ES2987237T3 - Biomarcadores de lesión cerebral traumática grave - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un método para diagnosticar y/o monitorear una lesión cerebral traumática (LCT) en un sujeto, comprendiendo el método determinar un nivel de al menos un miRNA en una muestra de fluido obtenida del sujeto, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde el al menos un miRNA comprende miR-335. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de lesión cerebral traumática grave
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones, kits, sistemas y métodos para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI, por sus siglas en inglésTraumatic Brain Injury).Más particularmente, la presente invención se refiere al diagnóstico y seguimiento de la TBI utilizando biomarcadores de miARN.
Antecedentes de la invención
La lesión cerebral traumática (TBI) es la principal causa de muerte y discapacidad en menores de 45 años en los países occidentales. Se espera que su carga sanitaria y sus costes sociales sigan aumentando y, para 2020, la Organización Mundial de la Salud prevé que la TBI se convertirá en la tercera causa principal de discapacidad en todo el mundo.
A pesar de muchos estudios, no se han encontrado biomarcadores fiables para evaluar la gravedad de la TBI y predecir la recuperación. Esto es especialmente cierto para la TBI leve (mTBI, por sus siglas en inglésmild TBI),que actualmente sigue siendo difícil de evaluar en la práctica clínica. Aunque los pacientes con TCE se evalúan inicialmente mediante la puntuación de coma de Glasgow (Glasgow Coma Score, GCS) y técnicas de neuroimagen, que requieren equipos costosos, las herramientas de diagnóstico actuales carecen de la capacidad de definir y cuantificar con precisión la gravedad real de la lesión cerebral, lo que conduce a una fácil detección de las lesiones graves, pero no de las lesiones cerebrales múltiples, que representan la gran mayoría de los casos (75-90%).
El diagnóstico correcto de la mTBI es particularmente importante en pacientes, tales como atletas, soldados y niños, que tienen un mayor riesgo de mTBI repetitiva y una forma catastrófica de lesión cerebral conocida como síndrome del segundo impacto (SIS) donde los efectos sinérgicos de la TBI repetida producen daños profundos e incluso la muerte. Por lo tanto, el diagnóstico temprano y la evaluación de la gravedad de la TBI se vuelven cruciales para el bienestar de los pacientes y, en última instancia, para salvarles la vida.
La búsqueda de biomarcadores de TBI ha recibido un impulso significativo por la mayor importancia de la conmoción cerebral deportiva en los medios. En los últimos años, muchos estudios se han centrado en biomarcadores que pueden respaldar la toma de decisiones clínicas en el campo o en una clínica deportiva. Sin embargo, los biomarcadores de proteínas descritos en la bibliografía carecen de especificidad o sensibilidad, o no son detectables durante algún tiempo después de la lesión. Esto puede deberse al hecho de que después de una conmoción cerebral, que es una forma de TBI, los compuestos derivados del cerebro se liberan solo en cantidades muy pequeñas y la barrera hematoencefálica permanece mayoritariamente cerrada.
Los microARN (miARN) son una clase abundante de moléculas de ARN no codificantes altamente conservadas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que inducen la degradación del ARNm, la represión traduccional o ambas por medio del emparejamiento con sitios parcialmente complementarios en la 3'UTR de los genes diana. El genoma humano codifica más de 2000 miARN, que pueden dirigirse a aproximadamente el 60% de todos los genes. Sin embargo, a pesar de la abundancia de miARN, sus funciones biomoleculares y su participación en la patología todavía no se han dilucidado por completo. Desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos, incluido el ciclo celular, metabolismo celular, apoptosis y respuestas inmunitarias, y están atrayendo un interés cada vez mayor en la investigación clínica como posibles biomarcadores para la detección, identificación y clasificación de cánceres y otras enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas.
La presente invención se ideó teniendo estas cuestiones en mente.
La publicación internacional WO 2015/196191 describe biomarcadores de microARN para lesión cerebral traumática y métodos de uso de los mismos. La publicación internacional WO 2015/164431 describe métodos, procedimientos, dispositivos y kits para la medición de biomarcadores de microARN del trastorno de estrés postraumático. La publicación internacional WO 2015/134551 describe marcadores de microARN para el diagnóstico de una afección neurológica. El documento US 2015/0344954 describe métodos mínimamente invasivos para detectar, diagnosticar y evaluar el daño neuronal asociado con una lesión cerebral traumática (TBI) o encefalopatía traumática crónica (CTE). El "Manual de usuario del kit de detección de RT-PCR en tiempo real hsa-miR-335", n.° de catálogo MBS825516 de MyBioSource proporciona un método de uso de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de miARN, incluido miR-335.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
La presente descripción se refiere a un método para diagnosticar o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, en donde la TBI es una TBI grave (sTBI, por sus siglas en ingléssevere TBI),comprendiendo el método detectar la presencia de y/o determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido del sujeto, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde al menos un miARN (también denominado en el presente documento "miR") comprende miR-335.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar el nivel de al menos un miARN adicional, en donde el al menos un miARN adicional (también denominado en el presente documento "miR") se puede seleccionar del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p; miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629. Estos miARN pueden denominarse en el presente documento miARN de interés o miARN diana.
En algunas realizaciones, el al menos un miARN adicional se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p. Se ha descubierto que estos microARN son biomarcadores expresados en todos los pacientes con TBI (leve o grave).
En algunas realizaciones, el al menos un miARN adicional se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-let-7g.
En algunos ejemplos de referencia, el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p y miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
En algunos ejemplos de referencia, el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.
Para evitar dudas, se entenderá que "el al menos un miARN se selecciona de un grupo de miARN", como se usa en el presente documento, significa que el método en cuestión, ya sea que se lleve a cabo para un fin de diagnóstico, pronóstico o terapéutico, se puede llevar a cabo con uno cualquiera de los miARN indicados o con cualquier pluralidad de los miARN indicados (p. ej., dos, tres, cuatro o más de los miARN enumerados). De ello se deduce que uno cualquiera o más de los miARN indicados pueden excluirse explícitamente (es decir, con la condición de que el miARN indicado comprenda miR-335).
Según un aspecto de la invención, se proporciona un método para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática grave (sTBI) en un sujeto, comprendiendo el método determinar un nivel de al menos un miARN en un muestra del sujeto, en donde el miARN comprende miR-335. En una realización, el método comprende además determinar el nivel de al menos un miARN adicional que se selecciona del grupo que consiste en: miR-425-5p; miR-502; y miR-21.
La lesión cerebral traumática ocurre cuando una fuerza externa daña de forma traumática el cerebro. Existen diferentes sistemas para clasificar la TBI basados, por ejemplo, en la gravedad, el tipo de lesión y el pronóstico. El sistema más comúnmente utilizado para clasificar la<t>B<i>es la Escala de Coma de Glasgow (GCS), que clasifica el nivel de conciencia de una persona en una escala de 3-15 basada en reacciones verbales, motoras y de apertura de ojos ante estímulos. En general, una TBI con una puntuación de GCS de 13 o más se define como leve, de 9-12 como moderada y de 8 o menos como grave. Otro sistema, el Sistema de Clasificación de Mayo, tiene tres clasificaciones principales que incluyen TBI moderada-grave definida, TBI leve probable y TBI posible. Se utilizan múltiples criterios en cada diagnóstico, incluyendo la pérdida del conocimiento, amnesia postraumática, fractura de cráneo y evidencia de anomalías neurorradiológicas que incluyen hematoma subdural, contusión cerebral y contusión hemorrágica. Los expertos en la técnica conocerán la clasificación de la TBI utilizando los sistemas de GCS o Mayo.
Como se utiliza en el presente documento, las referencias a TBI "leve", "moderada" y "grave" se hacen de acuerdo con la GCS. Las referencias en el presente documento a TBI "moderada a grave" abarca TBI tanto moderada como grave de acuerdo con la GCS.
