ES2967793T3

ES2967793T3 - Composiciones y procedimientos para mejorar la secuenciación de nanoporos

Info

Publication number: ES2967793T3
Application number: ES18213233T
Authority: ES
Inventors: Jens Gundlach; Andrew Laszlo
Original assignee: University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: University of Washington Center for Commercialization
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: EP3511424B1; EP2880186A1; FI3511424T3; EP3511424A1; US20210172013A1; AU2013296207A1; US20150191782A1; AU2021206796A1; US10858700B2; AU2019200897B2; US11821033B2; AU2019200897A1; WO2014022800A1; DK3511424T5; EP4290228A3; EP2880186A4; EP4290228A2; DK3511424T3; EP2880186B1; AU2013296207B2

Abstract

La presente divulgación proporciona métodos y reactivos para mejorar los análisis de polímeros basados en nanoporos. Específicamente, la divulgación proporciona un método para analizar un polímero que incluye un analito polimérico que contiene un dominio terminal que tiene al menos un resto cargado. La divulgación también proporciona un método para aumentar la velocidad de interacción entre un analito polimérico y un nanoporo, en el que el analito polimérico contiene un dominio terminal que tiene al menos un resto cargado. La divulgación también proporciona composiciones para usar con los métodos descritos, incluidas composiciones adaptadoras que contienen restos cargados, tales como grupos fosfato o sulfato, y que están configurados para unirse a un dominio de analito polimérico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para mejorar la secuenciación de nanoporos

ANTECEDENTES

[0001]El análisis rápido, fiable y rentable de moléculas de polímero, tal como la secuenciación de ácidos nucleicos y polipéptidos, es un objetivo principal de investigadores y médicos. La capacidad de determinar la secuencia de polímeros, tal como una secuencia de ácidos nucleicos en ADN o ARN, tiene una importancia adicional en la identificación de mutaciones genéticas y polimorfismos. Las tecnologías de secuenciación de ADN establecidas han mejorado considerablemente en la última década, pero todavía necesitan cantidades sustanciales de ADN y varias etapas prolongadas y luchan para producir longitudes de lectura superiores a 100 nucleótidos. Esta información debe entonces ensamblarse de una manera «shotgun», un esfuerzo que depende de manera no lineal del tamaño del genoma y de la longitud de los fragmentos a partir de los cuales se construye el genoma completo. Estas etapas son caras y consumen tiempo, especialmente cuando se secuencian genomas de mamíferos.

[0002]Se han investigado los procedimientos de análisis basados en nanoporos como una alternativa para los enfoques de análisis de polímeros tradicionales. Estos procedimientos implican pasar una molécula polimérica, por ejemplo, ADN de cadena sencilla («ADNss»), a través de una apertura nanoscópica mientras se controla una señal, tal como una señal eléctrica, que está influenciada por las propiedades físicas de las subunidades de polímero a medida que el analito de polímero pasa a través de la apertura de nanoporo. De manera óptima, el nanoporo tiene un tamaño o configuración tridimensional que permite al polímero pasar solamente en orden secuencia de fila única. Bajo las condiciones teóricamente óptimas, la molécula de polímero pasa a través del nanoporo a una velocidad tal que el pasaje de cada subunidad monomérica discreta del polímero se puede correlacionar con la señal controlada. Las diferencias en las propiedades químicas y físicas de las subunidades monoméricas que constituyen el polímero, por ejemplo, los nucleótidos que componen el ADNss, dan como resultado señales eléctricas características. Los nanoporos, tales como, por ejemplo, nanoporos de proteínas contenidas en las membranas de bicapa lipídicas y nanoporos en estado sólido, que han sido utilizados hasta ahora para el análisis de ADN, ARN y polipéptidos, proporcionan la ventaja potencial de análisis robusto de polímeros incluso con un número de copias bajo.

[0003]Sin embargo, permanecen los desafíos para la realización completa de tales beneficios. Por ejemplo, en las condiciones de secuenciación ideales, un analito de polímero debe translocarse de manera lineal a través del nanoporo, lo que tiene lugar más fácilmente cuando uno de los dos extremos terminales es capturado e hilado a través del nanoporo. Esto necesita una interacción inicial entre el extremo terminal del polímero analito con el nanoporo sin interferencia sustancial de la parte interna del analito de polímero. Un desafío se presenta por los analitos de polímeros largos. La probabilidad de interacción entre un nanoporo y los extremos terminales de polímeros, tales como ácidos nucleicos y polipéptidos, disminuye de manera proporcional en relación con la longitud del polímero, debido al aumento de la proporción de subunidades internas del polímero en relación con el número constante de subunidades de extremos terminales. Además, muchos biopolímeros, tales como ácidos nucleicos y polipéptidos, adoptan estructuras tridimensionales en solución, lo que a menudo puede reducir la accesibilidad de las subunidades de polímero del externo terminal al nanoporo. Finalmente, los biopolímeros, tales como ácidos nucleicos y polipéptidos, tienen una orientación (por ejemplo, ADN tiene un extremo 5' terminal y un extremo 3' terminal y los polipéptidos tienen un amino terminal y carboxi terminal), de tal manera que para algunas aplicaciones un extremo específico del polímero podría ser preferida sobre el otro para la interacción inicial y captura por el nanoporo.

[0004]El documento WO 2012/058647 menciona una composición que comprende un grupo cargado negativamente, una secuencia de oligonucleótidos y como mínimo ninguno o un grupo de enlace resistente a nucleasa para formar un cebador potenciado químicamente. El documento WO 2011/150852 menciona procedimientos para la secuenciación de ácidos nucleicos que comprende el uso de análogos de nucleótidos y una enzima de polimerasa de ácido nucleico. El documento EP0971039 menciona polímeros de ácidos nucleicos y procedimientos de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos. Kumar et al. (2005) Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 24:5-7, 401-408 menciona nucleótidos terminales marcados con fosfato.

[0005]Por consiguiente, persiste la necesidad de facilitar interacciones iniciales entre el extremo terminal preferido de un polímero analito y un nanoporo para facilitar translocaciones eficientes y análisis del polímero analito. Los procedimientos y las composiciones de la presente divulgación están dirigidos a esto y a las necesidades relacionadas de la técnica.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0006]La presente invención se define según las reivindicaciones. La presente invención da a conocer un kit para el análisis de polímeros a base de nanoporos que comprende: (a) un adaptador de ácido polinucleico de hasta 20 nucleótidos de longitud con un resto cargado unido a un extremo terminal del adaptador de ácido polinucleico; en el que el resto cargado comprende uno de: como mínimo dos fosfatos dispuestos en una configuración lineal o ramificada y un sulfato; (b) reactivos para ligar el adaptador de ácido polinucleico a un dominio de analito de polímero de un polímero; y (c) un sistema de nanoporos, en el que el sistema de nanoporos comprende un nanoporo, un recipiente de ensayo con múltiples cámaras, un aparato para aplicar y medir campos eléctricos, un motor molecular que transloca un polímero a través del nanoporo de manera enzimática, o cualquier combinación de los mismos; en el que la ligación del adaptador de ácido polinucleico al dominio de analito de polímero aumenta la carga negativa neta en la localización de la unión en comparación con la densidad de carga promedio de nucleótidos en el resto del polímero.

[0007]En algunas realizaciones, el resto cargado comprende como mínimo dos sulfatos.

[0008]En algunas realizaciones, el resto cargado comprende como mínimo un fosfato y como mínimo un sulfato.

[0009]En algunas realizaciones, los fosfatos y/o sulfato o sulfatos se disponen en una configuración lineal o ramificada. En algunas realizaciones, los grupos fosfato y/o sulfato se disponen en una configuración ramificada con dos o más grupos cargados en cada ramificación.

[0010]En algunas realizaciones, el resto cargado está unido a un nucleótido del extremo 5' terminal del adaptador de ácido polinucleico.

[0011]En algunas realizaciones, el resto cargado está unido a un nucleótido del extremo 3' terminal del adaptador de ácido polinucleico.

[0012]En algunas realizaciones, el adaptador de ácido polinucleico está configurado para estar ligado a un extremo terminal de un analito de polímero de ácido nucleico.

[0013]En algunas realizaciones, el sistema de nanoporos comprende un nanoporo, un recipiente de ensayo con múltiples cámaras, en el que el nanoporo puede instalarse entre el medio conductor líquido y un aparato para aplicar y medir campos eléctricos.

[0014]En algunas realizaciones, el sistema de nanoporos comprende un motor molecular, en el que el motor molecular es una enzima seleccionada entre una polimerasa, una exonucleasa y un fragmento de Klenow.

[0015]En algunas realizaciones, el nanoporo es un nanoporo en estado sólido, un nanoporo de proteína, un nanoporo híbrido en estado sólido/de proteína, un nanoporo en estado sólido adaptado biológicamente o un nanoporo en origami de ADN. En algunas realizaciones, el nanoporo de proteína es alfa-hemolisina o porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), o un homólogo de las mismas. En algunas realizaciones, el nanoporo de proteína es porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), o un homólogo de la misma.

[0016]En algunas realizaciones, la secuencia de nanoporo de proteína se modifica para contener como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido. En algunas realizaciones, la como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido da como resultado un cambio de carga neto en el nanoporo.

[0017]Este resumen se proporciona para presentar una selección de conceptos en una forma simplificada que se describen con más detalle a continuación en la Descripción Detallada. Este resumen no pretende identificar las características clave de la materia reivindicada, ni pretende ser utilizado como una ayuda en la determinación del alcance de la materia reivindicada.

[0018]En el presente documento se describe un procedimiento de análisis de un polímero. El procedimiento comprende la aplicación de un campo eléctrico suficiente para translocar el polímero a través de un nanoporo y medir una corriente de iones para proporcionar un patrón de corriente. El polímero comprende un dominio analito y un dominio terminal, en donde el dominio terminal contiene un primer resto cargado. El campo eléctrico puede ser suficiente para translocar el polímero a través de un nanoporo, desde un primer medio líquido conductor hasta un segundo medio líquido conductor. Una diferencia en la corriente de iones desde la cantidad umbral en el patrón de corriente indica una característica del polímero analito.

