ejemplar para determinar la MIC.
Como se usa en la presente, el término "concentración bactericida mínima" o "MBC" se refiere a la concentración más baja de un agente antimicrobiano, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, necesaria para matar una bacteria en particular. En una realización, la concentración bactericida mínima o MBC puede determinarse a partir de pruebas de concentración inhibitoria mínima (MIC) por dilución en caldo mediante subcultivo en placas de agar que no contienen el agente de prueba. En una realización, la MBC se identifica determinando la concentración más baja de agente antimicrobiano que reduce la viabilidad del inóculo bacteriano inicial en >99,9%. En una realización, los agentes antimicrobianos se consideran habitualmente bactericidas si la MBC no es de más de cuatro veces la MIC (French, J Antimicrob Chemother. 2006; 58(6): 1107-1117).
A continuación se describen con más detalle varios aspectos de las composiciones y métodos de la presente. A lo largo de la memoria descriptiva se exponen definiciones adicionales.
Lipopolisacáridos
En la presente se divulgan moléculas de anticuerpo y conjugados de molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que pueden unirse a lipopolisacáridos (LPS), por ejemplo, en la membrana externa de bacterias Gram negativas. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a una región pentasacárida de núcleo del LPS. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, se apunta a una región de núcleo de LPS, por lo menos en parte, porque tiene una o más de las siguientes propiedades: alta densidad, conservada dentro de las especies, accesible o esencial para la adhesión (Raetz y Whitfield Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 635-700; de Kievit y lam J Bacterial. 1994; 176(23):7129-39; Schmengler et al. EurJ Cell Biol. 2010; 89(1):25-33; Pieretal. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154(4 Pt 2):S175-82).
Los LPS, también conocidos como lipoglicanos o endotoxina, son moléculas grandes que incluyen un lípido y un polisacárido compuesto de antígeno O, núcleo externo y núcleo interno unidos por un enlace covalente. El LPS se encuentra, por ejemplo, en la membrana externa de las bacterias Gram negativas, que pueden provocar fuertes respuestas inmunitarias en los animales. El LPS contribuye a la integridad estructural de las bacterias y protege a la membrana contra ciertos tipos de ataques químicos. También aumenta la carga negativa de la membrana celular y ayuda a estabilizar la estructura general de la membrana. El LPS puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria en los animales. También se ha implicado en aspectos no patógenos de la ecología bacteriana, incluyendo la adhesión a la superficie, la sensibilidad a bacteriófagos y las interacciones con depredadores como las amebas. El LPS es necesario para la conformación adecuada de la actividad de las omptinas; sin embargo, un LPS liso obstaculizará estéricamente las omptinas. Como el LPS es un componente principal de la membrana externa de las bacterias Gram negativas, la mutación o eliminación del LPS puede provocar la muerte de las bacterias Gram negativas.
El LPS comprende tres partes: Antígeno O (o polisacárido O), Oligosacárido del núcleo y Lípido A.
El antígeno O, también conocido como polisacárido O o cadena lateral O, es un polímero de glicano repetitivo contenido dentro de un LPS de la bacteria. El antígeno O está unido al oligosacárido de núcleo, y comprende el dominio más externo de la molécula de LPS. La composición de la cadena O varía de una cepa a otra. Por ejemplo, hay más de 160 estructuras diferentes de antígeno O producidas por distintas cepas deE. coli(Raetz y Whitfield Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 635-700). La presencia o ausencia de cadenas O determina si el LPS se considera rugoso o liso. Las cadenas O de longitud completa harían que el LPS fuera liso, mientras que la ausencia o reducción de cadenas O haría que el LPS fuera rugoso (Rittig et al. J. Leukoc. Biol. 2003; 74 (6): 1045-55). Las bacterias con LPS rugoso tienen habitualmente membranas celulares más penetrables a los antibióticos hidrófobos, ya que un LPS rugoso es más hidrófobo (Tsujimoto etal. J. Infect. Chemother. 1999, 5(4): 196-200. El antígeno O está expuesto en la superficie externa de la célula bacteriana y puede ser reconocido por los anticuerpos del huésped.
El oligosacárido de núcleo o dominio de núcleo contiene un componente oligosacárido que se une directamente al lípido A y comúnmente contiene azúcares como heptosa (Hep) y ácido 3-deoxi-D-mannooctulosónico (también conocido como Kdo o ceto-desoxioctulosonato) (Hershberger y Binkley, J. Biol. Chem. 1968; 243 (7): 1578 1584). Una región típica de pentasacárido o pentasacárido de núcleo incluye, por ejemplo, dos residuos Kdo y uno, dos o tres residuos Hep. La composición y estructura de los pentasacáridos del núcleo de bacterias ejemplares se muestran en la FIG. 1. Los núcleos de LPS de muchas bacterias también contienen componentes no carbohidratos, como fosfato, aminoácidos y sustituyentes de etanolamina.
Un núcleo LPS puede incluir un núcleo interno y un núcleo externo.
La "base" del núcleo interno es de 1-3 residuos Kdo. El último Kdo se modifica a menudo con un grupo fosfato o etanolamina. A los residuos de Kdo se unen 2-3 residuos de heptosa (por ejemplo, L-glicero-D-mannoheptulosa) que habitualmente están fosforilados. Estos residuos de Kdo y heptosa forman el "núcleo interno". El enlace cetosídico entre Kdo y el lípido A (a2—6) es especialmente susceptible a la escisión por ácidos. Las porciones lipídica y polisacárida del LPS pueden separarse mediante un tratamiento con ácido débil. Una molécula de LPS que incluye sólo un lípido A y un núcleo interno (o menos) se denomina "LPS profundo".
El núcleo externo está formado por residuos de hexosas que se unen al último residuo de heptosa del núcleo interno. Las hexosas que se encuentran a menudo en el núcleo externo incluyen, por ejemplo, D-glucosa, D-manosa o D-galactosa. Habitualmente hay por lo menos tres hexosas unidas (31—»3, el antígeno O estando ligado a la tercera hexosa. Otras hexosas se encuentran a menudo unidas al núcleo externo, ramificándose desde el oligómero principal. Los LPS que incluyen el lípido A y un oligosacárido de núcleo completo (interno y externo) se denominan "LPS rugosos".
El lípido A es, en algunas circunstancias, un disacárido de glucosamina fosforilada decorado con múltiples ácidos grasos. Estas cadenas hidrófobas de ácidos grasos anclan el LPS en la membrana bacteriana, y el resto del LPS sobresale de la superficie celular. El dominio lipídico A es responsable de gran parte de la toxicidad de las bacterias Gram negativas. Cuando las células bacterianas son lisadas por el sistema inmunitario, se liberan a la circulación fragmentos de membrana que contienen lípido A, lo que provoca fiebre, diarrea y un posible shock endotóxico mortal (también llamado shock séptico).
En una realización, el objetivo es un glicano de núcleo deP. aeruginosa.En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a un glicano del núcleo interno deP. aeruginosa.Por ejemplo, el epítopo puede incluir Hepl y, en menor grado, contactos circundantes. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une al LPS liso, al LPS rugoso o a ambos. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC no se une, o no se une sustancialmente, a O-polisacáridos. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a una heptosa hiperfosforilada. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC no se une, o no se une sustancialmente, a bacterias Gram negativas distintas deP. aeruginosa.En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a una unidad de heptosa fosforilada sintética. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo o ADC descrita en la presente (por ejemplo, mAb001) puede unirse al epítopo mostrado en laFIG.29.Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, los glicanos de núcleo deP. aeruginosase conservan entre cepas, son accesiblesin vivo,y/o tienen elementos de variación/resistencia de fase limitados.
En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une al LPS fosforilado, por ejemplo, una región de pentasacárido de núcleo fosforilada del LPS. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC descrita en la presente se une a uno o más (por ejemplo, dos o tres) grupos fosfato en la región del núcleo del LPS deP. aeruginosa.En una realización, el grupo fosfato se une a un residuo de arginina en la molécula de anticuerpo o ADC. En una realización, el grupo fosfato es inhibido o neutralizado por un residuo de arginina en la molécula de anticuerpo o ADC. En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a por lo menos tres grupos fosfato (por ejemplo, Hep2,4,6-PO<4>) en la región LPS de núcleo deP. aeruginosa,cada uno de los cuales está unido, inhibido o neutralizado por un residuo de Arginina (por ejemplo, R100, R101 o R103) en la molécula de anticuerpo o ADC. Por ejemplo, la cavidad H3 y L3 de la molécula de anticuerpo puede alojar un monosacárido. En laFIG. 30se ilustran las interacciones entre los glicanos fosforilados (Hep2,4,6-PO4) y tres residuos de arginina (R100, R101 y R103) en una molécula de anticuerpo ejemplar, mAb001.
Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, los fosfatos a los que se dirige una molécula de anticuerpo o ADC descritos en la presente son esenciales para la supervivencia de las bacterias (por ejemplo,P. aeruginosa).En una realización, la molécula de anticuerpo o ADC se une a uno o más (por ejemplo, 2 o 3) fosfatos del núcleo interno (por ejemplo, HepI) del LPS deP. aeruginosa.La fosforilación adecuada de HepI es típicamente necesaria para la biosíntesis de la membrana externa en ciertas bacterias Gram negativas, por ejemplo,P. aeruginosa.Una membrana externa comprometida debido a la falta de fosforilación adecuada de HepI puede llevar a bacterias no virales.
Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, un operón que comprende tres quinasas presentes en múltiples cepas secuenciadas deP. aeruginosaestán implicadas en la fosforilación de HepI. En este operón exclusivo de Pseudomonas, los genes quinasawaaPywapPson genes esenciales para las cepas deP. aeruginosay son típicamente necesarios para la viabilidad (Delucia et al. MBio. 2011; 2(4). pii: e00142-11). El mismo operón también contiene genes que codifican quinasas adicionales (por ejemplo,wapQy por lo menos una quinasa putativa adicional), que son específicos para especies deP. aeruginosay codifican quinasas no esenciales. La unión entre las moléculas de anticuerpo o los ADC descritos en la presente yP. aeruginosano se ve afectada típicamente por la deleción de estos genes de quinasa no esenciales del operón. Por consiguiente, las moléculas de anticuerpos y los ADC descritos en la presente tienen una amplia cobertura de cepas deP. aeruginosa,tienen una alta especificidad hacia pacientes infectados por Pseudomonas y son eficaces para tratar o prevenir infecciones asociadas con cepas deP. aeruginosaresistentes o mutantes.
Moléculas de anticuerpos
En la presente se divulgan moléculas de anticuerpo que se unen a bacterias (por ejemplo, bacterias Gram negativas) y/o lipopolisacáridos (LPS). Los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) divulgados en la presente pueden incluir una molécula de anticuerpo divulgada en la presente.
Como se usa en la presente, el término "molécula de anticuerpo" se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o un fragmento de la misma, que comprende por lo menos una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. El término "molécula de anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos maduros de longitud completa y fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede incluir una secuencia de dominio variable de cadena pesada (H) (abreviada en la presente como VH), y una secuencia de dominio variable de cadena ligera (L) (abreviada en la presente como VL). En otro ejemplo, una molécula de anticuerpo incluye dos secuencias de dominio variable de cadena pesada (H) y dos secuencias de dominio variable de cadena ligera (L), formando de este modo dos sitios de unión a antígeno, como Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv, anticuerpos de cadena sencilla (scFv por ejemplo), anticuerpos de dominio variable simple, diacuerpos (Dab) (bivalentes y biespecíficos), y anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados), que pueden producirse mediante la modificación de anticuerpos enteros o los sintetizadosde novomediante tecnologías de ADN recombinante. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales conservan la capacidad de unirse selectivamente a su antígeno o receptor respectivo. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos, incluyendo, pero no limitados a, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, y de cualquier subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos. Las moléculas de anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. La molécula de anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, injertado con<c>D<r>o generadoin vitro.La molécula de anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada elegida entre, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La molécula de anticuerpo también puede tener una cadena ligera elegida entre, por ejemplo, kappa o lambda. En la presente el término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con el término "anticuerpo".
Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazaos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de diacuerpo (dAb), que consiste en un dominio VH; (vi) un dominio variable camélido o camelizado; (vii) un Fv de cadena sencilla (scFv), véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); viii) un anticuerpo de dominio único. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando cualquier método adecuado, incluyendo varias técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y pueden cribarse los fragmentos para determinar su utilidad de la misma manera que la de los anticuerpos intactos.
El término "anticuerpo" incluye moléculas intactas, así como fragmentos funcionales de las mismas. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden alterarse, por ejemplo, mutarse, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir una o más de: la unión al receptor Fc, la glicosilación del anticuerpo, el número de residuos de cisteína, la función de las células efectoras o la función del complemento).
La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) puede manipularse (véase, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80; y Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52). El anticuerpo de cadena sencilla puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tengan especificidades para diferentes epítopos de la misma proteína diana.
Las moléculas de anticuerpos divulgadas en la presente también pueden ser anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único pueden incluir anticuerpos cuyas regiones determinantes complementarias forman parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos de manera natural de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, anticuerpos manipulados y andamiajes de dominio único distintos de los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio único pueden ser cualquiera de los anticuerpos de dominio único del estado de la técnica o futuros. Los anticuerpos de dominio único pueden derivarse de cualquier especie, incluyendo, pero no limitadas a, ratón, humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. De acuerdo con algunos aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único de origen natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Tales anticuerpos de dominio único se divulgan en la Publicación Internacional N° WO 94/04678, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de manera natural de cadena ligera se conoce en la presente como VHH o nanocuerpo para distinguirlo dla VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH puede derivarse de anticuerpos criados en especies deCamelidae,por ejemplo en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además deCamelidaepueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos de manera natural de cadena ligera; también se contemplan tales VHH.
Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR o FW). Los términos "región determinante de la complementariedad" y "CDR", como se usan en la presente, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de los anticuerpos que confieren especificidad al antígeno y afinidad de unión. En la presente, los términos "marco", "FW" y "FR" se usan indistintamente.
La extensión de la región marco y de las CDR se ha definido con precisión mediante una serie de métodos (véase, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, N° de Publicación de NIH 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; y la definición AbM usada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase de manera general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En una realización, se usan las siguientes definiciones: definición de AbM de la CDR1 del dominio variable de la cadena pesada y definiciones Kabat para las demás CDR. En una realización, se usan las definiciones de Kabat para todas las CDR. Además, las realizaciones descritas con respecto a las CDR de Kabat o AbM también pueden implementarse usando asas hipervariables de Chothia. Cada VH y VL incluye típicamente tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Como se usa en la presente, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede incluir o no uno, dos o más aminoácidos N- o C-terminales, o puede incluir otras alteraciones que sean compatibles con la formación de la estructura de la proteína.
El término "región de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende determinantes que forman una interfaz que se une a un antígeno, por ejemplo, lipopolisacárido (LPS), o a un epítopo del mismo. Con respecto a las proteínas (o miméticos de proteínas), la región de unión a antígeno incluye típicamente una o más asas (de por lo menos, por ejemplo, cuatro aminoácidos o miméticos de aminoácidos) que forman una interfaz que se une al antígeno, por ejemplo, LPS. Típicamente, la región de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo incluye por lo menos una o dos CDR y/o asas hipervariables, o más típicamente por lo menos tres, cuatro, cinco o seis CDR y/o asas hipervariables.
Los términos "competir" o "competencia cruzada" se usan indistintamente en la presente para referirse a la capacidad de una molécula de anticuerpo de interferir con la unión de una molécula de anticuerpo anti-LPS, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS proporcionada en la presente, a una diana, por ejemplo, LPS en una bacteria Gram negativa. La interferencia con la unión puede ser directa o indirecta (por ejemplo, a través de una modulación alostérica de la molécula de anticuerpo o de la diana). El grado en el que una molécula de anticuerpo es capaz de interferir con la unión de otra molécula de anticuerpo a la diana, y por tanto si puede decirse que compite, puede determinarse usando un ensayo de unión en competición, por ejemplo, un ensayo FACS, un ensayo ELISA, un ensayo SPR o un ensayo OCTET® (ForteBio).Un ensayo de unión de competición es un ensayo de competición cuantitativo. Se dice que una primera molécula de anticuerpo anti-LPS compite por la unión a la diana con una segunda molécula de anticuerpo anti-LPS cuando la unión de la primera molécula de anticuerpo a la diana se reduce en un 10% o más, por ejemplo, un 20% o más, un 30% o más, un 40% o más, un 50% o más, un 55% o más, un 60% o más, un 65% o más, un 70% o más, un 75% o más, un 80% o más, un 85% o más, un 90% o más, un 95% o más, un 98% o más, un 99% o más en un ensayo de unión de competición (por ejemplo, un ensayo de competición descrito en la presente).
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usan en al presente se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Un anticuerpo monoclonal puede elaborarse mediante tecnología de hibridoma o mediante métodos que no usan tecnología de hibridoma (por ejemplo, métodos recombinantes).
Una proteína "efectivamente humana" es una proteína que no provoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, la respuesta de anticuerpos antimurinos humanos (HAMA). En varias circunstancias la HAMA puede ser problemática, por ejemplo, si la molécula de anticuerpo se administra repetidamente, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente. Una respuesta HAMA puede hacer que la administración repetida de anticuerpos sea potencialmente ineficaz debido a una depuración de anticuerpos aumentada del suero (véase, por ejemplo, Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32:180-190 (1990)) y también debido a posibles reacciones alérgicas (véase, por ejemplo, LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)).
La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, producirse mediante cualquier método combinatorio o de presentación en fagos adecuado.
En la técnica se conocen varios métodos combinatorios y de presentación en fagos para generar anticuerpos (como se describe en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Kang et al. Publicación internacional N° WO 92/18619; Dower et al. Publicación internacional N° WO 91/17271; Winter et al. Publicación internacional N° WO 92/20791; Markland et al. Publicación internacional N° WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional N° WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional N° WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional N° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982).
En una realización, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, un anticuerpo elaborado en un ratón que ha sido manipulado genéticamente para que produzca un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana), o un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo de roedor (ratón o rata), cabra, primate (por ejemplo, mono), camello. En una realización, el anticuerpo no humano es de un roedor (anticuerpo de ratón o rata). En la técnica se conocen los métodos de producción de anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse usando ratones transgénicos portadores de los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema del ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan mAb humanos con afinidades específicas para epítopos de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood et al. Solicitud Internacional WO 91/00906, Kucherlapati et al. Publicación de PCT WO 91/10741; Lonberg et al. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay et al. Solicitud Internacional 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326).
Un anticuerpo puede ser uno en el que la región variable, o una parte de la misma, por ejemplo, las CDR, se generan en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón. Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados forman parte de la invención. Los anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón, y luego modificados, por ejemplo, en el marco variable o la región constante, para disminuir la antigenicidad en un humano forman parte de la invención.
Los anticuerpos quiméricos pueden producirse mediante cualquier técnica de ADN recombinante adecuada.
En la técnica se conocen varias (véase, Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., Solicitud internacional WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559).
Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR tendrá por lo menos una o dos, pero generalmente las tres CDR del receptor (de las cadenas de inmunoglobulina pesada y/o ligera) sustituidas por una CDR del donante. El anticuerpo puede sustituirse con por lo menos una parte de una CDR no humana o pueden sustituirse con CDR no humanas sólo algunas de las CDR. Sólo es necesario sustituir el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado al lipopolisacárido. En una realización, el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será un marco humano o un marco humano consensuado. Típicamente, la inmunoglobulina que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina que proporciona el marco se denomina "aceptora". En algunas realizaciones, la inmunoglobulina donante es no humana (por ejemplo, de roedor). El marco aceptor típicamente es un marco de origen natural (por ejemplo, humano) o un marco de consenso, o una secuencia aproximadamente un 85% o más, por ejemplo, en un 90%, 95%, 99% o más idéntica al mismo.
Como se usa en la presente, el término "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con más frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de proteínas, cada posición de la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con más frecuencia en esa posición de la familia. Si hay dos aminoácidos con la misma frecuencia, puede incluirse cualquiera de ellos en la secuencia de consenso. El "marco de consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina de consenso.
Un anticuerpo puede humanizarse mediante cualquier método adecuado, y en la técnica se conocen varios métodos de este tipo (véase, por ejemplo, Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, de Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y de Queen et al. US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762).
Los anticuerpos humanizados o injertados con CDR pueden producirse por injerto de CDR o sustitución de CDR, en donde pueden sustituirse una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.225.539; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239: 1534; Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060; Winter US 5.225.539. Winter describe un método de injerto de CDR que puede usarse para preparar anticuerpos humanizados (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter<u>S 5,225,539).
También se proporcionan anticuerpos humanizados en los que se han sustituido, suprimido o añadido aminoácidos específicos. Los criterios para seleccionar aminoácidos del donante se describen en, por ejemplo, la US 5.585.089, por ejemplo, las columnas 12-16 de la US 5.585.089. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan et al. EP 519596 A1, publicada el 23 de diciembre de 1992.
En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; en particular, elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada (por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada humanas) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera (por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera humana) de kappa o lambda. La región constante puede alterarse, por ejemplo, mutarse, para modificar las propiedades de la molécula de anticuerpo (por ejemplo, para aumentar o disminuir una o más de: la unión al receptor Fc, la glicosilación del anticuerpo, el número de residuos de cisteína, la función de las células efectoras y/o la función del complemento). En una realización, la molécula de anticuerpo tiene función efectora y puede fijar el complemento. En otra realización, la molécula de anticuerpo no recluta células efectoras ni fija el complemento. En ciertas realizaciones, la molécula de anticuerpo tiene una capacidad reducida o nula para unirse a un receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no soporta la unión a un receptor Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor Fc mutagenizada o eliminada. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región Fc que se ha alterado para aumentar la actividad de ADCC. En una realización, la actividad de ADCC se aumenta 10 veces o más, por ejemplo, 25 veces o más, 50 veces o más, 100 veces o más, 200 veces o más, 400 veces o más, 600 veces o más, 800 veces o más, o 1000 veces o más, por ejemplo, entre 100 veces y 1000 veces o entre 250 veces y 750 veces. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región Fc que se altera para modular el acoplamiento con un receptor Fcy o una actividad de opsonofagocitosis. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región Fc que se ha alterado para modular el acoplamiento con un receptor FcRn.
En una realización, se altera una región constante de la molécula de anticuerpo. En la técnica se conocen los métodos para alterar la región constante de un anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector, como FcR en una célula, o el componente C1 del complemento pueden producirse sustituyendo por lo menos un residuo de aminoácido en la parte constante del anticuerpo por un residuo diferente (véanse, por ejemplo, la EP 388,151 A1, la Patente de Estados Unidos N° 5.624.821 y la Patente de Estados Unidos N° 5.648.260). También se contemplan mutaciones de aminoácidos que estabilizan la estructura del anticuerpo, como S228P (nomenclatura EU, S241P en la nomenclatura Kabat) en IgG4 humana. Podrían describirse alteraciones de tipo similar que si se aplicaran a la inmunoglobulina murina, o de otra especie, reducirían o eliminarían estas funciones.
En una realización, la molécula de anticuerpo está manipulada para un acoplamiento óptimo con un receptor Fc, por ejemplo, FcyRIIa, FcyRIl, C1q, o una combinación de los mismos, por ejemplo, para una actividad opsonofagocítica mejorada (OPA), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o ambas. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la OPA puede estar mediada por el acoplamiento de la región Fc del anticuerpo con el receptor de activación FcyRIIa y el receptor inhibidor FcyRIlb. En una realización, pueden identificarse mutaciones en el Fc que mejoran selectivamente el acoplamiento con FcyRIIa sobre FcyRIIb, por ejemplo, usando las estructuras cristalinas resueltas de Fc con FcyRIIa y FcyRIIb. Las moléculas de anticuerpo o<a>D<c>que albergan una o más mutaciones potenciadoras del acoplamiento Fc pueden evaluarse en ensayos OPA. En otra realización, pueden identificarse mutaciones de Fc para aumentar la unión al complejo C1q, por ejemplo, para promover el depósito del complemento en bacterias y la eliminación de bacterias mediada por C1q. Las moléculas de anticuerpo o a Dc que albergan una o más mutaciones que aumentan la afinidad C1q pueden evaluarse en ensayos CDC.
En una realización, los únicos aminoácidos de la molécula de anticuerpo son aminoácidos canónicos. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende aminoácidos de origen natural; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos que tienen cadenas laterales variantes; y/o todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. La molécula de anticuerpo puede comprender los isómeros ópticos D o L de aminoácidos y peptidomiméticos.
Un polipéptido de una molécula de anticuerpo descrita en la presente puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. La molécula de anticuerpo también puede modificarse; por ejemplo, mediante la formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de marcado. El polipéptido puede aislarse de fuentes naturales, puede producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota o procariota, o puede ser producto de procedimientos sintéticos.
La molécula de anticuerpo descrita en la presente puede usarse sola en forma no conjugada, o puede unirse a una sustancia, por ejemplo, una toxina o una fracción (por ejemplo, un fármaco terapéutico (por ejemplo, un antibiótico); un compuesto emisor de radiación; moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano; o una proteína biológica (por ejemplo, una toxina proteica) o partícula (por ejemplo, una partícula vírica recombinante, por ejemplo, a través de una proteína de la envoltura vírica). Por ejemplo, el anticuerpo anti-LPS puede acoplarse a un isótopo radiactivo como un emisor a-, p- o<y>, o un emisor p- y<y>.
Una molécula de anticuerpo puede derivatizarse o enlazarse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Como se usa en la presente, una molécula de anticuerpo "derivatizada" es aquella que ha sido modificada. Los métodos de derivatización incluyen, entre otros, la adición de una fracción fluorescente, un radionucleótido, una toxina, una enzima o un ligando de afinidad como la biotina. Por consiguiente, las moléculas de anticuerpos incluyen formas derivatizadas y modificadas de otro modo de los anticuerpos descritos en la presente, incluyendo las moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede estar funcionalmente enlazada (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) con una o más entidades moleculares, como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, una toxina, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Algunos tipos de moléculas de anticuerpos derivatizados se producen mediante la reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen los heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales conectores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
Los agentes detectables útiles con los que puede derivatizarse (o marcarse) una molécula de anticuerpo anti-LPS incluyen compuestos fluorescentes, varias enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, átomos metálicos emisores de fluorescencia, por ejemplo, europio (Eu), y otros antánidos, y materiales radiactivos (descritos más adelante). Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también puede derivatizarse con enzimas detectables, como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se derivatiza con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que usa la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando hay agente detectable peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Una molécula de anticuerpo también puede derivatizarse con un grupo prostético (por ejemplo, estreptavidina/biotina y avidina/biotina). Por ejemplo, un anticuerpo puede derivatizarse con biotina y detectarse mediante la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina.
La molécula de anticuerpo marcada puede usarse, por ejemplo, con fines diagnósticos y/o experimentales en una serie de contextos, que incluyen (i) para aislar un antígeno predeterminado mediante técnicas estándar, como la cromatografía de afinidad o la inmunoprecipitación; (ii) para detectar un antígeno predeterminado (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína; (iii) para monitorizar los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de análisis clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.
Una molécula de anticuerpo puede conjugarse con otra entidad molecular, típicamente un marcador o una fracción o agente terapéutico (por ejemplo, antimicrobiano (por ejemplo, antibacteriano o bactericida), inmunomodulador, inmunoestimulador, citotóxico o citostático). En aplicaciones diagnósticas o terapéuticas pueden usarse isótopos radiactivos. Los isótopos radiactivos que pueden acoplarse a las moléculas de anticuerpo incluyen, entre otros, emisores a, p o y, o emisores p y y. Tales isótopos radiactivos incluyen, entre otros, yodo (131I o 125I), itrio (90Y), lutecio (177Lu), actinio (225Ac), praseodimio, astato (211At), renio (186Re), bismuto (212Bi o 213Bi), indio (111In), tecnecio (99mTc), fósforo (32P), rodio (188Rh), azufre (35S), carbono (14C), tritio (3H), cromo (51Cr), cloro (36Cl), cobalto (57Co o 58Co), hierro (59Fe), selenio (75Se), o galio (67Ga). Los radioisótopos útiles como agentes terapéuticos incluyen itrio (90Y), lutecio (177Lu), actinio (225Ac), praseodimio, astatina (211At), renio (186Re), bismuto (212Bi o 213Bi) y rodio (188Rh). Los radioisótopos útiles como marcadores, por ejemplo, para su uso en diagnóstico, incluyen yodo (131I o 125I), indio (111In), tecnecio (99mTc), fósforo (32P), carbono (14C) y tritio (3H), o uno o más de los isótopos terapéuticos enumerados anteriormente.