Se espera que el diagnóstico y/o seguimiento de la TBI utilizando los biomarcadores de la presente invención respalde la toma de decisiones clínicas y los regímenes de tratamiento en una variedad de contextos, incluidas las siguientes situaciones: como parte de la evaluación inicial por paramédicos para determinar si los pacientes deben ser transportados a un centro con experiencia en neurocirugía, un centro de traumatología principal o una unidad de traumatología local; en el servicio de urgencias de los hospitales para determinar el tratamiento adecuado, incluida la necesidad de una exploración por CT del cerebro; en el campo, para ayudar en la toma de decisiones sobre la retirada de un jugador del juego y la evaluación de la necesidad de llevar a un jugador al hospital; en clínicas deportivas, para confirmar un suceso de conmoción cerebral y permitir la toma de decisiones con respecto al regreso al juego; en situaciones de combate, para determinar la necesidad de enviar un equipo de rescate y evacuar a una víctima. Por lo tanto, los sujetos para quienes la presente invención proporciona un beneficio particular incluyen víctimas de accidentes, deportistas y personal militar. En cualquier caso, pero quizás particularmente cuando el sujeto tiene un mayor riesgo de sufrir una TBI (p. ej., cuando el sujeto es un atleta profesional o está alistado en el ejército), se puede obtener una muestra del sujeto en un momento anterior a cualquier traumatismo conocido o reciente (p. ej., cerca del comienzo de una carrera deportiva o antes de un despliegue militar) y se puede evaluar cualquier miARN de interés en ese momento o más tarde, cuando el sujeto haya experimentado una TBI posible. De este modo, dichas muestras pueden proporcionar un patrón de referencia interno.
En algunas realizaciones, el sujeto es humano.
La TBI puede ser una TBI grave (sTBI). En algunas realizaciones, la TBI es una TBI de moderada a grave (msTBI).
El nivel del miARN o de cada miARN en la muestra se puede determinar de forma cuantitativa o semicuantitativa. Por "cuantitativamente", se entenderá que se determina la cantidad o concentración absoluta del miARN o de cada miARN en la muestra. La cantidad absoluta del miARN o de cada miARN en la muestra se puede comparar luego con un umbral predeterminado (p. ej., un valor publicado en la bibliografía para niveles normales esperados), un nivel conocido del mismo miARN o uno de referencia en una muestra de control tomada de un sujeto sano, o la cantidad de un miARN de referencia en la muestra tomada del sujeto. En algunas realizaciones, se diagnostica al sujeto que tiene una TBI cuando el nivel del miARN está por debajo del umbral predeterminado, o disminuye con respecto a una muestra de referencia o de control. En otras realizaciones, se diagnostica al sujeto que tiene una TBI cuando el nivel del miARN aumenta en comparación con el umbral predeterminado.
Por "semicuantitativamente", se entenderá que el nivel del o cada miARN de interés se mide con respecto a una referencia.
La referencia puede ser un miARN invariante, es decir, un miARN que tiene un nivel de expresión que permanece sustancialmente sin cambios entre sujetos sanos y aquellos que tienen una TBI. Se puede diagnosticar a un sujeto que padece una TBI si el nivel del miARN o de cada miARN de interés aumenta o disminuye con respecto al de un miARN invariante. Los miARN invariantes adecuados incluyen miR-331, miR-223*, miR-23a-3p y miR148b-3p. miR-23a-3p y miR148b-3p son invariantes sólo en la saliva.
En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN en la muestra obtenida del sujeto puede ser de aproximadamente 0,01 veces a aproximadamente 100 veces, de aproximadamente 0,05 veces a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 0,1 veces a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3 veces, o de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 2,0 veces menor o mayor que el nivel en la muestra de control, el nivel de referencia o el valor publicado.
Cuando se emplea un dispositivo o método para generar un valor, podemos calificar ese valor con el término "aproximadamente" con el fin de capturar el valor indicado y cualquier variación de ese valor inherente al dispositivo o método empleado. Cuando se describen específicamente valores o intervalos de valores, "aproximadamente" puede significar más o menos 10% del valor o intervalo indicado. Por ejemplo, aproximadamente 10 minutos puede significar 9-11 minutos.
El nivel del miARN o de cada miARN de interés se puede determinar usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, determinar el nivel del miARN o de cada miARN de interés comprende amplificar el miARN. En algunas realizaciones, el miARN total se puede aislar primero de la muestra usando técnicas convencionales, por ejemplo usando el mini kit miRNeasy (Qiagen). Luego se puede determinar la cantidad de miARN de interés. En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra se determina mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Por ejemplo, se puede usar PCR cuantitativa para la determinación cuantitativa del nivel del miARN o de cada miARN de interés. La PCR también se puede utilizar para la determinación semicuantitativa, comparando el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra con el de una referencia (p. ej., un miARN invariante).
Las técnicas adecuadas para la detección y/o cuantificación de miARN, que serán conocidas por los expertos en la técnica, incluyen qPCR, ensayos de miARN, secuenciación de nueva generación (NGS) y ensayos de perfiles de miARN múltiplex.
En algunas realizaciones, el nivel del miARN o de cada miARN de interés se determina usando hibridaciónin situ,por ejemplo usando una sonda (p. ej., una sonda marcada) específica para el miARN.
El nivel de miARN se puede determinar en una muestra que se obtuvo del sujeto inmediatamente después de la lesión (es decir, menos de 1 hora después de la lesión), y/o en una muestra obtenida en uno o más puntos temporales unas pocas horas o días después de la lesión. Por lo tanto, se pueden detectar los cambios en el nivel de miARN a lo largo del tiempo para permitir el seguimiento de una TBI. En el caso de que los niveles de miARN cambien a lo largo del tiempo, los métodos descritos en el presente documento para el seguimiento de la TBI se pueden ampliar para incluir el mantenimiento o ajuste del régimen de tratamiento del sujeto en consecuencia.
Dependiendo del miARN específico y el tipo de TBI, el nivel de miARN en el sujeto puede cambiar significativamente a lo largo del tiempo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, puede ser ventajoso medir el miARN relativamente pronto después de la lesión para permitir un diagnóstico preciso. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión.
El nivel de algunos miARN es sustancialmente estable a lo largo del tiempo, lo que permite realizar un diagnóstico unas pocas horas, días o incluso semanas después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto hasta 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 o 2 días desde la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto inmediatamente después de la lesión (p. ej., en T= 0 h), 4-12 horas después de la lesión, 48-72 horas después de la lesión o 15 días después de la lesión.
En algunas realizaciones, la TBI es TBI de moderada a grave (m-sTBI) y el al menos un miARN comprende miR-335, y opcionalmente al menos un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p.
En algunos ejemplos de referencia, la TBI es TBI leve (mTBI) y el miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-425-5p y miR-502. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene mTBI si se determina que el nivel de miR-425-5p y/o miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia.
En algunos ejemplos de referencia, un nivel de miR-425-5p y/o miR-502 que está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia, es diagnóstico de mTBI cuando el nivel se determina en una muestra obtenida menos de 48 horas después de la lesión.
En algunas realizaciones, la TBI es TBI de moderada a grave (m-sTBI) y el miARN es miR-335 (opcionalmente miR-335 y miR-21). Se puede diagnosticar que el sujeto tiene una TBI de moderada a grave si se determina que el nivel de miR-335 (y opcionalmente miR-335 y miR-21) está por encima de un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia.
En algunas realizaciones, un nivel de miR-335 (opcionalmente miR-335 y miR-21) que está por encima de un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia, es diagnóstico de TBI de moderada a grave cuando el nivel se determina en una muestra obtenida hasta 15 días después de la lesión.
