ES2964940T3 - Métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y vectores virales para su uso en la terapia de la misma - Google Patents

Métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y vectores virales para su uso en la terapia de la misma Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y vectores virales para su uso en la terapia de la misma
Antecedentes
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia en la sociedad occidental. A pesar de los intensos esfuerzos de investigación, su etiología precisa sigue siendo desconocida.
Se cree que la EA está provocada por una combinación de factores de riesgo genéticos y no genéticos, estando estos últimos probablemente mediados por mecanismos epigenéticos (Chouliaras Let al.,Epigenetic regulation in the pathophysiology of Alzheimer's disease. Progress in neurobiology 2010, 90:498-510; Sanchez-Mut JV y Graeff J, Epigenetic Alterations in Alzheimer's disease. Frontiers In Behavioral Neuroscience 2015, 9:347). Los factores de riesgo genéticos se investigan habitualmente mediante estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) que han identificado un número importante de loci asociados con la patología de la EA. Sin embargo, los GWAS tienden a dar como resultado fuertes asociaciones estadísticas de grandes porciones del genoma, para las cuales es difícil establecer una relación causal. Por el contrario, los estudios de asociación específicos de locus o de todo el epigenoma (EWAS) identifican alteraciones específicas de locus que proporcionan información mecanística para un gen de riesgo particular, pero carecen de la significación estadística de GWAS (Rakyan VKet al.,Epigenome-wide association studies for common human diseases. Nat Rev Genet. 2011, 12:529-41). Combinando ambos enfoques, recientemente ha sido posible identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que se correlacionan con alteraciones en los niveles de metilación del ADN, denominados loci de rasgos cuantitativos de metilación (mQTL), cuya importancia para enfermedades complejas está ahora empezando a reconocerse. Por ejemplo, se han notificado mQTL para el cáncer, la osteoartritis, la esclerosis múltiple, el trastorno de estrés postraumático y los trastornos obsesivo-compulsivo y bipolar, pero, hasta el momento, no para enfermedades neurodegenerativas tales como la EA, donde todavía se necesitan nuevos biomarcadores y, por tanto, nuevos métodos de pronóstico para identificar mejor a los pacientes con mal pronóstico en la EA.
La proteína 1 que contiene dominio de peptidasa M20 (PM20D1) es un gen codificante de proteína que se ha identificado de manera recurrente como mQTL (IPDGC y WTCCC2, A Two-Stage Meta-Analysis Identifies Several New Loci for Parkinson's Disease. Plos Genet. 2011) y loci de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL) (Grundberg Eet al.,Global Analysis of the Impact of Environmental Perturbation on cis-Regulation of Gene Expression. Plos Genet. 2011). Los SNP de mQTL PM20D1 asociados se conocen por Heyn Het al.2013 (Heyn Het al.,DNA methylation contributes to natural human variation. Genoma Res. 2013, 23(9):1363-72).
Hoy en día, aunque la patología final de la enfermedad de Alzheimer está bastante bien establecida, los métodos de diagnóstico y las modalidades de tratamiento eficaces siguen siendo, de hecho, difíciles de lograr debido a la compleja base biológica de la etiología y patogénesis de la enfermedad. Las técnicas de diagnóstico clínico para la enfermedad de Alzheimer actualmente se basan en el examen de individuos que presentan síntomas de demencia excluyendo otras posibles causas tales como depresión, mala nutrición, otras condiciones de demencia (por ejemplo, enfermedad de Parkinson con demencia) o interacciones farmacológicas. Estos métodos cualitativos e inespecíficos a menudo dejan a la EA mal diagnosticada o no reconocida hasta etapas posteriores de la enfermedad, cuando los tratamientos pueden ser menos eficaces. Hasta ahora, se han desarrollado pruebas genéticas, útiles para definir el proyecto de ensayo clínico, pero no capaces al 100 % de someter a prueba la patología a un solo nivel individual (Albertici Aet al.,Clinical, genetic, and neuroimaging features of Early Onset Alzheimer Disease: the challenges of diagnosis and treatment. Res. Alzheimer. 2014, 11 (10): 909 17). También se aplican técnicas de obtención de imágenes en gran medida en las pruebas de EA (Schindler SEet al.,Advances in diagnostic testing for Alzheimer disease. Mo Med. 2013, 110(5):401-5).
