ES2970888T3 - Dispositivo para la transfección in vivo mínimamente invasiva de tejido adiposo mediante electroporación y agente para su uso con dicho dispositivo - Google Patents

Abstract

Un método y dispositivo para electroporar adipocitos en la capa adiposa de tejido, donde el dispositivo incluye un marco, un primer electrodo acoplado al marco que tiene una primera superficie de contacto, un segundo electrodo acoplado al marco que tiene una segunda superficie de contacto, y donde el la primera superficie de contacto y la segunda superficie de contacto definen una zona de tratamiento entre ellas. El método incluye colocar un pliegue de tejido entre el primer y segundo electrodos de manera que la zona de tratamiento formada entre los dos electrodos incluya una capa adiposa de tejido y ningún músculo esquelético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para la transfección in vivo mínimamente invasiva de tejido adiposo mediante electroporación y agente para su uso con dicho dispositivo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un dispositivo para la transfecciónin vivomínimamente invasiva de tejido adiposo mediante electroporación.

Antecedentes

En la década de 1970, se ha descubierto que los campos eléctricos podían utilizarse para crear poros en las células sin causar daños permanentes a la célula. Este descubrimiento hizo posible la introducción de moléculas grandes, iones y agua en el citoplasma de una célula a través de la pared celular. En algunos casos, la electroporación puede utilizarse en tratamientos tópicos, tal como el cáncer de cabeza y cuello, para introducir sustancias químicas y otros compuestos en el tumor. Durante estos procedimientos, el paciente puede estar o no bajo anestesia general, por lo que deben minimizarse el dolor y los movimientos musculares involuntarios.

El músculo esquelético es una diana bien caracterizada para la administración de ADNinvivomediada por electroporación (PE). Los miocitos son capaces de producir y secretar proteínas durante largos periodos de tiempo, y se ha demostrado en repetidas ocasiones que las vacunas de ADN mejoradas con PE en el músculo son capaces de generar una respuesta inmunitaria. La piel es otra diana popular de la PE; es de fácil acceso y contiene una rica variedad de células inmunitarias. La función inmunitaria natural de la piel y su elevada tasa de renovación celular suelen dar lugar a respuestas humorales rápidas y potentes a la administración de ADN potenciada por PE. Sin embargo, las aplicaciones de la administración de ADN por PE muscular se complican por el espesor variable de la grasa subcutánea, lo que impide un enfoque de "talla única", ya que los diferentes espesores de la grasa dan lugar a diferentes profundidades de penetración de la aguja en el tejido muscular.

Históricamente, el tejido adiposo se ha considerado un tejido inerte utilizado principalmente para almacenar energía en forma de gotas de lípidos. Por ello, los procedimientos de ADN mejorados con PE no se han dirigido a esa capa específica de tejido. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la grasa subcutánea desempeña en realidad muchas funciones dinámicas. El tejido adiposo contiene muchas células madre y células inmunitarias, y actúa como un órgano endocrino al segregar numerosas hormonas, segrega muchas señales locales y contiene una elaborada red de capilares. Cualquier intento de lograr la transfecciónin vivodel tejido adiposo se ha limitado a técnicas quirúrgicas que requieren que el administrador corte y retire físicamente muestras de la piel del paciente para permitir el contacto directo con el tejido adiposo. Estos tratamientos son extremadamente invasivos y no son adecuados para dispositivos clínicos. Diferentes ejemplos de tales técnicas pueden hallarse en los documentos US 2003/149451 A1, WO 2015/192018 A1, US 2011/190659 A1, US 2011/009860 A1, US 2007/060989 A1, US 2005/182462 A1y WO 2009/091578 A1.

SUMARIO

La invención se define en el dispositivo de electroporación de la reivindicación 1 y el agente para uso con dicho dispositivo de electroporación de la reivindicación 11. Otros aspectos y realizaciones preferentes se definen en las reivindicaciones adjuntas. Los aspectos, las realizaciones y los ejemplos de la presente divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente a título ilustrativo. Además, los procedimientos presentados en la presente descripción se facilitan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista esquemática de un dispositivo de electroporación de la presente invención.

La Fig. 2 es una realización alternativa de un dispositivo de electroporación.

La Fig. 3 es una vista en sección tomada a lo largo de la línea 3-3 en la Fig. 2.

La Fig. 4 es una vista en perspectiva de un electrodo de placa.

La Fig. 5 es una vista en perspectiva de una realización de un electrodo de placa.

La Fig. 6 es un mapa de distribución del campo eléctrico que ilustra el electrodo de placa de la Fig. 5 aplicado a un pliegue de tejido.

La Fig. 7 es un mapa de distribución del campo eléctrico que ilustra el electrodo de placa de la Fig. 4 aplicado a un pliegue de tejido.

La Fig. 8 es una vista en perspectiva de una configuración de dos electrodos de placa aplicada a un pliegue de tejido.

La Fig. 9 es una simulación de campo E de la configuración ilustrada en la Fig. 8.

La Fig. 10 es un mapa de densidad de corriente eléctrica del montaje ilustrado en la Fig. 8.

La Fig. 11 es una vista en perspectiva de una configuración de aguja en tres electrodos aplicada a un pliegue de tejido.

La Fig. 12 es una simulación de campo E de la configuración ilustrada en la Fig. 11.

La Fig. 13 es un mapa de densidad de corriente eléctrica del montaje ilustrado en la Fig. 11.

La Fig. 14 es una vista en perspectiva de una configuración de placa de tres electrodos aplicada a un pliegue de tejido.

La Fig. 15 es una simulación de campo E de la configuración ilustrada en la Fig. 14.

La Fig. 16 es un mapa de densidad de corriente eléctrica del montaje ilustrado en la Fig. 14.

La Fig. 17. Datos de la almohadilla adiposa de cobaya. Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250|j1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo. Las áreas verdes indican las células que expresan GFP La sección de tejido tiene un espesor de 100 micrómetros.

La Fig. 18. Mayor aumento de la Fig. 17.

La Fig. 19. Datos de tejido adiposo de cobaya. Adipocitos individuales que expresan GFP alrededor del borde de las células, rodeando el interior no expresivo donde reside la gotita lipídica. Se transfectan numerosas células individuales. Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250<j>1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

La Fig. 20. Datos de tejido adiposo de conejo. Verde= expresión de GFP Rojo= lípido (tinción Oil Red O). Azul= núcleos celulares (tinción DAPI). Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250<j>1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

La Fig. 21. Imágenes confocales de tejido adiposo de cobaya. Numerosos núcleos celulares no están asociados a ninguna zona transfectada. La GFP se expresa en todo el borde de la célula. Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250<j>1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

La Fig. 22. La superficie transfectada no varía sensiblemente con un volumen de inyección comprendido entre 50 j l y 200 j 1 aproximadamente. Plásmido: Proteína roja fluorescente (RFP) a 0,5 mg/ml, 250 j 1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

La Fig. 23. Múltiples inyecciones seguidas de un único evento de electroporación. Cada punto de inyección es claramente visible. Los números indican el orden de inyección. Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250 j1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

La Fig. 24. La variación de la intensidad y el número de pulsos puede producir una señal de GFP más brillante (más células transfectadas). Plásmido: GFP a 0,5 mg/ml, 250 j1. Parámetros eléctricos: 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración, 200 ms de retardo.

Fig. 25. Administración de dMAb en tejido adiposo mediante PE. Hialuronidasa pretratada 2 horas antes de la PE de ADN. Plásmido= pGX9249. Las flechas indican el primer y el segundo tratamiento, respectivamente. El eje X indica los días transcurridos desde el último tratamiento. Tratamiento 1: 1 mg de ADN total, 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración. Tratamiento 2: 2 mg de ADN total, 75 V, 8 pulsos, 100 ms de duración.

La Fig. 26. Mismo estudio que la Fig. 25, mostrando la concentración individual de dMAb de cobaya. El animal resaltado en rojo recibió pulsos rápidos con un retardo de 9100 ms) en lugar de pulsos con un retardo de 1 seg.

La Fig. 27. Aguja de insulina frente a inyector de chorro: distribución del líquido en el tejido adiposo. Colorante=azul de metileno. Sin PE.

La Fig. 28. La descomposición tisular enzimática del tejido adiposo (pretratado con enzimas) mejora la distribución de fluidos. Colorante = azul de metileno.

Las Figs. 29 y 30. Optimización de PE. Cabe destacar las tendencias de la resistencia (Fig. 29) y la corriente (Fig. 30) con el aumento del número de pulsos. Cabe destacar también la variabilidad en el tratamiento de 100 V debido a la contracción muscular. Duración del pulso = 100 mseg. Retardo del pulso= 100 mseg.

La Fig. 31. Comparación de inmunogenicidad. Electroporación de ADN en piel adiposa y flancos. Parámetros: Tensión y volumen de tratamiento.

La Fig. 32. Modelo informático en 3D de un conjunto tejido-electrodo. PE no invasiva, con tejido plegado entre dos electrodos de placa.

La Fig. 33. Modelo informático en 3D de otro conjunto tejido-electrodo. PE invasiva mediante electrodos de aguja paralelos insertados directamente en el tejido.

La Fig. 34. Distribución simulada del campo eléctrico en diferentes tipos de tejido para configuraciones de electrodos de aguja (arriba) y de placa (abajo) utilizando una tensión de excitación de 200 V. Los histogramas (de izquierda a derecha: adiposo, músculo, piel) cuantifican la distribución del campo eléctrico dentro de cada tipo de tejido para campos eléctricos superiores a 50 V/cm. Las imágenes de la derecha muestran las distribuciones del campo eléctrico utilizadas en el análisis cuantitativo, con contornos y etiquetas para la piel (S), el tejido adiposo (A) y el músculo (M). Cada segmento de la barra de escala (blanco o negro) tiene 10 mm de longitud, y la longitud total de la barra de escala es de 20 mm.

La Fig. 35. Inyección de colorante en la almohadilla adiposa subcutánea de cobaya. A. Almohadilla adiposa intacta tras una única inyección de 100 pl. B. Inyección en un solo sitio seccionada a lo largo del plano sagital para mostrar la distribución del fluido dentro del tejido. C. Almohadilla adiposa intacta tras cinco inyecciones de 50 pl. Las flechas indican los puntos de inyección.

La Fig. 36. Procedimiento PE adiposa, mostrando una región interescapular rasurada antes de la aplicación de los electrodos. B. el lugar de tratamiento sujeto entre dos electrodos de placa no invasivos. C. una vista posterior del lugar de tratamiento sujeto.

La Fig. 37. Parte Superior: Distribución de la expresión del constructo informador de GFP (verde) por las almohadillas adiposas intactas de cobaya tras una PE adiposa no invasiva de 50 V a 200 V. Parte Inferior: Comparación de la señal fluorescente en el lugar de tratamiento de cobayas que recibieron la inyección de ADN plasmídico sin PE (izquierda) o con PE adiposa 200V (derecha). Los marcadores indican septos de colágeno (*), adipocitos que expresan GFP (cabezas de flecha) y regiones de alta autofluorescencia (flecha). Las barras de escala son de 10 mm (parte superior) o 100 pm (parte inferior).

La Fig. 38. Para el análisis histológico posterior se utilizó una almohadilla adiposa de cobaya intacta, después de una electroerosión adiposa a 200 V (izquierda); la línea de puntos indica el plano de sección. Derecha) La sección de la izquierda se cortó a lo largo de la línea de puntos en secciones histológicas de 100 pm de espesor. La GFP (verde) se superpone a la imagen en color de campo claro del tejido sin teñir. Las barras de escala son de 10 mm (izquierda) y 1 mm (derecha).

La Fig. 39. Imagen confocal que muestra la expresión de GFP (verde) y los núcleos (azul) en un único plano focal (columna central) y dos perspectivas tridimensionales diferentes (dos columnas de la derecha).

La Fig. 40. Cinética de la expresión génica y cambios histológicos tras la PE adiposa a 200 V. Las barras de escala para la expresión de GFP (arriba) son de 10 mm, y las barras de escala para las secciones teñidas con H&E (abajo) son de 200 pm.

Las Figs. 41 y 42. Respuesta de anticuerpos de cobayas a la vacunación PE adiposa e ID-PE con ADN plasmídico que codifica el antígeno de la gripe. Las cobayas fueron vacunadas en la semana 0, semana 3, semana 6 y semana 21 con 25 pg de plásmido. Fig. 41: Cinética de inmunogenicidad humoral de diferentes procedimientos de tratamiento con adiposidad-PE en cobayas, con ID-PE (piel) como comparación (n=4). Fig. 42: Los mismos datos de inmunogenicidad, agrupados por tensión PE (n = 8 para HV adiposo y L V adiposo, n = 4 para piel). Los datos son la media geométrica del título ± error estándar. Los parámetros del tratamiento Adiposa-PE se abrevian como HV = alta tensión (200V), LV = baja tensión (50V), y para el gráfico de la Fig. 41, el número de puntos de inyección de ADN se indica con un número (1 o 5).

La Fig. 43. Respuesta inmunitaria de las células T de cobayas a la vacunación PE adiposa e ID-PE con ADN plasmídico que codifica el antígeno de la gripe. Las cobayas fueron vacunadas en la semana 0, semana 3, semana 6 y semana 21 con 25 pg de plásmido, y la ELISPOT se realizó 18 días después de la última vacunación. Los resultados se muestran para el pool de péptidos 1. Los grupos de tratamiento se dividen según el lugar de la PE (piel o adiposo), y los tratamientos PE adiposa se dividen a su vez según la tensión (HV = 200V, LV = 50V) y el número de lugares de inyección del plásmido (1 o 5). Los datos son la media geométrica ± error estándar (n=4).

La Fig. 44 es una vista en perspectiva de una realización alternativa de electrodos de placa acoplados a un dispositivo de electroporación.

