ES2975798T3 - Anticuerpos contra antígeno carcinoembrionario para tratamiento y diagnóstico de cáncer - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos contra el antígeno carcinoembrionario (CEA) que tienen una actividad inhibidora directa del crecimiento celular en células tumorales que expresan CEA y a su uso para el tratamiento y diagnóstico del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra antígeno carcinoembrionario para tratamiento y diagnóstico de cáncer

La invención se refiere a anticuerpos contra antígeno carcinoembrionario (CEA) que tiene una actividad de inhibición directa del crecimiento de células tumorales y a su uso para el tratamiento y diagnóstico de cáncer.

El antígeno carcinoembrionario (CEA o CEACAM-5) es un antígeno asociado a tumor de la familia de la molécula de adhesión celular relacionada con antígeno carcinoembrionario (CEACAM). CEACAM es una familia génica grande, altamente conservada, que comprende 12 moléculas con funciones diversas en la adhesión celular, en la señalización intracelular e intercelular, y durante procesos biológicos complejos tales como progresión del cáncer, inflamación, angiogénesis y metástasis (revisado en Beauchemin, M y Arabzadeh A, Cancer Metastasis Rev., 2013, 32, 643-671). Todas las proteínas CEACAM son proteínas altamente glucosiladas, que pertenecen a la familia supergénica de inmunoglobulina (Ig) y tienen una estructura similar. CEACAM5 comprende un dominio similar al variable (V), identificado como dominio N, seguido de tres unidades repetitivas que comprenden, en total, seis dominios similares al constante C2, y está asociada con a la membrana a través de un enlace glucosilfosfatidilinositol (GPI).

CEA se considera un biomarcador clínico válido y diana terapéutica prometedora para diversos cánceres. Durante la transformación maligna, CEA se detecta en al menos carcinomas de pulmón (incluyendo cáncer pulmonar microcítico), páncreas, vesícula biliar, vejiga urinaria, ovario mucinoso y endometrio y CEA se sobreexpresa significativamente en una diversidad de cánceres mucosos del epitelio, tales como cáncer colorrectal (CRC), de mama y gástrico.

Por lo tanto, se ha perseguido activamente el desarrollo de anticuerpos monoclonales (MAb) anti-CEA que puedan abordar de manera eficaz células tumorales para el diagnóstico y tratamiento del cáncer.

99mTc arcitumomab (CEA-Scan) es un fragmento F(ab<')2>de IMMU-4, un anticuerpo IgG1 monoclonal murino anti-CEA, marcado con 99m-tecnecio, que se comercializa por Immunomedics para imágenes de diagnóstico por tomografía computarizada de emisión de un solo fotón (SPECT) de cáncer colorrectal. CEA-Scan se mostró adecuado para el diagnóstico de recidiva local de carcinoma colorrectal, pero no adecuado para la detección de metástasis distantes (hígado, hueso y pulmón) y afectación de ganglio linfáticos (Willkommet al.,J. Nucl. Med., 2000, 41, 1657-1663).

IMMU-130 (hMN14-SN38 o Labetuzumab-SN38; Govindanet al.,Clin. Cancer Res., 2009, 15, 6052-6061), un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido a CEA se está ensayando actualmente en un ensayo en fase I/II. 131I-labetuzumab se ha ensayado en radioinmunoterapia complementaria de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal (Sahlmannet al.,Cancer, 15 de febrero de 2017, 123, 638-649).

Se han divulgado varios Ab biespecíficos dirigidos a CEA y linfocitos T (documento WO 2013/012414) y están en ensayos preclínicos (Bacacet al.,Clin. Cancer Res., 2016, 22, 3286-; Weidleet al.,Seminars in Oncology, 2014, 41, 653-660).

El documento WO 92/01059 (CELLTECH LIMITED) divulga anticuerpo recombinante humanizado o quimérico anti CEA derivado del MAb A5B7 de ratón anti-CEA que tiene afinidad de unión por CEA que no se ve afectado de manera sustancialmente adversa por el proceso de humanización.

El documento US 8.771.690 divulga anticuerpos monoclonales (MAb) humanos, humanizados o quiméricos anti-CEA fijados a secuencias de la región constante de IgG1 o IgG4 humana que se unen a CEA y CEACAM6 e inhiben la adhesión de células tumorales a células endoteliales.

Los MAb anti-CEA se consideraron posibles candidatos para tratamiento citotóxico contra el cáncer, ya que destruían células tumorales que expresan CEA mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) al reclutar células efectoras que expresan el receptor de Fc de Ig (FcR), incluyendo FcR de IgG (Fc-gammaR) y FcR de IgA (FcalfaR) o mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC; Staffet al.,J. Clin. Immunol., 2012, 32, 855-865; Zhaoet al.,Oncol. Res., 2008, 17, 217-222). El anticuerpo humano recombinante IgA anti-CEA y los anticuerpos quiméricos de ratón-humanos anti-CEA se obtuvieron de anticuerpos monoclonales de ratón anti-CEA (Shibaguchiet al.,Anticancer research, 2003, 23, 4883-4888; Senbaet al.,Anticancer research, 1998, 18, 17-24; Kogaet al.,Hybridoma, 1990, 9, 43-56).

Se construyó una IgA recombinante dimérica de ratón-humana anti-CEA y demostró traslocarsein vitroa través de una monocapa de células epiteliales que expresaban el receptor de poliIg (Terskikhet al.,Molecular Immunology, 1994, 31, 1313-1319).

A pesar de estos esfuerzos, el diagnóstico y tratamiento de cáncer mucoso del epitelio aún es difícil, ya que uno de cada dos pacientes diagnosticados con CRC ya padece metástasis hepática y pulmonar. El cáncer colorrectal es el segundo cáncer, en términos de frecuencia, en mujeres (después del cáncer de mama) y el tercero en hombres (después de cáncer pulmonar y de próstata). Los cánceres colónicos tiene una alta frecuencia en Francia: cada día, 100 personas descubren que tienen cáncer colorrectal. Actualmente, en el caso de cáncer colorrectal, muy pocas moléculas terapéuticas abordan directamente un marcador expresado en las células cancerosas. Se sabe que aproximadamente un 30-50 % de los tumores colorrectal tienen un gen KRAS mutado (anómalo), lo que indica que solamente un 30 % de los pacientes con cáncer colorrectal (CRC) responderán a la quimioterapia convencional de primera línea. Además, un 50 % de los pacientes que responden bien a inhibidores de tirosina cinasa desarrollan resistencia debido a la aparición de mutaciones secundarias. El anticuerpo monoclonal (cetuximab; ERBITUX®) dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFr) es la referencia en el actual tratamiento por inmunoterapia de CRC. Sin embargo, solamente un 50 % de los pacientes podrían responder a tratamiento(cetuximab,ERBITUX®) y un 40-60 % de pacientes elegibles paracetuximabno responden a dicho tratamiento. Incluso si están disponibles en el mercado diferentes líneas de tratamiento, una proporción significativa de pacientes no pueden tratarse eficazmente. Por lo tanto, para mejorar la detección temprana y el tratamiento de cánceres mucosos del epitelio, hay una necesidad de anticuerpos anti-CEA que puedan conseguir abordar pronto y eficazmente tumores mucosos del epitelio incluyendo tumores primarios y metástasis.

Actualmente, IgG es el anticuerpo más ampliamente usado en tratamiento y ensayos clínicos. Estudiada intensamente durante muchos años, la IgG es bien conocida por inducir funciones de citotoxicidad celular mediante los diversos receptores FcgammaR (FcyR).

Sin embargo, se han puesto de relieve algunas limitaciones funcionales de IgG, tales como la accesibilidad inadecuada al tejido y la farmacocinética, y las interacciones alteradas con las células efectoras. La IgA podría representar una alternativa prometedora a IgG, particularmente para abordar tumores mucosos, considerando que la IgA constituye la clase de Ig principal en la superficie mucosa.

En seres humanos, la IgA es el isotipo más intensamente producido (66 mg/kg/día) y el segundo isotipo circulante más prevalente, después de IgG. Mucho tiempo considera un anticuerpo antinflamatorio implicado en el mantenimiento del equilibrio homeostático al nivel de la membrana mucosa, se ha demostrado recientemente que la IgA puede habilitar o inhibir diferentes respuestas inflamatorias. La IgA se expresa en tres formas diferentes: monomérica (en la sangre; de 1 a 3 g/l), dimérica/polimérica (en membranas mucosas) y secretora (en los órganos mucosos). Aunque la IgA monomérica está predominante concentrada en la sangre y producida por las células plasmáticas de la médula ósea, la IgA dimérica se expresa preferentemente en lalamina propria.Esta dimerización requiere la unión covalente de una cadena de unión (J) de 15 kDa a la pieza final de dos IgA. La cadena J en el dímero de IgA es crucial para su transporte en las superficies mucosas, porque media el reconocimiento por el receptor de Ig polimérico (pIgR) en la superficie basolateral de las células epiteliales, que permite la unión de IgA. Después de la internalización endocitótica y la transcitosis, el pIgR se escinde en la superficie luminal, el bucle extracelular del receptor permanece unido covalentemente al dímero, liberando IgA secretora.