El documento WO 2014/009733 da a conocer dianas terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer. El documento FR-A-2929292 da a conocer la detección de la enfermedad de Alzheimer usando alteraciones genéticas o expresión de ARN.
Por tanto, existe la necesidad de pruebas de diagnóstico y biomarcadores específicos que sean predictivos de que un sujeto desarrolle EA y que puedan ayudar a establecer un pronóstico claro de la enfermedad.
Descripción
Diversas realizaciones de la presente descripción proporcionan métodos para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA. Resultarán evidentes áreas adicionales de aplicabilidad a partir de la descripción proporcionada en el presente documento. Debe entenderse que la descripción y los ejemplos específicos están previstos para fines de ilustración solo y no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas.
Descripción de las figuras
Las figuras de los dibujos descritas en el presente documento son para fines de ilustración solo y no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ningún modo. Las presentes enseñanzas se entenderán más completamente a partir de la descripción detallada y las figuras de los dibujos adjuntos en las que:
Figura 1: a) mapa de calor de genes metilados de manera diferencial identificados en las matrices de metilaciión de ADN GSE45775 Illumina 27K y muestras de hipocampo de EA (izquierda), y secuenciación con bisulfito de todo el genoma GSE57361 (WGBS) y muestras de corteza frontal de EA (derecha); b) diagrama de Venn que muestra que sólo PM20D1 esta comúnmente hipermetilada en ambos estudios.
Figura 2: visión general del locus rs708727-PM20D1. La región comprende varios genes, indicados por flechas. Debajo de los genes, la tasa de recombinación alcanza su punto máximo en el cuerpo del gen de PM20D1 que divide rs708727 y el promotor PM20D1 en dos bloques independientes de desequilibrio de ligamiento, según el mapa de recombinación HapMap CEU indicado a continuación. rs708727 (en un círculo), ubicado en el exón seis del gen vecino SLC41A1, está en desequilibrio de ligamiento con otros SNP del bloque, entre ellos rs708730, ubicado en el mismo gen SCL41A1. rs11540014 (en un círculo), ubicado en el promotor de PM20D1, está en desequilibrio de ligamiento con otros SNP de su propio bloque. La región metilada de manera diferencial (DMR) en el promotor PM20D1 está resaltada en negro.
Figura 3: a) rs708727 muestra una asociación dependiente de la dosis del alelo con la EA; b) rs708727 se correlaciona con los niveles de metilación del a Dn de PM20D1 en muestras de cerebro humano medidos mediante pirosecuenciación; c) rs708727 se correlaciona con la expresión de PM20D1 en muestras de cerebro humano medidas mediante PCR cuantitativa en tiempo real; d) rs1361754 está ubicado en la región codificante de PM20D1 y está en desequilibrio de ligamiento con rs708727. La secuenciación de Sanger por PCR con retrotranscripción de muestras heterocigotas para rs1361754 detecta transcritos de ARN de rs1361754 (T) pero no de rs1361754 (A), lo que indica que solo la cromátida rs708727 (G) está activa.
Figura 4: Análisis de asociación de EA de los SNP ubicados en ambos bloques de desequilibrio de ligamiento de la región promotora rs708727-PM20D1, a), b) los SNP de mQTL ubicados en la región de desequilibrio de ligamiento de rs708727 también están asociados con la EA. c), d) Los SNP ubicados en la región de desequilibrio de ligamiento del promotor PM20D1 no están asociados con la EA.
Figura 5: a) análisis de secuenciación con bisulfito de todo el genoma de la metilación del ADN en muestras de corteza frontal humana de GG y GA rs708727. Las diferencias en la metilación del ADN se limitan a la DMR detectada en el promotor PM20D1; b) secuenciación con bisulfito específica de locus de las regiones promotoras rs708727, SLC41A1 y PM20D1 que confirman los datos de pirosecuenciación y secuenciación con bisulfito de todo el genoma en muestras de corteza frontal humana de GG, GA y AA rs707827; c) expresión de SLC41A1 a partir de tres muestras heterocigotas diferentes, resultados obtenidos mediante secuenciación de Sanger por RT-PCR.