La Fig. 45 es una fotografía del dispositivo de electroporación de la Fig. 44 siendo utilizado en un sujeto de prueba.

Las Figs. 46-48. Datos eléctricos, en particular, datos de corriente (Fig. 46), datos de tensión (Fig. 47) y datos de resistencia (Fig. 48), promediados cada uno de ellos a partir de la aplicación de calibradores aislados y no aislados a cuatro cobayas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERENTES

Los inventores han desarrollado un dispositivo y un procedimiento de electroporación que se dirigen y transfectan la capa adiposa del tejidoin vivode forma mínimamente invasiva. Más específicamente, el tratamiento utiliza una pluralidad de electrodos de placa, junto con un mecanismo de inyección, para exponer una región de tejido a un volumen de un agente que puede ser medido previamente, y luego producir un campo eléctrico dentro de la misma región de tejido configurado para dirigirse a la capa adiposa causando la electroporación en los adipocitos correspondientes.

I. DEFINICIONES

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones. A continuación se describen los materiales preferentes, aunque en la práctica o en las pruebas de la presente invención se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria. Los materiales y ejemplos desvelados en la presente memoria son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Los términos "comprende", "incluye", "tiene", "puede", "contiene" y sus variantes, como se utilizan en la presente memoria, pretenden ser expresiones, términos o palabras transitorias abiertas que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares "un", "y" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" las realizaciones o los elementos presentados en la presente memoria, tanto si se exponen explícitamente como si no.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “aproximadamente”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertos aspectos, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

El término "agente" puede significar un polipéptido, un polinucleótido, una molécula pequeña o cualquier combinación de los mismos. El agente puede ser una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo, un fragmento del mismo, una variante del mismo, o una combinación de los mismos, como se detalla en el documento WO/US2014/089492. El término "agente" puede significar una composición que comprende un polipéptido, un polinucleótido, una pequeña molécula o cualquier combinación de los mismos. La composición puede comprender una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación del mismo, como se detalla en el documento WO/US2014/089492. El agente puede estar formulado en agua o en un tampón, por ejemplo. El tampón puede ser citrato salino-sódico (SSC) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), por ejemplo. El contenido iónico de los tampones puede aumentar la conductividad, lo que provoca un mayor flujo de corriente en el tejido objetivo. La concentración del polinucleótido formulado puede estar entre 1 |jg y 20 mg/ml. La concentración del polinucleótido formulado puede ser de 1 jg/m l, 10 jg/m l, 25 jg/ml, 50 jg/ml, 100 jg/ml, 250 jg/ml, 500 jg/ml, 750 jg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml o 20 mg/ml, por ejemplo.

El término "anticuerpo" puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, o fragmentos, o derivados de los mismos, que incluyen Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de cadena simple, y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado de la muestra de suero de un mamífero, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo purificado por afinidad, o cualquier mezcla de los mismos que presente suficiente especificidad de unión a un epitopo deseado o a una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo sintético como se describe en la presente memoria.

"Fragmento de anticuerpo" o "fragmento de un anticuerpo", tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable. La porción no incluye los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fe del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diabodies, moléculas Fv de cadena única (scFv), polipéptidos de cadena única que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contengan las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contengan sólo una región variable de cadena pesada y polipéptidos de cadena única que contengan las tres CDR de la región variable de cadena pesada.

El término "fragmento" tal y como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los fragmentos pueden ser fragmentos de a Dn seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de proteínas que se exponen a continuación. El término "fragmento" también puede hacer referencia a una secuencia polipeptídica o una porción de la misma que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Un "péptido", "proteína" o "polipéptido", como se utiliza en la presente memoria, puede significar una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintético o una modificación o combinación de natural y sintético.

Los términos "polinucleótido" u "oligonucleótido" o "ácido nucleico", como se utiliza en la presente memoria, significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, o puede contener porciones de secuencia bicatenario y monocatenario. El polinucleótido puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, a Rn o un híbrido. El polinucleótido puede contener combinaciones de desoxirribo y ribo-nucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina, isoguanina, y nucleótidos y nucleósidos sintéticos o no naturales. Los polinucleótidos se pueden obtener por procedimientos de síntesis química o por procedimientos recombinantes.

"Individuo", tal como se utiliza en la presente memoria, puede significar un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un chimpancé, una cobaya, un cerdo, un macaco, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un ratón, una rata u otro primate no humano.

"Variante" utilizado en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico significa (i) una porción o fragmento de una secuencia de nucleótidos de referencia; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos de referencia o una porción de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico de referencia o al complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con el ácido nucleico de referencia, el complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica.

La variante puede definirse además como un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva al menos una actividad biológica. Ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como algo que típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, tal como se entiende en la técnica (Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y su carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden ser sustituidos y seguir conservando la función proteica. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también puede utilizarse para revelar las sustituciones que harían que las proteínas conservaran su función biológica. La consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilicidad media local de ese péptido, una medida útil que, según se ha informado, se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede dar lugar a que los péptidos conserven la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tengan valores de hidrofilicidad dentro de un margen de ±2. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral concreta de ese aminoácido. En consonancia con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y, en particular, de las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal y como revelan la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y otras propiedades.

Una variante puede ser una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia genética completa o en un fragmento de la misma. La secuencia de ácido nucleico puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia genética o de un fragmento de la misma. Una variante puede ser una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma. La secuencia de aminoácidos puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma

El término "vector", tal como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector viral, un bacteriófago, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser de ADN o de ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante y, preferentemente, es un plásmido de ADN.

Para la citación de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

II) DISPOSITIVO DE ELECTROPORACIÓN

La invención se dirige a un dispositivo de electroporación que incluye un dispositivo de aplicación que tiene una pluralidad de electrodos de placa no invasivos. El dispositivo de electroporación también puede incluir una fuente de alimentación que proporciona una señal de electroporación a los electrodos de placa, donde, cuando los electrodos están en contacto eléctrico con una muestra biológica, la señal de electroporación suministrada a los electrodos es absorbida principalmente por la capa adiposa de tejido de tal manera que se crea un campo eléctrico en la capa adiposa objetivo. Este campo eléctrico provoca la electroporación dentro de la pared celular de los adipocitos correspondientes, aumentando así la permeabilidad de las membranas celulares y permitiendo, por ejemplo, la introducción de un agente en las células. Como se ilustra en la Fig. 1, el dispositivo de electroporación 10 de la presente invención incluye una carcasa 14 que contiene un generador de señales de electroporación (PE) 18, un aplicador 22 acoplado de forma extraíble a la carcasa 14, y un dispositivo de inyección 26 para inyectar un volumen predeterminado de un agente, como lípidos, en la capa adiposa de la muestra antes de que se produzca la electroporación.

Como se muestra en la Fig. 1, el aplicador manual 22 de la presente invención incluye un bastidor 30, un primer electrodo 34 acoplado al bastidor 30, teniendo el primer electrodo 34 una primera superficie de contacto 38, y un segundo electrodo 42 acoplado al bastidor 30, teniendo el segundo electrodo 42 una segunda superficie de contacto 46 de tal manera que la primera superficie de contacto 38 y la segunda superficie de contacto 46 se enfrentan entre sí y están sustancialmente alineadas. Durante su uso, el aplicador 22 está configurado para permitir al usuario manipular el bastidor 30 haciendo que cambie la distancia entre la primera superficie de contacto 38 y la segunda superficie de contacto 46. A efectos de la presente solicitud, la distancia entre la primera superficie de contacto 38 y la segunda superficie de contacto 46 se denomina en la presente memoria "distancia entre electrodos 50."

El bastidor 30 del aplicador 22 incluye una base 54, y una pluralidad de brazos elásticos 58 que se extienden cada uno desde la base 54 para producir un extremo distal 62 correspondiente. Cuando se ensamblan, cada extremo distal 62 está configurado para tener uno de los electrodos 34, 42 acoplado al mismo. En la realización ilustrada, los brazos 58 están configurados para que el usuario pueda deformarlos elásticamente, permitiendo que los extremos distales 62 y sus correspondientes electrodos 34, 42, se muevan. Los electrodos correspondientes 34, 42, pueden moverse independientemente o en tándem uno respecto del otro, por ejemplo. En la realización ilustrada, el bastidor 30 incluye dos brazos 58 (Fig. 1); sin embargo, en una realización alternativa, el bastidor 30 puede incluir más o menos brazos 58 para soportar el número de electrodos necesarios para el tratamiento del tejido diana deseado.

Como se ilustra en la Fig. 2, una realización alternativa del aplicador 22' incluye un bastidor 30' que tiene tres brazos 58a', 58b', 58c' que se extienden desde el mismo. Más específicamente, el bastidor 30' incluye dos brazos opuestos 58a', 58b' configurados para soportar los primeros y segundos electrodos 34, 42 de tal manera que la primera superficie de contacto 38 y la segunda superficie de contacto 46 se enfrentan y están sustancialmente alineadas entre sí. El bastidor 30' también incluye un tercer brazo 58c' configurado para soportar un tercer electrodo 66' de tal manera que la tercera superficie de contacto 68' del tercer electrodo 66' está posicionada perpendicularmente a las primeras y segundas superficies de contacto 38', 46'. En el aplicador alternativo 22', la distancia entre electrodos 50' se define como la distancia entre la primera superficie de contacto 38' y la segunda superficie de contacto 46' (es decir, la distancia entre las dos superficies de contacto enfrentadas).

El aplicador 22 también incluye un mecanismo de ajuste 56 para fijar o manipular de otro modo la distancia entre electrodos 50 en preparación para y durante el tratamiento. El mecanismo de ajuste 56 incluye una varilla 70 que se extiende entre los dos brazos 58 del bastidor 30 y se acopla a ellos de forma roscable, de modo que la rotación de la varilla 70 con respecto a los brazos 58 en una primera dirección hace que la distancia entre electrodos 50 se reduzca. Por el contrario, la rotación de la varilla 70 con respecto a los brazos 58 en una segunda dirección, opuesta a la primera, hace que la distancia entre electrodos 50 aumente. En la realización ilustrada, la varilla 70 está configurada de tal manera que la distancia entre electrodos 50 permanecerá fija a menos que la varilla 70 sea girada por el usuario (es decir, las roscas no son accionables hacia atrás). En realizaciones alternativas, el mecanismo de ajuste 56 puede incluir un pestillo (no mostrado) ajustable entre una configuración desacoplada, en la que la distancia entre electrodos 50 es ajustable por el usuario, y una configuración acoplada, en la que la distancia entre electrodos 50 es fija. En otras realizaciones, el mecanismo de ajuste 56 puede incluir cualquier forma de mecanismo de ajuste bien conocido en la técnica y no descrito en la presente memoria.

El aplicador 22 también puede incluir un sensor 74 en comunicación operable con el generador de señales 18 y configurado para determinar la distancia entre electrodos 50 durante el funcionamiento del dispositivo 10. Durante su uso, el sensor 74 envía señales al generador de señales 18 indicando la distancia actual de los electrodos 50. En algunas realizaciones, el sensor 74 puede incluir un sensor de resistencia, un sensor óptico, y similares acoplados a la estructura 30 del aplicador 22. En la realización ilustrada, el sensor 74 proporciona señales al generador de señales 18 que permiten al generador 18 registrar los datos de la distancia entre electrodos 50 y compensar automáticamente las diferentes distancias entre electrodos 50 durante el tratamiento. En realizaciones alternativas, el sensor 74 puede indicar la distancia en una pantalla (no mostrada) permitiendo al usuario compensar la distancia del electrodo 50 manualmente. En otras realizaciones, el aplicador 22 puede configurarse de tal manera que el usuario pueda introducir una distancia predeterminada de electrodos 50 en el generador de señales 18, por lo que el aplicador 22 ajustará automáticamente los electrodos 34, 42 para producir la distancia de electrodos 50 adecuada. En otras realizaciones, el sensor puede ser de naturaleza mecánica, mostrando la distancia del electrodo 50 en un dial y similares.

Ilustrado en la Fig. 4, el primer electrodo de placa 34 del aplicador 22 tiene una primera superficie de contacto 38 configurada para contactar directamente con el tejido diana. El primer electrodo de placa 34 puede tener cualquier forma. La forma puede ser rectangular, por ejemplo. El primer electrodo de placa 34 también incluye un primer perímetro 78 que se extiende alrededor y define la extensión de la superficie de contacto 38. Durante el uso, el primer electrodo de placa 34 está en comunicación operable con el generador de señales 18 y está configurado para acoplarse y formar conductividad eléctrica con el tejido de la muestra durante el tratamiento. Como tal, el electrodo de placa 34 es capaz de aplicar las señales de electroporación producidas por el generador de señales 18 al tejido diana. El electrodo de placa 34 también puede detectar parámetros en el tejido diana, como la impedancia, la tensión, la corriente y similares, y transmitir esa información al generador de señales 18 para diagnóstico y retroalimentación. En la realización ilustrada, la primera superficie de contacto 38 del primer electrodo de placa 34 es sustancialmente plana; sin embargo, en realizaciones alternativas, la primera superficie de contacto 38 puede tener un contorno curvilíneo. En otras realizaciones, la primera superficie de contacto 38 puede tener cualquier forma o tamaño que maximice la superficie de contacto entre el electrodo 34 y el tejido diana. En otras realizaciones, el aplicador puede incluir una pluralidad de electrodos 34, cada uno de los cuales incluye una primera superficie de contacto 38 específicamente dimensionada y conformada para corresponderse con una zona específica del cuerpo de un paciente o individuo de ensayo. En otras realizaciones, el tamaño y la forma de los electrodos pueden utilizarse para focalizar la distribución del campo eléctrico dentro del tejido diana. En otras realizaciones, la primera superficie de contacto 38 puede incluir un patrón o moleteado formado en ella. En otras realizaciones, la primera superficie de contacto 38 puede incluir un revestimiento o adhesivo aplicado a la misma para mejorar la conductividad o el agarre entre el electrodo 34 y el tejido diana.

