ES2966726T3 - Uso de fragmentos de cfADN como biomarcadores en pacientes después de trasplante de órgano - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona métodos relacionados con la detección de ADN libre de células de un donante en la circulación de un receptor de trasplante de órganos para la identificación temprana del rechazo del trasplante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de fragmentos de cfADN como biomarcadores en pacientes después de trasplante de órgano
La presente invención proporciona métodos para controlar el estado del rechazo de órganos trasplantados o de la eficacia del tratamiento inmunosupresor en un sujeto, relacionados con la detección de ADN libre de células del donante en la circulación de un receptor de trasplante de órganos para la identificación temprana del rechazo del trasplante.
Antecedentes de la invención
Cada año, 100.000 pacientes se someten a un trasplante de órganos en todo el mundo como único tratamiento definitivo para la insuficiencia orgánica terminal.
Independientemente del órgano trasplantado, el rechazo del injerto es un problema sin cerrar importante para estos pacientes, que se produce cuando el injerto es reconocido como extraño, atacado y rechazado por el sistema inmunológico del receptor, lo que provoca daño celular y fallo del injerto. Los cuidados postoperatorios consisten en una dolorosa vigilancia que dura toda la vida, con frecuentes biopsias de órganos, necesarias para garantizar una supervivencia que actualmente se espera que sea de 15 años.
Actualmente, los principales métodos de seguimiento del rechazo de órganos tras el trasplante son dos:
a) biopsia de tejido, que es un procedimiento invasivo mediante el cual se toman células de tejido directamente del órgano trasplantado. Este procedimiento conlleva varios aspectos críticos: riesgo para los pacientes, incómodo para ser realizado por los médicos, costoso, factible con sedación o anestesia en un entorno hospitalario, las muestras podrían tomarse de tejido de injerto no afectado porque el proceso de rechazo suele ser focal y el número de muestras tomadas por procedimiento es limitado (de 5 a 8), con al menos una muestra no informativa porque se puede tomar una muestra que no esté incluida en el área rechazada (inutilizable).
b) biomarcadores, cuya eficacia varía según los diferentes órganos y depende de las características del paciente. Por ejemplo, aproximadamente el 50 % de la función del riñón trasplantado puede perderse antes de un aumento mensurable de la creatinina sérica (biomarcador renal), según el sexo, la masa muscular o el origen étnico. Las pruebas convencionales de función hepática no evalúan específicamente el rechazo agudo celular (ACR).
Un caso particular es el ejemplo del corazón donde aproximadamente 7.000 de los trasplantes por año son trasplantes de corazón (Observatorio Mundial de Donación y Trasplantes de la OMS).
La biopsia endomiocárdica (EMB) sigue siendo el estándar de excelencia para la vigilancia del rechazo agudo después de Htx, pero esta técnica detalla muchas características negativas y críticas. Por lo tanto, en el trasplante de órganos sólidos, las intervenciones terapéuticas pueden verse retrasadas por un diagnóstico tardío. El rechazo alogénico se diagnostica y clasifica mediante el estudio histológico de la biopsia del aloinjerto (1). El rechazo agudo de aloinjertos cardíacos sigue siendo común durante el primer año posterior al trasplante, con una incidencia superior al 40 %, y representa una de las principales causas de mortalidad durante este período, responsable de aproximadamente el 12 % de las muertes (1). Además, un episodio de rechazo que ocurre durante el primer año, incluso cuando aparentemente se trata con éxito, confiere una mayor mortalidad a los dos y cuatro años en aquellos que sobreviven más allá del primer año, y genera factores de riesgo independientes para la vasculopatía del aloinjerto (1).
Los mecanismos de rechazo agudo en receptores pediátricos de Htx son similares a los que ocurren en adultos. Si bien los bebés y los niños pequeños tienen tasas de rechazo agudo más bajas, los adolescentes tienen las tasas de rechazo agudo más altas, con muchos episodios � de Grado 2R (clasificación ISHTL 2010, rechazo agudo celular moderado) asintomáticos y detectados solo mediante vigilancia EMB (2).
La EMB es una técnica invasiva y sufre de variabilidad entre observadores, alto costo, posibles complicaciones y una importante incomodidad para el paciente (3). El análisis histológico del tejido miocárdico del ventrículo derecho obtenido con EMB sigue siendo la técnica de "estándar de excelencia" para la vigilancia del rechazo agudo; durante el primer año postoperatorio los pacientes se someten a biopsias frecuentes. No existe consenso sobre la frecuencia óptima de vigilancia con EMB, y los cronogramas de EMB varían entre los centros de Htx. La frecuencia de la EMB es mayor en los primeros 3 meses posoperatorios y luego disminuye. El primer año después del Htx, el paciente se somete a unas 20 EMB. Este cronograma se basa en la observación de que el riesgo de rechazo del aloinjerto es mayor en los primeros 6 meses y disminuye marcadamente después de 12 meses. La utilidad de la EMB de vigilancia en todos los pacientes después de 1 año después del trasplante es objeto de debate. Si el paciente manifiesta un cuadro clínico compatible con el rechazo del aloinjerto, entonces es apropiado realizar EMB, ya que los resultados pueden dictar cambios en el tratamiento (4). Existen datos contradictorios sobre el rendimiento diagnóstico y la necesidad de vigilancia de la EMB en receptores pediátricos. En centros individuales, las tasas de rechazo agudo en la EMB de vigilancia oscilan entre el 0,3 % y el 1,4 % en el primer año después del trasplante y entre el 0 % y el 10 % posteriormente. Debido a las tasas muy bajas de rechazo en la EMB de vigilancia más allá de 5 años, existe un consenso cada vez mayor de que la EMB más allá de 5 años tiene poca utilidad en pacientes asintomáticos. Dado el mayor riesgo de complicaciones en los receptores pediátricos, muchos centros minimizan el número de EMB de vigilancia en niños muy pequeños y las evitan por completo en los lactantes, mientras que en unos pocos centros pediátricos no se realizan EMB de vigilancia de rutina en preadolescentes. Además, debido al error de muestreo relacionado con la naturaleza irregular del rechazo agudo, la variabilidad en la interpretación de los hallazgos histológicos y la detección no rutinaria del rechazo mediado por anticuerpos, el rechazo agudo "biopsia negativa" (características hemodinámicas que sugieren un rechazo agudo significativo, pero aparentemente EMB normal) se informa que ocurre hasta en el 20 % de los pacientes. Existe una variabilidad sustancial entre observadores en la clasificación de las biopsias cardíacas y el rechazo agudo puede pasar desapercibido cuando se toman pequeñas muestras de tejido miocárdico, debido a la distribución no homogénea de los infiltrados inflamatorios y el daño del injerto.
Además, la EMB es invasiva, con una tasa de complicaciones asociadas de alrededor de 0,5 % (lo que incluye perforación de miocardio, taponamiento pericárdico, arritmia, complicaciones en el sitio de acceso e insuficiencia tricuspídea significativa) (5), es costosa y no es del agrado de los pacientes, factores que previenen procedimientos más frecuentes y, por lo tanto, limitan la titulación óptima del tratamiento inmunosupresor.
En niños, generalmente se requiere sedación profunda o anestesia general para lograr un acceso vascular seguro y realizar la EMB. El procedimiento es particularmente desafiante en bebés muy pequeños. El riesgo general de complicaciones graves con la EMB en niños es del 0,6 % (6).
En síntesis, el procedimiento estándar de excelencia tiene la ventaja de que es posible realizar el diagnóstico tanto del rechazo agudo como de las infecciones.
Sin embargo, dicho procedimiento es muy invasivo con un riesgo asociado para el paciente, tiene una variabilidad entre observadores, necesita hospitalización y un personal altamente especializado y depende del estado de salud de los pacientes.
