ES2970340T3 - Detección de SARS-COV-2 en una pluralidad de muestras biológicas - Google Patents

Abstract

La invención está dirigida a un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos y a un kit para la realización de dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de SARS-COV-2 en una pluralidad de muestras biológicas

La presente invención se refiere a un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular, más particularmente a la detección de material viral en una muestra biológica.

Antecedentes de la invención

A finales del siglo pasado, el escándalo del VIH/SIDA [13,22,39] permitió la integración de una nueva tecnología en el cribado de donantes de sangre mediante la investigación de parámetros moleculares mediante técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) [1,6,11,16,29,31-34]. Al principio, sólo unos pocos laboratorios médicos pudieron implementar esta tecnología a finales de los años 90 en el cribado de donantes de sangre. Para la técnica NAT era estrictamente necesario tener salas separadas (sala pre-NAT, sala NAT y sala post-NAT). El personal fue capacitado para trabajar de una manera unidireccional y estaba estrictamente prohibido regresar a la sala NAT después de entrar en la sala post-NAT el mismo día. La detección de virus de ARN y ADN supuso un desafío adicional para los análisis de cribado. Al principio, los tubos de las muestras deben abrirse nuevamente después de la etapa de transcripción inversa para cambiar la enzima de una transcriptasa inversa a una ADN polimerasa. Pero la técnica se desarrolló rápidamente y ahora hay disponibles sistemas robóticos de NAT completos para el cribado de donantes de sangre [7,12,15], así como para la detección de virus en los laboratorios clínicos.

Los sistemas robóticos de tipo NAT de cribado actuales (por ejemplo, Roche Cobas 8800 o Grifols Panther) [14] han implementado diferentes cámaras para separar la sala pre-NAT de la sala NAT y la sala post-NAT. Para trabajar con estos "sistemas de NAT todo en uno" sólo se necesita personal capacitado, entrada de muestras individuales o muestras en mini-mezclas, reactivos y material desechable.

En 2019, se descubrió por primera vez en China un nuevo coronavirus llamado SARS-CoV-2. El nuevo virus se propagaba rápidamente de persona a persona. Debido a las intensas actividades de viajes humanos, el SARS-CoV-2 infectó a personas en todo el mundo. En marzo de 2020, la OMS declaró que se cumplían todos los criterios de pandemia. En los jóvenes el SARS-CoV-2 induce síntomas gripales como tos, dolor de garganta, diarrea o fiebre. Sin embargo, en algunos casos también se produce una neumonía grave con muerte, especialmente en personas inmunodeprimidas, personas mayores o personas con enfermedades pulmonares como el asma bronquial. Hasta el momento no existe ningún tratamiento adecuado. Por lo tanto, la comunidad mundial apuesta por un diagnóstico precoz y el posterior aislamiento de las personas infectadas para frenar la propagación del SARS-CoV-2. Como resultado, desde marzo de 2020, muchos países han introducido medidas especiales como parte de sus planes nacionales contra la pandemia que restringen la libertad de movimiento de las personas. El diagnóstico precoz es posible mediante la técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT). Esto permite la detección directa del virus. Sin embargo, debido al número cada vez mayor de personas infectadas, también hay escasez de reactivos para este método de detección, por lo que no todas las personas que son el primer contacto con personas infectadas por SARS-CoV-2 o que tienen síntomas leves similares a los de la gripe pueden someterse a un análisis NAT.

La publicación de Internet "Pooling Method for Accelerated Testing of COVID-19" puede obtenerse en https://www.technion.ac.il/en/2020/03/pooling-method-for-accelerated-testing-of-covid-19/ sugiere una mezcla de muestras clínicas de SARS-CoV-2 para aumentar el rendimiento de los análisis.

En este contexto, un objetivo subyacente de la invención es proporcionar un método para la detección del SARS-CoV-2 que supere las desventajas de la técnica. Preferiblemente, debería proporcionarse un método que permita acelerar el rendimiento del análisis y un aumento de la capacidad de análisis con respecto a los métodos de detección actuales. Además, debería proporcionarse un método de detección que requiera menos reactivos, etapas de proceso, equipos de análisis y utensilios.