[0019]El polímero puede comprender ADN, ARN, PNA, un polipéptido o una combinación de los mismos. El dominio terminal del polímero puede ser un dominio contiguo que consiste en el 50 % o menos de las subunidades de polímero totales que incluyen uno de las subunidades terminales. El dominio terminal de polímero puede ser un domino contiguo que consiste en de 1 a 10 subunidades de polímero que incluyen una de las subunidades terminales del polímero.

[0020]El resto cargado puede dar como resultado un dominio terminal que está más cargado que la densidad de carga promedio del polímero. El resto cargado puede dar como resultado un dominio terminal que está menos cargado que la densidad de carga promedio del polímero. El resto cargado puede dar como resultado un dominio terminal que contiene la carga opuesta a la densidad de carga promedio del polímero. El resto cargado puede tener una carga positiva neta. El resto cargado con una carga positiva neta puede comprender uno de un aminoácido cargado, un nucleótido cargado modificado y un residuo básico que forma un catión. En algunas realizaciones, el resto cargado tiene una carga negativa neta. El resto cargado con una carga negativa neta puede comprender uno de un fosfato, un sulfato, un aminoácido cargado, un nucleótido cargado modificado y un residuo ácido que forma un anión. El nanoporo puede comprender un vestíbulo con una carga neta que es opuesta a la carga neta del primer resto cargado.

[0021] El nanoporo puede ser un nanoporo en estado sólido, nanoporo de proteína, nanoporo híbrido en estado sólidoproteínas (o biológico), poro en estado sólido adaptado biológicamente o un nanoporo en origami de ADN. El nanoporo puede ser un nanoporo de proteína seleccionado entre alfa-hemolisina o porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), o un homólogo de las mismas. La secuencia de nanoporo de proteína se puede modificar para contener como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido. La como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido da como resultado un cambio de carga neta en el nanoporo. El cambio de carga neta puede disminuir la similitud de la carga con el primer resto cargado (es decir, aumentar la diferencia de carga).

[0022] El analito de polímero puede comprender adicionalmente un segundo dominio terminal en el extremo opuesto del analito de polímero del primer dominio terminal, en donde el segundo dominio terminal comprende un segundo resto cargado que tiene una carga opuesta a la carga del primer resto cargado. El polímero puede comprender ADN con el dominio terminal que comprende la subunidad en el extremo 5' terminal del ADN y en donde el primer resto cargado es un fosfato. El procedimiento puede comprender también añadir un resto cargado positivamente al dominio en el extremo 3' del ADN. El polímero puede comprender ADN con el dominio terminal que comprende la subunidad en el extremo 3' terminal del ADN y en donde el primer resto cargado es un fosfato. El procedimiento puede comprender también añadir un resto cargado positivamente al dominio en el extremo 5' terminal del ADN.

[0023] El campo eléctrico se puede situar entre aproximadamente 40 mV y 1 V.

[0024] El nanoporo se puede asociar con un motor molecular, en donde el motor molecular es capaz de mover un analito en o a través del nanoporo con una velocidad de translocación promedio que es inferior a la velocidad de translocación promedio a la que el analito se transloca electroforéticamente en o a través del nanoporo en ausencia del motor molecular. La característica del polímero analito puede ser la presencia del polímero analito. La característica del polímero analito puede ser la identidad de como mínimo una subunidad del dominio de analito. Una diferencia en la corriente de una corriente de referencia puede definir un bloqueo en el patrón de corriente para la como mínimo una subunidad del dominio de analito. La identificación de la como mínimo una subunidad puede comprender la comparación del uno o más bloqueos en el patrón de corriente con uno o más bloqueos en un patrón de corriente conocido obtenido utilizando un analito conocido.

[0025] En el presente documento se describe también un procedimiento para aumentar la tasa de interacción entre un polímero y un nanoporo dispuestos entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor. El procedimiento puede comprender la aplicación de un campo eléctrico suficiente para translocar un polímero desde el primer medio líquido conductor hasta el segundo medio líquido conductor a través del nanoporo. El procedimiento puede comprender también la medición de una corriente iónica para proporcionar un patrón de corriente. El polímero puede tener un dominio de analito y un dominio terminal. El dominio terminal puede comprender un primer resto cargado. Una diferencia en la corriente iónica de un nivel umbral de corriente iónica en el patrón de corriente puede indicar una interacción entre el polímero y el nanoporo.

[0026] El polímero puede comprender ADN, ARN, APN, un polipéptido o una combinación de los mismos. El dominio terminal puede comprender entre 1 y 10 subunidades de polímeros que incluyen una subunidad terminal.

[0027] El primer resto cargado puede tener una carga positiva neta. El primer resto cargado puede tener una carga negativa neta.

[0028] El nanoporo puede comprender un vestíbulo con una carga neta que es opuesta a la carga neta del primer resto cargado

[0029] La tasa de interacción entre el nanoporo y el polímero puede ser como mínimo del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 % o 200 % superior a la tasa de interacción entre el nanoporo y el polímero que carece del primer resto cargado en el dominio terminal.

[0030] La divulgación da a conocer una composición de adaptador de polímero. La composición de adaptador comprende un ácido polinucleico con entre 1 y 20 nucleótidos, y un resto cargado unido a como mínimo uno de los polinucleótidos del ácido polinucleico. El resto cargado puede comprender como mínimo dos grupos fosfato y/o sulfato.

[0031] El resto cargado se puede unir de manera covalente al como mínimo un nucleótido. El resto cargado se puede unir de manera iónica al como mínimo un nucleótido. El resto cargado se puede unir de manera indirecta al como mínimo un nucleótido.

[0032] Los grupos fosfato y/o sulfato pueden disponerse en una configuración lineal o ramificada. Los grupos fosfato y/o sulfato pueden disponerse en una configuración ramificada con dos o más grupos cargados en cada ramificación.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0033] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas consiguientes de la presente invención se entenderán con más facilidad en cuando los mismos se entiendan mejor mediante la referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se contempla en conjunto con los dibujos que la acompañan, en los que:

La FIGURA 1 muestra un polímero analito de ADN con un grupo fosfato unido al extremo 5' terminal. Específicamente, la FIGURA 1A muestra un analito de ADN (SEQ ID NO:1), con dominios indicados que hibridan con un oligo de bloqueo (SEQ ID NO: 2) y un dominio de un oligo con horquilla (SEQ ID NO:3). El oligo de bloqueo (SEQ ID NO:2), tal como se muestra, tiene un dominio «deshilacliado abásico» en el extremo 3' terminal con siete residuos abásicos contiguos (cada uno se muestra con una «X») y un espaciador de carbono (se muestra con una «Z»). Se incluyen flechas para indicar cómo los dominios de diferentes ácidos polinucleicos se hibridan entre sí. La FIGURA 1B muestra el polímero analito de ADN cuando este se hibrida con oligos de bloqueo y de horquilla. El oligo de horquilla tiene un dominio en bucle que consiste en TTTT, dos dominios de horquilla complementarios que se hibridan entre sí y un dominio que se hibrida con el extremo 3' terminal del polímero analito de ADN. El oligo de bloqueo se hibrida con el polímero analito de ADN que empieza después del extremo 3' terminal del oligo de horquilla, pero sin estar unido al oligo de horquilla. Se muestra el dominio deshilachado abásico del oligo de bloqueo cuando no se hibrida con la secuencia de analito. Esta configuración de polímero analito de ADN y oligos se puede utilizar junto con un sistema de nanoporos que incorpora un motor molecular, tal como phi29, tal como se describe en el presente documento.

La FIGURA 2 muestra el efecto de aumentar cargas negativas sobre tasas de interacción ácido nucleico - poro. La tasa de eventos se muestra para una cadena de analito de ADN plantilla que no contiene o aumenta el número de grupos fosfato en diferentes configuraciones mostradas en el extremo 5' terminal. Los eventos «sin procesar» se asocian con cualquier interacción medible entre el ácido nucleico y el poro, mientras que los eventos «profundos» son la proporción de los eventos «sin procesar» que se asocian con la translocación de ácido nucleico a través del poro. Se muestra que los restos cargados mostrados aumentan la tasa de interacción entre ácido nucleico - poro muy por encima al ácido nucleico sin fosforilación. Los restos cargados con múltiples grupos fosfato se generaron con una configuración duplicadora asimétrica.

La FIGURA 3 muestra que los polímeros analitos de ADN que tienen una variedad de restos cargados negativos, tales como duplicadores asimétricos y/o fosforilación, tienen grados variables de adherencia de ADN al volumencis,incluso después de la perfusión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0034] La presente divulgación se refiere de manera general a las composiciones y los procedimientos para analizar de manera eficiente características de polímero, en los que se requieren las interacciones entre el polímero analito y un nanoporo. En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos que mejoran la tasa de interacción entre el analito polímero y el nanoporo.

[0035] Los nanoporos parecen prometedores para el análisis de polímeros económico, rápido y casi «libre de reactivos». En un ejemplo general de un sistema de nanoporos, se aplica un voltaje externo a lo largo de una escala nanométrica, poro rellenado con electrolitos, incluyendo un campo eléctrico. Cualquier analito, tal como un polímero que entra en contacto, se encuentra en o se mueve a través de, el interior del poro, modula la corriente iónica que pasa a través del poro dependiendo de sus características físicas. Si el túnel interior formado por el poro es de un diámetro y longitud suficientemente pequeños, los polímeros que pasan a través deben pasar de una manera lineal, de tal modo que solamente un subconjunto de las subunidades de polímeros se encuentra en la zona más estrecha del túnel de poro al mismo tiempo. Por tanto, la corriente iónica fluctúa con el tiempo a medida que el polímero pasa a través del nanoporo, subunidad tras subunidad, dependiendo de las características físicas diferentes de la subunidad o subunidades que se encuentran en la zona de constricción del nanoporo durante en etapa de interacción.