En algunos ejemplos de referencia, la TBI es TBI de moderada a grave (m-sTBI) y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene msTBI si se determina que el nivel de miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642 y/o miR-99a está por encima un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene m-sTBI si se determina que el nivel de miR-192, miR-429, miR-520D-3p y/o miR-629 está por debajo de un umbral predeterminado, o disminuido con respecto a una referencia.
Los miARN se pueden usar individualmente para diagnosticar TBI. Por ejemplo, en una conmoción cerebral deportiva, se podrían utilizar miR-502 o miR-425-5p para confirmar que se ha producido una lesión cerebral traumática.
Por lo tanto, también se describe en el presente documento un método para determinar la gravedad de la TBI, y las etapas de este método se pueden repetir para el seguimiento del sujeto a lo largo del tiempo. Se apreciará que un resultado positivo para un único miARN (p. ej., se determina que el nivel de un único miARN está por encima/por debajo de un umbral predeterminado o aumentado/disminuido con respecto a una referencia) es suficiente para determinar la gravedad de la TBI. Por ejemplo, si el nivel de miR-425-5p está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia, se determina que la gravedad de la TBI es leve (mTBI). Sin embargo, puede resultar conveniente combinar diferentes miARN (p. ej., en un panel de ensayo) para facilitar la evaluación de la gravedad de la TBI.
En algunas realizaciones, el método comprende determinar un nivel de una pluralidad (p. ej., dos o más) miARN en la muestra. En algunas realizaciones, los dos o más miARN se seleccionan del grupo que consiste en: miR-425-5p; miR-502; miR-21; y miR-335.
En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de:
(i) un primer miARN seleccionado de miR-425-5p y miR-502; y
(ii) un segundo miARN que es miR-335.
Se puede diagnosticar que un sujeto tiene una TBI si se determina que el nivel de miR-425-5p o miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido con respecto a una referencia, o el nivel de miR-21 o miR-335 se determina que está por encima de un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia.
En algunos ejemplos la TBI es TBI leve (mTBI) y el al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miRmmiR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p, y miR-652-3p, o una combinación de los mismos. Se puede diagnosticar que el sujeto tiene mTBI si hay un cambio de al menos 0,5, al menos 1,0, al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0 veces en el nivel de la microARN comparado con una referencia. En algunas realizaciones, se diagnostica que el sujeto tiene mTBI si el(los) nivel(es) de microARN está(n) aumentado(s) en comparación con una referencia.
Las secuencias y números de acceso para los miARN descritos en el presente documento se proporcionan en la Tabla 1:
Tabla 1
En la presente invención, la muestra es una muestra de fluido, en donde la muestra de fluido comprende suero. También se describe en el presente documento, en algunos ejemplos o ejemplos de referencia, que la muestra puede ser cualquier muestra de tejido o fluido apropiado obtenida del sujeto. Por ejemplo, la muestra biológica puede comprender al menos una del grupo que consiste en: orina, saliva, sangre entera, plasma, suero, esputo, semen, heces, un hisopo nasal, lágrimas, un hisopo vaginal, un hisopo rectal, un frotis cervical, una biopsia de tejido y un hisopo uretral. De manera adecuada, la muestra es una que se puede obtener fácilmente del individuo, tal como orina, saliva, sangre y esputo. En la presente invención, la muestra comprende suero. Se apreciará que en algunas realizaciones el proceso de obtención de la muestra no forma parte de la invención descrita en el presente documento.
En la presente invención, la muestra comprende o está constituida por suero. El suero no sólo tiene ventajas prácticas, sino que también está exento de anticoagulantes tales como heparina, un potencial inhibidor de las reacciones de PCR. El suero también puede estar menos afectado por la hemólisis en comparación con el plasma.
En algunos ejemplos de referencia, la muestra es saliva. La saliva se puede obtener fácilmente del paciente (p. ej., en el campo o sobre el terreno), sin necesidad de formación especializada ni equipo médico. Los miARN que se ha descubierto que son indicativos de mTBI en la saliva incluyen: hsa-let-7ca-5p, hsa-let-7i-5p, hsamiR-1421-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsamiR-20b-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b se selecciona del grupo que consiste en -5p; miR-324-5p; y miR-652-3p.
Se pueden usar niveles de miARN para realizar el seguimiento de la recuperación de un sujeto de una lesión. Por lo tanto, la presente invención abarca el seguimiento de la recuperación de un sujeto de la TBI, como alternativa o además del diagnóstico inicial.
En algunas realizaciones, el método comprende hacer el seguimiento de la TBI y el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 10 o al menos 14 días después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto 15 días después de la lesión. En algunas realizaciones, el nivel de al menos un miARN se determina en al menos dos muestras obtenidas en diferentes intervalos de tiempo después de la lesión, permitiendo así seguir la recuperación. Por ejemplo, los niveles de miARN podrían determinarse a los 7 y 14 días después de la lesión, o a los 5, 10 y 15 días después de la lesión. Un retorno de los niveles de miARN a la normalidad puede ser indicativo de la recuperación del sujeto de la TBI.
En algunos ejemplos de referencia, se determina que un sujeto se ha recuperado de la mTBI si el nivel de miR-425-5p y/o miR-502 ya no está por debajo de un umbral predeterminado o ya no está disminuido con respecto a una referencia.
En algunas realizaciones, se determina que un sujeto se ha recuperado de la TBI de moderada a grave si el nivel de miR-335 (opcionalmente miR-335 y miR-21) ya no está por encima de un umbral predeterminado o ya no está aumentado respecto a una referencia.
El diagnóstico de un sujeto que sufre una TBI, y en particular el diagnóstico de una TBI leve o una TBI de moderada a grave, puede facilitar la determinación de un tratamiento apropiado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un ensayo que permite a los trabajadores de la salud, tales como médicos, clínicos, paramédicos e incluso personal no médico (p. ej., profesores, entrenadores deportivos, personal militar) decidir sobre la acción apropiada para un sujeto que se sospecha que tiene una TBI. Por lo tanto, un sujeto que se ha determinado que tiene una TBI puede recibir el tratamiento más adecuado como resultado de que se ha hecho un diagnóstico. Por lo tanto, también se describe en el presente documento un método para dirigir la terapia adecuada a un sujeto diagnosticado de una TBI.
Un sujeto diagnosticado de TBI puede ser evaluado adicionalmente, p. ej., mediante exploración por CT. En algunas realizaciones, el sujeto ingresa en un hospital. En algunas realizaciones, si se puede descartar la TBI de moderada a grave, es posible que no sea necesario ingresar al sujeto en el hospital para su evaluación. Un sujeto diagnosticado de TBI de moderada a grave puede ser ingresado en un hospital o en un centro especializado con experiencia en neurotrauma.
Un sujeto diagnosticado de una TBI (particularmente mTBI) fuera de un entorno hospitalario, por ejemplo, en un evento deportivo, durante un combate o durante un juego, puede ser retirado del juego o del combate inmediatamente. El sujeto posteriormente puede empezar con un regreso gradual al juego o al combate.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para determinar si es apropiado administrar a un sujeto una terapia para aliviar la TBI, comprendiendo el método:
determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto; y
determinar si es apropiado o no administrar una terapia para aliviar la TBI, basándose en el nivel de al menos un miARN.
Se apreciará que la etapa de administrar la terapia al sujeto no forma parte del método reivindicado, a menos que se indique específicamente.
También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un método que comprende administrar al sujeto un tratamiento apropiado. En algunos ejemplos, el tratamiento puede comprender una terapia para aliviar la TBI. Por consiguiente, la descripción presenta métodos para diagnosticar y tratar la TBI en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de (a) obtener una muestra (p. ej., una muestra de sangre, plasma, orina o saliva) del sujeto; (b) detectar uno o más miARN (seleccionados de los descritos en el presente documento); diagnosticar que el paciente tiene una TBI cuando el(los) nivel(es) de miARN difiere(n) de un patrón de referencia (como se describe en el presente documento); y administrar un tratamiento para la TBI.