La presente invención satisface estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La presente descripción, aunque no forma parte de la invención, enseña un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos que comprende las siguientes etapas:

(1) Proporcionar al menos una muestra biológica S<1>de un primer ser vivo, y se sospecha que dicha muestra S<1>contiene SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(2) Proporcionar al menos una muestra biológica S<2>de al menos un segundo ser vivo, y se sospecha que dicha muestra contiene SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(3) Mezclar al menos una alícuota de dicha al menos una muestra biológica S1 y al menos una alícuota de dicha al menos una muestra biológica S2 para obtener una muestra mezclada Sp;

(4) Analizar la muestra mezclada Sp en busca de la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(5) Calificar a dicho primer ser vivo y a dicho al menos segundo ser vivo como negativo para SARS-CoV-2 si en la etapa (4) no se detecta el SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada S<p>; o

Analizar la muestra S1 y muestra S2 individualmente en busca de la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 si en la etapa (4) se detecta el SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada Sp.

Mediante el análisis simultáneo de al menos dos muestras biológicas, es decir, muestras biológicas de al menos dos seres vivos, p. ej., seres humanos o pacientes humanos, respectivamente, el rendimiento de los análisis aumenta significativamente. Además, los recursos de análisis disponibles se emplean de una manera más eficaz al obtener, en caso de un resultado negativo en la etapa (4), un resultado de análisis para más de un ser vivo en una sola ronda del método.

Según dicha enseñanza, “al menos un segundo ser vivo” significa 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ..., 49, ..., 99, ..., 199, ..., 299, ..., 399, ..., 499, etc. muestras biológicas adicionales o seres vivos adicionales a analizar mediante el método según la invención.

Según la invención, el "material derivado del SARS-CoV-2" se refiere a estructuras, moléculas o características que forman parte o se originan del SARS-CoV-2 y son adecuadas para indicar la presencia del SARS-CoV-2 en la muestra biológica. El "material derivado del SARS-CoV-2" incluye, por ejemplo, ácido nucleico, proteínas, péptidos y fragmentos de los mismos.

En una realización de la invención, dicho primer y dicho al menos segundo ser vivo representan un grupo de seres vivos, y dicho grupo consiste en un número de seres vivos que se selecciona de un número entero de 2-500, preferiblemente de 3-100, más preferiblemente de 5-50, y más preferiblemente de 10.

Esta realización tiene la ventaja de que mediante el método según la invención se pueden tomar muestras biológicas de hasta 500 seres vivos, p. ej., seres humanos o pacientes humanos, respectivamente, pueden analizarse de forma bastante simultánea en una ronda del método.

Según la invención, dichas muestras biológicas son hisopos, preferiblemente hisopos de garganta.

Esta medida tiene la ventaja de que se utiliza un tipo de suministro de muestra que garantiza, debido a la alta concentración del virus en la zona de la garganta, que se someta al método según la invención el mejor material de origen biológico posible. Por "hisopo" debe entenderse el propio material biológico arrastrado y, alternativamente, el bastoncillo o bastoncillo de algodón que comprende el material biológico.

En una realización del método según la invención, dicho material derivado del SARS-CoV-2 es ácido nucleico del SARS-CoV-2.

Esta medida tiene la ventaja de que la detección puede realizarse mediante métodos de laboratorio habituales que permiten la detección directa del virus o del material derivado del mismo de forma fiable.

En otra realización del método según la invención, dicho análisis de las muestras para detectar la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 se realiza mediante una técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT), preferiblemente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Esta medida aprovecha la ventaja de utilizar métodos de detección bien establecidos y muy fiables, lo que hace que el método según la invención sea muy preciso.

Otro aspecto de la descripción que no forma parte de la invención se refiere a un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos, preferiblemente un método como el descrito en los párrafos anteriores, y dicho método comprende las siguientes etapas:

(1) Proporcionarnmuestras biológicas, cada una de ellas procede de un ser vivo individual de un grupo denseres vivos individuales, en dondenes un número entero de 2-500, preferentemente de 3-100, más preferentemente de 5-50, y más preferentemente de 10;

(2) Colocar cada una de dichasnmuestras biológicas en una disolución tampón individual e incubar durante un período de tiempo que permita el desplazamiento del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 de la muestra biológica y su transferencia al tampón para obtener muestras primarias individuales. muestras Sn;

(3) Extraer una alícuota de las muestras primarias individuales Sn y diluirla en tampón a 1:npara obtener muestras diluidas individuales SDn;

(4) Mezclar dichas muestras diluidas individuales SDn para obtener una muestra mezclada Sp .