La presente divulgación proporciona moléculas de anticuerpo radiomarcadas y métodos de marcado de las mismas. En la presente, se divulga un método de marcado de una molécula de anticuerpo. El método incluye poner en contacto una molécula de anticuerpo, con un agente quelante, para producir de este modo un anticuerpo conjugado. El anticuerpo conjugado es radiomarcado con un radioisótopo, por ejemplo, 111Indio, 90Itrio y 177Lutecio, para producir de este modo una molécula de anticuerpo marcada.
Como se ha analizado con anterioridad, la molécula de anticuerpo puede conjugarse con un agente terapéutico. Ya se han mencionado los radioisótopos terapéuticamente activos. Ejemplos de otros agentes terapéuticos incluyen agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibacterianos), por ejemplo, péptidos antimicrobianos. En una realización, un péptido antimicrobiano puede acoplarse (por ejemplo, fusionarse) a la molécula de anticuerpo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de la molécula de anticuerpo. En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla (por ejemplo, fusiona) al extremo N-terminal de la cadena pesada o la cadena ligera o a un fragmento funcional de la misma. En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla (por ejemplo, fusiona) al extremo C-terminal de la cadena pesada o la cadena ligera o a un fragmento funcional de la misma. En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla (por ejemplo, fusiona) a una región constante o a una porción de la misma. En una realización, la cadena pesada o ligera, o una porción de la misma, y el péptido antimicrobiano, forman un polipéptido de fusión, por ejemplo, codificado por un marco de lectura abierto (ORF). A la molécula de anticuerpo se le pueden acoplar (por ejemplo, fusionar) uno o más péptidos antimicrobianos. En una realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son idénticos o sustancialmente idénticos. En otra realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son diferentes. En una realización, todos los péptidos antimicrobianos son idénticos o sustancialmente idénticos.
La divulgación proporciona un método para elaborar una molécula de anticuerpo divulgada en la presente. El método incluye: proporcionar un antígeno, por ejemplo, una bacteria (por ejemplo, una bacteria Gram-negativa) o LPS; obtener una molécula de anticuerpo que se une específicamente al antígeno; evaluar la eficacia de la molécula de anticuerpo en la modulación de la actividad del antígeno y/u organismo que expresa el antígeno, por ejemplo, una bacteria (por ejemplo, una bacteria Gram-negativa). El método puede incluir además administrar la molécula de anticuerpo, incluyendo un derivado de la misma (por ejemplo, una molécula de anticuerpo humanizada) a un sujeto, por ejemplo, un humano.
Esta divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la molécula de anticuerpo anterior, vectores y células huésped de la misma. La molécula de ácido nucleico incluye, entre otros, ARN, ADN genómico y ADNc.
En lasTablas 1, 2 y 8siguientes se describen secuencias ejemplares de moléculas de anticuerpos.
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o tres CDR de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. Aveces, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o tres CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1,2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. Aveces, la molécula de anticuerpo comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VH y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia.
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o tres HCDR descritas en laTabla 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una, dos o tres LCDR descritas en laTabla 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) HCDR y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) LCDR descritas en laTabla 1 u 8.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una, dos, tres o cuatro estructuras de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una, dos, tres o cuatro estructuras de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VH y/o una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1,2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.Aveces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2y una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera. En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera. A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, y regiones variables de cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, y regiones variables que comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a una región pentasacárida de núcleo del LPS. En una realización, la región pentasacárida de núcleo comprende uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo y uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo, o a uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep, o a cualquier combinación de los mismos.
En una realización, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende además uno o más marcos de región variable de cadena pesada o ligera humanos o derivados de humanos.
A veces, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 103). A veces, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 103).
A veces, la molécula de ADC o anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 104). Aveces, la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de laVldel anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 104).
A veces, el ADC o la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, la VH del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 103), y en donde la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 104).
A veces, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la VH del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 103) y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la VL del anticuerpo mAb001 (por ejemplo, SEQ ID NO: 104).
Aveces, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de laTabla 2(por ejemplo, SEQ ID NO: 113). A veces, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de laTabla 2(por ejemplo, SEQ ID NO: 114).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, y HCDR3), en donde la VH comprende una, dos, o todas las siguientes: una HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); o una HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118).
A veces, la VH comprende uno, dos, o todos los siguientes: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); o una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118).
A veces, la VH comprende: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de lasSe QID NOS: 115-118).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VL comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, y LCDR3), en donde la VL comprende una, dos, o todas las siguientes: una LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); o una LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, la VL comprende una, dos, o todas las siguientes: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); o una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, la VL comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de lasSe QID NOS: 119-137).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, y HCDR3), y la VL comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera(lCd R1, Lc Dr 2,y LCDR3),
en donde la VH comprende una, dos, o todas las siguientes: una HCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); o una HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); y
en donde la VL comprende una, dos, o todas las siguientes: una LCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); o una LCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 99 o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, la VH comprende una, dos, o todas las siguientes: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); o una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de lass EqID NOS: 115-118); y la VL comprende una, dos, o todas los siguientes: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); o una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, la VH comprende: una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118); y la VL comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137); y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de lalCd R3de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de lass EqID NOS: 119-137).
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además uno o más marcos de región variable de cadena pesada o ligera humanos o derivados de humanos.
Aveces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118). Aveces, la VH comprende la secuencia de aminoácidos de una VH descrita en laTabla8 (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137). Aveces, la VL comprende la secuencia de aminoácidos de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118), y en donde la VL comprende una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137). Aveces, la VH comprende la secuencia de aminoácidos de una VH descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 115-118), y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de una VL descrita en laTabla 8(por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 119-137).
A veces, las HCCDR1, HCCDR2 y HCCDR3 son de la misma VH descrita en laTabla 8.A veces, las LCCDR1, LCCDR2 y LCCDR3 son de la misma VL descrita en laTabla 8.
Cualquiera de las secuencias de aminoácidos VH (o las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2, y HCDR3 de las mismas) divulgadas en laTabla 8(o una secuencia que difiera en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, I I , 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de las mismas, o que tenga por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de homología con las mismas) puede combinarse con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la VL (o las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2, y LCDR3 de las mismas) descritas en laTabla 8(o una secuencia que difiera en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 residuos de aminoácidos de las mismas, o que tenga por lo menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de homología con las mismas), por ejemplo, para formar una molécula de anticuerpo humanizado. Las combinaciones ejemplares incluyen:
SEQ ID NOS: 103 y 104; SEQ ID NOS: 103 y 119; SEQ ID NOS: 103 y 120; SEQ ID NOS: 103 y 121; SEQ ID NOS: 103 y 122; SEQ ID NOS: 103 y 123; SEQ ID NOS: 103 y 124; SEQ ID NOS: 103 y 125; SEQ ID NOS: 103 y 126; SEQ ID NOS: 103 y 127; SEQ ID NOS: 103 y 128; SEQ ID NOS: 103 y 129; SEQ ID NOS: 103 y 130; SEQ ID NOS: 103 y 131; SEQ ID NOS: 103 y 132; SEQ ID NOS: 103 y 133; SEQ ID NOS: 103 y 134; SEQ ID NOS: 103 y 135; SEQ ID NOS: 103 y 136; SEQ ID NOS: 103 y 137; SEQ ID NOS: 115 y 104; SEQ ID NOS: 115 y 119; SEQ ID NOS: 115 y 120; SEQ ID NOS: 115 y 121; SEQ ID NOS: 115 y 122; SEQ ID NOS: 115 y 123; SEQ ID NOS: 115 y 124; SEQ ID NOS: 115 y 125; SEQ ID NOS: 115 y 126; SEQ ID NOS: 115 y 127; SEQ ID NOS: 115 y 128; SEQ ID NOS: 115 y 129; SEQ ID NOS: 115 y 130; SEQ ID NOS: 115 y 131; SEQ ID NOS: 115 y 132; SEQ ID NOS: 115 y 133; SEQ ID NOS: 115 y 134; SEQ ID NOS: 115 y 135; SEQ ID NOS: 115 y 136; SEQ ID NOS: 115 y 137; SEQ ID NOS: 116 y 104; SEQ ID NOS: 116 y 119; SEQ ID NOS: 116 y 120; SEQ ID NOS: 116 y 121; SEQ ID NOS: 116 y 122; SEQ ID NOS: 116 y 123; SEQ ID NOS: 116 y 124; SEQ ID NOS: 116 y 125; SEQ ID NOS: 116 y 126; SEQ ID NOS: 116 y 127; SEQ ID NOS: 116 y 128; SEQ ID NOS: 116 y 129; SEQ ID NOS: 116 y 130; SEQ ID NOS: 116 y 131; SEQ ID NOS: 116 y 132; SEQ ID NOS: 116 y 133; SEQ ID NOS: 116 y 134; SEQ ID NOS: 116 y 135; SEQ ID NOS: 116 y 136; SEQ ID NOS: 116 y 137; SEQ ID NOS: 117 y 104; SEQ ID NOS: 117 y 119; SEQ ID NOS: 117 y 120; SEQ ID NOS: 117 y 121; SEQ ID NOS: 117 y 122; SEQ ID NOS: 117 y 123; SEQ ID NOS: 117 y 124; SEQ ID NOS: 117 y 125; SEQ ID NOS: 117 y 126; SEQ ID NOS: 117 y 127; SEQ ID NOS: 117 y 128; SEQ ID NOS: 117 y 129; SEQ ID NOS: 117 y 130; SEQ ID NOS: 117 y 131; SEQ ID NOS: 117 y 132; SEQ ID NOS: 117 y 133; SEQ ID NOS: 117 y 134; SEQ ID NOS: 117 y 135; SEQ ID NOS: 117 y 136; SEQ ID NOS: 117 y 137; SEQ ID NOS: 118 y 104; SEQ ID NOS: 118 y 119; SEQ ID NOS: 118 y 120; SEQ ID NOS: 118 y 121; SEQ ID NOS: 118 y 122; SEQ ID NOS: 118 y 123; SEQ ID NOS: 118 y 124; SEQ ID NOS: 118 y 125; SEQ ID NOS: 118 y 126; SEQ ID NOS: 118 y 127; SEQ ID NOS: 118 y 128; SEQ ID NOS: 118 y 129; SEQ ID NOS: 118 y 130; SEQ ID NOS: 118 y 131; SEQ ID NOS: 118 y 132; SEQ ID NOS: 118 y 133; SEQ ID NOS: 118 y 134; SEQ ID NOS: 118 y 135; SEQ ID NOS: 118 y 136; o SEQ ID NOS: 118 y 137.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende o consiste en dos regiones variables de cadena pesada y dos regiones variables de cadena ligera.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, o ambas.
En una realización, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, la molécula de anticuerpo no es una molécula de anticuerpo IgM.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera de una cadena ligera kappa o lambda.
En una realización, la molécula de anticuerpo es capaz de unirse a dos o más cepas Gram-negativas. Las moléculas de anticuerpo capaces de unirse a dos o más cepas bacterianas Gram-negativas tienen varias propiedades ventajosas. Por ejemplo, puede usarse una terapia para tratar, prevenir o diagnosticar múltiples infecciones bacterianas. Además, un médico no necesita determinar qué cepa bacteriana infectó a un paciente para determinar la terapia adecuada.
De acuerdo con una realización, la molécula de anticuerpo se une a una o más bacterias, por ejemplo, una o más bacterias Gram-negativas, por ejemplo, de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas.
En una realización, la una o más bacterias Gram-negativas se seleccionan de una especiede Enterobacteriaceae(por ejemplo, una especie deKlebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia,oCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistente), una especiede Pseudomonas,una especie deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a una o más de:Klebsiella pneumonia(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobacter cancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia coliATCC 25922,Escherichia coliATCC 35401, oEscherichia coliATCC 43895),Escherichia fergusonii, Salmonella choleraesuis, Salmonella choleraesuissubsp.indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuissubsp.arizonae, Salmonella choleraesuissubsp.diarizonae, Salmonella choleraesuissubsp.houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacterbraakii,Citrobacterwerkmanii,Citrobacterfreundii,Citrobacteryoungae,Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a Pseudomonas, por ejemplo,P. aeruginosa.
En una realización, la una o más bacterias son una o más bacterias resistentes a los antibióticos, por ejemplo, una o más bacterias Gram negativas resistente a múltiples fármacos.
En una realización, la una o más bacterias resistentes a los antibióticos se seleccionan entre Pseudomonas (por ejemplo,P. aeruginosa),Enterobacteriaceae (por ejemplo,Klebsiella pneumonia o E. coli),o Acinetobacter (por ejemplo,A. baumannii).
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a uno o más de:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo, P.aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo, A.gonorrhoaeaeresistente a fármacos), Salmonella(por ejemplo,Salmonellaresistente a fármacos),Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos), una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL),o Mycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M. tuberculosisresistente a fármacos).
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o todas) cepas deP. aeruginosade la Tabla 7. En otra realización, la molécula de anticuerpo se une a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, o todas) cepas deP. aeruginosaresistente a múltiples fármacos de la Tabla 7.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une al LPS con alta afinidad, por ejemplo, con una K<d>que es menor de aproximadamente 10 nM, por ejemplo, medida por un método ELISA.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une al LPS con una K f más lenta de 1x10'4, 5x10'5, o 1x10' V . En una realización, la molécula de anticuerpo se une al LPS con una Kon más rápida de 1x104, 5x104, 1x105, o 5x105M -V .
En una realización, la molécula de anticuerpo tiene actividad opsonofagocítica, por ejemplo, como se determina por un ensayo OPA, por ejemplo, como se describe en la presente.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo que comprende uno o más (por ejemplo, dos) residuos Kdo y/o uno o más (por ejemplo, dos o tres) residuos Hep en LPS.
En una realización, a) la molécula de anticuerpo que se une al lipopolisacárido (LPS) se acopla (por ejemplo, se fusiona) a b) el péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente, por ejemplo, para formar un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC).
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH), en donde la región variable de cadena pesada se acopla (por ejemplo, se fusiona) al péptido antimicrobiano, por ejemplo, en donde la región variable de cadena pesada es N-terminal al péptido antimicrobiano.
En una realización, la región variable de cadena pesada se acopla (por ejemplo, fusiona) al péptido antimicrobiano indirectamente, por ejemplo, en donde el extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada se acopla (por ejemplo, fusiona) al extremo N-terminal del péptido antimicrobiano a través de una región constante.
En una realización, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región variable de cadena ligera se acopla (por ejemplo, se fusiona) al péptido antimicrobiano, por ejemplo, en donde la región variable de cadena ligera es N-terminal al péptido antimicrobiano.
En una realización, la región variable de la cadena ligera se acoplada (por ejemplo, fusiona) al péptido antimicrobiano indirectamente, por ejemplo, en donde el extremo C-terminal de la región variable de la cadena ligera se acopla (por ejemplo, fusiona) al extremo N-terminal del péptido antimicrobiano a través de una región constante.
En una realización, la molécula de anticuerpo se acopla (por ejemplo, fusiona) a dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más, por ejemplo, cuatro) péptidos antimicrobianos, por ejemplo, mediante conjugación enzimática o conjugación química. En una realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son idénticos. En una realización, por lo menos dos de los péptidos antimicrobianos son diferentes.
En una realización, la molécula de anticuerpo se acopla (por ejemplo, fusiona) a dos péptidos antimicrobianos idénticos, cada uno de los cuales se acopla (por ejemplo, fusiona) a una región variable de cadena pesada, por ejemplo, indirectamente, por ejemplo, a través de una región constante.
En una realización, el péptido antimicrobiano acoplado (por ejemplo, fusionado) a la molécula de anticuerpo es más eficaz para inhibir, por ejemplo, inhibir el crecimiento, virulencia o infectividad de una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que el péptido antimicrobiano o la molécula de anticuerpo solos, por ejemplo, con una concentración inhibitoria mínima (MIC) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces menor, que la MIC del péptido antimicrobiano solo.
En una realización, el péptido antimicrobiano acoplado (por ejemplo, fusionado) a la molécula de anticuerpo es más eficaz para reducir la viabilidad de, por ejemplo, matar, una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que el péptido antimicrobiano o la molécula de anticuerpo solos, por ejemplo, teniendo una concentración bactericida mínima (MBC) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces menor, que la MBC del péptido antimicrobiano solo.
En una realización, la molécula de anticuerpo tiene actividad opsonofagocítica (por ejemplo, se fagocita cuando se une al receptor Fc (FcR) de un neutrófilo), por ejemplo, como se determina mediante un ensayo OPA, por ejemplo, como se describe en la presente.
En una realización, el péptido antimicrobiano acoplado (por ejemplo, fusionado) a la molécula de anticuerpo no inhibe, por ejemplo, no inhibe el crecimiento, virulencia o infectividad de una bacteria Gram-positiva (por ejemplo, una bacteria Gram-positiva descrita en la presente), por ejemplo, que tiene una concentración inhibitoria mínima (MIC) para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces menor, que una MIC para una bacteria Gram positiva (por ejemplo, una bacteria Gram positiva).
En una realización, el péptido antimicrobiano acoplado (por ejemplo, fusionado) a la molécula de anticuerpo no reduce la viabilidad de, por ejemplo, no mata, una bacteria Gram-positiva (por ejemplo, una bacteria Gram-positiva descrita en la presente), por ejemplo, que tiene una concentración bactericida mínima (MBC) para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa) que es menor, por ejemplo, por lo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o 1000 veces menor, que una MBC para una bacteria Gram positiva (por ejemplo, una bacteria Gram positiva).
En una realización, la bacteria Gram-positiva esStaphylococcus aureus.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un epítopo lineal o conformacional en una bacteria Gram-negativa o en LPS.
En una realización, la molécula de anticuerpo se une al LPS de bajo MW y al LPS de alto MW, por ejemplo, según se determina mediante análisis Western. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a una región de heptosa altamente fosforilada del LPS de núcleo deP. aeruginosa.En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un residuo Hep I fosforilado (por ejemplo, hiperfosforilado, por ejemplo, bifosforilado) del LPS de núcleo. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a una región en el LPS del núcleo (por ejemplo, enP. aeruginosa)que es esencial para la formación de la membrana externa (como se describe, por ejemplo, en DeLucia et al. MBio. 2011; 2(4). pii: e00142-11).
En una realización, la molécula de anticuerpo se une a heptosa bifosforilada con afinidad alta, por ejemplo, con una Kd aparente igual o menor de aproximadamente 20 nM, por ejemplo, como se determina mediante un método descrito en la presente. En una realización, la molécula de anticuerpo se une preferiblemente a heptosa fosforilada (por ejemplo, hiperfosforilada), en comparación con heptosa no fosforilada. En una realización, la molécula de anticuerpo se une preferiblemente a heptosa hiperfosforilada (por ejemplo, bifosforilada), en comparación con heptosa con fosforilación simple. En una realización, la molécula de anticuerpo se une preferiblemente a heptosa hiperfosforilada (por ejemplo, bifosforilada), en comparación con manosa bifosforilada, manosa con fosforilación simple o manosa no fosforilada.
En una realización, la molécula de anticuerpo que tiene las propiedades de unión descritas en la presente comprende un motivo de sulfatasa (por ejemplo, un motivo de sulfatasa modificado), por ejemplo, como se describe en la presente.
Péptidos antimicrobianos
Como se usa en la presente, el término "péptido antimicrobiano" se refiere a un péptido que tiene una actividad antimicrobiana, por ejemplo, una actividad antibacteriana. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, los péptidos antimicrobianos pueden tener longitud, secuencia y estructura variables con una actividad de amplio espectro contra una serie de microorganismos, por ejemplo, bacterias, y opcionalmente bajos niveles de resistencia inducida. En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido antibacteriano.
Los péptidos antimicrobianos son un grupo diverso de moléculas, que se dividen en subgrupos en función de su composición y estructura de aminoácidos. Típicamente, estos péptidos incluyen dos o más residuos cargados positivamente proporcionados porarginina, lisina o, en entornos ácidos, histidina, y una gran proporción (por ejemplo, más del 50%) de residuos hidrófobos. Las estructuras secundarias de estas moléculas incluyen, por ejemplo, i) hélice a, ii) cadena p debido a la presencia de 2 o más enlaces disulfuro, iii) lazo u horquilla p debido a la presencia de un único enlace disulfuro y/o ciclización de la cadena peptídica, y iv) extendida. Algunos de estos péptidos pueden estar desestructurados en solución libre y plegarse en su configuración final al dividirse en membranas biológicas. Los péptidos antimicrobianos pueden contener residuos de aminoácidos hidrófilos alineados a lo largo de un lado y residuos de aminoácidos hidrófobos alineados a lo largo del lado opuesto de una molécula helicoidal. Esta capacidad anfipática de los péptidos antimicrobianos les permite dividirse en la bicapa lipídica de la membrana. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que en una realización, la capacidad de asociarse con las membranas es una característica típica de los péptidos antimicrobianos, aunque la permeabilización de la membrana puede no ser necesaria.
Los tipos de péptidos antimicrobianos incluyen, por ejemplo, péptidos aniónicos (por ejemplo, ricos en ácidos glutámico y aspártico), péptidos catiónicos a-helicoidales lineales (por ejemplo, que carecen de cisteína), péptidos catiónicos (por ejemplo, ricos en prolina, arginina, fenilalanina, glicina o triptófano), y péptidos aniónicos y catiónicos que contienen cisteína y forman enlaces disulfuro (por ejemplo, que contienen 1-3 enlaces disulfuro).
Los modos de acción mediante los cuales los péptidos antimicrobianos matan a los microbios son variados y pueden diferir para diferentes especies bacterianas. La membrana citoplasmática es una diana frecuente, pero los péptidos también pueden interferir con la síntesis de ADN y proteínas, el plegamiento de proteínas y la síntesis de la pared celular. El contacto inicial entre el péptido y el organismo diana puede ser electrostático, ya que la mayoría de las superficies bacterianas son aniónicas, o hidrófobas. Su composición de aminoácidos, anfipaticidad, carga catiónica y tamaño les permiten adherirse e insertarse en bicapas de membrana para formar poros mediante mecanismos de "barril de duelas", "alfombra" o "poro toroidal". Alternativamente, pueden penetraren la célula para unirse a moléculas intracelulares que son cruciales para la vida celular. Los modelos de unión intracelular incluyen la inhibición de la síntesis de la pared celular, la alteración de la membrana citoplasmática, la activación de la autolisina, la inhibición de la síntesis de ADN, ARN y proteínas, y la inhibición de ciertas enzimas. Estos péptidos pueden ser bactericidas y/o bacteriostáticos. Típicamente, la actividad antimicrobiana (por ejemplo, antibacteriana) de estos péptidos se determina midiendo la concentración inhibitoria mínima (MIC).
Se ha demostrado que los péptidos antimicrobianos matan bacterias Gram negativas y Gram positivas, virus, hongos y células transformadas o cancerígenas (Reddy et al. (2004) International Journal of Antimicrobial Agents 24 (6): 536-547). Los péptidos antimicrobianos también pueden tener una actividad inmunomoduladora. Por ejemplo, las actividades inmunomoduladoras pueden estar implicadas en la depuración de la infección, por ejemplo, la capacidad de alterar la expresión génica del huésped, actuar como quimiocinas y/o inducir la producción de quimiocinas, inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias inducida por lipopolisacáridos, promover la curación de heridas o modular las respuestas de las células dendríticas y las células de la respuesta inmunitaria adaptativa.
Pueden usarse varios métodos para determinar los mecanismos de la actividad del péptido antimicrobiano. Estos métodos incluyen, por ejemplo, espectroscopia de NMR de estado sólido, microscopía, espectroscopia de emisión atómica, tintes fluorescentes, formación de canales iónicos, dicroísmo circular y dicroísmo circular orientado, interferometría de polarización dual o difracción de neutrones y rayos X.
Un péptido antimicrobiano puede ser menor de 10kDa, por ejemplo, menor de 8kDa, 6kDa, 4kDa, 2kDa o 1kDa. A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en de aproximadamente 6 a aproximadamente 100 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 75 aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 50 aminoácidos, de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos, de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos, o de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 aminoácidos. En una realización, el péptido antibacteriano comprende o consiste en de aproximadamente 12 a aproximadamente 50 aminoácidos. A veces, el péptido antibacteriano comprende o consiste en de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 aminoácidos. A veces, el péptido antimicrobiano es sustancialmente catiónico. A veces, el péptido antimicrobiano es sustancialmente anfipático. A veces, el péptido antimicrobiano es sustancialmente catiónico y anfipático. A veces, el péptido antimicrobiano es citostático para una bacteria Gram negativa. Aveces, el péptido antimicrobiano es citotóxico para una bacteria Gram negativa. A veces, el péptido antimicrobiano es citostático y citotóxico para una bacteria Gram positiva. A veces, el péptido antimicrobiano es un péptido antimicrobiano de amplio espectro, por ejemplo, citostático y/o citotóxico para dos o más bacterias de géneros, especies, subespecies y/o cepas diferentes. A veces, el péptido antimicrobiano es un polipéptido secretado.
Se han aislado y descrito péptidos antimicrobianos de una amplia variedad de animales: microorganismos, invertebrados, plantas, anfibios, aves, peces y mamíferos (Wang et al., Nucleic Acids Res. 2009; 37 (Database issue):D933-7). Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos se describen en Antimicrobial Peptide Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php; Wang et al., Nucleic Acids Res. 2009; 37 (Database issue):D933-7), CAMP: Collection of Anti-Microbial Peptides (http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/; Thomas et al, Nucleic Acids Res. 2010; 38 (Database issue):D774-80), US 5221732, US 5447914, US 5519115, US 5607914, US 5714577, US 5734015, US 5798336, US 5821224, US 5849490, US 5856127, US 5905187, US 5994308, US 5998374, US 6107460, US 6191254, US 6211148, US 6300489, US 6329504, US 6399370, US 6476189, US 6478825, US 6492328, US 6514701, US 6573361, US 6573361, US 6576755, US 6605698, US 6624140, US 6638531, US 6642203, US 6653280, US 6696238, US 6727066, US 6730659, US 6743598, US 6743769, US 6747007, US 6790833, US 6794490, US 6818407, US 6835536, US 6835713, US 6838435, US 6872705, US 6875907, US 6884776, US 6887847, US 6906035, US 6911524, US 6936432, US 7001924, US 7071293, US 7078380, US 7091185, US 7094759, US 7166769, US 7244710, US 7314858, y US 7582301.
Los péptidos antimicrobianos descritos en la presente pueden inhibir o reducir la viabilidad de una o más especies de bacterias, por ejemplo, una o más bacterias (por ejemplo, bacterias Gram-negativas) de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas. En una realización, el péptido antimicrobiano es capaz de inhibir y/o reducir la viabilidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más cepas bacterianas Gram-negativas. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede inhibir y/o reducir la viabilidad de una o más bacterias de diferentes especies, subespecies, y/o cepas deEnterobacteriaceae(por ejemplo,Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia,oCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentes), una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas dePseudomonas,una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el péptido antimicrobiano es capaz de inhibir o reducir la viabilidad deKlebsiella pneumoniae(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobacter cancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia coliATCC 25922,Escherichia coliATCC 35401 oEscherichia coliATCC 43895),Escherichia fergusonii, Salmonella choleraesuis, Salmonella choleraesuissubsp.indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuissubsp.arizonae, Salmonella choleraesuissubsp.diarizonae, Salmonella choleraesuissubsp.houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacter braakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacterfreundii,Citrobacter youngae, Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, el péptido antimicrobiano es capaz de inhibir y/o reducir la viabilidad de uno o más:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo,P. aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo,N. gonorrhoaeaeresistente a fármacos),Salmonella(por ejemplo,Salmonellaresistente a fármacos),Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos), una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL),o Mycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M.tuberculosisresistente a fármacos). Los péptidos antimicrobianos descritos en la presente pueden tener una o más (por ejemplo, dos, tres o todas) de las siguientes propiedades: fuerte actividad de inhibición bacteriana, fuerte actividad bactericida, baja actividad hemolítica de glóbulos rojos (RBC) o baja citotoxicidad (por ejemplo, toxicidad fuera del diana). En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración inhibitoria mínima (MIC) de menos de 100 pg/ml, por ejemplo, de menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 pg/ml, frente a una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922,Pseudomonas aeruginosaATCC27853, o ambas. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración bactericida mínima (MBC) de menos de 100 pg/ml, por ejemplo, menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 pg/ml, contra una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922,Pseudomonas aeruginosaATCC27853, o ambas. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una baja actividad hemolítica, por ejemplo, tiene una relación PLC a MIC para una bacteria Gram-negativa (por ejemplo, una bacteria Gram-negativa descrita en la presente) que es igual o mayor de 1 (por ejemplo, mayor de 4:1, 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1), por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo MIC, respectivamente. En una realización, la PLC es la concentración (por ejemplo, concentración mínima) requerida o necesaria para lisar el 50% de los glóbulos rojos. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene baja actividad hemolítica, por ejemplo, tiene una relación MLC a MIC para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que es mayor de 4:1 (por ejemplo, mayor de 8:1, 16:1, 24:1 o 32:1), por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo de MIC, respectivamente. En una realización, la MLC es la concentración (por ejemplo, concentración mínima) requerida o necesaria para lisar el 100% de los glóbulos rojos.