[0036] Tal como se describe anteriormente, un desafío principal para el análisis de polímeros basado en nanoporos es establecer una interacción inicial adecuada entre el analito de polímero y el nanoporo para facilitar la captura del extremo terminal adecuado del analito de polímero y el pasaje posterior del polímero a través del nanoporo de una manera lineal. Con el aumento de longitud de polímero, disminuye la accesibilidad de un extremo terminal de un polímero al nanoporo, en oposición a una parte interna del polímero, debido al aumento de la proporción del volumen interno del polímero. Esta accesibilidad reducida, especialmente en situaciones con un número bajo de copias de analitos, hace que el establecimiento de una interacción inicial apropiada entre el analito de polímero y el nanoporo sea muy difícil.

[0037] Los presentes inventores han desarrollado un enfoque para mejorar la tasa de interacción adecuada entre un analito de polímero y el nanoporo para facilitar el análisis en un sistema de análisis basado en nanoporos. La tasa de interacción mejorada da como resultado tasas de captura mejoradas del polímero, y, por tanto, condiciones y resultados de análisis mejorados. Tal como se describe en más detalle a continuación, los inventores han desarrollado procedimientos y compuestos que aumentan la carga en uno o más extremos del polímero analito. La carga de los extremos del analito de polímero aumenta la favorabilidad energética por el extremo preferido del polímero para interactuar con, y ser capturado por, el nanoporo para el análisis. Para ilustrar, los inventores modificaron los extremos 5' terminales de ADN de cadena sencilla con una variedad de grupos fosfato en diferentes configuraciones, tal como se describe con más detalle a continuación. Los analitos de ADN se sometieron al análisis comparativo en un sistema de nanoporos que incorporaba de manera específica un nanoporo de una porina A deMycobacterium smegmatis(MspA) modificado. Los analitos con adiciones de grupos fosfato cargados mostraron una interacción y tasas de captura notablemente mejoradas sobre el analito de ADN no modificado, que dio como resultado una eficiencia notablemente aumentada en el análisis.

[0038] De acuerdo con lo dicho anteriormente, la presente divulgación proporciona un procedimiento de análisis de un polímero. El procedimiento comprende la aplicación de un campo eléctrico suficiente para translocar el polímero a través de un nanoporo desde un primer medio líquido conductor hasta un segundo medio líquido conductor, en donde el polímero comprende un dominio de analito y un dominio terminal, en donde el dominio terminal tiene un primer resto cargado. El procedimiento puede comprender también la medición de una corriente iónica para proporcionar un patrón de corriente, en donde una reducción de la corriente iónica por debajo de un nivel de corriente iónica umbral en el patrón de corriente indica una característica del polímero analito.

[0039] En el presente documento se describen los procedimientos y compuestos para facilitar el análisis de cualquier analito de polímero modificable para el análisis en un sistema basado en nanoporos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término «polímero» se refiere a un compuesto químico que comprende dos o más unidades estructurales de repetición, a los que se hace referencia en el presente documento de manera intercambiable como «subunidades», «unidades monoméricas» o «meros», donde cada subunidad puede ser la misma o diferente. Los ejemplos no limitativos de polímeros para ser analizados con los presentes procedimientos incluyen: ácidos nucleicos, péptidos y proteínas, así como una variedad de polímeros de hidrocarburos (por ejemplo, polietileno, poliestireno) y polímeros de hidrocarburos funcionalizados, en donde el esqueleto del polímero comprende una cadena de carbonos (por ejemplo, cloruro de polivinilo, polimetacrilatos). Los polímeros incluyen copolímeros, copolímeros de bloque y polímeros ramificados, tales como polímeros estrella y dendrímeros.

[0040] En algunas realizaciones, el polímero es o comprende un ácido nucleico. El término «ácido nucleico» hace referencia a un polímero de desoxirribonucleótido (ADN) o un polímero de ribonucleótido (ARN) en forma de cadena sencilla o doble. La estructura de las subunidades canónicas de polímero de ADN, por ejemplo, se conocen comúnmente y se les hace referencia en el presente documento como adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Como un grupo, a estos se les hace referencia en el presente documento como nucleótidos o residuos de nucleótidos. Para ARN, las 20 subunidades canónicas de polímero son las mismos, a excepción de uracilo (U) en lugar de timina (T).

[0041] En algunas realizaciones, el polímero es o comprende un polipéptido, es decir el polipéptido es o comprende una secuencia de residuos de aminoácidos. Tal como se utiliza en el presente documento, un «aminoácido» hace referencia a cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural que se encuentran en proteínas, D-estereoisómeros de los aminoácidos de origen natural (por ejemplo, D-treonina), aminoácidos no naturales y aminoácidos modificados químicamente. Cada uno de estos tipos de aminoácidos no es mutuamente excluyente. Los a-aminoácidos comprenden un átomo de carbono al que se unen un grupo amino, un grupo carboxilo, un átomo de hidrógeno y un grupo distintivo al que se hace referencia como una «cadena lateral». Las cadenas laterales de aminoácidos de origen natural se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, hidrógeno (por ejemplo, tal como en glicina), alquilo (por ejemplo, tal como en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina), alquilo sustituido (por ejemplo, tal como en treonina, serina, metionina, cisteína, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina, arginina y lisina), arilalquilo (por ejemplo, tal como en fenilalanina y triptófano), arilalquilo sustituido (por ejemplo, tal como en tirosina) y heteroarilalquilo (por ejemplo, tal como en histidina).

[0042] Las siguientes abreviaturas se utilizan para los 20 aminoácidos de origen natural: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

[0043] Cualquiera de los ejemplos anteriores de polímeros puede incluir también subunidades o análogos no canónicos. Las subunidades no canónicas pueden ser útiles para proporcionar una señal de salida obvia para indicar que el extremo de un dominio de referencia ha pasado a través del nanoporo. En los que se refiere a las realizaciones de polímeros de ácido nucleico, los ejemplos no limitativos de subunidades no canónicas incluyen uracilo (para ADN), 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formetilcitosina, 5-carboxicitosina b-glucosil-5-hidroxi-metilcitosina, 8-oxoguanina, 2-amino-adenosina, 2-amino-desoxiadenosina, 2-tiotimidina, pirrolo-pirimidina, 2-tiocitidina o una lesión abásica. Una lesión abásica es una ubicación a lo largo del esqueleto de desoxirribosa, pero que carece de una base. Los análogos conocidos de nucleótidos naturales se hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a los nucleótidos de origen natural, tales como ácidos nucleicos (APNs) y ADN de fosforotioato.

[0044] Los residuos de péptidos no canónicos representativos se conocen en la técnica, tal como se expone en, por ejemplo, Williams et al., Mol. Cell. Biol. 9:2574 (1989); Evans et al., J. Amer. Chem. Soc. 112:4011-4030 (l990); Pu et al., J. Amer. Chem. Soc. 56:1280-1283 (1991); Williams et al., J. Amer. Chem. Soc. 113:9276-9286 (1991); y todas las referencias citadas en los mismos. Los aminoácidos no canónicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: ácido 2-aminoadípico, N-etilasparagina, ácido 3-aminoadípico, hidroxilisina, p-alanina, ácido p-amino-propiónico, alohidroxilisina, ácido 2-aminobutírico, 3-Hidroxiprolina, ácido 4-aminobutírico, ácido piperidínico, 4-hidroxiprolina, ácido 6-aminocaproico, isodesmosina, ácido 2-aminoheptanoico, alo-isoleucina, ácido 2-aminoisobutírico, N-metilglicina, sarcosina, ácido 3-aminoisobutírico, N-metilisoleucina, ácido 2-aminopimélico, 6-N-metil lisina, ácido 2,4-diaminobutírico, N-metilvalina, desmosina, norvalina, ácido 2,2'-diaminopimélico, norleucina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ornitina, N-etilglicina. Los procedimientos de incorporación de aminoácidos no canónicos se conocen bien en la técnica.

[0045]En algunas realizaciones, un único analito de polímero puede comprender una combinación de cualquiera de los polímeros y/o subunidades de polímeros anteriores. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el analito de polímero es una combinación de cualquiera de dos o más de ADN, ARN APN y/o polipéptido.

[0046]Adicionalmente, en algunas realizaciones, el analito de polímero puede contener modificaciones en una o más subunidades de polímeros. En algunas realizaciones, el analito modificado comprende un ácido nucleico modificado o aminoácido modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende un ADN modificado, un ARN modificado, un APN modificado o una combinación de los mismos. Tales modificaciones y su implementación en los polímeros son conocidos habitualmente en la técnica y pueden facilitar el análisis de los analitos de polímeros.

[0047]Se puede caracterizar el polímero como el que comprende un dominio de analito y como mínimo un dominio terminal. El «dominio de analito» es la parte del analito de polímero que se caracteriza de algún modo mediante el análisis de nanoporos. Por ejemplo, la presencia de una característica identificable, tal como una «huella dactilar», patrón de secuencia o secuencia primaria real de varias subunidades de los mismos, se puede identificar en el dominio de analito. La mera presencia del dominio de analito, es decir, la presencia de una o más subunidades de polímero, que excluye el dominio terminal, se puede confirmar en el análisis. Se puede determinar la secuencia primaria (es decir, la identidad) de dos o más subunidades de polímeros en el dominio de analito. La descripción adicional de cómo se caracteriza el dominio de analito en un sistema de nanoporos se proporciona a continuación.

[0048]El «dominio terminal» es una parte del polímero que comprende como mínimo un resto cargado. El resto se une al polímero en uno de los extremos terminales del polímero. El término «extremo terminal» se utiliza en el presente documento para indicar una parte del polímero que comprende una subunidad de polímero terminal. El término «subunidad terminal» se utiliza en el presente documento para indicar una subunidad de polímero que está solamente unida a una otra subunidad de polímero, en oposición a una subunidad «interior», que se une a como mínimo dos subunidades adicionales (por ejemplo, unida a una subunidad en cada lado, para una subunidad interior en un polímero lineal). Por consiguiente, un polímero lineal tendrá dos extremos terminales, y, por lo tanto, dos subunidades de extremos terminales, en los extremos opuestos del polímero. En algunas realizaciones, un extremo terminal puede comprender el terminal con como mucho 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 subunidades de polímero que incluyen una subunidad del extremo terminal. Por lo tanto, por ejemplo, el dominio terminal puede ser como mínimo una resto cargado unido a cualquiera de las subunidades de polímero en uno de los extremos terminales, tal como se indica anteriormente. En algunas realizaciones, el extremo terminal del polímero se define como un dominio contiguo de subunidades de polímero que consiste en el 60 % o menos de las subunidades totales del polímero e incluye una de las subunidades terminales, tales como 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o cualquier porcentaje entre los mismos, o inferior de las subunidades totales del polímero, que incluye una de las subunidades terminales.