Debido a las características anteriores, el estándar de excelencia (EMB) no alcanza un cribado y una vigilancia de trasplantes eficientes: no es adecuado para niños y para pacientes con condiciones físicas críticas, aumento del problema de saturación hospitalaria, procedimientos complejos y que requieren mucho tiempo, e implica varios riesgos para el paciente.
Se requiere la capacidad de medir de forma rápida y fiable la integridad del injerto para ajustar eficazmente el tratamiento en pacientes individuales (es decir, proporcionar inmunosupresión personalizada) y mejorar así la supervivencia del injerto a largo plazo. El hecho de que los trasplantes de órganos también sean trasplantes de genoma abre la posibilidad de monitorear la lesión y la integridad del aloinjerto mediante la cuantificación del ADN circulante libre de células (cfADN) derivado del injerto. En 2014, De Vlaminick et al. (7) realizó un estudio de cohorte prospectivo (65 pacientes, 565 muestras) destinado a establecer la eficacia potencial del cfADN como biomarcador en Htx. Utilizaron la técnica de Secuenciación de Nueva Generación (NGS), secuenciando todo el genoma, con una considerable ralentización del tiempo de proceso y posterior análisis bioinformático.
En dicho método se caracterizó el genoma de los donantes y receptores de trasplantes mediante genotipado de SNP, en promedio 53.423 marcadores de SNP, y las posiciones de SNP con alelos de base única que eran distintos entre el donante y el receptor y homocigotos dentro de cada individuo, permitieron discriminación de secuencias derivadas de donante y receptor.
Concluyeron que el método era muy específico (93 %), pero los costos debido al elevado número de marcadores SNP utilizados y las dificultades de implementación eran obstáculos concretos para traducir estos hallazgos en la práctica clínica.
En el documento deSnyder et al.en 2011 (8) se divulga un informe en donde se ha analizado el cfADN que circula en la sangre de receptores de trasplantes de corazón y en donde se han observado niveles aumentados de cfADN del genoma del donante en pacientes después del rechazo de un trasplante de órgano sólido, mediante el uso de una secuenciación de escopeta para medir las diferencias de SNP entre individuos para cuantificar la señal del ADN del donante. Los autores informaron la presencia de cfADN del donante al inicio del estudio (día 0 del trasplante de corazón) entre el 0 y el 1 % y que la cantidad de cfADN del donante aumenta con el rechazo hasta al menos el 3-6 % en el trasplante de corazón.
El método divulgado en el documento se basa en la secuenciación del ADN del donante y del receptor y en el análisis del SNP informativo, sin una selección de una lista específica de SNP que puedan usarse en un método de seguimiento del estado de un órgano trasplantado en un sujeto y aplicable a todas las muestras analizadas.
Por su parte,Ollerich et al.(9) no encontró elevación del cfADN en 5 pacientes con colestasis intrahepática o inducida por fármacos, o después de colangiopatía por trasplante de hígado que no presentaban signos clínicos de rechazo. Esto contrastaba con los marcadores convencionales como AST y [gamma]-GT, que estaban muy elevados en estas condiciones de no rechazo.
En tanto,Sigdel et al.en 2013 (10) utilizaron un método de secuenciación basado en ChrY mediante el uso de orina de receptores de trasplante de riñón. El método no era adecuado para uso rutinario debido a la necesidad de tener pares de donante/receptor de género específico (de masculino a femenino).
EnBeck et al.en 2013 (11) y en WO2014/194113 utilizaron un método de PCR digital en gotas (ddPCR) como técnica candidata para la determinación de porcentajes de cfADN y la discriminación entre donante y receptor. En particular, la PCR de gotas digitales permite una cuantificación rápida del cfADN del donante en la circulación de los receptores de trasplantes como un posible biomarcador universal de lesión del injerto, mediante la selección de no menos de 30 a 35 SNP conocidos para frecuencias alélicas menores altas. La precisión de la ddPCR fue muy prometedora, pero los costos y el tiempo de preparación son muy limitantes.
Además, se ha observado que dicho método tiene el límite de ser dependiente de la tecnología de la PCR digital en gotas, y es difícil de reproducir si se comparan los datos de diferentes laboratorios. Finalmente, el método es aplicable en caso de presencia de una línea de base con la que comparar detecciones posteriores y calcular una tendencia de variación en la proporción de cfADN donante/receptor.
En tanto,Groskovic et al.en 2016 (12) y WO2015/138997 desarrollaron un ensayo que cuantifica indirectamente la fracción de cfADN en pares donante-receptor no relacionados y relacionados, con un tiempo de prueba de 3 días, mediante el uso de NGS y un panel de un máximo de 266 SNP diferentes.
Dichos documentos divulgan un método para monitorear el estado de un aloinjerto en un receptor de trasplante y para ajustar los tratamientos inmunosupresores que se administran a los receptores de trasplante, en base al análisis de diferentes paneles de SNP para cada paciente analizado, que comprende un mínimo de alrededor de 195 hasta un máximo de alrededor de 266 SNP diferentes.
En otras palabras, se supone que la señal mayoritaria de la muestra de ADN libre de células es ADN procedente del receptor y que la señal minoritaria es ADN procedente del donante, y esta información se puede utilizar para calcular los niveles de ADN derivado del donante en la muestra de ADN libre de células.
Además, el cálculo del porcentaje del ADN libre de células derivado del donante con respecto al ADN libre de células del receptor en WO2015/138997, se determina en base a la varianza en la distribución alélica de SNP, al comparar dicha distribución de alelos a los patrones de distribución homocigotos o heterocigotos esperados que pueden verse afectados por errores de secuenciación o artefactos de PCR, lo que resulta en una baja precisión del resultado final. En,Gordon et al.en 2016 (13) desarrolló un ensayo de 124 SNP para aplicación de NGS.
Estos dos últimos métodos aplican un algoritmo de análisis basado en la comparación entre la probabilidad a priori de presencia del alelo variante en el panel de SNP y la probabilidad a posteriori calculada después de NGS, para inferir la presencia de ADN del donante. Sin embargo, dichos métodos son costosos, requieren un largo tiempo de preparación, secuenciación y análisis y necesitan conocer el genotipo del donante, que muchas veces no es accesible, o están sujetos al cálculo de umbrales de significancia para la inferencia de la presencia de rechazo, debido a la hipótesis de partida sobre la presencia o ausencia de cfADN del donante.
Finalmente, los métodos son aplicables solo en caso de presencia de una línea de base con la que comparar detecciones posteriores.
Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento menos invasivo, menos arriesgado, más preciso y siempre aplicable para el seguimiento del paciente sometido a trasplante, y de un método más fiable, estandarizado y económico.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra todo el procedimiento de prueba, desde la toma de muestra de sangre hasta el cálculo y el algoritmo de la fracción del donante.
La figura 2 son instrucciones legibles por computadora: desde datos sin procesar hasta DF%.
La figura 3 muestra los resultados de la simulación de una mezcla de diferentes fracciones de cfADN en 2 individuos diferentes (donante simulado y receptor simulado).
Eje X: % de cfADN del donante insertado en la mezcla simulada (mezcla FD simulada). Eje Y: % de cfADN del donante simulado medido con nuestro método (FD medido).
La figura 4 muestra los resultados de la simulación in vitro de 6 mezclas de cfADN de 2 sujetos (imitando al receptor y al donante), en porcentaje conocido de cfADN del donante en el receptor.
Eje X: % de cfADN del donante insertado en la mezcla in vitro (% esperado).
Eje Y: % de cfADN del donante medido con nuestro método.
La figura 5 muestra la curva ROC derivada del análisis ROC (característica operativa del receptor) que representa la evaluación de la precisión del modelo de aprendizaje automático después del entrenamiento con un conjunto de datos simulado y probado con un conjunto de pruebas de validación cruzada aleatoria (validación de 20 veces). Eje X: Tasa de falsos positivos (1-Sensibilidad). Eje Y: Tasa de verdaderos positivos (Sensibilidad).