En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido a-helicoidal. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados. Por ejemplo, pueden reticularse dos residuos de cisteína del péptido antimicrobiano, por ejemplo, químicamente. Aunque sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la reticulación de dos o más residuos de aminoácidos en un péptido antimicrobiano puede mejorar la conformación a-helicoidal, mejorar la estabilidad sérica y/o aumentar la potencia antimicrobiana. En una realización, el péptido antimicrobiano que tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados es por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces más estable, por ejemplo, en suero, que un péptido antimicrobiano idéntico que no tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados. En una realización, el péptido antimicrobiano que tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados tiene una MIC que es por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% más baja que un péptido antimicrobiano idéntico que no tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla (por ejemplo, se fusiona) con una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en la presente, por ejemplo, para formar un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC).
Para seleccionar un péptido antimicrobiano candidato pueden usarse los siguientes criterios: espectro amplio (por ejemplo, actividad contra múltiples patógenos bacterianos), estructura secundaria alfa-helicoidal (por ejemplo, fácilmente expresable en forma funcional), mecanismo de acción por alteración de membrana (por ejemplo, bactericida y/o sinergia con moléculas pequeñas), estabilidadin vivo(por ejemplo, estable en sueros humanos), y adaptable a modificaciones N-terminales (por ejemplo, para funcionar como conjugados C-terminales de anticuerpos).
Los péptidos antimicrobianos descritos en la presente pueden contener una secuencia que no tiene actividad antimicrobiana por sí misma. En una realización, el péptido antimicrobiano comprende una secuencia conectora. En una realización, el péptido antimicrobiano comprende una secuencia donante de sortasa.
En una realización, el péptido antimicrobiano por sí solo no se une al LPS, por ejemplo, a una región de núcleo del LPS.
En una realización, una cadena pesada de la molécula de anticuerpo comprende una primera secuencia aceptora de sortasa y una cadena ligera de la molécula de anticuerpo comprende una segunda secuencia aceptora de sortasa. En una realización, la secuencia aceptora de sortasa, por ejemplo, la primera secuencia de reconocimiento de sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de (GS)6LPETGGG (SEQ ID NO: 24). En otra realización, la secuencia aceptora de sortasa, por ejemplo, la segunda secuencia aceptora de sortasa, comprende la secuencia de aminoácidos de P(G<4>S)<2>LPETGGSG (SEQ ID NO: 26).
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de homología con, una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NOS: 67 80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256, o una porción de la misma, por ejemplo, un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, se omiten uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) de los residuos G N-terminales). Por ejemplo, pueden omitirse los tres primeros residuos G N-terminales en cualquiera de las SEQ ID NOS: 101, 147, 152-154, 156 o 163-164. Aveces, la presencia de uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) de los residuos G N-terminales no reduce, o reduce significativamente, la actividad del péptido antimicrobiano.
A veces, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de:
RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 68),
GGGRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 80), GGGGRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (SEQ ID NO: 101), o
GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (SEQ ID NO: 102).
En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido antimicrobiano grapado. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, el grapado puede aumentar la estabilidad, reducir la unión no específica, o ambas, por ejemplo, en suero. Métodos de grapado ejemplares se describen, por ejemplo, en Alexander et al. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (16), 5946-5949; y Ejemplo 7.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos descrita en lasTablas 3o6A-6Bo en lasFIGS. 4,15A-15B,o 36. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos descrita en lasTablas 3 o 6A-6Bo en lasFIGS. 4,15A-15B,o 36, o una porción de la misma, por ejemplo, un fragmento funcional de la misma. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende un grupo carboxamida (por ejemplo, un grupo funcional carboxamida C-terminal).
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 154.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% homología con, la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 156 y 246-256.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250.
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 253.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255.
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256.
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, o más) D-aminoácidos. En una realización, por lo menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de los residuos de aminoácidos en el péptido antimicrobiano son D-aminoácidos. En una realización, todos los residuos de aminoácidos del péptido antimicrobiano son D-aminoácidos. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la presencia de uno o más (por ejemplo, todos) D-aminoácidos en el péptido antimicrobiano puede aumentar la estabilidad del péptido antimicrobiano o ADC, por ejemplo, en suero (por ejemplo, suero humano), por ejemplo, en comparación con un péptido antimicrobiano idéntico que contiene uno o más (por ejemplo, todos) L-aminoácidos.
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, o más) L-aminoácidos. En una realización, por lo menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de los residuos de aminoácidos en el péptido antimicrobiano son L-aminoácidos. En una realización, todos los residuos de aminoácidos del péptido antimicrobiano son L-aminoácidos.
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más D-aminoácidos y uno o más L-aminoácidos. Por ejemplo, cualquiera de los residuos de aminoácidos en los péptidos antimicrobianos descritos en lasTablas 3o6A-6Bo en lasFIGS. 4,15A-15B,o 36
puede ser un D-aminoácido o un L-aminoácido.
T l .n i min i i nimi r i n m l r
A veces, el ADC comprende un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 68), GGGRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 80), GGGGRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (SEQ ID NO: 101), o GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (SEQ ID NO: 102).
Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 68), GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK (SEQ ID NO: 69), KKLLKWLKKLL (SEQ ID NO: 72), RLGNFFRKAKKKIGRGLKKIGQKIKDFLGNLVPRTES (SEQ ID NO: 74), GIGKHVGKALKGLKGLLKGLGES (SEQ ID NO: 94), GRRKRKWLRRIGKGVKIIGGAALDHL (SEQ ID NO: 95), GGLRSLGRKILRAWKKYGPQATPATRQ (SEQ ID NO: 96), IKWKKLLRAAKRIL (SEQ ID NO: 97), IGKKWKRIVKRIKKFLRKL (SEQ ID NO: 98), ILGKIWKIKKLF (SEQ ID NO: 99), o RLGDILQKAREKIEGGLKKLVQKIKDFFGKFAPRTES (SEQ ID NO: 100).
A veces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias peptídicas descritas en laFIG.36.Aveces, el péptido antimicrobiano es un análogo de un péptido antimicrobiano descrito en la presente, por ejemplo, para potenciar una o más propiedades biofísicas del péptido antimicrobiano. A veces, el péptido antimicrobiano es un análogo del péptido 297 (P297), por ejemplo, (D)-P297. A veces, el péptido antimicrobiano (por ejemplo, un análogo de P297) comprende una mutación de un residuo cargado (por ejemplo, arginina o lisina) a un residuo no cargado (por ejemplo, alanina o treonina. A veces, el péptido antimicrobiano (por ejemplo, un análogo de P297) comprende una mutación de R a A, de R a T, de R a S, o una combinación de las mismas. A veces, el péptido antimicrobiano (por ejemplo, un análogo de P297) comprende una mutación de K a A, una mutación de K a T, una mutación de K a S, o una combinación de las mismas. A veces, el péptido antimicrobiano comprende un péptido aniónico en el extremo C- o N-terminal, o en una localización cercana al extremo C- o N-terminal (por ejemplo, a no más de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos del extremo C- o N-terminal). A veces, la longitud del péptido aniónico es de aproximadamente 2 a 15, 3 a 14, 4 a 13, 5 a 12, 6 a 11, 7 a 10, 8 a 9, 2 a 13, 2 a 11, 2 a 9, 2 a 7, 2 a 5, 12 a 15, 9 a 15, 6 a 15, 3 a 15, 4 a 9, 5 a 8, o 6 a 7 residuos de aminoácidos. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende una secuencia de AAA, por ejemplo, N-terminal y adyacente a la secuencia del péptido aniónico.
Conjugados molécula de anticuerpo-fármaco
Como se usa en la presente, el término "conjugado de molécula de anticuerpo-fármaco" o ADC se refiere a una molécula de anticuerpo que se acopla a una fracción no de anticuerpo, por ejemplo, un agente o marcador terapéutico, por ejemplo, un péptido antimicrobiano. La molécula de anticuerpo puede acoplarse a la fracción no de anticuerpo directa o indirectamente, por ejemplo, a través de un conector.
En una realización, la molécula de anticuerpo se acopla a la fracción no de anticuerpo mediante un enlace covalente. En una realización, la molécula de anticuerpo se acopla a la fracción no de anticuerpo mediante un enlace peptídico. En una realización, el acoplamiento de la molécula de anticuerpo a la fracción no de anticuerpo está mediado por una sortasa. En una realización, el acoplamiento de la molécula de anticuerpo y la fracción no de anticuerpo forma una proteína de fusión. En una realización, la molécula de anticuerpo y la fracción no de anticuerpo forman una proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión comprende un conector entre la molécula de anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada, una cadena ligera, o ambas) y la fracción no de anticuerpo. En una realización, la molécula de anticuerpo se acopla a la fracción no de anticuerpo mediante un enlace no peptídico. En una realización, la molécula de anticuerpo no se acopla a la fracción no de anticuerpo mediante un enlace no peptídico. En una realización, una fracción no de anticuerpo también se denomina "carga útil".
En una realización, la fracción no de anticuerpo se acopla a la estructura principal de la molécula de anticuerpo. En otra realización, la fracción no de anticuerpo se acopla a una cadena lateral de la molécula de anticuerpo. En una realización, la fracción no de anticuerpo es un péptido (por ejemplo, un péptido antimicrobiano) y la molécula de anticuerpo se acopla a la cadena principal del péptido (por ejemplo, el péptido antimicrobiano). En una realización, la fracción no de anticuerpo es un péptido (por ejemplo, un péptido antimicrobiano) y la molécula de anticuerpo se acopla a una cadena lateral del péptido (por ejemplo, el péptido antimicrobiano).
En una realización, dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más) fracciones no de anticuerpo (por ejemplo, péptidos antimicrobianos) se acoplan a la molécula anticuerpo. En una realización, a la molécula de anticuerpo se acoplan cuatro fracciones no de anticuerpo (por ejemplo, péptidos antimicrobianos). Por ejemplo, las fracciones no de anticuerpo pueden ser las mismas, o por lo menos algunas de las fracciones no de anticuerpo son diferentes entre sí. En una realización, la fracción no de anticuerpo (por ejemplo, el péptido antimicrobiano) se acopla a la molécula de anticuerpo de manera bivalente. En otra realización, la fracción no de anticuerpo (por ejemplo, el péptido antimicrobiano) se acopla a la molécula de anticuerpo de manera tetravalente.
En una realización, el ADC comprende una molécula de anticuerpo que se une a una bacteria (por ejemplo, una bacteria Gram-negativa). En una realización, el ADC comprende una molécula de anticuerpo que se une a LPS, por ejemplo, en la membrana externa de una bacteria Gram-negativa). En una realización, el ADC comprende una molécula de anticuerpo descrita en la presente.
A veces, el ADC comprende una, dos o tres CDR de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. A veces, el ADC comprende una, dos o tres CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. A veces, el ADC comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VH y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia.
A veces, el ADC comprende una, dos, o tres CDR de VH descriaos en laTabla 1 u 8.A veces, el ADC comprende una, dos, o tres CDR de VL descritas en laTabla 1 u 8.A veces, el ADC comprende una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de VH y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) CDR de VL descritas en laTabla 1 u 8.
A veces, el ADC comprende una, dos, tres o cuatro estructuras de la región VH de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). A veces, el ADC comprende una, dos, tres o cuatro estructuras de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). A veces, el ADC comprende una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VH y/o una o más (por ejemplo, dos, tres o cuatro) estructuras de la región VL de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7 o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados).
A veces, el ADC comprende una región variable de cadena pesada de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1,2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). A veces, el ADC comprende una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNv1, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados). Aveces, el ADC comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8(por ejemplo, mAb001, A001-25, hWN01, hWNvl, 3E7, 3G1, 2C7, o 3D6, o cualquiera de los mAb001 humanizados).
A veces, el ADC comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.A veces, el ADC comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.A veces, el ADC comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 2y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en laTabla 1 u 8.
A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.Aveces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.A veces, la molécula de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2y una región variable de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos descrita en laTabla 2.
En una realización, el ADC comprende una región constante de cadena pesada. En una realización, el ADC comprende una región constante de cadena ligera. En una realización, el ADC comprende una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera. A veces, el ADC comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, y regiones variables de cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8.Aveces, el ADC comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera y regiones variables que comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de una molécula de anticuerpo descrita en laTabla 1 u 8.
En una realización, el ADC es capaz de unirse a dos o más bacterias Gram-negativas de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas. Las moléculas de anticuerpo o ADC capaces de unirse a dos o más bacterias Gramnegativas de diferentes géneros, especies, subespecies, y/o cepas tienen varias propiedades ventajosas. Por ejemplo, puede usarse una terapia para tratar, prevenir o diagnosticar múltiples infecciones bacterianas. Además, un médico no necesita determinar qué género, especie, subespecie y/o cepa bacteriana infectó a un paciente para determinar la terapia apropiada. Por consiguiente, en una realización, el ADC es capaz de unirse independientemente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bacterias Gram negativas de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas, con alta afinidad. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede unirse independientemente con alta afinidad a una o más bacterias de diferentes especies, subespecies, y/o cepas deEnterobacteriaceae(por ejemplo,Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia,oCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentes), una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas dePseudomonas,una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el ADC es capaz de unirse aKlebsiella pneumoniae(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobacter cancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia coliATCC 25922,Escherichia coliATCC 35401 oEscherichia coliAt CC 43895),Escherichia fergusonii, Salmonellacholeraesuis, Salmonella choleraesuissubsp.indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuissubsp.arizonae, Salmonella choleraesuissubsp.diarizonae, Salmonella choleraesuissubsp.houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacter braakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae, Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, el ADC es capaz de unirse a uno o más de:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo, P.aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo, N.gonorrhoaeaeresistente a fármacos),Salmonella(por ejemplo,Salmonella resistente a fármacos), Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos), una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL)o Mycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M. tuberculosisresistente a fármacos).
En una realización, el ADC es capaz de unirse a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o todas) cepas deP. aeruginosade la Tabla 7. En otra realización, el ADC es capaz de unirse a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o todas) cepas deP. aeruginosaresistente a múltiples fármacos de la Tabla 7.
En una realización, el ADC se une a un epítopo lineal o conformacional del LPS. En otra realización, el ADC se une a una región pentasacárida de núcleo del LPS. En una realización, el ADC tiene una actividad opsonofagocítica, por ejemplo, determinada por un ensayo de opsonofagocitosis descrito en la presente.
A veces, el ADC comprende un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente, por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos divulgada en las Tablas 3 o 6A-6B o en las FIGS. 4, 15A-15B, o 36. Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos descrita en las Tablas 3 o 6A-6B o en las FIGS. 4, 15A-15B, o 36, o una porción de la misma, por ejemplo, un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, se omiten uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) de los residuos G N-terminales). Aveces, el péptido antimicrobiano comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. En una realización, el ADC comprende uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más) péptidos antimicrobianos, cada uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164 o 246-256, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% de homología con la misma. En una realización, el ADC comprende cuatro o más péptidos antimicrobianos, cada uno de los cuales tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164 o 246-256, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% de homología con la misma. En una realización, el ADC comprende cuatro o más péptidos antimicrobianos, cada uno de los cuales comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 67-80, 94-102, 147-156, 158-159, 163-164, o 246-256. En una realización, el péptido antimicrobiano comprende un grupo carboxamida (por ejemplo, un grupo funcional carboxamida C-terminal).
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, o más) D-aminoácidos. En una realización, por lo menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de los residuos de aminoácidos en el péptido antimicrobiano son D-aminoácidos. En una realización, todos los residuos de aminoácidos del péptido antimicrobiano son D-aminoácidos.
En una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, o más) L-aminoácidos. En una realización, por lo menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de los residuos de aminoácidos en el péptido antimicrobiano son L-aminoácidos. En una realización, todos los residuos de aminoácidos del péptido antimicrobiano son L-aminoácidos.
E n una realización, el péptido antimicrobiano comprende uno o más D-aminoácidos y uno o más L-aminoácidos.
En una realización, el ADC es capaz de inhibir y/o reducir la viabilidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más bacterias (por ejemplo, bacterias Gram-negativas) de diferentes géneros, especies, subespecies, y/o cepas. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede inhibir y/o reducir la viabilidad de una o más bacterias de diferentes especies, subespecies, y/o cepas deEnterobacteriaceae(por ejemplo,Klebsiella, Enterobacter, Shigella, Escherichia, Salmonella, Yersinia,oCitrobacter,por ejemplo,Enterobacteriaceaepanresistentes), una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas dePseudomonas,una o más bacterias de diferentes especies, subespecies y/o cepas deAcinetobacter,o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el ADC es capaz de inhibir o reducir la viabilidad deKlebsiella pneumoniae(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobacter cancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia fergusonii, Salmonella choleraesuis, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacter braakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter freundii, Citrobacter youngae, Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosiso cualquier combinación de las mismas.
En una realización, el ADC es capaz de inhibir o reducir la viabilidad de uno o más de:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo,P. aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo, N.gonorrhoaeaeresistente a fármacos),Salmonella(por ejemplo,Salmonellaresistente a fármacos),Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos),una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL)o Mycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M. tuberculosisresistente a fármacos).
En una realización, el ADC es capaz de unirse a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o todas) cepas deP. aeruginosade la Tabla 7. En otra realización, el ADC es capaz de unirse a una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, o todas) cepas deP. aeruginosaresistente a múltiples fármacos de la Tabla 7.
Sin querer estar limitado por la teoría, los péptidos antimicrobianos adecuados para los ADC descritos en la presente pueden seleccionarse, por lo menos en parte, basándose en una o más (por ejemplo, dos, tres o todas) de las propiedades siguientes: fuerte actividad de inhibición bacteriana, fuerte actividad bactericida, baja actividad hemolítica de glóbulos rojos (RBC), o baja citotoxicidad (por ejemplo, toxicidad fuera del objetivo). En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración inhibitoria mínima (MIC) de menos de 100 pg/ml, por ejemplo, de menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 pg/ml, frente a una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922,Pseudomonas aeruginosaATCC27853, o ambas. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una concentración bactericida mínima (MBC) de menos de 100 pg/ml, por ejemplo, menos de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o 5 pg/ml, contra una cepa bacteriana descrita en la presente, por ejemplo,Escherichia coliATCC 25922,Pseudomonas aeruginosaATCC27853, o ambas. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene una baja actividad hemolítica, por ejemplo, tiene una relación PLC a MIC para una bacteria Gram-negativa (por ejemplo, una bacteria Gram-negativa descrita en la presente) que es igual o mayor de 1 (por ejemplo, mayor de 4:1, 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1), por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo MIC, respectivamente. En una realización, la PLC es la concentración (por ejemplo, concentración mínima) requerida o necesaria para lisar el 50% de los glóbulos rojos. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene baja actividad hemolítica, por ejemplo, tiene una relación MLC a MIC para una bacteria Gram negativa (por ejemplo, una bacteria Gram negativa descrita en la presente) que es mayor de 4:1 (por ejemplo, mayor de 8:1, 16:1, 24:1 o 32:1), por ejemplo, según se determina mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos y un ensayo de MIC, respectivamente. En una realización, la MLC es la concentración (por ejemplo, concentración mínima) requerida o necesaria para lisar el 100% de los glóbulos rojos.
En una realización, el péptido antimicrobiano es un péptido a-helicoidal. En una realización, el péptido antimicrobiano tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados. Por ejemplo, dos residuos de cisteína del péptido antimicrobiano pueden estar reticulados, por ejemplo, químicamente. Aunque sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la reticulación de dos o más residuos de aminoácidos en un péptido antimicrobiano puede mejorar la conformación a-helicoidal, mejorar la estabilidad sérica y/o aumentar la potencia antimicrobiana. En una realización, el péptido antimicrobiano que tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados es por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces más estable, por ejemplo, en suero, que un péptido antimicrobiano idéntico que no tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados. En una realización, el péptido antimicrobiano que tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados tiene una MIC que es por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% más baja que un péptido antimicrobiano idéntico que no tiene dos o más residuos de aminoácidos reticulados.
En una realización, el ADC se produce por síntesis enzimática. Por ejemplo, los ADC pueden producirse por expresión de una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo etiquetada), síntesis química de un péptido (por ejemplo, un péptido antimicrobiano), y ligamiento enzimático del péptido a la molécula de anticuerpo. En una realización, se consigue una eficacia de reacción del 90% o más, por ejemplo, del 92% o más, del 95% o más, del 97% o más, o del 99% o más. En otra realización, el método comprende además purificar el ADC. En una realización, el rendimiento es del 60% o más (por ejemplo,del70% o más, del 75% o más, del 80% o más, del 90% o más, o del 95% o más) después de la purificación.
En una realización, el ADC se une a una superficie bacteriana. En otra realización, el ADC se une a una vesícula secretada. En otra realización más, el ADC se une tanto a una superficie bacteriana como a una vesícula secretada. En una realización, la unión se detecta mediante microscopía electrónica. En una realización, el ADC tiene una unión mejorada a bacterias de un primer género, especie o subespecie, en comparación con la unión a bacterias de un segundo género, especie o subespecie. En una realización, el ADC tiene una unión mejorada aP. aeruginosa,en comparación con la unión a bacterias distintas deP. aeruginosa(por ejemplo,E. coli o Klebsiella spp.).
A veces, el ADC comprende: a) una molécula de anticuerpo que se une al lipopolisacárido (LPS); y b) un péptido antimicrobiano,
en donde la molécula de anticuerpo comprende una VH y una VL, en donde la VH comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y la VL comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3), y en donde el ADC o molécula de anticuerpo comprende:
(a) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108; una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 109, 145, o 146; una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la<s>E<q>ID NO: 107; una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 110, 138, 140, o 144; una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 111, 139, 141, 142, o 143; y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 112, o
(b) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105; una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106; una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 110, 138, 140, o 144; una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 111, 139, 141, 142, o 143; y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 112; y
en donde el péptido antimicrobiano comprende o consiste en:
(i) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 101;
(ii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 147;
(iii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 152;
(iv) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 153;
(v) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 154;
(vi) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156;
(vii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 163;
(viii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 164;
(ix) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246;
(x) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247;
(xi) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248;
(xii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249;
(xiii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250;
(xiv) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251;
(xv) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 252;
(xvi) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 253;
(xvii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
(xviii) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255; o
(xix) una secuencia de aminoácidos que difiere en no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácidos de, o tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de homología con, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256.
Conjugación específica del sitio
Los ADC descritos en la presente pueden elaborarse mediante métodos de conjugación específica del sitio. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la conjugación específica de sitio puede ofrecer ciertas ventajas sobre las químicas de conjugación convencionales usadas para elaborar ADC. Por ejemplo, la conjugación específica de sitio, incluyendo, por ejemplo, la colocación de carga útil específica de sitio, permite el control sobre la relación entre el fármaco y el anticuerpo y el sitio de conjugación, que puede afectar a las propiedades de un ADC, por ejemplo, farmacocinética (PK), disposición o eficacia del ADC. Además, la composición del conector usado en la conjugación específica del sitio también puede afectar a las propiedades de un ADC.
Los métodos de conjugación específica del sitio para elaborar los ADC pueden producir productos homogéneos, por ejemplo, con carga de fármaco controlada, analítica simplificada y un índice terapéutico mejorado. Típicamente, estos métodos introducen aminoácidos reactivos en localizaciones definidas de la estructura principal del anticuerpo y usan la reactividad química o enzimática única de estos aminoácidos para conjugar cargas útiles (como se describe, por ejemplo, en Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008; 26(8):925-32; Strop et al. Chem Biol. 2013; 20(2): 161-7; Axup et al. Proc Natl Acad Sci U S A . 2012; 109(40):16101-6; Kung Sutherland et al. Blood. 2013; 122(8):1455-63).
También se describen métodos ejemplares de conjugación en sitios específicos, por ejemplo, en Drake et al. Bioconjug Chem. 2014; 25(7): 1331-41, Patente de Estados Unidos N° 9,238,878, y en la Publicación Internacional N° WO 2010/096394. Por ejemplo, un enfoque quimioenzimático para la modificación selectiva de proteínas puede usar la enzima generadora de formilglicina (FGE) para introducir un residuo de formilglicina (fGly) en la estructura principal de una proteína. Los conectores pueden diseñarse para que reaccionen selectivamente con la cadena lateral de aldehído de fGly y formar un enlace C-C estable con la proteína. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, los métodos descritos en la presente pueden generar ADC conjugados específicamente del sitio, por ejemplo, con estequiometría controlada y analítica limpia, lo que permite el diseño de ADC con eficacia deseada y toxicidad reducida.
Como se describe en la presente, en una realización, la producción de ADC específica de lsitio se basa en la incorporación de formilglicina (fGly), un aminoácido no natural, en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, para incorporar fGly, puede insertarse una secuencia de consenso corta (por ejemplo, CXPXR, donde X es típicamente serina, treonina, alanina o glicina) en una localización deseada, por ejemplo, en una región conservada, de una cadena pesada o ligera de anticuerpo, usando técnicas de clonación de biología molecular estándar (Rabuka et al. Nat Protoc.
2012; 7(6):1052-67). La secuencia de consenso puede insertarse en una variedad de localizaciones de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, en una cadena pesada (por ejemplo, en CH1, CH2 o CH3, o en el extremo C-terminal), en una cadena ligera (por ejemplo, en la región constante o en el extremo C-terminal), o en ambas. En la molécula de anticuerpo pueden insertarse una pluralidad de secuencias de consenso (por ejemplo, 2, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, o más secuencias de consenso idénticas, similares o diferentes).
La molécula de anticuerpo etiquetada puede ser producida recombinantemente en células que coexpresan la enzima generadora de formilglicina (FGE). La FGE puede convertir cotraduccionalmente la cisteína dentro de la etiqueta en un residuo fGly, dando como resultado una molécula de anticuerpo expresada con una etiqueta de aldehído (Carison et al. J Biol Chem. 2008; 283(29):20117-25). El grupo funcional aldehído de la etiqueta puede servir como asa química para la conjugación bioortogonal (Sletten et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2009; 48(38):6974-98). En una realización, se usa la ligación Hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS) para conectar la carga útil a fGly, formando un enlace C-C covalente estable entre la carga útil del fármaco (por ejemplo, un péptido antimicrobiano) y la molécula de anticuerpo (Agarwal et al. Bioconjug Chem. 2013; 24(6):846-51). Este enlace C-C es típicamente estable a los desafíos fisiológicamente relevantes a los que se enfrenta el ADC, por ejemplo, durante la circulación y el reciclaje del FcRn (por ejemplo, proteasas, pH bajo o reactivos reductores). En laFIG.26se describe un método de conjugación ejemplar y la química relacionada.
La presente divulgación proporciona un ADC que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en la presente) y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente), en donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa modificado. La divulgación también proporciona una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que puede acoplarse covalentemente y en un sitio específico a un péptido antimicrobiano para proporcionar un andamiaje que contiene fármaco. Los ADC descritos en la presente pueden usarse para tratar o prevenir una infección bacteriana (por ejemplo, una infección asociada con una bacteria Gram-negativa, por ejemplo,Pseudomonas aeruginosa)o un trastorno relacionado de acuerdo con un método descrito en la presente. También se describen en la presente métodos para la producción de los ADC o moléculas de anticuerpo etiquetadas con aldehído descritos en la presente.
Etiquetas de aldehído
Típicamente, una etiqueta de aldehído puede basarse en cualquier secuencia de aminoácidos derivada de un motivo de sulfatasa, que es capaz de ser convertida por una enzima generadora de formilglicina (FGE) para que contenga una formilglicina (FGly). Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la acción de la FGE se dirige de una manera específica de la secuencia, por ejemplo, la FGE actúa en un motivo de sulfatasa y este motivo de sulfatasa puede colocarse dentro de cualquier región de una molécula de anticuerpo. En una realización, la conversión de un motivo de sulfatasa mediada por FGE es específica del sitio, por ejemplo, la FGE actúa en la secuencia de aminoácidos de un motivo de sulfatasa. En otra realización, la capacidad de la FGE para actuar sobre el motivo de sulfatasa es independiente del contexto de secuencia, por ejemplo, la capacidad de la FGE para convertir una cisteína/serina de un motivo de sulfatasa es independiente del contexto de secuencia en donde se presenta el motivo de sulfatasa en la molécula de anticuerpo.