[0049]En algunas realizaciones, el dominio terminal consiste en el como mínimo un resto cargado, con la condición de que se une al polímero en uno de los extremos terminales del polímero.

[0050]En otras realizaciones, el dominio terminal comprende el como mínimo un resto cargado y comprende también como mínimo una de las subunidades de polímero. En algunas realizaciones, el dominio terminal comprende una de las subunidades terminales del polímero y como mínimo un resto cargado. En algunas realizaciones, el dominio terminal comprende una pluralidad de subunidades de polímero contiguas que incluyen una de las subunidades terminales del polímero. Por ejemplo, el dominio del extremo terminal puede comprender las últimas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 subunidades de polímero, que incluyen una subunidad del extremo terminal y como mínimo un resto cargado. En algunas realizaciones, el dominio extremo terminal comprende un dominio contiguo de subunidades de polímero que consiste en 20% o menos de las subunidades totales del polímero e incluye una de las subunidades terminales y el como mínimo un resto cargado.

[0051]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «resto cargado» significa cualquier estructura o subestructura química que proporciona una carga eléctrica, ya sea positiva o negativa, que es el resultado de un déficit o un exceso de electrones en relación a los protones en la estructura o la subestructura. El resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado, puede tener una carga positiva neta. En algunas realizaciones, el resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado, tiene una carga negativa neta. En algunas circunstancias, es útil considerar la carga neta del dominio terminal en relación con otros componentes del polímero. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el resto cargado da como resultado un dominio terminal que está más cargado en comparación con la densidad de carga promedio del polímero. Por ejemplo, en general, el ADN está cargado negativamente y tiene una densidad de carga promedio negativa por residuo de nucleótido en el polímero. La adición de un resto cargado negativamente en el dominio terminal del polímero de ADN da como resultado una carga negativa mayor en el sitio de unión (es decir, indicando un exceso adicional de electrones) en comparación con la densidad de carga promedio de nucleótidos en el resto del polímero de ADN. El resto cargado puede dar como resultado un dominio terminal menos cargado, en comparación con la densidad de carga promedio del polímero. Por ejemplo, con el polímero de ADN ilustrativo descrito anteriormente, la adición de un resto cargado positivamente en el dominio terminal del polímero de ADN da como resultado una carga negativa menor o incluso una carga positiva en el sitio de unión (es decir, indicando un exceso menor de electrones o un déficit relativo de electrones) en comparación con la densidad de carga promedio de nucleótidos en el resto del polímero de ADN.

[0052] Algunos analitos de polímero contienen terminaciones estructuralmente diferentes, que dan como resultado una orientación discernible en relación con el pasaje a través del nanoporo. Por ejemplo, el ADN tiene un extremo 5' terminal y un extremo 3' terminal. De manera alternativa, los polipéptidos tienen un extremo amino y un extremo carboxi. Por consiguiente, un resto cargado y/o un dominio terminal, tal como se describen en el presente documento, se pueden añadir de manera estratégica a un extremo específico del polímero analito. De este modo, dependiendo de las cargas relativas del extremo o extremos del polímero y el nanoporo, la interacción inicial, la captura y la translocación del analito de polímero se pueden hacer mucho más favorables energéticamente para uno de los dos extremos del polímero, promoviendo de este modo una orientación preferida con respecto a las interacciones con el nanoporo.

[0053] Por consiguiente, en algunas realizaciones, el resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado tienen una carga neta que es opuesta a la carga neta en la apertura o el vestíbulo del nanoporo. La estructura del nanoporo, que incluye el vestíbulo, se describe con más detalle a continuación. El resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado pueden tener una carga positiva neta, mientras que la apertura o el vestíbulo del nanoporo tienen una carga negativa neta. De manera alternativa, en algunas realizaciones, el resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado tienen una carga negativa neta, mientras que la apertura o el vestíbulo del nanoporo tienen una carga positiva neta. Con las cargas contrarias, la interacción entre el dominio terminal y la apertura o el vestíbulo del nanoporo resulta mucho más favorable energéticamente. Además, en las realizaciones donde la carga neta del dominio terminal es superior a la carga de densidad promedio de las partes restantes del polímero, el dominio terminal es más propenso a la disociación de las estructuras tridimensionales que a menudo se forman con polímeros largos. Por consiguiente, el dominio terminal es más accesible a la apertura o el vestíbulo del nanoporo.

[0054] En algunas realizaciones, el resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado tienen una carga neta que es la misma que la carga neta en la apertura o el vestíbulo del nanoporo. Por ejemplo, el resto cargado o el dominio terminal que incluye el resto cargado, y la apertura o el vestíbulo del nanoporo pueden tener una carga positiva neta. Con las mismas cargas netas, la interacción entre el dominio terminal y la apertura o el vestíbulo del nanoporo resulta mucho menos favorable energéticamente. Por consiguiente, cualquier interacción entre el nanoporo y un extremo de analito más probablemente favorecerá al extremo que no tiene el resto cargado con la misma carga neta que el nanoporo. Además, cuando la carga neta del dominio terminal es inferior a (u opuesta a) la carga de densidad promedio de las partes restantes del polímero, el dominio terminal es más propenso a la asociación con las estructuras tridimensionales que a menudo se forman con los polímeros largos. Por consiguiente, el dominio terminal resulta menos accesible a la apertura o el vestíbulo del nanoporo. De nuevo, esto puede dar como resultado un favorecimiento de una interacción inicial y captura entre el extremo del polímero que no tiene el resto cargado con la misma carga neta que el nanoporo.

[0055] En algunas realizaciones, el analito de polímero comprende adicionalmente un segundo dominio terminal que comprende un segundo resto cargado. Por ejemplo, en polímeros lineales, el segundo dominio terminal se ubica en el extremo opuesto del polímero del primer dominio terminal. En algunas realizaciones, el segundo resto cargado tiene una carga que es opuesta al primer resto cargado, dando como resultado de este modo un polímero polarizado con un dominio terminal cargado positivamente y un dominio terminal cargado negativamente. Como con el resto cargado descrito anteriormente (es decir, el «primer» resto cargado), el segundo resto cargado se une al polímero en el extremo terminal del polímero. Tener un analito de polímero polarizado puede promover adicionalmente la orientación preferida del polímero con respecto a la interacción con el nanoporo y la translocación a través del mismo. En un ejemplo que incorpora un nanoporo con una carga positiva neta en el vestíbulo, un analito de ADN puede comprender un primer dominio terminal con un resto negativo en el extremo 5' terminal para promover la captura de ese extremo por el nanoporo. Adicionalmente, el mismo analito de ADN puede comprender adicionalmente un segundo dominio terminal en el extremo 3' terminal con un resto cargado positivamente, que sirve para promover adicionalmente la captura del extremo 5' terminal por el nanoporo. Se entenderá que si la orientación preferida es tener que el extremo 3' terminal entre el primero en el nanoporo, las cargas en los dominios terminales pueden revertirse de los descrito anteriormente, teniendo el dominio del extremo 3' terminal un resto cargado negativamente y el dominio del extremo 5' terminal un resto cargado positivamente.

[0056] Los ejemplos de estructuras químicas que pueden servir como restos cargados positivamente se conocen bien en la técnica. Una lista ilustrativa y no limitativa incluye: aminoácidos cargados, residuos básicos que forman un catión y similares.

[0057] Los ejemplos de estructuras químicas que pueden servir como restos cargados negativamente se conocen bien en la técnica. Una lista lustrativa y no limitativa incluye: fosfato, sulfato, aminoácido cargado, nucleótido cargado modificado, residuo ácido que forma un anión y similares.

[0058]El resto cargado puede comprender copias múltiples de cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento. Esto presenta la ventaja de aumentar la carga deseada para incorporarla en el dominio terminal del polímero. Las copias múltiples pueden unirse de manera covalente en cualquier configuración que no impida al resto completo unirse al dominio terminal. Por ejemplo, tal como se describe con más detalle a continuación, los múltiples grupos fosfato se unieron al extremo de un dominio de ADN de cadena sencilla de una manera lineal, ramificada (a la que se refiere también como «duplicador») y una combinación de los mismos (tal como un duplicador conteniendo cada rama uno o más múltiples grupos fosfato en una configuración lineal; y un «duplicador apilado», donde cada una de dos ramas primarias conduce a una ramificación adicional, lo que da como resultado cuatro grupos fosfato). Véase, por ejemplo, la FIGURA 2. Para generar la configuración ramificada o duplicadora, se puede utilizar un duplicador asimétrico, de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR12-11.html). Las configuraciones duplicadoras e incluso triplicadoras están fácilmente disponibles como sintones de fosforamiditas que se pueden utilizar en las técnicas de síntesis de oligómeros estándar ampliamente conocidas en el sector. Por ejemplo, los adaptadores de ADN se pueden ligar sobre los analitos deseados utilizando técnicas conocidas.