También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para determinar un tratamiento apropiado para un sujeto que se sospecha que sufre una TBI, comprendiendo el método identificar si el sujeto tiene o no una TBI determinando un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto.
Si se identifica que un sujeto tiene una TBI, un tratamiento apropiado puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo mediante pruebas adicionales (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), exploración por CT y/o MRI; retirar al sujeto de la actividad (p. ej., la actividad durante la cual se produjo la TBI); ingresar al sujeto en un hospital o una clínica especializada; cirugía; y administrar una terapia para aliviar la TBI al sujeto.
La terapia para aliviar la TBI puede incluir fármacos neuroprotectores, p. ej., fármacos para tratar la inflamación cerebral tales como manitol y solución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tales como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.
En algunas realizaciones, posteriormente se puede hacer un seguimiento de la recuperación del paciente, por ejemplo, en un hospital o clínica.
También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para detectar y/o determinar un nivel de un miARN diana en un sujeto, comprendiendo el método las etapas de (a) obtener una muestra del sujeto; y (b) detectar y/o determinar el nivel del miARN diana en la muestra poniendo en contacto la muestra con una sonda que es específica para el miARN diana.
La muestra puede ser cualquier muestra de tejido o fluido apropiado obtenida del sujeto, como se define anteriormente. En algunas realizaciones, la muestra es sangre, suero, plasma, orina o saliva.
El método puede comprender determinar el nivel de dos o más miARN diana en la muestra. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un fármaco neuroprotector o un sedante para usar en un método para tratar a un sujeto que lo necesita, en donde se identifica que dicho sujeto tiene una sTBI determinando un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde el al menos un miARN comprende miR-335.
La etapa de determinar el nivel del miARN diana puede comprender poner en contacto la muestra con un sustrato funcionalizado con la sonda, por ejemplo, un chip que comprende la sonda. El sustrato o chip puede incluir convenientemente múltiples sondas, cada una específica para un miARN diana diferente.
El sujeto puede haber sufrido una lesión, en particular una lesión en la cabeza. Se puede sospechar que el sujeto tiene una TBI. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión.
En algunas realizaciones, el método comprende además tratar al sujeto. El tratamiento puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo mediante pruebas adicionales (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), exploración por CT y/o MRI; retirar al sujeto de la actividad (p. ej., la actividad durante la cual se produjo la TBI); ingresar al sujeto en un hospital o una clínica especializada; y administrar una terapia para aliviar la TBI al sujeto. En algunos ejemplos de referencia, el tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de un fármaco neuroprotector.
También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para tratar la TBI, comprendiendo el método:
determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto; y
si el nivel del al menos un miARN es indicativo de mTBI, administrar un tratamiento apropiado para la mTBI; o
si el nivel del al menos un miARN es indicativo de m-sTBI, administrar un tratamiento apropiado para la msTBI.
Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar diferentes vías de tratamiento para la mTBI y msTBI.
Un tratamiento apropiado para la mTBI puede incluir: retirar al sujeto de la actividad; tratamientoin situo en la comunidad; evaluación adicional del sujeto en el hospital sin ingreso nocturno (típicamente los pacientes con mTBI son dados de alta pronto con asesoramiento sobre lesiones en la cabeza); o ingreso en el hospital durante un período de observación (normalmente 1-2 días). El sujeto se puede evaluar adicionalmente usando pruebas (p. ej., pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas). Generalmente, la exploración por CT solo se requiere si existen ciertas indicaciones, incluyendo la sospecha de fractura de cráneo, convulsiones postraumáticas, déficit neurológico focal, vómitos repetidos, una puntuación de GCS de menos de 13 en la evaluación inicial (menos de 14 para niños, o menos de 15 para bebés menores de 1 año), de acuerdo con las directrices del NICE.
Un tratamiento apropiado para m-sTBI puede incluir: exploración por MRI o CT (particularmente en el plazo de 1 hora de la lesión); ingreso en el hospital (que puede incluir ingreso en cuidados intensivos y/o el traslado a una clínica especializada o a un centro de traumatología principal con instalaciones neuroquirúrgicas); neuromonitorización; cirugía; administrar una terapia para aliviar la TBI, tal como administrar fármacos neuroprotectores, p. ej. fármacos para tratar la inflamación cerebral tales como manitol y solución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tales como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.
Por lo tanto, la presente invención permite estratificar rápidamente a los sujetos con TBI en mTBI o m-sTBI, de modo que puedan recibir el tratamiento más adecuado.
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un sistema de detección en el método de la invención para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de la sTBI, comprendiendo el sistema de detección un elemento sensor que comprende un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN diana en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335. El sistema de detección puede comprender además un dispositivo de detección que sea capaz de detectar la unión de un miARN diana a la sonda.
Según otro aspecto más de la invención, se proporciona el uso de un elemento sensor en el método de la invención para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de la sTBI, comprendiendo el elemento sensor un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN diana (miR-335), en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
El elemento sensor puede comprender además una zona de adición de muestra para recibir una muestra (p. ej., una muestra de fluido) sobre la misma.
La sonda es capaz de unirse selectivamente al miARN de interés. El sustrato puede funcionalizarse con una pluralidad de sondas. Las sondas pueden ser todas iguales o pueden proporcionarse dos o más sondas diferentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sustrato puede funcionalizarse con una primera sonda específica para un primer miARN y una segunda sonda específica para un segundo miARN. La primera y segunda sondas pueden agruparse entre sí, por ejemplo, en diferentes partes del elemento sensor.
En un aspecto adicional de esta descripción, se proporciona una composición para su uso en un método de diagnóstico y/o seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, comprendiendo la composición una sonda específica para un miARN diana. La composición puede comprender uno cualquiera de los miARN indicados o cualquier pluralidad de los miARN indicados (p. ej., dos, tres, cuatro o más de los miARN indicados).
En algunos aspectos de esta descripción, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsalet-7c-5p, hsa-let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.
La presente invención también proporciona el uso de una composición en el método de la presente invención para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática grave (sTBI) en un sujeto, comprendiendo la composición una sonda específica para miR-335, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
En algunos aspectos de esta descripción, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsamiR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p. Se ha descubierto que estos microARN son biomarcadores expresados en todos los pacientes con TBI (leve o grave).
En algunos aspectos de esta descripción, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g y miR-335.
En algunos ejemplos de referencia, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p y miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
En algunos ejemplos de referencia, el miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.
En algunas realizaciones, el miARN diana se selecciona del grupo que consiste en miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-335.
La sonda puede comprender una molécula biológica tal como una proteína (p. ej., un anticuerpo) o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la sonda comprende un ácido nucleico. El ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de longitud completa del miARN diana. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia que es 100% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia del miARN diana (es decir, el receptor comprende una secuencia de ácido nucleico que es el complemento exacto de la secuencia de miARN diana).
Las sondas se pueden unir a una superficie del sustrato mediante cualquier medio adecuado, tal como por química de acoplamiento conocida por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, cada sonda se une a una superficie del sustrato mediante un conector. En algunas realizaciones, la sonda comprende un resto para inmovilizar la sonda sobre el sustrato, o para unir la sonda a un conector inmovilizado sobre el sustrato.
Alternativamente o además, la sonda puede comprender un marcador detectable. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, radiactivo, fluorescente, luminiscente o basado en anticuerpos (p. ej., puede constituir un anticuerpo tetramérico convencional o un fragmento detectable del mismo).