Un motivo mínimo de sulfatasa de una etiqueta de aldehído típicamente no tiene más de<6>residuos de aminoácidos en longitud, típicamente aproximadamente 5 o<6>residuos de aminoácidos en longitud. Las etiquetas de aldehído pueden comprender un motivo de sulfatasa mínimo de 5 o<6>residuos, o pueden ser más largas y comprender un motivo de sulfatasa mínimo que puede estar flanqueado en los lados N- y/o C-terminal del motivo por uno o más residuos de aminoácidos adicionales. Pueden usarse etiquetas de aldehído de, por ejemplo, 5 o<6>residuos de aminoácidos, así como secuencias de aminoácidos más largas de más de 5,<6>, 7,<8>, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más residuos de aminoácidos.
Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que en una realización, es deseable minimizar la extensión de la modificación de la secuencia de aminoácidos nativa de una molécula de anticuerpo, minimizando el número de residuos de aminoácidos que son insertados, eliminados, sustituidos (reemplazados), o añadidos (por ejemplo, al extremo N- o C-terminal). En una realización, la etiqueta de aldehído requiere la modificación (inserción, adición, eliminación, sustitución/reemplazo) de menos de 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,<8>o 7 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo.
En una realización, un motivo de sulfatasa útil en etiquetas de aldehído como se describe en la presente tiene la fórmula:
X<1>Z<1>X<2>Z<2>X<3>Z<3>(I)
donde
Z<1>es cisteína o serina (que también puede representarse por (C/S));
Z<2>es o un residuo de prolina o de alanina (que también puede representarse por (P/A));
Z<3>es un aminoácido básico, y puede ser arginina (R), lisina (K) o histidina (H), habitualmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), habitualmente A, G, L, V o I;
X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, puede ser cualquier aminoácido, aunque habitualmente es un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado, (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), habitualmente L, M, V, S o T, más habitualmente L, M, S o V, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa está en el extremo N-terminal de una cadena de anticuerpos, X<1>está presente; y
X<2>y X<3>independientemente pueden ser cualquier aminoácido, aunque habitualmente son un aminoácido alifático, un aminoácido polar, no cargado, o un aminoácido que contiene azufre (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), habitualmente S, T, A, V, G o C, más habitualmente S, T, A, V o G.
En una realización, el motivo sulfatasa tiene la fórmula:
X1Z1X2Z2X3R (Ia).
Típicamente, después de la acción de una FGE en el motivo de sulfatasa, Z<1>se oxida para generar un residuo de 2-formilglicina (FGly). Tras la conversión mediada por FGE y la reacción con un compañero reactivo de un péptido antimicrobiano, la posición FGly en Z<1>en la fórmula anterior se une covalentemente al péptido antimicrobiano. En una realización, el compañero reactivo es un a-nucleófilo, por ejemplo, un grupo aminooxi o hidrazida, y proporciona la unión de la molécula de anticuerpo al péptido antimicrobiano, por ejemplo, a través de una unión oxima o hidrazona. En una realización, la molécula de anticuerpo y el péptido antimicrobiano no están enlazados a través de un enlace amida, como puede encontrarse en otros conjugados de fármacos basados en la tecnología de proteínas de fusión recombinantes.
En una realización, la etiqueta de aldehido está presente en una localización distinta del extremo N-terminal de una cadena de anticuerpo, y X<1>de la fórmula anterior es proporcionado por un residuo de aminoácido de la secuencia de aminoácidos nativa de la molécula de anticuerpo. En una realización, cuando está presente en una localización distinta del extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, el motivo de sulfatasa tiene la fórmula:
(C/S)X<1>(P/A)X2Z3 (II)
donde X<1>y X<2>son independientemente cualquier aminoácido, aunque típicamente un aminoácido alifático, un aminoácido polar, no cargado, o un aminoácido que contiene azufre (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), típicamente S, T, A, V, o C, más típicamente S, T, A, o V. Z<3>en la Fórmula II se define como antes.
En una realización, el motivo sulfatasa tiene la fórmula:
(C/S)X<i>(P/A)X<2>R (IIa)
El motivo de sulfatasa puede contener residuos adicionales en uno o ambos de los extremos N- y C-terminales de la secuencia, por ejemplo, de tal manera que la etiqueta de aldehído incluye tanto un motivo de sulfatasa como un "motivo auxiliar". En una realización, el motivo de sulfatasa incluye un motivo auxiliar opcional en el extremo C-terminal (por ejemplo, después del residuo de arginina en la fórmula anterior) 1, 2, 3, 4, 5,<6>, o los 7 residuos contiguos de una secuencia de aminoácidos de AALLTGR (SEQ ID NO: 170), SQLLTGR (SEQ ID NO: 171), AAFMTGR (SEQ ID NO: 172), AAFLTGR (SEQ ID NO: 173), SAFLTGR (SEQ ID NO: 174), ASILTGK (SEQ ID NO: 175), VSFLTGR (SEQ ID NO: 176), ASLLTGL (SEQ ID NO: 177), ASILITG (SEQ ID NO: 178), VSFLTGR (SEQ ID NO: 176), SAIMTGR (SEQ ID NO: 179), SAIVTGR (SEQ ID NO: 180), TNLWRG (SEQ ID NO: 181), TNLWRGQ (SEQ ID NO: 182), TNLCAAS (SEQ ID NO: 183), VSLWTGK (SEQ ID NO: 184), SMLLTG (SEQ ID NO: 185), SMLLTGN (SEQ ID NO: 186), SMLLTGT (SEQ ID NO: 187), ASFMAGQ (SEQ ID NO: 188), o ASLLTGL (SEQ ID NO: 177) (véanse, por ejemplo, Dierks et al. (1999) EMBO J 18(8): 2084-2091), o de GSLFTGR (SEQ ID NO: 189). En una realización, la etiqueta de aldehído no contiene una secuencia de aminoácidos CGPSR(M/A)S (SEQ ID NO: 190) o CGPSR(MZA) (SEQ ID NO: 191), que puede estar presente como secuencia de aminoácidos nativa en fosfonato monoéster hidrolasas.
El motivo sulfatasa de la etiqueta de aldehído se selecciona típicamente para que sea capaz de conversión por una FGE seleccionada. En una realización, la FGE está presente en una célula huésped en donde se expresa la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído. En otra realización, la FGE se pone en contacto con la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído en un método libre de células.
Típicamente, los motivos de sulfatasa susceptibles a conversión por una FGE eucariota contienen una cisteína y una prolina (por ejemplo, una cisteína y prolina en Z<1>y Z<2>, respectivamente, en la Fórmula I anterior (por ejemplo, X1CX2PX3R); CX1P<x>2<r>en la Fórmula II anterior) y son modificados por la FGE "tipo SUMF1" (como se describe, por ejemplo, en Cosma et al. Cell 2003, 113, (4), 445-56; Dierks et al. Cell 2003, 113, (4), 435-44). Los motivos de sulfatasa susceptibles de conversión por una FGE procariota contienen una cisteína o una serina, y una prolina en el motivo de sulfatasa (por ejemplo, una cisteína o serina en Zi, y una prolina en Z<2>, respectivamente, en la Fórmula I anterior (por ejemplo, X1(C/S)X2PX3R); (C/S)X1PX2R en la Fórmula II anterior) se modifican mediante la FGE "tipo SUMF1" o la FGE "tipo AtsB", respectivamente (como se describe, por ejemplo, en Szameit et al. J Biol Chem 1999, 274, (22), 15375-81). Otros motivos de sulfatasa susceptibles de conversión por una FGE procariota contienen una cisteína o una serina, y una prolina o una alanina en el motivo de sulfatasa (por ejemplo, una cisteína o serina en Z<1>, y una prolina o alanina en Z<2>, respectivamente, por ejemplo, SX<1>AX<2>R; X<1>CX<2>PX<3>Z<3>; X<1>SX<2>PX<2>Z<3>; X<1>CX<2>AX<3>Z<3>; X<1>SX<2>AX<3>Z<3>; CX<1>PX<2>Z<3>; SX<1>PX<2>Z<3>; CX<1>AX<2>Z<3>; SX<1>AX<2>Z<3>(en la Fórmula I anterior); CX<1>PX<2>Z<3>(en la fórmula II anterior); X<1>CX<2>PX<3>R; X<1>SX<2>PX<2>R; X<1>CX<2>AX<3>R; X<1>SX<2>AX<3>R (en la fórmula Ia anterior); CX<1>PX<2>R; SX<1>PX<2>R; CX<1>AX<2>R; SX<1>AX<2>R, y son susceptibles de ser modificados, por ejemplo, pueden ser modificados por una FGE de un Firmicutes (por ejemplo,Clostridium perfringens),como se describe, por ejemplo, en Berteau et al. J. Biol. Chem.
2006; 281:22464-22470).
En una realización, la FGE es una FGE eucariota (por ejemplo, una FGE de mamífero, por ejemplo, una FGE humana) y el motivo de sulfatasa tiene la fórmula:
X<1>CX<2>PX<3>Z<3>(III)
donde
X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, aunque típicamente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), típicamente L, M, S o V, con la condición de que cuando el motivo de sulfatasa está en el extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, X<1>está presente;
X<2>y X<3>son independientemente cualquier aminoácido, aunque típicamente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado, (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), típicamente S, T, A, V, G, o C, más usualmente S, T, A, V o G; y
Z<3>es un aminoácido básico (que puede ser distinto de la arginina (R), y puede ser lisina (K) o histidina (H), habitualmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I), o prolina (P), habitualmente A, G, L, V, o I, donde Z3 es arginina (R) en la Fórmula IIIa.
En una realización, el motivo sulfatasa tiene la fórmula
X<1>CX<2>PX<3>R (IIIa).
Por ejemplo, motivos de sulfatasa ejemplares incluyen, pero no se limitan a, LCTPSR (SEQ ID NO: 169), MCTPSR (SEQ ID NO: 192), VCTPSR (SEQ ID NO: 193), LCSPSR (SEQ ID NO: 194), LCAPSR (SEQ ID NO: 195), LCVPSR (SEQ ID NO: 196), LCGPSR (SEQ ID NO: 197), ICTPAR (SEQ ID NO: 198), LCTPSK (SEQ ID NO: 199), MCTPSK (SEQ ID NO: 200), VCTPSK (SEQ ID NO: 201), LCSPSK (SEQ ID NO: 202), LCAPSK (SEQ ID NO: 203), LCVPSK (SEQ ID NO: 204), LCGPSK (SEQ ID NO: 205), LCTPSA (SEQ ID NO: 206), ICTPAA (SEQ ID NO: 207), MCTPSA (SEQ ID NO: 208), VCTPSA (SEQ ID NO: 209), LCSPSA (SEQ ID NO: 210), LCAPSA (SEQ ID NO: 211), LCVPSA (SEQ ID NO: 212), y LCGPSA (SEQ ID NO: 213).
Como se describe con más detalle a continuación, una molécula de anticuerpo convertida etiquetado con aldehído se hace reaccionar con un compañero reactivo de una fracción de interés para proporcionar conjugación entre la fracción de interés y el residuo FGly de la molécula de anticuerpo convertida etiquetada con aldehído, y la producción de un polipéptido modificado (por ejemplo, un ADC descrito en la presente). Las moléculas de anticuerpo modificadas que tienen una etiqueta de aldehído modificada se describen típicamente comprendiendo una sulfatasa modificada que tiene la fórmula:
X1(FGly')X2Z2X3Z3 (I')
donde
FGly' es un residuo de formilglicina que tiene una fracción unida covalentemente (por ejemplo, un péptido antimicrobiano descrito en la presente);
Z<2>es un residuo de prolina o alanina (que también puede representarse por (P/A));
Z<3>en la Fórmula I' es un aminoácido básico, y puede ser arginina (R) (como en la Fórmula Ia'), lisina (K) o histidina (H), habitualmente lisina), o un aminoácido alifático (alanina (A), glicina (G), leucina (L), valina (V), isoleucina (I) o prolina (P), normalmente A, G, L, V o I;
X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, aunque típicamente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), típicamente L, M, V, S o T, más típicamente L, M o V, con la salvedad de que cuando el motivo sulfatasa está en el extremo N-terminal de una cadena de anticuerpo, X<1>está presente; y
X<2>y X<3>es independientemente cualquier aminoácido, aunque típicamente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar, no cargado (por ejemplo, distinto de un aminoácido aromático o un aminoácido cargado), típicamente S, T, A, V, G o C, más típicamente S, T, A, V o G.
En una realización, el motivo de sulfatasa modificado tiene la fórmula:
X-,(FGly')X2Z2X3R (Ia')
Motivos de sulfatasa convertida ejemplares incluyen, pero no se limitan a, L(FGly)TPSR (SEQ ID NO: 214), M(FGly) TPSR (SEQ ID NO: 215), V(FGly)TPSR (SEQ ID NO: 216), L(FGly)SPSR (SEQ ID NO: 217), L(FGly)APSR (SEQ ID NO: 218), L(FGly)VPSR (SEQ ID NO: 219), L(FGly)GPSR (SEQ ID NO: 220), I(FGly)TPAR (SEQ ID NO: 221), L(FGly) TPSK (SEQ ID NO: 222), M(FGly)TPSK (SEQ ID NO: 223), V(FGly)TPSK (SEQ ID NO: 224), L(FGly)SPSK (SEQ ID NO: 225), L(FGly)APSK (SEQ ID NO: 226), L(FGly)VPSK (SEQ ID NO: 227), L(FGly)GPSK (SEQ ID NO: 228), L(FGly) TPSA (SEQ ID NO: 229), M(FGly)TPSA (SEQ ID NO: 230), V(FGly)TPSA (SEQ ID NO: 231), L(FGly)SPSA (SEQ ID NO: 232), L(FGly)APSA (SEQ ID NO: 233), L(FGly)VPSA (SEQ ID NO: 234), y L(FGly)GPSA (SEQ ID NO: 235).
Las moléculas de anticuerpos ejemplares que se acoplan covalentemente al péptido antimicrobiano mediante reacción con el aldehído del residuo FGly pueden incluir aquellas que tienen las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, pero tienen el FGly modificado (representado anteriormente por FGly') en lugar del FGly no modificado.
Modificación de moléculas de anticuerpos para que contengan una etiqueta de aldehído
Una etiqueta de aldehído puede proporcionarse en una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de anticuerpo, o un fragmento de la misma) por inserción (por ejemplo, para proporcionar una inserción de 5 o 6 residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos nativa) y/o por adición (por ejemplo, en un extremo N- o C-terminal de una cadena de anticuerpo). También puede proporcionarse una etiqueta de aldehído mediante la sustitución total o parcial de residuos de aminoácidos nativos de la molécula de anticuerpo por la secuencia contigua de aminoácidos de una etiqueta de aldehído. Por ejemplo, puede proporcionarse una etiqueta de aldehído heteróloga de 5 o 6 residuos de aminoácidos en una molécula de anticuerpo sustituyendo 1,2, 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa por los residuos de aminoácidos correspondientes de la etiqueta de aldehído.
La modificación de una molécula de anticuerpo para que incluya una o más etiquetas de aldehído puede lograrse usando técnicas de genética molecular recombinante, por ejemplo, para producir un ácido nucleico que codifique el polipéptido marcado con aldehído deseado. Alternativamente, puede añadirse una etiqueta de aldehído mediante técnicas no recombinantes, por ejemplo, mediante ligadura química nativa o ligadura química pseudonativa, por ejemplo, para añadir una etiqueta de aldehído a un extremo C-terminal del polipéptido (como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6.184.344, 6.307.018, 6.451.543, y 6.570.040; y Rush et al. (5 de enero de 2006) Org Lett. 8(1):131-4).
Las etiquetas de aldehído pueden colocarse en cualquier localización adecuada dentro de una molécula de anticuerpo. En una realización, el sitio de la etiqueta de aldehído es accesible para conversión por una FGE y la posterior modificación en la FGly, o puede hacerse accesible (por ejemplo, desnaturalizando el polipéptido). La molécula de anticuerpo puede incluir una pluralidad de etiquetas de aldehído, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más etiquetas de aldehído. En una realización, por lo menos dos (por ejemplo, todas) de las etiquetas de aldehído de la pluralidad son idénticas. En otra realización, por lo menos una etiqueta de aldehído de la pluralidad difiere de otra etiqueta de aldehído de la pluralidad.
Moléculas de anticuerpos con múltiples etiquetas de aldehído
En la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede colocarse una pluralidad de etiquetas de aldehído, por ejemplo, para distribuir las etiquetas sobre la superficie de la molécula de anticuerpo.
En una realización, las etiquetas de aldehído están separadas en la molécula de anticuerpo por residuos de aminoácidos nativos de la molécula de anticuerpo. En otra realización, las etiquetas de aldehído están separadas por un conector, donde el conector tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga a la molécula de anticuerpo.
En una realización, las etiquetas de aldehído se proporcionan en la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído como un constructo concatenado de 2, 3, 4 o más etiquetas de aldehído, en donde el constructo de expresión codifica para 2, 3, 4 o más motivos de sulfatasa en una secuencia contigua de la molécula de anticuerpo modificada, en donde los motivos de sulfatasa están separados por un conector. Por ejemplo, el conector puede seleccionarse para que proporcione flexibilidad entre las etiquetas de aldehído, permitiendo por tanto la rotación de los péptidos antimicrobianos unidos covalentemente, por ejemplo, para mejorar la presentación del péptido antimicrobiano biológicamente activo en la superficie del ADC. Tales conectores también pueden usarse cuando las etiquetas de aldehido no se proporcionan como un concatámero, por ejemplo, cuando una etiqueta de aldehído se coloca en el extremo C- o N-terminal de una cadena de anticuerpo. Las etiquetas de aldehído, incluyendo las proporcionadas como concatámeros, pueden colocarse en o cerca del extremo C-terminal de una cadena de anticuerpo, en o cerca del extremo N-terminal de una cadena de anticuerpo, y/o en uno o más bulazoscles accesibles por solvente de la molécula de anticuerpo.
Los conectores pueden seleccionarse, por ejemplo, de acuerdo con la etiqueta de aldehído usada, el número de etiquetas de aldehído en el concatámero, el grado de flexibilidad deseado o una combinación de los mismos. La longitud del conector puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 2-50, 3-25, 4-23, 5-20, 6-18, 7-16, 8-14, o 9 12 aminoácidos. Los conectores flexibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 236) y (GGGS)n (SEQ ID<n>O: 237), donde n es un número entero de por lo menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros conectores flexibles como el anclaje para el canal de potasio agitador. Los polímeros de glicina y glicina-serina son interesantes porque ambos aminoácidos están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como anclaje neutro entre componentes. Los polímeros de glicina son especialmente interesantes, ya que la glicina accede a un espacio significativamente más phi-psi que la alanina, y está mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga,Rev. Computational Chem.11173-142 (1992)). Los conectores flexibles ejemplares incluyen, entre otros, GGSGG (SEQ ID NO: 238), GSGSG (SEQ ID NO: 239), GSGGG (SEQ ID NO: 240), GGGSG (SEQ ID NO: 241) o GSSSG (SEQ ID NO: 242). Otros conectores pueden estar compuestos por enlaces no aminoácidos. Las repeticiones de polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, EG<2>, EG<3>, EG<4>, o EG6) son particularmente interesantes ya que las repeticiones de PEG tienen poca unión inespecífica a biomoléculas.
Los constructos de etiquetas de aldehído concataméricas que contienen un conector pueden describirse mediante la fórmula general: T-i-Ln-T<2>, donde T<1>y T<2>son las mismas etiquetas de aldehído o unas diferentes a las descritas en la presente (por ejemplo, fórmulas I, Ia, I', Ia', II, IIa, III, y IIIa), L es un péptido conector, y n es un número entero de 1 o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más. Una secuencia de aminoácidos ejemplar de una etiqueta de aldehído concatémerica que contiene un conector es LCTPSRGGGGLCTPSR (SEQ ID NO: 243), donde la cisteína (C) se modifica a un FGly por acción de una FGE, y puede reaccionar con un péptido antimicrobiano que contiene un compañero reactivo para proporcionar un péptido antimicrobiano unido covalentemente como se describe en la presente.
La etiqueta o etiquetas de aldehído pueden colocarse en la molécula de anticuerpo para tener en cuenta su estructura cuando se pliega (por ejemplo, en un entorno libre de células, habitualmente un entorno fisiológico libre de células), por ejemplo, para proporcionar la etiqueta de aldehído en un sitio accesible al solvente en la molécula de anticuerpo plegada. De este modo, se puede acceder a la etiqueta de aldehído accesible al solvente en la molécula de anticuerpo plegada, no convertida y etiquetada con aldehído, para que sea accesible a una FGE para la conversión de la serina o cisteína a un FGly y/o a un reactivo compañero reactivo para la conjugación con un péptido antimicrobiano. Cuando se coloca una etiqueta de aldehído en un sitio accesible al solvente, la conversión mediada por FGE libre de células y la modificación con una fracción por reacción con un compañero reactivo pueden realizarse sin necesidad de desnaturalizar la proteína. Los sitios accesibles al solvente también pueden incluir regiones polipeptídicas que están expuestas en una superficie celular extracelular o intracelular cuando se expresan en una célula huésped.
Por consiguiente, pueden proporcionarse una o más etiquetas de aldehído en sitios seleccionados independientemente de, por ejemplo, un extremo N-terminal accesible por solvente, una región N-terminal accesible por solvente, un extremo C-terminal accesible por solvente, una región C-terminal accesible por solvente, y/o una estructura de lazo. En una realización, la etiqueta de aldehído se coloca en un sitio distinto del extremo C-terminal de una cadena de anticuerpo. En una realización, dos o más etiquetas de aldehído están situadas en una cadena pesada, por ejemplo, en una, dos o todas las CH1, CH2 o CH3. En una realización, la cadena ligera de la molécula de anticuerpo no contiene una etiqueta de aldehído.
En una realización, un sitio de etiqueta de aldehído se localiza en un sitio que se modifica postraduccionalmente en la molécula de anticuerpo original (por ejemplo, un sitio natural). Por ejemplo, una etiqueta de aldehído puede introducirse en un sitio de glicosilación (por ejemplo, N-glicosilación, O-glicosilación), fosforilación, sulfatación, ubiquitinación, acilación, metilación, prenilación, hidroxilación o carboxilación, en la molécula de anticuerpo nativa. En una realización, el sitio de la modificación postraduccional se manipula (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes) y no se produce de manera natural en la molécula de anticuerpo.
En una realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído comprende un fragmento Fc marcado con aldehído. Los fragmentos Fc de IgG1 de ratón marcados con aldehído ejemplares que tienen etiquetas de aldehído simples y múltiples, incluyendo los fragmentos Fc marcados con aldehído ejemplares que contienen un concatámero de etiquetas de aldehído con dos etiquetas de aldehído separadas por un conector, se describen en la Patente de Estados Unidos N° 9.238.878.
Enzimas generadoras de form ilglicina (FGE)
Una enzima generadora de formilglicina (FGE) es una enzima que oxida cisteína o serina en un motivo de sulfatasa a FGly. Como se usan en la presente, las FGE incluyen enzimas que convierten una cisteína (C) en FGly en un motivo de sulfatasa, y enzimas que convierten serina (S) en FGly en un motivo de sulfatasa (también conocidas como Ats-B-like).
La FGE usada para facilitar la conversión de cisteína o serina en FGly en un motivo de sulfatasa de una etiqueta de aldehído de un polipéptido puede seleccionarse de acuerdo con el motivo de sulfatasa presente en la etiqueta de aldehído. La FGE puede ser nativa de la célula huésped en donde se expresa el polipéptido marcado con aldehído, o la célula huésped puede modificarse genéticamente para expresar una FGE apropiada. Las sulfatasas eucariotas generalmente contienen una cisteína en su motivo sulfatasa y son modificadas por la FGE "tipo SUMF1" (Cosma et al. Cell 2003, 113, (4), 445-56; Dierks et al. Cell 2003, 113, (4), 435-44). Las sulfatasas procariotas contienen generalmente una cisteína o una serina en su motivo sulfatasa y son modificadas por la FGE "tipo SUMF1" o la FGE "tipo AtsB", respectivamente (Szameit et al. J Biol Chem 1999, 274, (22), 15375-81). Se ha descrito una FGE en Mycobacterium tuberculosis (por ejemplo, N° de Registro GenBank NP-215226 (gi:15607852) y Publicación Internacional N°WO 2008/036350), en deuterostomia, incluyendo vertebrados y equinodermos (por ejemplo, Pepe et al. Cell 2003; 113, 445-456, Dierks et al. (2003) Cell 113, 435-444; Cosma et al. Hum. Mutat. 2004; 23, 576-581). En la técnica se conocen los ácidos nucleicos que codifican una serie de FGE y están fácilmente disponibles (por ejemplo, Preusser et al. J. Biol. Chem. 2005; 280(15):14900-10; Fang et al. JBiol. Chem. 2004; 79(15):14570-8; landgrebe et al. Gene. 2003; 316:47-56; Dierks et al. FEBS Lett. 1998; 423(1):61-5; Dierks et al. Cell. 2003; 113(4):435-44; Cosma et al. Cell 2003; 113(4):445-56; Baenziger Cell 2003; 113(4):421-2 (revisión); Dierks et al. Cell. 2005; 121(4):541-52; Roeser et al. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103(1):81-6; Sardiello et al. Hum Mol. Genet. 2005; 14(21):3203-17; N° de Registro GenBank NM182760; Publicaciones Internacionales N° WO 2004/072275 y WO 2008/036350). En una realización, el motivo de sulfatasa es compatible con una FGE humana (por ejemplo, la FGE de tipo SUMF1, como se describe, por ejemplo, en Cosma et al. Cell 2003; 113, 445-56; Dierks et al. Cell 2003; 113, 435-44). En una realización, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído se expresa en una célula humana que expresa la FGE o en una célula huésped, típicamente una célula de mamífero, modificada genéticamente para que exprese una FGE humana. Cuando se usa un método libre de células para convertir una molécula de anticuerpo que contiene un motivo sulfatasa, puede usarse una FGE aislada.
Métodos para la conversión y m odificación de una etiqueta de aldehído
La conversión de una etiqueta de aldehído presente en una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede llevarse a cabo mediante métodos a base de células o libres de células.
En una realización, la conversión de una etiqueta de aldehído de una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede lograrse mediante la expresión de la proteína etiquetada con aldehído en una célula que contenga una FGE adecuada. Por ejemplo, la conversión de la cisteína o serina de la etiqueta de aldehído puede producirse durante o después de la traducción en la célula huésped. La FGE de la célula huésped puede ser endógena a la célula huésped, o la célula huésped puede ser recombinante para una FGE adecuada que sea heteróloga a la célula huésped. La expresión de FGE puede ser proporcionada por un sistema de expresión endógeno al gen FGE (por ejemplo, la expresión es proporcionada por un promotor y otros elementos de control presentes en el gen de FGE nativo de la célula huésped), o puede ser proporcionada por un sistema de expresión recombinante en donde la secuencia codificante de FGE está enlazada operativamente a un promotor heterólogo para proporcionar una expresión constitutiva o inducible. Las condiciones adecuadas para lograr la conjugación de una fracción de compañero reactivo con una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído son similares a las descritas en Mahal et al. Science 1997; 276(5315):1125-8.
En otra realización, la conversión libre de células de una etiqueta de aldehído de una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede lograrse poniendo en contacto una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído con una FGE bajo condiciones adecuadas para la conversión de una cisteína o serina de un motivo de sulfatasa de la etiqueta de aldehído a un FGly. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un polipéptido marcado con aldehído puede expresarse en un sistema de transcripción/traducciónin vitroen presencia de una FGE adecuada para producir una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído convertida.
Alternativamente, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído aislada y no convertida puede aislarse después de la producción recombinante en una célula huésped que carece de una f Ge adecuada o por producción sintética. A continuación, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído aislada se pone en contacto con una FGE adecuada en condiciones que permitan la conversión de la etiqueta de aldehído. La molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede desplegarse mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando calor, ajuste del pH, agentes caotrópicos (por ejemplo, urea), solventes orgánicos (por ejemplo, hidrocarburos: octano, benceno o cloroformo) y la proteína desnaturalizada se pone en contacto con una f Ge adecuada. A continuación, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede volver a plegarse en condiciones adecuadas.