(5) Analizar la muestra mezclada Sp en busca de la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(6) Calificar a cada uno de losnseres vivos individuales como negativo para SARS-CoV-2 si en la etapa (5) no se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada Sp; o

Analizar cada una de dichas muestras primarias individuales Sn en busca de la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 si en la etapa (5) se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada Sp.

Tal realización del método según este aspecto de la descripción que no forma parte de la invención también se denomina "método de dilución". La primera muestra biológica, p. ej. un primer hisopo de un primer individuo, se proporciona y se coloca en un tubo con tampón (muestra o tubo primario) durante un tiempo suficiente para dispensar el SARS-CoV-2 o el material derivado del mismo en el tampón. En la siguiente etapa, se diluye un pequeño volumen de la muestra o tubo primario y se transfiere al tubo de mezcla o muestra de mezcla, respectivamente. para dos muestras biológicas o hisopos/seres (n = 2) se usa una dilución de 1:2, y para otros números de muestras biológicas o hisopos/seres se usan otras diluciones, es decir, para n = 3 se utiliza una dilución de 1:3, para n = 4 se utiliza una dilución de 1:4, para n = 5 se utiliza una dilución de 1:5, etc.

Esta realización tiene la ventaja de que se consigue un volumen de análisis óptimo para la siguiente etapa de análisis. Esto es importante porque el aparato de análisis, como el dispositivo de PCR, tiene un volumen de muestra máximo determinado que no debe superarse.

Las características, elementos y ventajas del método descrito al principio se aplican también al "método de dilución" y viceversa.

En una realización del "método de dilución" según la invención en la etapa (1), cada una de dichasnmuestras biológicas se proporciona mediante un hisopo, preferiblemente un hisopo de garganta.

Esta medida tiene la ventaja de que se emplea un tipo de provisión de muestras que garantiza, debido a la alta concentración del virus en el área de la garganta, que se someta al método de acuerdo con dicho aspecto de la descripción el mejor material de origen biológico posible.

La invención se refiere a un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos, preferiblemente un método como el descrito en los párrafos anteriores, y dicho método comprende las siguientes etapas:

(1) Proporcionar 2n muestras biológicas (muestra doble), y cada una de ellas procede de un ser vivo individual de un grupo denseres vivos individuales, dondenes un número entero de 2-500, preferiblemente de 3-100, aún más preferiblemente de 5-50, y más preferiblemente de 10;

(2) Colocar la primera de dichas 2nmuestras biológicas (muestra doble) en una disolución tampón individual para obtener muestras de archivo individuales SAn;

(3) Mezclar la segunda de dichas 2nmuestras biológicas (muestra doble) colocándolas en una disolución tampón común e incubándolas durante un período de tiempo que permita el desplazamiento del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 de la muestra y su transferencia al tampón común para obtener una muestra mezclada Sp.

(4) Analizar la muestra mezclada Sp en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(5) Calificar a cada uno de losnseres vivos individuales como negativo para SARS-CoV-2 si en la etapa (4) no se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada S<p>; o

Analizar cada una de dichas muestras de archivo individuales SAn en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 si en la etapa (4) se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada Sp, en donde dichas muestras biológicas son hisopos.

La invención también se denomina "método de hisopo doble". Proporcionar "2n muestras biológicas" significa que por ser vivo o individuo, de n muestras o individuos, se proporcionan dos muestras o una "muestra doble", p. ej. se proporcionan dos hisopos de garganta para cada ser. Uno de los hisopos se coloca en la muestra o tubo de archivo, respectivamente. El otro hisopo se coloca en la muestra o tubo de mezcla. Después del tiempo de dispensación se analiza la muestra mezclada.

Las características, elementos y ventajas descritas para el método al principio o el "método de dilución" se aplican igualmente al "método de hisopo doble" y viceversa.

En una realización del "método de hisopo doble" de la etapa (1), cada una de dichas 2n muestras biológicas (muestras dobles) se proporciona mediante 2 hisopos.

Esta medida tiene la ventaja de que se utiliza un tipo de suministro de muestra que garantiza, debido a la alta concentración del virus en la zona de la garganta, que se someta al método según la invención el mejor material de origen biológico posible.