El conocimiento de IgA y sus aplicaciones están limitados parcialmente debido a las dificultades en la identificación de linfocitos B productores de IgA, y con respecto a la producción estable de anticuerpos IgA. Los linfocitos B secretores de IgA representan menos de un 1 % de los esplenocitos de ratón normales (incluso se encuentran menos en los compartimentos linfáticos de la mucosa: un 0,01 % en lalamina propriay un 0,1 % en las placas de Peyer). La tecnología HAMIGA™ desarrollada recientemente permite esquivar esta limitación (patente EP 1 680 449 B1). Al remplazar el dominio Sp con un gen constante alfa 1 humano posterior a los segmentos génicos variables, la población de linfocitos B secretores de IgA en el bazo se aumentó significativamente y, por tanto, podría generar fácilmente IgA humanizada monoclonal altamente específica.

Los autores de la invención han producido anticuerpos IgA contra CEA usando la tecnología HAMIGA™. Sorprendentemente, han descubierto anticuerpos anti-CEA que tienen una actividad de inhibición directa del crecimiento de células cancerosas sobre células cancerosas que expresan CEA. Esta actividad está presente al menos en anticuerpos IgA e IgG. Este efecto antitumoral único se potencia más por la capacidad de los anticuerpos anti-CEA de reclutar la ruta del complemento y los inmunocitos-efectores de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) que da lugar a la lisis de células cancerosas. Todos estos efectos antitumorales son específicos para las células tumorales abordadas porque los anticuerpos son específicos para CEA.

Usando un modelo ortotópico de cáncer colorrectal humano, los autores de la invención han demostrado que estos anticuerpos (IgA) anti-CEA tienen una potencia de dirección rápida y fuerte por el tumor primario y la metástasis inicial (antes de la detección macroscópica) que podría evitar eficazmente el crecimiento del tumor en un entorno mucoso. El efecto antitumoral de los anticuerpos IgA anti-CEA en el modelo ortotópico de cáncer colorrectal humano fue superior al de un anticuerpo IgG anti-EGFR (cetuximab), el tratamiento de referencia para inmunoterapia del cáncer colorrectal avanzado. Estos resultados apoyan el potencial de estos anticuerpos anti-CEA para el diagnóstico y tratamiento de tumores mucosos.

Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal contra antígeno carcinoembrionario (CEA), que tiene una actividad de inhibición directa del crecimiento de células tumorales sobre células tumorales que expresan CEA y comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de los dominios variables de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada (VH) seleccionadas del grupo que consiste en:

a) la secuencia de VL-CDR1 de SEQ ID NO: 1; la secuencia AAT de VL-CDR2; la secuencia de VL-CDR3 de SEQ ID NO: 2; la secuencia de VH-CDR1 de SEQ ID NO: 3; la secuencia de VH-CDR2 de SEQ ID NO: 4; la secuencia de VH-CDR3 de SEQ ID NO: 5; y

b) la secuencia de VL-CDR1 de SEQ ID NO: 6; la secuencia YAS de VL-CDR2; la secuencia de VL-CDR3 de SEQ ID NO: 7; la secuencia de VH-CDR1 de SEQ ID NO: 8; la secuencia de VH-CDR2 de SEQ ID NO: 9; la secuencia de VH-CDR3 de SEQ ID NO: 10.

Como se demuestra en los ejemplos de la presente solicitud, el anticuerpo de la invención en solitario (es decir, anticuerpo aislado) puede inhibir la proliferación de células tumorales que expresan CEA induciendo directamente la apoptosis en células tumorales abordadas. En particular, el anticuerpo de la invención es eficaz en ausencia de inmunocitos efectores que median la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) o agentes citotóxico, conjugado (estrategia de inmunoconjugado) al anticuerpo o no conjugado al anticuerpo (complemento u otras moléculas citotóxicas libres).

Los dados experimentales proporcionados en los ejemplos muestran que la unión del anticuerpo anti-CEA de la invención a CEA expresado en células tumorales activa directamente la señalización apoptótica en células tumorales abordadas. Sin limitarse a teoría alguna, se considera que el efecto antiproliferativo directo del anticuerpo anti-CEA de la invención está mediado por sus regiones Fab variables. Esto contrasta con ADCC y CDC que son mecanismos indirectos de destrucción de células diana mediada por anticuerpos, que requiere la interacción de las regiones constantes de los anticuerpos con proteínas del complemento o receptores de Fc en inmunocitos efectores tales como linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, macrófagos y células polinucleadas.

Además de tener un efecto inhibidor directo del crecimiento celular sobre células tumorales que expresan CEA, el anticuerpo de la invención también presenta ADCC y CDC en presencia de inmunoefectores que tienen proteínas del complemento o receptores de Fc en su superficie.

La actividad inhibidora del crecimiento de células cancerosas del anticuerpo de la invención puede medirse en células tumorales que expresan CEA usando ensayosin vitroconvencionales tales como, sin limitaciones: MTT, filtración de LDH, medición de proteínas celulares totales, rojo neutro, alamarBlue® o ensayo de incorporación de uridina. Como alternativa o adicionalmente, la inducción de la apoptosis por el anticuerpo de la invención directamente en células tumorales que expresan CEA puede ensayarse por detección de marcadores de apoptosis tales como exposición a fosfatidilserina, activación de caspasa, calpaína y catepsina, cambios en el potencial transmembranario mitocondrial, gemación de la membrana celular y condensación nuclear, usando técnicas convencionales que están disponibles en la técnica.

De acuerdo con la invención, "anticuerpo" se refiere a "anticuerpo aislado". Un anticuerpo se refiere a una glucoproteína producida por linfocitos B en respuesta a estimulación con un inmunógeno. Los anticuerpos poseen la capacidad de reaccionarin vitroein vivoespecífica y selectivamente con un determinante antigénico o epítopo que provoca su producción o con un determinante antigénico muy relacionado con el antígeno homólogo.

En la presente invención, los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" son equivalentes y se usan de forma indiferente. Anticuerpo se indica "Ab" e inmunoglobulina se indica "Ig". Las expresiones "anticuerpo anti-CEA", "anticuerpo frente a CEA", "anticuerpo contra CEA", "anticuerpo dirigido contra CEA" o "anticuerpo dirigido a CEA" son equivalentes y se usan de forma indiferente. "CEA" se refiere a proteína CEA. La proteína CEA también se indica antígeno CEA.

De acuerdo con la invención, el anticuerpo anti-CEA reconoce específicamente CEA. Esto significa que el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una afinidad relativamente alta por uno o más epítopos de CEA, pero no reconoce sustancialmente ni se une a péptidos distintos del de interés o de los de interés. Como se usa en este documento, la expresión "afinidad relativamente alta" significa una afinidad de unión entre el anticuerpo y la proteína de interés de al menos 10-6 M, y preferiblemente de al menos aproximadamente 10-7 M e incluso más preferiblemente de 10-8 M a 10 10 M. La determinación de dicha afinidad se realiza preferiblemente en condiciones convencionales de inmunoensayo de unión competitiva que es de conocimiento común para los expertos en la materia.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender un anticuerpo completo o fragmento de unión a antígeno del mismo. El fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en: fragmentos Fv, scFv, Fab, F(ab)<2>, Fab' y anticuerpos de un solo dominio (VHH). Los dominios de región constante pueden ser dominios de IgA, IgM, IgE, IgG o IgD. El anticuerpo puede ser no recombinante o recombinante, quimérico o humanizado. Un anticuerpo monoclonal es una molécula de inmunoglobulina monoespecífica y bivalente. Se entiende que el término "anticuerpo" abarca un agregado, polímero, derivado o conjugado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Ejemplos de derivado incluyen variantes y construcciones que usan el fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, tales como anticuerpos multivalentes y/o multiespecíficos.

El antígeno CEA es bien conocido en la técnica; las secuencias de nucleótidos y codificantes de proteína para CEA están disponibles en bases de datos públicas de secuencias. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CEA humano está disponible en GenBank AAA51967.1, GenBank AAA62835.1 o UniProtKB/Swiss-Prot: P06731.3.

En algunas realizaciones preferidas, dicho anticuerpo monoclonal (mAb) es humano, humanizado o quimérico. Un anticuerpo quimérico tiene dominios constantes humanos y dominios variables de una fuente no humana, en general ratón (anticuerpo quimérico humano/de ratón). Un anticuerpo más preferido de la invención es un anticuerpo monoclonal quimérico humano/de ratón.

En algunas realizaciones, dicho anticuerpo tiene una región variable formada por la asociación de un dominio VL que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 11 y un dominio VH que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 12 tal como el anticuerpo monoclonal 15B3 o por un dominio VL que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 13 y un dominio VH que comprende o que consiste en SEQ ID NO: 14 tal como el anticuerpo monoclonal 14G8.