De manera similar, la modificación de una etiqueta de aldehido convertida de una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede lograrse mediante métodos basados en células o libres de células. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído convertida puede aislarse de una fuente de producción (por ejemplo, producción de célula huésped recombinante, producción sintética), y ponerse en contacto con un péptido antimicrobiano que contenga un compañero reactivo en condiciones adecuadas para proporcionar la conjugación de una fracción del compañero reactivo con el FGly de la etiqueta de aldehído.
Métodos para la modificación de péptidos para que contengan un compañero reactivo para la reacción con 2-formilglicina
Los péptidos antimicrobianos que se conjugarán con una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído pueden modificarse para que incorporen un compañero reactivo para la reacción con un aldehído del residuo FGly de la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído.
Como los métodos de modificación de anticuerpos etiquetados con aldehído son compatibles con los procesos químicos convencionales, para llevar a cabo la conjugación puede usarse cualquiera de una variedad de reactivos disponibles comercialmente. Por ejemplo, los derivados aminooxi, hidrazida, hidrazina o tiosemicarbazida de un número de moléculas de interés son compañeros reactivos adecuados, y están fácilmente disponibles o pueden generarse usando métodos químicos estándar.
En una realización, la fracción reactiva (por ejemplo, aminooxi o hidrazida) puede colocarse en una región N-terminal, el extremo N-terminal, una región C-terminal, el extremo C-terminal, o en una posición interna al péptido. Por ejemplo, el péptido puede sintetizarse a partir de un precursor protegido con Boc. Un grupo amino de un péptido puede reaccionar con un compuesto que comprende un grupo ácido carboxílico y un grupo oxi-N-Boc (por ejemplo, ácido 3-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxi)propanoico). Otras variaciones del compuesto que comprende un grupo ácido carboxílico y un grupo oxi-N-protector pueden incluir diferente número de carbonos en el conector alquileno y sustituyentes en el conector alquileno. La reacción entre el grupo amino del péptido y el compuesto que comprende un grupo ácido carboxílico y un grupo protector oxi-N se produce mediante química estándar de acoplamiento peptídico. Ejemplos de reactivos de acoplamiento peptídico que pueden usarse incluyen, entre otros, DCC (diciclohexilcarbodiimida), DIC (diisopropilcarbodiimida), di-p-toluoylcarbodiimida, BDP (1-benzotriazol dietilfosfato-1-ciclohexil-3-(2-morfoliniletil)carbodiimida), EDC (clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil-3-etilcarbodiimida), fluoruro cianúrico, cloruro cianúrico, TFFH (hexafluorofosfato de tetrametilfluoroformamidinio), DPPA (difenilfosforazidato), BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iltris(dimetilamino)fosfonio), HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio), TBTU (tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio), TSTU (tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio), HATU (hexafluorofosfato N-óxido de N-[(dimetilamino)-1-H-1,2,3-triazolo[4,5,6]-piridin-1-ilmetileno]-N-metilmetanaminio), BOP-Cl (cloruro bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico), PyBOP (tetrafluorofosfato de (1-H-1,2,3-benzotriazol-1 -iloxi)-tris(pirrolidino)fosfonio), BrOP (hexafluorofosfato de bromotris(dimetilamino)fosfonio), DEPBT (3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona) PyBrOP (hexafluorofosfato de bromotris(pirrolidino)fosfonio).
En el péptido que comprende un grupo N-protector puede realizarse la desprotección para exponer la funcionalidad amino-oxi. La desprotección del grupo N-oxisuccinimida, por ejemplo, se produce de acuerdo con las condiciones estándar de desprotección para un grupo amida cíclico. Las condiciones de desprotección pueden encontrarse en Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3a Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY y Harrison et al. Ciertas condiciones de desprotección incluyen un reactivo hidrazina, un reactivo amino o borohidruro sódico. Por ejemplo, la desprotección del grupo protector Boc puede producirse con TFA. Otros reactivos para la desprotección incluyen, pero no se limitan a, hidrazina, metilhidrazina, fenilhidrazina, borohidruro de sodio y metilamina. El producto y los productos intermedios pueden purificarse mediante medios convencionales, como la purificación por HPLC.
En una realización, la reacción de conjugación se realiza a un pH inferior a 7, con un pH de aproximadamente 5.5, aproximadamente 6, o aproximadamente 6.5. Cuando la conjugación se realiza con una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído presente en una célula viva, las condiciones se seleccionan para que sean fisiológicamente compatibles. Por ejemplo, el pH puede reducirse temporalmente durante un tiempo suficiente para permitir que se produzca la reacción, pero dentro de un periodo tolerado por la célula que tiene una etiqueta de aldehído (por ejemplo, de aproximadamente 3o minutos a 1 hora). Las condiciones fisiológicas para llevar a cabo la modificación de moléculas de anticuerpo etiquetadas con aldehído en una superficie celular pueden ser similares a las usadas en una reacción de cetona-azida en la modificación de células que llevan azidas en la superficie celular (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.570.040).
ADC específicos de sitio ejemplares
En una realización, el ADC está decorado específicamente en el sitio con uno o más péptidos antimicrobianos acoplados covalentemente. La especificidad del sitio de reacción de un péptido antimicrobiano que contiene un compañero reactivo con una etiqueta de aldehído de la proteína permite la producción de proteínas que tienen múltiples sitios para la conjugación química, proporcionando así un andamiaje para la producción de ADC que tienen una carga útil de péptido deseada por proporción de proteína. En una realización, la posición relativa de las etiquetas de aldehído en la proteína etiquetada con aldehído puede diseñarse para que proporcionen una presentación deseada de los péptidos antimicrobianos unidos covalentemente en la superficie del ADC final, permitiendo de este modo el control de la orientación espacial de la carga útil peptídica mostrada.
En una realización, la naturaleza específica del sitio de la modificación química de las etiquetas de aldehído para unir el péptido antimicrobiano a la molécula de anticuerpo puede usarse para proporcionar una composición que comprenda una población sustancialmente homogénea de ADC. Tales ADC pueden proporcionar un control de la estequiometría de la administración del fármaco. Dichas poblaciones homogéneas incluyen aquellas en las que el 60% o más, por ejemplo, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, el 95% o más, de los ADC de la población tienen la misma carga útil de péptido antimicrobiano con respecto a la molécula de anticuerpo.
En una realización, los ADC de la presente divulgación comprenden una molécula de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-LPS descrita en la presente) y uno o más péptidos antimicrobianos unidos covalentemente (por ejemplo, péptidos antimicrobianos descritos en la presente), donde la molécula de anticuerpo comprende un motivo de sulfatasa modificado de la fórmula:
X1(FGly')X2Z2XaZa
donde FGly' tiene la fórmula:
en donde J<1>es el péptido antimicrobiano unido covalentemente;
cada L<1>es una fracción divalente seleccionada independientemente entre alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, alquinileno, alquinileno, arileno, arileno sustituido, cicloalquileno, cicloalquileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, heterocicleno, heterocicleno sustituido, acilo, amido, aciloxi, uretanileno, tioéster, sulfonilo, sulfonamida, éster de sulfonilo, -O-, -S-, -NH- y amina sustituida;
n es un número seleccionado entre cero y 40;
Z<2>es un residuo de prolina o alanina;
X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa está en un extremo N-terminal del polipéptido, X<1>está presente;
X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y
Z<3>es un aminoácido básico, y
en donde la molécula de anticuerpo presenta el fármaco unido covalentemente en una superficie accesible al solvente cuando se encuentra en estado plegado. X<1>, X<2>, Z<2>, X<3>, y Z<3>pueden definirse además como se ha analizado anteriormente.
En una realización, el ADC es formado por la ligadura química HIPS (por ejemplo, como se describe en la FIG. 27).
En una realización, la proteína etiquetada con aldehido puede estar diseñada para que proporcione múltiples sitios para conjugación química, por ejemplo, para que proporcione un andamiaje para la producción de ADC que tienen una carga útil de fármaco deseada por proporción de proteína. Los ADC de la presente divulgación incluyen típicamente por lo menos 2 (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) motivos de sulfatasa modificados que tienen péptidos antimicrobianos unidos covalentemente. Los ADC de la presente divulgación pueden proporcionar 4 o más, 5 o más, o 6 o más péptidos antimicrobianos unidos covalentemente en el ADC. Los ADC de la presente divulgación incluyen, por tanto, aquellos que tienen una relación de carga útil de péptido a molécula de anticuerpo de por lo menos 2:1, por lo menos 3:1, por lo menos 4:1, por lo menos 5:1, por lo menos 6:1, por lo menos 7:1, o por lo menos 8:1.
La posición relativa de las etiquetas de aldehído en la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído puede diseñarse para proporcionar una presentación deseada de los péptidos antimicrobianos acoplados covalentemente en la superficie del ADC final. Esta característica permite controlar la orientación espacial de la carga útil del fármaco presentado en la superficie del ADC final. Los ADC que contienen múltiples etiquetas de aldehído, que pueden incluir etiquetas de aldehído concateméricas separadas por conectores flexibles como se describe en la presente, pueden proporcionar, por ejemplo, una mayor carga útil del fármaco: relaciones de molécula de anticuerpo y una presentación mejorada del fármaco a un entorno fisiológico en donde está presente el ADC. En una realización, la ADC puede describirse como una molécula de anticuerpo modificada "decorada" con un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente a la molécula de anticuerpo, por ejemplo, mediante un enlace de oxima o hidrazona a la estructura principal de la molécula de anticuerpo.
Por ejemplo, las etiquetas de aldehído pueden colocarse en el ADC en un extremo N-terminal de una cadena de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de anticuerpo, y un lazo accesible por solvente de la molécula de anticuerpo. Las etiquetas de aldehído pueden proporcionarse opcionalmente en conexión con un conector, por ejemplo, un conector flexible, como se ha descrito anteriormente. Las etiquetas de aldehído múltiples pueden localizarse en una región o regiones particulares de la molécula de anticuerpo o cadena de anticuerpo (por ejemplo, proporcionadas en uno o más de un lazo accesible al solvente, región N-terminal (incluyendo el extremo N-terminal), región C-terminal (incluyendo el extremo C-terminal)), o pueden distribuirse por la superficie accesible al solvente de la molécula de anticuerpo modificada plegada. En una realización, por lo menos una etiqueta de aldehído se localiza en una región constante de cadena pesada (por ejemplo, una, dos o todas de CH1, CH2, o CH3), una región constante de cadena ligera, o ambas.
En una realización, las etiquetas de aldehído están espaciadas de tal manera que el ADC final tiene péptidos antimicrobianos acoplados covalentemente espaciados a una distancia suficiente para evitar la interacción entre los péptidos antimicrobianos acoplados covalentemente, por ejemplo, de tal manera que los péptidos no entren en contacto entre sí o interfieran de otra manera con sus actividades biológicas respectivas.
Métodos de elaboración de ADC
La presente divulgación proporciona métodos de conjugación de una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que contiene FGly con un péptido antimicrobiano que contiene un compañero reactivo para proporcionar un ADC que tiene una relación deseada de carga útil de péptido a molécula de anticuerpo.
En una realización, los métodos descritos en la presente implican combinar una molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que contiene FGly con un péptido antimicrobiano que contiene un compañero reactivo (por ejemplo, un péptido que contiene aminooxi o hidrazida) en una mezcla de reacción en condiciones adecuadas para promover la reacción entre el aldehído o los aldehídos para el FGly o los FGly de la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído con el compañero reactivo del péptido o los péptidos, produciendo de este modo un producto de reacción de un ADC que tiene el péptido acoplado covalentemente a la estructura principal de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, a través de un enlace de oxima, hidrazida o un enlace de oxima, a través de un enlace oxima, un enlace hidrazida u otras químicas específicas del aldehído, como aminaciones reductoras o reacciones de Wittig.
Después de la producción de la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído, se aísla usando cualquiera de una variedad de técnicas disponibles en la técnica (por ejemplo, cromatografía, por ejemplo, HPLC, FPLC, o purificación por inmunoafinidad). En una realización, la molécula de anticuerpo contiene una etiqueta inmunológica (por ejemplo, etiqueta His, etiqueta FLAG), colocada típicamente en un extremo N-terminal o C-terminal para facilitar el aislamiento y la purificación antes de la conjugación con el fármaco. La molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que contiene FGly para su uso en una reacción de conjugación con péptido antimicrobiano puede proporcionarse en forma desnaturalizada o puede plegarse antes de combinarse en la mezcla de reacción. Típicamente, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que contiene FGly se proporciona en forma plegada en la mezcla de reacción de conjugación. Cuando se obtiene a partir de células que expresan la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído y una FGE compatible, la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehído que contiene FGly puede aislarse en forma plegada de las células o, cuando se secreta, del sobrenadante del cultivo. Cuando sea necesario, en la técnica hay disponibles métodos para el plegamiento de proteínas, que pueden aplicarse fácilmente a los métodos descritos en la presente.
En una realización, la proteína etiquetada con aldehído que tiene un residuo FGly se aísla. En una realización, la proteína etiquetada con aldehído que tiene un residuo FGly se purifica. En una realización, la proteína etiquetada con aldehído se combina en una mezcla de reacción (por ejemplo, en una solución tamponada) con un péptido antimicrobiano que contiene un compañero reactivo. La solución tamponada puede estar a un pH fisiológico o casi fisiológico, por ejemplo, un pH de aproximadamente 5 a 7, típicamente un pH de aproximadamente 6,5. En una realización, el péptido antimicrobiano que contiene el compañero reactivo se proporciona en la mezcla de reacción en exceso a los moléculas de aldehído de la proteína etiquetada con aldehído que contiene FGly, típicamente por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces o más exceso, por ejemplo, para impulsar la reacción hasta su finalización. Después de la adición del péptido antimicrobiano que contiene compañero reactivo a la mezcla de reacción, la mezcla se agita en condiciones adecuadas de tiempo y temperatura (por ejemplo, a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h). El ADC resultante se aísla de la mezcla de reacción y puede purificarse adicionalmente mediante técnicas estándar (por ejemplo, cromatografía, por ejemplo, HPLC o FPLC).
Métodos alternativos de ligadura de ADC
Los ADC descritos en la presente pueden ser producidos mediante una serie de métodos diferentes.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo por conjugación de lisina (por ejemplo, usando una lisina expuesta a la superficie como grupo reactivo del anticuerpo). En una realización, la molécula de anticuerpo se conjuga directamente con un aminoácido activado en el péptido antimicrobiano. En otra realización, una lisina de la molécula de anticuerpo se convierte en un grupo reactivo tiol y la molécula de anticuerpo con el grupo reactivo tiol se liga a un péptido antimicrobiano tiolado. En otra realización más, una lisina de la molécula de anticuerpo se convierte en un tiol libre y la molécula de anticuerpo con el tiol libre se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo mediante disulfuros entre cadenas (por ejemplo, usando disulfuros que ligan HC-HC o HC-LC). En una realización, los disulfuros entre cadenas de la molécula de anticuerpo se reducen y la molécula de anticuerpo con los disulfuros entre cadenas reducidos se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol.
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo usando un aminoácido no nativo (por ejemplo, un aminoácido sustituido con aldehído, azida o alquino). En una realización, la molécula de anticuerpo se liga al péptido antimicrobiano mediante química de clic (Kolb et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2001; 40(11):2004-2021; Evans Australian Journal of Chemistry. 2007; 60 (6): 384-395).
En una realización, el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo usando un polímero biodegradable (por ejemplo, lisina o tiol). En una realización, el péptido antimicrobiano se liga a un polímero biodegradable y el polímero se liga a la molécula de anticuerpo.
También se proporcionan ADC elaborados mediante los métodos descritos en la presente.
Evaluación de los candidatos
Los ADC descritos en la presente pueden evaluarse usando una serie de ensayosin vitro,que incluyen, por ejemplo, 1) actividad bactericida, 2) actividad opsonofagocítica, y 3) alteración de membrana.
Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización el mecanismo dual de acción, eliminación directa y actividad opsonofagocítica (OPA), puede permitir que los ADC descritos en la presente sean funcionales en pacientes normales o neutropénicos. Los anticuerpos opsonofagocíticos funcionan típicamente uniéndose a la superficie bacteriana, reclutando complemento y células fagocíticas (por ejemplo, neutrófilos), que luego engullen las bacterias. Los pacientes inmunodeprimidos corren el mayor riesgo de infección y a menudo tienen niveles muy bajos de células fagocíticas. Un enfoque antibacteriano que ofrezca un mecanismo de acción bactericida directo puede superar algunas de las limitaciones de las terapias basadas en anticuerpos que se centran en la opsonofagocitosis o en la eliminación mediada por complemento como mecanismo de acción. También se cree que en una realización, al incorporar una función bactericida directa y de acción rápida, los ADC descritos en la presente pueden superar varios mecanismos de resistencia.
Ensayo bactericida: la actividad de eliminación directa del ADC puede medirse frente a dos cepas de laboratorio bien descritas deP. aeruginosa(PA14 y PA01) y no menos de tres cepas clínicas deP. aeruginosa,incluyendo cepas MDR y panresistentes. Estos ensayos se realizan en ausencia de complemento o de células efectoras. La actividad en este ensayo puede proporcionar información sobre la actividad letal inherente del ADC.
Ensayo de opsofagocitosis: la actividad de eliminación del ADC puede medirse frente a las mismas cepas de P.aeruginosaque para la actividad bactericida, pero esta vez en presencia de complemento y leucocitos polimorfonucleares recién purificados. La actividad en este ensayo puede proporcionar información sobre la capacidad del ADC para reclutar neutrófilos e inducir la muerte bacteriana mediante opsonofagocitosis.
Alteración de la membrana: Puede realizarse un ensayo de liberación/captación de colorante frente a las mismas cepas deP. aeruginosausadas en el ensayo bactericida y de opsonofagocitosis. Se mide la capacidad del ADC para alterar la membrana externa bacteriana. La actividad en este ensayo puede proporcionar información sobre el mecanismo de acción molecular del ADC.
Evaluación de candidatos: Ensayo de opsonofagocitosis (OPA)
Los candidatos de moléculas de anticuerpo y conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) descritos en la presente pueden evaluarse, por ejemplo,in vitro,para sus actividades opsonofagocíticas, mediante ensayos de opsonofagocitosis.
Los ensayos para la opsonización mediada por anticuerpos dependiente del complemento se describen, por ejemplo, en Hemachandra et al. Infect Immun. 2001; 69(4):2223-2229. Brevemente, la capacidad de la molécula de anticuerpo o de los candidatos a ADC de opsonizar bacterias para su captación por leucocitos polimorfonucleares humanos (PMN) puede medirse mediante citometría de flujo. Las bacterias se cultivan, se matan por calor y se marcan con FITC. La opsonización puede llevarse a cabo incubando las bacterias marcadas con moléculas de anticuerpo o conjugados molécula de anticuerpo-fármaco con o sin un 1% de suero humano de un paciente agammaglobulinémico como fuente de complemento. Las bacterias se lavan en PBS que contiene 6% de dextrano y 0,2% de glucosa y luego se vuelven a suspender en solución salina equilibrada de Hanks con un 0,1% de gelatina. Los PMN pueden aislarse de la sangre humana periférica mediante venopunción de voluntarios adultos sanos. Los PMN se vuelven a suspender hasta alcanzar una concentración de 107 células/ml y se activan durante 30 min con 10 pl de una dilución de 10'6 de N-formil-Met-Leu-Phe (FMLP; Peninsula laboratories, San Carlos, Calif.) por ml de células. Se añaden PMN a cada muestra bacteriana opsonizada, se incuban a 37°C, se separan de las bacterias libres por centrifugación diferencial y se vuelven a suspender en PBS. El análisis citométrico de flujo monocolor de PMN puede realizarse usando un FACScan y el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, Calif.), y la fagocitosis se expresa en unidades relativas de fluorescencia media de 10.000 PMN para cada muestra. Para demostrar que la opsonofagocitosis observada está asociada a la eliminación bacteriana, puede usarse un ensayo alternativo en donde se mezclan 25.000 CFU de bacterias vivas con suero humano agammaglobulinémico, varias concentraciones de moléculas de anticuerpos o conjugados molécula de anticuerpo-fármacos y 106 PMN humanos recientes obtenidos como se ha descrito anteriormente en medio RPMI (volumen final de 400 ml). Las muestras se obtienen al principio y al final de una incubación de 90 minutos a 37°C, tras la cual se diluyen las bacterias y se colocan en placas para el recuento bacteriano.
En una realización, la actividad de eliminación del ADC puede medirse contra las mismas cepas deP.aeruginosaque para la actividad bactericida, pero esta vez en presencia de complemento y leucocitos polimorfonucleares recién purificados. La actividad en este ensayo puede proporcionar información sobre la capacidad del ADC para reclutar neutrófilos e inducir la eliminación bacteriana mediante opsonofagocitosis.
En el Ejemplo 1 también se describe un ensayo de opsonofagocitosis ejemplar.
Evaluación de candidatos: Determinación de la concentración inhibitoria mínima
Los candidatos de péptidos antimicrobianos y conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) descritos en la presente pueden evaluarse, por ejemplo,in vitro,para sus actividades inhibitorias microbianas, determinando la concentración inhibitoria mínima (MIC).
En una realización, la MIC se determina en presencia de suero humano (por ejemplo, 50% de suero humano), y a veces se denomina en la presente hsMIC. En una realización, la MIC se determina en presencia de solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización, la MIC o la hsMIC se determina por ADC. En una realización, la MIC o hsMIC se determina por carga útil o péptido antimicrobiano. En una realización, la relación de hsMIC a MIC es igual o menor de 2, por ejemplo, igual o menor de 1,5 o 1.
Los métodos para determinar la MIC también se describen, por ejemplo, en Clinical and laboratory Standards Institute. 2012. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard, 9a ed., Clinical and laboratory Standards Institute, Wayne, PA. M07-A8, vol 29, N° 2 Clinical and laboratory Standards Institute, Wayne, PA. Por ejemplo, la MIC puede determinarse de acuerdo con las directrices del CLSI, usando diluciones en serie dobles de compuestos, en placas de microtitulación de 96 pocillos. Brevemente, los compuestos se diluyen en agua en una placa madre y, a continuación, se estampan 2 pl en placas de ensayo, una placa por cada cepa a probar. Las cepas bacterianas se subcultivan durante la noche en placas de agar a 37° C. Las placas de la noche se usan para preparar cultivos de 0,5 McFarland en solución salina al 0,85%. Estos cultivos concentrados se diluyen 1:200 en medio de cultivo hasta alcanzar aproximadamente 5 x 105 células/ml. Todas las placas de ensayo reciben 100 pl de cultivo diluido por pocillo. Todas las placas se colocan a 37° C durante la noche. Después de 18 horas, las placas se leen usando un lector de placas de espejo y luz incandescente reflejada. En algunas realizaciones, la MIC puede definirse como la concentración más baja del compuesto que inhibe el crecimiento en por lo menos un 80%. Los pocillos por encima de la MIC deben aparecer vacíos de crecimiento cuando se leen a ojo.
En el Ejemplo 2 también se describe un método ejemplar para la determinación de la MIC.
Evaluación de candidatos: Estudiosin vitrode liberación de citoquinas y función Fc
La capacidad del ADC para estimular la liberación de citoquinas puede evaluarse en un ensayoin vitrode liberación de citoquinas solubles. Por ejemplo, puede incubarse sangre completa humana de voluntarios sanos durante 24 horas a 37°C con tres concentraciones de la molécula de anticuerpo y controles apropiados. Una vez finalizada la incubación, las muestras pueden analizarse para un panel de citoquinas. La ausencia de impacto en el perfil de liberación de citoquinas en relación con otros anticuerpos comerciales puede usarse como criterio de aprobación para este estudio.
Pueden caracterizarse las características de la molécula de anticuerpo para unirse y mediar funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y la citotoxicidad dependiente de complemento, para confirmar que el candidato a ADC tiene las funciones efectoras Fc esperadas basadas en sus características canónicas de unión de isotipo a receptores Fcy y Clq.
Modelos animales
Las moléculas de anticuerpo, los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC), y los péptidos antimicrobianos descritos en la presente pueden evaluarsein vivo,por ejemplo, usando varios modelos animales. Por ejemplo, puede usarse un modelo animal para probar la eficacia de una molécula de anticuerpo, péptido antibacteriano o conjugado molécula de anticuerpo-fármaco descrito en la presente al reducir o inhibir la infección bacteriana. Los modelos animales también pueden usarse, por ejemplo, para investigar efectos secundarios, medir concentraciones de moléculas de anticuerpo, péptidos antibacterianos o conjugados molécula de anticuerpo-fármacoin situ,demostrar correlaciones entre infección bacteriana y bacterias en condiciones controladas.
Los modelos animales ejemplares que pueden usarse para evaluar una molécula de anticuerpo, un péptido antibacteriano o un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco descrito en la presente incluyen, pero no se limitan a, modelos básicos de cribado antimicrobiano (por ejemplo, como se describe en Zak y O'Reilly, Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35(8): 1527-1531); modelos de infección primaria de roedores (por ejemplo, como se describe en Marra y Girard Curr. Protoc. Pharmacol. 2006; Capítulo 13: Unidad13A.4); modelosex vivo(por ejemplo, como se describe en Zak and O'Reilly, Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35(8): 1527-1531); modelos monoparamétricos o discriminativos (por ejemplo, como se describe en Zak and O'Reilly, Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35(8): 1527 1531); modelos de ratones para la curación de heridas (por ejemplo, como se describe en Samy et al. Methods Mol. Biol. 2011; 716: 245-265); modelos de conejos para la evaluación de la migración y colonización bacterianas (por ejemplo, como se describe en Allan et al. J. Biomed. Biotechnol. 2012; 2012: 921617). La modelización farmacocinética-farmacodinámica de fármacos antimicrobianos se describe, por ejemplo, en Nielsen and Friberg Pharmacol. Rev. 2013; 65(3): 1053-1090.
Tipos ejemplares de animales que pueden usarse para evaluar moléculas de anticuerpos, péptidos antibacterianos o conjugados molécula de anticuerpo-fármaco descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejos, cobayas y monos. Para aumentar la virulencia de las bacterias para inoculación pueden usarse varios métodos de inmunosupresión. Estos métodos incluyen, por ejemplo, dirigirse a la médula ósea (por ejemplo, mediante irradiación), la focalización en los neutrófilos (por ejemplo, usando citostáticos), dirigirse a los macrófagos (por ejemplo, usando mucina o levadura de panadería), dirigirse al complemento (por ejemplo, usando el factor del veneno de cobra), dirigirse a la tuftsina (por ejemplo, mediante esplenectomía), dirigirse a las inmunoglobulinas (por ejemplo, usando anti-Ig), dirigirse a los linfocitos T (por ejemplo, mediante timectomía) o dirigirse a las interleucinas (por ejemplo, usando anticuerpos o compuestos químicos). Otras consideraciones que pueden influir en la actividad antibacteriana en ensayosin vivoincluyen, por ejemplo, el tamaño del inóculo, la virulencia, el tiempo de crecimiento o generaciónin vivo,el momento del tratamiento, el método de administración, la farmacocinética/farmacodinámica y el desarrollo de resistenciain vivo.
Composiciones y kits farmacéuticos
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables, que incluyen una molécula de anticuerpo, un conjugado molécula de anticuerpofármaco (ADC), o un péptido antimicrobiano, como se describe en la presente, formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. El portador puede ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, rectal, espinal, transdérmica o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). En ciertas realizaciones, menos del 5%, por ejemplo, menos del 4%, 3%, 2% o 1% de las moléculas de anticuerpos, ADC o péptidos antimicrobianos en la composición farmacéutica están presentes como agregados. En otras realizaciones, por lo menos aproximadamente el 95%, por ejemplo, por lo menos aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8% o más de las moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos en la composición farmacéutica están presentes como monómeros. En algunas realizaciones, el nivel de agregados o monómeros se determina mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HP-SEC).