[0059]A continuación se describirán varios aspectos del nanoporo y el sistema de nanoporos. Un “nanoporo” se refiere de manera específica a un poro que tiene una apertura con un diámetro en su punto más estrecho de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Los nanoporos útiles en la presente divulgación incluyen cualquier poro capaz de permitir la translocación lineal de un polímero de un lado al otro con una velocidad susceptible para las técnicas de monitorización, tales como técnicas de detección de fluctuaciones de corriente. En algunas realizaciones, el nanoporo comprende una proteína, tal como alfa-hemolisina, porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), OmpATb, homólogos de las mismas u otras porinas, tal como se describe en la Publicación de Estados Unidos N.° US2012/0055792, las Publicaciones de PCT internacionales N.° WO2011/106459 y WO2011/106456. Un «homólogo», tal como se utiliza en el presente documento, es un gen de otras especies bacterianas que tiene una estructura similar y origin evolutivo. A modo de ejemplo, los homólogos de MspA de tipo salvaje, tales como MppA, PorMI, PorM2 y Mmcs4296, pueden servir como el nanoporo en la presente invención. Los nanoporos de proteínas presentan la ventaja que, como moléculas biológicas, se auto-ensamblan y son esencialmente idénticas entre sí. Adicionalmente, es posible modificar genéticamente los nanoporos de proteínas para otorgarles características deseadas, tales como sustitución de residuos de aminoácidos por aminoácidos con cargas diferentes o para la creación de una proteína de fusión (por ejemplo, una exonucleasa+alfa-hemolisina). Por tanto, los nanoporos de proteínas pueden ser de tipo salvaje o pueden modificarse para contener como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido. En algunas realizaciones, la como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido da como resultado una carga neta diferente del nanoporo. En algunas realizaciones, la diferencia en la carga neta aumenta la diferencia de la carga neta cuando se compara con el primer resto cargado del analito de polímero. Por ejemplo, si el primer resto cargado tiene una carga negativa neta, la como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido da como resultado un nanoporo que está menos cargado negativamente. En algunos casos, la carga neta resultante es negativa (pero mucho menos), es neutra (donde anteriormente era negativa), es positiva (donde anteriormente era negativa o neutra) o es más positiva (donde anteriormente era positiva, pero mucho menos).

[0060]Se han descrito las descripciones de modificaciones en nanoporos de MspA, véase la Publicación de Estados Unidos N.° 2012/0055792. Descrito de manera breve, los nanoporos de MspA pueden modificarse con sustituciones de aminoácidos que dan como resultado un mutante de MspA con una mutación en la posición 93, una mutación en la posición 90, posición 91 o ambas posiciones 90 y 91 y de manera opcional una o más mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoácidos: 88, 105, 108, 118, 134 o 139, con referencia a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En una realización específica, la MspA contiene las mutaciones de D90N/D91N/D93N, con referencia a las posiciones de la secuencia de tipo salvaje (a la que se refiere en ese documento como «M1MspA» o «M1-NNN»). En otra realización, la MspA contiene las mutaciones D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K, con referencia a las posiciones de la secuencia de tipo salvaje (a la que se refiere en ese documento como «M2MspA»). Véase la Publicación de Estados Unidos N.° 2012/0055792. Tales mutaciones pueden dar como resultado un nanoporo de MspA que comprende un vestíbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, donde el vestíbulo y la zona de constricción en conjunto definen un túnel. Además, las sustituciones de aminoácidos descritas en estos ejemplos proporcionan una carga positiva neta mayor en el vestíbulo del nanoporo, potenciando adicionalmente la favorabilidad energética de la interacción con un extremo de polímero analito cargado negativamente.

[0061]En algunas realizaciones, los nanoporos pueden incluir o comprender estructuras basadas en ADN, tales como generadas mediante técnicas de origami de ADN. Para las descripciones de nanoporos basados en origami de ADN para la detección de analitos, véase la Publicación de PCT N.° WO2013083983.

[0062]En algunas realizaciones, el nanoporo puede ser un nanoporo en estado sólido. Los nanoporos en estado sólido pueden producirse tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos N.° 7,258,838 y 7,504,058. Los nanoporos en estado sólido tiene la ventaja de que son más robustos y estables. Además, los nanoporos en estado sólido en algunos casos pueden multiplexarse y fabricarse en lotes de una manera más eficiente y rentable.

Finalmente, podrían combinarse con la tecnología de fabricación microelectrónica. En algunas realizaciones, el nanoporo comprende un nanoporo híbrido de proteína/en estado sólido en el que una proteína de nanoporo se incorpora en un nanoporo de estado sólido. En algunas realizaciones, el nanoporo es un poro en estado sólido adaptado biológicamente.

[0063]En algunas realizaciones, tales como la incorporación de nanoporos de proteínas de MspA, el nanoporo comprende un vestíbulo y una zona de constricción que en conjunto forman un túnel. Un «vestíbulo» se refiere a la parte con forma cónica del interior del nanoporo, cuyo diámetro disminuye de manera general de un extremo al otro a lo largo de un eje central, donde la parte más estrecha del vestíbulo está conectada con la zona de constricción. Un vestíbulo se puede visualizar de manera general en «forma de copa». Debido a que el vestíbulo está en forma de copa, el diámetro cambia a lo largo de la trayectoria de un eje central, donde el diámetro es más grande en un extremo que en el extremo opuesto. El diámetro puede oscilar entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, el diámetro es aproximadamente, o como mínimo aproximadamente o como máximo aproximadamente 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable entre los mismos. La longitud del eje central puede oscilar entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, la longitud es aproximadamente, o como mínimo aproximadamente o como máximo aproximadamente, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0 nm o cualquier intervalo derivable entre los mismos. Cuando en el presente documento se hace referencia a «diámetro», se puede determinar un diámetro realizando una medición de distancias de centro a centro o distancias atómicas de superficie a superficie.

[0064]Una «zona de constricción» hace referencia a la parte más estrecha del túnel del nanoporo, en términos del diámetro, que está conectada con el vestíbulo. La longitud de la zona de constricción puede oscilar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,3 nm y aproximadamente 20 nm. Opcionalmente, la longitud es aproximadamente, o como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable entre los mismos. El diámetro de la zona de constricción puede oscilar entre aproximadamente 0,3 nm y aproximadamente 2 nm. De manera opcional, el diámetro es aproximadamente, como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable entre los mismos. En otras realizaciones, tal como aquellas que incorporan los poros en estado sólido, el intervalo de dimensión (longitud o diámetro) se puede extender hasta aproximadamente 20 nm. Por ejemplo, la zona de constricción de un nanoporo en estado sólido es aproximadamente, como máximo aproximadamente o como mínimo aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nm o cualquier intervalo derivable entre los mismos.

[0065]En algunos casos, el nanoporo se dispone en una membrana, película delgada o bicapa lipídica, que puede separar el primero y el segundo medio líquido conductor, que proporciona una barrera no conductora entre el primer medio líquido conductor y el segundo medio líquido conductor. De este modo, el nanoporo proporciona comunicación líquida entre el primero y el segundo medio líquido conductor. En algunas realizaciones, el poro proporciona la única comunicación líquida entre el primero y el segundo medio líquido conductor. El medio líquido comprende típicamente electrolitos o iones que pueden fluir desde el primer medio líquido conductor hasta el segundo medio líquido conductor a través del interior del nanoporo. Los líquidos que se utilizan en los procedimientos que se describen en el presente documento se conocen bien en la técnica. Las descripciones y los ejemplos de tales medios, que incluyen medio líquido conductor, se proporcionan en la Patente de EE.UU. N°. 7,189,503, por ejemplo. El primero y el segundo medio líquido pueden ser los mismos o diferentes, y cualquiera de los dos o ambos pueden comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón. De hecho, cualquier medio líquido descrito en el presente documento puede comprender uno o más de una sal, un detergente o un tampón, Adicionalmente, cualquier medio líquido descrito en el presente documento puede comprender una sustancia que altere la viscosidad o una sustancia que altere la velocidad.

[0066]El polímero analito que sirve como la diana o el foco de un análisis es capaz de interactuar con el nanoporo y translocarse, preferiblemente de una manera lineal, a través del poro hacia el otro lado. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «interactuar» o «que interactúa», indican que el analito se mueve en como mínimo una parte interna del nanoporo y, opcionalmente, se mueve a través del nanoporo. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «a través del nanoporo» o «translocar» se utilizan para expresar que como mínimo una parte del analito de polímero entra por un lado del nanoporo y se mueve y sale por el otro lado del nanoporo. En algunos casos, al primero y al segundo medios líquidos conductores que se ubican en cualquiera de los dos lados del nanoporo se les hace referencia como que se encuentran en las regionescisytrans,donde el polímero analito que se mide se transloca generalmente desde la regióncishasta la regióntransa través del nanoporo. Sin embargo, en algunas realizaciones, el polímero analito que se mide, puede translocarse desde la regióntranshasta la regióncisa través del nanoporo. En algunos casos, la longitud entera del polímero no pasa a través del poro, pero las partes o segmentos del polímero pasan a través del nanoporo para el análisis.

[0067]El polímero analito puede translocarse a través del nanoporo utilizando una variedad de mecanismos. Por ejemplo, el polímero analito y/o secuencia de referencia pueden translocarse de manera electroforética a través del nanoporo. Los sistemas de nanoporos incorporan también elementos estructurales para aplicar un campo eléctrico a través de la membrana o película que contiene el nanoporo. Por ejemplo, el sistema puede incluir un par de electrodos impulsores que impulsan la corriente a través de los nanoporos. Adicionalmente, el sistema puede incluir uno o más electrodos de medición que miden la corriente a través del nanoporo. Estos pueden ser, por ejemplo, un amplificador de tipo “patch-clamp” o un dispositivo de adquisición de datos. Por ejemplo, los sistemas de nanoporos pueden incluir amplificador “patch-clamp” Axopatch-1B (Axon Instruments, Union City, CA) para aplicar el voltaje a lo largo de la bicapa y medir la corriente iónica que fluye a través del nanoporo. El campo eléctrico es suficiente para translocar un analito de polímero a través del nanoporo. Tal como se entenderá, el intervalo de voltaje que se puede utilizar puede depender del tipo del sistema de nanoporos que se utiliza. Por ejemplo, el campo eléctrico aplicado puede oscilar entre aproximadamente 20 mV y aproximadamente 260 mV, para nanoporos basados en proteínas integrados en las membranas lipídicas. El campo eléctrico aplicado puede oscilar entre aproximadamente 40 mV y aproximadamente 200 mV. El campo eléctrico aplicado puede oscilar entre aproximadamente 100 mV y aproximadamente 200 mV. El campo eléctrico puede ser de aproximadamente 180 mV. Cuando se utilizan los nanoporos en estado sólido, el campo eléctrico aplicado puede estar en un intervalo similar al descrito, hasta un máximo de 1 V.