La figura 6 muestra los resultados de las pruebas en 6 muestras reales de 3 pacientes que se sometieron a Htx. T1 fue 2 semanas después del Htx, T2 después de 3 semanas. Las etiquetas representan la clasificación EMB de acuerdo con las pautas de ISHLT. El % representa la fracción del donante calculada mediante el uso de nuestra prueba. DF%= % de la fracción del donante cfADN calculado mediante el uso de nuestra prueba.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica utilizada en la presente tienen el significado comúnmente entendido por las personas del oficio de nivel medio a las que se refiere esta divulgación. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia; por lo tanto, la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse como una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica. El término "ADN circulante libre de células" en la presente se refiere a los fragmentos de ADN/ADN libre de 25 nucleótidos de mayor longitud que no están asociados con células intactas, liberados en el torrente sanguíneo después de la apoptosis de las células.
Un "polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)" en el contexto de esta invención se refiere a la presencia de una base alternativa en posiciones específicas de la secuencia de ADN, elegida para caracterizar el genotipo de ADN de un individuo con respecto a otro. Un SNP de este tipo es un marcador genético del material donado.
El término "variante" en la presente se refiere a la presencia de una base de ADN alternativa en una posición particular de la secuencia de ADN, en referencia a la secuencia de referencia universalmente reconocida (GRCH37). El término "frecuencia alélica" en la presente se refiere a la frecuencia relativa (porcentaje) de una base alternativa en una posición particular del ADN, en referencia a la secuencia de referencia universalmente reconocida (GRCH37), calculada sobre la cantidad total de secuencias en esa posición.
Los términos "aproximadamente" y "alrededor de" en la presente se refieren al rango del error experimental que puede ocurrir en una medición.
Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluyen, pero no se limitan a") y deben considerarse que proporcionan soporte también para términos como "consiste esencialmente en", "que consiste esencialmente en", "consiste en" o "que consiste en".
Los términos "consiste esencialmente en", "que consiste esencialmente en" deben interpretarse como términos semicerrados, lo que significa que no se incluyen otros ingredientes que afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la invención (por lo tanto, se pueden incluir excipientes opcionales).
Los términos "consiste en", "que consiste en" deben interpretarse como términos cerrados.
Descripción de la invención
Se ha descubierto sorprendentemente que al secuenciar un panel de 94 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) a partir de ADN libre de células de una muestra obtenida por un sujeto que es receptor de un trasplante de órgano, es posible diferenciar entre ADN libre de células derivado del donante y ADN libre de células derivado del receptor y, por lo tanto, correlacionar el daño del injerto con la cantidad de ADN libre de células del injerto liberado de las células dañadas en los pacientes.
En particular, se ha demostrado que la selección de un número predeterminado de SNP, en particular de un panel de 94 SNP, reduce la posibilidad de obtener falsos positivos durante la fase de secuenciación, que podría ser muy alta al analizar cfADN, que suele estar muy fragmentado.
Esto se basa en el hecho de que, durante el rechazo agudo, el sistema inmunológico del receptor reconoce el órgano trasplantado como extraño, ataca el órgano y causa daño celular, lo que resulta en la dispersión del ADN nuclear de las células del órgano donante en el torrente sanguíneo del receptor.
Este ADN, llamado "ADN circulante libre de células" (cfADN) del donante, es distintivo del donante y puede reconocerse del ADN del receptor, fisiológicamente presente en pequeña cantidad en el torrente sanguíneo del receptor, debido a la necrosis normal de células como las endoteliales.
Cuanto mayor es la cantidad de cfADN del donante en la sangre del receptor, mayor es el daño del injerto causado por el sistema inmunológico del receptor, por lo que al calcular la cantidad de dicho cfADN es posible correlacionar el daño del injerto con el nivel de ADN del injerto liberado de las células dañadas en el paciente.
En particular, nuestro método se basa en una simple observación biológica relacionada con el rechazo agudo y crónico: la respuesta inmune al aloinjerto que daña las células del injerto, que liberan residuos celulares en el torrente sanguíneo. Estos residuos celulares incluyen ADN libre de células altamente fragmentado pero detectable en plasma. Este daño induce un quimerismo identificable y cuantificable en la sangre del receptor. La suposición es que, durante el rechazo agudo, la mayor cantidad de moléculas derivadas del donante (y por lo tanto derivadas del órgano implantado) están presentes en el torrente sanguíneo del receptor y se incrementa con el aumento de la extensión del daño al órgano.
Nuestro objetivo es interrogar directamente el estado del injerto, al individualizar y medir la huella digital del ADN de células alogénicas moribundas en el ADN libre de células que circula en el plasma del receptor. Si se caracteriza la huella digital del ADN del órgano donado (en comparación con el genoma del receptor), entonces se puede monitorear la presencia y el nivel de "cfADN del donante" a lo largo del tiempo. Los cambios en el estado de los órganos se pueden detectar como cambios en los niveles de cfADN del donante. La justificación de este enfoque surge de la observación de que tanto los procesos de rechazo agudo como los crónicos están asociados con la apoptosis de tipos de células específicas de órganos dentro del aloinjerto. Se ha informado de un aumento del ADN del injerto del 1 % al 5 % durante los episodios de rechazo en la circulación de receptores de trasplantes de corazón estables, mientras que un aumento del ADN del injerto > 5 % es indicativo de un comienzo de rechazo.
De los experimentos realizados en nuestro laboratorio observamos que al secuenciar un número elevado de SNP, como diferentes paneles de 138 a 155 SNP (véase la tabla 1), tuvimos un número elevado de falsos positivos y obtuvimos un método con una precisión menor y muy laboriosa.
En base a dichos resultados identificamos un método con un panel de 94 SNP previamente identificados que era capaz de diferenciar entre dos individuos no relacionados.
En particular, el sistema de nuestro método está compuesto por un panel de marcadores genéticos específicos, denominados SNP (polimorfismos de un solo nucleótido), y por un algoritmo de análisis diseñado específicamente para discriminar dos individuos, el donante y el receptor, mediante el uso de un panel específico identificado de 94 SNP y mediante la cuantificación de la fracción de ADN libre del donante.
Para cada experimento, procesamos un par de ADN genómico, del donante y del receptor, y el cfADN total de las muestras de sangre del receptor (individuo 1). El objetivo es identificar la presencia del cfADN del donante (individuo 2), mediante el uso del ADN genómico del receptor y del donante como referencia.
En caso de imposibilidad de procesar la muestra de ADN genómico del donante, procesamos el ADN genómico y el cfADN total, mediante el uso del ADN genómico del receptor como única referencia.
Las ventajas del nuevo método desarrollado es que con al menos un SNP de diferencia entre el donante y el receptor es posible identificar la presencia del cfADN del donante en una muestra de sangre y cuantificarlo, sin necesidad del ADN genómico del donante como referencia.
Además, nuestro método tiene un bajo límite de detección (1 %) y, por lo tanto, es posible identificar hasta 1 % de fracción mínima de cfADN donante en un cfADN total (receptor donante), y una muy alta sensibilidad (>98 %), y una baja incidencia de falso negativo (≤1 %). Por lo tanto, el algoritmo utilizado en el método es capaz de identificar correctamente porciones de SNP en el panel e identificar variantes en esas posiciones y calcular el porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante con respecto al ADN libre de células receptor, mediante el uso del ADN genómico receptor como referencia.