Figura 6: a) La metilación del ADN del promotor PM20D1 se correlaciona con los genotipos de rs708727 en células B inmortalizadas medidas mediante secuenciación con bisulfito/clonación; b) la metilación del ADN de la región rs708727 no se correlaciona con los genotipos de rs708727 en células B inmortalizadas medidas mediante secuenciación con bisulfito/clonación.
Figura 7: a) Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) que muestra una mayor unión de MeCP2 en muestras metiladas de rs708727 a A en la región promotora PM20D1; b) ChIP que muestra que la región promotora PM20D1 de las muestras de rs708727 Aa está agotada en H3K9ac; c) ChIP que muestra que la región promotora PM20D1 de las muestras de rs708727 AA está agotada en H3K14ac; d) Chip que muestra que la región promotora PM20D1 de las muestras de rs708727 AA está agotada en H4K12ac; e) ChIP que muestra una menor unión de la polimerasa-II en el promotor PM20D1; f) qRT-PCR que muestra niveles más bajos de ARN de PM20D1 en muestras de rs708727 AA.
Figura 8: a) marcas epigenéticas enriquecidas con potenciadores tales como monometilación de histona 3 lisina 4 (H3K4me1) y H3K27ac en líneas celulares para las cuales también estaba disponible el perfil de metilación del<a>D<n>usando ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements; ENCODE/Broad Histone Track para H3K4me1 y H3K27ac, y HAIB Mmethyl450 Track para las líneas celulares K562 y GS12878) que muestran un pico de H3K4me1 y H3K27ac a 10 kb aguas abajo de rs708727 en las células k562 no metiladas del promotor PM20D1, lo que sugiere la existencia de un potenciador activo dependiente de alelo. b) Ensayo de ChIP que muestra que H3K4me1 (izquierda) y H3K27ac (derecha) están enriquecidos en muestras de rs708727 (Gg ) en el locus potenciador de rs708727.
Figura 9: frecuencias relativas de interacción entre regiones en función de las distancias genómicas (en Kb) y el genotipo de rs708727.
Figura 10: Ensayo de ChIP que muestra la unión de CTCF en los loci de rs708727 (a) y en la región promotora PM20D1 (b).
Figura 11: una combinación de 5-aza/VPA restaura los niveles de expresión de ADN 3C (a) y PM20D1 (b).
Figura 12: Expresión de ARN de PM20D1 en áreas del cerebro de ratón afectadas y no afectadas por la EA. Figura 13: Expresión de ARN de PM20D1 a) en ratones wt y APP/PS1; b) en células de neuroblastoma, después de la exposición a factores de estrés relacionados con la EA tales como especies reactivas de oxígeno producidas por H2O2 y AP; c) en la corteza frontal corregida con el genotipo de rs708727 de muestras de EA humanas. Los datos se presentan como medias más error estándar. *p<0,05 mediante la prueba t de Student. Figura 14: a) se detecta PM20D1 sobreexpresado en cultivo primario de hipocampo en medios de cultivo; b) la transducción de PM20D1 disminuye los niveles de Ab en cultivos primarios de hipocampo. Los datos representan 15 experimentos emparejados diferentes realizados (transducción simulada frente a transducción de PM20D1) con tres producciones de lotes de virus diferentes (cinco experimentos por lote de virus). ***p<0,001; prueba t pareada.
Figura 15: a) ratones APP/PS1 sintomáticos (18 meses de edad) y b) enfermedad de Alzheimer (EA)postmortemen estadios avanzados de la enfermedad (Braak V) muestran una mayor inmunorreactividad de PM20D1 en las células gliales que rodean las placas de amiloide neuríticas; c) la sobreexpresión de PM20D1 en células SH-SY5Y aumenta la supervivencia celular tras el tratamiento con H<2>O<2>.