Las Figs. 5 y 6 ilustran una realización alternativa de un electrodo de placa 34". El electrodo de placa 34" es sustancialmente similar y funciona de la misma manera que el electrodo de placa 34, descrito anteriormente. Como tal, sólo las diferencias entre los dos electrodos 34", 34 se describirán en detalle en este documento. Mejor ilustrado en la Fig. 5, la superficie de contacto 38" del electrodo de placa 34" incluye una base 54", y una pluralidad de protuberancias 58" cada una extendiéndose sustancialmente normal a la base 54" una profundidad de protuberancia 64" para formar un extremo distal 62". Durante el uso, las protuberancias 58" del electrodo de placa 34" presionan el tejido diana sin perforarlo, lo que permite que las protuberancias 58" alteren la capa superior de la piel, mejorando la distribución del campo eléctrico dentro del tejido diana (compárese la Fig. 6 con la Fig. 7) y mejorando también el agarre. Más específicamente, las protuberancias 58" aumentan la magnitud del campo eléctrico formado dentro del tejido diana para una tensión de entrada dado. Aunque todas las protuberancias 58" de la realización ilustrada producen una profundidad de protuberancia 64'' similar, se entiende que cada protuberancia 58" puede tener un tamaño diferente según sea necesario para producir la conductividad y el agarre deseados con el tejido objetivo. Además, la realización ilustrada incluye una profundidad de protrusión 64" de aproximadamente 500 micrómetros, 600 micrómetros, 700 micrómetros, 800 micrómetros, 900 micrómetros, 1 mm, 1,5 mm, 2 mm, 2,5 mm y 3 mm.

En la realización ilustrada, cada protuberancia 58" del electrodo 34" tiene una forma sustancialmente piramidal. Cada protuberancia piramidal también puede tener una anchura de base de aproximadamente 500 micrómetros por 500 micrómetros, 600 micrómetros por 600 micrómetros, 700 micrómetros por 700 micrómetros, 800 micrómetros por 800 micrómetros, 900 micrómetros por 900 micrómetros, 1 mm por 1 mm, 1,5 mm por 1,5 mm, 2 mm por 2 mm, 2,5 mm por 2,5 mm, 3 mm por 3 mm. En realizaciones alternativas, cada protuberancia piramidal también puede tener dimensiones de base no cuadradas. En realizaciones alternativas, cada protuberancia 58" puede tener cualquier otra forma configurada para presionar y deformar el tejido objetivo sin perforar el tejido durante la operación. Por ejemplo, las protuberancias 58" pueden tener forma cilíndrica, rectangular, cónica, frusto-cónica o frusto-piramidal. Además, cada protuberancia 58" puede incluir una anchura de aproximadamente 500 micrómetros, 600 micrómetros, 700 micrómetros, 800 micrómetros, 900 micrómetros, I mm, 1,5 mm, 2 mm, 2,5 mm o 3 mm, por ejemplo.

En otras realizaciones, cada protuberancia 58" puede estar configurada para perforar el tejido diana. Por ejemplo, dichas protuberancias 58" pueden incluir una aguja (no mostrada) que se extiende desde la base 54". En otras realizaciones, dichas protuberancias 58" pueden tener forma de aguja hipodérmica, aguja de trocar y similares. En otras realizaciones, dichas protuberancias 58" pueden tener una punta roma o una punta plana. En otras realizaciones, cada protuberancia 58" puede tener una forma diferente a la de otras protuberancias 58" del mismo electrodo.

Ilustradas en la Fig. 5, las protuberancias 58" del electrodo 34" están colocadas uniformemente sobre la base 58" del electrodo de placa 34" en forma de un conjunto rectangular. En realizaciones alternativas, las protuberancias 58" pueden colocarse en cualquier patrón necesario para proporcionar la conductividad y el agarre necesarios con el tejido diana. Por ejemplo, las protuberancias 58" pueden colocarse en anillos concéntricos (no mostrados) u otros patrones.

Las Figs. 44 y 45 ilustran otra realización alternativa de un electrodo de placa 34". El electrodo de placa 34' " es sustancialmente similar y funciona de la misma manera que el electrodo de placa 34, descrito anteriormente. Como tal, sólo las diferencias entre los dos electrodos 34", 34 se describirán en detalle en este documento. Mejor ilustrado en la Fig. 44, la superficie de contacto 38" del electrodo de placa 34" incluye una o más porciones no aisladas 500, donde la superficie de contacto 38" crea una primera resistencia con el tejido diana cuando está en contacto con el mismo, y una o más porciones aisladas 504, en el que la superficie de contacto 38" crea una segunda resistencia con el tejido diana cuando está en contacto con el mismo que es mayor que la primera resistencia. Durante el uso, la interacción de las partes aisladas y no aisladas 500", 504" de la superficie de contacto 38" con el tejido diana afecta al campo eléctrico resultante aplicado al tejido diana. En particular, al aislar al menos una parte de la superficie de contacto 38" del electrodo 34", el electrodo 34" enfoca mejor el campo eléctrico dentro de la capa adiposa del tejido diana, disminuyendo así la cantidad de contracción muscular y dolor experimentados por el paciente. Dicho de otro modo, el electrodo de placa alternativo 34" reduce la cantidad de corriente que viaja a través del músculo en comparación con un electrodo de placa de forma y tamaño similares que no tiene una parte aislada (véanse las Figs.

46 a 48; mostrando la diferencia entre un "calibrador aislado" en el que está presente al menos una porción aislada 504", y un calibrador no aislado en el que no está presente ninguna porción aislada 504").

Ilustrada en las Fig. 44 y 45, la porción aislada 504" del electrodo de placa 34" incluye una capa de material aislante 508" colocada entre la superficie de contacto 38" y el tejido diana para aumentar la resistencia entre ellos (véase la Fig. 45). En la realización ilustrada, el electrodo 34" incluye una vaina 512" formada de material aislante 508" que se puede colocar de forma extraíble sobre al menos una parte del electrodo 34". Dependiendo del tamaño y forma de la vaina 512", diferentes tamaños y formas de la superficie de contacto 38" pueden ser revestidos por el material aislante 508". En otras realizaciones, el material aislante 508" puede aplicarse a la superficie de contacto 38" del electrodo 34" (por ejemplo, como un revestimiento). En otras realizaciones, el material aislante 508" puede aplicarse a la superficie de contacto 38" con un adhesivo extraíble (no mostrado).

El segundo electrodo de placa 42 es sustancialmente similar al primer electrodo de placa 34 y funciona de la misma manera que este. El segundo electrodo de placa 42 incluye una segunda superficie de contacto 46 que tiene un segundo perímetro 60 que define la extensión de la segunda superficie de contacto 46. Como tal, el segundo electrodo de placa 42 no se describirá en detalle en la presente memoria. Aunque la realización ilustrada muestra el segundo electrodo de placa 42 del mismo tamaño y forma que el primer electrodo 34, se entiende que el segundo electrodo 42 puede tener un tamaño y una forma diferentes a los del primer electrodo 34. Además, la segunda superficie de contacto 46 del segundo electrodo 42 puede tener un tamaño y una forma diferentes a los de la primera superficie de contacto 38 del primer electrodo 34. En otras realizaciones, un electrodo de placa puede incluir protuberancias 58" mientras que otro electrodo no. Además, un electrodo de placa puede incluir una porción aislada 504" mientras que el otro electrodo puede no incluirla.

Como se ilustra en la Fig. 1, el dispositivo 10 puede incluir además un dispositivo de inyección 26 para inyectar agente en el tejido diana en una ubicación deseada. Más específicamente, el dispositivo de inyección 26 incluye un depósito 82 configurado para contener un volumen predeterminado de agente en el mismo, y una aguja de inyección 86 que se extiende desde y en comunicación fluida con el depósito 82 para producir un extremo distal 90. Durante el uso, el usuario introduce la aguja de inyección 86 en el tejido diana de forma que el extremo distal 90 se sitúe a la profundidad deseada (es decir, dentro de la capa adiposa 104; véase la Fig. 11). A continuación, el usuario puede inyectar el fluido contenido en el depósito 82 a través de la aguja 86, por el extremo distal 90, y en el tejido deseado. Aunque el dispositivo de inyección 26 ilustrado incluye una aguja hipodérmica (es decir, una aguja de insulina), en realizaciones alternativas, se entiende que puede utilizarse un inyector de chorro u otras formas de inyección.

Además, en algunas realizaciones, la aguja 86 del dispositivo de inyección 26 puede estar en comunicación operable con el generador de señales 18 y ser capaz de funcionar como un electrodo similar a los primeros y segundos electrodos de placa 34, 42 (véase la Fig. 1). En tales realizaciones, el generador de señal 18 puede ser capaz de enviar la señal de tratamiento a la aguja 86, así como recibir información, como la impedancia, el flujo de corriente, y similares de vuelta al generador de señal 18 para fines de diagnóstico y retroalimentación.

El dispositivo de inyección 26 también puede incluir un limitador de profundidad (no mostrado) para controlar la posición del extremo distal 90 dentro del tejido de la muestra. Durante el uso, el limitador de profundidad puede ajustarse a una profundidad predeterminada para que el limitador de profundidad impida que el extremo distal 90 de la aguja 86 penetre más allá de la profundidad deseada en el tejido. En algunas realizaciones, el limitador de profundidad puede incluir un tope duro que define un orificio guía. En tales realizaciones, la longitud del orificio guía dicta la profundidad a la que la aguja penetra en el tejido diana. En otras realizaciones, el limitador de profundidad también puede incluir un acoplador eléctrico para acoplar eléctricamente la aguja 86 con el generador de pulsos 18.

III) TRATAMIENTO DE LA CAPA ADIPOSA

El dispositivo descrito anteriormente puede utilizarse en diversos procedimientos terapéuticos destinados a transfectar tejido adiposo con un agente mediante electroporación. Cada tratamiento o "configuración" ofrece flexibilidad en cuanto al tamaño, la forma y las características del campo eléctrico resultante creado en el tejido de la muestra. Cada configuración ofrece también varios niveles de invasividad.

a) Configuración de dos electrodos

Para administrar el tratamiento mediante la configuración de tratamiento de dos electrodos, el usuario primero obtiene un paciente, tomando nota de la zona o región que desea tratar (en adelante en la presente memoria, la "región tisular 100"). Para los fines de esta aplicación, la región tisular 100 puede incluir tejido cutáneo que tenga, por ejemplo, una o más de una capa cutánea 104, una capa adiposa 108, y una capa muscular lisa 112.

Capa de piel. La capa de piel puede tener dos partes: una porción externa de epidermis y una porción de dermis, a la que puede estar conectada la epidermis. Debajo de la dermis puede existir una capa subcutánea que puede contener tejidos areolares y adiposos. Las fibras de la dermis pueden extenderse hasta la capa subcutánea y conectar ésta con la capa cutánea. La capa subcutánea puede estar unida a los tejidos y órganos subyacentes.

Epidermis. La epidermis puede estar compuesta por epitelio escamoso estratificado y contener queratinocitos, melanocitos y dendrocitos granulares no pigmentados (por ejemplo, células de Langerhans y células de Granstein). Los queratinocitos pueden estar organizados en varias capas. El número de capas puede depender de la localización en el cuerpo. Por ejemplo, cuando la exposición a la fricción es grande, la epidermis puede tener muchas capas, por ejemplo cinco. Cuando la exposición a la fricción no es grande, la epidermis puede tener menos de cinco capas, por ejemplo. La epidermis puede tener una o más de las siguientes capas: estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso, estrato lúcido y/o el estrato córneo.

Dermis. La dermis puede estar compuesta por tejido conjuntivo que contiene fibras colágenas y elásticas. La dermis puede ser gruesa o pensar según la localización en el cuerpo. Por ejemplo, la dermis puede ser más gruesa en las palmas de las manos y las plantas de los pies, pero más fina en los párpados. La dermis puede contener vasos sanguíneos, nervios, glándulas y folículos pilosos. La dermis puede tener una región o capa papilar, que puede estar formada por tejido conjuntivo laxo que contiene fibras elásticas finas. La región papilar también puede presentar papilas dérmicas que se proyectan en la epidermis. Estas papilas pueden contener capilares, corpúsculos del tacto (o corpúsculos de Meissner), que son terminaciones nerviosas sensibles al tacto. Las papilas dérmicas pueden provocar crestas en la epidermis suprayacente.

La porción restante de la dermis puede ser la región o capa reticular. Esta región puede contener tejido conjuntivo densamente empaquetado y haces de fibras colágenas y elásticas gruesas. Los distintos espesores de la región reticular pueden ser responsables, al menos en parte, de las diferencias en el espesor de la piel.

Capa adiposa. La capa o tejido adiposo puede ser una forma de tejido conjuntivo laxo en el que los adipocitos almacenan grasa. Un adipocito puede tener el citoplasma y el núcleo empujados hacia el borde de la célula por la gota de grasa que contiene. Cada adipocito puede estar rodeado por una membrana basal colágena como soporte estructural, y puede estar en contacto con un capilar. Los grupos de adipocitos pueden estar contenidos en "lóbulos", que pueden estar unidos por septos colágenos. El tejido adiposo puede encontrarse allí donde se localice tejido conjuntivo laxo. El tejido adiposo puede encontrarse en la capa subcutánea, debajo de la piel.