Una forma de realización de la presente invención es, por lo tanto, un método para monitorear el estado del rechazo de órganos trasplantados o del tratamiento inmunosupresor en un sujeto, que comprende:
a) proporcionar ADN libre de células de una muestra biológica obtenida de un sujeto que es el receptor de un trasplante de órgano de un donante;
b) secuenciar un panel de 94 polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) del ADN libre de células; y c) calcular la cantidad del ADN libre de células derivadas del donante en dicha muestra biológica; caracterizado porque los 94 polimorfismos de nucleótidos únicos secuenciados en el punto b) son aquellos enumerados en la tabla 3, en que en la etapa c) se calcula las diferencias en las posiciones de SNP al identificar y comparar las variaciones en posiciones de nucleótidos específicas entre el ADN libre de células derivadas de donante y el ADN libre de células derivadas del receptor, mediante el uso del ADN genómico del receptor previamente caracterizado, como referencia, y en que la etapa c) se basa en el cálculo de la fracción de donante de cfADN con la fórmula:
para cada SNPi y el DF % total se calcula como: DF % = media DFi % 6 SD DF en donde:
AF(SNPi) es la frecuencia de alelos del SNP considerado, calculado para la mezcla de cfADN total (donante receptor), y
AF(SNPidon) y AF(SNPirec) es la frecuencia de alelos del SNP considerado en el cfADN del donante y receptor, respectivamente, de acuerdo con su genotipo. De acuerdo con la descripción, el ADN libre de células aislado en la etapa a) del receptor del trasplante se puede extraer de métodos y protocolos para la extracción de ADN conocidos en la técnica.
Dichos métodos se seleccionan preferentemente de kits de ccfADN Qiagen QIAaRSCmp MinElute, kit de plasma de cfADN Maxwell RSC, kit de aislamiento de ADN libre de células Invitrogen MagMAX. La selección de dicho panel de 94 SNP se llevó a cabo al identificar los SNP que son útiles para identificar de manera única un individuo de otros (45 SNP identificados como iiSNP en la genética forense (14)) y que tienen una alta variabilidad, fáciles de mapear y con un índice de fijación de 0,06 (49 SNP, seleccionados de https://alfred.med.yale.edu/, accedido por última vez en abril del 2017).
En una forma de realización adicional, la secuenciación de SNP se realiza con los cebadores enumerados en la tabla 4.
De acuerdo con la presente divulgación, los métodos de secuenciación de ADN divulgados en la etapa b) se seleccionan de los métodos e instrumentos de secuencias de próxima generación conocidos en la técnica (es decir, Illumina platforms, Ion-Torrent, MiniON, GeneRead, PacBio).
Preferentemente, dichos métodos para secuenciar el ADN se seleccionan de un método de amplicon, método de captura, método de enriquecimiento, pirosecuenciación, incorporación de nucleótidos, tecnologías semiconductoras, lectura de tiempo real de nanoporos y métodos de secuenciación sin PCR.
El análisis de bioinformática utilizado en el método de la presente invención es similar al utilizado para identificar mutaciones somáticas en el tejido. En particular, dicho análisis bioinformático compara el ADN genómico receptor con el cfADN, al buscar variantes en el cfADN. La presencia de aquellas variantes se puede asociar solo con errores de secuenciación o con ADN donante procedente de la destrucción de las células de injerto debido al rechazo. El análisis excluye errores que identifican variantes reales en posiciones específicas (SNP).
Los SNP en donde el trasplante, material y receptor son homocigóticos, pero con diferentes alelos, se pueden utilizar luego para la futura determinación del porcentaje de cfADN de injerto.
Preferentemente, dicho algoritmo está compuesto por 2 partes: la primera parte tiene por objeto identificar las 94 variantes (panel de SNP), la segunda parte tiene por objeto identificar el genotipo del donante y receptor, distinguir lecturas de cfADN de 2 individuos, y calcular la fracción de donante.
Las etapas utilizadas en la primera parte son:
• Alineación de la secuencia al genoma humano GRCH37 mediante el uso de un algoritmo conocido seleccionado de BWA, BWA-MEM o Novoalign.
• Preprocesamiento de la secuencia alineada para reducir los errores de secuenciación o alineación mediante el uso de algoritmos de código abierto dedicados seleccionados de GATKv3.7 o Picard v2.7.
• Llamado de variantes mediante el uso de un algoritmo de código abierto conocido para la identificación de variantes en un análisis de control de caso seleccionado de Mutect2, VarDictJava, GATK v3.7, Varscan v2.3.9 o Freebayes v0.9.10.
• Posprocesamiento y extracción de característica: durante el posprocesamiento, las variantes obtenidas de cada llamado de variante se combinan en un único conjunto de datos, e informan todas las características en un formato de archivo tsv.
La segunda parte del análisis tiene por objeto identificar el genotipo del donante y receptor, distinguir lecturas de cfADN de 2 individuos, y calcular la fracción de donante.
Las etapas utilizadas en la segunda parte son:
• Filtración de variantes: en donde las variantes se clasifican como PASAR o FILTRAR para identificar TP y FB en función de la calidad de la secuenciación y cobertura. En esta etapa se identifican los 94 SNP (como anotación de variante) y se consideran para un futuro análisis.
• Identificación de genotipo: en el caso de ausencia de ADN donante, el algoritmo aplica un modelo de inferencia de aprendizaje automático supervisado, preferentemente basado en la probabilidad de Bayes posterior (Naive Bayes) para clasificar cada SNP nueva independientemente. El aprendizaje automático se puede aplicar mediante el uso de un paquete basado en Python tal como Scikit-Learn, Teano, Tensor Flow o Weka, STATA, o software Orange o R para el análisis de datos.
• Cálculo de fracción de donante: la fracción de donante se calcula mediante el uso de la fórmula descrita anteriormente para cada SNP. Se calcula la media de la fracción de donante de todas las SNP informativas. En el caso de la ausencia del genotipo de donante, se calcula una media de valor ponderado para cada genotipo.
• Informe de los resultados: para cada muestra, se crea un informe que contiene el SNP identificado, el genotipo, la presencia de las variantes que se refieren al donante y la cantidad del cfADN donante (DF %).
Un esquema del algoritmo entero se representa en la figura 2.
AF(SNPi) y AF(SNPirec) para cada SNP encontrada en la muestra evaluada se calcula por el algoritmo en función de la secuencia obtenida por el instrumento.
En el caso de la disponibilidad del ADN donante genómico, también se calcula el AF(SNPidon) por el algoritmo y la variable desconocida única en la fórmula es DF, de otra forma el AF(SNPidon) se deduce mediante el uso de un modelo de aprendizaje automático supervisado que utiliza como atributos la calidad de la secuencia en esa posición, AF(SNPirec) y AF(SNPi) y genotipos relativos.
Preferentemente, dicho modelo de aprendizaje automático supervisado se basa en la probabilidad de Bayes posterior (Naïve Bayes), para clasificar cada SNP nueva independientemente.
En una forma de realización preferida, en el método de acuerdo con la presente invención, el órgano trasplantado se selecciona del corazón, pulmón, riñón, hígado o páncreas.
En particular, el método de la presente invención se puede aplicar a todos los órganos trasplantados, ya que la presencia de cfADN es independiente de órgano.
De acuerdo con el método de la presente descripción, la cantidad de SNP secuenciadas serán suficientes para discriminar entre alelos receptores y donantes en individuos relacionados (excepto mellizos).
En un aspecto preferido, la mezcla biológica utilizada en el método reivindicado es una muestra de sangre del receptor, y una muestra de sangre o tejido del donante, si está presente.
De acuerdo con la presente invención, el diagnóstico del estado del órgano trasplantado en el sujeto se realiza al evaluar el porcentaje y/o la cantidad del ADN libre de células derivadas de donante con respecto al ADN libre de células receptor, mediante el uso del ADN genómico receptor como referencia.
Preferentemente, un cambio en el porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante durante un período de tiempo es indicador del estado del órgano trasplantado.
De acuerdo con el método de la presente invención, un aumento en los niveles del ADN libre de células derivadas de donante durante el intervalo de tiempo es indicador del rechazo del trasplante, una necesidad de ajustar el tratamiento inmunosupresor, y/o una necesidad de más investigación del estado del órgano trasplantado.
Preferentemente, un aumento en el nivel de cfADN comprendido entre 5 y 15 % es indicador de, probablemente, la presencia de un rechazo, con mayor preferencia, un aumento de 10 a 25 % es indicador de un rechazo clínicamente significativo.