El sustrato del elemento sensor puede formarse a partir de cualquier material adecuado. En algunas realizaciones, el sustrato comprende o está formado de metal, plástico, vidrio, sílice, silicio, grafito, grafeno o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el sustrato comprende múltiples capas. Por ejemplo, se puede preparar un sustrato formando una superficie o capa de grafeno sobre una capa de carburo de silicio o sílice. La superficie del grafeno puede modificarse químicamente, por ejemplo, a óxido de grafeno (GO) o amina de grafeno (GA). Los expertos en la técnica conocerán métodos para formar capas de grafeno, tales como crecimiento epitaxial y crecimiento por sublimación.
Convenientemente, las sondas que comprenden o están constituidas por un ácido nucleico pueden unirse a una superficie de GO mediante un conector, usando un reactivo de acoplamiento de amida (p. ej., hexafluorofosfato de (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronio (HATU)). Luego se puede usar un elemento sensor que comprende una superficie funcionalizada con una sonda de ácido nucleico para detectar selectivamente su miARN complementario.
Los conectores adecuados pueden comprender un resto de anilina (o un derivado del mismo), un resto de ácido benzoico (o un derivado del mismo) o un resto de etenodiamina (o un derivado del mismo). Se puede formar un conector de anilina uniendo una molécula de nitrobenceno (o derivado) a una superficie de grafeno (p. ej., usando una sal de diazonio) y reduciendo el nitrobenceno a anilina. Luego se puede utilizar el grupo amina de la anilina para unirlo a la sonda. De manera similar, se puede usar una sal de diazonio (p. ej., tetrafluoroborato de diazonio del ácido 4-benzoico) para unir un ácido benzoico o derivado del ácido benzoico a una superficie de grafeno. Se puede unir un resto de etanodiamina al grafeno carboxilado o al óxido de grafeno.
El elemento sensor puede estar comprendido dentro de una tira reactiva. La tira reactiva puede ser desechable.
El dispositivo de detección puede configurarse para detectar la unión de un miARN diana al receptor por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo detectando cambios en la impedancia eléctrica, la concentración de iones de hidrógeno o cambios conformacionales que resultan de la hibridación.
El dispositivo de detección puede incluir además una interfaz de usuario para enviar datos a un usuario.
En algunas realizaciones, el dispositivo de detección incluye una base de datos de información de tratamiento. El dispositivo puede ser capaz de identificar opciones de tratamiento adecuadas a partir de la base de datos dependiendo de los niveles de cada miARN de interés. La información del tratamiento puede proporcionarse al usuario a través de la interfaz de usuario.
Convenientemente, el dispositivo de detección puede ser portátil, p. ej. manual. El dispositivo de detección puede comprender una unidad de almacenamiento de datos para almacenar niveles de miARN y otra información relacionada con el sujeto. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un medio de comunicación de datos para comunicar datos a otros dispositivos. Por ejemplo, el dispositivo puede comunicar datos de forma inalámbrica a través de WiFi, 3G, 4G, Bluetooth o mediante una aplicación móvil. Esto puede permitir convenientemente que los profesionales médicos accedan fácilmente a los datos si es necesario.
Por lo tanto, se prevé que el dispositivo de detección de la invención proporcione un medio de diagnóstico inmediato asequible y portátil para diagnosticar y hacer el seguimiento de la TBI de forma no invasiva. El dispositivo puede ser utilizado por equipos de ambulancias, militares, escuelas, clubes deportivos y profesionales de la salud, lo que permite la evaluación y clasificación correcta de pacientes con sospecha de lesión cerebral traumática.
En un aspecto adicional pero que no forma parte de la invención, se proporciona un kit para usar en los presentes métodos. El kit puede comprender al menos una sonda (p. ej., una proteína, tal como un anticuerpo o un ácido nucleico) que sea capaz de unirse selectivamente al miARN de interés. En algunas realizaciones, el kit comprende una matriz que comprende una pluralidad de sondas. En algunas realizaciones, la al menos una sonda es un cebador para llevar a cabo la PCR. El kit puede comprender además instrucciones de uso, por ejemplo instrucciones de uso en el diagnóstico y/o seguimiento de la TBI. El kit puede comprender además tampones y reactivos adecuados, tales como cebadores de amplificación y enzimas (p. ej., ADN polimerasa, transcriptasa inversa para la conversión de miARN en ADNc).
La presente invención también proporciona el uso de un kit en el método de la presente invención para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática grave (sTBI) en una muestra de fluido de un sujeto, comprendiendo el kit al menos una sonda específica para miR-335, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde la sonda comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
Se apreciará que las declaraciones hechas en el presente documento con respecto a cualquier aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente a cualquier otro aspecto de la invención, según corresponda.
Descripción detallada de la invención
A continuación se describirán realizaciones de la invención y ejemplos de referencia a modo de ejemplo y con referencia a las figuras adjuntas:
Figura 1: Expresión de miR-425-5p y miR-502 en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV (voluntarios sanos, por sus siglas en inglés,Healthy Volunteers).Expresión de MiR-425-5p y miR-502 en pacientes 10 HV, 10 mTBI+CE (1 día), 10 mTBI+CE (15 días), 10 CE (1 día), 10 CE (15 días), 10 sTBI+CE (1 día) y 10 sTBI+CE (15 días), detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-425-5p estaba notablemente disminuida en mTBI+CE (1 día) en comparación con H<v>(p<0,01), mTBI+CE (15 días) (p<0,001) y sTBI+CE (1 día) (p <0,01) (Figura 1A). Se encontró que la expresión de MiR-502 estaba notablemente disminuida en mTBI+CE (1 día) en comparación con HV (p<0,05), mTBI+CE (15 días) (p<0,01) y sTBI+CE (1 día) (p<0,05) (Figura 1B).
Figura 2: Expresión de miR-21 y miR-335 en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV. Expresión de MiR-21 y miR-335 en pacientes 10 HV, 10 mTBI+CE (1 día), 10 mTBI+CE (15 días), 10 CE (1 día), 10 CE (15 días), 10 sTBI+CE (1 día) y 10 sTBI+CE (15 días), detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-21 estaba significativamente regulada por aumento en sTBI+CE (1 día y 15 días) en comparación con HV (p<0,01) (Figura 2A). Se encontró que la expresión de MiR-335 estaba notablemente regulada por aumento en sTBI+c E (1 día) en comparación con HV (p<0,001), CE (15 días) (p<0,001) y mTBI+CE (1 día) (p< 0,05) (Figura 2B).
Figura 3: Evolución temporal de la expresión de miR-425-5p (Figura 3A) y miR-502 (Figura 3B) en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV
Expresión de MiR-425-5p y miR-502 en pacientes 30 HV, 30 mTBI+CE, 30 CE, 30 sTBI+CE en diferentes puntos temporales desde la lesión (T0, T4-12 h, T48-72 h, 15 días) detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-425-5p estaba notablemente disminuida en mTBI+CE en T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTBI+CE y CE (p<0,05). Se encontró que la expresión de MiR-502 estaba notablemente disminuida en mTBI+CE en T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTBI+CE y CE (p<0,05). Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.
* significativamente diferente de HV
Figura 4: Evolución temporal de la expresión de miR-21 (Figura 4A) y miR-335 (Figura 4B) en 3 categorías diferentes de traumatismo y HV
Expresión de MiR-21 y miR-335 en pacientes 30 HV, 30 mTBI+CE, 30 CE, y 30 sTBI+CE en diferentes puntos temporales desde la lesión (T0, T4-12 h, T48-72 h, 15 días) detectada por análisis de qRT-PCR. Se encontró que la expresión de MiR-21 estaba significativamente regulada por aumento en sTBI+CE en T4-12h, T48-72h y 15 días en comparación con HV (p<0,01). Se encontró que la expresión de MiR-335 estaba notablemente regulada por aumento en sTBI+CE en T0, T4-12h, T48-72h y 15 días en comparación con HV y mTBI+CE (p<0,001), pero no solo en CE. Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.