Correlación observada en muestras humanas
Los inventores analizaron el perfil epigenético (perfil de metilación de las histonas) en una cohorte ampliada de pacientes con EA. Se han analizado el hipocampo y la corteza frontal de muestras de EA. Estudios de EWAS identificaron sorprendentemente solo una única hipermetilación de ADN común a las muestras de hipocampo y corteza frontal analizadas, que consiste en una hipermetilación de PM20D1, tal como se notifica en la figura 1. A partir de esta observación, se han seleccionado los SNP de mQTL de PM20D1 previamente asociados (Heynet al.2013, citado anteriormente), notificados en la figura 2, para evaluar su relación, si la hay, con la EA. Se han examinado datos de una base de datos disponible pública de estudios de GWAS del NCBi (phs000168.v1.p1 NIA) ajustando una regresión logística univariada bayesiana con el fenotipo como resultado. Cabe señalar que los datos analizados se obtuvieron en una muestra de sangre. Se ha detectado una asociación significativa dependiente de la dosis de alelo del SNP rs708727 con la razón de probabilidades para desarrollar EA (tendencia P <0,001, figura 3a). En apoyo de esta observación, otros cuatro SNP de mQTL y eQTL de PM20D1 notificados, ubicados en la región de desequilibrio de ligamiento de rs708727, rs947211, rs708730, rs708724 y rs823130, también se correlacionaron con la EA (figuras 4a y b; tabla 1, en negrita), aunque no tan fuertemente. Tabla 1: Análisis de asociación con EA de eQTL del GTEX Consortium 2015, Science, incluidos en el phs000168.v1.p1 NIA - Late Onset AD and National Cell Repository for AD Family Study. También se indican los alelos mayor y menor y los datos de desequilibrio de ligamiento de la base de datos del SNAP Broad Institute.
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Por el contrario, los SNP ubicados en la región de desequilibrio de ligamiento del promotor PM20D1 no estaban asociados con la EA (figuras 4c yd; subrayados en la tabla 1). Sorprendentemente, rs708727, rs947211, rs708730, rs708724 y rs823130, y la región promotora PM20D1 están ubicados en dos regiones de desequilibrio de ligamiento independientes (HapMap, figura 2), excluyendo por tanto que la asociación de mQTL/eQTL fuera una mera consecuencia de un efecto de desequilibrio de ligamiento.
Al someter a prueba una muestra de corteza frontal, se observó una fuerte correlación en un haplotipo rs708727 y de manera dependiente de la dosis con la metilación del ADN de PM20D1 (figura 3b, valor P <0,0001; correlación de Pearson), pero también con los niveles de ARN de PM20D1 (figura 3c, valor P<0,0001; correlación de Pearson). Se han observado asociaciones similares en diferentes tejidos a niveles de ARN (datos no mostrados), lo que sugiere que la correlación es independiente del origen celular. Además, PM20D1 se expresa de manera monoalélica y solo es detectable en las cromátidas de rs708727 G en muestras heterocigotas (figura 3d). Como control, se ha evaluado la expresión de SLC41A1, ya que rs708727 se encuentra en la región codificante de SLC41A1 (figura 2). SLC41A1 no muestra diferencias en la metilación del ADN y su ARN puede detectarse en ambas cromátidas (figuras 5a, b, c). Tomados conjuntamente, estos hallazgos indican sorprendentemente que la metilación y expresión de PM20D1 dependen del SNP rs708727, y que tanto la regulación epigenética de PM20D1 como la variación genética en rs708727 están vinculadas con la EA.
Ensayos en células B inmortalizadas.
Se han inmortalizado células B a partir de portadores de rs708727 GG y AA. De manera similar a las muestras de la corteza frontal, el genotipo de rs708727 estaba asociado con los niveles de metilación del ADN de PM20D1 de una manera dependiente de la dosis de haplotipo (figura 6a), mientras que la metilación del ADN en la región rs708727 no difirió entre los genotipos (figura 6b). Se ha evaluado la unión de laproteína 2 de unión a metil CpG (MeCP2)y se observaron niveles de unión más altos en los portadores de rs708727 AA (figura 7a), en donde los portadores de rs708727 AA mostraron niveles más bajos de acetilación de histona 3 lisina 9 (H3K9ac) (figura 7b) y de H3K14ac y H4K12ac (figuras 7c y d), lo que estaba acompañado por una menor accesibilidad de la ARN polimerasa II (figura 7e) y una expresión reducida de ARN de PM20D1 (figura 7f), de acuerdo con la interacción conocida de MECP2 con la histona desacetilasa 1 (HDAC1; Suzukiet al.Direct association between PU.1 and MeCP2 that recruits mSin3A-HDAC complex for PU.1-mediated transcriptional repression. Oncogene 2003, 22).