En una forma de realización adicional, una disminución en los niveles del ADN libre de células derivadas de donante durante el intervalo de tiempo es indicador de la tolerancia del trasplante, una necesidad de ajustar el tratamiento inmunosupresor, y/o una necesidad de más investigación del estado de los órganos trasplantados; mientras que un valor por debajo de 5 % o ningún cambio en los niveles del ADN libre de células derivadas de donantes durante el intervalo de tiempo es indicador del estado de rechazo de trasplante estable y/o oportunidad para ajustar el tratamiento inmunosupresor. Preferentemente, una disminución en el nivel de cfADN comprendida entre 10 y 25 % de la evaluación positiva es indicadora de la eficacia del tratamiento inmunosupresor. Con mayor preferencia, dicha disminución está comprendida entre 15 y 20 %.
De acuerdo con la presente invención, las muestras biológicas se pueden tomar de un receptor de trasplante durante un período de tiempo (es decir, durante un intervalo de tiempo). El tiempo en el que las muestras se toman del receptor de trasplante luego del evento de trasplante puede variar. Las muestras se pueden tomar de un receptor de trasplante en diversos tiempos y durante diversos períodos de tiempo para su uso en la determinación del estado del aloinjerto de acuerdo con los métodos de la presente divulgación. Por ejemplo, las muestras se pueden tomar del receptor de trasplante dentro de días y semanas después, alrededor de tres meses después, alrededor de seis meses después, alrededor de nueve meses después, o menos de un año después del evento de trasplante. Las muestras se pueden tomar del recipiente de trasplante en diversos tiempos antes del primer aniversario del evento del trasplante, en el primer aniversario del evento del trasplante, o en diversos tiempos después del primer aniversario del evento de trasplante. Por ejemplo, en el primer aniversario luego de un trasplante, las muestras pueden comenzar a tomarse del receptor de trasplante en el mes 12 (es decir, el primer aniversario del evento de trasplante) y seguir tomándose por períodos de tiempo después de esto.
En algunas formas de realización, un receptor de trasplante tiene muestras biológicas tomadas durante uno a tres meses consecutivos, que comienzan en el primer aniversario del evento de trasplante (es decir, 12 meses luego del evento de trasplante), lo que proporciona un total de 4-6 muestras para análisis tomadas durante un período de tiempo de tres meses, con las muestras recolectadas alrededor de cada dos semanas. En algunos aspectos, a un receptor de trasplante se le toman muestras de fluidos corporales una vez a la semana durante uno a tres meses consecutivos, que comienzan en el primer aniversario del evento de trasplante (es decir, 12 meses luego del evento de trasplante), lo que proporciona un total de doce muestras para análisis tomadas durante un período de tiempo de tres meses. La duración total de la obtención de muestras de un receptor de trasplante, como también la frecuencia de obtener tales muestras, puede variar y dependerá de una variedad de factores, tales como progreso clínico. Por ejemplo, un receptor de trasplante puede tener muestras obtenidas para análisis del ADN libre de células por la duración de su vida útil. El momento y frecuencia apropiada del muestreo se podrá determinar por una persona del oficio de nivel medio para un receptor de trasplante determinado.
Los métodos de la presente divulgación se pueden utilizar para predecir el riesgo del futuro rechazo de trasplantes tales como, por ejemplo, es riesgo de rechazo dentro de los siguientes 3-6 meses luego del análisis de muestras del receptor de trasplante.
Los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para proporcionar una evaluación del estado inmune del receptor de trasplante, que se puede utilizar para guiar las decisiones con respecto al tratamiento inmunosupresor en el receptor de trasplante. Los métodos de la presente divulgación también se pueden utilizar para guiar las decisiones relacionadas con el ajuste de tratamientos inmunosupresores que se administran al receptor del trasplante, con respecto a la presencia o nivel de rechazo identificado.
Los beneficios adicionales y/o usos de los métodos de la presente divulgación serán fácilmente evidentes para una persona del oficio de nivel medio.
En una forma de realización adicional, la invención proporciona un método para monitorear el estado de un trasplante en un receptor de trasplante para evaluar el tratamiento inmunosupresor donde el método comprende cuantificar la cantidad del ADN libre de célula derivada del donante en una muestra del receptor de trasplante en puntos temporales deseados y ajustar el tratamiento inmunosupresor, por ejemplo, ajustar la cantidad de fármaco inmunosupresor. Por lo tanto, la dosis más baja de un fármaco inmunosupresor se puede identificar para ese paciente individual.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método para monitorear el estado de un trasplante en un receptor de trasplante para evaluar la lesión por reperfusión al trasplante, en dicho aspecto, las cantidades de cfADN de injerto se determinan durante un curso de tiempo, por ejemplo, un curso de tiempo de días o semanas hasta un mes después del trasplante. Preferentemente, el cfADN se monitorea durante los primeros 7 días luego del injerto. En un aspecto adicional, el método comprende determinar el nivel de cfADN de injerto durante un curso de siete días, o hasta 30 días después del trasplante.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método para monitorear el estado del injerto trasportado con respecto al rechazo mediado por anticuerpos (AMR) en un receptor de trasplante para evaluar el estado del injerto. En tales aspectos, la cantidad de cfADN de injerto se determina luego de 2 años de los trasplantados. La presencia de AMR determinará cambios en la estrategia del tratamiento inmunosupresor.
Un aspecto adicional se relaciona con un producto de programa informático que comprende un medio utilizable por computadora que tiene códigos o instrucciones de programas legibles por computadora incluidos en él para permitir que un procesador lleve a cabo el análisis y correlacione las funciones como se describió anteriormente.
Una forma de realización adicional de la presente invención es un medio informático que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por una computadora, causan que la computadora lleve a cabo las siguientes etapas:
(i) recibir datos sin procesar de secuencias de SNP obtenidas del método de la reivindicación 1;
(ii) alinear dichos datos de secuenciación con el genoma de referencia;
(iii) preprocesar y preparar datos sin procesar para el llamado de variantes;
(iv) identificar las variantes de SNP y calcular el genotipo del receptor para estos SNP, que se identifican como no mutados (0/0) heterocigóticos mutados (0/1) u homocigóticos mutados (1/1), a través de un proceso de llamado de variantes de línea de gérmenes;
(v) calcular el genotipo de la mezcla de cfADN y compararlo con el receptor uno calculado a través de un proceso de llamado de variantes somáticas;
(vi) calcular la fracción de donante de acuerdo con la siguiente fórmula:
Preferentemente, dicho método es una lista legible por computadora de instrucciones de acuerdo con la figura 2 registrada para causar que una computadora lleve a cabo las etapas informadas anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1.
Diseño del panel SNP
Mediante el uso de nuestros antecedentes bioinformáticos y nuevo conocimiento desarrollado en la genómica forense sobre la discriminación individual (15), se diseñó un panel de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) que contiene los llamados SNP de identificación individuales. El objetivo de la solución de diseño de panel de SNP fue poder discriminar la presencia de fragmentos de ADN de una persona diferente de la que se realizó el muestreo de sangre.
Antes de identificar la cantidad más apropiada de SNP que llevan al método confiable, preciso y económico de acuerdo con la presente invención, se comenzó a utilizar una cantidad diferente de SNP, variable desde 138 a 155 SNP, que tiene como característica principal una alta variabilidad y una diferencia homocigótica/homocigótica entre el donante y el receptor.
Como se informó en la tabla N.° 1, esto lleva a un método con una muy baja precisión y exactitud (de 40-50 %) y un alto número de falsos positivos.
Tabla 1. Resultados de la simulación de diferentes concentraciones de cfADN del individuo 1 y 2 y un panel de SNP de 138-155: estadísticas.
Como se puede observar de la tabla N.° 1, el método basado en un panel de 138-155 SNP no fue suficiente para identificar claramente entre los 2 individuos, debido al alto número de falsos positivos detectados. Por lo tanto, se debería usar un número más bajo de SNP más precisos para aumentar el rendimiento del método.