Otra descripción que no forma parte de la invención se refiere a un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos, preferiblemente un método como el descrito en los párrafos anteriores, y dicho método comprende las siguientes etapas:

(1) Proporcionarnmuestras biológicas, cada una de ellas procede de un ser vivo individual de un grupo denseres vivos individuales, en dondenes un número entero de 2-500, preferentemente de 3-100, más preferentemente de 5-50, y más preferentemente de 10;

(2) Colocar cada una de dichasnmuestras biológicas en una disolución tampón individual e incubar durante un período de tiempo que permita el desplazamiento parcial del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 de la muestra y su transferencia al tampón para obtener una muestra de archivo individual SAn;

(3) Retirar cada una de dichasnmuestras biológicas del tampón individual, mezclarlas colocándolas en una disolución tampón común e incubarlas durante un período de tiempo que permita el desplazamiento del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 de la muestra para obtener una muestra mezclada S<p>.

(4) Analizar la muestra mezclada S<p>en busca de la presencia de SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(5) Calificar a cada uno de losnseres vivos individuales como negativo para SARS-CoV-2 si en la etapa (4) no se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada S<p>; o

Analizar cada una de dichas muestras de archivo individuales SAn en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 si en la etapa (4) se detecta SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada S<p>.

Este aspecto de la descripción que no forma parte de la invención también se denomina "método de hisopo individual". La primera muestra o hisopo original se coloca primero en una muestra o tubo de archivo, respectivamente. Después del tiempo de dispensación que desplaza una parte del virus o material viral de la muestra o hisopo, que deja suficiente virus o material viral en la muestra o hisopo para una detección posterior, la muestra o hisopo se coloca en la muestra o tubo de mezcla. Este procedimiento se repite para más muestras o hisopos de n muestras o hisopos, respectivamente.

Las características, elementos y ventajas descritas al principio para el método "método de dilución" o "método de hisopo doble" se aplican igualmente al "método de hisopo individual" y viceversa.

En una realización del "método de hisopo individual" de la etapa (1), cada una de dichas n muestras biológicas se proporciona mediante un hisopo.

Esta medida tiene la ventaja de que se emplea un tipo de provisión de muestra que garantiza, debido a la alta concentración del virus en el área de la garganta, que se someta al método de acuerdo con dicho aspecto de la descripción el mejor material de origen biológico posible.

En una realización del método según dicho aspecto de la descripción, en particular de cualquiera del "método de dilución" o "método de hisopo doble" o "método de hisopo individual", dicho período de tiempo de incubación está en el reivindicaciones de aprox. 1 segundo a aprox. 2 horas.

Esta medida tiene la ventaja de que se elige un tiempo de incubación que garantiza un desplazamiento suficiente del virus o del material viral de la muestra y su transferencia al tampón.

En una realización del método según dicho aspecto de la descripción, en particular de cualquiera del "método de dilución" o "método de hisopo doble" o "método de hisopo individual", dicho tampón es un medio de PCR convencional. para tal medida se utiliza un medio que permite un procesamiento directo de la muestra mediante métodos de detección convencionales como la PCR.

Otro aspecto de la descripción que no forma parte de la invención se refiere a un kit para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos, que comprende hisopos, tubos de ensayo, disoluciones tampón y un manual del método según a la invención.

Los rasgos, características, ventajas y realizaciones descritas para el método según la invención se aplican igualmente al kit según dicho aspecto de la descripción.

Un "kit" es una combinación de elementos individuales útiles para llevar a cabo el método de la invención, en donde los elementos están optimizados para el uso juntos en los métodos. El kit también puede contener reactivos, productos químicos, tampones, viales de reacción, etc. adicionales que pueden ser útiles para llevar a cabo el método según la invención. Un kit de este tipo unifica todos los elementos esenciales necesarios para ejecutar el método según la invención, por lo que se minimiza el riesgo de errores. Por lo tanto, tales kits también permiten al personal de laboratorio semicalificado realizar el método según la invención.

La invención se describe y explica a continuación con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos y dibujos no limitantes.

Figura 1: Dilución de la disolución del hisopo original;

Figura 2: Valores de CT para la detección individual, así como para una mini-mezcla de 2, una mini-mezcla de 3, una mini-mezcla de 5 y una mini-mezcla de 10 hisopos;

Figura 3: Método de mini-mezcla con hisopo doble;

Figura 4: Valores de CT para el método de hisopo doble;

Figura 5: Método de mini-mezcla con un hisopo individual;

Figura 6: Valores de CT para el método de hisopo individual.