La región genética del cromosoma 1 que abarca rs708727 y PM20D1 se ha examinado en busca de marcas epigenéticas enriquecidas con potenciadores, tales como la monometilación de histona 3 lisina 4 (H3K4me1) y H3K27ac en líneas celulares para las cuales el perfil de metilación del ADN también estaba disponible usando ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements; ENCoDE/Broad Histone Track para H3K4mel y H3K27ac, y HAIB Methyl450 Track para las líneas celulares K562 y GS12878). Se ha detectado un pico de H3K4me1 y H3K27ac a 10 kb aguas abajo de rs708727 en células K562 no metiladas con promotor PM20D1, lo que postula la existencia de un potenciador activo dependiente de alelo (figura 8a). En apoyo de esta observación, se ha observado un enriquecimiento de H3K4me1 y H3K27ac en muestras de rs708727 GG (figura 8b). Teniendo en cuenta que los potenciadores a menudo interaccionan físicamente con sus promotores diana (Whalen Set al.Enhancerpromoter interactions are encoded by complex genomic signatures on looping chromatin. Nature Genetics 2016, 48:488-496), se ha realizado un ensayo de captura de conformación de cromatina (3C) en células B portadoras de rs708727 GG (cuadrado) y AA (círculo). Se ha descubierto que la región promotora PM20D1 interacciona con la región rs708727, pero también esta interacción era dependiente del genotipo de rs708727 y estaba debilitada en el genotipo transcripcionalmente silencioso de PM20D1 (AA) (figura 9). En línea, el factor de unión a CCCTC (CTFC), que es responsable de más del 90 % de los bucles de ADN en genomas de mamíferos y se ve afectado negativamente por la metilación del ADN, mostró una unión reducida a las regiones rs708727 y PM20D1 en portadores de AA (figura s10a, b).
Entonces, las células B se trataron con el agente desmetilante del ADN 5-azacitidina-dC (5-aza) en combinación con el inhibidor de histona desacetilasa ácido valproico (VPA). El tratamiento con 5-aza/VPA restauró la unión a CTFC y permitió que se reformara el bucle de cromatina rs708727-PM20D1 (figura 11a). Además, el tratamiento aumentó la expresión del ARN de PM20D1 (figura 11 b).
Los experimentos notificados demuestran claramente una interacción de cromatina tridimensional dependiente del genotipo entre la región rs708727, con características similares a las de un potenciador, y la región promotora de PM20D1, que muestra una expresión diferencial dependiente del genotipo y del bucle.
Correlación observada en el modelo de ratón de EA.
Se ha usado el modelo de ratón APP/PS1 de EA ampliamente usado. Según la base de datos de ratones Allen Brain Atlas, las áreas del cerebro afectadas y no afectadas por la EA se han separado y sometido a prueba para determinar los niveles de expresión del a Rn de PM20D1. Los datos obtenidos se notifican en la figura 12, indicando una mayor expresión en las regiones del cerebro afectadas por EA.
Luego se ha analizado la corteza frontal en ratones wt y APP/PS1, a los 3 y 18 meses. A los 3 meses, los ratones APP/PS1 son presintomáticos y no se observan diferencias en la expresión de PM20D1. A los 18 meses, los ratones APP/PS1 son sintomáticos y se observa una diferencia significativa, donde la expresión de PM20D1 está aumentada en la EA (figura 13a y figura 15a), mostrando la inmunorreactividad más fuerte para PM20D1 la célula glial que rodea las placas de amiloide neuríticas (figura 15a).
Ensayo en células de neuroblastoma SH-SY5Y
Se expusieron células SH-SY5Y a estímulos ampliamente usados para imitar el ataque intracerebral de la EA, es decir, estrés oxidativo y p-amiloide. Las células se trataron con H<2>O<2>al 0,02 % o con Ap 50 uM durante 6 horas. Antes y después del tratamiento, se evaluaron los niveles de expresión de PM20D1. Los resultados, notificados en la figura 13b, indican un aumento inducido por estímulos en la expresión de PM20D1.