[0068]Adicional o alternativamente, los sistemas de nanoporos pueden incluir un componente que transloca un polímero a través del nanoporo de manera enzimática. Por ejemplo, puede incluirse un motor molecular para influir en la translocación de polímeros a través del nanoporo. Un motor molecular puede ser útil para facilitar la entrada de un polímero en el nanoporo y/o facilitar o modular la translocación del polímero a través del nanoporo. De manera ideal, la velocidad de translocación o una velocidad de translocación promedio es inferior a la velocidad de translocación que tendría lugar sin el motor molecular. En cualquiera de las reivindicaciones del presente documento, el motor molecular puede ser una enzima, tal como una polimerasa, una exonucleasa o un fragmento de Klenow. En un ejemplo, descrito con más detalle a continuación, una ADN polimerasa, tal como phi29, se puede utilizar para facilitar el movimiento en ambas direcciones. Véanse Cherf, G.M., et al., «Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-Á precision», Nat. Biotechnol. 30:344-348 (2012), y Manrao et al., «Reading DNA at singlenucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase», Nat. Biotechnol. 30:349-353 (2012).

[0069]Tal como se describe anteriormente, el «dominio de analito» es la parte del analito de polímero que se caracteriza de algún modo mediante el análisis de nanoporos. Típicamente, el dominio de analito es la parte del analito de polímero que no forma parte del dominio terminal. Sin embargo, se pueden determinar las características del dominio terminal (si comprende las subunidades de polímero), además de determinar las características del dominio de analito. Las características de un dominio de analito, o subunidades del mismo, pueden determinarse en un sistema de nanoporos basado en efectos medibles de su residencia en el nanoporo. La mera presencia del dominio de analito, es decir, la presencia de una o más subunidades de polímero, que excluyen el dominio terminal, se puede confirmar durante el análisis. Se puede determinar la información adicional sobre la una o más subunidades de polímero en el dominio de analito. La presencia de una característica identificable, tal como una «huella dactilar» o secuencia primaria de subunidad, se puede identificar en el dominio de analito. La identidad de secuencia se puede determinar para una, dos o más subunidades del polímero en el dominio del analito. Se puede determinar la secuencia del dominio de analito.

[0070]Las características del dominio de analito o la subunidad o subunidades del mismo se pueden determinar basándose en el efecto del dominio de analito o la subunidad o subunidades del mismo, en una señal medible, cuando interactúa con el nanoporo, tal como las interacciones con el borde exterior, el vestíbulo o la zona de constricción del nanoporo. Con fines de ilustración, la subunidad o subunidades del polímero que determinan o tienen influencia sobre una señal medible pueden ser la subunidad o subunidades que residen en la «zona de constricción», es decir, la región tridimensional en el interior del poro con el diámetro más estrecho. Dependiendo de la longitud de la zona de constricción, el número de subunidades de polímero que tienen influencia sobre el pasaje de electrolitos, y, por consiguiente, sobre la señal de salida de corriente, puede variar. La señal de salida generada por el sistema de nanoporos es cualquier señal medible que proporcione una multitud de señales diferentes y reproducibles dependiendo de las características físicas del polímero o la subunidad o subunidades del polímero. Por ejemplo, el nivel de corriente iónica a través del poro es una señal de salida que puede variar dependiendo de la subunidad o subunidades del polímero particulares que residen en la zona de constricción del nanoporo. Dado que el polímero se transloca en etapas iterativas (por ejemplo, de manera lineal, subunidad tras subunidad a través del poro), los niveles de corriente pueden variar para crear un rastro, o un «patrón de corriente», de múltiples señales de salida que corresponden a la secuencia continua de las subunidades de polímero. Esta detección de los niveles de corriente, o eventos de «bloqueo», se ha utilizado para caracterizar una multitud de información sobre los polímeros de estructuras, tales como ADN, que pasan a través, o se mantienen en, un nanoporo en diferentes contextos.

[0071]De manera general, un «bloqueo» se demuestra por un cambio en una corriente iónica que es claramente distinguible de fluctuaciones de ruido y normalmente se asocia a la presencia de una molécula de analito, por ejemplo, una o más subunidades de polímero, en el nanoporo, tal como en la zona de constricción. La fuerza del bloqueo, o cambio en la corriente, dependerá de la característica de la subunidad o subunidades de polímero presentes. Por consiguiente, se puede definir un «bloqueo» contra un nivel de corriente de referencia. El nivel de corriente de referencia puede corresponder al nivel de corriente cuando el nanoporo está no bloqueado (es decir, no tiene ninguna estructura de analito presente en, o interactuando con, el nanoporo). El nivel de corriente de referencia puede corresponder al nivel de la corriente cuando el nanoporo contiene un analito conocido (por ejemplo, una subunidad de polímero analito conocido) que reside en el nanoporo. El nivel de corriente puede volver de manera espontánea al nivel de referencia (si el nanoporo vuelve a un estado vacío o resulta ocupado de nuevo por el analito conocido). El nivel de corriente puede seguir hasta un nivel que refleja el siguiente evento de translocación iterativo del dominio de analito de polímero a través del nanoporo, y la subunidad o subunidades particulares que residen en el nanoporo cambian. Con fines de ilustración, en lo que se refiere al nivel de corriente de referencia definido como un nivel no bloqueado, el bloqueo se estable cuando la corriente es inferior al nivel de corriente de referencia en una cantidad de aproximadamente 1-100 % del nivel de corriente de referencia. Se entenderá que el nivel de corriente de referencia puede preceder de manera inmediata el evento de bloqueo o de manera alternativa puede estar separado del evento de bloqueo por un periodo de tiempo con mediciones de corriente intermedias. Por ejemplo, la corriente iónica puede ser inferior al nivel de corriente de referencia en una cantidad umbral de aproximadamente, como mínimo aproximadamente o como máximo aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % o cualquier intervalo derivable entre los mismos, del nivel de corriente de referencia, cuando una subunidad de dominio de analito de polímero entra al nanoporo. En lo que se refiere al nivel de corriente de referencia definido por la presencia de un analito conocido (por ejemplo, subunidad o subunidades de polímero conocido), el bloque se establece, cuando la corriente es inferior o superior al nivel de referencia en una cantidad de aproximadamente 1-100 % del nivel de corriente de referencia. Se entenderá que el nivel de corriente de referencia puede preceder de inmediato al evento de bloqueo o de manera alternativa, puede estar separado del evento de bloqueo por un periodo de tiempo con mediciones de corriente intermedias. Por ejemplo, la corriente iónica puede ser inferior o superior al nivel de corriente de referencia en un umbral de aproximadamente, como mínimo aproximadamente o como máximo aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % o cualquier intervalo derivable entre los mismos, del nivel de corriente de referencia, cuando una subunidad de dominio de analito de polímero entra al nanoporo. Los «bloqueos profundos» pueden identificarse como intervalos donde la corriente iónica es inferior (o superior) en como mínimo el 50 % del nivel de referencia. Los intervalos donde la corriente cae en menos del 50 % del nivel de referencia pueden identificarse como «bloqueos parciales». El nivel de corriente en un bloqueo puede permanecer a un nivel reducido (o elevado) durante como mínimo aproximadamente 1,0 |js.

[0072]La señal medible obtenida del análisis de nanoporos del dominio de analito de polímero se puede comparar con una señal conocida o una señal obtenida de un analito conocido. El término «analito conocido» se utiliza con referencia a un analito para el cual se conoce el estatus con respecto a una característica particular, tal como secuencia de subunidad. La señal conocida se puede obtener del analito conocido bajo las mismas condiciones analíticas o similares. La comparación de las señales medibles, tales como patrones de corriente obtenidos a partir de un dominio de analito desconocido y un analito de polímero estándar de referencia, puede permitir la identificación de una «huella dactilar» identificable que distingue el dominio de analito de otros dominios de analito potenciales. La comparación de señales medibles, tales como patrones de corriente obtenidos a partir de un dominio de analito desconocido y un analito de polímero estándar de referencia, puede permitir la identificación de una o más subunidades de polímero en el dominio de analito. Se entenderá que los niveles de corriente de identidades de subunidades de polímero correspondiente en los dominios de polímero analito desconocidos y de referencia no tienen que coincidir. En cambio, las identidades pueden determinarse por sus niveles de corriente relativos entre niveles de corriente que corresponden a una selección finita de identidades de subunidades.

[0073]En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de aumento de la tasa de interacción entre un polímero y un nanoporo dispuestos entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor. El procedimiento comprende la aplicación de un campo eléctrico suficiente para translocar un polímero que tiene un dominio de analito y un dominio terminal desde el primer medio líquido conductor hasta el segundo medio líquido conductor a través del nanoporo. El procedimiento puede comprender también la medición de una corriente iónica para proporcionar un patrón de corriente, en donde una diferencia en la corriente iónica de un nivel umbral de corriente iónica en el patrón de corriente, tal como se describe anteriormente, indica una interacción entre el polímero y el nanoporo.

[0074]Diferentes elementos en relación con este aspecto de la divulgación, tales como analitos de polímero, el dominio terminal de polímero, el dominio de analito de polímero, el como mínimo (por ejemplo, «primer») resto cargado, nanoporos y sistemas de nanoporos, corrientes iónicas y patrones de corrientes, etc., se describen con más detalle anteriormente en lo que se refiere a otros aspectos de la divulgación. Sin embargo, las descripciones mencionadas anteriormente se aplican igualmente al presente aspecto de la divulgación.