Las composiciones expuestas en la presente pueden presentarse en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. Una forma adecuada depende del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas adecuadas se presentan en forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo de administración adecuado es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En ciertas realizaciones, el anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente", como se usan en al presente, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a la alta concentración de anticuerpos. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estérilmente del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las moléculas de anticuerpo, ADC, o péptido antimicrobiano pueden administrarse por una variedad de métodos. En la técnica se conocen varios, y para muchas aplicaciones terapéuticas, profilácticas o diagnósticas, una ruta/modo de administración apropiado es la inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano pueden administrarse por infusión intravenosa a una velocidad de menos de 10 mg/min; preferiblemente menor o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 mg/m2, de aproximadamente 7 a 25 mg/m2 y más preferiblemente, de aproximadamente 10 mg/m2. Como apreciarán los expertos en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un portador que proteja el compuesto contra la liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como el acetato de etileno vinilo, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En ciertas realizaciones, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. La molécula de anticuerpo, el ADC o el péptido antimicrobiano (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano por administración distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto o coadministrarlo con un material que impida su inactivación. Las composiciones terapéuticas, profilácticas o de diagnóstico también pueden administrarse con dispositivos médicos, y en la técnica se conocen varios.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica, profiláctica o diagnóstica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformizar la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas de dosificación unitarias están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas de la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, y el efecto terapéutico, profiláctico o de diagnóstico particular que debe lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparación como compuesto de dicha molécula de anticuerpo, a Dc o péptido antimicrobiano para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
En una realización, el ADC se administra a un sujeto como una dosis única. Los estudiosin vitrode un ADC ejemplar descrito en la presente demuestran una rápida actividad bactericida a ~10 microgramos/ml o menos contraPseudomonas aeruginosa,incluyendo cepas MDR, incluso en ausencia de suero o células efectoras. Además, los estudiosin vivocon el ADC ejemplar demuestran una reducción significativa de los recuentos bacterianos en un modelo de infección pulmonar neutropénica porP. aeruginosa.Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que en una realización, la especificidad y la semivida del ADC descrito en la presente (por ejemplo, del orden de días) puede permitir una administración de dosis única del ADC, por ejemplo, como un antibacteriano específico de patógeno, paraP. aeruginosa,incluyendo las cepas MDR/XDR, a la vez que promueve la administración antimicrobiana, conservando el microbioma intestinal y limitando el desarrollo de resistencia.
Un intervalo ejemplar, no limitativo, para una cantidad terapéutica, profiláctica o diagnósticamente eficaz de una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano es 0,1-100 mg/kg, por ejemplo, 0,1-50 mg/kg o 0,1-20 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 1-10, 1-5, 5-10 o 1-3 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. La molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano puede administrarse por infusión intravenosa a una velocidad de menos de 10 mg/min, por ejemplo, menor o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2, por ejemplo, aproximadamente 5 a 50 mg/m2, aproximadamente 7 a 25 mg/m2, por ejemplo, aproximadamente 10 mg/m2. Debe tenerse en cuenta que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se desea aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en la presente son sólo ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o la puesta en práctica de las composiciones reivindicadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz", una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad diagnósticamente eficaz" de una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de anticuerpo,<a>D<c>o péptido antimicrobiano puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o la porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "dosificación terapéuticamente eficaz" típicamente inhibe un parámetro medible por lo menos en un 20%, por ejemplo, por lo menos en un 40%, por lo menos en un 60% o por lo menos en un 80% con respecto a los sujetos no tratados. El parámetro medible puede ser, por ejemplo, carga bacteriana, fiebre, dolor de cabeza, dolores musculares o articulares, erupciones cutáneas, hemorragias, niveles reducidos de plaquetas y presión arterial reducida. La capacidad de una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano para inhibir un parámetro medible puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia para reducir, inhibir o prevenir una infección bacteriana. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad de la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano para inhibir o reducir la viabilidad de las bacterias, por ejemplo, mediante un ensayoin vitrodescrito en la presente.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica se usa en sujetos antes o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Una "cantidad diagnósticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaicones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado diagnóstico deseado. Típicamente, una cantidad diagnósticamente eficaz es aquella en la que una infección bacteriana o un trastorno relacionado puede diagnosticarsein vitro, ex vivooin vivo.
Un kit puede comprender una molécula de anticuerpo, ADC, o péptido antimicrobiano descrito en la presente. El kit puede incluir uno o más elementos distintos que incluyen: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico o un agente útil para quelar, o acoplar de otro modo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano a un marcador o agente terapéutico, o una composición radioprotectora; dispositivos u otros materiales para preparar la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano para su administración; portadores farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para su administración a un sujeto.
Ácidos nucleicos
La presente divulgación también presenta ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de anticuerpo (por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera y CDR de las moléculas de anticuerpo), conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera y CDR de los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco), o péptido antimicrobiano, como se describe en la presente.
Por ejemplo, la presente divulgación presenta un primer y un segundo ácido nucleico que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente, de una molécula de anticuerpo elegida entre una o más de las moléculas de anticuerpo divulgadas en la presente, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de la Tabla 1 u 8, o una porción de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, las regiones variables de la Tabla 1 u 8. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las tablas de la presente, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 3, 6, 15, 30 o 45 nucleótidos de las secuencias mostradas en las tablas de la presente).
A veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en las tablas de la presente, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). A veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en las tablas de la presente, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). A veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis c Dr de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en las tablas de la presente, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas).
A veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos, o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 2, una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en la presente). Aveces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que es capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en la presente). A veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen la secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en la presente).
A veces, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en la presente). Aveces, el ácido nucleico comprende una porción de una secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en la presente). La porción puede codificar, por ejemplo, una región variable (por ejemplo, VH o VL); una, dos o tres o más CDR; o una, dos, tres o cuatro o más regiones marco.
A veces, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se expone en las Tablas 3 o<6>A-<6>B o en las FIGS. 4,15A-15B, o 36, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en la presente). A veces, el ácido nucleico comprende una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se expone en las Tablas 3<0 6>A-<6>B o en las FIGS. 4,15A-15B, o 36, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en la presente).
Los ácidos nucleicos divulgados en la presente incluyen desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El polinucleótido puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido). Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, por ejemplo mediante conjugación con un componente de marcado. El ácido nucleico puede ser un polinucleótido recombinante o un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o está unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.
La solicitud presenta células huésped y vectores que contienen los ácidos nucleicos descritos en la presente. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en un único vector o en vectores separados presentes en la misma célula huésped o en células huésped separadas, como se describe con más detalle a continuación.
Vectores
Los vectores pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo, un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) o un péptido antimicrobiano, descritos en la presente. Aveces, los vectores comprenden nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo descrita en la presente. A veces, los vectores comprenden las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Los vectores incluyen, entre otros, un virus, un plásmido, un cósmido, un fago lambda o un cromosoma artificial de levadura (YAC).
Pueden emplearse numerosos sistemas de vectores. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de ADN derivados de virus animales como, por ejemplo, virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (virus del sarcoma de Rous, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otra clase de vectores utiliza elementos de ARN derivados de virus de ARN como el virus del bosque de Semliki, el virus de la encefalitis equina oriental y los flavivirus.
Adicionalmente, las células que han integrado establemente el ADN en sus cromosomas pueden seleccionarse introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar, por ejemplo, prototropía a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos), o resistencia a metales pesados como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede unirse directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar, o introducirse en la misma célula por cotransformación. También pueden necesitarse elementos adicionales para una síntesis óptima del ARNm. Estos elementos pueden incluir señales de corte y empalme, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación.
Una vez que se ha preparado para la expresión el vector de expresión o la secuencia de ADN que contiene los constructos, los vectores de expresión pueden transfectarse o introducirse en una célula huésped apropiada. PAra lograr esto, pueden emplearse varias técnicas como, por ejemplo, fusión de protoplastos, precipitación de fosfato de calcio, electroporación, transducción retroviral, transfección viral, pistola de genes, transfección basada en lípidos u otras técnicas convencionales. En el caso de la fusión de protoplastos, las células se cultivan en medios y se examinan para determinar la actividad apropiada.
Los métodos y condiciones para cultivar las células transfectadas resultantes y para recuperar la molécula de anticuerpo, el péptido antibacteriano o el conjugado molécula de anticuerpo-fármaco producido son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden variarse u optimizarse dependiendo del vector de expresión específico y la célula huésped de mamífero empleada, basándose en la presente descripción.
Células
Las células huésped pueden comprender un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo, un péptido antibacteriano o un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco como se describe en la presente. Por ejemplo, las células huésped pueden comprender un ácido nucleico de la Tabla 2, una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en la presente), o una porción de uno de dichos ácidos nucleicos. Además, las células huésped pueden comprender un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos descrita en las Tablas 1, 3, 6A-6B u 8, una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (por ejemplo, una secuencia por lo menos aproximadamente un 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma), o una porción de una de dichas secuencias.
A veces, las células huésped se modifican genéticamente para que comprendan ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano.
Aveces, las células huésped se manipulan genéticamente usando un casete de expresión. La frase "casete de expresión," se refiere a secuencias de nucleótidos, que son capaces de afectar a la expresión de un gen en huéspedes compatibles con tales secuencias. Tales casetes pueden incluir un promotor, un marco de lectura abierto con o sin intrones, y una señal de terminación. También pueden usarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, como, por ejemplo, un promotor inducible.
Las células huésped pueden comprender los vectores descritos en la presente.
La célula puede ser, pero no se limita a, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula de insecto o una célula humana. Las células eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células Vero, células HeLa, células COS, células CHO, células HEK293, células BHK y células MDCKII. Las células de insecto adecuadas incluyen, entre otras, las células Sf9.
Usos de moléculas de anticuerpos, conjugados de molécula de anticuerpo-fármaco, y péptidos antim icrobianos
Las moléculas de anticuerpo, los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC), o los péptidos antimicrobianos divulgados en la presente, así como las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente, tienen utilidades terapéuticas, profilácticas, y/o diagnósticasin vitro, ex vivo,ein vivo.
En una realización, la molécula de anticuerpo, ADC, o péptido antimicrobiano, inhibe o reduce la viabilidad de bacterias, por ejemplo, bacterias Gram-negativas. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo,in vitrooex vivo,o a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, por ejemplo,in vivo,para inhibir o reducir la viabilidad de bacterias, por ejemplo, bacterias Gram-negativas. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una infección bacteriana en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una molécula de anticuerpo, a Dc o péptido antimicrobiano, descrito en la presente, de tal manera que se trata o previene la infección bacteriana. Por ejemplo, estas moléculas de anticuerpo pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo,in vitrooex vivo,o en un sujeto, por ejemplo,in vivo,para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infección bacteriana, o para inhibir o reducir una infección bacteriana.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano infectado con bacterias, por ejemplo, bacterias que provocan enfermedades, por ejemplo, bacterias Gram-negativas, o en riesgo de ser infectado con bacterias, por ejemplo, bacterias que provocan enfermedades, por ejemplo, bacterias Gram-negativas. El término "animales no humanos" incluye mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. Los métodos y composiciones descritos en la presente son adecuados para el tratamiento de pacientes humanos infectados con bacterias, por ejemplo, bacterias que provocan enfermedades, por ejemplo, bacterias Gram negativas. Los pacientes infectados con bacterias, por ejemplo, bacterias que provocan enfermedades, por ejemplo, bacterias Gram negativas, incluyen aquellos que han estado expuestos a las bacterias pero que son (por lo menos temporalmente) asintomáticos, pacientes que tienen una infección bacteriana o pacientes que tienen un trastorno relacionado con una infección bacteriana.
Métodos para tratar o prevenir las infecciones bacterianas
Las bacterias Gram-negativas muestran lipopolisacáridos (LPS) en la membrana externa de la bacteria. Sin querer estar limitados por la teoría, en una realización, las moléculas de anticuerpo, los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) o los péptidos antimicrobianos descritos en la presente pueden inhibir o reducir la viabilidad de las bacterias Gram negativas, por lo menos en parte, uniéndose a los LPS.
Las moléculas de anticuerpos, ADC, y péptidos antimicrobianos descritos en la presente, pueden usarse para tratar o prevenir infecciones bacterianas, así como trastornos, afecciones o síntomas asociados con infecciones bacterianas.
En una realización, la infección bacteriana está provocada por una o más de las siguientes bacterias:Klebsiella pneumoniae(por ejemplo,Klebsiella pneumoniaesubsp.ozaenae, Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae,oKlebsiella pneumoniaesubsp.rhinoscleromatis), Enterobacter cancerogenous, Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter asburiae, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Escherichia coli(por ejemplo,Escherichia coliATCC 11775,Escherichia coliATCC 25922,Escherichia coliATCC 35401 oEscherichia coliATCC 43895),Escherichia fergusonii, Salmonella choleraesuis, Salmonella choleraesuissubsp.indica, Salmonella enteritidis, Salmonella virchow, Salmonella paratyphi B, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A, Salmonella typhi, Salmonella choleraesuissubsp.arizonae, Salmonella choleraesuissubsp.diarizonae, Salmonella choleraesuissubsp.houtenae, Salmonella bongori, Citrobacter sedlakii, Citrobacterbraakii,Citrobacterwerkmanii,Citrobacterfreundii,Citrobacteryoungae,Citrobacter amalonaticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis,o cualquier combinación de las mismas.
En una realización, la infección bacteriana está provocada por uno o más de:Enterococcus faecium(por ejemplo,Enterococcus faeciumresistente a vancomicina (VRE)),Staphylococcus aureus(por ejemplo,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA)),Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii(por ejemplo,Acinetobacterresistente a múltiples fármacos (MDR)),Pseudomonas aeruginosa(por ejemplo,P. aeruginosaresistente a múltiples fármacos (MDR), por ejemplo,P. aeruginosaresistente a carbapenémicos),Enterobacteriaceae(por ejemplo,E. coli, K. pneumoniaeoEnterobacter spp.,por ejemplo,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE)),N. gonorrhoaeae(por ejemplo, A.gonorrhoaeaeresistente a fármacos),Salmonella(por ejemplo,Salmonellaresistente a fármacos),Shigella(por ejemplo,Shigellaresistente a fármacos), una bacteria productora de una p-lactamasa de espectro extendido (ESBL) oMycobacterium tuberculosis(por ejemplo,M. tuberculosisresistente a fármacos).
Los trastornos o afecciones ejemplares que pueden asociarse con infecciones bacterianas incluyen, pero no se limitan a neumonía (por ejemplo, neumonía adquirida en la comunidad y neumonía adquirida en el hospital), una infección del tracto urinario (ITU), septicemia, meningitis, diarrea (por ejemplo, diarrea del viajero), una infección de tejidos blandos, una infección de la piel, bacteriemia, una infección del sistema respiratorio (por ejemplo, una infección del tracto respiratorio inferior), endocarditis, una infección intraabdominal, artritis séptica, osteomielitis, una infección del SNC, una infección oftálmica, colecistitis, colangitis, meningitis (por ejemplo, meningitis neonatal), fiebre tifoidea, intoxicación alimentaria, gastroenteritis, fiebre entérica, shigelosis, infección del torrente sanguíneo, sepsis intraabdominal, absceso cerebral, meningitis, sepsis (por ejemplo, sepsis neonatal), infección articular, infección ósea, infección gastrointestinal o infección de heridas.
Ciertas moléculas de anticuerpos, ADC y péptidos antimicrobianos descritos en la presente son capaces de tratar por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 o más bacterias (por ejemplo, bacterias Gram-negativas) de diferentes géneros, especies, subespecies y/o cepas. Por consiguiente, en una realización, la molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano se administra a un paciente infectado o con riesgo de ser infectado por una infección bacteriana, cuando no se ha realizado ninguna prueba para determinar el género, la especie, la subespecie y/o la cepa de la bacteria, por ejemplo, puede desconocerse el tipo de bacteria infectada o causante de la enfermedad.
Las moléculas de anticuerpo, ADC, o péptidos antimicrobianos se administran típicamente a una frecuencia que mantiene un nivel terapéuticamente efectivo de moléculas de anticuerpo, ADC, o péptidos antimicrobianos en el sistema del paciente hasta que el paciente se recupere. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos pueden administrarse a una frecuencia que alcance una concentración sérica suficiente para que por lo menos 1, 2, 5, 10, 20, 30 o 40 moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos se unan a cada bacteria. En una realización, las moléculas de anticuerpo, ADC o péptidos antimicrobianos se administran cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días.
Los métodos para administrar varias moléculas de anticuerpo, ADC, o péptidos antimicrobianos son conocidos en la técnica y se describen a continuación. Las dosificaciones adecuadas de las moléculas de anticuerpos, ADC o péptidos antimicrobianos usados dependerán de la edad y el peso del sujeto y del fármaco concreto usado.
Las moléculas de anticuerpo o los péptidos antimicrobianos pueden usarse solos o conjugados con un segundo agente, por ejemplo, un agente antibacteriano, toxina o proteína,por ejemplo, una segunda molécula de anticuerpo o péptido antimicrobiano antibacteriano (por ejemplo, anti-LPS). Este método incluye: administrar la molécula de anticuerpo o el péptido antimicrobiano, solo o conjugado con un segundo agente, a un sujeto que requiera dicho tratamiento. Las moléculas de anticuerpo pueden usarse para administrar una variedad de agentes terapéuticos, por ejemplo, una toxina o un agente antivírico, o mezclas de los mismos.
Terapias combinadas
Las moléculas de anticuerpo, los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) y los péptidos antimicrobianos pueden usarse en combinación con otras terapias. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano coformulado con, y/o coadministrado con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes antibacterianos (incluyendo antibióticos u otros anticuerpos antibacterianos), vacunas o agentes que potencian una respuesta inmunitaria. En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo, los péptidos antibacterianos o los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéutico, como la hidratación intravenosa, los agentes antifebriles (como el paracetamol) o la transfusión de sangre. Tales terapias combinadas pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando por tanto posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias.
Administrado "en combinación", como se usa en la presente, significa que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto antes, o durante el curso de la aflicción del sujeto con una infección bacteriana o enfermedad. En una realización, los dos o más tratamientos se administran profilácticamente, por ejemplo, antes de que el sujeto se infecte o se le diagnostique una bacteria, por ejemplo, una bacteria Gram-negativa. En otra realización, los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto haya sido infectado o se le hayan diagnosticado bacterias, por ejemplo, bacterias Gram-negativas. En algunas realizaciones, la administración de un tratamiento aún está en curso cuando comienza la administración del segundo, de tal manera que se produce un solapamiento. Esto se denomina a veces "administración simultánea" o "concurrente". En otras realizaciones, la administración de un tratamiento finaliza antes de que comience la administración del otro. En algunas realizaciones de cualquiera de los casos, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, es decir, se observa un efecto equivalente con menos cantidad del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida de lo que se observaría si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o se observa una situación análoga con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, la administración es tal que la reducción de un síntoma, u otro parámetro relacionado con la infección o trastorno bacteriano es mayor que la que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o más que aditivo. La administración puede ser tal que el efecto del primer tratamiento administrado siga siendo detectable cuando se administra el segundo.
En alguna realización, el agente antimicrobiano adicional es un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico puede ser un antibiótico betalactámico (por ejemplo, una penicilina, una cefalosporina, una monobactama o un carbapenémico), una monobactama, un carbapenémico, un macrólido, una lincosamida, una estreptogramina, un aminoglucósido, una quinolona, una sulfonamida, una tetraciclina, un glucopéptido, un lipoglucopéptido, una oxazolidinona, una rifamicina, un polipéptido o una tuberactinomicina. Los antibióticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, amikacina, amoxicilina, ampicilina, azitromicina, aztreonam, bacampicilina, bacitracina, balofloxacina, besifloxacina, capreomicina, carbenicilina, cefacetrilo (cephacetrile), cefaclomezina, cefaclor, cefadroxil (cefadroxyl), cefalexina (cephalexin), cefaloglicina (cephaloglycin), cefalonio (cephalonium), cefaloram, cefaloridina (cephaloradine), cefalotina (cephalothin), cefamandol, cefaparol, cefapirina (cefapirina), cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina (cefazolina), cefcanel, cefcapeno, cefclidina, cefdaloxima, cefdinir, cefditoren, cefedrolor, cefempidona, cefepima, cefetamet, cefetrizol, cefivitril, cefixima, cefluprenam, cefmatileno, cefmenoxima, cefmepidio, cefmetazol, cefodizima, cefonicid, cefoperazona, cefoselis, cefotaxima, cefotetan, cefovecina, cefoxazol, cefoxitina, cefozopran, cefpimizol, cefpirome, cefpodoxima, cefprozil (cefproxil), cefquinoma, cefradina (cefradina), cefrotil, cefroxadina, cefsumida, ceftarolina, ceftarolina (teflaro), ceftazidima, cefteram, ceftezol, ceftibuteno, ceftiofur, ceftioleno, ceftióxido, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuracetime, cefuroxima, cefuzonam, cloranfenicol, ciprofloxacino, claritromicina, clinafloxacina, clindamicina, cloxacilina, cicloserina, daptomicina (cubicina), demeclociclina, dicloxacilina, diritromicina, doripenem, doxiciclina, enoxacina, ertapenem, eritromicina, flucloxacilina, flumequina, gatifloxacina, gemifloxacina, gemifloxacina (factiva), gentamicina, grepafloxacina, imipenem, imipenem/cilastatina, kanamicina, levofloxacino, lincomicina, linezolid, lomefloxacino, macrocíclicos, meropenem, metronidazol, mezlocilina, minociclina, moxifloxacina, nadifloxacina, nafcilina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, ácido oxolínico, oxitetraciclina, paromomicina, pazufloxacina, pefloxacina, penicilina g, penicilina v, ácido pipemídico, piperacilina, ácido piromídico, pivampicilina, pivmecillinam, polimixina b, pristinamicina, prulifloxacina, quinupristina/dalfopristina, rifabutina, rifampicina, rifapentina, rosoxacina, roxitromicina, rufloxacina, sitafloxacina, esparfloxacina, estreptomicina, sulfametozol, sulfametoxazol, sulfisoxazol, teicoplanina, telavancina, telavancina (vibativ), telitromicina, temafloxacina, tetraciclina, ticarcilina, tigeciclina, tinidazol, tobramicina, tosufloxacina, trimetoprima-sulfametoxazol, trovafloxacina, vancomicina, viomicina o zeocina.
En algunas realizaciones, el agente antibacteriano adicional es una vacuna. La vacuna puede ser, por ejemplo, bacterias vivas, atenuadas o inactivadas, por ejemplo, vacuna contra el ántrax (por ejemplo, BIOTHRAX®), vacuna DTaP (por ejemplo, DAPTACEL® o INFANRIX®), vacuna DT, vacuna contra Haemophilus influenzae tipo b (Hib) (por ejemplo, Ac THIB®, HIBERIX®, o PEDVAXHIB®), vacuna meningocócica (por ejemplo, MENOMUNE®, MENACTRA®, MENVEO®, TRUMENBA®, o BEXSERO®), vacuna antineumocócica (por ejemplo, PNEUMOVAX® 23 o PREVNAR® 13), vacuna contra el tétano/difteria (por ejemplo, DECAVAC® o TENIVAC®), vacuna contra el tétano/difteria/tosferina (por ejemplo, BOOSTRIX® o<a>D<a>CEL®), vacuna antitifoidea (por ejemplo, TYPHIM VI® o VIVOTIF®), vacuna DTPa/polio (por ejemplo, KINRIX®), vacuna DTPa/hepatitis B/polio (por ejemplo, PEDIARIX®), vacuna DTPa/polio/Haemophilus influenza tipo b (por ejemplo, PENTACEl®), vacuna Haemophilus influenza tipo b/hepatitis B (por ejemplo, COMVAX®), y vacuna Haemophilus influenza tipo b/meningocócica (por ejemplo, MENHIBRIX®).
En ciertas realizaciones, el agente antiviral adicional es una segunda molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano diferente de una primera molécula de anticuerpo, ADC o péptido antimicrobiano. Las moléculas de anticuerpo ejemplares que pueden usarse en combinación incluyen, pero no se limitan a, cualquier combinación de las moléculas de anticuerpo enumeradas en la Tabla 1 u 8.
En algunas realizaciones, el agente antibacteriano adicional es un péptido antimicrobiano (por ejemplo, antibacteriano). Los péptidos antimicrobianos ejemplares incluyen, entre otros, acetato de pexiganano (MSI 78), omiganano (MX-226/MBI-226 o CLS001), iseganano (IB-367), hLF1-11, XOMA 629, PAC-113, CZEN-002, IMX942, OP-145, ghrelina, PMX-30063, delmitida (RDP58), plectasina y HB1345.
En algunas realizaciones, el agente antibacteriano adicional es un agente modificador de la resistencia. Los agentes modificadores de la resistencia ejemplares incluyen, entre otros, un inhibidor del eflujo (por ejemplo, Phe-Argp-naftilamida) y un inhibidor de la betalactamasa (por ejemplo, ácido clavulánico o sulbactam).
Métodos de diagnóstico
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de diagnósti
presencia de una bacteriain vitro(por ejemplo, en una muestra biológica, como una muestra de sangre) oin vivo(por ejemplo, imagenologíain vivoen un sujeto). El método incluye: (i) poner en contacto la muestra con una molécula de anticuerpo o un conjugado molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) descrito en la presente, o administrar al sujeto, la molécula de anticuerpo o el ADC; (opcionalmente) (ii) poner en contacto una muestra de referencia, por ejemplo, una muestra de control (por ejemplo, una muestra biológica de control, como plasma o sangre) o un sujeto de control con una molécula de anticuerpo o ADC descritos en la presente; y (iii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo o ADC, y la muestra o sujeto, o la muestra o sujeto de control, en donde un cambio, por ejemplo, un cambio estadísticamente significativo, en la formación del complejo en la muestra o sujeto con respecto a la muestra o sujeto de control es indicativo de la presencia de la bacteria en la muestra. La molécula de anticuerpo o ADC puede marcarse directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos, como se ha descrito anteriormente y se describe con más detalle a continuación.
El término "muestra", cuando se refiere a muestras usadas para detectar bacterias incluye, pero no se limita a, células, lisados celulares, proteínas o extractos de membrana de células, fluidos corporales como sangre o muestras de tejido.
La formación de complejos entre la molécula de anticuerpo o ADC y una bacteria o lipopolisacárido puede detectarse midiendo o visualizando o la molécula de anticuerpo o el conjugado molécula de anticuerpo-fármaco unido a la bacteria o lipopolisacárido, o la molécula de anticuerpo o ADC no unido. Puede usarse cualquier ensayo de detección adecuado, y los ensayos de detección convencionales incluyen un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. Como alternativa al marcado de la molécula de anticuerpo o ADC, la presencia de una bacteria o lipopolisacárido puede analizarse en una muestra mediante un inmunoensayo de competición usando estándares marcados con una sustancia detectable y una molécula de anticuerpo o ADC no marcados. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares marcados y la molécula de anticuerpo o ADC se combinan y se determina la cantidad de estándar marcado unido a la molécula de unión no marcada. La cantidad de bacterias o lipopolisacáridos en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de estándar marcado unido a la molécula de anticuerpo o ADC.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Evaluaciónin vitrode moléculas de anticuerpos candidatas mediante ensayo opsonofagocítico (OPA)
Se evaluóin vitrola actividad opsonofagocítica de las moléculas de anticuerpos candidatas frente a múltiples bacterias gramnegativas. El ensayo opsonofagocítico (OPA) evalúa la capacidad de una molécula de anticuerpo para opsonizar bacterias en presencia de complemento y neutrófilos. La opsonización de bacterias es una de las principales vías por las que se ha demostrado que los anticuerpos eliminan bacteriasin vivo.La actividad en este ensayo es un requisito previo para la selección y posterior evaluación de moléculas de anticuerposin vivo.
Brevemente, se usaron los siguientes componentes de ensayo:
Complemento (C'): suero humano normal adsorbido con la cepa bacteriana específica de la prueba.
Neutrófilos: sangre humana reciente de donantes adultos sanos.
Bacterias:E. coliATCC cepa 25922.
Controles positivos: IgG policlonal opsónica (pAb) para cada bacteria probada.
Cribado: se cribaron moléculas de anticuerpos para OPA de 0,1 pg/ml a 25 pg/ml.
El reactivo de complemento se preparó por adsorción de moléculas de anticuerpos específicos bacterianos de suero humano normal. Brevemente, se suspendieron ~109 CFU de bacterias en suero (10 ml) y se incubaron en hielo durante 30 min con mezclado. La muestra se centrifugó y el suero se transfirió y se volvió a suspender en 109 CFU de bacterias. Se incubó en hielo con mezclado durante 30 minutos adicionales. El suero/complemento se recuperó por centrifugación y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 pM.
Se prepararon células polimorfonucleares (PMN) de un único donante. Se mezcló sangre humana reciente con un volumen igual de HISTOPAQUE® y se incubó durante 1 hora a 37°C. Se recogió la capa superior y las células se dispersaron por centrifugación a 250 g durante 5 minutos. Los glóbulos rojos restantes se lisaron con NH<4>Cl al 1% mediante incubación a temperatura ambiente durante 10 min. Las células se lavaron y se volvieron a suspender en MEM. La viabilidad celular se determinó mediante azul de tripano y se suspendieron a una concentración final de 5x106 células/ml.