En función de los resultados no óptimos obtenidos con un panel de un número más alto de SNP, se realizaron los mismos experimentos con un panel identificado de 94 SNP previamente identificado como adecuado para diferenciar entre cualquiera de dos individuos no relacionados. Se eligieron SNP con una alta frecuencia de mutación en población general (independientemente de género o etnicidad), para asegurarse de encontrar un porcentaje mínimo de SNP en el panel, diferente en cada combinación de dos individuos. Los fundamentos fueron discriminar el cfADN del donante a través de la identificación de SNP diferentes del receptor.
El panel obtenido está compuesto por 94 SNP. Esta combinación de SNP tiene una extremadamente baja probabilidad de que dos individuos no relacionados tengan genotipos idénticos. Todos los SNP tienen una heterocigosidad promedio de >0,4 y/o un Fst>0,06. El índice de fijación (Fst) es una medida de diferenciación de población debido a la estructura genética, los valores varían de 0 a 1. Un valor de cero implica una panximia completa (acoplamiento aleatorio); es decir, que las dos poblaciones se están cruzando libremente; un valor de uno implica que toda variación genética se explica por la estructura de la población, y que las dos poblaciones no comparten ninguna diversidad genética. El valor elegido hace que esto sea un panel aplicable de forma universal independientemente de etnicidad o ascendencia (tabla 1). Las frecuencias de SNP se verificaron en 1000Genomas (http://www.internationalgenome.org/1000-genomes-browsers/, accedido por última vez el 19/1/2019).
Tabla 2. Resultados de la simulación de diferentes concentraciones de cfADN del individuo 1 y 2 y un panel de 94
SNP: estadísticas.
Los resultados obtenidos con este nuevo panel fueron muy prometedores en términos de exactitud y precisión (95-100 %), con una alta exactitud y precisión con respecto al panel de 138-155 SNP informadas en la tabla 1.
Tabla 3. Lista del panel de 94 SNP. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/, visitado por última vez (19/1/2019), Fst, heterocigosidad y poblaciones
(continuado)
Cada uno de los SNP en el panel informado en la tabla 3 pueden estar presentes en el donante y el receptor sin mutar (0/0 o homocigótico de referencia), homocigótico mutado (1/1 u homocigótico alternativo), o heterocigótico 0/1 ó 1/0.
Para discriminar únicamente los 2 individuos no relacionados, sólo son útiles para el análisis las combinaciones específicamente diferentes del receptor y del donante tales como 0/0 - 0/1 ó 0/0 - 1/1.
Algoritmo de análisis
Se desarrolló un conducto de distribución de análisis ad hoc de datos de NGS mediante el uso de paquetes de software desarrollados en Unix Bash, que incluyen diversas herramientas de bioinformática y scripts de Python. El conducto se realiza en función del cálculo contemporáneo del genotipo (GT) de las muestras analizadas, mediante el uso de una línea de gérmenes y un conducto somático para la identificación de NGS de las variantes. El conducto de línea de gérmenes está concentrado en la identificación de genotipo de ADN genómico del individuo 1.
El conducto para la identificación de genotipo de la línea de gérmenes en paralelo y la identificación somática de las diferencias se informan a continuación.
• Alineación: Los archivos de FASTQ que provienen del secuenciador de Illumina están alineados mediante el uso de la herramienta BWA-MEM v 0.7.15.
• Preprocesamiento Los archivos de SAM obtenidos luego se convierten en archivos BAM y se ordenan mediante el uso de picard v2.7. Se agrega el grupo de lectura. El análisis de Amplicón diana incluye una etapa de depuración de datos para reducir los falsos positivos y falsos negativos mediante el uso de la recalibración de puntaje de calidad base con el uso de GATK v3.7 y los archivos BAM se indexan con el uso de picard v2.7.1.
• Llamado de variantes: esta etapa incluye el uso de tres llamados de variantes para aumentar la sensibilidad. Los conductos somáticos realizan un análisis de caso control mediante el uso de Mutect2, VarDictJava y VarScan v2.3.9, donde el caso es cfADN y el control es ADN genómico. Los llamados de variantes se utilizan sin filtros. El genotipo de ADN de la genómica también se puede llamar mediante tres llamados de variantes (GATK v3.7, Varscan v2.3.9 y Freebayes v0.9.10) para el análisis de línea de gérmenes. El ADN genómico proporciona la información de genotipo acerca del individuo 1, para su uso en la fase de informe. Todos los llamados de variantes se utilizan sin parámetros por defecto.
• Posprocesamiento y extracción de característica: durante el posprocesamiento, las variantes obtenidas de cada llamado de variante se combinan en un único conjunto de datos, e informan todas las características en un formato de archivo tsv.
• Filtrado de variantes: las variantes se clasifican como PASS o FILTER para identificar TP y FP en función de la calidad de secuenciación y cobertura. Los 94 SNP se identifican (anotación de variantes) y se consideran para el análisis adicional.
• Identificación de genotipo: en el caso de ausencia de ADN donante, el algoritmo aplica un modelo de inferencia de aprendizaje automático supervisado, basado en la probabilidad de Bayes posterior (Naive Bayes) para clasificar cada SNP nueva independientemente. Para el cálculo se usó Weka 3.8.1.
• Cálculo de fracción de donante: la fracción de donante se calcula mediante el uso de la fórmula descrita anteriormente para cada SNP. Se calcula la media de la fracción de donante de todas los SNP informativos. En el caso de la ausencia del genotipo de donante, se calcula una media de valor ponderado para cada genotipo.
• Informe de los resultados: Para cada muestra, se crea un informe que contiene el SNP identificado, el genotipo, la presencia de las variantes que se refieren al donante y la cantidad del cfADN donante (DF %).
Materiales y métodos
Extracto de cfADN
Se recolectó sangre entera (6 ml) en tubos de recolección de sangre (tubos BD con EDTA). La sangre se centrifugó a 4.000 rpm (volúmenes mayores) o 13.000 rpm (volúmenes menores) a 4 °C durante 15 minutos, se retiró el plasma y se volvió a centrifugar a 13.000 rpm a 4 °C durante 15 minutos y el sobrenadante se congeló a -80 °C hasta su uso.
En 10 muestras de sangre (3 ml) de 10 donantes voluntarios no relacionados, se separó plasma y se purificó el cfADN mediante el uso de un método semiautomático o completamente automático: Qiagen (QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit) y Promega (Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit), de acuerdo con ambos protocolos, respectivamente. La concentración de cdfADN se midió con el uso del kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Invitrogen, Life Technologies, CA, EE. UU.) en un fluorómetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Preparación de colecciones y secuenciación
El ensayo de cfADN se realiza en función de la amplificación de diana de las regiones de ADN que albergan 94 SNP. El cfADN extraído de 1 ml de plasma o los materiales de referencia se preamplificó en una única reacción de multiplex con 270 pares de cebadores (véase la tabla 2) durante 15 ciclos. El protocolo de preparación usado fue Illumina Truseq Custom Amplicon para la secuenciación de diana. Se agregaron las secuencias de índice y los adaptadores de secuenciación Illumina a cada muestra de ADN mediante PCR, y la muestra se calificó y se cuantificó mediante el fluorómetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies, CA, EE. UU.) y un bioanalizador de Agilent Technologies 2100 (Agilent, Santa Clara, CA), de acuerdo con los protocolos de preparación. Se acumularon hasta 24 muestras amplificadas en cantidades equimolares, se purificaron mediante el uso de perlas de Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA), y se secuenciaron en un instrumento de Illumina MiSeq.
La tabla 4 informa los cebadores de SNP de los amplicones de diana utilizados para los experimentos. Algunos SNP están cubiertos mediante más de una diana para garantizar la cobertura total del panel.