En algunas realizaciones, dicho anticuerpo es una IgG o IgA, preferiblemente una IgA.

En algunas realizaciones, dicho anticuerpo es polimérico. El anticuerpo polimérico comprende o consiste en polímeros de Ig. El anticuerpo polimérico es preferiblemente un anticuerpo monoclonal polimérico derivado de un anticuerpo monoclonal como se define anteriormente. Los polímeros de Ig comprenden o consisten en dímeros. El anticuerpo polimérico habitualmente comprende una o más cadenas de unión (J) de inmunoglobulina además de moléculas de Ig. La cadena J es un polipéptido de 137 aminoácidos expresado por células plasmáticas o de mieloma que regulan la formación de polímero de Ig al unirse covalentemente a dos moléculas de Ig a través de enlaces disulfuro entre residuos de cisteína. En particular, se forman anticuerpos diméricos por dos moléculas de Ig monoméricas, que se unen covalentemente a una cadena J.

En una realización preferida, dicho anticuerpo es una IgA polimérica, preferiblemente un anticuerpo monoclonal de IgA polimérica derivado de un anticuerpo monoclonal como se define anteriormente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo secretor. Un anticuerpo secretor puede transportarse a través de células epiteliales hasta la superficie luminal de tejidos serosos. El anticuerpo secretor habitualmente es un anticuerpo polimérico, preferiblemente una IgA polimérica, que comprende un complejo de polímero que contiene cadena J de Ig y componente secretor (SC). El componente secretor es un producto de escisión proteolítica de la parte extracelular del receptor de inmunoglobulina polimérico (pIgR) que se une a Ig polimérica que contiene cadena J. El anticuerpo secretor es preferiblemente un anticuerpo monoclonal secretor derivado de un anticuerpo monoclonal como se define anteriormente.

El anticuerpo de la invención puede dirigirse contra una proteína CEA de cualquier mamífero. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo está dirigido contra CEA humano.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es específico para CEA y no reacciona de forma cruzada con otra u otras moléculas CEACAM. En una realización preferida, el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con CEACAM6.

Ejemplos de anticuerpos preferidos de acuerdo con la invención incluyen:

a) un anticuerpo de IgA monoclonal quimérico humano/de ratón que comprende:

(i) un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene (es decir que comprende o que consiste en) la secuencia:

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTRLAWYQQKPGKSPQLLIYAATRLADGV

P.SRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 11) y un dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene (es decir que comprende o que consiste en) la secuencia:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVNQAPGKGLKWMGWINTNT

GEPTYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARLWYLYFDVWGAGTT VTVSS (SEQ ID NO: 12), correspondiente a mAb 15B3,

(ii) un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene (es decir que comprende o que consiste en) la secuencia:

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSFSNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPS

KFTGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 13) y un dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene la secuencia:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVNQAPGKGLKWMGWINTNT

GEPTYAEEFK.GRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARLWYLYFDVWGAGT TVTVSS (SEQ ID NO: 14), correspondiente a mAb 14G8, y

(iii) dominios constantes de IgA humana, y un dominio constante de la cadena ligera de Ig humana, preferiblemente un dominio constante kappa de Ig humana;

b) un anticuerpo de IgA polimérico derivado del anticuerpo de IgA en a);

c) un anticuerpo de IgA secretor derivado del anticuerpo de IgA polimérico en b).

En algunas realizaciones, el anticuerpo se acopla a un agente de marcaje que produce una señal detectable y/o cuantificable, en particular un agente radiactivo, magnético o luminiscente (radioluminiscente, quimioluminiscente, bioluminiscente, fluorescente o fosforescente). El anticuerpo marcado puede marcarse directa o indirectamente, mediante enlaces covalentes o no covalentes, usando técnicas convencionales de conjugación que son bien conocidas por los expertos en la materia.

En una realización preferida, el anticuerpos marcado se liga covalentemente a un agente radiactivo, preferiblemente tecnecio-99 (99Tc).

El acoplamiento covalente del agente de marcaje, por ejemplo, un agente radiactivo, al anticuerpo puede conseguirse incorporando un grupo reactivo en una proteína recombinante o sintética, y después usando el grupo para ligar el agente de marcaje covalentemente, como se ilustra en los ejemplos de la presente solicitud.

El anticuerpo anti-CEA de la invención puede producirse por las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se producen anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas obtenidos por fusión de linfocitos B de un animal inmunizado con antígeno CEA, con mielomas, de acuerdo con la técnica de Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497); los hibridomas se cultivanin vitro,en particular en fermentadores. Puede prepararse anticuerpo recombinante quimérico y/o humanizado y y fragmentos de anticuerpo a partir de células de hibridoma específicas para el antígeno por las técnicas convencionales de clonación y expresión de ADN recombinante. Puede obtenerse anticuerpo humano de un ratón transgénico que posee locus de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo de IgA monoclonal quimérico humano/de ratón se produce ventajosamente a partir de ratón transgénico HAMIGA™ (patente EP 1680449 B1) inmunizado con antígeno CEA recombinante. HAM<i>G<a>™ es una cepa de ratón transgénico humanizado que expresa IgA quiméricas humanas/murinas. Después de la inmunización de ratones HAMIGA™ con antígeno CEA, se producen hibridomas usando técnicas convencionales, como se describe anteriormente. Preferiblemente, los hibridomas se obtienen de células de la línea celular de mieloma de ratón Sp2/0, que expresan la cadena J de inmunoglobulina.

Se producen anticuerpos poliméricos mediante células plasmáticas o de mieloma que expresan la cadena J de inmunoglobulina, tales como, por ejemplo, las células de la línea celular de mieloma de ratón Sp2/0.

Se producen anticuerpos secretoresin vitro,como se describe previamente (Rindisbacheret a l,JBC, 1995, 270, 14220-14228; Koteswaraet a l,PNAS, 1997, 94, 6364-6368).

La invención también se refiere a un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la invención en forma expresable. El polinucleótido que codifica el anticuerpo en forma expresable se refiere a una molécula de ácido nucleico que, tras la expresión en una célula o un sistema sin células, produce un anticuerpo funcional. El polinucleótido, sintético o recombinante, puede ser ADN, ARN o combinación de los mismos, mono- y/o bicatenario. El polinucleótido está unido de forma funcional a al menos una secuencia reguladora de la transcripción y, opcionalmente, a al menos una secuencia reguladora de la traducción. En algunas realizaciones, dicho polinucleótido codifica el dominio VH y/o VL del anticuerpo monoclonal 15B3 o 14G8.

Preferiblemente, el polinucleótido comprende al menos una de las siguientes secuencias de nucleótidos:

• SEQ ID NO: 15:

gacattcagatgacccagtctcctgcctcccagtctgcatctctgggagaaagtgtcaccatcacatgcctggcaagtcagaccattggt acacggttagcatggtatcagcagaaaccagggaaatctcctcagctcctgatttatgcagcaaccaggttggcagatggggtcccatc aaggttcagtggtagtggatctggcacaaaattttctttcaagatcagcagcctacaggctgaagattttgtaagttattactgtcaacaact ttacagtactccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa, correspondiente a la secuencia de nucleótidos de los genes V y J que codifican el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal 15B3;

• SEQ ID NO: 16:

cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcac aaactatggaatgaactgggtaaaccaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaac atatgctgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgag gacacggctacatatttctgtgcaagattgtggtacctgtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca, correspondiente a la secuencia de nucleótidos de los genes V, D y J que codifican el dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal 15B3;

• SEQ ID NO: 17: gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagcgtcagtctttcctgcagggccagccaaagttttagca acaacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaa gttcactggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagta acagctggcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagttgaaac, correspondiente a la secuencia de nucleótidos de los genes V y J que codifican el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal 14G8; y • SEQ ID NO: 18: cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcac aaactatggaatgaactgggtaaaccaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccaacactggagagccaac atatgctgaagagttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgag gacacggctacatatttctgtgcaagattgtggtacctgtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca, correspondiente a la secuencia de nucleótidos de los genes V, D y J que codifican el dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal 14G8.

El vector recombinante es ventajosamente un vector de expresión con capacidad de expresar dicho polinucleótido cuando se transfecta o transforma en una célula hospedadora tal como una célula de mamífero, bacteriana o fúngica. Los vectores recombinantes incluyen vectores habituales tales como, por ejemplo, plásmidos y vectores víricos. La divulgación proporciona una célula hospedadora transformada con dicho polinucleótido o vector recombinante. El vector de la invención, y el polinucleótido, célula de la divulgación son útiles para la producción de la proteína de la invención usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas.

El polinucleótido de acuerdo con la divulgación se prepara por los métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, se produce por amplificación de una secuencia de ácido nucleico por PCR o RT-PCR, cribando colecciones de ADN genómico por hibridación con una sonda homóloga, o también por síntesis química total o parcial. Los vectores recombinantes se construyen e introducen en células hospedadoras por las técnicas convencionales de ADN recombinante e ingeniería genética, que son conocidas en la técnica.