Las bacterias se prepararon sembrando un tubo de 6 ml de caldo Mueller Hinton, ajustado a cationes (MHB), hasta una absorbancia de 600 nM de 0,1 a partir de y crecimiento durante una noche deE. coli25922 en una placa de agar de sangre. Las células se cultivaron hasta la mitad de la fase logarítmica (A<600>nM = 0,6-1,0) y, a continuación, se diluyeron en solución salina al 0,9% hasta una A<600>nM = 0,2. Esto proporcionó un cultivo de aproximadamente 1x108 cfu/ml. El cultivo se diluyó 1:100 en medio esencial mínimo (MEM) para obtener un cultivo a 1x106 cfu/ml. Esta fue la suspensión bacteriana usada en el OPA. La absorbancia requerida del cultivo variaba entre cepas bacterianas.
Cada serie del ensayo contenía múltiples controles y artículos de prueba. Además de las bacterias, los grupos de ensayo se estratificaron por: C' solo, PMNs C', PMNs C' inactivado por calor, PMNs C' mAb inespecífico; PMNs C' pAb de control positivo, C' pAb de control positivo, PMNs C' mAbs de artículo de prueba (serie de dilución). La OPA se realizó de la siguiente manera. Se mezclaron 100 pl de cada suspensión de PMN, la suspensión bacteriana, los antisueros o anticuerpos y el complemento, para obtener un volumen total de 400 pl. De esta mezcla se tomó inmediatamente una muestra de 25 pl en T = 0. Después de la incubación en una gradilla rotatoria a 37°C durante 90 minutos, se volvió a tomar una muestra en T = 90 minutos. Las muestras se diluyeron 1:10 en 225 pl de TSB 0,05% de Tween para lisar los glóbulos blancos (saponina de lisis alternativa). Las muestras se sembraron en placas TSA duplicadas (100 pl cada una) y se incubaron durante la noche a 37C. Como la preparación era de 1x106 CFU/ml y había 0,1 ml/tubo en un volumen final de 0,4 ml, habría 250.000 CFU/ml. Colocando una placa al 1:100 se obtendrían 250 CFU por placa por duplicado. Una gota logarítmica sería de 25 CFU por placa. Se ajustó la temperatura para cada especie bacteriana para obtener una mejor resolución. Se contaron las placas. Se calculó la reducción del número de CFU a T = 90 minutos en comparación con T = 0 y se notificó como porcentaje de eliminación. Sería deseable una reducción de por lo menos un logaritmo.
Las moléculas de anticuerpo se clasificaron en función de su actividad OPA contra E.coli.Las moléculas de anticuerpos que tuvieran la mayor actividad OPA contraE. coli.se seleccionarían para la evaluaciónin vivo.
Métodos para realizar un ensayo OPA también se describen, por ejemplo, en Hemachandra et al. Infect Immun. 2001; 69(4): 2223-2229.
Los métodos descritos en la presente también pueden usarse para evaluar la actividad de eliminación opsonofagocíticain vitrode los conjugados molécula de anticuerpo-fármaco contra múltiples bacterias Gram negativas.
Ejemplo 2: Ensayo de concentración inhibitoria mínima
El ensayo de concentración inhibitoria mínima (MIC) se realizó basándose en las normas y prácticas publicadas por el CLSI (documentos M07-A9, M100-24). Se usó para determinar las concentraciones inhibitorias mínimas de los compuestos de prueba frente a varias especies microbianas usando microdilución en caldo. El ensayo mezcla compuestos con bacterias en presencia de caldo rico y mide la concentración mínima de compuesto a la que el crecimiento bacteriano disminuye por lo menos un 80%. El ensayo puede usar una placa de 96 pocillos/formato de alto rendimiento de tal manera que los compuestos puedan probarse simultáneamente contra un gran panel de cepas bacterianas. Para cada cepa de prueba hay un estándar inhibitorio publicado y los resultados para los estándares, publicados en los documentos CSLI, deben caer dentro de dos veces de los valores publicados y no deben variar más de dos veces en las pruebas posteriores.
Los procedimientos se describen a continuación:
El día 1, todas las cepas que se iban a usar en el ensayo se sacaron del almacén a -80° C, se descongelaron en hielo y se subcultivaron en una placa de agar apropiada usando un asa de inoculación de 10 pl. Todas las placas se colocaron a 37° C durante la noche. Como alternativa, las cepas pueden subcultivarse a partir de una placa de agar reciente de una noche o de una placa de agar refrigerada de menos de una semana.
El Día 2, se examinaron todas las placas de la noche para comprobar la homología y la morfología apropiada de las colonias. Todas las cepas se subcultivaron en una placa de agar adecuada usando un asa de inoculación de 10 pl. Todas las placas se colocaron a 37° C durante la noche.
El Día 3, se examinaron todas las placas de la noche para comprobar la homología y la morfología apropiada de las colonias. Se prepararon placas madre para compuestos de prueba y estándares. En una placa de polipropileno de 96 pocillos, se colocaron 40 pl de una concentración 50x de compuesto (50 veces la concentración final máxima deseada para el ensayo) en la columna 1 (8 compuestos por placa). En las columnas 2-12 se colocaron 20 pl de diluyente. En las columnas 2-11 se colocaron 20 pl de diluyente en 20 pl (diluciones dobles) a lo largo de la placa. La columna 12 se usó como control de crecimiento. El diluyente puede variar dependiendo de la solubilidad del compuesto (los diluyentes comunes son agua, DMSO y HCl 0,1 N).
Los intervalos de concentración también pueden variarse dependiendo de la eficacia de los compuestos. Típicamente, los compuestos se volvieron a suspender a 3,2 mg/ml para una concentración final superior del ensayo de 64 pg/ml, sin embargo, los compuestos menos eficaces se volvieron a suspender a 25,6 mg/ml para una concentración final superior del ensayo de 512 pg/ml. Alternativamente, los compuestos con MIC aún más altas o los compuestos cuyo stock está a una concentración inicial baja pueden ejecutarse usando un protocolo alternativo para determinaciones de MIC de alta concentración en donde el compuesto se diluye directamente en la placa de ensayo usando 40 pl de stock sin diluir en la columna 1 y 20 pl se llevan a 20 pl a través de las columnas 2-11 de la placa. A continuación, el ensayo añade 80 pl (en lugar de 100 pl) de medio de cultivo para que la dilución del compuesto sea sólo de 1:5 (en lugar de 1:50).
Las placas hijas se prepararon de la siguiente manera. Las placas hijas se estamparon a partir de la placa madre llevando 2 pl de cada fila de la placa madre a una fila correspondiente de la placa hija, haciendo una placa hija por cada cepa que se iba a probar.
Los medios de cultivo se prepararon de la siguiente manera. Para cada cepa a probar, se preparó un cultivo equivalente a McFarland 0,5. Se usó un asa de inoculación de 10 pl para sembrar células de placas de agar de una noche en tubos Pyrex de 10 ml que contenían 5 ml de solución salina al 0,85%. Usando un densitómetro, cada tubo se ajustó a 0,5 unidades McFarland añadiendo más células o solución salina. Estos cultivos deben contener aproximadamente 1x108 células/ml. Estos cultivos se diluyeron a 1:200 en medios adecuados para reducir la concentración celular a aproximadamente 5x105 células/ml. La excepción son las cepas de levadura, incluyendoC. albicans,que deben diluirse a 1:2000. Cada placa se sembró con cada cultivo diluido con 100 pl por pocillo (aproximadamente 10 ml por placa). Todas las placas hijas se sembraron con 100 pl/pocillo del cultivo apropiado. Todas las placas se fijaron a 37° C durante la noche.
El Día 4, se leyeron todas las placas 18 horas después del sembrado usando un lector de placas de espejo y luz incandescente reflejada. En ciertos experimentos, la MIC se consideró como la concentración más baja de compuesto que inhibe el crecimiento en por lo menos un 80%. El pocillo debe parecer vacío de crecimiento cuando se lee a ojo e incluso un botón parcial constituiría un crecimiento observable. Por ejemplo, como se muestra en la FIG.
5, las MlC duplicadas se leerían como 3, 3, 2, 2, 6, 6, 2, 2.
Para cada cepa de prueba, el compuesto de control correspondiente debe tener una MIC dentro de 2 veces del valor esperado. Si se verificaban los controles, se comunicaban los valores de todos los compuestos de prueba.
En la Tabla 4 se muestran valores ejemplares de compuestos de control MIC para varias cepas.
T l 4. V l r m l r m nr l MI
continuación
Ejemplo 3: Actividadin vitrodirigida de conjugados anticuerpo-fármaco
Se investigó el efecto de un ADC ejemplar (Anticuerpo Anti-Pseudomonas con Péptido 2 fusionado en el extremo C-terminal de la Cadena Pesada) sobre la unión e inhibición de bacterias. En este ejemplo, se empleó la cepa bacteriana ATCC 27853. El ADC ejemplar mostró una unión a la superficie bacteriana similar a la del anticuerpo solo, según se determinó mediante FACS (datos no mostrados). Como se muestra en la Tabla 5, el ADC mostró una actividad 10 veces superior a la del péptido solo. El ADC también conservó la actividad opsonofagocítica. Además, el ADC demostró especificidad para patógenos Gram-negativos, ya que en este experimento no se observó la muerte de bacterias Gram-positivas.
Tabla 5. Actividad in vitro diri ida
Ejemplo 4: Generación y ensayo de anticuerpos ejemplares
Los anticuerpos ejemplares hWN01 y h WNv 1 se diseñaron mediante ingeniería guiada por estructura de WN1 222-5 (Di Padova et al., Infectlmmun. 1993; 61(9):3863-3872). Los anticuerpos hWN01 y hWNv1 se dirigen al glicano de núcleo conservado del LPS y se diseñaron para acercarlos a la línea germinal humana y mejorar la unión aK. pneumoniae.Como se muestra en la FIG. 2, hWN01 mostró una unión picomolar (pM) a E.coliy nanomolar (nM) a cepas deK. pneumoniae.Además, hWN01 y h WNv 1 son proximales a la secuencia de la línea germinal humana y tienen una expresión mejorada.
También se generaron anticuerpos ejemplares 2C7, 3D6, 3E7 y 3G1. La unión de los anticuerpos 2C7, 3D6, 3E7 y 3G1 a cepas representativas deE. coli, K. pneumoniaey S.typhimuriumse determinó mediante ELISA. Los resultados se muestran en las FIGS. 7-10.
Ejemplo 5: Andamiaje novedoso para la manipulación del mAb A001-25 de inmunización de ratones
Para identificar un anticuerpo ampliamente reactivo dirigido al núcleo del LPS, se inmunizó a ratones CD-1 con la vacuna JS-OMP de E.coli(10 |jg) y el adyuvante Hiltonol (10 |jg). A los ratones se les dosificó por vía intraperitoneal la mezcla de inmunógeno y adyuvante semanalmente durante 3 semanas, momento en el que se evaluaron los sueros de los ratones inmunizados por sus títulos contra múltiples patógenos mediante ELISA de células completas. Se seleccionaron para la fusión los ratones con los títulos más altos contraE. coliyK. pneumoniae.Se realizaron fusiones esplénicas con células asociadas de mieloma y se sembraron en placas de 96 pocillos para el desarrollo clonal. Dos semanas más tarde, se examinó la capacidad de los hibridomas para reconocer el LPS J5 deE. coli.Uno de estos clones con unión aE. coli, K. pneumoniaey S.typhimuriummediante ELISA de células enteras es el mAb A001-25. Se dirige al glicano de núcleo conservado del LPS. Como se muestra en la FIG. 3, A001-25 tiene una fuerte unión picomolar (pM) aE. coliyK. pneumoniae.La evaluación estructural basada en la estructura modelada indicó vías para la mejora de la afinidad.
Ejemplo 6: Clasificación de péptidos antimicrobianos ejemplares mediante ensayo en cascada
Se probaron los péptidos antimicrobianos candidatos por su actividad inhibidora sobre las bacterias y su actividad hemolítica. Se priorizaron como candidatos principales los péptidos con alta actividad de eliminación contra tantoE. colicomoPseudomonasen caldo, ratón y suero humano junto con baja citotoxicidad o actividad hemolítica. Los resultados se muestran en la Tabla 6A. Pra análisis posteriores se seleccionaron los péptidos antimicrobianos con fuerte actividad inhibidora o bactericida, baja hemólisis de glóbulos rojos y baja toxicidad fuera del objetivo.
T l A. A ivi inhi i ri l i nimir i n m l r r ri ivi h m líi
Se examinaron las relaciones estructura-actividad de AMP ejemplares para la construcción de ADC. Los AMP candidatos se seleccionaron basándose, por ejemplo, en la actividad letal, el nivel de hemólisis y la actividad en suero humano. Los resultados se muestran en la Tabla 6B. Los AMP ejemplares P265, P271, GGG-Octapeptina, P293, P294, P295, P261 y P297 se seleccionaron para su evaluación como ADC.
En la Tabla 6B, MIC se determinó en presencia de PBS, hsMIC se determinó en presencia de 50% de suero humano, MLC se determinó como la concentración (por ejemplo, concentración mínima) que llevó al 100% de lisis de glóbulos rojos; PLC se determinó como la concentración (por ejemplo, concentración mínima) que llevó al 50% de lisis de glóbulos rojos.
Pae:P. aeruginosa;Eco:E. coli;Sau: S.aureus;Kpn:K. pneumoniae
Se compararon además dos péptidos ejemplares, P295 y P297. Los resultados se muestran en la Tabla 6C.
Tabla 6C. Com aración de P295 con P297
Ejemplo 7: Grapado de péptidos para mejorar la potencia y la estabilidad de los péptidos antim icrobianos
Este ejemplo muestra que el grapado de péptidos mejoró la potencia y la estabilidad de un péptido antimicrobiano a-helicoidal ejemplar. En la FIG. 4 se ilustra el proceso de grapado del péptido mediante reticulación química. Se determinó la actividad inhibidora del péptido antimicrobiano antes y después del grapado. La MIC para el péptido ejemplar es de 160 pg/ml, mientras que la MIC para el péptido grapado es de 10 pg/ml. Los métodos de grapado ejemplares se describen, por ejemplo, en Alexander et al. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (16), 5946-5949.
Ejemplo 8: Producción de conjugados anticuerpo-fármaco usando ligación basada en sortasa
La ligación de la sortasa forma un enlace peptídico nativo entre una secuencia de reconocimiento de sortasa y una secuencia donante de sortasa. En la FIG. 37 se muestra un esquema ejemplar de la ligación por sortasa de la carga o cargas útiles peptídicas en la molécula de anticuerpo para producir a Dc .
Se logró la adición cuantitativa del péptido GGGRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 80) en los extremos C-terminales de las cadenas pesadas de anticuerpos que contienen (GS)6LPETGGG (SEQ ID NO: 24), y de las cadenas ligeras que contienen P(G<4>S)<2>LPETGGSG (SEQ ID NO: 26) usando sortasa A pentamutante (Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108 (28): 11399-11404). La secuencia de GGG es el dominio donante de la sortasa y la secuencia de RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG (SEQ ID NO: 68) es el dominio del péptido antimicrobiano.
A continuación se describe un método representativo. Se combinaron 1,5 mg/ml de anticuerpo en 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM CaCh, 20 equivalentes molares de péptido donante de sortasa por secuencia aceptora de sortasa, 1 equivalente molar de sortasa por 75 equivalentes molares de secuencia aceptora de sortasa. La reacción se incubó a 25°C durante 20 horas y el grado de conversión se monitorizó mediante espectrometría de masas Q-TOF. Una vez se hubo completado la conversión de la reacción, según se determinó por Q-TOF, la mezcla de la reacción se diluyó 10 veces en PBS y se purificó en una columna de proteína A. Los constructos purificados por FPLC se purificaron en una columna de proteína A y se purificaron por FPLC. Los constructos purificados por FPLC se caracterizaron mediante Q-TOF y electroforesis en gel. Los resultados se muestran en la FIG. 6.
La ligación de la sortasa también se realizó de la siguiente manera. Los péptidos que contenían una secuencia donante de sortasa GGG N-terminal se ligaron a los extremos C-terminales de la cadena pesada del anticuerpo que contenía la secuencia de reconocimiento de sortasa A LPETGGG (SEQ ID NO: 244). Los anticuerpos se intercambiaron en tampón en 150 mM NaCl/50 mM Tris (pH 7,5) antes de la ligación. Las condiciones optimizadas de ligación con sortasa se realizaron en 150 mM NaCl/50 mM Tris (pH 7,5) usando 20 mol de péptido por mol de mAb a 1,5 mg/ml de mAb (150 kDa), 10 mM CaCl2, 5,8 pg/ml de Sortasa A (de BPS Bioscience, (21,7 kDa)). Después de la incubación a temperatura ambiente en la oscuridad durante 18 horas, las muestras se diluyeron a un volumen total de 10 ml en PBS y se purificaron por FPLC. La eficacia de la conjugación se determinó por espectrometría de masas Q-TOF usando un anticuerpo reducido preparado calentando una muestra de 5 pg a 65° C durante 15 min en 10 mM DTT.
Ejemplo 9: Evaluación de la selectividad de conjugados anticuerpo-fármaco
Se evaluó la selectividad de un ADC ejemplar para las bacterias diana usando un ensayo mixto de eliminación microbiana. Como se muestra en las FIGS. 11A-11D, la actividad de eliminación del ADC dirigido aPseudomonasfue preferencial paraPseudomonassobreE. coliyKlebsiellaspp. en comparación con el anticuerpo solo, el péptido solo o una combinación de anticuerpo y péptido.
Ejemplo 10: Unión aP. aeruginosa,incluyendo las cepas resistente a múltiples fármacos
Se probó la unión de un ADC ejemplar (que comprende mAb001) aP. aeruginosa,incluyendo las cepas resistentes a múltiples fármacos. Como se muestra en la FIG. 12 y la Tabla 7, el ADC ejemplar mostró una fuerte unión aP. aeruginosa.El ADC ejemplar es altamente seleccionado paraP. aeruginosa(datos no mostrados). La unión es específica del núcleo del LPS.
T l 7. Avi i ni nP. r inE
Ejemplo 11: Acoplamiento con la superficie bacteriana
Se examinó la unión de un ADC ejemplar (que comprende mAb001) a la superficie bacteriana. La unión se visualizó mediante microscopía electrónica usando marcado secundario con inmunogold. Como se muestra en la FIG.
13, el ADC ejemplar se une a la superficie bacteriana. Se observó una unión superficial mejorada en comparación con otras dianas.
Ejemplo 12: Actividadin vivodel anticuerpo: Neumonía aguda murina
Se probó la actividadin vivode una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar (mAb001) en un modelo murino de neumonía aguda.
Los ratones fueron suministrados por Charles River (Margate, Reino Unido) y estaban libres de patógenos específicos. La cepa de ratones usada fue ICR (también conocida como ratones<c>D 1), que es una cepa murina exogámica bien caracterizada. Los ratones (machos) pesaban entre 11 y 15 g cuando se recibieron y se permitió que se aclimatasen durante por lo menos 7 días. Los ratones se volvieron neutropénicos mediante inmunosupresión con ciclofosfamida a 200 mg/kg 4 días antes de la infección y 150 mg/kg 1 día antes de la infección por inyección intraperitoneal. El régimen de inmunosupresión provoca neutropenia a partir de las 24 horas después de la administración de la primera inyección, que continúa durante todo el estudio. Para los estudiosin vivose usó la cepa ATCC 27853 dePseudomonas aeruginosa.
Los ratones se infectaron aproximadamente 24 horas después de la segunda dosis del agente inmunosupresor mediante instilación intranasal conP. aeruginosaATCC 27853 preparada a partir de caldo reciente y diluida a una concentración óptima con PBS. Para la infección, se anestesió a los animales con Ketamina/Xilacina (90 mg/kg de Ketamina/9 mg/kg de Xilacina) mediante inyección IP administrada a ~15 ml/kg. Los ratones anestesiados se infectaron con 0,04 ml de inóculo mediante instilación intranasal (20 pl por fosa nasal, 5 min entre fosas nasales) y se mantuvieron en posición vertical en un soporte de cuerda durante ~10 minutos después de la infección. La concentración del inóculo fue de 6,67 x 105 CFU/ml (~2,67 x 104 CFU/pulmón de ratón). Las soluciones madre de los artículos de prueba se prepararon en PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Después de la reconstitución, todas las soluciones de dosificación de prueba permanecieron translúcidas y sin partículas durante el periodo de dosificación.
Los artículos de prueba se dosificaron una vez por vía intravenosa (IV) 12 horas antes del momento previsto de la infección. Los comparadores tobramicina y polimixina B se dosificaron tres veces al día (TID) por vía IV y subcutánea (SC), respectivamente, comenzando a las 2 horas post-infección. El volumen de dosificación fue de 10 ml/kg para todas las dosis del artículo de ensayo y los comparadores.
Cada grupo incluía 8 animales neutropénicos. Los animales recibieron inoculación intranasal deP. aeruginosaATCC 27853. La molécula de anticuerpo se administró a 5 mg/kg o 45 mg/kg por vía intravenosa. Se usó polimixina B como control positivo. Se midió la carga bacteriana de 24 horas en el pulmón. Como se muestra en la FIG. 14, la molécula de anticuerpo ejemplar mostró una reducción de 2 log (CFU/g). Los resultados demostraron la eficaciain vivode un anticuerpo dirigido al núcleo del LPS en un modelo murino de neumonía aguda.
Ejemplo 13: Efecto del grapado AMP sobre la estabilidad y la unión no específica
Se examinó el efecto del grapado sobre la estabilidad y la unión no específica (NSB) usando un péptido antimicrobiano ejemplar. Como se muestra en las FIGS. 15A-15B, tanto las mediciones de suero en T=0 como en T=60 min muestran cantidades mayores del AMP grapado con respecto a la versión no grapada. Estos datos son cuantitativos y se generaron en un L<s>/MS. El aumento se atribuyó a la reducción de NSB con el compuesto grapado. La FIGS. 15C ilustra la diferencia entre la carga útil no optimizada y la carga útil optimizada. Las cargas útiles pueden seleccionarse basándose en la estabilidad del suero. Pueden seleccionarse cargas útiles que tengan una unión no específica reducida y/o una estabilidad de proteasa mejorada.
La generación de la muestra de estabilidad de suero se realizó de la siguiente manera. Se descongeló suero humano normal (NHS) (Sigma S-7023), se diluyó en agua, se centrifugó a 13000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se calentó a 37°C en un baño de agua. Se colocaron 20 pl de cada artículo de ensayo en un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2,0 ml. A cada tubo se añadieron 2 ml de NHS diluido e inmediatamente se agitaron los tubos en un vórtex y se transfirieron 200 pl a un tubo de microcentrífuga nuevo con 40 pl de ácido tricloroacético (TCA) al 15%. Los tubos de ensayo se colocaron a 37° C en una gradilla rotatoria entre los puntos temporales. Los tubos de TCA se colocaron en hielo durante 15 minutos y luego se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante de cada tubo y se congeló a -20° C para su análisis. Las muestras se recogieron y procesaron en varios puntos temporales de hasta 6 horas. También se describen métodos ejemplares en Nguyenet al.(2010)PLoS ONE5(9): e12684.
Ejemplo 14: Efecto del anticuerpo anti-LPS sobre la señal de endotoxina
Para la detección y cuantificación de la señal de endotoxina LPS se usó un ensayo colorimétrico basado en células. Este ensayo se basa en la activación del receptor tipo Toll (TLR) 4, el sensor de endotoxinas de mamíferos (Beutler et al. Curr Top Microbiol Immunol. 2002; 270:109-20). TLR4 reconoce LPS de bacterias Gram-negativas y activa NF-kB. Las células manipuladas para ser sensibles a LPS, como las células HEK-Blue™ -4 (InvivoGen), expresan de manera estable TLR4 humano y un gen informador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) inducible por NF-<k>B. La presencia de LPS puede ser detectada por las células HEK-Blue™ -4 provocando la activación de NF-kB. Usando QUANTI-Blue™ (InvivoGen), un medio de detección de SEAP que produce una señal de color, puede detectarse la activación de NF-kB a 620-655 nm. Como la absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de endotoxina presente, la concentración de endotoxina puede medirse a partir de una curva estándar obtenida usando diluciones en serie del estándar de endotoxina HEK-Blue™ (InvivoGen).
Como se muestra en la FIG. 16, la señal de endotoxina(Pseudomonas-LPS)se suprimió por completo en presencia de una molécula ejemplar de anticuerpo anti-LPS, mAb001. El control negativo (un anticuerpo antitoxina deC. difficile,CDA1) no mostró ningún efecto sobre la señal de endotoxina. En este estudio se usaron 0,5 EU/ml dePseudomonas-LPS.
Ejemplo 15: Actividad de eliminación microbiana con conjugados anticuerpo-fármaco
Se probaron ADC ejemplares para determinar su actividad de eliminación microbiana.
El ensayo de eliminación microbiana se realizó de la siguiente manera. Las células bacterianas se cultivaron aeróbicamente durante la noche en placas de agar a 37° C. Las placas de la noche se usaron por la mañana para sembrar cultivos de 30 ml de medio de crecimiento en matraces de 250 ml con ventilación. Los cultivos se cultivaron aeróbicamente a 37°C, agitándolos a 150 rpm. El crecimiento se monitorizó a A600 nM y las células bacterianas se recogieron a mitad del crecimiento log. Se precipitaron diez ml de cultivo a 4000 x G durante 10 minutos y se lavaron una vez con PBS más 1% de BSA antes de volver a suspenderlos en 2 ml de PBS BSA. El cultivo concentrado se usó para sembrar tubos de 6 ml de PBS más BSA hasta un OD que diera una concentración de 1x108 células/ml. Los cultivos se diluyeron a 1x104 células/ml en PBS más BSA. Los artículos de prueba se diluyeron en PBS 1% de BSA y se cargaron 50 pl por concentración probada en una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos. Se añadieron 50 pl de cultivo diluido a todos los pocillos de prueba, así como a los pocillos de control sin compuesto. Las placas se agitaron y se incubaron a 37° C, 90 minutos, estáticas. Se sembraron diez pl de cada pocillo de ensayo en placas de agar y se incubaron a 37° C durante la noche. El porcentaje de eliminación se determinó comparando las CFU de los pocillos de ensayo con las CFU de los pocillos de control sin compuesto.
Como se muestra en la Tabla 9, múltiples ADC ejemplares mostraron un 50% de actividad de eliminación contra cepas de P.aeruginosaa una concentración de menos de 10 pg/ml.
T l . A ivi limin i n mi r i n AD m l r
Ejemplo 16: Actividad de eliminación microbiana contra cepas resistentes a múltiples fármacos
Se probaron compuestos ejemplares para determinar su actividad de eliminación microbiana frente a cepas deP. aeruginosaresistentes a múltiples fármacos.
El ensayo de eliminación microbiana se realizó como se describe en el Ejemplo 15. Como se muestra en la Tabla 10, los ADC ejemplares mostraron actividad de eliminación microbiana frente a cepas deP. aeruginosaresistentes a múltiples fármacos (MDR).
Tabla 10. Actividad de eliminación microbiana de ADC eem lares contra ce as MDR
Ejemplo 17: Eliminación selectiva de bacterias mediante conjugados anticuerpo-fármaco
Se probaron compuestos ejemplares para determinar su selectividad de eliminación contra diferentes bacterias.
Las cepas de Pseudomonas usadas en el ensayo fueronP. aeruginosa27853 (ATCC),P. aeruginosa39324 (ATCC),P. aeruginosaPA01 (UMD). Las cepas de E.coliusadas en el ensayo fueron E.coli25922 (ATCC) yE. coli43745 (J5) (ATCC). La cepa deKlebsiellausada en el ensayo fueK. pneumoniae700603 (ATCC). Las células bacterianas se cultivaron en placas de agar a partir de cepas congeladas. Todas las cepas bacterianas se cultivaron en placas de agar sangre (<t>S<a>+ 5% de sangre de oveja). Todas las placas se cultivaron a 37° C durante la noche.
Se usaron placas durante la noche para establecer cultivos McFarland de 0,5 en tubos Pyrex de 10 ml en 6 ml de PBS 1X. Los cultivos concentrados (aproximadamente 1x108 células/ml) se diluyeron 2x 1 : 100 en PBS (0,1 ml de cultivo en 9,9 ml de PBS) hasta una concentración de aproximadamente 1x104 células/ml. Se sembraron diez pl de cada uno de los cultivos diluidos en placas de agar sangre (BAP) usando esparcidores estériles con forma de "palo de hockey" para determinar la concentración inicial, comprobar la pureza y establecer la morfología de la cepa. A continuación, se mezcló un ml de cada cultivo diluido con suficiente PBS para alcanzar un volumen de 10 ml. Este cultivo mixto tenía aproximadamente 1x103 células de cada cepa bacteriana por ml. Se sembraron en placas 25 pl de este cultivo mixto en un BAP para establecer el t = 0 CFU/ml de cada cepa.