La sobreexpresión de PM20D1 aumenta la supervivencia celular
Se sobreexpresó PM20D1 en células SH-SY5Y, luego se expusieron a estímulo con H<2>O<2>al 0,02 %. Se evaluó la viabilidad celular. Los datos, que se muestran en la figura 15c, demuestran que la sobreexpresión de PM20D1 aumenta la supervivencia celular tras el tratamiento con H<2>O<2>.
Estos datos sugieren que PM20D1 aumenta en las células gliales en respuesta a la presencia de placas de amiloide neuríticas y podría aumentar la supervivencia neuronal en respuesta a especies reactivas de oxígeno que están asociadas con la EA.
Expresión de PM20D1 en muestras humanas.
Se analizo la expresión del ARN de PM20D1 en una base de datos disponible públicamente de estudios de expresión del NCBI (GSE330000). Las muestras de EA representadas mostraron niveles más bajos de PM20D1 con respecto a las muestras de control (log del cambio en veces -0,0195; valor P<0,05). Estos datos confirman la correlación de AA rs708727 y AD, en donde PM20D1 se expresa de manera monoalélica y solo es detectable a partir de las cromátidas de rs708727 G en muestras heterocigotas (figura 3d). Luego se analizaron las muestras de corteza frontal recogidas y genotipadas. Después de la corrección del genotipo, se observó un aumento de la expresión de PM20D1 en muestras de EA, en línea con la observación en el modelo de ratón con EA ein vitro(figura 13c) y que demuestra que los portadores de rs708727 G regulan por incremento PM20D1 en la EA. Cuando se ha evaluado PM20D1 en la enfermedad de Alzheimer (EA)postmortemen estadios avanzados de la enfermedad (Braak V), se observó un aumento de la inmunorreactividad de PM20D1 en las células gliales que rodean las placas de amiloide neuríticas (figura 15b).
Niveles de Ap tras la sobreexpresión de PM20D1
Se cultivaron cultivos primarios de hipocampo obtenidos de ratones P0 APPswe/PSldE9 (Borcheltet al.1997) en medios que consistían en Neurobasal (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), L-glutamina (Invitrogen) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen) (0,2 ml por pocillo) en placas de 96 pocillos (2,5 * 10A4 células/pocillo) recubiertas con poli-L-lisina Cultrex (Trevigen). En el díain vitro(DIV) 5, las células se trataron con p-D-arabinofuranósido de citosina (AraC, 2 nM) para inhibir la división de células gliales y se infectaron en DIV5 con 10-40 * 10A3 (100-400 ng/pocillo) de partículas virales que contenían una versión simulada o con PM20D1 del plásmido. En DIV12, se recogieron los medios de los 96 pocillos y se midieron usando el kit de ELISA de Ap 40, humano (Novex). PM20D1 contiene un péptido señal de secreción N-terminal. Se secreta activamente y puede detectarse en los medios de cultivo (figura 14a). Después de la sobreexpresión de PM20D1, se ha observado una disminución significativa de Ap soluble, con respecto al cultivo neuronal infectado de control (figura 14b), lo que indica que PM20D1 actúa como una enzima degradante de Ap directa o indirecta.
Siguiendo las sorprendentes observaciones descritas anteriormente, se describen en el presente documento métodos de diagnóstico para determinar un estado de EA. También se describe un enfoque terapéutico novedoso. Estos métodos comprenden las etapas de colocar una muestra sobre un sustrato que marca la muestra para identificar al menos un marcador epigenético y/o variación genética; realizar un análisis estadístico multivariado para producir un valor de salida; comparar el valor de salida con un valor de referencia; y determinar un estado de la enfermedad de Alzheimer, en donde uno de dichos marcadores epigenéticos es la metilación del ADN del promotor PM20D1 y/o una de dicha variación genética es al menos un SNP asociado a mQTL de PM20D1, en donde dichos S<n>P se seleccionan de rs708727 y/o rs947211 y/o rs708730 y/o rs708724 y/o rs823130.
En una realización más preferida, dicho marcador epigenético es la metilación del ADN del promotor PM20D1, en donde un aumento en los niveles de metilación está asociado con un diagnóstico de EA.