El anticuerpo de acuerdo con la invención se usa para abordar células tumorales que sobreexpresan CEA con propósitos de diagnóstico y terapéuticos.

En la presente invención "células tumorales o cancerosas que sobreexpresan CEA" se refiere a células tumorales o cancerosas que presentan un nivel de expresión de CEA que es significativamente mayor en comparación con el de células normal del tejido u órgano correspondiente en un individuo sano. El nivel de expresión de CEA se mide por ensayos convencionales de expresión génica basados en análisis cuantitativo de ARNm (RT-PCR y otras) o proteína (inmunoensayo tal como ELISA y otros).

La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, el anticuerpo está marcado con un agente radiactivo adecuado para tratamiento contra el cáncer tal como, sin limitaciones: itrio90, lutecio177 y bismuto213.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo polimérico o secretor, preferiblemente una IgA.

Los vehículos farmacéuticos son los apropiados para la vía planeada de administración, que son bien conocidos en la técnica.

La composición de la invención comprende una dosis terapéuticamente eficaz de anticuerpo, suficiente para inhibir la proliferación de células tumorales y producir un efecto antitumoral en el individuo que tiene uno o más tumores que sobreexpresan CEA al que se administra.

El efecto de la composición de acuerdo con la invención puede verificarse fácilmente por diversos ensayos, que son conocidos por los expertos en la materia tales como los descritos en los ejemplos de la presente solicitud.

La dosis eficaz se determina y se ajusta dependiendo de factores tales como la composición usada, la vía de administración, las características físicas del individuo en consideración tales como sexo, edad y peso, medicación simultánea, y otros factores, que los expertos en los campos médicos reconocerán.

En algunas realizaciones, la composición comprende además al menos un agente antineoplásico y/o inmunomodulador. El agente antineoplásico puede ser una agente quimioterápico tal como, por ejemplo: irinotecán, oxaliplatino, ácido folínico (leucovorina), fluorouracilo (5FU), floxuridina (5-fluorodesoxiuridina), gemcitabina, Folfox (ácido folínico más 5-FU), Folfiri (ácido folínico más 5-FU e irinotecán) y Xelox (capecitabina más oxaliplatino). El agente antineoplásico también puede ser otro anticuerpo tal como un anticuerpo anti-receptor de VEGF. El agente inmunomodulador puede ser un agente anti-PD1 o anti-PDL1, en particular un anticuerpo anti-PD1 o anti-PDL1; una citocina, por ejemplo, IL2 o variante de IL-2 manipulada (IL-2v) con unión anulada de IL-2Ra (CD25), u otros. El agente antineoplásico y/o inmunomodulador puede estar ligado ventajosamente al anticuerpo de acuerdo con la invención por un medio convencional que es conocido en la técnica, tal como por acoplamiento covalente o generación de una fusión génica.

La invención proporciona también un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso como medicamento, en particular un medicamento antineoplásico.

La invención proporciona también un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer que sobreexpresa CEA.

La composición de la presente invención se administra en general de acuerdo con procedimientos conocidos, a dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para inducir efecto antitumoral en el individuo. La administración puede ser por inyección o por administración oral, sublingual, intranasal, rectal o vaginal, inhalación o aplicación transdérmica. La inyección puede ser subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica o cualquiera.

Un anticuerpo secretor, preferiblemente una IgA, es ventajosamente para administración oral o local (rectal, vaginal, intravesical) o inhalación. Un anticuerpo secretor se usa ventajosamente para abordar el tumor inicial.

Un anticuerpo polimérico, preferiblemente una IgA, se administra ventajosamente por inyección. Un anticuerpo polimérico se usa ventajosamente para prevenir la formación de metástasis y recidiva del cáncer.

El anticuerpo de la invención se usa ventajosamente en combinación con cirugía, radioterapia, quimioterapia y/o inmunoterapia con agentes inmunomoduladores.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se usa para el tratamiento de seres humanos.

En algunas realizaciones, dicho cáncer es un cáncer mucoso del epitelio, tal como gastrointestinal, respiratorio y genitourinario, y cánceres de mama. Ejemplos no limitantes de dichos cánceres incluyen cánceres colorrectales, gástricos, de tiroides, pulmonares, de mama, de páncreas, de vesícula biliar, de vejiga urinaria, de ovario y de endometrio. Preferiblemente, dicho cáncer es carcinoma colorrectal.

Un objeto de la presente invención también es el uso de anticuerpo de acuerdo con la invención,in vitro,para diagnosticar un cáncer que sobreexprese CEA.

La divulgación proporciona el anticuerpo para su uso,in vivo,para diagnosticar un cáncer que sobreexpresa CEA. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo marcado, se usa para detectar la expresión de CEA. Por ejemplo, la sobreexpresión de CEA puede detectarse,in situ,en un tejido de un paciente, en comparación con el mismo tipo de tejido de un individuo sano.

La divulgación proporciona un kit para diagnosticar cáncer que sobreexprese CEA, que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la invención, preferiblemente un anticuerpo marcado, y opcionalmente instrucciones para el uso del anticuerpo.

La divulgación proporciona el uso del anticuerpo de acuerdo con la invención, como herramienta de investigación para estudiar CEA.

La divulgación proporciona un método para detectar CEA,in vitroy/oin vivo,que comprende al menos las etapas de:

• poner las células a analizar en contacto con el anticuerpo marcado, y

• detectar las células marcadas.

Las células marcadas se detectan por técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

La detección de CEA,in vivo,en el cuerpo de un mamífero, comprende una etapa previa de administrar dicho péptido a dicho mamífero (inyección parenteral, administración oral).

La invención abarca el uso de mezclas o combinaciones de anticuerpos, tales como mezclas de diferentes anticuerpos anti-CEA de acuerdo con la invención o mezclas de anticuerpos de acuerdo con la invención y otros anticuerpos. Ejemplos no limitantes de dichas mezclas incluyen mezclas de anticuerpos de IgA y IgG dirigidos al antígeno CEA en solitario o el antígeno CEA y otro antígeno asociado a tumor y mezclas de al menos un anticuerpo anti-CEA de acuerdo con la invención con uno o más anticuerpos anti-CD3, en particular anti-cadena épsilon de CD3, anti-receptor de VEGF, anti-PD1 y anti-PDL1.

La invención abarca también los anticuerpos multivalentes y multiespecíficos correspondientes a las mezclas o combinaciones de anticuerpos anteriores.

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales que pertenecen a las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía.

Además de las disposiciones anteriores, la invención también comprende otras disposiciones, que surgirán de la descripción que sigue, que se refiere a realizaciones ejemplares del objeto de la presente invención, con referencia a los dibujos adjuntos, en que:

• Figura 1:Análisis de inmunoelectrotransferencia de anticuerpo monoclonal de IgA anti-CEA (clon n.° 15B3) usando anticuerpo anti-cadena pesada alfa humana como sonda.

• Figura 2:Inhibición directain vitrodel crecimiento de células cancerosas por anticuerpo monoclonal anti-CEA en células diana de cáncer colorrectal humano (WiDr- CEA+).

A.Inhibición de la proliferación de células cancerosas al aumentar las concentraciones (6,25, 12,5 y 25 pg/ml) del sobrenadante de cultivo de los clones positivos de IgA anti-CEA n.° 15B3 y n.° 14G8, en comparación con el clon negativo (n.° 17C7).B.Inducción directa de apoptosis en células diana al aumentar las concentraciones (5, 20 y 40 pg/ml) de sobrenadante de cultivo del clon de IgA anti-CEA n.° 15B3, en comparación con el sobrenadante de cultivo de clon de IgG anti-CEA n.° 15B3 e IgA irrelevante anticacahuete (IgA n.° 15F11). *valor dep<0,05; ** valor dep<0,01

• Figura 3:Inducción dein vitrode citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por anticuerpo monoclonal de IgA anti-CEA en células diana de cáncer colorrectal humano (WiDr- CEA+). La inhibición de la proliferación celular en células diana se ensayó con concentraciones crecientes (6,25, 12,5 y 25 pg/ml) de sobrenadante de cultivo de clones positivos de IgA anti-CEA n.° 15B3 y n.° 14G8 y el clon negativo n.° 17C7, en presencia (IgA mab(n.° 15B3)-CDC; IgA mab(n.° 14G8)-CDC; IgA mab(n.° 17C7)-CDC) o ausencia (IgA mab(n.° 15B3); IgA mab(n.° 14G8); IgA mab(n.° 14G8)) del complemento. *valor dep<0,05; ** valor dep<0,01.

• Figura 4:Inducciónin vivode ADCC por anticuerpo de IgA anti-CEA en células diana de cáncer colorrectal humano (WiDr- CEA+). Se inyectaron células diana en la cavidad peritoneal de ratones transgénicos que expresan CD89 humano (receptor de Fc-alfa) en presencia de IgG purificada o IgA polimérica purificada anti-CEA o IgA irrelevante anticacahuete (n = 4 ratones por grupo).A.Recuento de células diana.B.Porcentaje de doblete de células diana (CEA+)/células efectoras (CD89+) en las células diana totales. *valor dep<0,05.