Capa muscular lisa. La capa de músculo liso puede estar situada en las paredes de estructuras internas huecas como, por ejemplo, los vasos sanguíneos. El músculo liso también puede estar unido a los folículos pilosos. La capa muscular lisa es tejido muscular involuntario no estriado y puede estar influenciada por nervios involuntarios y algunas hormonas. La capa muscular lisa es un tipo de capa muscular distinta del tejido muscular cardíaco y del tejido muscular esquelético. El músculo esquelético está unido principalmente a los huesos y puede mover partes del esqueleto. El músculo esquelético también es estriado, porque las estrías, o estructuras alternas en forma de bandas claras y oscuras, son visibles cuando se examina el tejido al microscopio, y voluntario, porque puede contraerse y relajarse mediante un control consciente. El tejido muscular cardíaco es estriado e involuntario y forma la mayor parte de la pared del corazón.

Con el área de tratamiento seleccionada, el usuario obtiene el dispositivo de inyección 26 e inserta la aguja 86 en la región tisular 100 de forma que el extremo distal 90 se posicione dentro de la capa adiposa 108. A continuación, el usuario inyecta un volumen de un agente, opcionalmente un volumen previamente medido de un agente, en la capa adiposa 108 de la región tisular 108, creando un punto de inyección 116. Una vez completa la inyección, el usuario retira la aguja 86 de la región tisular 100.

Con la aguja 86 retirada, el usuario manipula una porción de la región tisular 100 que contiene el punto de inyección 116 y crea un pliegue 120 en la misma. El tejido se manipula de forma que el tejido contenido dentro del pliegue 120 se limita a una capa de piel 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112. No se incluye músculo esquelético (no mostrado) en el pliegue 120. El pliegue resultante 120 incluye un primer lado 124, un segundo lado 128 opuesto al primer lado 124, y una parte superior 132 que se extiende entre el primer lado 124 y el segundo lado 128. (Fig. 8). El pliegue 120 también define un espesor de pliegue 134 definido como la distancia entre el primer lado 124 y el segundo lado 128.

Después de preparar el pliegue 120, el usuario manipula el bastidor 30 o el mecanismo de ajuste 67 del aplicador 22 hasta que la distancia entre electrodos 50 sea ligeramente mayor que el espesor del pliegue 134. A continuación, el usuario coloca el aplicador 22 de forma que cada electrodo 34, 42 se sitúe en lados opuestos del pliegue 120 con las superficies de contacto 38, 46 orientadas hacia dentro (véase la Fig. 9). Más específicamente, el usuario coloca el aplicador 22 de modo que la primera superficie de contacto 38 del primer electrodo de placa 34 esté en contacto con el primer lado 124 del pliegue 120, y la segunda superficie de contacto 46 de los segundos electrodos de placa 42 esté en contacto con el segundo lado 128 del pliegue 120, creando una zona de tratamiento 136 entre ellos. Una vez en posición, el usuario puede aumentar o disminuir la distancia de los electrodos 50 para sujetar eficazmente el pliegue 120 entre los dos electrodos 34, 42.

A los efectos de la presente solicitud, la zona de tratamiento 136 se define como el volumen de espacio situado entre los primeros y segundos electrodos 34, 42 y definido en dos lados por las primeras y segundas superficies de contacto 38, 46, y definido en los lados restantes por una barrera imaginaria que se extiende entre el primer perímetro 78 de la superficie de contacto primera 38 y el segundo perímetro 60 de la superficie de contacto segunda 46 (véanse las Figs.

8-10). Como tal, después de que el usuario haya colocado los primeros y segundos electrodos 34, 42 en lados opuestos del pliegue 120, la zona de tratamiento 136 del tratamiento descrito actualmente contendrá al menos una porción del pliegue 120 y al menos una porción del sitio de inyección 116 en el mismo. En la realización ilustrada, el tejido colocado dentro de la zona de tratamiento 136 durante el tratamiento se limita a una capa de piel 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112. La zona de tratamiento 136 no incluye ningún músculo esquelético.

Aunque la realización ilustrada muestra las superficies de contacto 38, 42 de los electrodos 34, 42 colocadas en contacto directo con el pliegue 120 , se entiende que puede utilizarse gel conductor (no mostrado) u otras sustancias para mejorar la comunicación eléctrica entre los electrodos 34, 42 y el pliegue 120.

Una vez que los electrodos 34, 42 están en posición, el sensor 74 del aplicador 22 determina la distancia de los electrodos 50 y transmite esa información al generador de señales 18 permitiéndole establecer los parámetros de la señal de electroporación 150 en consecuencia. El generador de señales 18 también puede producir una señal de prueba (es decir, un pulso de baja tensión) donde la corriente y la tensión resultantes pueden ser detectados por los electrodos 34, 42 y posteriormente utilizados por el generador de señales 18 para calcular la impedancia del tejido que se está tratando. Además, los datos detectados por los electrodos 34, 42 durante la señal de prueba también pueden utilizarse para verificar que los pulsos se dispararon con éxito. Para ello, el generador de señales 18 compara si el flujo de corriente se mantiene durante la duración de los pulsos, si los tiempos no coinciden (es decir, faltan más de uno o dos puntos de recogida de datos), entonces los pulsos pueden considerarse incompletos. Más específicamente, al menos uno de las tensiones de pulso 158, longitud de pulso 162, número de pulsos y/o retardo de pulso 166 de la señal de electroporación puede determinarse al menos parcialmente por la distancia de electrodo 50 (descrita más adelante). En la realización ilustrada, la distancia entre electrodos 50 se determina automáticamente mediante el sensor 74 del aplicador 22. Sin embargo, en realizaciones alternativas, el usuario puede medir manualmente la distancia entre electrodos 50 e introducirla en el dispositivo 10.

En la realización ilustrada, la señal de electroporación 150 consiste en una serie de "pulsos 154" eléctricos, donde cada pulso 154 es entregado a una tensión de pulso predeterminada 158 y dura una longitud de pulso predeterminada 162. Además, cada pulso individual 154 está separado en el tiempo de los pulsos adyacentes 154 por un retardo de pulso 166. (Fig. 26). En la realización ilustrada, la señal de electroporación incluye una tensión de pulso 158 de entre aproximadamente 50 V y aproximadamente 200 V. En otra realización, la señal puede incluir una tensión de pulso 158 de entre aproximadamente 5 V y aproximadamente 10 V. En otras realizaciones, la señal puede incluir una tensión de pulso 158 de aproximadamente 1 kV. Además, la longitud de pulso de electroporación 162 ilustrada es de aproximadamente 100 microsegundos, 200 microsegundos, 300 microsegundos, 400 microsegundos, 500 microsegundos, 600 microsegundos, 700 microsegundos, 800 microsegundos, 900 microsegundos, 1 milisegundo, 10 milisegundos, 50 milisegundos, 75 milisegundos y 100 milisegundos. Aún más, el retardo del pulso de electroporación 166 es de aproximadamente 1 milisegundo, 50 milisegundos, 100 milisegundos, 500 milisegundos y 1 segundo. Aún más, cada señal de electroporación incluye entre aproximadamente 1 pulso y aproximadamente 10 pulsos. Conjuntamente, en algunas realizaciones la señal de electroporación 150 puede incluir 3 pulsos a aproximadamente 200 V de aproximadamente 100 milisegundos de duración con 200 milisegundos de retardo entre pulsos. En otras realizaciones, la señal de electroporación 150 puede incluir 3 pulsos a aproximadamente 50 V de aproximadamente 100 milisegundos de duración con 200 milisegundos de retardo entre pulsos. En otras realizaciones, la señal de electroporación 150 puede incluir 10 pulsos a aproximadamente 50 V de 100 milisegundos de duración con 1 segundo de retardo entre pulsos. En otras realizaciones, la señal de electroporación 150 puede incluir 8 pulsos de 75 V de aproximadamente 100 milisegundos de duración con aproximadamente 100 milisegundos de retardo entre pulsos. En otras realizaciones, la señal de electroporación 150 puede incluir 3 pulsos de entre aproximadamente 500 V y aproximadamente 1000 V de aproximadamente 10 microsegundos y aproximadamente 100 microsegundos de duración con aproximadamente 100 milisegundos a aproximadamente 1 segundo de retraso entre pulsos. En otras realizaciones, la señal de electroporación puede incluir un solo pulso.

Después de establecer los parámetros de la señal de electroporación, el generador de señales 18 del dispositivo 10 envía la señal deseada al primer y segundo electrodos 34, 42 de tal manera que uno de los primeros electrodos 34 actúa como uno de los electrodos positivos o el electrodo negativo mientras que el segundo electrodo 42 actúa como el otro de los electrodos positivos o el electrodo negativo. Más específicamente, el generador de señales 18 puede ajustar los parámetros de la señal de electroporación 150 dependiendo, al menos parcialmente, del valor de impedancia detectado y de la distancia entre electrodos 50. Al recibir la señal de electroporación, los electrodos 34, 42 conducen la señal en serie al pliegue 120 creando un campo eléctrico en el mismo (Figs. 9 y 10). El campo eléctrico resultante se concentra en la capa adiposa 108 creando una región de transfección dentro del pliegue 120. Más específicamente, el campo eléctrico puede crear una región de transfección de forma sustancialmente esférica o elipsoidal. Sin embargo, en realizaciones alternativas, el tamaño y la forma de la región de transfección pueden depender, al menos parcialmente, de la distribución del campo eléctrico dentro del tejido diana y de la ubicación y cantidad de agente que se inyectó en el tejido diana. Además, la corriente fluye libremente a través de la capa muscular subyacente 112 y es relativamente baja cerca del punto de inyección 116 en comparación con un tratamiento similar realizado mediante configuraciones de electrodos de aguja penetrantes utilizadas habitualmente para la administración de electroporación subcutánea o intramuscular. Estas características del campo eléctrico son potencialmente beneficiosas para tratamientos en los que no se desea una respuesta inmunitaria.

Una vez finalizada la electroporación, los electrodos 34, 42 pueden retirarse del pliegue 120.

b) Configuración de tres electrodos con aguja

Para administrar el tratamiento mediante la configuración de tres electrodos, el usuario primero obtiene un paciente, tomando nota de la región de tejido 100 que desea tratar. Para los fines de esta aplicación, la región tisular 100 puede incluir tejido cutáneo que tenga, por ejemplo, una o más de una capa cutánea 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112, como se ha descrito en detalle anteriormente. Con la región de tejido 100 seleccionada, el usuario manipula una parte de la región de tejido 100 y crea un pliegue 120 en ella. Más específicamente, el usuario manipula la región de tejido 110, creando un pliegue 120 de tejido que incluye una capa de piel 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112. No se incluye músculo esquelético en el pliegue 120. Además, el pliegue resultante 120 de tejido incluye un primer lado 124, un segundo lado 128 opuesto al primer lado 124, y una parte superior 132 que se extiende entre el primer lado 124 y el segundo lado 128. El pliegue 120 también define un espesor de pliegue 134 definido como la distancia entre el primer lado 124 y el segundo lado 128.

Con el pliegue 120 preparado, el usuario obtiene el dispositivo de inyección 26 e inserta la aguja 86 longitudinalmente a través del pliegue 120 sustancialmente paralela al primer lado 124 y al segundo lado 128. A continuación, el usuario inyecta un volumen previamente medido de agente en la capa adiposa 108 de la región tisular 100, creando un punto de inyección 116. Una vez completa la inyección, el usuario no retira la aguja 86 del tejido 100.

Con el sitio de inyección 116 creado y con la aguja 86 todavía posicionada en el tejido 100, el usuario manipula el bastidor 30 o el mecanismo de ajuste 56 del aplicador 22 hasta que la distancia de electrodos 50 sea ligeramente mayor que el espesor del pliegue 134. A continuación, el usuario coloca el aplicador 22 de modo que cada electrodo 34, 42 se sitúe en lados opuestos del pliegue 120 (véanse las Figs. 11-13). Más específicamente, el usuario coloca el aplicador 22 de modo que la primera superficie de contacto 38 del primer electrodo de placa 34 esté en contacto con el primer lado 124 del pliegue 120, y la segunda superficie de contacto 46 de los segundos electrodos de placa 42 esté en contacto con el segundo lado 128 del pliegue 120, creando entre ellos una zona de tratamiento 136 (descrita anteriormente; véanse las Figs. 11-13).

Aunque la realización ilustrada muestra las superficies de contacto 38, 46 de los electrodos 34, 42 colocadas en contacto directo con el pliegue 120 , se entiende que puede utilizarse gel conductor (no mostrado) u otras sustancias para mejorar la comunicación eléctrica entre los electrodos 34, 42 y el pliegue 120.

Una vez que los electrodos 34, 42 están en posición, el sensor 74 del aplicador 22 determina la distancia entre electrodos 50 y ajusta los parámetros de la señal de electroporación en consecuencia (descrita anteriormente). El generador de señales 18 también puede producir una señal de prueba (descrita anteriormente) en la que la corriente y la tensión resultantes pueden ser detectadas por los electrodos 34, 42 o la aguja 86 y posteriormente utilizados por el generador de señales 18 para calcular la impedancia del tejido que se está tratando. En la realización ilustrada, la señal de electroporación 150 consiste en una serie de pulsos eléctricos 154, donde cada pulso 154 se da a una tensión de pulso 158 predeterminada y dura una longitud de pulso 162 predeterminada. Además, cada pulso individual 154 está separado en el tiempo de los pulsos adyacentes 154 por un retardo de pulso 166. (Véase la Fig. 26). En la realización ilustrada, la señal de electroporación incluye una tensión de pulso 158 de entre aproximadamente 5 V y aproximadamente 500 V. La tensión de pulso puede ser, por ejemplo, de 5 V, 10 V, 20 V, 40 V, 60 V, 80 V, 100 V, 150 V, 200 V, 250 V, 300 V, 350 V, 400 V, 450 V o 500 V. Además, la longitud de pulso de electroporación 162 ilustrada está entre aproximadamente 1 microsegundo y aproximadamente 100 milisegundos. Aún más, el retardo del pulso de electroporación 166 está entre aproximadamente 10 milisegundos y aproximadamente 1 segundo. Aún más, cada señal de electroporación incluye entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 pulsos. En realizaciones alternativas, los parámetros de la señal de electroporación 150 pueden alterarse para permitir un rendimiento óptimo para diferentes agentes. Los parámetros de señalización pueden ajustarse en función del agente utilizado, el grado de transfección y el daño tisular deseado. Por ejemplo, los constructos dMAb requieren generalmente una tensión más baja, una duración de pulso más corta y retardos entre pulsos más largos, mientras que las vacunas de ADN requieren generalmente una tensión más alta, un retardo más corto y pulsos más largos.