En una realización preferida adicional, dicho SNP está en rs708727, en donde el haplotipo AA está asociado con un diagnóstico de E<a>y/o en rs947211 en donde el haplotipo GG está asociado con un diagnóstico de EA y/o en rs708730 en donde el haplotipo AA está asociado con un diagnóstico de EA y/o en rs708724 en donde el haplotipo CC está asociado con un diagnóstico de EA y/o en rs823130 en donde el haplotipo TT está asociado con un diagnóstico de EA.
En una realización adicional, se describe en el presente documento un método que comprende las etapas de identificar la expresión del ARN de PM20D1 en una muestra; determinar el nivel de expresión y comparar el valor con un valor de referencia; y determinar un estado de la enfermedad de Alzheimer. Opcionalmente, dicha muestra se corrige por genotipo y, en donde dicha muestra es un portador de G rs708727, una expresión aumentada de ARN de PM20D1 es indicativa de EA.
En una realización preferida adicional, la variación genética es un SNP en rs708727.
Todavía más preferiblemente, la variación genética va acompañada de un marcador epigenético que es un aumento de la metilación del ADN del promotor PM20D1.
Preferiblemente, para el objetivo de la presente invención, la muestra se selecciona de uno de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de mucosas, biopsia de tejido, secreción lagrimal, semen o sudor.
La presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un proceso conocido por el experto en la técnica, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en secuenciación directa, hibridación de sondas específicas de alelo, extensión de cebadores específicos de alelo, amplificación específica de alelo, incorporación de nucleótidos específicos de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de balizas moleculares, ensayo de ligamiento de oligonucleótidos, análisis de tamaño y polimorfismo de conformación monocatenario. En una realización adicional, se emplean electroforesis, cromatografía, espectroscopia de masas, digestión proteolítica, secuenciación de proteínas, ensayo de inmunoafinidad o una combinación de los mismos. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la muestra se amplifican antes de determinar la presencia de una o más variaciones genéticas.
En una realización preferida adicional, el método de diagnóstico comprende además someter al sujeto a una o más pruebas de diagnóstico adicionales para EA seleccionadas del grupo que consiste en examen de uno o más marcadores genéticos/epigenéticos adicionales, administrar un examen del estado mental o someter al sujeto a procedimientos de obtención de imágenes.
En una realización adicional, se describe un método para ayudar al pronóstico de un subfenotipo de EA en un sujeto, comprendiendo el método detectar en una muestra biológica derivada del sujeto la presencia de un SNP en rs708727, en donde el portador de G rs708727 se caracteriza por niveles de expresión aumentados de PM20D1 en una muestra biológica derivada del sujeto en comparación con uno o más sujetos de control.
En una realización, se administra un vector viral que codifica para PM20D1 a un sujeto que lo necesita. Alternativamente, se usa una proteína PM20D1 recombinante.
El enfoque descrito es particularmente adecuado en un subfenotipo de EA caracterizado por un SNP en rs708727, en donde dicho subfenotipo de EA son sujetos portadores de G en rs708727.
En una realización adicional, la presente solicitud describe y reivindica el uso de un kit que comprende un conjunto de sondas moleculares para el diagnóstico o pronóstico de EA que comprende al menos una sonda capaz de detectar directa o indirectamente al menos un marcador seleccionado del grupo que comprende: un SNP en rs708727 y/o en rs947211 y/o en rs708730 y/o rs708724 y/o rs823130. Preferiblemente, dicho conjunto comprende además una o más sondas capaces de detectar directa o indirectamente una metilación del ADN en el promotor PM20D1.