• Figura 5:Biodistribución de 99mTc-IgA monomérica anti-CEA-SH, 99mTc-IgA polimérica anti-CEA-SH y 99mTc-IgG anti-CD20-SH en ratones Balb/c sanos a las 4, 8, 18, 24 y 48 h, expresada como el porcentaje de dosis inyectada (intravenosa; IV) por gramo, % de DI/g (los valores representan la media ± DT del % de DI/g). *valor dep<0,05.

• Figura 6:Biodistribución de 99mTc-IgA polimérica anti-CEA-SH y anticuerpo irrelevante 99mTcanticacahuete (anti-ARA) en ratones atímicos que portan tumores intracecales, a las 8 h, expresada como el porcentaje de la dosis inyectada por gramo, % de DI/g (los valores representan la media ± DT del % de DI/g). ***valor dep<0,001.

• Figura 7:Inhibición del crecimiento de tumor colorrectal por tratamiento con IgA anti-CEA en modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal humano. A los 8 días tras el implante de las células tumorales en ratones atímicos, se administró IgA polimérica anti-CEA (IgA anti-CEA) e IgA dimérica irrelevante anticacahuete (IgA anti-ARA) por vía intravenosa (0,2 o 0,3 mg/inyección durante 5 días consecutivos) y también se administró IgA anti-CEA (IgA anti-CEA) por vía intravenosa (1 mg) e intraperitoneal (1 mg), mientras se administró IgA secretora anti-CEA e IgA secretora irrelevante anticacahuete por vía oral (0,135 mg/día durante 11 días consecutivos) o vía oral (0,6 mg) e intraperitoneal (1 mg). A las 10 semanas tras el implante de las células tumorales, se comparó el peso del ciego de ratones tratados con IgA anti-CEA con el de controles tratados con IgA irrelevante.

• Figura 8:Inhibición del crecimiento de tumor colorrectal por tratamiento con IgA anti-CEA o IgG anti-EGFR (cetuximab) en modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal humano. A las siete semanas tras el implante de las células tumorales, se administró IgA polimérica anti-CEA (IgA) e IgG anti-EGFR (cetuximab) por vía intravenosa (4 mg para cada anticuerpo). A las diez semanas tras el implante de las células tumorales, se comparó el peso del ciego de ratones tratados con IgA anti-CEA e IgG/cetuximab con el de controles sin tratar.

Ejemplo 1: Material y métodos

- Inmunización

La inmunización se realizó en ratones transgénicos HAMIGA™ (patente EP 1 680 449 B1), una cepa de ratón transgénico que produce IgA quiméricas humanas/de ratón que consisten en regiones constantes de la cadena pesada de IgA humana y regiones constantes de la cadena ligera de ratón y regiones variables de ratón (de la cadena pesada y ligera). Los ratones transgénicos HAMIGA™ (4 ratones) se inmunizaron por vía intraperitoneal dos veces a intervalo de dos semanas con CEA recombinante humano (Eurobio-Abcys) o antígeno irrelevante (cacahuete), en adyuvante de Freund (10 pg/ratón/inyección, relación 1:1 de CFA (SIGMA) y 10 pg/ratón/inyección, relación 1:1 de IFA (SIGMA).

- Preparación de IgA monoclonal

Se preparó IgA (IgA1) monoclonal quimérica humana contra CEA o antígeno irrelevante (cacahuete) por inmortalización de linfocitos B de ratones HAMIGA™ inmunizados con CEA, de acuerdo con un protocolo convencional (Kohler, G. y Milstein, C., European Journal of Immunology, 1976, 6, 511-9). En resumen, todos los esplenocitos de los ratones inmunizados con CEA se recogieron y sedimentaron antes de fusionarse con células de mieloma de ratón (P3X63 Sp2/0:AG14; ATCC CRL-1581; proporción celular de 1 SP2/0 para 3 esplenocitos). Los hibridomas se subclonaron en placa de 96 pocillos. Después de tres semanas de cultivo, los sobrenadantes de los clones de hibridoma se recogieron y ensayaron para su actividad biológica o afinidad de antígeno. Cada clon se crioconservó en DMSO al 10 %/SVF al 20 %/medio DMEM en nitrógeno líquido.

- Clonación y secuenciación de Ig

La clonación y secuenciación de Ig se realizó usando técnicas convencionales de clonación y secuenciación.

- Preparación de IgG1 recombinante

Se sintetizó IgG1 quimérica humana-de ratón recombinante anti-CEA después de clonar las regiones variable de ratón de las cadenas pesada y ligera de IgA1 quimérica humana-de ratón anti-CEA. Entonces se produjo en células de embrionarias de riñón humano (HEK 293).

- Radiomarcaje de Ig con [99mTc(CO)3(H2O)3]+

Se adaptó el método de radiomarcaje de IgA del método de radiomarcaje previamente descrito para IgG (Carpenetet al.,PLoS One, 6 de octubre de 2015; 10(10):e0139835). En resumen, la primera etapa fue derivatización con tiol de Ig con 2-iminotiolano. A continuación, se incubaron de 0,5 a 2,2 nmol de IgA e IgG (300 pl en PBS) con 2-IT (3,8 pM, 25 °C, 120 min). Las soluciones se purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño. El número de grupos tiol se determinó por un micrométodo usando reactivo de Ellman (ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico, DTNB). La segunda etapa fue síntesis del precursor de tricarbonilo [99mTc(CO)3(H2O)3]+. A continuación, se añadió 0,8-1 ml de [Na99mTcO4] (CisBio, Codolet, Francia) recién diluido en actividades fijas (2220-3700 MBq) al kit IsoLink® (Covidien, Petten, Países Bajos) y se incubó durante 25 min a 100 °C. Se realizó análisis de pureza radioquímica (RCP) por cromatografía en capa fina (TLC) usando dos sistemas para separar [99mTc(CO)3(H2O)3]+ de [99mTc]-pertecnetato libre, 99mTc reducido y [99mTc(OH)n(H<2>O)y] hidrolizado (Baker-flex aluminio, MeOH/HCl (95/5 v/v); cromatografía inmediata en capa fina-gel de sílice (ITLC-SG), MeOH; JT Baker Inc., Phillipsburg, NJ, EE. UU.). Los rendimientos de marcaje con 99mTc-Isolink® fueron superiores a un 98 %. La tercera y última etapa fue el radiomarcaje de Ig natural o derivatizada con [99mTc(CO)3(H2O)3]+. Se incubó un total de 0,5-2,2 nmol de IgA no derivatizada o IgA-SH derivatizada, o 1,5 nmol de IgG-SH en 300 pl de PBS, durante 120 min (25 °C) con 150 pl (148-185 MBq) de una solución de 99mTc-tricarbonilo, previamente neutralizado a pH 7,0 (HCl 0,5 M). La RCP se determinó por TLC con ITLC-SG/NaCl al 0,9 %.

- Purificación de Ig

Los anticuerpos se purificaron por cromatografía de afinidad usando una columna Tricorn 5/100 con proteína A-Sepharose a un caudal de 1,0 ml/min (GE Healthcare, Waukesha, WI, EE. UU.) y se eluyeron con glicina (0,1 M pH 2,7) equilibrada en Tris/base (1,0 M). Posteriormente, se dializaron IgA e IgG frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) por centrifugación (1000 xg,15 min) usando Amicon 30 kDa (Millipore, Saint-Quentin, Francia). Las concentraciones de proteína se determinaron antes y después del radiomarcaje usando kit de ensayo de proteínas Micro Bicinchoninic Acid (BCA™) (ThermoFisher Scientific, Elancourt, Francia), usando seroalbúmina bovina (BSA) como patrón con límites de cuantificación de 2,5 y 100 gg/ml.

- Purificación de IgA monomérica y polimérica

Las IgA totales se purificaron usando matriz de afinidad por IgA CAPTURESELECT™ (ThermoFisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entonces se separaron las formas monoméricas y poliméricas de IgA por cromatografía en columna de exclusión por tamaño usando HILOAD™ 26/600 SUPERDEX™ 200 pg (GE Healthcare), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvo una fracción enriquecida de la forma monomérica (mIgA) o polimérica (pIgA) (purezas de un 95 % y 85 %, respectivamente).

- Preparación de IgA secretora

Se produjo IgA secretora anti-CEA por enlace covalentein vitrocon componente secretor humano recombinante (hSC), como se describe previamente (Rindisbacheret al.,JBC, 1995, 270, 14220-14228; Koteswaraet al.,PNAS, 1997, 94, 6364-6368). En resumen, se amplificó el ADNc del componente secretor humano por PCR de preparación de ARN de íleon y se insertó en vector de expresión en mamífero (pCDNA.3, Invitrogen). El hSC recombinante se expresó en células HEK-293 y se purificó por cromatografía de afinidad. El ensamblaje covalentein vitrode hSC e IgA dimérica se realizó incubando hSC e IgA dimérica durante 1 h a 37 °C (a una proporción en masa de proteína de 1:1).