Después de configurar los parámetros de la señal de electroporación, el generador de señales 18 del dispositivo 10 envía la señal de electroporación al primer electrodo 34, al segundo electrodo 42, y a la aguja 86 de tal manera que la aguja 86 actúa como uno de los electrodos positivos o el electrodo negativo mientras que los primeros y segundos electrodos 34, 42 juntos, actúan como el otro de los electrodos positivos o el electrodo negativo. Al recibir la señal de electroporación, los electrodos 34, 42 y la aguja 86 conducen la señal al pliegue 120 creando un campo eléctrico en el mismo (Figs. 12 y 13). El campo eléctrico resultante se concentra en la capa adiposa 108 alrededor de la aguja 86, disminuyendo su intensidad radialmente a partir de la misma. El campo eléctrico también crea una región de transfección que se desplaza a lo largo de la aguja en forma de elipsoide muy alargado. Además, la corriente eléctrica es más alta alrededor de la aguja 86.

Una vez completada la electroporación, los electrodos 34, 42 y la aguja 86 pueden retirarse del pliegue 120.

c) Configuración de tres placas

Para administrar el tratamiento con la configuración de tres placas, el usuario primero obtiene un paciente, tomando nota de la región de tejido 100 que desea tratar. Para los fines de esta aplicación, la región tisular 100 puede incluir tejido cutáneo que tenga, por ejemplo, una o más de una capa cutánea 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112 como se ha descrito en detalle anteriormente. Con el área de tratamiento seleccionada, el usuario obtiene el dispositivo de inyección 26 e inserta la aguja 86 en la región tisular 100 de forma que el extremo distal 90 se posicione dentro de la capa adiposa 108. A continuación, el usuario inyecta un volumen previamente medido de agente en la capa adiposa 108 de la región tisular 108, creando un punto de inyección 116. Una vez completa la inyección, el usuario retira la aguja 86 de la región tisular 100.

Con la aguja 86 retirada, el usuario obtiene una porción de la región de tejido 100 que contiene el punto de inyección 116 y crea un pliegue 120 que incluye el punto de inyección 116, una capa de piel 104, una capa adiposa 108 y una capa de músculo liso 112. No se incluye músculo esquelético en el pliegue 120. Además, el pliegue resultante 120 de tejido incluye un primer lado 124, un segundo lado 128 opuesto al primer lado 124, y una parte superior 132 que se extiende entre el primer lado 124 y el segundo lado 128 del pliegue 120. El pliegue 120 también define un espesor de pliegue 134 definido como la distancia entre el primer lado 124 y el segundo lado 128.

Tras preparar el pliegue 120, el usuario manipula el bastidor 30' o el mecanismo de ajuste 56' del aplicador 22' hasta que la distancia entre electrodos 50' sea ligeramente mayor que el espesor del pliegue 134. A continuación, el usuario coloca el aplicador 22' de modo que la primera superficie de contacto 38' del primer electrodo de placa 34' esté en contacto con el primer lado 124 del pliegue 120, y la segunda superficie de contacto 46' de los segundos electrodos de placa 42' esté en contacto con el segundo lado 128 del pliegue 120, creando entre ellos una zona de tratamiento 136 (descrita anteriormente). El usuario también posiciona el tercer electrodo de placa 66' de manera que la tercera superficie de contacto 68' esté en contacto con la parte superior 132 del pliegue 120 y posicionada generalmente entre los primeros y segundos electrodos 34', 42' (véanse las Figs. 14-16) de forma que el tercer electrodo de placa 66' no entre en contacto directo con el primer o segundo electrodos 34', 42'.

Aunque la realización ilustrada muestra las superficies de contacto 38', 46', 68' de los electrodos 34', 42', 66' colocadas en contacto directo con el pliegue 120, se entiende que puede utilizarse gel de acoplamiento o conductor (no mostrado) u otras sustancias para mejorar la comunicación eléctrica entre los electrodos 34', 42', 66' y el pliegue 120.

Una vez que los electrodos 34', 42', 66' están en posición, el sensor 74' del aplicador 22' determina la distancia entre electrodos 50 entre los primeros y segundos electrodos 34', 42' y ajusta los parámetros de la señal de electroporación en consecuencia (descrito anteriormente). El generador de señales 18 también puede producir una señal de prueba (descrita anteriormente) en la que la corriente y la tensión resultantes pueden ser detectadas por los electrodos 34', 42', 66' y posteriormente utilizadas por el generador de señales 18 para calcular la impedancia del tejido que se está tratando. En la realización ilustrada, la señal de electroporación consiste en una serie de "pulsos 154" eléctricos, donde cada pulso 154 se da a una tensión de pulso 158 predeterminada y dura una longitud de pulso 162 predeterminada. Además, cada pulso individual 154 está separado en el tiempo por pulsos adyacentes 154 por un retardo de pulso 166 (véase la Fig. 26). En la realización ilustrada, la señal de electroporación incluye una tensión de pulso 158 de entre aproximadamente 5 V y aproximadamente 500 V. Además, la longitud de pulso de electroporación 162 ilustrada está entre aproximadamente 1 microsegundo y aproximadamente 100 milisegundos. Aún más, el retardo del pulso de electroporación 166 está entre aproximadamente 10 milisegundos y aproximadamente 1 segundo. Aún más, cada señal de electroporación incluye entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 pulsos.

Después de establecer los parámetros de la señal de electroporación, el dispositivo 10 aplica la señal de electroporación a los primeros, segundos y terceros electrodos 34', 42', 66' de tal manera que los primeros y segundos electrodos 34', 42' actúan como uno de los electrodos positivo y negativo mientras que el tercer electrodo 66' actúa como el otro de los electrodos positivo y negativo. Al recibir la señal de electroporación, los electrodos 34', 42', 66' conducen la señal en serie al pliegue 120 creando un campo eléctrico en el mismo (Figs. 15 y 16). El campo eléctrico resultante es más intenso justo debajo del tercer electrodo de placa 66' y su intensidad disminuye al aumentar la profundidad del tejido. Además, la corriente eléctrica es fuerte en la capa de piel 104 y mucho más débil en la capa adiposa 108, lo que crea un equilibrio deseable entre un campo eléctrico fuerte y el mantenimiento de una corriente más baja en el sitio de inyección. Estos campos eléctricos suelen ser óptimos para las inyecciones de ADN en la grasa subcutánea poco profunda.

Una vez completa la electroporación, los electrodos 34', 42', 66' pueden retirarse del pliegue 120.

IV) EJEMPLOS

Ejemplo 1. Resultados experimentales: Los tratamientosin vivo serealizaron en almohadillas adiposas subcutánea de cobayas Hartley hembras utilizando una variación del tratamiento descrito anteriormente. Durante el experimento, el usuario afeitó el pelo cerca de la zona de tratamiento próxima a la nuca del cobaya. A continuación, se utilizó crema depilatoria para eliminar por completo cualquier resto de barba de la zona tratada. A continuación, se inyectaron plásmidos en la capa adiposa de la zona de tratamiento con una jeringa de insulina, creando un punto de inyección. A continuación, se manipuló el sitio de inyección y el tejido cutáneo de la zona de tratamiento, separando las capas cutánea, adiposa y muscular lisa de cualquier músculo esquelético. A continuación, el pliegue de piel resultante se colocó entre un par de electrodos de placa, cada uno de los cuales tenía la superficie de contacto correspondiente cubierta de gel conductor. Por último, se enviaron pulsos eléctricos a los electrodos de placa, donde un electrodo de placa actuó como electrodo positivo y el otro electrodo de placa actuó como electrodo negativo. Una vez finalizado el tratamiento, se tomaron muestras del tejido de la zona tratada para su análisis (véanse las Figs. 17-30).

Los estudios de inyección de colorante demostraron que el colorante inyectado se desplaza preferentemente por los septos colgantes que rodean los lóbulos adiposos, y estas observaciones fueron coherentes con los patrones de transfección de GFP Para demostrar la sección de las proteínas codificadas, se realizó un tratamiento Pe dirigido a los adipositos utilizando ADN que codificaba anticuerpos monoclonales (dMAbs), lo que condujo a niveles sistémicos detectables de proteínas. Por último, se demostró que la vacunación con ADN PE dirigido a los adipositos con un plásmido que codifica la nucleoproteína H1N1 es inmunógena. En comparación con las vías intramusculares tradicionales, las vacunas de ADN PE dirigidas al tejido adiposo pueden ofrecer ventajas de tolerabilidad debido a las tensiones más bajos, las inyecciones menos profundas y los electrodos no invasivos que se utilizan.

A mayor aumento, se podía ver en verde brillante un patrón de "panal de abeja" característico de los adipocitos debido a los numerosos adipocitos transfectados. También se observaron septos colágenos de color verde brillante como líneas verdes sólidas que recorrían la red de adipocitos. Véase la Fig. 18, en la que la región transfectada en verde corresponde al volumen de tejido sujetado entre los electrodos de la placa. Un examen más detallado de una sección de tejido adiposo reveló muchos adipocitos individuales. El interior de cada célula no está bien iluminado, porque la gotita lipídica no expresa proteínas. Más bien, la proteína verde fluorescente (GFP) se encuentra alrededor de los bordes de cada célula, donde se produce la síntesis, producción, tráfico y modificación de proteínas (véanse las Figs.

17, 18 y 19).

Esta tecnología también se demostró en conejos (en la grasa subcutánea de la base del cuello). Véase la Fig. 20, en la que la tinción Oil Red O resalta las gotitas lipídicas, así como el anillo verde de GFP que rodea las células transfectadas. Los núcleos se muestran en azul.

Las imágenes confocales de tejido adiposo de cobaya transfectado muestran que la proteína se produce y expresa alrededor de todo el borde de las células. Las numerosas células más pequeñas que rodean a los adipocitos no expresan GFP, lo que concuerda con un cierto grado de especificidad para los adipocitos (véase la Fig. 21).

El volumen de inyección puede reducirse de aproximadamente 200 pL a 50 pL sin que ello afecte al tamaño de la región transfectada (véase la Fig. 22). Las inyecciones múltiples, seguidas de una única PE, pueden ser una forma de aumentar el número de células transfectadas (véase la Fig. 23). Disminuir la tensión y aumentar el número de pulsos puede mejorar la señal de GFP, lo que posiblemente indique un mayor número de células transfectadas. Los tratamientos de 80V causaron contracciones musculares notablemente más débiles en comparación con los tratamientos de 200V (véase la Fig. 24). El dMAb se produjo a niveles máximos de alrededor de 1000 ng/ml en cobayas tras un segundo tratamiento en adiposo. El primer tratamiento se realizó con parámetros no optimizados (véase la Fig. 25).

La cobaya que recibió pulsos rápidos produjo más dMAb que los cobayos que recibieron pulsos con retrasos entre pulsos más largos de 1 segundo (véase Fig. 26). La inyección a chorro parecía distribuir el a Dn de forma más uniforme por todo el tejido y transfectar más células. Véase la Tabla 27. La descomposición enzimática del tejido mejoró la distribución del líquido por todo el tejido (véase la Fig. 28). A medida que aumenta el número de pulsos, disminuye la resistencia eléctrica. A 25 V, la corriente era prácticamente indetectable (véase la Fig. 30). A 100 V, la contracción muscular fue lo suficientemente intensa como para provocar fluctuaciones en las lecturas eléctricas (véase la Fig. 29).

Ejemplo 2. Inmunogenicidad Se administraron tratamientosin vivoa cinco grupos experimentales, todos los cuales recibieron la misma dosis de ADN. Para el experimento, se administró PE intradérmica a un grupo para que actuara como grupo de control positivo. Los cuatro grupos restantes fueron tratados en la capa adiposa del tejido utilizando diversas combinaciones de tensión alta o baja y volúmenes de inyección altos o bajos. Las tensiones de los pulsos para los cuatro grupos adiposos variaron entre aproximadamente 50 V y aproximadamente 200 V, mientras que los parámetros de inyección variaron entre aproximadamente 100 microlitros en un solo sitio, a cinco inyecciones de 50 microlitros son cada sitio. Para cada inyección, se diluyó el plásmido para aumentar el volumen sin cambiar la dosis total de ADN.

Como se ilustra en la Fig. 31, los grupos adiposos tratados con alta tensión y alto volumen de inyección tuvieron una respuesta inmune humoral más fuerte y rápida (es decir, título de punto final) que cualquier otro grupo, incluyendo el grupo tratado intradérmicamente. La intensidad de esta respuesta siguió aumentando durante 6 semanas. Ambos tratamientos de baja tensión (es decir, con volumen alto y bajo) tuvieron una respuesta escasa o nula al cabo de 3 semanas, y tuvieron una respuesta débil o nula al cabo de 6 semanas.