Diseño del estudio sintético
Validación del panel SNP
El uso de la frecuencia de alelo menos común (MAF) en la población general informado en el proyecto 1000Genome (1000G) para calcular la probabilidad de la mutación de cada alelo de cada uno de los 94 SNP en nuestro panel (tabla 3), se crearon 10000 genotipos simulados (0/0, 0/1, 1/1), según la hipótesis de independencia de mutación entre los SNP:
es decir, la probabilidad conjunta de la presencia de dos SNP es igual al producto de la única probabilidad.
Se realizaron cálculos para cada SNP en cada muestra simulada como:
El objetivo fue estimar la probabilidad de mutación de cada SNP en la población simulada, en un genotipo útil para la evaluación.
Tabla 5. Lista de SNP, 1000G MAF y frecuencias calculadas de acuerdo con la fórmula anterior.
MAF es la frecuencia alélica de la variante de base menor representada en la posición de cada SNP en una población secuenciada.
El P(SNP) en la población se calculó según la teoría de Hardy Weinberg como:
Límite de detección: evaluación in silico
Se crearon 10 archivos de FASTQ de simulación que imitan las características (cobertura, calidad, tasa de error) de los archivos sin procesar provenientes del instrumento Miseq Ilumina, con el uso de la herramienta Simulvar v1.0. La elección de las características fue cubrir el espectro de la salida posible del instrumento (cobertura baja, tasa de error alta a cobertura alta, tasa de error baja). A partir de los 10 archivos iniciales se crearon 5 pares de archivos BAM con los 94 genotipos de SNP obtenidos de 5 (aleatorios) de los 10.000 genotipos simulados de la frecuencia de alelo de población general.
El objetivo fue imitar las diferentes concentraciones (en un porcentaje conocido entre 0,1 % y 5 %) del donante en el cfADN del receptor.
Los archivos obtenidos se analizaron con el uso del algoritmo de análisis divulgado anteriormente.
Límite de detección: evaluación in vitro
Para poder confirmar el resultado anterior, se crearon 6 muestras de control, con una cantidad predefinida cfADN del individuo 1 en una cantidad del individuo 2 (1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100%), para evaluar los límites de detección de nuestra metodología de prueba en una mezcla progresivamente diluida calculada de las parejas reales muestras de cfADN.
Diseño de estudio piloto
Se llevó a cabo un estudio piloto de etapa temprana en 23 series de muestras de pacientes con corazones trasplantados que se sometieron a monitoreo de EMB, para confirmar el concepto y verificar los resultados. Se evaluó la eficacia para detectar precisamente el cfADN del donante (individuo 1) en la sangre del receptor (individuo 2).
Actualmente, se desarrolló un prototipo de laboratorio operativo, en función del panel de marcadores genéticos específicos designados y el algoritmo innovador.
Validación del diseño de panel
El proceso funciona correctamente para individualizar el genomarcador del par individuo1/individuo2 de cfADN. En particular, la probabilidad para individualizar al menos un SNP con un genotipo informativo se informa en la tabla 6 y es una probabilidad aproximada a 1 tanto en caso de homocigosis (0/0 y 1/1) y en el caso de heterocigosis (0/1 y 0/0).
Para el diseño del panel, la presencia de al menos 1 combinación informativa del genotipo de SNP es suficiente para discriminar el ADN de diferentes individuos.
0/0 de referencia homocigótica, 1/1 alternativa homocigótica, 0/1 o 1/0 de límite de detección homocigótica: evaluación in silico.
Se identificó un límite de detección de 1 % del método desarrollado (la cantidad mínima de cfADN del individuo 1 que se puede identificar en el total de cfADN, que contiene el cfADN del individuo 1 el cfADN del individuo 2). En las muestras reales, se espera un incremento de la fracción de ADN del donante dentro del total concurrente de cfADN con la presencia de rechazo y proporcional al grado de rechazo. La tabla 7 y la figura 3 representan los resultados de esta evaluación. Las estadísticas informadas se refieren a la capacidad del algoritmo de identificar correctamente los SNP en la fracción informada del ADN del donante.
Límite de detección: evaluación in vitro
Se identificó un límite de detección de 1 % (la cantidad mínima de cfADN del individuo 2 que se puede identificar en el total del cfADN del individuo 1), coherente con los resultados simulados. El límite de la evaluación fue la dificultad de preparar las muestras con una concentración <1 %. Los resultados se informan en la figura 4. El algoritmo pudo identificar la fracción correcta del individuo 2 en la mezcla in vitro, con un error de 0,01 %.
Resultados del proceso de aprendizaje automático para la predicción de GT de genotipo de donante
Para evaluar la precisión y rendimiento del método se usó un acercamiento supervisado de aprendizaje automático (Naïve Bayes) en datos simulados como conjunto de entrenamiento y datos reales (con el GT de donante conocido para cada SNP en el panel) como conjunto de pruebas. En la tabla 8 se informan los resultados del rendimiento del modelo entrenado.
La figura 5 muestra la curva ROC (característica operativa del receptor), el área bajo la curva fue 0,991.
Tabla 8. GT real contra GT previsto mediante el modelo de aprendizaje automático entrenado.
Finalmente, se aplicó el modelo de aprendizaje automático entrenado en el conjunto de datos sintético (GT de donante desconocido, pero fracción cfADN de donante conocido).
En la tabla 9 se informan los resultados del modelo de aprendizaje automático.
Tabla 9. Porcentaje de fracción del donante calculado mediante el GT previsto mediante el modelo de aprendizaje automático entrenado en el conjunto de datos sintético contra el porcentaje conocido para las mismas muestras.
Estudio piloto de etapa temprana
Para evaluar el conducto en una configuración real, los resultados estándares de excelencia (derivados de la EMB de biopsia endomiocárdica) clasificada de acuerdo con los estándares ISLHT (Stewart S, et al. Revision of the 1990 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart rejection. J Heart Lung Transplant. 2005; 24:1710-20) se compararon con la prueba en un grupo de estudio de 4 muestras, en el que la sangre del donante estaba genotipificada y se usó el GT del donante para calcular la fracción de donante esperada. La fracción de donante esperada se estimó con el uso de la inferencia de genotipo de donante mediante aprendizaje automático.
En la tabla 10 se informan el porcentaje de fracción de donante calculado del algoritmo, la clasificación preliminar y la comparación con el estándar de excelencia.
Tabla 10. La fracción del donante se calculó con GT conocido y GT calculado en un conjunto de datos real.
Finalmente, se aplicó la prueba en un grupo de estudio de 4 muestras. El ADN genómico del donante no estaba disponible, y se utilizó el acercamiento de aprendizaje automático para calcular el genotipo del donante. La fracción del donante luego se calculó con el genotipo del donante asumido. Los resultados de la prueba y la comparación con el estándar de excelencia se informan en la figura 6. Para cada paciente, se recolectaron 2 muestras, T0 tras 15 días y T1 tras 21 días desde el trasplante de corazón.
Conclusiones
El sistema es útil para identificar y medir correctamente el cfADN de un individuo en el total de cfADN extraído de una muestra de sangre de otro individuo que comienza desde un porcentaje de 1 % de concentración, con una sensibilidad muy alta (98 %).
En la hipótesis del trasplante, el sistema puede reconocer la presencia del donante no relacionado de cfADN en la cantidad total muestreada del receptor y cuantificarla para identificar la presencia del rechazo.
Luego se puede usar para monitorear el rechazo durante el período posterior al trasplante, y la eficacia del tratamiento inmunosupresor.
Referencias
1. Miller CA, Fildes JE, Ray SG, Doran H, Yonan N, Williams SG, Schmitt M. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection.Heart. abril de 2013; 99(7):445-53.
2. Costanzo MR, Dipchand A,Starling R, et al. The International Society of Heart and Lung Transplantation Guidelines for the care of heart transplant recipients. J Heart Lung Transplant.2010; 29: 914-956.