- Análisis de especificidad de antígeno

Se evaluó la IgA específica de CEA por ELISA usando placas de 96 pocillos Maxisorp® (NUNC) recubiertas con 1 a 5 gg/ml de antígenos durante una noche a 4 °C. Los sobrenadantes en bruto de IgA sin purificar (diluida en PBS/gelatina al 0,2 %) se incubaron 2 horas a 37 °C. La unión de IgA específica se reveló con un anticuerpo de cabra anti-IgA humana conjugado con AP (diluido 1/2000, Beckman Coulter).

- Valoración de la concentración de IgA monomérica y polimérica purificada e IgA secretora por ELISA

La IgA purificada (purificada por cromatografía de afinidad) e IgA secretora se valoraron por ELISA. En resumen, se recubrieron placas de 96 pocillos (NUNC, Maxisorp®) con 1 gg/ml de anticuerpo de cabra anti-IgA humana (Beckman Coulter) en tampón PBS a 4 °C durante una noche. Los pocillos se saturaron en tampón PBS que contenía un 2 % de BSA durante 30 minutos a 37 °C. La incubación de las muestras (IgA secretora, diluida 10 veces en PBS que contiene un 0,2%de BSA; IgA purificada, diluida 100 veces en PBS que contiene un 0,2 % de BSA) se realizó a 37 °C durante 2 h. El intervalo de calibración de IgA humana (de [hIgA de control] = 0,2 mg/ml a 1,56 ng/ml) se incubó siguiendo el mismo protocolo y se reveló mediante un anticuerpo policlonal de cabra anti-hIgA marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Beckman Coulter; diluido 2000 veces en PBS que contiene un 0,2 % de BSA).

- Cultivo celular

WiDr, una línea celular colorrectal humana que expresa CEA, derivada de un adenocarcinoma primario del rectosigmoide, se adquirió de la ATCC (VA, EE. UU.) (WiDr ATCC® CCL-218™). HT-29, una línea celular humana de adenocarcinoma colorrectal se adquirió de ATCC (HTB-38™). Las líneas celulares se cultivaron en DMEM o en RPMI, complementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10 %, piruvato de sodio al 1 %, penicilina-estreptomicina al 1 % (100 U/ml) (100 gg/ml). El medio también se complementó con un 1 % de aminoácidos no esenciales y un 1 % de glutamina.

- Inhibición in vitro del crecimiento celular

Las células se recogieron cuando alcanzaron la etapa de crecimiento en fase logarítmica. Las células entonces se sembraron a 50000 células/pocillo en 100gl y se incubaron durante una noche. El medio de cultivo se retiró y se remplazó por medio de cultivo (DMEM/FCS al 10 %) que contenía diversas concentraciones de los anticuerpos (IgA anti-CEA, IgA irrelevante anticacahuete, IgG recombinante anti-CEA). Después de 48 h de incubación, se añadió ALAMARBLUE™ de forma aséptica en una cantidad igual a un 10 % del volumen de cultivo. Los cultivos se volvieron a colocar en la estufa de incubación. A diversos momentos, se midió la fluorescencia/absorbancia. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 600 nm. Para evaluar el impacto de elementos del complemento humano recientes sobre la inhibición del crecimiento celular, el medio de cultivo se retiró y se remplazó por medio (DMEM) que contenía un 10 % de suero humano reciente con diversas concentraciones de anticuerpos (IgA anti-CEA, IgA anticacahuete, IgG recombinante anti-CEA).

- Ensayo de apoptosis

El ensayo de apoptosis se realizó usando el kit I de detección de apoptosis de PE anexina V, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD PHARMINGEN™). En resumen, las células recogidas cuando alcanzaron la etapa de crecimiento en fase logarítmica se sembraron a 50000 células/pocillo en 100 gl y se incubaron durante una noche. El medio de cultivo se retiró y se remplazó por medio de cultivo (DMEM/SVF al 10 %) que contenía diversas concentraciones de los anticuerpos (IgA anti-CEA, IgA irrelevante anticacahuete, IgG recombinante anti-CEA). Después de 48 h de incubación, las células se recogieron, se lavaron varias veces en PBS y se diluyeron a 106 células/ml en tampón de unión (BD PHARMINGEN™). Las células se incubaron con anexina V conjugada con PE (BD PHARMINGEN™) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron en tampón de unión y se resuspendieron en tampón de unión 1X. Se añadió solución de tinción de viabilidad 7AAD (BD PHARMINGEN™) justo antes de analizarla por citometría de flujo.

- Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) in vivo

Se ha usado un modelo de ratón transgénico SCID-CD89 (proporcionado por Pr Jeannette Leusen, Utrecht University, Países Bajos), en que los neutrófilos y monocitos expresan CD89 humano. Se incubaron 107 células a 106 células/ml con IgA polimérica anti-CEA, IgA polimérica anticacahuete o IgG recombinante anti-CEA (a 20 gg/ml) durante 1 h a 4 °C. Las células diana (adenocarcinoma CEApositivo -WiDr) se sedimentaron, se resuspendieron en PBS y se inyectaron en la cavidad peritoneal. De 16 a 18 h después de la inoculación, las células se recogieron mediante lavado frío peritoneal y las poblaciones celulares se analizaron por citometría de flujo (FACS) usando tinción con FITC-anticuerpo anti-CD89 (BioLegend). Las células efectoras se identificaron por expresión selectiva de CD89positivo en la superficie celular y las células cancerosas se seleccionaron por sus características de tamaño y estructura celular.

- Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal humano (CRC)

Todos los experimentosin vivose realizaron de acuerdo con las regulaciones éticas en animal y se hicieron todos los esfuerzos por minimizar el sufrimiento. Se realizó microinyección directa de células ortotópicas (OCMI) de acuerdo con el método de Cespedes (Cespedeset al.,Am.J. Pathol., 2007, 170, 1077-1085). En resumen, se anestesiaron ratones atímicos hembra de siete semanas de edad (lampiños atímicos, HARLAN Laboratories) o ratones SCID-CD89 transgénicos (proporcionados por Pr Jeannette Leusen, Utrecht University, Países Bajos) con ketamina (80 mg/kg; Imalgene (100 mg/ml), MERIAL) y xilazina (9,6 jg/kg; 2 % de Rompun, BAYER) para exteriorizar su ciego mediante laparotomía. Se inyectaron lentamente células WiDr (2,105 células suspendidas en 10 gl de PBS en una micropipeta estéril) entre la mucosa y las capas de la muscular externa de la pared del ciego, bajo un lente binocular, con un ángulo aproximado de 30°. Después de la inyección, el ciego se devolvió a la cavidad abdominal. Los animales se trataron mediante antibióticos veterinarios para prevenir infecciones intraperitoneales. La cavidad peritoneal se cerró mediante laparotomía quirúrgica. Si los animales mostraban alteración clínica o pérdida de peso, los animales se sacrificaron mediante anestesia y dislocación cervical.

- Biodistribución de 99mTc-IgA anti-CEA-SH y 99mTc-IgG anti-CEA-SH en ratones normales y modelo de ratón de CRC humano

Se realizaron experimentos de biodistribución en ratones BALB/c macho de 7 semanas de edad (Charles River Laboratories, Chalaronne, L'ARBRESLE Cedex) o ratones atímicos xenoinjertados. Se inyectó 99mTc-IgA monomérica-SH o 99mTc-IgA polimérica-SH o 99mTc-IgG-SH (40 MBq, 170 gg de anticuerpo ) por vía intravenosa (vena de la cola) a los ratones BALB/c. De 6 a 8 semanas después del procedimiento OCMI, los ratones atímicos xenoinjertados se dividieron en 2 grupos. El primer grupo (n = 6) recibió por vía intravenosa 170 gg de 99mTc-pIgA anti-CEA-SH y el segundo (n = 6) 170 gg de 99mTc-pIgA anticacahuete-SH (todos los ratones recibieron una actividad de 35-37 MBq). Los controles de ratón atímico recibieron el la misma 99mTc-pIgA anti-CEA-SH. Los animales se sacrificaron mediante anestesia y dislocación cervical, en diferentes momentos después de la administración (4 h, 8 h, 18 h, 24 h, 48 h después de la inyección para los ratones BALB/c; 4 h y 8 h para los ratones atímicos xenoinjertados). Los tejidos seleccionados se escindieron, se aclararon y se pesaron, y se midieron sus niveles de radiactividad con un contador gamma. La captación de radiactividad en estos órganos se expresó como un porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% de DI/g) después de corregir la descomposición radiactiva para cada punto temporal. También se recogieron glóbulos, plasma y heces y se midieron. Heces se refiere a la materia fecal recogida del intestino delgado y el colon durante la disección. Además, el ciego se abrió longitudinalmente, se lavó con PBS y se limpió por separado de heces del ciego para evaluar la IgA luminiscente. El ciego y los pulmones de ratones atímicos xenoinjertados se fijaron con formol tamponado durante la descomposición radiactiva (48 h).