Tanto el volumen de la inyección de ADN como la tensión de la PE parecen influir en la respuesta inmunitaria en el tejido adiposo. Cuanto mayor es el volumen de agente inyectado en el tejido, mayor es el contacto entre las células y el agente. El aumento de volumen puede resolver problemas relacionados con la administración de ADN formulado en agua en el tejido adiposo. Además, cuanto mayor sea la tensión de PE, mayor será el número de células que pueden sufrir PE. Además, cualquier daño tisular como resultado de una mayor tensión, puede ayudar en la inducción de una respuesta inmune y células asociadas.

Ejemplo 3. Materiales y Procedimientos para los Ejemplos 4-9 Para simular diferentes modalidades de PE, se crearon dos modelos de tejido como ensamblajes CAD 3D en SolidWorks 2013 (SolidWorks Corp., Concord, MA, EE. UU.). Ambos modelos consistían en tres capas eléctricamente isótropas: piel, adiposo y músculo. El estrato córneo no se incluyó en estos modelos porque tensiones tan bajas como 50 V permeabilizarán el estrato córneo en microsegundos, y su contribución a la resistencia total del tejido será entonces insignificante. El espesor del estrato córneo es del orden de 20 |jm, y las capas muy finas pueden causar artefactos en el análisis de elementos finitos. Para modelar el tejido sujeto entre electrodos de placa, se creó una geometría de tejido plegado y se colocaron dos geometrías de electrodos de placa cuadrados con un área de contacto de 400cm2 en lados opuestos del pliegue (Fig. 32). Para modelar electrodos de aguja penetrantes dentro del mismo tejido, se creó una geometría de tejido plano y se colocaron dos geometrías de aguja de 19 mm y calibre 22 en el tejido con una separación entre electrodos de 10 mm y una profundidad de penetración de 18 mm (Fig. 33).

Los dos conjuntos tejido-electrodo se exportaron a ANSYS Maxwell 2015.2 (ANSYS Software, Canonsburg, PA, EE.UU.) para el análisis de elementos finitos. Los valores de conductividad eléctrica para cada tipo de tejido se basaron en valores bibliográficos y se supusieron constantes. Los valores de conductividad y las dimensiones generales de los tejidos utilizados en los modelos figuran en la Tabla 1. Se aplicó una tensión de excitación a un electrodo mientras que al electrodo opuesto se le asignó una tensión de cero, y se crearon secciones transversales bisecando los electrodos en el plano de análisis x-y para visualizar la intensidad del campo eléctrico.

Tabla 1.

Animales. Todos los estudios con animales se realizaron conforme a protocolos aprobados por un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para todos los estudios in vivo se utilizaron cobayas Hartley hembras. Los tratamientos y las extracciones de sangre se realizaron mientras los animales se mantenían bajo anestesia general con isoflurano inhalado. Las inyecciones subcutáneas se realizaron en las almohadillas adiposas subcutánea interescapular (situadas en la nuca) con una aguja de insulina de calibre 29 orientada en paralelo a la columna vertebral. Para los estudios terminales, las cobayas se sometieron primero a anestesia general y luego a eutanasia humanitaria mediante inyección intracardiaca de pentobarbital.

Plásmidos. En los estudios de expresión génica se utilizó ADN plasmídico que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). Se realizaron estudios inmunológicos utilizando ADN plasmídico que codifica la nucleoproteína (NP) de longitud completa de la gripe A (H1N1, A/Puerto Rico/ 8). Todas las formulaciones de plásmidos se prepararon en tampón salino de citrato sódico para una concentración tampón final de 1X.

Estudios de inyección de colorante. El azul de metileno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se disolvió en agua desionizada a una concentración de 0,5 mg/ml. Para las inyecciones en un solo sitio, se inyectó a las cobayas por vía subcutánea 100 j l de solución de azul de metileno. Para las inyecciones en sitios múltiples, se realizaron cinco inyecciones subcutáneas de 50 j l separadas aproximadamente por 5 mm. Tras la inyección, se sujetó firmemente toda la almohadilla adiposa entre dos electrodos de placa para simular el protocolo de tratamiento completo. Los animales fueron sacrificados inmediatamente y se tomaron imágenes de las almohadillas adiposas intactas; a continuación, se diseccionaron a lo largo del plano sagital y se volvieron a tomar imágenes para visualizar la distribución del colorante en el tejido.

Procedimiento general de tratamiento PE adiposa. Se rasuraron y limpiaron las zonas de tratamiento. Los tratamientos PE adiposa se realizaron en la almohadilla adiposa subcutánea de la región interescapular, mientras que los tratamientos cutáneos se realizaron en el flanco. Para los tratamientos adiposos, se pellizcó el tejido entre dos dedos para aislar la almohadilla adiposa y se inyectó ADN con una aguja de insulina de calibre 29 orientada paralelamente a la columna vertebral. Inmediatamente después de la inyección de ADN, se recubrieron con gel conductor dos electrodos de placa fijados a mandíbulas de pinza opuestas y se utilizaron para pinzar el tejido que rodeaba el sitio de inyección, y se administraron pulsos utilizando la unidad de control Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals, San Diego,<c>A). Para los tratamientos ID-PE, se inyectó ADN por vía intradérmica seguido inmediatamente de electroporación utilizando el dispositivo de electroporación de superficie (SEP) consistente en una matriz de 4x4 electrodos de aguja.

Imagen macroscópica y análisis histológico. Para los estudios de la proteína verde fluorescente (GFP), se realizó una PE adiposa con plásmido de GFP, y se extrajeron almohadillas adiposas intactas en puntos temporales predeterminados y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de obtención de imágenes FluorChem R (ProteinSimple, San Jose, CA, EE.UU.). A continuación, se congelaron las almohadillas adiposas y se cortaron muestras de aproximadamente 10 mm x 10 mm de la región transfectada de la almohadilla adiposa y se crioseccionaron con un espesor de 30 micrómetros, bien a lo largo del plano transversal para ver la profundidad de la transfección, bien a lo largo del plano coronal para ver la distribución horizontal de las células transfectadas. Algunas secciones se fijaron en formol al 4%, se aclararon en xileno, se tiñeron con DAPI o Hoechst 3342 (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se cubrieron con Fluoromount (eBioscience, San Diego, CA). Otras secciones se fijaron en formol, se aclararon en xileno, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se cubrieron con Permount (VWR, Radnor, PA, EE.UU.). Las secciones teñidas con H&E se visualizaron en campo claro con un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Center Valley, PA) equipado con una cámara MicroPublisher 3.3 (Qlmaging, Surrey, BC, Canadá). Las imágenes de fluorescencia se capturaron con una cámara Retiga 3000 (Qlmaging, Surrey, BC, Canadá). Las imágenes confocales se adquirieron como apilamientos Z de alta resolución multipanel y autocosidos de todo el tejido utilizando un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Jena, Alemania) y las imágenes se procesaron posteriormente utilizando Zen 2012 (Carl Zeiss) y el software IMARIS (Bitplane, Belfast, Reino Unido).

Expresión de GFP y cinética celular. La PE adiposa se realizó en 14 cobayas, utilizando 100 |jg de un plásmido que codificaba la GFP y parámetros de PE de 200 V, 3 pulsos, 100 ms de duración y 100 ms de retraso entre pulsos. Como controles, dos cobayas fueron tratadas con PE pero no recibieron la inyección del plásmido, mientras que otras dos cobayas recibieron la inyección del plásmido pero no fueron tratadas con PE. Los controles fueron sacrificados 3 días después de los tratamientos, y las cobayas tratadas fueron sacrificadas a intervalos (n=2 ) tras el tratamiento, que oscilaron entre 3 horas y 14 días postratamiento, así como un seguimiento a largo plazo en el día 60. Se tomaron imágenes de las almohadillas adiposas intactas para la expresión de GFP y, a continuación, se seccionaron y tiñeron con H&E para visualizar signos de infiltración celular en el lugar del tratamiento.

Estudio de inmunogenicidad. Las cobayas fueron tratadas con 25 jg de ADN NP. Cuatro grupos de cobayas (n=4) recibieron tratamientos de PE adiposa como se ha descrito anteriormente, y cada grupo recibió una única inyección de 100 j l de ADN o cinco inyecciones separadas de 50 jl, seguidas de un único tratamiento de PE consistente en tres pulsos de onda cuadrada de 100 mseg con un retraso entre pulsos de 200 mseg. Las cobayas vacunadas mediante ID-PE con el dispositivo SEP (n=3) sirvieron como grupo de comparación para este estudio, ya que se ha demostrado previamente que este procedimiento transfecta células epidérmicas, pero no adipocitos subcutáneos. Los grupos PE adiposa son los siguientes: PE de alta tensión con 1 punto de inyección (HV-1), PE de alta tensión con 5 puntos de inyección (HV-5), PE de baja tensión con 1 punto de inyección (LV-1) y PE de baja tensión con 5 puntos de inyección (LV-5). Para las cobayas que recibieron 5 inyecciones, se realizó un único procedimiento de PE inmediatamente después de la última inyección. La dosis total de ADN plasmídico fue idéntica para todos los grupos. El diseño de estudio se ilustra en la Tabla 2. Cada tres semanas durante la duración del estudio, se extrajeron 300 jL de sangre y el plasma se almacenó a -20°C hasta su análisis. Los tratamientos se administraron en las semanas 0, 3 y 6 del estudio, inmediatamente después de la extracción de sangre. En la semana 21 del estudio, todos los animales fueron reforzados y 18 días después, se recogieron 3 ml de sangre y se separaron las células mononucleares de sangre periférica para el análisis ELISpot.

Tabla 2.

El Suero ELISA de las cobayas vacunadas se analizó mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Las pruebas ELISA se realizaron utilizando placas de 96 pocillos (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) recubiertas durante la noche con 100 pl/pocillo de antígeno pNP 0,3 pg/ml (Sino Biological, Pekín, China) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) (VWR). Se lavaron las placas, se bloquearon con PBS que contenía un 3% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich) y un 0,05% de Tween-20 (Sigma-Aldrich) a 150 pl/pocillo durante una hora a 37 °C y se volvieron a lavar. El suero se diluyó en serie de 1:50 a 1:2952450 en PBS que contenía 1% de BSA y 0,05% de Tween-20 (tampón de dilución de muestras) a 100 pl/pocillo y se incubó durante dos horas a 37°C. A continuación, se lavaron las placas y se diluyó 1:10 000 con tampón de dilución de muestras una IgG de cabra anticobaya conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrich) y se añadió a cada pocillo a 100 p1/pocillo durante una hora a 37 °C. Se lavaron las placas y se incubó a 100 pl/pocillo con tampón de dilución de muestras. Se lavaron las placas y se añadió solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (VWR) a cada pocillo a 100 pl/pocillo y se detuvo el desarrollo del color con solución de reactivo de parada de TMB (VWR) al cabo de 6 minutos. Los valores de absorbancia a 450 nm en cada pocillo se midieron utilizando un lector de placas SpectraMax PLUS 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.), y el punto de corte para un título positivo se calculó según lo descrito por Frey, at al., en el que la absorbancia media y la desviación estándar de los controles negativos (en este caso, las muestras pre-sangrado) se utilizaron para calcular los valores de absorbancia de corte. Se utilizaron títulos de punto final para todos los resultados ELISA presentados.

Recipiente ELIS. Las cobayas vacunadas se reforzaron en la semana 21 del estudio inmunológico y, 18 días después, se extrajeron 3 ml de sangre periférica y se recogieron en tubos EDTA para realizar la prueba ELISpot de interferón gamma (IFN-<y>), utilizando procedimientos desarrollados previamente en la propia empresa. La sangre se diluyó 1: 1 con HBSS y se centrifugó sobre Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Se recogió la capa leucocitaria y se resuspendió a una concentración de 1x106 células vivas/ml en medio R10, y se sembraron a una densidad de 1x105 células/pocillo en placas Millipore IP de 96 pocillos recubiertas durante la noche con 5 pg/ml de anticuerpo primario anti-IFN-Y (V-E4) y bloqueadas con 1X PBS con un 10% (p/v) de sacarosa y un 2% (p/v) de BSA por triplicado, Las PBMC se incubaron durante 18 horas con Concanavalina A (ConA) o con uno de los tres conjuntos de péptidos de antígenos NP previamente considerados inmunoestimulantes. Tras un lavado para eliminar las células, se añadió a cada pocillo 0,2 pg de anticuerpo secundario anti-IFN-Y biotinilado (N-G3) y se dejó incubar durante 2 horas. A continuación, se lavaron los pocillos y se añadieron 100 pl de sustrato reactivo de detección BCIP/NBT a cada pocillo durante 15 minutos. Se tomaron imágenes de las placas con un lector de placas ELISPOT CTL-Immunospot S6 y se utilizó el software CTL-Immunospot para procesar y contar las manchas. Para cada animal, los recuentos de puntos se normalizaron restando los recuentos de células no estimuladas.

Procedimientos estadísticos. Para comparar los datos de títulos ELISA de los grupos tratados con PE adiposa, se realizó un ANOVA factorial de medidas repetidas sobre los datos de títulos transformados logarítmicamente en todos los puntos temporales recogidos, utilizando como factores la tensión de PE, el número de puntos de inyección y la semana de tratamiento. Para comparar los datos de títulos ELISA entre todos los tratamientos, se estratificaron los datos por punto temporal y luego se realizó un ANOVA unidireccional sobre los datos transformados logarítmicamente utilizando el grupo de tratamiento como factor, y se hicieron comparaciones por pares utilizando la prueba post-hoc de Tukey cuando la prueba F era significativa. El error de tipo II se redujo al mínimo y no hubo corrección para comparaciones múltiples en este caso. Los datos ELISpot se analizaron en primer lugar dentro de los grupos tratados con PE adiposa mediante ANOVA factorial, con la tensión de PE y el número de sitios de tratamiento como factores. Se realizó un ANOVA unidireccional para comparar los datos ELISA de todos los grupos de tratamiento, incluido ID-PE. El umbral de significación se definió como p< 0,05, y todas las observaciones de tendencias y diferencias no significativas se acompañaron de valores p.