3. Saraiva F, Matos V, Gonçalves L, Antunes M, Providência L. Complications of endomyocardial biopsy in heart transplant patients: A retrospective study of 2117 consecutive procedures. Transplant Proc.2011;43:1908-1912.
4. Stehlik J, Starling RC, Movsesian MA et al. Utility of longterm surveillance endomyocardial biopsy: a multiinstitutional analysis. J Heart Lung Transplant 2006; 25(12):1402-1409.)
5. Deckers JW, Hare JM, Baughman KL. Complications of transvenous right ventricular endomyocardial biopsy in adult patients with cardiomyopathy: a seven-year survey of 546 consecutive diagnostic procedures in a tertiary referral center. J Am Coll Cardiol 1992; 19(1):43-47.
6. Pophal SG, Sigfusson G, Booth KL et al. Complications of endomyocardial biopsy in children. J Am Coll Cardiol 1999; 34(7):2105-2110
7. De Vlaminck I, Valantine HA, Snyder TM, et al. Circulating cell-free DNA enables noninvasive diagnosis of heart transplant rejection. Sci Transl Med.2014; 6:241ra77.
8. Snyder TM, Khush KK, Valantine HA, Quake SR. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proc Natl Acad Sci U S A.2011; 108:6229-34.
9. Oellerich M, Kanzow P, Beck J, et al.. Graft-derived cell-free DNA (GcfDNA) as a sensitive measure of individual graft integrity after liver transplantation. Am J Transplant.2014; 14(suppl I):874.
10. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, et al.. A rapid noninvasive assay for the detection of renal transplant injury. Transplantation.2013; 96:97-101.
11. Beck J, Bierau S, Balzer S, et al.. Digital droplet PCR for rapid quantification of donor DNA in the circulation of transplant recipients as a potential universal biomarker of graft injury. Clin Chem. 2013; 59:1732-1741.
12. Grskovic M et al. Validation of a Clinical-Grade Assay to Measure Donor-Derived Cell-Free DNA in Solid Organ Transplant Recipients. J Mol Diagn.2016; 18:890-902.
13. Gordon PM, et al. An Algorithm Measuring Donor Cell-Free DNA in Plasma of Cellular and Solid Organ Transplant Recipients That Does Not Require Donor or Recipient Genotyping. Front Cardiovasc Med.
2016; 3:33. eCollection 2016.
14. Pakstis AJ, et al. SNPs for a universal individual identification panel. Hum Genet.2010; 127:315-24. 15. Kidd KK, et al. Expanding data and resources for forensic use of SNPs in individual identification. Forensic Sci Int Genet.2012; 6(5):646-52.
Claims (11)
- REIVINDICACIONES 1. Método in vitro o ex vivo para monitorear el estado del rechazo de órganos trasplantados o la eficacia del tratamiento inmunosupresor en un sujeto, que comprende: a) proporcionar ADN libre de células de una muestra biológica obtenida de un sujeto que es el receptor de un trasplante de órgano de un donante; b) secuenciar un panel de 94 polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) del ADN libre de células, y c) calcular la cantidad de ADN libre de células derivadas del donante en dicha muestra biológica; caracterizado porque los 94 polimorfismos de nucleótidos únicos secuenciados en el punto b) son aquellos enumerados en la tabla 3, en que en la etapa c) se calcula las diferencias en las posiciones de SNP al identificar y comparar las variaciones en posiciones de nucleótidos específicas entre el ADN libre de células derivadas de donante y el ADN libre de células derivadas del receptor, mediante el uso del ADN genómico del receptor previamente caracterizado, como referencia, y en que la etapa c) se basa en el cálculo de la fracción de donante de cfADN con la fórmula:para cada SNPi y el DF % total se calcula como: DF % = media DFi % 6 SD DF en donde: AF(SNPi) es la frecuencia de alelos del SNP considerado, calculado para la mezcla de cfADN total (donante receptor), y AF(SNPidon) y AF(SNPirec) es la frecuencia de alelos del SNP considerado en el cfADN del donante y receptor, respectivamente, de acuerdo con su genotipo.
- 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuenciación de SNP se realiza con los cebadores enumerados en la tabla 4.
- 3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el estado del rechazo del órgano trasplantado o la eficacia del tratamiento inmunosupresor en el sujeto se detecta al evaluar el porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante con respecto al ADN libre de células receptor, mediante el uso del ADN genómico receptor como referencia.
- 4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el órgano trasplantado se selecciona de corazón, pulmón, riñón, hígado o páncreas.
- 5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque un cambio en el porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante durante un período de tiempo es indicador del rechazo del órgano trasplantado o de la eficacia del tratamiento inmunosupresor.
- 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque un incremento del porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante durante el intervalo de tiempo es indicador del rechazo del trasplante, o de una necesidad de ajustar el tratamiento inmunosupresor.
- 7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque una disminución del porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante durante el intervalo de tiempo es indicador de la tolerancia del trasplante, o de una necesidad de ajustar el tratamiento inmunosupresor.
- 8. El método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque un valor inferior a 5 % o sin cambio en el porcentaje del ADN libre de células derivadas de donante durante el intervalo de tiempo es indicador del estado de rechazo del trasplante estable y/o de la oportunidad de ajustar el tratamiento inmunosupresor.
- 9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las muestras biológicas se toman de un receptor de trasplante dentro de días y semanas después, alrededor de tres meses después, alrededor de seis meses después, alrededor de nueve meses después, o menos de un año después del evento de trasplante.
- 10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las muestras biológicas se toman durante uno a tres meses consecutivos, que comienzan en el primer aniversario del evento de trasplante, lo que proporciona un total de 4-6 muestras para análisis tomadas durante un período de tiempo de tres meses, con las muestras recolectadas alrededor de cada dos semanas.
- 11. El medio informático que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por una computadora, causan que la computadora lleve a cabo las siguientes etapas: (i) recibir datos sin procesar de secuencias de SNP obtenidas del método de la reivindicación 1; (ii) alinear dichos datos de secuenciación con el genoma de referencia; (iii) preprocesar y preparar datos sin procesar para el llamado de variantes; (iv) identificar las variantes de SNP y calcular el genotipo del receptor para estos SNP, que se identifican como no mutados (0/0) heterocigóticos mutados (0/1) u homocigóticos mutados (1/1), a través de un proceso de llamado de variantes de línea de gérmenes; (v) calcular el genotipo de la mezcla de cfADN y compararlo con el receptor uno calculado a través de un proceso de llamado de variantes somáticas; (vi) calcular la fracción de donante de acuerdo con la siguiente fórmula:
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|---|---|---|---|---|
| CN110129434A (zh) * | 2018-02-08 | 2019-08-16 | 埃提斯生物技术（上海）有限公司 | 胆汁中生物标志物在诊断恶性肿瘤中的应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012115851A1 (en) * | 2011-02-22 | 2012-08-30 | City Of Hope | Ultra-high sensitive monitoring of early transplantation failure |
| EP3741871A3 (en) * | 2012-04-19 | 2021-02-17 | The Medical College of Wisconsin, Inc. | Highly sensitive surveillance using detection of cell free dna |
| PT3004388T (pt) | 2013-05-29 | 2019-01-29 | Chronix Biomedical | Deteção e quantificação de dna livre de células do dador na circulação de recetores de transplante de órgão |
| WO2015069933A1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Circulating cell-free dna for diagnosis of transplant rejection |
| PT3108009T (pt) * | 2014-02-18 | 2021-05-10 | Illumina Inc | Métodos e composições para a criação de perfis de adn |
| ES2726650T3 (es) * | 2014-03-14 | 2019-10-08 | Caredx Inc | Métodos de monitorización de terapias inmunosupresoras en un receptor de trasplante |
| KR101850437B1 (ko) * | 2015-04-14 | 2018-04-20 | 이원다이애그노믹스(주) | 차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법 |
-
2018
- 2018-01-30 EP EP18154208.5A patent/EP3517629A1/en not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-01-29 US US16/963,355 patent/US11987844B2/en active Active
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