Los anticuerpos, péptidos antimicrobianos (AMP) y conjugados anticuerpo-fármaco (ADCs) a probar se diluyeron en 1x PBS. Las diluciones se multiplicaron por 2 o por 4 y se probaron 3 o 4 concentraciones de cada compuesto. En el caso de los anticuerpos y conjugados, las concentraciones finales típicas para el ensayo fueron de 100, 25, 6,25 y 1,56 pg/ml, aunque se habían usado intervalos de dilución mayores, menores y más amplios. Los péptidos antimicrobianos se probaron en equivalentes molares a la cantidad de péptido que se encontraba en el conjugado correspondiente (más comúnmente 4,4, 1,1, 0,28 y 0,07 pg/ml). Todos los compuestos estaban a un volumen final de 200 pl en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2,0 ml. También se incluyó un tubo de control sin compuesto.
Se añadieron 200 |jl del cultivo bacteriano mixto anterior a todos los tubos de ensayo. Los tubos se agitaron en vórtice y se sembraron 50 j l de cada tubo de ensayo en BAP separados. A continuación, los tubos de ensayo se colocaron a 37° C en una gradilla rotatoria. El procedimiento de colocación en placas se repitió a intervalos de una o dos horas durante cuatro horas, rotando los tubos a 37° C entre los puntos temporales. Todas las placas se colocaron a 37° C durante la noche.
Total de placas necesarias = (número de tubos de ensayo x número de puntos temporales) t = 0 controles
(3-4)
Al día siguiente, se contaron todas las placas para CFU de cada cepa bacteriana.
Para cada compuesto, se calculó el porcentaje de eliminación (% de reducción de CFU comparado con un control sin compuesto) para cada cepa en cada punto temporal. Los datos se tabularon y se representaron en gráficos como % de eliminación frente al tiempo.
Como se muestra en la FIG. 17, el ADC ejemplar eliminó selectivamente Pseudomonas y se logró una eliminación rápida (en el plazo de una hora).
Ejemplo 18: Actividadin vivodel conjugado anticuerpo-fármaco: Neumonía aguda murina
Se probó la actividadin vivode un ADC ejemplar (mAb001-conj2) en un modelo murino de neumonía aguda.
Los ratones fueron suministrados por Charles River (Margate, Reino Unido) y estaban libres de patógenos específicos. La cepa de ratones usada fue ICR (también conocida como ratones CD1), que es una cepa murina exogámica bien caracterizada. Los ratones (machos) pesaban entre 11 y 15 g cuando se recibieron y se permitió que se aclimatasen durante por lo menos 7 días. Los ratones se volvieron neutropénicos mediante inmunosupresión con ciclofosfamida a 200 mg/kg 4 días antes de la infección y 150 mg/kg 1 día antes de la infección por inyección intraperitoneal. El régimen de inmunosupresión provoca neutropenia a partir de las 24 horas después de la administración de la primera inyección, que continúa durante todo el estudio. Para los estudiosin vivose usó la cepa ATCC 27853 dePseudomonas aeruginosa.
Los ratones se infectaron aproximadamente 24 horas después de la segunda dosis del agente inmunosupresor mediante instilación intranasal conP. aeruginosaATCC 27853 preparada a partir de caldo reciente y diluida a una concentración óptima con PBS. Para la infección, se anestesió a los animales con Ketamina/Xilacina (90 mg/kg de Ketamina/9 mg/kg de Xilacina) mediante inyección IP administrada a ~15 ml/kg. Los ratones anestesiados se infectaron con 0,04 ml de inóculo por instilación intranasal (20 j l por fosa nasal, 5 min entre fosas nasales) y se mantuvieron en posición vertical en un soporte de cuerda durante ~10 minutos después de la infección. La concentración del inóculo fue de 6,67 x 105 CFU/ml (~2,67 x 104 CFU/pulmón de ratón). Las soluciones madre de los artículos de prueba se prepararon en PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Después de la reconstitución, todas las soluciones de dosificación de prueba permanecieron translúcidas y sin partículas durante el periodo de dosificación.
Para la dosificación intravenosa, los artículos de prueba se dosificaron una vez por vía IV 12 horas antes del momento planificado para la infección. Los comparadores tobramicina y polimixina B se dosificaron TID por vía IV y SC respectivamente comenzando 2 horas después de la infección. El volumen de dosificación fue de 10 ml/kg para todas las dosis del artículo de prueba y los comparadores.
Para la dosificación intranasal (IN), los artículos de prueba y el comparador Tobramicina se dosificaron una vez por vía intranasal (IN) después de la infección (15 min para la administración conjunta; 2h para la terapéutica). Se anestesió a los animales con isoflurano. A los ratones anestesiados se les dosificaron 0,04ml de inóculo por instilación intranasal (20 jl por fosa nasal, 5 min entre fosas nasales) y se mantuvieron en posición vertical en un soporte de cuerda durante ~10 minutos después de la dosificación
2 Horas después de la infección, se sacrificó a los animales de control pretratamiento humanitariamente usando una sobredosis de pentobarbitona. Se monitorizó el estado clínico de los animales restantes y los que sucumbieron a la enfermedad se sacrificaron humanitariamente. El estudio se dio por concluido ~23h después de la infección, cuando la mayoría de los ratones vehículo alcanzaron el punto final acordado éticamente.
A las 23 horas después de la infección, se evaluó el estado clínico de todos los animales restantes y se sacrificaron humanitariamente mediante una sobredosis de pentobarbitona. Se determinó el peso de los animales antes de extraer y pesar los pulmones. Las muestras de pulmón se homogeneizaron en solución salina estéril tamponada con fosfato helada usando un batidor de bolas Precellys; los homogeneizados se cultivaron cuantitativamente en agar selectivo para Pseudomonas y se incubaron a 37°C durante 16 a 24 horas antes de contar las colonias. La carga bacteriana en el pulmón se calculó en CFU/g. El modelo murino también se describe en Secheret al. PLoS One.2013; 8(9):e73396.
En el brazo del estudio de coadministración, cada grupo incluía 6 animales neutropénicos. Los animales recibieron coadministración de ADC o molécula de anticuerpo con bacterias. El ADC (mAb001-Conj2) se administró a 10 |jg o 200 |jg (mAb001-Conj2 = conjugado mAb001-P297), y mAb001 se administró a 200 |jg. Se midió la carga bacteriana a las 24 horas en el pulmón. Como se muestra en la FlG. 18A, el ADC ejemplar mostró una actividad rápida cuando se coadministró con bacterias. La actividad fue comparable a la de la Tobramicina.
En el brazo del estudio intranasal (IN), cada grupo incluía 6 animales neutropénicos. Los animales recibieron inoculación intranasal deP. aeruginosaATCC 27853. El ADC (mAb001-Conj2) se administró a 10 jg o 200 jg 2 horas después de la inoculación. Se midió la carga bacteriana a las 24 horas en el pulmón. Como se muestra en la FIG.
18B, el ADC ejemplar mostró una reducción de aproximadamente 2logi0 en CFU/g.
Se obtuvieron datos adicionales usando el modelo de neumonía aguda en ratón y la inoculación nasal de Pseudomonas aeruginosa. Se administró mAb001-(D)-P297 por vía intravenosa a 2 mg/kg 12 horas antes de la infección. La carga bacteriana en los pulmones se midió después de 8 horas. Se observó una reducción significativa (>90%) de la carga bacteriana (P = 0,0047).
Ejemplo 19: Biodisponibilidad del conjugado anticuerpo-fármaco
Se estudió la biodisponibilidad de un ADC ejemplar en un modelo de ratón. Se usaron ratones C57/BL6, macho de 6 semanas de edad. Cada grupo incluía cuatro ratones. Se dosificaron mAb001 y mAb001-P297 a 5 mg/kg por inyección intravenosa. Los datos se recogieron 24 horas y 120 horas después de la administración. La IgG humana se cuantificó mediante ELISA.
Como se muestra en la FIG. 19, la biodisponibilidad del conjugado mAb001 fue comparable a la del mAb001.
Ejemplo 20: Estudio de glicanos fosforilados en LPS del núcleo
Los glicanos fosforilados representan un motivo clave y conservado en todas las cepas deP. aeruginosa.Se preparó LPS a partir de la cepa PAC557. El análisis por NMR reveló múltiples glicoformas, O-acetilación variable en el núcleo externo y unidades de L, D-mannoheptosa hiperfosforiladas.
Ejemplo 21: Efecto de los D-aminoácidos sobre la estabilidad de péptidos en suero
Se estudió el efecto de los D-aminoácidos sobre la estabilidad del péptido antimicrobiano en suero humano. En este estudio se usó un péptido antimicrobiano ejemplar, P297. P297 está relacionado con la familia Cathelicidin de AMP a-helicoidales. De acuerdo con la predicción de la estructura secundaria, P297 forma una a-hélice en un entorno hidrófobo. En la FIG. 33 se muestran los resultados del dicroísmo circular (CD). La alfa-hélice de la superficie de Pseudomonas se intercala en la membrana. (D)-P297 contiene todos los D-aminoácidos y (L)-P297 contiene todos los L-aminoácidos. (D)-P297 forma una hélice de giro hacia la derecha y (L)-P297 forma una hélice de giro hacia la izquierda. Los porcentajes de péptidos intactos restantes se midieron en ausencia de suero humano, o en presencia de 2%, 5% o 10% de suero humano, durante un periodo de 60 minutos. Como se muestra en las FIGS. 20-21, (L)-P297 se degradó rápidamente (y completamente bajo ciertas condiciones de prueba), y (D)-P297 fue considerablemente más estable que (L)-P297.
Ejemplo 22: Identificación de epítopos
El análisis Western de un gel de LPS reveló que mAb001 se une tanto al LPS de bajo MW como al de alto MW deP. aeruginosa,confirmando que el epítopo diana se encuentra en la región de núcleo del LPS y es accesible, incluso en cadenas largas y lisas de LPS. mAb0001 también se une fuertemente al LPS deP. aeruginosa,y no al LPS de E.colioK. pneumoniae,en ELISA. Basándose en el modelado computacional del sitio de unión del anticuerpo, se cree que mAb001 se dirige específicamente a la región de heptosa altamente fosforilada del LPS del núcleo deP. aeruginosa(FIG. 22).
Los datos de unión usando monosacáridos sintetizados químicamente apoyan fuertemente la unión de mAb001 a la Hep I hiperfosforilada.
Para los experimentos de unión se prepararon glicanos sintéticos a escala de mg. En la FIG. 23 se muestran las estructuras de los glicanos sintéticos. Se realizó un análisis de octeto para examinar la unión entre mAb001 y los glicanos sintéticos. Como se muestra en la FIG. 24, se observó una unión selectiva a los análogos más fosforilados. La cuantificación de las afinidades de unión se muestra en la FIG. 25.
En resumen, mAb001 se une a glicanos sintéticos con las siguientes afinidades de unión: Heptosa 2P >> Mañosa 2P >>> Heptosa 1P, Mañosa 1P, Heptosa, Mañosa. La K d aparente para el monosacárido Heptosa 2P es de aproximadamente 20 nM. Los resultados muestran una fuerte unión a un único componente monosacárido del LPS deP. aeruginosa.El glicano sintético Heptosa 2P se correlaciona con la unidad HepI del núcleo del LPS. Los cambios en la fosforilación de Hep1 hacen queP. aeruginosano sea viable. La unión correcta de Hep1 fosforilada a la maquinaria de transporte de LPS es esencial para la formación de la membrana externa (DeLucia et al. MBio.
2011;2(4). pii: e00142-11). La fosforilación está muy conservada enP. aeruginosay es poco probable que mute para provocar resistencia. Los resultados sugieren selectividad porque la hiperfosforilación no está presente en otros Gram negativos.
En la FIG. 26 también se describen enfoquesin silico,químicos y analíticos para la identificación de epítopos.
Ejemplo 23: Amplitud de vinculación y resistencia
Se realizó un ELISA de células enteras para evaluar la uniónin vitroa aislados clínicos de diversas regiones geográficas y múltiples sitios corporales. Una molécula de anticuerpo anti-LPS ejemplar, mAb001, se une a más de 100 aislados clínicos evaluados. En la FIG. 28 se muestran los cambios de veces con respecto a las cepas de control. Todas las uniones estaban dentro de la variabilidad del ensayo. Además, se demostró que mAb001 se une a todos los serotipos O deP. aeruginosa, avarias cepas mutantes de LPS y a cepas mucoides.
Se observó una baja frecuencia de resistencia con un péptido antimicrobiano ejemplar, P297, contraP. aeruginosaATCC 27853 (aproximadamente 10'8-10'1°).
En la Tabla 11 se muestra un resumen de las determinaciones de la tasa de resistencia. Usando el protocolo estándar, las tasas para P32 (GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK-NH2 (SEQ ID NO: 245) (Carboxamida en el extremo C-terminal)) y (L)-P297 a 2x MIC estaban en el intervalo de 10-8 a 10-9 y no se observó crecimiento a 4x MIC y por encima para ninguno de los compuestos. Usando el protocolo de micropuntos, las tasas se situaron entre 10-7 y 1°-9 para P32, (L)-P297 y (D)-P297 a todas las concentraciones probadas. Estas tasas se consideran favorables si se comparan con las tasas publicadas en el intervalo de 10-5 a 10-8. P297 presenta un desarrollo de resistencia equivalente o inferior en comparación con la colistina.
Tabla 11. R m n l rmin i n l r i n i l AMP emplares
Ejemplo 24: Unión a un epítopo conservado
Se probó la unión de una molécula de anticuerpo ejemplar, mAb°01, a cepas deP. aeruginosade tipo salvaje y mutante. Como se muestra en la FIG. 31A, mAb°01 se une de manera equivalente a las cepas de P.aeruginosade tipo salvaje y mutante. La unión a la cepa wapQ- muestra la capacidad de mAb°01 de unirse al LPS mínimo conservado deP. aeruginosa.La unión a la cepa galU- muestra la capacidad de mAb°01 para unirse al LPS de núcleo fosforilado de manera variable. Las cepas mutantes generalmente representan mecanismos de resistencia primarios empleados porP. aeruginosa.Por lo tanto, los resultados confirman la ausencia de resistencia preexistente a mAb°01.
Se probó la unión de un ADC ejemplar, mAb°01-P297, a cepas deP. aeruginosade tipo salvaje y mutante. Como se muestra en la FIG. 31B, el ADC se une de manera equivalente a las cepas deP. aeruginosade tipo salvaje y mutante. El ADC (mAb°01-P297) tiene una EC50 comparable a la molécula de anticuerpo (mAb°01) sola. Los resultados indican que la presencia de carga útil en el ADC no afecta a la unión a la diana.
Ejemplo 25: Evaluación de la similitud a fármacos
El mAb001 humanizado es próximo a las líneas germinales humanas con alto contenido de cadena humana. En la Tabla 12A se muestran los resultados para un mAb001 humanizado ejemplar.
T l 12A. m r i n n m l l m l r ni r ni-LP n lín rmin l h m n
El mAb001 humanizado también tiene características favorables de capacidad de desarrollo. La tasa de expresión en transfecciones transitorias es de >50 mg/ml. La Tm del Fab es de aproximadamente 65°C. Eluye como un solo pico en el perfil SEC. En la Tabla 12B se muestran resultados adicionales para un mAb001 humanizado ejemplar.
T l 12B. r rí i i rr ll n m l l m l r ni r ni-LP
Como se muestra en las FIGS.32A-32B, el mAb001 humanizado se acopla con FcyRIIa y C1q para la activación de la actividad opsonofagocítica (OPA) y la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Ejemplo 26: Efecto de los D-aminoácidos y los L-aminoácidos sobre las actividades peptídicas
Se compararon las versiones D- y L- de un AMP ejemplar (P297) en diferentes ensayos. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
(D)-P297 tiene un perfil MIC muy similar a (L)-P297. Estos péptidos son activos frente aPseudomonasyE. coli, perono son muy activos frente a S.aureusoK. pneumoniae.No se observó toxicidad con p297, independientemente de la "lateralidad". Ninguno de los compuestos mostró actividad hemolítica contra los glóbulos rojos. No se observó citotoxicidad contra las células 293T.
Como se muestra en la Tabla 14, (D)-297 mantuvo la actividad de eliminación dePseudomonasen suero. (D)-P297 y su conjugado mostraron una actividad letal equivalente o mejorada en suero humano.
Tabla 13. El efecto de los D-aminoácidos L-aminoácidos sobre las actividades de AMP
Tabla 14. Actividad de eliminación microbiana de D -P297 en suero
Ejemplo 27: Efecto sinérgico con antibióticos
Un péptido ejemplar, (D)-P297, mostró sinergia con dos clases de antibióticos contra P.aeruginosa.Como se muestra en la FIG.34A, al 50% de la MIC para (D)-P297, el valor de la MIC para colistina se redujo 32 veces. Como se muestra en la FIG. 34B, al 50% de la MIC para D-P297, el valor de la MIC para meropenem se redujo 16 veces. Ejemplo 28: Evaluación de la actividad de alteración de la membrana
Los liposomas DOPE/DOPG representan membranas bacterianas modelo. Como se muestra en la FIG. 35A, (D)-P297 alteró la bicapa lipídica de forma dependiente de la concentración y del tiempo.
Como se muestra en la FIG. 35B, tanto (D)-P297 como (L)-P297 solas indujeron la fuga de calceína de una manera dependiente de la concentración y del tiempo. Los resultados indican un mecanismo de alteración de la membrana que no requiere interacción con componentes quirales como proteínas transmembrana. La conjugación alteró ciertas propiedades bactericidas del péptido antimicrobiano. La funcionalidad de direccionamiento de mAb001 puede ser importante para la actividad de ADC observada contraP. aeruginosa.
Ejemplo 29: Optimización de péptidos
Se diseñaron análogos de (D)-P297 para mejorar las propiedades biofísicas de la carga útil. En la FIG. 36 se muestran análogos ejemplares.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un conjugado de molécula de anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende una molécula de anticuerpo anti-LPS y un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente, en donde la molécula de anticuerpo comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende: (a) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; o bien (b) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142, y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 112; y (iii) un motivo de sulfatasa modificado que tiene la fórmula X1(FGly')X2Z2XaZa donde FGly' tiene la fórmula:
    en donde J<1>es el péptido antimicrobiano acoplado covalentemente; cada L<1>es una fracción divalente seleccionada independientemente entre alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, alquinileno, alquinileno, arileno, arileno sustituido, cicloalquileno, cicloalquileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, heterocicleno, heterocicleno sustituido, acilo, amido, aciloxi, uretanileno, tioéster, sulfonilo, sulfonamida, éster de sulfonilo, -O-, -S-, -NH- y amina sustituida; n es un número seleccionado entre cero y 40; Z<2>es un residuo de prolina o alanina; X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa está en un extremo N-terminal del polipéptido, X<1>está presente; X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y Z<3>es un aminoácido básico; y en donde el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos de GGGKFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF (SEQ ID NO: 156).
  2. 2. El ADC de la reivindicación 1, en donde: (i) la molécula de anticuerpo presenta el péptido antimicrobiano acoplado covalentemente en una superficie accesible al solvente cuando se encuentra en estado plegado; (ii) el motivo de sulfatasa modificado es un motivo de sulfatasa modificado heterólogo; (iii) el motivo de sulfatasa modificado comprende o consiste en<12>o menos (por ejemplo,<11>o menos,<10>o menos, 9 o menos,<8>o menos, 7 o menos, o<6>o menos) residuos de aminoácidos; (iv) el motivo de sulfatasa modificado se localiza en el ADC en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, o un lazo accesible por solvente de la molécula de anticuerpo; (v) el motivo de sulfatasa modificado se localiza en una cadena pesada (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo; (vi) el motivo de sulfatasa modificado se localiza en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3), por ejemplo, en un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de la cadena pesada; (vii) el motivo de sulfatasa modificado se localiza en una cadena ligera (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo; (viii) el motivo de sulfatasa modificado se localiza en una región constante de una cadena ligera, por ejemplo, en un extremo terminal (por ejemplo, el extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera; y/o (ix) el ADC comprende una pluralidad de motivos de sulfatasa modificados, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>o más) motivos de sulfatasa modificados, opcionalmente en donde: (a) los motivos de sulfatasa modificados se localizan en una cadena pesada (o un fragmento de la misma), una cadena ligera (o un fragmento de la misma), o ambas, de la molécula de anticuerpo; (b) los motivos de sulfatasa modificados se localizan en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una o más de CH1, CH2, o CH3), una región constante de la cadena ligera, o ambas; (c) el ADC comprende dos o más cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado; y/o (d) el ADC comprende dos o más cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado.
  3. 3. El ADC de la reivindicación 1 o 2, en donde: (i) Z<3>es arginina (R); (ii) X<1>, cuando esté presente, X<2>, y X<3>son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar no cargado; y/o (iii) X<1>, cuando esté presente, es L, M, V, S o T; y/o (iv) X<2>y X<3>son cada uno independientemente S, T, A, V, G o C.
  4. 4. Una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehido que comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende: (a) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; o (b) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; y (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142, y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 112; y (iii) un motivo de sulfatasa que tenga una secuencia de aminoácidos de: X<1>Z<1>X<2>Z<2>X<3>Z<3> donde Z<1>es un residuo de cisteína, serina o<2>-formilglicina; Z<2>es un residuo de prolina o alanina; X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa heteróloga está en un extremo N-terminal del polipéptido marcado con aldehído, X<1>está presente; y X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y Z<3>es un aminoácido básico.
  5. 5. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 4, en donde: (i) la molécula de anticuerpo es capaz de presentar un péptido antimicrobiano acoplado covalentemente en una superficie accesible al solvente cuando se encuentra en estado plegado; (ii) el motivo de sulfatasa es un motivo de sulfatasa heterólogo, y/o un motivo de sulfatasa no modificado o un motivo de sulfatasa modificado; (iii) el motivo de sulfatasa comprende o consiste en 12 o menos (por ejemplo, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos,<8>o menos, 7 o menos, o<6>o menos) residuos de aminoácidos; (iv) el motivo de sulfatasa está localizado en el ADC en un extremo N-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, un extremo C-terminal de una cadena de molécula de anticuerpo, o un lazo accesible por solvente de la molécula de anticuerpo; (v) el motivo sulfatasa está localizado en una cadena pesada (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo; (vi) el motivo de sulfatasa está localizado en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3), por ejemplo, en un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de la cadena pesada; (vii) el motivo de sulfatasa está localizado en una cadena ligera (o un fragmento de la misma) de la molécula de anticuerpo; (viii) el motivo de sulfatasa está localizado en una región constante de una cadena ligera, por ejemplo, en un extremo terminal (por ejemplo, extremo C-terminal) de la región constante de la cadena ligera; (ix) la molécula de anticuerpo comprende una pluralidad de motivos de sulfatasa, por ejemplo, dos o más (por ejemplo, 3, 4, 5,<6>, 7,<8>, o más) motivos de sulfatasa modificados, opcionalmente en donde: (a) los motivos de sulfatasa están localizados en una cadena pesada (o un fragmento de la misma), una cadena ligera (o un fragmento de la misma), o ambas, de la molécula de anticuerpo; (b) los motivos de sulfatasa están localizados en una región constante de la cadena pesada (por ejemplo, una o más de CH1, CH2, o CH3), una región constante de la cadena ligera, o ambas; (c) la molécula de anticuerpo comprende dos o más cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende un motivo sulfatasa; y/o (d) la molécula de anticuerpo comprende dos o más cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende un motivo de sulfatasa modificado; (x) Z<3>es arginina (R); (xi) X<1>, cuando está presente, X<2>, y X<3>son cada uno independientemente un aminoácido alifático, un aminoácido que contiene azufre, o un aminoácido polar no cargado; y/o (xii) X<1>, cuando está presente, es L, M, V, S o T, opcionalmente en donde X<2>y X<3>son cada uno independientemente S, T, A, V, G, o C. <6>.
  6. Un método para producir un ADC que comprende poner en contacto una molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehído y un péptido antimicrobiano en condiciones que permitan que se produzca una reacción entre un aldehído de la molécula de anticuerpo y un grupo reactivo del péptido antimicrobiano, produciendo de este modo el ADC; en donde la molécula de anticuerpo comprende: (i) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende: (a) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 108, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 146, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; o (b) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 105, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106, y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107; (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende: una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 142, y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 112; y (iii) un motivo de sulfatasa que tiene una secuencia de aminoácidos de: X<1>Z<1>X<2>Z<2>X<3>Z<3> donde Z<1>es un residuo de cisteína, serina o 2-formilglicina; Z<2>es un residuo de prolina o alanina; X<1>está presente o ausente y, cuando está presente, es cualquier aminoácido, con la salvedad de que cuando el motivo de sulfatasa heteróloga está en un extremo N-terminal del polipéptido marcado con aldehido, X<1>está presente; y X<2>y X<3>son cada uno independientemente cualquier aminoácido; y Z<3>es un aminoácido básico; y en donde el péptido antimicrobiano comprende la secuencia de aminoácidos de GGGKFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF (SEQ ID NO: 156).
  7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde: (i) la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido comprende un residuo de 2-formil-glicina (por ejemplo, FGly' en (ii) el péptido antimicrobiano comprende un grupo reactivo aminooxi o hidrazida; (iii) el método comprende combinar en una mezcla de reacción la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido y el péptido antimicrobiano; (iv) el péptido antimicrobiano se pone en contacto con la molécula de anticuerpo, o se proporciona en una mezcla de reacción, en una cantidad suficiente para proporcionar una proporción deseada de péptido antimicrobiano a molécula de anticuerpo, por ejemplo, la proporción de aproximadamente 1:1,2:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1, 8:1, o más; (v) la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido y el péptido antimicrobiano se acoplan mediante la ligación Hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS) o mediante conjugación con oximas e hidrazidas seguido de reducción; (vi) el método comprende además aislar (por ejemplo, purificar) el ADC, por ejemplo, a partir de una mezcla de reacción; y/o (vii) la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido se pliega antes de que la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido entre en contacto con el péptido antimicrobiano (por ejemplo, antes de que la molécula de anticuerpo etiquetada con aldehido se combine con el péptido antimicrobiano en una mezcla de reacción).
  8. 8. Una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el ADC de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  9. 9. Una mezcla de reacción que comprende el ADC de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  10. 10. Un ADC de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una composición farmacéutica que comprende un ADC de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una infección bacteriana o trastorno relacionado, opcionalmente, en donde la infección bacteriana: (i) está asociada con una bacteria Gram negativa; (ii) es una infecciónpor Pseudomonas;y/o (iii) está asociada aPseudomonas aeruginosa.
  11. 11. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de anticuerpo anti-LPS etiquetada con aldehido de la reivindicación 4 o 5.
  12. 12. El ADC de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de (a) conjugación con lisina (por ejemplo, usando una lisina expuesta a la superficie como grupo reactivo del anticuerpo); (b) disulfuros entre cadenas (por ejemplo, usando disulfuros que enlazan HC-HC o HC-LC); (c) un aminoácido no nativo (por ejemplo, un aminoácido sustituido con aldehido, azida o alquino); o (d) un polimero biodegradable (por ejemplo, lisina o tiol), opcionalmente, en donde el péptido antimicrobiano se acopla a la molécula de anticuerpo a través de: (i) conjugación con lisina, y en donde la molécula de anticuerpo se conjuga directamente con un aminoácido activado en el péptido antimicrobiano; (ii) conjugación con lisina, y en donde una lisina en la molécula de anticuerpo se convierte en un grupo reactivo tiol y la molécula de anticuerpo con el grupo reactivo tiol se liga a un péptido antimicrobiano tiolado; (iii) conjugación con lisina, y en donde una lisina de la molécula de anticuerpo se convierte en un tiol libre y la molécula de anticuerpo con el tiol libre se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol; (iv) disulfuros entre cadenas, y en donde los disulfuros entre cadenas de la molécula de anticuerpo se reducen y la molécula de anticuerpo con los disulfuros entre cadenas reducidos se liga a un péptido antimicrobiano reactivo al tiol; (v) un aminoácido no nativo, y en donde la molécula de anticuerpo se liga al péptido antimicrobiano usando química de clic; o (vi) un polímero biodegradable, y en donde el péptido antimicrobiano se liga a un polímero biodegradable y el polímero se liga a la molécula de anticuerpo.
  13. 13. Una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el ADC de la reivindicación 12.
  14. 14. Un ADC de la reivindicación 12, o una composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en un método para tratar o prevenir una infección bacteriana o trastorno relacionado.
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