- Análisis histológico de injertos ortotópicos colorrectales humanos

Se transfirieron los órganos de los ratones a formol al 4 % y se incluyeron en parafina después de un sistema automatizado de ciclo de deshidratación. Se prepararon secciones de 4 gm usando un micrótomo. Para análisis histológico, los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina y azafrán (análisis HES), con azul alcián (análisis de moco secretor). Para el análisis de la vascularización, se hizo tinción de CD31 usando robot VENTANA.

- Inhibición in vivo del crecimiento tumoral

Se realizaron experimentos en el modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal humano (CRC) descrito anteriormente. El anticuerpo de IgA anti-CEA y el anticuerpo de IgA irrelevante anticacahuete se administraron 8 días después del implante de las células tumorales humanas en el ciego de ratones atímicos Balb/c (n = 12 por grupo). Se han evaluado dos vías de administración: la intravenosa (por administración de 0,2 o 0,3 mg/inyección durante 5 días consecutivos) para la IgA polimérica y la oral (por administración de 0,135 mg/día durante 11 días consecutivos) para la IgA secretora. A las 8 semanas tras el final del tratamiento, los animales se sacrificaron mediante anestesia y dislocación cervical y se escindió el ciego, se vació, se aclaró y se pesó.

Ejemplo 2: Identificación de anticuerpos monoclonales anti-CEA que tienen actividad directa inhibidora del crecimiento en células tumorales que expresan CEA

Se generaron anticuerpos monoclonales (MAb) de IgA anti-CEA por inmunización de ratones transgénicos HAMIGA™, una línea de ratón transgénico que produce anticuerpos quiméricos humanos/de ratón que tienen regiones constantes de la cadena pesada de IgA humana y regiones constantes de la cadena ligera de ratón y regiones variables de ratón (de la cadena pesada y ligera). Se produjeron hibridomas después de la fusión de linfocitos B de los ratones HAMIGA™ inmunizados con la línea celular de mieloma de ratón Sp2/0. Como la línea Sp2/0 deriva de mieloma murino que expresa la cadena J murina necesaria para la dimerización de la IgA, los hibridomas que se obtuvieron producen distintas formas de MAb IgA anti-CEA: una forma monomérica (sin la cadena J) y una forma polimérica que contiene una o más cadenas J e incluye la forma dimérica y formas poliméricas superiores de IgA(figura 1).El nivel de expresión de las diversas formas de IgA depende del hibridoma seleccionado. Las diferentes formas pueden purificarse y separarse por cromatografía.

Los clones de hibridoma se seleccionaron por la actividad directa inhibidora del crecimiento de células cancerosas en diversas líneas celulares de tumor humano que expresan CEA usando ensayo ALAMARBLUE™.

La IgA anti-CEA del clon 15B3 (también denominado n.° 15B3) y clon 14G8 (también denominado n.° 14G8) bloquean el crecimiento celular de dos líneas celulares derivadas de adenocarcinoma colorrectal humano (WiDr, 18,2 % ± 1,9 % para 15B3 y 18,1 ± 1,2 para 14G8 a 25 pg/ml (sobrenadante de cultivo);figura 2). Estos clones positivos se seleccionaron para análisis adicional. Se clonaron y secuenciaron las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (VH y VL) de IgA. Las secuencias de aminoácidos de VL y VH corresponden a SEQ ID NO: 11 y 12 y SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente para 15B3 y 14G8. Las secuencias de nucleótidos que codifican dichas secuencias de aminoácidos corresponden a SEQ ID NO: 15 y 16 y SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente para 15B3 y 14G8.

Se construyó una IgG1 recombinante anti-CEA derivada del clon 15B3 usando los dominios VH y VL clonados y se expresó en la línea celular Sp2/0 o HEK. RecIgG1 anti-CEA n.° 15B3 muestra un nivel equivalente de inhibición del crecimiento en comparación con IgA anti-CEA (clon n.° 15B3). La afinidad del anticuerpo (principalmente portada por las regiones variables que forma el "parátopo") se conserva durante el proceso de transformación de una IgA1 hacia una IgG1.

Dosis crecientes de IgA anti-CEA (5, 20 y 40 pg/ml, clon n.° 15B3) inducen mecanismos iniciales de apoptosis (fijación de anexina V, permeabilización de la membrana visualizada por marcaje mediante 7AAD+ (figura 2B), significativamente mayor que para otras condiciones (recIgG recombinante n.° 15B3, IgA1 irrelevante (anticacahuete n.° 15F11))). La mayor valencia de una IgA polimérica permitiría una posible reticulación de CEA en la superficie de células diana WiDr, que induce un efecto biológico inesperado (apoptosis directa) más fuerte y más rápido que una forma monomérica de IgA, como en el caso de recIgG1 n.° 15B3.

IgA recluta elementos del complemento que dan lugar a lisis de la célula diana mediante la ruta alternativa. Se realizaron los mismos ensayos de inhibición del crecimiento celular de células cancerosas WiDr en presencia de sueros humanos (los sueros humanos en solitario no afectaban biológicamente al cultivo de células WiDr). Se registró una elevación significativa de la inhibición del crecimiento en presencia de complemento humano para los dos clones seleccionados de IgA anti-CEA (clon n.° 15B3 y clon n.° 14G8;

figura 3).

En seres humanos, IgA recluta también inmunocitos efectores que expresan un receptor de IgA de alta afinidad (FcalfaR o CD89), principalmente neutrófilos y monocitos, dos células particularmente numerosas en la población de glóbulos. Para demostrar la capacidad de reclutamiento de células efectoras mediada por la IgA anti-CEA n.° 15B3, se ha usado un modelo de ratón transgénico en que los neutrófilos y monocitos expresan el CD89 humano. El análisis por citometría de flujo (FACS) muestra la presencia de una nueva población de células seleccionadas doblemente (célula efectora (CD89+): células diana WiDr (CEA+) en ratones tratados con la IgA anti-CEA (31 % ± 15 %) en comparación con ratones tratados con IgA irrelevante (IgA anticacahuete; 10,2 % ± 3,5 %,figura 4). Estos resultados demuestran que la IgA anti-CEA reconoce CEAin vivoen la superficie de células cancerosas WiDr e induce el reclutamiento de células (monocitos/macrófagos y células polinucleadas) mediante el receptor de CD89. En presencia de IgA anti-CEA (n.° 15B3), un efecto citotóxico muy potente elimina más de un 80 % de la población de células cancerosas en 16 h a 18 h (figura 4). En comparación con la población WiDr recogida en ratones tratados con la IgA irrelevante, solamente un 16,4 % ± 3,6 % de las células diana WiDr se recogen después del tratamiento con la IgA anti-CEA específica (n.° 15B3).

Los tipos de células reclutados preferentemente por IgG e IgA son diferentes: se sabe que la ADCC mediada por IgG se induce por los linfocitos NK, que expresan fuertemente el FcgammaR. La IgG recombinante generada a partir de las regiones variables del clon de IgA anti-CEA (n.° 15B3) induce una lisis celular citotóxica de WiDr-CEA+ tan fuerte como la IgA "original" ya que solamente un 11,3 % ± 8,6 % de WiDr se recogió por lavado peritoneal después de tratamiento con recIgG anti-CEA

(Figura 4).

El efecto citotóxico similar de los dos anticuerpos apoya la demostración de que la IgA puede inducir los mecanismos de ADCC tan rápida y eficazmente como la IgG. También valida que la transformación de la IgA hacia IgG no modifica la afinidad del anticuerpo por su diana.

Además, el análisis de inmunofluorescencia en tejidos (hígado y estómago, datos no mostrados) y el análisis de citometría de flujo en leucocitos (datos no mostrados) demostraron que el anticuerpo anti-CEA n.° 15B3 no reacciona de forma cruzada con CEACAM-6 (NCA o CD66c).

En conclusión, los anticuerpos anti-CEA de acuerdo con la invención tienen un efecto directo de inhibición del crecimiento celular en células cancerosas que expresan CEA. Este efecto antitumoral único se potencia más por su capacidad de reclutar la ruta del complemento y los inmunocitos-efectores de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) que da lugar a la lisis de células cancerosas. Todos estos efectos antitumorales son específicos para las células tumorales abordadas porque los anticuerpos son específicos para CEA.