Ejemplo 4. Análisis de elementos finitos y optimización de parámetros. Para comprender las propiedades eléctricas del tejido adiposo desde la perspectiva de la PE, se llevó a cabo un análisis de elementos finitos. Esto permitió cuantificar la distribución prevista del campo eléctrico dentro de cada tipo de tejido de interés (en este caso, piel, músculo y adiposo) que definen los intervalos de tensión apropiados para la PE en tejido adiposo utilizando el diseño de electrodos ilustrado en la Fig. 32. El análisis de elementos finitos en el plano x-y indicó que los electrodos de aguja estándar distribuían un fuerte gradiente de campos eléctricos por igual a través de la piel, el tejido adiposo y el músculo (Fig. 34, arriba), mientras que los electrodos de placa generan un campo eléctrico más uniforme casi exclusivamente dentro del tejido adiposo (Fig. 34, abajo). Se predijo que los electrodos de aguja proporcionan intensidades de campo superiores a 350 V/cm al 12-14% de cada tejido, mientras que aproximadamente la mitad del tejido recibe una intensidad de campo inferior a 150 V/cm. Se predijo que los electrodos de placa producirían campos eléctricos de entre 150 V/cm y 350 V/cm en el 95% del tejido adiposo tratado, y el músculo no recibió ningún campo eléctrico superior a 100 V/cm. En estas simulaciones, los electrodos de placa produjeron campos eléctricos inferiores a 150 V/cm en el 87% de la piel.

El análisis de elementos finitos sugirió que los electrodos de placa no invasivos concentran activamente el campo eléctrico en el tejido adiposo, actuando a la inversa que los electrodos de aguja, que proporcionan el mismo campo eléctrico indiscriminadamente a cada tejido que penetran. Además, el campo generado por los electrodos de placa es más uniforme que el de los electrodos de aguja.

El modelo de elementos finitos supuso una conductividad eléctrica constante para cada tipo de tejido. Las pruebas recientes sugieren que la conductividad es, de hecho, una función de la intensidad del campo eléctrico y, por lo tanto, cambia dinámicamente durante la PE. Sin embargo, estos modelos dinámicos sólo se han validado en piel, músculo y tejido tumoral, por lo que se optó por una conductividad constante para evitar hacer suposiciones que pudieran sobrestimar la distribución del campo eléctrico. Además, se supuso que la capa de grasa no pinzada situada directamente debajo de los electrodos y que limita el flujo de corriente hacia el músculo subyacente estaba comprimida hasta un espesor de 1 mm. Esta suposición se hizo para evitar sobrestimar la capacidad aislante del tejido adiposo, aunque en realidad la grasa subyacente es probablemente mucho más gruesa incluso con los electrodos firmemente colocados. Los resultados de las simulaciones pueden considerarse el "peor de los casos", y la validación de un modelo de conductividad dinámica en el tejido adiposo probablemente aumentará la intensidad del campo eléctrico prevista en toda la grasa.

Los electrodos de placa se eligieron para los experimentos posteriores con base en la distribución superior del campo eléctrico calculado en todo el tejido adiposo, la minimización del campo eléctrico en otros tipos de tejido y la naturaleza no invasiva del dispositivo. Un prototipo optimizado del electrodo de placa podría aplicarse fácilmente en clínica y que los datos generados en este análisis de elementos finitos podrían extrapolarse a las regiones adiposas más densas y gruesas de los seres humanos.

Ejemplo 5. Estudios de inyección de colorantes. Mientras que las propiedades fluidodinámicas de una inyección IM o ID en bolo están bien caracterizadas, la distribución de un fluido dentro de la grasa subcutánea in vivo estaba menos clara. Además, se desconocía el efecto físico que podría tener la compresión del punto de inyección entre los electrodos de placa sobre la distribución del fluido. Esta dinámica se investigó mediante estudios de inyección de colorante, que se llevaron a cabo para permitir la visualización de la distribución del fluido inyectado dentro de la grasa. Tras la inyección y la compresión entre los calibradores, el colorante era visible dentro de las almohadillas adiposas intactas en forma de bolo alargado (Fig. 35, arriba a la izquierda). Tras disecar la grasa, el colorante parecía retenerse principalmente en los septos colágenos que dividen los lóbulos adiposos (Fig. 35, arriba a la derecha). La tinción azul quedó retenida dentro de la almohadilla adiposa, sin apenas tinción en la piel suprayacente ni en el músculo subyacente. Dado que el colorante no parecía desplazarse por todo el tejido tras ser apretado entre los electrodos, se realizó el mismo análisis del colorante con múltiples puntos de inyección con el objetivo de aumentar la distribución del ADN por todo el tejido adiposo. Cuando se realizaron cinco inyecciones separadas de 50 pL de colorante y luego se sujetaron entre las placas de electrodos, cinco sitios individuales de colorante permanecieron visibles, aunque algunos eran más prominentes que otros (Fig. 35, abajo). Cuando se diseccionaron, cada uno de los puntos de inyección presentaba una distribución similar del colorante en el tejido adiposo, con el colorante concentrado a lo largo de los septos colágenos.

Los estudios de tinción sugirieron que parte del inyectado está en contacto con la dermis, pero no se observó expresión génica fuera de la almohadilla adiposa. Esta observación es coherente con el análisis de elementos finitos, que sugiere que los campos eléctricos de intensidad suficiente para provocar la transfección se generan casi exclusivamente en el tejido adiposo. Cuando se realizaron inyecciones múltiples, algunos puntos eran más prominentes que otros, lo que puede deberse a que los puntos de inyección cercanos se fusionan cuando se aprietan entre los electrodos de la placa. La tinción más intensa se produjo a lo largo de los septos de colágeno que dividen los lóbulos adiposos y, de hecho, muchos adipocitos transfectados se agruparon alrededor de estos septos. Es probable que la corriente eléctrica y la solución de ADN viajen principalmente a través de estos septos colágenos, y la transfección adiposa se produce cuando la solución de a Dn escapa de estos canales y entra en contacto con los adipocitos cercanos antes de la PE.

A nivel celular, había un gran número de adipocitos transfectados en el sitio de inyección, fácilmente distinguibles por su gran tamaño, forma globular característica y patrón único de expresión génica "en forma de anillo" causado por la gotita de lípido inerte que ocupaba el centro de cada célula. Los tratamientos parecían altamente selectivos para los adipocitos, porque a pesar de los numerosos otros tipos de células que ocupaban el espacio entre los adipocitos, la GFP sólo se expresaba alrededor de los adipocitos. Esto se debe probablemente a la propensión de la PE a transfectar preferentemente células más grandes a intensidades de campo más bajas. Los adipocitos son células globulares con un diámetro muy grande (50-100 pm), y es posible que su forma y diámetro las hagan más susceptibles a la PE que otros tipos celulares más pequeños. El tejido adiposo también alberga numerosas células inmunitarias, células endoteliales, células madre y fibroblastos, por lo que resultó un tanto sorprendente que no hubiera una transfección generalizada evidente de estos otros tipos celulares.

Ejemplo 6. Transfecciónin vivode adipocitos. Para evaluar la expresiónin vivode un constructo informador en tejido adiposo, se inyectó plásmido codificante para GFP en almohadillas adiposas de cobaya y se electroporó con tensiones que oscilaban entre 50 V y 200 V utilizando electrodos de placa no invasivos como se describe en la sección de procedimiento general de tratamiento PE adiposa del Ejemplo 3. En la Fig. 36 se muestra el lugar de tratamiento y el procedimiento de sujeción del PE. Tres días después de realizar estos tratamientos, se extrajeron las almohadillas adiposas intactas y se obtuvieron imágenes a nivel de tejido macroscópico. La GFP se expresó exclusivamente en el sitio de inyección dentro de las almohadillas adiposas subcutánea en una región de aproximadamente 5-10 mm de longitud y l-2 mm de ancho, y no hubo diferencias visibles en el área o intensidad de la señal entre las tensiones de PE probados (Fig. 37, arriba). No se detectó expresión de GFP en los animales que recibieron la inyección del plásmido sin PE adiposa. A nivel celular microscópico, los adipocitos se distinguían por su gran diámetro (50-100 pm) y su característica forma globular debida a la gota lipídica que ocupa el centro del volumen celular (Fig. 37, abajo). Las almohadillas adiposas de cobayas que recibieron PE adiposa poseían numerosos adipocitos que expresaban GFP y que se distinguían fácilmente por su nítido contorno fluorescente. Había regiones de autofluorescencia fuerte y difusa localizadas en el espacio extracelular entre los adipocitos, y los septos de colágeno también eran prominentemente fluorescentes. En las cobayas que recibieron la inyección de ADN plasmídico sin adiposidad-PE, no había adipocitos con expresión de GFP detectables ni regiones de alta autofluorescencia, y los septos de colágeno eran visibles, pero menos prominentes. Se realizó un análisis histológico adicional para visualizar la distribución del constructo informador a través de la profundidad de la almohadilla adiposa. La señal GFP más fuerte y abundante se localizó en los adipocitos adyacentes a los septos colágenos que dividen los lóbulos adiposos (Fig. 38). No se detectó GFP en la capa cutánea suprayacente. La expresión génica era detectable a varios milímetros de profundidad en la grasa y, en general, coincidía con la distribución de fluidos observada en los estudios de inyección de colorantes. Las imágenes confocales de alta resolución revelaron que la GFP se expresaba de forma punteada alrededor de cada adipocito transfectado (Fig. 39). La expresión de GFP no estaba asociada a los numerosos núcleos que rodeaban y se encontraban entre los adipocitos, que son indicativos de una población celular secundaria más pequeña dentro del adipocito. Esta población incluye preadipocitos, fibroblastos y células endoteliales.

Ejemplo 7. Cinética de expresión génica y análisis histológico. Para investigar la cinética de la expresión del constructo informador en una población de adipocitos, se llevó a cabo un estudio de curso temporal en el que se extrajeron, seccionaron y analizaron muestras de la almohadilla adiposa tratada en puntos temporales definidos tras una electroforesis adiposa de 200 V con electrodos de placa no invasivos. La expresión génica fue medible ya a las 24 horas del tratamiento con PE adiposa, y la expresión se mantuvo durante los 60 días monitorizados (Fig. 40, arriba). No hubo diferencias cualitativas claras en la intensidad o distribución de la fluorescencia de la GFP durante los primeros 7 días. La señal apareció más difusa a partir del día 14, y aún más débil y difusa en el día 60. Cada lugar de expresión de GFP era del orden de 10 mm de diámetro. Los cambios histológicos, observados mediante tinción de H&E de las secciones adiposas, tras la PE adiposa fueron notables a partir del día 3, continuaron hasta el día 14 y parecieron resolverse en su mayor parte en el día 60 (Fig. 40, abajo). No se observaron diferencias detectables en la fisiología de los tejidos a las 3 o 24 horas del tratamiento. En estos primeros momentos, los adipocitos estaban bien definidos, las gotas de almacenamiento de lípidos eran identificables como huecos vacíos debido a la eliminación del xileno, y los septos colágenos eran visibles debido a la tinción con eosina más oscura y a los numerosos núcleos. A partir del día 3 y durante los 60 días de observación, los septos colágenos en el lugar del tratamiento fueron notablemente más prominentes, probablemente debido a la visualización de un gran número de núcleos de células infiltrantes. En las regiones en las que los septos colágenos eran más prominentes, el espacio extracelular alrededor de los adipocitos también se pobló con un mayor número de células. Estos cambios histológicos fueron más prominentes entre los 3 y los 7 días posteriores al tratamiento, y a los 60 días, la infiltración en el espacio extracelular era leve y la densidad celular dentro de los septos colágenos seguía siendo elevada, pero menos pronunciada.

Se demostró que el tejido adiposo es capaz de una expresión génica rápida y sostenida tras un único tratamiento PE adiposa. No hubo signos histológicos de infiltración celular hasta 3 días después del tratamiento, aunque la expresión génica fue robusta ya 24 horas después del tratamiento. Sin embargo, estas cinéticas pueden diferir para un antígeno altamente inmunogénico, en lugar de la GFP. PE adiposa pareció transfectar principalmente adipocitos, lo que sugiere que la inmunogenicidad se debe predominantemente al antígeno producido por los adipocitos. Se puede transfectar selectivamentein vivoun pequeño número de adipocitos (20-60 células) aplicando directamente PE al tejido adiposo expuesto quirúrgicamente mediante electrodos de pinza con una superficie de contacto de aproximadamente 0,065cm2. En este caso, se utiliza una técnica de PE no invasiva para transfectar grandes cantidades de adipocitos utilizando electrodos de placa con una superficie aproximadamente 100 veces mayor.