Realizaciones

Objetivos

Se ilustran las siguientes tres realizaciones independientes diferentes de los métodos según la descripción que realizan la detección mediante NAT en un formato de mini-mezcla para poder examinar a más personas sin una reducción significativa de la sensibilidad de NAT de diagnóstico.

El objetivo de la validación actual era comparar una detección mediante NAT individual de SARS-CoV-2 con diferentes formatos de NAT en mini-mezcla.

Resultados

En la primera realización del método de mezcla (método de dilución), los hisopos se recogen en una primera etapa en un tampón y luego se pipetean diferentes volúmenes juntos dependiendo del tamaño de la mezcla. Los tubos primarios en los que se retiraron los virus del hisopo permanecen intactos para la resolución de la mezcla. Los resultados de la validación muestran valores de umbral de ciclo (CT) comparables hasta un tamaño de mini-mezcla de 3 (valor de CT del tubo primario de 24,33, valor de CT de la mini-mezcla de 3 de 26,65).

En la segunda realización (método de hisopo doble), se extrajeron 2 hisopos de cada persona. Se coloca un hisopo en el tubo de archivo y el otro en el tubo de la mini-mezcla. Dado que ambos hisopos se retiraron al mismo tiempo, la concentración de virus es comparable (valor de CT del tubo de archivo de 24,87; valor de CT del tubo de la mini mezcla de 24,72). En la validación se muestran valores de CT comparables entre los hisopos. El método también es adecuado para tamaños de mini-mezclas de entre 2 y 100 muestras.

La tercera realización (método de hisopo individual) es un método que funciona con un solo hisopo. Primero se coloca el hisopo en un tubo de archivo que puede usarse para la deconstrucción de la mini-mezcla. Después de un período de incubación adecuado, el hisopo se transfiere al tubo de mezcla. En la validación, se muestran valores de CT comparables entre el tubo de archivo (valor de CT de 24,47) y el tubo de la mini-mezcla (valor de CT de 24,93). Este método es adecuado para mini-mezclas de entre 2 y 100 muestras.

Conclusiones

Las tres realizaciones de los métodos de mezcla descritos son adecuadas para el cribado del SARS-CoV-2 en un formato de mini-mezcla para ahorrar recursos limitados de reactivos de NAT sin perder significativamente la sensibilidad diagnóstica de NAT. El procedimiento de mini-mezcla mediante NAT es especialmente adecuado para el cribado del SARS-CoV-2 en personas asintomáticas en las que se tienen pocas sospechas de un resultado positivo.Materiales y métodos

Hisopos:

Son posibles todos los hisopos convencionales (p. ej., hisopo forense Sarstedt xl)

Solución de desplazamiento de virus:

Son posibles todos los reactivos convencionales para el desplazamiento de virus de los hisopos (p. ej., medios de PCR de Roche)

Análisis de ácidos nucleicos (NAT):

Todos los análisis NAT se realizaron en los instrumentos Roche Cobas 6800/8800 con el ensayo Roche SARS-CoV-2.

Recogida de muestras

Debido a que el SARS-CoV-2 infectó principalmente la zona de la nasofaringe, las muestras se tomaron con hisopos secos.

Procesamiento de muestras

En la siguiente etapa, los hisopos se colocaron en una disolución de desplazamiento (tiocianato de guanidinio; GTC o PBS, o plasma, u otras disoluciones). Luego, el ARN del SARS-CoV-2 se extrajo manualmente o mediante sistemas robóticos seguido de un método NAT.

Primer formato de mini-mezcla (método de dilución)como referencia

El hisopo original se colocó en el tampón de desplazamiento durante aproximadamente 5 minutos para dispensar el SARS-CoV-2 del hisopo al tampón (todos los tampones son posibles, por ejemplo, los medios de PCR de Roche). El tiempo de dispensación puede estar en un reivindicaciones entre 1 segundo y 2 horas dependiendo del tampón utilizado. En la siguiente etapa, se transfirió un pequeño volumen del tubo primario al tubo de la mini-mezcla. Para mini-mezclas de dos hisopos se utiliza una dilución 1:2. Para otros formatos de mini-mezcla se tomaron otras diluciones (mini-mezcla de 3 en una dilución 1:3; mini-mezcla de 4 en una dilución 1:4; mini-mezcla de 5 en una dilución 1:5). La Figura 1 muestra el principio de dilución de este método.