Ejemplo 3: Biodistribución de anticuerpo anti-CEA en ratones normales y modelo de ratón ortotópico de carcinoma colorrectal humano

Se realizaron estudios de biodistribución y farmacocinéticos usando diferentes formas de Ig, IgA (monomérica (mIgA) y polimérica (pIgA)) e IgG, todas marcadas con tecnecio 99m (99mTc). Muy rápidamente, desde 8 h después de la inyección (por i.v.) para ratones Balb/c normales, la concentración de IgA monomérica bajó en los sueros y es incluso más marcada para la IgA polimérica hasta el límite detectable(figura 5).A la inversa, la concentración de la IgA polimérica (y monomérica, hasta un grado menor) es cuantificable tan pronto como 4 h después de inyección iv, en el ciego, el pulmón y el hígado(figura 5).El ciclo hepatobiliar de la IgA es particularmente patente aquí, la IgA circulante se captura rápidamente por el hígado, se dirige a la vesícula biliar para excretarse con la bilis en la luz del tubo digestivo. Esto es lo que explica el fuerte marcaje del hígado por un lado y del líquido intestinal y las heces por otro lado. Tan pronto como 4 h después de la inyección, la IgA secretora es detectable en la luz de los órganos mucosos. En este modelo murino sano, el tropismo de IgA polimérica por el ciego es el más fuerte y el más rápido, superior al tropismo de la IgA monomérica, pero también de la IgG, que ya se ha descrito que persiste más tiempo en la sangre.

En conclusión, los estudios de biodistribución de 99mTc-IgA monomérica anti-CEA-SH y 99mTc-IgA polimérica anti-CEA-SH en ratones Balb/c normales confirmaron el tropismo mucoso rápido y fuerte de pIgA y, a un menor grado, mIgA.

Para evaluar la potencia de dirección de IgA, se creó un modelo de tumor CRC en que se injertaron células cancerosas humanas en el entorno mucoso. El análisis microscópico patológico reveló claramente una arquitectura glandular estructural del tumor injertado y la presencia de vacuolas grandes en la línea celular WiDr, coherente con las mucosecreciones en la capalamina propria.Las células cancerosas invadieron el ciego normal, bajo la capa muscular a través de lalamina propria,para producir pólipos sobresalientes en la luz. Dependiendo del retardo después de la microinyección ortotópica, se han observado diferentes estadios de CRC desde tumores localizados hasta metástasis en los pulmones. El análisis inmunohistoquímico en tumores reveló que las células tumorales estaban presentes dentro de los vasos tumorales, lo que sugiere diseminación celular por el sistema vascular. Todos estos factores dieron lugar a considerar los injertos ortotópicos colorrectal como modelos útiles de CRC humana, porque comparten las mismas características que los tumores humanos.

Después de 8 semanas, las células tumorales se propagaron e identificaron por inmunohistoquímica, como metástasis pulmonares (no se detectan rastros de colonización hepática en este modelo). La invasión de los capilares pulmonares y la presencia de nódulos cancerosos en el tejido pulmonar fueron particularmente identificables por tinción HES. Entonces se administró por vía intravenosa 99mTc-IgA polimérica anti-CEA-SH o 99mTc-pIgA anticacahuete-SH irrelevante. Muy rápidamente (ya a las 4 h después de la inyección), se detecta el indicador radiactivo en el pulmón(figura 6).La IgA anti-CEA puede reconocer células tumorales muy rápidamente y con una afinidad muy fuerte mientras las metástasis son pequeñas (observables solamente en cortes de inmunohistoquímica, no es visible tumor macroscópico). La administración de una IgA irrelevante marcada con 99mTc no logró detectar ningún foco de metástasis cuando se administraban a animales con metástasis pulmonares en la misma fase de desarrollo que animales tratados con la IgA anti-CEA específica. Estos estudios confirman el rápido tropismo mucoso del anticuerpo IgA (8 h después de la inyección) y la fuerte potencia de dirección a los focos metastásicos inicialesin vivo(en el pulmón).

Ejemplo 4: Efecto antitumoral de anticuerpo anti-CEA en modelo de ratón ortotópico de carcinoma colorrectal humano

Se evaluó el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CEA (n.° 15B3) en el modelo de ratón ortotópico de carcinoma colorrectal humano divulgado en el ejemplo 1. Los resultados preliminares mostraron un beneficio significativo del tratamiento con la forma polimérica de IgA anti-CEA sobre la supervivencia de los animales y la disminución en el crecimiento tumoral.

En un primer experimento, el tratamiento se administró 8 días después del implante de las células tumorales humanas en el ciego de ratón (atímicos Balb/c, Harlan) para todas las condiciones. Se han evaluado dos vías de administración: la intravenosa (por administración de una dosis/día durante 5 días, 8 días después del implante del tumor) para la IgA polimérica y la oral (por administración de una dosis/día durante 11 días, 8 días después del implante del tumor) para la IgA secretora. Cuando los animales (n = 12) se tratan con una dosis acumulativa de 1 mg (IV, 0,2 mg/inyección durante 5 días consecutivos), la reducción de la masa tumoral es significativa en comparación con el grupo tratado con una dosis acumulativa de 1 mg (IV, 0,2 mg/inyección durante 5 días consecutivos) de IgA polimérica irrelevante anticacahuete (**,p= 0,001). La combinación de administración intravenosa de 1 mg y administración intraperitoneal de 1 mg de IgA polimérica anti-CEA evita el crecimiento tumoral tan eficazmente como solamente administración intravenosa de 1 mg de IgA anti-CEA(figura 7).La masa tumoral reducida es incluso más marcada por administración intravenosa de una dosis acumulativa mayor (1,5 mg) de IgA polimérica anti-CEA (0,3 mg/inyección 5 días; ***,p= 0,0002) en comparación con el grupo tratado con una IgA polimérica irrelevante anticacahuete(figura 7).

La IgA secretora es el isotipo único que se puede administrar por vía oral sin experimentar degradación enzimática, el crecimiento tumoral se redujo significativamente por administración oral de 1,5 mg de IgA secretora anti-CEA (0,135 mg/administración 11 días, 8 días después del implante) en comparación con administración oral de una IgA secretora irrelevante (sIgA anticacahuete) (figura 6; **,p= 0,004).

En un segundo experimento, siete semanas después del implante de las células tumorales humanas en el ciego de ratón (SCID-CD89 transgénico), se administró por vía intravenosa IgA polimérica anti-CEA (4 mg) o IgG anti-EGFR (cetuximab; 4 mg) a ratones injertados (n = 10 por grupo).

La masa tumoral del ciego se redujo significativamente (en aproximadamente un 30 %) en ratones tratados con IgA anti-CEA en comparación con ratones tratados con cetuximab (figura 8; **,p= 0,0032).

Estos resultados muestran la eficacia de los anticuerpos IgA anti-CEA de acuerdo con la invención en prevenir el crecimiento del tumor primario localizado en el entorno mucoso intestinal. La IgA anti-CEA demuestra por primera vez un mayor beneficio terapéutico que el tratamiento de referencia para inmunoterapia de cáncer colorrectal avanzado,cetuximab-ERBITUX®/IgGanti-EGFr. Además, la alta captación pulmonar de 99mTc-pIgA anti-CEA-SH en el modelo de tumor de ratón (ejemplo 3) sugirió una potencia de dirección eficaz de pIgA. Debido al tropismo mucoso intrínseco y la afinidad por biomarcador, la IgA polimérica podía alcanzar sus dianas muy eficazmente. Este trabajo demostró claramente el potencial de los anticuerpos IgA anti-CEA de acuerdo con la invención para el diagnóstico y tratamiento de tumores mucosos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal contra antígeno carcinoembrionario (CEA), que tiene una actividad de inhibición directa del crecimiento de células tumorales sobre células tumorales que expresan CEA y comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) de los dominios variables de la cadena ligera (VL) y la cadena pesada

(VH) seleccionadas del grupo que consiste en:

a) la secuencia de VL-CDR1 de SEQ ID NO: 1; la secuencia AAT de VL-CDR2; la secuencia de VL-CDR3 de SEQ ID

NO: 2; la secuencia de VH-CDR1 de SEQ ID NO: 3; la secuencia de VH-CDR2 de SEQ ID NO: 4; la secuencia de VH-CDR3 de SEQ ID NO: 5; y

b) la secuencia de VL-CDR1 de SEQ ID NO: 6; la secuencia YAS de VL-CDR2; la secuencia de VL-CDR3 de SEQ ID

NO: 7; la secuencia de VH-CDR1 de SEQ ID NO: 8; la secuencia de VH-CDR2 de SEQ ID NO: 9; la secuencia de VH-CDR3 de SEQ ID NO: 10.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una región variable formada por la asociación de un dominio VL de SEQ ID NO: 11 y un dominio VH de SEQ ID NO: 12 o un dominio VL de SEQ ID NO: 13 y un dominio

VH de SEQ ID NO: 14.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es humano, humanizado o quimérico.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, que es un anticuerpo quimérico humano/de ratón.

5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una IgA.

6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es un anticuerpo polimérico.

7. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo secretor.

8. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que es un anticuerpo de IgA poliméric o secretor.

9. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que está acoplado a un agente de marcaje.

10. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en el tratamiento de un cáncer que sobreexpresa CEA.

12. Uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,in vitro,para el diagnóstico de cáncer que sobreexpresa CEA.

13. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde dicho cáncer es un cáncer mucoso del epitelio.

14. El anticuerpo para el uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer colorrectal, gástrico, de tiroides, pulmonar, de mama, de páncreas, de vesícula biliar, de vejiga urinaria, de ovario y de endometrio.

15. Un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en forma expresable.