Ejemplo 8. Inmunogenicidad humoral. Para evaluar la aplicabilidad del tejido adiposo como tejido diana para la vacunación con ADN y si se puede provocar una respuesta inmunitaria, se inmunizó a cobayas con un constructo que expresaba el antígeno de la nucleoproteína de la gripe (PR8), utilizando PE adiposa o ID-PE como comparación, los grupos experimentales de PE adiposa incluyeron PE de alta tensión con 1 punto de inyección (HV-1), PE de alta tensión con 5 puntos de inyección (HV-5), PE de baja tensión con 1 punto de inyección (LV-1) y PE de baja tensión con 5 puntos de inyección (LV-5). Todas las cobayas recibieron la misma dosis total de ADN. La PE adiposa de VH y la ID-PE dieron lugar a una cinética de respuesta de anticuerpos similar, pero los tratamientos con PE adiposa de VL dieron lugar a respuestas de anticuerpos muy variables y, en general, inferiores en comparación con la PE adiposa de VH o la ID-PE (Fig. 41). Se evaluaron las diferencias de títulos entre los cuatro tratamientos diferentes de PE adiposa mediante ANOVA factorial de medidas repetidas Hubo un efecto principal de la tensión (p = 0,0062) y del punto temporal (p = 0,0065), pero no del número de puntos de inyección (p = 0,16) sobre los títulos. Al parecer, la inyección en múltiples puntos proporciona un inicio más rápido de la inmunidad humoral, pero la interacción entre el número de puntos de inyección y el tiempo no fue significativa (p = 0,13). El análisis simple de efectos principales reveló que la diferencia de títulos entre los tratamientos HV y L V PE adiposa era significativa a partir de la semana 6 (0,0056 < p < 0,039). No hubo diferencias en los títulos entre HV PE adiposa e ID-PE en ningún punto temporal (0,31<p<0,79), e ID-PE proporcionó títulos generalmente más altos que LV PE adiposa en todos los puntos temporales (0,075 < p < 0,12). La falta de diferencias significativas entre ID-PE y LV PE adiposa se debe potencialmente al número de réplicas para ID-PE en este estudio exploratorio (n=3). La administración de una vacuna de ADN, introducida en el tejido adiposo a través de la PE, para inducir respuestas humorales robustas. Se demostró que la respuesta inmunitaria humoral tras las vacunaciones con ADN de P<e>adiposa depende tanto de la tensión como de la distribución espacial, siendo la tensión más alta, en particular, fundamental para lograr respuestas de anticuerpos rápidas y de gran magnitud. Se trata de la primera demostración de que los adipocitos transfectados pueden provocar una respuesta inmunitaria. Se observó una fuerte dependencia de la tensión, a pesar de que no había diferencias dependientes de la tensión en la expresión génica. Se preveía el impacto positivo de múltiples lugares de tratamiento, ya que más células están en contacto con el plásmido.

Ejemplo 9. Inmunogenicidad celular. Para investigar la rama celular de la respuesta inmunitaria, se realizó ELISpot en sangre periférica de cobayas inmunizadas. HV-1 (n=3), HV-5 (n=2) e ID-PE (n=2) tuvieron menos repeticiones como resultado de un bajo recuento de células viables. En L V-5 (n=3) murió una cobaya por causas ajenas al estudio. Todas las cobayas vacunadas produjeron IFN-y en respuesta a los tres grupos de péptidos, así como a ConA. La combinación de péptidos 1, que fue el más inmunogénico, se utilizó para análisis posteriores (Fig. 43). Los recuentos de puntos parecían similares entre los grupos ID-PE y HV PE adiposa, y parecían tender a ser más bajos para LV PE adiposa, con LV-1 en particular pareciendo provocar la respuesta inmune celular más débil. Dentro de los grupos de tratamiento PE adiposa, el ANOV<a>factorial no reveló diferencias significativas en los recuentos de puntos transformados logarítmicamente para la tensión (p = 0,15) o el número de puntos de inyección (p = 0,26), y no hubo interacción entre estos dos factores (p = 0,39). La comparación ANOVA de una vía de todos los grupos de tratamiento, incluido ID-PE, no mostró diferencias significativas en los recuentos de manchas transformados logarítmicamente (p = 0,31).

PE adiposa fue capaz de producir respuestas inmunitarias celulares equivalentes a IDEP, y aunque las diferencias entre los grupos no fueron significativas debido a las escasas repeticiones y a la alta variabilidad, los recuentos de puntos tendieron a ser más bajos para las cobayas que recibieron la tensión más bajo y sólo un lugar de tratamiento. Estos resultados apoyan la dependencia de la inmunogenicidad de la PE adiposa tanto de la tensión de la PE como de la distribución del ADN, y sugieren que los parámetros de electroporación y la distribución del ADN en el tejido son factores importantes que pueden ajustarse independientemente para mejorar las respuestas inmunitarias.

La dependencia de la tensión de la respuesta de anticuerpos tiene dos factores clave. En primer lugar, las tensiones más altas producen un campo eléctrico más grande y fuerte, por lo que potencialmente se pueden transfectar más células. Se ha demostrado que la eficacia de la transfección y las respuestas inmunitarias dependen de la tensión en otros tejidos, como la piel y el músculo. Sin embargo, los resultados de los estudios de optimización indicaron que se producía una amplia transfección incluso a tensiones bajas, por lo que es poco probable que ésta sea la única explicación. La segunda explicación de la respuesta de los anticuerpos dependiente de la tensión es que las tensiones más altas requieren una mayor corriente eléctrica, que puede causar daños o irritación en los tejidos debido al calentamiento resistivo. Aunque los sitios de tratamiento no presentaban signos externos de daño, el análisis histológico mostró una marcada infiltración celular en el tejido adiposo a partir de los 3 días posteriores al tratamiento. Se ha sugerido anteriormente que la PE tiene un efecto adyuvante. Por lo tanto, es posible que la infiltración celular observada esté relacionada con el daño térmico leve causado por la PE, y desempeñe un papel en el aumento de la respuesta inmunitaria a tensiones altas. Aunque 200V es similar a las tensiones utilizadas en las vacunaciones IM DNA PE, la corriente nunca superó IA, que también es similar a IM-PE. Por lo tanto, una cantidad similar de energía eléctrica se distribuye por una superficie mayor (6,25cm2) en comparación con una aguja típica de 19 pulgadas y calibre 22 (0,88cm2), por lo que la densidad de energía en la superficie del electrodo debería ser aproximadamente 7 veces menor en el tratamiento con PE de ADN adiposo en comparación con la IM-PE.

El leve efecto positivo del aumento del número de puntos de inyección de ADN sobre la inmunogenicidad se debe probablemente al aumento del número de células en contacto con el ADN antes de la PE. Se demostró que no hay ningún beneficio detectable para la expresión génica al aumentar el volumen de inyección en un solo sitio más allá de 50|jL, por lo que la misma dosis de ADN se distribuyó en 5 sitios diferentes, cada uno recibiendo inyecciones de 50 |jL. El hecho de que los tratamientos en sitios múltiples puedan proporcionar un beneficio de inmunogenicidad en comparación con el tratamiento en sitio único de la misma dosis, especialmente en los primeros momentos, proporciona pruebas de que la vacunación del PE adiposa con ADN puede beneficiar directamente al exponer más adipocitos al ADN

Los resultados sugieren que la respuesta inmunitaria puede amplificarse implicando a más adipocitos y proporcionando parámetros de electroporación óptimos. Otros factores como la duración del pulso, el número de pulsos, el retardo entre pulsos y la concentración de ADN pueden contribuir a la respuesta inmunitaria. Se ha demostrado que la ID-PE ahorra dosis, pero estos datos inmunológicos muestran que la PE adiposa fue capaz de generar respuestas inmunológicas igual de robustas a la misma dosis que la ID-PE. El tejido adiposo tiene el potencial de albergar dosis mucho mayores que la ID-PE, similares a las del músculo, sin los inconvenientes de tolerabilidad e invasividad asociados a la IM-PE. Los ejemplos demuestran que una vacuna de ADN dirigida a los adipositos es inmunógena tras la optimización de los parámetros de administración y electroporación del ADN. Este enfoque proporciona respuestas inmunitarias rápidas y sostenidas, y no requiere electrodos de aguja invasivos. Con una dosis fija de ADN, tanto la magnitud como el inicio de la respuesta inmunitaria mejoran con la tensión de electroporación y el aumento del número de puntos de inyección. La vacunación con ADN PE dirigido a los adipositos ofrece ventajas potenciales de seguridad, tolerabilidad y facilidad de uso en comparación con la administración IM, y no sufre las limitaciones de dosificación o recambio celular de los tratamientos ID.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de electroporación (10) para uso con un pliegue de tejido (120), el pliegue de tejido (120) incluyendo una capa de piel (104), una capa adiposa (108), y una capa de músculo liso (112), el dispositivo de electroporación (10) incluyendo:

un bastidor (30) que tiene un primer brazo (58) y un segundo brazo (58) que se extienden desde el mismo;

un primer electrodo (34) acoplado a un extremo distal (62) del primer brazo (58), teniendo el primer electrodo una primera superficie de contacto (38) que define un primer perímetro;

un segundo electrodo (42) acoplado a un extremo distal (62) del segundo brazo (58), teniendo el segundo electrodo (42) una segunda superficie de contacto (46) que define un segundo perímetro; y

un generador de señales de electroporación (18) configurado para enviar una señal eléctrica a los primeros y segundos electrodos (34, 42),

en el que la primera superficie de contacto (38) y la segunda superficie de contacto (46) están enfrentadas y definen una zona de tratamiento (136) entre ellas; y

en el que los primeros y segundos electrodos (34, 42) están configurados para agarrar el pliegue de tejido (120) de tal manera que el tejido posicionado dentro de la zona de tratamiento (136) incluye la capa de piel (104), la capa adiposa (108), y la capa de músculo liso (112),

caracterizado por quelas primeras y segundas superficies de contacto (38, 46) están configuradas para comunicar la señal eléctrica al pliegue de tejido (120) para aumentar la permeabilidad de la membrana celular en el pliegue de tejido (120), en el que las primeras y segundas superficies de contacto (38, 46) tienen cada una una porción eléctricamente aislada (504) y una porción no aislada (500), y la porción no aislada (500) está situada entre el extremo distal del brazo respectivo (58) y la porción aislada (504).

2. El dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 1, en el que el tejido posicionado dentro de la zona de tratamiento (136) no incluye músculo esquelético.

3. El dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además un dispositivo de inyección (26) para inyectar una cantidad predeterminada de un agente en la capa adiposa (108) del pliegue de tejido (120) antes de aplicar la señal eléctrica al primer electrodo (34) y al segundo electrodo (42).

4. El dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 3, en el que el dispositivo de inyección (26) incluye:

un depósito (82) configurado para contener la cantidad predeterminada del agente; y

una aguja de inyección (86) que se extiende desde y está en comunicación fluida con el depósito (82), en el que la aguja de inyección (86) está configurada para inyectar la cantidad predeterminada del agente en la capa adiposa (108).

5. El dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 4, en el que la aguja de inyección (86) está configurada de tal manera que un extremo distal (90) de la aguja (86) es insertable en la capa adiposa (108) dentro de la zona de tratamiento (136), y la aguja (86) está en comunicación eléctrica con el generador de señales de electroporación (18) y actúa como un electrodo que conduce la señal eléctrica al pliegue de tejido (120).

6. El dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos una de la primera superficie de contacto (38) y la segunda superficie de contacto (46) incluye una pluralidad de protuberancias (58") que se extienden desde la misma.

7. El dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 6, en el que cada protuberancia (58") tiene una forma sustancialmente piramidal.

8. El dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que:

el bastidor (30) está incluido en un aplicador manual (22), el bastidor (30) incluye una base (54) y el primer y segundo brazos opuestos (58) se extienden desde la base (54), y

el aplicador (22) incluye un mecanismo de ajuste (56) configurado para permitir a un usuario manipular una distancia entre la primera superficie de contacto (38) y la segunda superficie de contacto (46).

9. El dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la porción eléctricamente aislada (504) de cada uno de los primeros y segundos electrodos (34, 42) incluye una capa de material aislante (508”) colocada entre la superficie de contacto primera y segunda respectiva (38, 46) y el pliegue de tejido (120).

10. El dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 6-9, que comprende además un tercer electrodo (66') que tiene una tercera superficie de contacto (68') configurada para entrar en contacto con una parte superior (132) del pliegue de tejido (120) y generalmente posicionada entre los primeros y segundos electrodos (34, 42) de tal manera que el tercer electrodo (66') no entra en contacto directamente con los primeros o segundos electrodos (34, 42).

11. Un agente para uso con el dispositivo de electroporación (10) de cualquier reivindicación precedente en un procedimiento terapéutico de transfección de tejido adiposo, comprendiendo el agente un polipéptido, un polinucleótido, una molécula pequeña, o cualquier combinación de los mismos, una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo, un fragmento del mismo, una variante del mismo, o una combinación de los mismos, comprendiendo el procedimiento:

obtener el pliegue de tejido (120);

posicionar el pliegue de tejido (120) entre el primer electrodo (34) y el segundo electrodo (42), en el que la etapa de posicionamiento comprende;

colocar la primera superficie de contacto (38) en contacto con un primer lado (124) del pliegue de tejido (120); y

colocar la segunda superficie de contacto (46) en contacto con un segundo lado (128) del pliegue de tejido (120), de forma que la zona de tratamiento (136) entre la primera y la segunda superficies de contacto (38, 46) incluya la capa adiposa (108) de tejido; y

aplicar la señal eléctrica al primer electrodo y al segundo electrodo, provocando así la electroporación dentro de las paredes celulares de los adipocitos en la capa adiposa (108) del tejido.

12. El agente para uso con el dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 11, en el que el generador de señales de electroporación (18) está configurado para enviar la señal eléctrica al primer electrodo (34) y al segundo electrodo (42) en forma de uno o más pulsos eléctricos.

13. El agente para uso con el dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 12, en el que la aplicación de la señal eléctrica incluye:

(a) aplicar un pulso eléctrico de entre 5 voltios y 1000 voltios; o

(b) aplicar un pulso eléctrico entre 100 microsegundos y 100 milisegundos aproximadamente.

14. El agente para uso con el dispositivo de electroporación (10) de la reivindicación 12, en el que la aplicación de la señal eléctrica incluye aplicar entre aproximadamente 1 pulso y aproximadamente 10 pulsos.

15. El agente para uso con el dispositivo de electroporación (10) de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que la aplicación de la señal eléctrica comprende: crear un campo eléctrico en el pliegue de tejido (120); y concentrar el campo eléctrico en la capa adiposa (108), creando así una región de transfección que tiene una forma sustancialmente esférica o elipsoidal.