La Figura 2 muestra los valores de CT para la detección individual, así como para una mini-mezcla de 2, una mini mezcla de 3, una mini-mezcla de 5 y una mini-mezcla de 10 hisopos.

El valor de CT de los hisopos individuales (24,33) no fue significativamente diferente de las mini-mezclas de 2 hisopos (25,82) o las mini-mezclas de 3 hisopos (26,65) y aumentó ligeramente en las mini-mezclas de 5 (27,05) o en las mini mezclas de 10 (27,40).

Segundo formato de mini-mezcla (método de hisopo doble)

Se tomaron dos hisopos de cada paciente. Uno de los hisopos se colocó en el tubo de muestra de archivo. El otro hisopo se colocó en un tubo de mini-mezcla. Después del tiempo de dispensación, se analizó primero el tubo de mini mezcla mediante el sistema NAT. En caso de un resultado negativo del análisis de la mini-mezcla, todas las muestras incluidas en la mini-mezcla serán negativas. En caso de un resultado positivo de la mini-mezcla, todas las muestras archivadas de la mini-mezcla deberán examinarse individualmente. La Figura 3 muestra el procedimiento de la mini mezcla.

La Figura 4 muestra los valores de CT para los hisopos de archivo y para los hisopos de la mini-mezcla.

El valor de CT de los hisopos de archivo (24,87) no fue significativamente diferente del de los hisopos de las mini mezclas (24,72). El método de mini-mezcla de hisopos dobles es posible para mini-mezclas de entre 2 y 100 hisopos (preferiblemente mini-mezclas de 5).

Tercer formato de mini-mezcla (método de hisopo individual)como referencia

Para el método de hisopo individual, el hisopo original se coloca primero en un tubo de archivo. Después del tiempo de dispensación (reivindicaciones entre 1 segundo y dos horas, preferiblemente 5 minutos) se colocó el hisopo en el tubo de mini-mezcla iniciando un segundo tiempo de dispensación (reivindicaciones entre 1 segundo y dos horas, preferiblemente 5 minutos). Este procedimiento se repetirá para más hisopos.

En caso de un resultado negativo del análisis de la mini-mezcla, todas las muestras incluidas en la mini-mezcla serán negativas. En caso de un resultado positivo de la mini-mezcla, todas las muestras archivadas de la mini-mezcla deberán examinarse individualmente. La Figura 5 muestra el procedimiento de la mini-mezcla.

La Figura 6 muestra los valores de CT para los hisopos de archivo y para los hisopos de la mini-mezcla.

El valor CT de los hisopos de archivo (24,47) no fue significativamente diferente del de los hisopos de las mini-mezclas (24,93). El método de mini-mezcla de hisopos individuales es posible para mini-mezclas de entre 2 y 100 hisopos (preferiblemente mini-mezclas de 5).

Conclusión

En resumen, es posible mezclar muestras de hisopos para la detección del SARS-CoV-2 mediante tres variantes diferentes de métodos sin perder la sensibilidad diagnóstica del método de detección NAT. El procedimiento NAT con mini-mezclas es necesario en una pandemia para utilizar de forma óptima los recursos limitados existentes y para que el mayor número posible de personas puedan beneficiarse de la detección temprana de una infección por SARS.Referencias

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23 Kuhns MC, Kleinman SH, McNamara AL, et al.: Lack of correlation between HBsAg and HBV DNA levels in blood donors who test positive for HBsAg and anti-HBc: implications for future HBV screening policy. Transfusion 2004; 44:1332-1339.

24 Lange W, Apodaca J, Kohler H: Antikorper gegen Hepatitis B (surface)-Antigen bei Hepatitispatienten und anderen epidemiologisch interessanten Bevolkerungsgruppen. Zentralbl Bakteriol Orig A 1975; 232:199-212.

25 Lange W, Kohler H, Apodaca J: Der Ausab-Test, ein Radioimmunoassay in der soliden Phase zum Nachweis von Antikorpern gegen Hepatitis B (Surface)-Antigen (Anti-HBsAg). Zentralbl Bakteriol Orig A 1974; 229:423-428. 26 Laperche S, Sauleda S, Piron M, et al.: Evaluation of the sensitivity and specificity performance of the Elecsys(R) HTLV-I/II assay in a multicenter study in Europe and Japan. J Clin Microbiol 2017.