* significativamente diferente de HV
Ejemplos
Dado que los miARN están surgiendo como biomarcadores prometedores en una variedad de patologías diferentes, los autores de la presente invención intentaron explorar su papel en la TBI.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Pacientes y recogida de muestras
Los participantes del estudio se reclutaron del Centro de Investigación de Microbiología y Reconstrucción Quirúrgica (SRMRC) en el Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido) como parte del estudio de biomarcadores cerebrales después de traumatismo (The Golden Hour Study) (Ethics Ref. 13/WA/0399).
Primero, se llevó a cabo el cribado de 754 miARN en 5 pacientes de mTBI con lesión extracraneal (CE), 5 pacientes con lesión sTBI+CE y voluntarios sanos (HV) el día 1 y a los 15 días de la lesión con el objetivo de seleccionar biomarcadores candidatos específicos capaces de discriminar la TBI leve de la grave y predecir la recuperación de la mTBI después de 15 días. Basándose en esta información (Tabla 2), después se podían confirmar los resultados del estudio en una cohorte ampliada de pacientes de 40 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=10), CE (n=10), mTBI+CE (n=10), sTBI+CE (n=10). Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio RECOS. Los pacientes con lesiones CE tenían fracturas confirmadas radiográficamente, no tenían traumatismo craneoencefálico, ni infección, ni antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y no tenían dependencia de alcohol o drogas. La TBI leve con CE incluía a aquellos con un traumatismo craneoencefálico no penetrante y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow (GCS) >13. La TBI grave con CE incluía a pacientes con una puntuación de GCS de 8 o menos. Todos los pacientes se emparejaron por sexo y edad con los HV.
Procesamiento de muestras
Se tomaron muestras de sangre periférica 1 día y 15 días después de la lesión en cada paciente. Las muestras de sangre se procesaron para el aislamiento del suero en el plazo de 2 h posteriores a la extracción. La sangre completa se dejó reposar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente antes de centrifugar a 3000 rpm durante 10 min a 4°C. El suero se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C hasta el análisis.
Aislamiento de ARN, transcripción inversa y perfilado de miARN mediante matriz de baja densidad TaqMan (TLDA)
Se llevó a cabo un cribado inicial (conjunto de descubrimiento) en 5 pacientes con mTBI+CE y 5 sTBI+CE, que se compararon con los HV en los dos puntos temporales diferentes (1 día y 15 días desde la lesión). El suero de estos pacientes se utilizó para el perfilado del transcriptoma de 754 miARN. Las muestras de suero se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 min para sedimentar y eliminar cualquier célula o residuo circulante. Los miARN se extrajeron de 400 |jl de muestras de suero utilizando el mini kit miRNeasy de Qiagen (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania), de acuerdo con el protocolo complementario de Qiagen para la purificación de ARN pequeños de suero y plasma y finalmente se eluyeron en un volumen de 30 j l de agua exenta de ARNasa. La concentración y pureza del ARN resultante se determinó con un espectrofotómetro UV-Vis ND-1000 (NanoDrop). Se retrotranscribieron y preamplificaron 20 ng de ARN séricos, según las instrucciones del fabricante. Los productos preamplificados se cargaron en TLDA, matriz de microARN humano TaqMan v3.0 A y B (Applied Biosystems LifeTechnologies™). Las PCR en las TLDA se realizaron en el sistema de PCR en tiempo real rápido 7900HT (Applied Biosystem, LifeTechnologies™).
Análisis de datos
Para obtener un perfil de miARN preciso, los autores de la invención usaron el método de normalización de la mediana global. De manera similar al análisis de micromatrices, los valores de Ct de cada muestra se normalizaron respecto a la mediana de Ct de la matriz. Además, al calcular la correlación de Pearson entre las medianas y medias de Ct de cada matriz y el Ct de cada miARN, se identificaron dos miARN que mostraron un perfil de expresión cercano a la mediana y la media de las TLDA, es decir, miR-331 y miR-223* También se confirmó que estos miARN se encuentran entre los más estables en las TLDA aplicando dos métodos diferentes [el software DataAssistv.3 (Applied Biosystem Life Technologies™)] y el algoritmo geNorm. Por consiguiente, se utilizaron miR-331 y miR-223* como genes de referencia para la validación mediante ensayos TaqMan individuales. Los cambios en la expresión se calcularon por el método 2-AACT. Los miARN expresados diferencialmente (miARN DE) se identificaron mediante la significación del análisis de micromatrices (SAM) calculada por el Multi experiment Viewer v4.8.1, aplicando una prueba para datos no pareados de dos clases entre ACts y utilizando un valor p basado en 100 permutaciones; motor de imputación: K-vecinos más cercanos (10 vecinos); se utilizó una tasa de descubrimiento falso <0,15 como corrección para comparaciones múltiples. Se aceptaron como fiables solo los miARN DE concordantes usando todos los controles endógenos.
Ensayos TaqMan individuales
Se eligieron diez miARN expresados diferencialmente de las matrices como posibles biomarcadores candidatos con el objetivo de discriminar la TBI leve de grave y hacer el seguimiento de la recuperación de la leve. Estos candidatos se utilizaron para validar los datos en una cohorte ampliada de 30 pacientes (conjunto de validación) agrupados en 3 categorías diferentes (mTBI+CE, sTBI+CE y CE únicamente) y 10 controles (HV) en dos puntos temporales diferentes (1 y 15 días desde la lesión) mediante ensayos TaqMan individuales (AppliedBiosystems, Life Technologies™). Las muestras se extrajeron y retrotrascribieron como se describe anteriormente y el análisis de RT-qPCR se realizó en el sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Los cambios en la expresión se calcularon por el método 2-AACT.
Análisis estadístico
Se verificó la distribución normal de los datos y se transformaron para realizar pruebas paramétricas. Las comparaciones entre grupos en cada momento y dentro de los grupos a lo largo del tiempo se realizaron mediante el análisis de varianza de una vía y la prueba post-hoc de Tukey en datos transformados. Se utilizó un análisis de las características operativas del receptor para calcular la sensibilidad y especificidad de cada biomarcador en el diagnóstico de mTBI o sTBI expresado como área bajo la curva (AUC). Todos los análisis se realizaron en SPSS v.20 (IBM). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor de p <0,05.
Resultados
Perfiles de expresión por matrices de baja densidad TaqMan (TLDA)
A partir de 754 miARN cribables de la TLDA, se identificaron diez miARN circulantes el día 1 y 13 a los 15 días en mTBI+CE, 19 el día 1 y 22 a los 15 días en sTBI+CE expresados diferencialmente (Tabla 2). De esta lista, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p se excluyeron para análisis adicionales porque se expresaban en la mayoría de los pacientes, por lo que no eran biomarcadores candidatos adecuados solo para traumatismos leves o graves. Sin embargo, los microARN anteriores pueden identificar TBI de cualquier gravedad y, por lo tanto, son biomarcadores de TBI útiles. Por otro lado, miR-184, miR-301b, miR-502 y miR-505 expresados de forma única y diferencial en mTBI+CE el día 1, se seleccionaron como biomarcadores candidatos tempranos de la mTBI. Además, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655 expresados diferencialmente 15 días después de mTBI+CE se seleccionaron como biomarcadores candidatos capaces de seguir la recuperación de la mTBI.
Finalmente, se seleccionaron dos miARN, miR-21 y miR-335, expresados constantemente en ambos puntos temporales en sTBI+CE, para estudios adicionales.
Tabla 2: Cambio de los microARN expresados diferencialmente en pacientes 5 de mTBI+CE (1 y 15 días) y 5 de sTBI+CE (1 y 15 días), en comparación con 5 HV y detectados por TLDA.
Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTBI
Con el fin de validar estos hallazgos, posteriormente los autores de la invención ensayaron la expresión de los miARN seleccionados en tres grupos separados e independientes (10 mTBI CE, 10 sTBI CE, 10 CE) en los dos puntos de tiempo elegidos (1 y 15 días desde la lesión) usando ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon por el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como genes de referencia.
Entre los biomarcadores candidatos de mTBI en ambos puntos temporales (miR-184, miR-301b, miR-502, miR-505, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), dos mostraron resultados interesantes y se expresaban de manera significativa y diferencial en las tres categorías diferentes en comparación con HV. En particular, miR-425-5p y miR-502 mostraban una tendencia similar (Fig 1). Ambos eran regulados por disminución de manera significativa en mTBI+CE (media de 0,387 ± 0,201 y 0,314 ± 0,146) respectivamente el día 1 desde la lesión en comparación con HV (p<0,001), CE (p<0,001) y sTBI+CE (p<0,001). A los 15 días desde la lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvieron a los niveles normales (0,886 ± 0,310 y 1,157 ± 0,258). La expresión de miR-425-5p y miR-502 se encontró que también era similar a la de HV en muestras de CE tanto 1 día como 15 días desde la lesión, lo que sugiere que estos dos biomarcadores se expresan de manera diferencial solo en pacientes con lesión cerebral. Además, ninguno de ellos mostraba ninguna diferencia significativa en sTBI+CE en comparación con HV en ambos puntos temporales. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían considerarse los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el seguimiento de la mTBI a los 15 días después del traumatismo. Las AUC de estos biomarcadores se muestran en la Tabla 3.
Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTBI
miR-21 y miR-335 se analizaron como posibles biomarcadores de sTBI ya que ambos aparecían regulados por aumento en ambos puntos temporales de sTBI+CE en el cribado inicial. Mostraron que también eran buenos candidatos en el segundo conjunto de datos de pacientes (Fig 2). Mir-21 era regulado por aumento de manera significativa en ambos puntos temporales en sTBI con CE (7,106 ± 4,192 y 4,012 ± 1,577) con respecto a HV (p <0,001), CE (p <0,001) y mTBI (p <0,001). En el resto de categorías no se encontraron diferencias significativas en comparación con HV. miR-335 mostró regulación por aumento en sTBI+CE y en ambos puntos temporales (16,824±14,195 y 12,324t8,931, respectivamente). El día 1, este grupo era significativamente diferente de los controles (p=0,001) y mTBI+CE (p=0,031), pero no de CE. Es interesante que se encontró una regulación por aumento significativa en los pacientes con CE el día 1 (7,951 ± 4,870), pero no a los 15 días desde la lesión (1,260 ± 0,531). Por esta razón, el día 15, miR335 era significativamente mayor en el grupo de sTBI+CE con respecto a HV (p=0,002), CE (p=0,007) y mTBI+CE (p=0,001). miR-335 no mostró ninguna diferencia significativa en mTBI+CE en ambos puntos temporales en comparación con HV. Las AUC de estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Área bajo la curva
Discusión
El presente estudio investigó si los cambios en los niveles de miARN se pueden aplicar al diagnóstico de la TBI y evaluar su gravedad. Se identificaron cuatro miARN que se expresaban diferencialmente en la TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.
miR-425-5p mostró resultados significativos el día 1 en mTBI+CE en comparación con HV y se obtuvieron resultados similares en todas las demás categorías. Su regulación por disminución en el plazo de las primeras 24 h desde la lesión leve y su regreso a niveles normales después de 15 días hacen de miR-425-5p un biomarcador candidato adecuado de traumatismo leve.
También se encontró que miR-502 se expresaba diferencialmente en mTBI+CE. La tendencia de este miARN era muy similar a la de miR-425-5p. Mostraba especificidad para pacientes con lesión cerebral y también podría usarse para realizar un seguimiento de la recuperación, ya que vuelve al valor normal después de 15 días desde la lesión leve.
Después de sTBI, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaban tanto el día 1 como a los 15 y, por lo tanto, se seleccionaron como posibles biomarcadores para sTBI. miR-21 y miR-335 eran regulados por aumento significativamente en ambos puntos temporales en comparación con los controles en sTBI+CE. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó los resultados de la matriz y mostró el potencial de estas moléculas como biomarcadores de la sTBI.
El panel seleccionado de miARN tiene el potencial de diagnosticar la TBI con precisión y permitir la estratificación de pacientes según la gravedad, lo que, a su vez, permite administrar el tratamiento más adecuado.
Ejemplo 2
Pacientes y recogida de muestras
Los participantes del estudio se reclutaron en el Centro de Investigación de Microbiología y Reconstrucción Quirúrgica (SRMRC) del Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido) como parte del estudio SIR (Los esteroides y la inmunidad desde la lesión hasta la rehabilitación) (Ethics Ref. 11/SW/0177), estudio ReCoS (The REpetitive COncussion in Sport) (Ethics Ref. 11-0429AP28) y estudio Golden Hour (Ethics Ref.
13/WA/0399). Se recibió el consentimiento informado por escrito de los participantes o de un apoderado válido (familiar o un profesional no involucrado directamente en el estudio) antes de la inclusión en el estudio.
El segundo conjunto de datos de muestras utilizó muestras de suero de un total de 120 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=30), CE (n=30), mTBI+CE (n=30), sTBI+CE (n=30) y se extrajo sangre en diferentes puntos temporales (T0-1h, T4-12h, T48-72h, 15 días) en cada paciente. Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio ReCoS. Los pacientes con lesiones CE tenían fracturas ortopédicas confirmadas radiográficamente, no tenían traumatismo craneoencefálico, ni infección, ni antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y no tenían dependencia de alcohol o drogas. La TBI leve con CE incluía a aquellos con un traumatismo craneoencefálico no penetrante y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow (GCS) >13. La TBI grave con EC incluía pacientes con GCS<8.
Procesamiento de muestras
Las muestras de sangre se procesaron para aislar el suero en el plazo de 2 h posteriores a la extracción. La sangre completa se dejó reposar durante aproximadamente 30 min a temperatura ambiente antes de centrifugar a 3000 rpm durante 10 min a 4°C. El suero se dividió en partes alícuotas y se almacenó a -80°C hasta el análisis.
El aislamiento del ARN, el análisis de datos, los ensayos y el análisis estadístico se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTBI
Con el fin de validar los hallazgos del Ejemplo 1, se midió la expresión de los miARN seleccionados en 3 grupos separados e independientes (30 mTBI C<e>, 30 sTBI CE, 30 CE) en diferentes puntos de tiempo (T0, T4-12h, T48-72h y 15 días desde la lesión) usando ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon por el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como referencia.
Entre los biomarcadores candidatos de mTBI en ambos puntos temporales (miR-184, miR-502, miR-505, miR-301b, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), solo dos mostraron resultados interesantes y se expresaban de manera significativa y diferencial en las 3 categorías diferentes en comparación con HV. Específicamente, miR-425-5p y miR-502 mostraban una tendencia similar (Figura 3). Ambos eran regulados por disminución de manera significativa en mTBI+CE, miR-425-5p en T0-1h (p=0,01845) y en T4-12h (p=0,01962), respectivamente, en comparación con HV, o CE y sTBI+CE (p<0,05), y miR-502 en T0-1h y en T4-12h en comparación con HV (p=0,02538 y p=0,03718 respectivamente), o CE y s tBi+CE (p<0,01). Después de 48 h desde la lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvían a sus niveles normales. La expresión de miR-425-5p y miR-502 también se encontró en el grupo CE a un nivel comparable al de HV, lo que sugiere que estos dos biomarcadores están regulados por disminución solo en pacientes con lesión cerebral. Además, ninguno de ellos mostró ninguna regulación por disminución significativa en sTBI+CE en comparación con HV en todos los puntos temporales. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían considerarse los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el seguimiento de la mTBI. Las AUC de estos biomarcadores en los puntos temporales más relevantes se muestran en la Tabla 4.