[0075]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «interacción» hace referencia al contacto o asociación próxima de cualquier parte de un analito de polímero con el nanoporo. Un dominio terminal del analito de polímero puede interactuar con el nanoporo. Con la aplicación de un campo eléctrico, el analito de polímero en el primer medio líquido conductor finalmente interactuará con el nanoporo. Para analizar con éxito el analito de polímero, un dominio terminal del analito debe primero entrar en estrecha asociación con el borde externo del nanoporo (por ejemplo, tal como el ladocisdel nanoporo). El hecho de la interacción comprende que el dominio terminal de polímero entre en el espacio interior definido por el vestíbulo del nanoporo. Tal como se describe con más detalle a continuación, la adición de restos cargados (por ejemplo, grupos fosfato) al dominio terminal de un analito de polímero aumentó de manera sustancial la velocidad con la que el analito de polímero interactúa con el nanoporo, tal como se demuestra por los bloqueos de corriente medibles. La tasa de interacción aumentada, a su vez, facilita un análisis de polímeros mucho más eficiente. Esto es especialmente ventajoso para analitos de polímero muy largos o analitos con un número de copias bajo, que de otra manera podrían no tener un dominio terminal que probablemente interactuase con el nanoporo, ni siquiera con la aplicación de un campo eléctrico.

[0076] Por consiguiente, la aplicación de la presente divulgación proporciona una tasa de interacción potenciada o aumentada entre un analito de polímero y un nanoporo. La tasa de interacción entre el nanoporo y el polímero puede ser como mínimo el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 % o más, superior a la tasa de interacción entre el nanoporo y un polímero similar que carece del primer resto cargado en el dominio terminal. El polímero similar que carece del primera resto cargado en el dominio terminal puede ser del mismo tipo de polímero (por ejemplo, polipéptido, ADN, ARN, PNA, etc.). El polímero similar que carece del primer resto cargado en el dominio terminal puede tener una longitud que esté entre como mínimo el 80 % y 120 % de la longitud del analito de polímero. El polímero similar que carece del primer resto cargado en el dominio terminal puede tener una secuencia de subunidades que es como mínimo un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idéntica al analito de polímero.

[0077] En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de secuenciación de dos o más nucleótidos de un ácido nucleico que comprende: (a) proporcionar un ácido nucleico que comprende como mínimo dos nucleótidos desconocidos en un dominio de analito, comprendiendo el ácido nucleico adicionalmente un resto cargado positivamente o negativamente en un dominio terminal en el extremo 3' o 5' terminal (b) proporcionar una porina que se ubica entre un ladocis,que comprende un primer medio líquido conductor y el ácido nucleico modificado, y un ladotrans,que comprende un segundo medio líquido conductor; y (c) provocar que el ácido nucleico pase a través de un túnel de la porina, produciendo de este modo un primer y un segundo nivel de corriente iónica, secuenciando de esta manera dos o más nucleótidos del ácido nucleico.

[0078] En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de mejorar la tasa y la eficiencia de secuenciación de nanoporo de un analito, que comprende: (a) proporcionar un nanoporo que se ubica entre un ladocisque comprende un primer medio líquido conductor y un analito modificado con uno o más restos cargados positivamente o negativamente en un dominio terminal del extremo 3' o 5' terminal, y un ladotransque comprende un segundo medio líquido conductor, en el que el nanoporo comprende una abertura que proporciona la comunicación líquida entre el ladocisy el ladotrans;(b) provocar que el analito modificado entre en la abertura del nanoporo, produciendo de este modo un nivel de corriente iónica medible, en el que el nivel de corriente iónica representa una primera unidad conocida del analito; (c) avanzar el analito modificado hacía el ladotrans,produciendo de esta manera un segundo nivel de corriente iónica que representa una segunda unidad; y (e) calibrar el nanoporo con un analito modificado conocido que contiene todas las unidades y correspondientes niveles de corriente iónica de interés, y correlacionar de este modo cada nivel de corriente iónica con una unidad conocida de un analito. Se puede repetir este o cualquier otro procedimiento para secuenciar una tercera, cuarta o quinta unidad conocida en el analito modificado.

[0079] En otro aspecto, la presente divulgación da a conocer una composición de adaptador de polímero. El adaptador comprende un ácido polinucleico y un resto cargado unido a como mínimo uno de los nucleótidos en el ácido polinucleico.

[0080] En algunas realizaciones, el resto cargado se une de manera covalente a como mínimo uno de los nucleótidos en el ácido polinucleico.

[0081] En algunas realizaciones, el adaptador de ácido polinucleico tiene entre 1 y 20 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, las realizaciones incluyen un adaptador con un ácido polinucleico con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos.

[0082] En algunas realizaciones, el resto cargado en la composición adaptadora comprende como mínimo dos grupos fosfato, como mínimo dos grupos sulfato o como mínimo un grupo fosfato y un grupo sulfato. En algunas realizaciones, la composición adaptadora comprende cuatro grupos, en la que cada grupo se selecciona de manera independiente entre un fosfato o sulfato.

[0083] En algunas realizaciones, el grupo o grupos fosfato y/o el grupo o grupos sulfato se disponen en una configuración lineal. En algunas realizaciones, el grupo o grupos fosfato y/o el grupo o grupos sulfato se disponen en una configuración ramificada («duplicadora»), tal como se describe en el presente documento.

[0084] En algunas realizaciones, el resto cargado está unido a un nucleótido que se encentra a 3 posiciones de residuo de un nucleótido terminal (es decir, ya sea el nucleótido 5' o 3' terminal). En algunas realizaciones, el resto cargado está unido a un nucleótido terminal. En algunas realizaciones, el resto cargado está unido al nucleótido del extremo 3' terminal. En algunas realizaciones, el resto cargado está unido al nucleótido del extremo 5' terminal.

[0085] La composición adaptadora es útil como un reactivo que se puede añadir a los extremos de secuencias de analitos desconocidas para facilitar el análisis basado en nanoporos de las mismas. Por ejemplo, un adaptador que comprende una secuencia de oligonucleótidos corta y un resto cargado en el extremo 5' terminal se puede ligar con el extremo 5' terminal de un polímero de nucleótido de una secuencia desconocida. De manera específica, el extremo 3' terminal del adaptador (el extremo sin un resto cargado añadido) se liga con el extremo 5' terminal del polímero de nucleótido de una secuencia desconocida. En este ejemplo, el adaptador con el resto cargado sirve como el dominio terminal de la construcción de analito de nucleótido final, mientras que el polímero de nucleótido de una secuencia desconocida sirve como el dominio de analito de la construcción de analito de nucleótido final, de acuerdo con la descripción anterior.

[0086] La presente invención proporción un kit de análisis de polímeros basado en nanoporos tal como se define en las reivindicaciones. La presente divulgación proporciona un kit que comprende la composición adaptadora descrita anteriormente. En algunas realizaciones, el kit es útil en la secuenciación de polímeros basada en nanoporos. En algunas realizaciones, el kit comprende adicionalmente reactivos para facilitar la ligadura del adaptador al polímero para ser analizado (es decir, el dominio de analito). En algunas realizaciones, el kit comprende adicionalmente elementos del sistema de nanoporos, descrito anteriormente. Por ejemplo, el kit puede comprender adicionalmente elementos estructurales, tales como nanoporo, un recipiente de ensayo con múltiples cámaras en el que se pueden colocar el nanoporo entre los medios líquidos conductores, y un aparato para la aplicación y la medición de campos eléctricos.

[0087] El uso del término «o» en las reivindicaciones se utiliza para significar «y/o» a menos que se indique explícitamente lo contrario para hacer referencia a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la divulgación apoye una definición que se refiere a alternativas solamente e «y/o».

[0088] Siguiendo la ley de patentes largamente implementada, las palabras «un» y «una», cuando se utilizan junto con las palabras «que comprende» en las reivindicaciones o memoria descriptiva, indica uno o más, a menos que se indique de manera específica.

[0089] A menos que el contexto claramente indique lo contrario, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, las palabras «comprende», «que comprende» y similares deben interpretarse en un sentido inclusivo en oposición a un sentido exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de «que incluye, pero no se limita a». Las palabras que utilizan el número singular o plural también incluyen el número plural o singular, respectivamente. Adicionalmente, las palabras «en el presente documento», «anteriormente» y «a continuación» y las palabras con significado similar, cuando se utilizan en esta solicitud, harán referencia a esta solicitud en su conjunto y no a ninguna parte particular de la solicitud.

[0090] A continuación se encuentra una descripción de un enfoque de ejemplo para mejorar la tasa de interacción entre un analito de polímero y un nanoporo mediante la adición de una resto cargado en un dominio terminal.

[0091] Se generó la proteína M2-MspA a partir deMycobacterium smegmatistal como se describe previamente en Butler, T.Z., Pavlenok, M., Derrington, I.M., Niederweis, M. y Gundlach, J.H., «Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore», Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:20647-20652 (2008). De manera específica, la proteína M2-MspA contiene mutaciones de D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134<r>con referencia a la proteína MspA de tipo salvaje. Los oligonucleótidos de ADN se sintetizaron en la instalación de proteínas y ácido nucleico de Universidad de Stanford y se purificaron utilizando procedimientos de purificación en columna. Las plantillas de ADN, cebadores y oligómeros de bloqueo se mezclaron a concentraciones molares relativas de 1:1:1.2 y se acoplaron mediante la incubación a 95 °C durante 3 minutos, seguido de enfriamiento lento a una temperatura inferior a 30 °C. El ADN y phi29 DNAP se almacenaron a -20 °C hasta su uso inmediato.

[0092] Se establecieron poros de MspA individuales en una bicapa lipídica utilizando los procedimientos descritos previamente en Butler, T.Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:20647-20652 (2008). De manera resumida, se formaron las capas lipídicas de 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL) a lo largo de una apertura de Teflon con un diámetro de ~20 pm horizontal. Los compartimentos de ~60 pl en ambos lados de la bicapa contenían tampón experimental de 0,3 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT y 10 mM HEPES/KOH tamponado a pH 8,0 ± 0,05. Un Axopatch 200B que incorpora el amplificador de tipo “patch clamp” (Axon Instruments) aplicó un voltaje de 180 mV a lo largo de la bicapa (lado positivotrans)y midió la corriente iónica a través del poro. Se añadió M2-MspA al compartimentociscon toma de tierra, generando una concentración de ~2,5 ng/ml. Cuando se insertó un poro individual, el compartimento se descargó con el tampón experimental para eliminar inserciones adicionales.