27 Lelie N, Bruhn R, Busch M, et al.: Detection of different categories of hepatitis B virus (HBV) infection in a multiregional study comparing the clinical sensitivity of hepatitis B surface antigen and HBV-DNA testing. Transfusion 2017; 57:24-35.

28 McCluskie JA: Transmission of Syphilis by Blood Transfusion. Br Med J 1939; 1:264-266.

29 Nubling CM, Heiden M, Chudy M, et al.: Experience of mandatory nucleic acid test (NAT) screening across all blood organizations in Germany:<n>A<t>yield versus breakthrough transmissions. Transfusion 2009; 49:1850-1858. 30 Roth WK, Busch MP, Schuller A, et al.: International survey on NAT testing of blood donations: expanding implementation and yield from 1999 to 2009. Vox Sang 2012; 102:82-90.

31 Roth WK, Seifried E: The German experience with NAT. Transfus Med 2002; 12:255-258.

32 Roth WK, Weber M, Buhr S, et al.: Yield of HCV and HIV-1 NAT after screening of 3.6 million blood donations in central Europe. Transfusion 2002; 42:862-868.

33 Schmidt M, Brixner V, Ruster B, et al.: NAT screening of blood donors for severe acute respiratory syndrome coronavirus can potentially prevent transfusion associated transmissions. Transfusion 2004; 44:470-475.

34 Schmidt M, Jimenez A, Muhlbacher A, et al.: Head-to-head comparison between two screening systems for HBsAG, anti-HBc, anti-HCV and HIV combination immunoassays in an international, multicentre evaluation study. Vox Sang 2015; 109:114-121.

35 Schryver A de, Meheus A: Syphilis and blood transfusion: a global perspective. Transfusion 1990; 30:844-847. 36 Schwarz HP, Dorner F: Karl Landsteiner and his major contributions to haematology. Br J Haematol 2003; 121:556-565.

37 Shimelis T, Lemma K, Ambachew H, et al.: Syphilis among people with HIV infection in southern Ethiopia: seroprevalence and risk factors. BMC Infect Dis 2015; 15:189.

38 Wiener AS: Karl Landsteiner, M.D. History of Rh-Hr blood group system. N Y State J Med 1969; 69:2915-2935.

39 Zeiler T, Kretschmer V: Blutspenderbefragung zum Thema "Aufiniandsentschadigung fur Blutspender". Infusionsther Transfusionsmed 1995; 22:19-24.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección del SARS-CoV-2 en una pluralidad de muestras biológicas de seres vivos, y dicho método comprende las siguientes etapas:

(1) Proporcionar2nmuestras biológicas (muestra doble), cada una de las cuales proviene de un ser vivo individual de un grupo denseres vivos individuales, en los quenes un número entero de 2-500, preferiblemente de 3-100, más preferiblemente de 5-50, y más preferiblemente de 10;

(2) Colocar la primera de dichas 2nmuestras biológicas (muestra doble) en una disolución tampón individual para obtener muestras de archivo individuales S<A>n;

(3) Mezclar la segunda de dichas 2n muestras biológicas (muestra doble) colocándolas en una disolución tampón común e incubarlas durante un período de tiempo que permite el desplazamiento del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 de la muestra y su transferencia al tampón común para obtener una muestra mezclada S<P>.

(4) Analizar la muestra mezclada Sp en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2;

(5) Calificar cada uno de losnseres vivos individuales como negativos para SARS-CoV-2 si en la etapa (4) no se detecta el SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada S<p>; o Analizar cada una de dichas muestras de archivo individuales S<An>en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 si en la etapa (4) se detecta el SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 en la muestra mezclada Sp,

en donde dichas muestras biológicas son hisopos.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichos hisopos son hisopos de la garganta.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho material derivado del SARS-CoV-2 es ácido nucleico del SARS-CoV-2.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho análisis de las muestras en busca de la presencia del SARS-CoV-2 y/o material derivado del SARS-CoV-2 se realiza mediante una técnica de amplificación de ácidos nucleicos (NAT), preferiblemente mediante una reacción en cadena de la polimerasa (pCR).

5. El método de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho período de tiempo de incubación está en el reivindicaciones de aprox. 1 segundo a aprox. 2 horas.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho tampón es un medio de PCR convencional.