Ensayo TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTBI
MiR-21 y miR-335 se analizaron como posibles biomarcadores de sTBI ya que ambos aparecían regulados por aumento en ambos puntos temporales de sTBI+CE en el cribado inicial. Mostraron que eran buenos candidatos en el segundo conjunto de datos de pacientes (Figura 4). Mir-21 era regulado por aumento de manera significativa en sTBI con CE en todos los puntos temporales después de 4 h desde la lesión con respecto a HV, CE y mTBI+CE (p=0,00306 en T4-12h, p=0,00844 en T48-72h y p=0,00077 a los 15 días). En el resto de categorías no se encontraron diferencias significativas respecto a HV. MiR-335 mostró regulación por aumento en sTBI+CE y en todos los puntos temporales en comparación con HV (p=0,00109 en T0-1h, p=0,00284 en T4-12h, p=0,00012 T48-72h y p=0,01284 a los 15 días) y mTBI+ CE, pero no se encontró regulación por aumento significativa en comparación con CE. Las AUC de estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Área bajo la curva de los cuatro biomarcadores candidatos de TBI en diferentes puntos temporales. Sólo se muestran los puntos temporales más relevantes.
Discusión
Este estudio validó el hallazgo anterior de que los cambios en los niveles de miARN se pueden aplicar al diagnóstico de la TBI y evaluar su gravedad. El estudio confirmó que los siguientes cuatro miARN se expresan diferencialmente en la TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.
miR-425-5p mostró resultados significativos en T0 y T4-12h en mTBI+CE en comparación con HV y se obtuvieron resultados similares en todas las demás categorías. Su regulación por disminución vuelve a los niveles normales después de T48-72h, lo que confirma que miR-425-5p es un biomarcador candidato adecuado para el traumatismo leve.
También se confirmó que miR-502 se expresaba diferencialmente en mTBI+CE. La tendencia de este miARN era muy similar a la de miR-425-5p. Mostraba especificidad para pacientes con lesión cerebral y también podía usarse para realizar un seguimiento de la recuperación, ya que vuelve al valor normal después de T48-72h desde la lesión leve.
Después de sTBI, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaban en todos los puntos temporales analizados y por lo tanto se confirmaron como posibles biomarcadores para sTBI. miR-21 y miR-335 eran regulados por aumento significativamente en comparación con los controles en sTBI+CE. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó el potencial de estas moléculas como biomarcadores de la sTBI.
Ejemplo de referencia 3
Se recogieron muestras de saliva de atletas profesionales que sufrieron una conmoción cerebral después de 2-3 días de la lesión y se analizaron los microARN presentes en la saliva. A los atletas se les diagnosticó clínicamente mTBI.
Materiales y métodos
Se analizaron los microARN utilizando tecnología nCounter (nanoString Technologies®), que utiliza "códigos de barras" moleculares e imágenes microscópicas para detectar y contar hasta varios cientos de transcritos únicos en una reacción de hibridación. Cada código de barras codificado por colores está unido a una única sonda específica de la diana correspondiente a un microARN de interés.
El análisis se llevó a cabo según el protocolo del fabricante que incluye las siguientes etapas:
Hibridación: La tecnología emplea dos sondas de ~20 bases por microARN que se hibridan en solución. Una sonda indicadora transporta la señal, mientras que una sonda de captura permite inmovilizar el complejo para la recogida de datos.
Purificación e inmovilización: Después de la hibridación, se eliminan las sondas en exceso y los complejos sonda/diana se alinean e inmovilizan en el cartucho nCounter.
Recogida de datos: Los cartuchos de muestra se ponen en un instrumento analizador digital para la recogida de datos. Los códigos de color en la superficie del cartucho se cuentan y tabulan para cada molécula diana. Resultados
La Tabla 4 a continuación es una lista de microARN que se encontró que se expresaban significativa y diferencialmente en atletas con conmoción cerebral en comparación con voluntarios sanos. La tabla muestra el cambio en la expresión de los microARN en los pacientes en comparación con el grupo de control. Los cambios se calcularon utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como genes de referencia.
Tabla 4
Discusión
Este estudio muestra que los microARN presentes en la saliva son un indicador de conmoción cerebral/mTBI. Esto es importante porque la saliva se obtiene más fácilmente que la sangre y, por lo tanto, la detección de microARN salivales ofrece un medio rápido y conveniente para diagnosticar la TBI, particularmente en el campo.
Claims (13)
1. Un método para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, en donde la t Bi es una TBI grave (sTBI), comprendiendo el método determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido obtenida del sujeto, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde el al menos un miARN comprende miR-335.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además comparar el nivel del al menos un miARN con un umbral predeterminado o un nivel de referencia, en donde el nivel de referencia es el nivel de un miARN de referencia en una muestra de control tomada de un sujeto sano o el nivel de un miARN de referencia en una muestra tomada del sujeto.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar el nivel de al menos un miARN adicional, en donde el al menos un miARN adicional se selecciona del grupo que consiste en:
(a) miR-21;
(b) miR-425-5p, miR-21 y miR-502, o cualquier combinación de los mismos;
(c) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, mir-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p; miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629, o cualquier combinación de los mismos;
(d) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p, o cualquier combinación de los mismos; o
(e) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-let-7g, o cualquier combinación de los mismos.
4. El método de la reivindicación 3, que comprende determinar el nivel de dos, tres, cuatro o más miARN.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde se diagnostica que el sujeto tiene sTBI si se determina que el nivel de miR-335 está por encima de un umbral predeterminado o aumentado con respecto a una referencia.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el método comprende determinar el nivel de: (i) un primer miARN seleccionado de miR-425-5p y miR-502; y
(ii) miR-335.
7. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde el método es para diagnosticar la TBI y la muestra de fluido que comprende suero se ha obtenido del sujeto:
(a) hasta 20 días desde la lesión;
(b) hasta 18 días desde la lesión; o
(c) hasta 15 días desde la lesión.
8. Uso de un elemento sensor en el método de la reivindicación 1 para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de la sTBI, comprendiendo el elemento sensor un sustrato funcionalizado con una sonda específica para miR-335, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
9. Uso de un sistema de detección en el método de la reivindicación 1 para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de la sTBI, que comprende:
- el uso del elemento sensor según la reivindicación 8; y
- un dispositivo de detección que es capaz de detectar la unión de un miARN diana a la sonda.
10. Uso de un kit en el método de la reivindicación 1, para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática grave (sTBI) en una muestra de fluido de un sujeto, comprendiendo el kit al menos una sonda específica para miR-335, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde la sonda comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
11. Un fármaco neuroprotector o un sedante para usar en un método para tratar a un sujeto que lo necesita, en donde dicho sujeto se ha identificado como que tiene una sTBI determinando un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido del sujeto, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde el al menos un miARN comprende miR-335.
12. Uso de una composición en el método de la reivindicación 1 para diagnosticar y/o hacer el seguimiento de una lesión cerebral traumática grave (sTBI) en un sujeto, comprendiendo la composición una sonda específica para miR-335, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de miR-335.
13. Uso del elemento sensor, sistema de detección, kit o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o 12, que comprende además al menos una sonda específica adicional para un miARN diana en donde el miARN se selecciona del grupo que consiste en:
(a) miR-21;
(b) miR-425-5p, miR-21 y miR-502, o cualquier combinación de los mismos; o
(c) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629, o cualquier combinación de los mismos.
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