[0093] Se prepararon los polímeros analitos de una manera para translocarse a través del nanoporo de MspA en asociación con el motor molecular phi29, tal como se describe en Manrao et al., «Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase», Nat. Biotechnol. 30:349-353 (2012). De forma resumida, los analitos de ADNss se prepararon con los dominios de secuencia en 3' que se acoplan a un oligo de bloqueo y un oligo de horquilla separado, tal como se muestra en la FIGURA 1A. En todos los experimentos, las cadenas de ADN de 80-91 nucleótidos (nt) (ejemplificados en la SEQ ID NO:1) que contenían la sección a leer (es decir, el «dominio de analito») se acoplaron a un cebador de «oligo de horquilla» complementario a los 2 nucleótidos en el extremo 3' terminal de la plantilla. La secuencia establecida en la SEQ ID NO:1 contiene un residuo «n» en la posición 14, que representa un X o un residuo abásico. La posición abásica se puede utilizar para confirmar el posicionamiento del analito en el nanoporo y para realizar la correspondencia con los niveles de corriente medidos a medida que el analito pasa a través del nanoporo. Sin embargo, se entenderá que esta característica no es necesaria en el polímero analito para que funcione la presente invención. El cebador de oligo de horquilla (ejemplificado en la SEQ ID NO: 3) tenía una secuencia en su extremo 5' terminal correspondiente para permitir su pliegue sobre sí mismo e impedir la acción del DNAP phi29 en el extremo de doble cadena de la construcción de analito de ADN. Adyacente al cebador de horquilla a medida que se acoplaba al dominio de analito, se acopló un oligómero de bloqueo. El oligómero de bloqueo (ejemplificado en la SEQ ID NO: 2) contenía una secuencia complementaria a un dominio interior de la cadena de analito y adyacente a la secuencia complementaria del oligo de horquilla. El oligo de bloqueo contenía también, en su extremo 3' terminal, un dominio «deshilacliado abásico» con siete residuos abásicos y un espaciador de tres carbonos. Las posiciones abásicas y los espaciadores de carbono se indican en las FIGURAS 1A y 1B con X y Z, respectivamente.

[0094]El oligo de bloqueo funciona para impedir la realización de la síntesis de ADN polimerasa phi29 («DNAP») en una solución en masa. La asociación del oligo de bloqueo con la cadena de analito de ADN limita la acción de phi29, de tal modo que solamente puede pasar el analito de ADN cuando la cadena de analito de ADN ha sido introducida en el poro deseado. Cuando el conjugado de ADN-DNAP phi29 se introduce en el poro, la fuerza del poro sobre el DNAP phi29 lo empuja en el oligo de bloqueo, abriendo eficazmente el oligo de bloqueo desde la cadena de analito en etapas de nucleótidos individuales. Esta apertura de cadena permite una lectura inicial de la cadena de ADN plantilla debido a que se introduce a través del poro a una tasa sostenible. Cuando el oligo de bloqueo se abre por completo y se desasocia de la cadena de analito, el extremo 3' terminal del oligo de horquilla se expone al sitio activo de la polimerasa phi29 y tiene lugar la síntesis de ADN. La cadena plantilla se saca del poro y se realiza una segunda lectura a medida que la cadena pasa a través del poro en la dirección opuesta. Véase, por ejemplo, Manrao et al., «Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase», Nature Biotechnology 30:349-353 (2012).

[0095]Los polímeros analito contenían un resto cargado que se añadió al extremo 5' terminal (o no, para el control). Los diferentes restos comprendían 1,2 o 4 grupos fosfato. Los restos con dos o más fosfatos incorporaron una o más conformaciones ramificadas o «duplicadoras», tal como se describe anteriormente. Se entenderá que una variedad de configuraciones de fosfato, con o sin duplicadores, se pueden incorporar en los oligos sintéticos. En los casos, donde los analitos desconocidos, tales como ADNs genómicos, tienen que analizarse, los oligos sintéticos con los fosfatos (es decir, dominios terminales) se pueden ligar con el analito desconocido.

[0096]Las construcciones de horquilla de ADN acopladas, tal como se muestran en la FIGURA 1B, se añadieron, a continuación, al volumencisexperimental para lograr una concentración final próxima a -1 pM. Tal como se ha descrito, se había insertado un poro de MspA individual en una bicapa lipídica que separa dos cámaras(cisytrans)que contenía una solución tampón de KCl 0,3 M. Se aplicó un amplificador de tipo “patch-clamp” a 180 mV al ladotransde la bicapa y se utilizó para medir la corriente iónica a través del poro. La corriente a través de un poro de MspA abierto fue lo = 110 ± 6 pA (media ± d.e., N = 25). Una vez se añadió el ADN de horquilla al sistema, se observaron las interacciones entre el analito de ADN y el poro, tal como se describe anteriormente en Butler, T.Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:20647-20652 (2008). Los estados intermedios se asociaron con la entrada de ADN al vestíbulo del nanoporo, mientras que los estados profundos (indicados por las caídas de niveles de corriente del 40 %, o las caídas hasta un nivel que era el 60 % de la corriente del poro desbloqueado, abierto) se asociaron con el ADN hilado a través del poro y translocado al otro lado. La adición del resto cargado, es decir, la fosforilación, dio como resultado un aumento significativo en las tasas de eventos de estado intermedio y, de manera más importante, tasas de eventos de estado profundo. La «tasa de eventos sin procesar», que incluye todos los casos de estados intermedios y profundos medidos, y la «tasa de eventos profunda» se muestran en la FIGURA 2 para las construcciones de analitos con diferentes restos cargados.

[0097]La FIGURA 3 muestra el efecto de perfusión sobre la tasa de interacción de analito-nanoporo. Durante la perfusión, el tampón de pocillocisse reemplazó haciendo fluir un tampón nuevo en el pocillociscon un jeringuilla, mientras se eliminaba el tampón del pocillociscon una segunda jeringuilla. Generalmente, el procedimiento de perfusión extrae la mayoría de los analitos sin restos cargados añadidos. Véase, por ejemplo, la FIGURA 3, columna izquierda. En cambio, los analitos con restos de fosfato se perfundieron menos fácilmente. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría particular, es posible que la carga negativa adicional sobre los analitos de<a>D<n>facilite la asociación con el nanoporo y/o la bicapa lipídica. Tal interacción podría permitir la agregación de los analitos cerca del poro, contribuyendo de esta manera a las tasas de interacción aumentadas de analito-nanoporo.

[0098]En conclusión, estos datos demuestran que la adición de un resto cargado en el extremo de un analito de polímero de ADN potencia significativamente la tasa de interacción entre el analito de ADN y el nanoporo. La tasa de interacción aumentada tiene correlación también con una tasa de translocación aumentada de manera significativa, lo que puede llevar a condiciones de análisis mejoradas significativamente, tales como un mayor rendimiento de secuenciación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Kit para el análisis de polinucleótidos basado en nanoporos, que comprende:

(a) un adaptador de ácido polinucleico de hasta 20 nucleótidos de longitud con un resto cargado unido a un extremo terminal del adaptador de ácido polinucleico, en el que el resto cargado comprende uno de: como mínimo dos fosfatos dispuestos en una configuración lineal o ramificada y un sulfato;

(b) reactivos para la ligación del adaptador de ácido polinucleico a un dominio de analito de polímero de un polinucleótido y

(c) un sistema de nanoporos, en el que el sistema de nanoporos comprende un nanoporo, un recipiente de ensayo con múltiples cámaras, un aparato para aplicar y medir campos eléctricos, un motor molecular que transloca un polinucleótido a través del nanoporo de manera enzimática, o cualquier combinación de los mismos;

en el que la ligación del adaptador de ácido polinucleico al dominio de analito de polímero aumenta la carga negativa neta en la localización de la unión en comparación con la densidad de carga promedio de nucleótidos en el resto del polímero.

2. Kit, según la reivindicación 1, en el que el resto cargado comprende como mínimo dos sulfatos.

3. Kit, según la reivindicación 1, en el que el resto cargado comprende como mínimo un fosfato y como mínimo un sulfato.

4. Kit, según una de las reivindicaciones 1-3, en el que los fosfatos y/o el sulfato o sulfatos están dispuestos en una configuración lineal o ramificada.

5. Kit, según la reivindicación 4, en el que los grupos fosfato y/o sulfato se disponen en una configuración ramificada con dos o más grupos cargados en cada rama.

6. Kit, según una de las reivindicaciones 1-5, en el que el resto cargado está unido a un nucleótido del extremo 5' terminal del adaptador de ácido polinucleico.

7. Kit, según una de las reivindicaciones 1-6, en el que el resto cargado está unido a un nucleótido del extremo 3' terminal del adaptador de ácido polinucleico.

8. Kit, según una de las reivindicaciones 1-7, en el que el adaptador de ácido polinucleico está configurado para estar ligado a un extremo terminal de un analito de polímero de ácido nucleico.

9. Kit, según una de las reivindicaciones 1-8, en el que el sistema de nanoporos comprende un nanoporo, un recipiente de ensayo con múltiples cámaras, en el que se puede colocar el nanoporo entre los medios conductores líquidos, y un aparato para aplicar y medir campos eléctricos.

10. Kit, según una de las reivindicaciones 1-9, en el que el sistema de nanoporos comprende un motor molecular, en el que el motor molecular es una enzima seleccionada entre una polimerasa una exonucleasa y un fragmento de Klenow.

11. Kit, según una de las reivindicaciones 1-10, en el que el nanoporo es un nanoporo en estado sólido, un nanoporo de proteína, un nanoporo híbrido en estado sólido/de proteína, un nanoporo en estado sólido adaptado biológicamente, o un nanoporo en origami de ADN.

12. Kit, según la reivindicación 11, en el que el nanoporo de proteína es alfa-hemolisina o porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), o un homólogo de las mismas.

13. Kit, según la reivindicación 12, en el que el nanoporo de proteína es porina A deMycobacterium smegmatis(MspA), o un homólogo de la misma.

14. Kit, según una de las reivindicaciones 1-13, en el que la secuencia del nanoporo de proteína está modificada para contener como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido.

15. Kit, según la reivindicación 14, en el que la como mínimo una sustitución, supresión o adición de aminoácido da lugar a un cambio de carga neta en el nanoporo.