Material y método
Datos de GWAS
Se obtuvieron datos públicos de GWAS de la base de datos NCBI GEO (phs000168.v1.p1 NIA Late Onset AD and National Cell Repository for AD Family Study). Los SNP seleccionados se extrajeron usando el software PLIN v1.07 (Purcell Set al.,PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 2007; 81(3):559-75) y la relación con EA mediante ajuste de regresión logística univariada bayesiana usando bayesglm (Gelman A, Su YS. 2013. arm: Data analysis using regression and multilevel/hierarchical models. R package versión 1.6-09) con el fenotipo como resultado y estimaciones de puntos e intervalos de activos que codifican el genotipo como variable categórica y la prueba de dosificación de alelo (p para tendencia) que codifica el genotipo como factor ordenado. El equilibrio de Hardy-Weinberg y la prueba alélica se realizaron tal como se notificó anteriormente (Guedj Met al.,A fast, unbiased and exact allelic test for case-control association studies. Human Heredity 2006, 61:210-221). Los datos de desequilibrio de ligamiento se obtuvieron de la base de datos del SNAP Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/mpg/snap/ldsearch.php) y de las pistas de UCSC para el mapa de recombinación HapMap versión 24 CEU y el desequilibrio de ligamiento de HapMap -Fase II de genotipos en fase. Los perfiles de H3K27ac en capas se obtuvieron de las líneas celulares UCSC H3K27ac7 ENCODE track.
Datos de EWAS
Se obtuvieron datos públicos de EWAS de la base de datos NCBI GEO (GSE45775 y GSE57361) y se analizaron utilizando el software R (//www.Rproject.org) tal como se describió anteriormente (Sanchez-Mut JVet al.,2015 citado anteriormente). Brevemente, los datos de GSE45775 Infinium HumanMethylation27 BeadArray 27K (Illumina) se normalizaron por cuantiles usando el paquete lumi y se analizaron con el paquete Genefilter (Bioconductor). Se definieron DMR mediante dos o más sondas que notificaban constantemente cambios en la metilación del ADN. Los datos de secuenciación con bisulfito de todo el genoma de GSE57361 se alinearon usando el software Bismark (Krueger F y Andrews SR, Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 2011; 27(11):1571 -2) y se analizaron con los paquetes SAMtools (Li Het al.,The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009; 25(16):2078-9), Bedtools (Quinlan AR y Hall IM, BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics 2010, 26(6):841-842), Tabix (Li H Tabix: fast retrieval of sequence features from generic TAB-delimited files. Bioinformatics 2011, 27(5):718-719) y ggplot2. Se identificaron DMR buscando regiones con más de cinco sitios CpG consecutivos ubicados de manera constante fuera del intervalo de confianza del 95 % del perfil de metilación suavizado.
Muestras de cerebro
Se obtuvieron tejidospostmortemdel biobanco IDIBELL. Las muestras se diseccionaron y se caracterizaron para el estadio de Braak antes de un examen adicional. Se extrajeron ADN y ARN de muestras de materia gris de la corteza frontal para experimentos posteriores. Solo se incluyeron en el estudio muestras con RIN > 6,5 según la prueba de calidad de ARN desarrollada usando el bioanalizador Agilent 2100. De estas muestras seleccionadas, se obtuvieron ADN y ARN de materia gris de la corteza frontal (área de Brodmann 9), de 22 controles (Braak 0---II; 32%de mujeres; edad 64 ± 3 años, media ± EEM) y 23 con enfermedad de Alzheimer (Braak V—VI; 43%de mujeres; edad 77 ± 2 años, media ± EEM), donde las muestras eran de edad y sexo coincidentes.
Metilación del ADN
Se aisló ADN de muestras de cerebro humanopostmortemmediante extracción con fenol-cloroformo y se convirtieron con bisulfito usando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research) según Bibikovaet al.(2009) con modificaciones menores. Los cebadores para la clonación/secuenciación con bisulfito se diseñaron usando Methyl Primer Express, versión 1.0 (Applied Biosystems), y los productos de PCR se clonaron en el vector de secuenciación pGEMT-easy (Promega) y se secuenciaron por Sanger. Los cebadores para la pirosecuenciación se diseñaron usando el programa de diseño de ensayos PyroMark, versión 2.0.01.15 (Qiagen), y las reacciones de pirosecuenciación se analizaron usando el sistema PyroMark Q24 versión 2.0.6 (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Expresión de ARN
La purificación de ARN total y el tratamiento con ADNasa se realizaron usando TRIzol (Invitrogen) y el kit Turbo DNA Free (Ambion). El ARN se transcribió de manera inversa usando el sistema de RT-PCR Thermoscript (Invitrogen) y la PCR se ejecutó usando el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) y SYBR Green PCR MasterMaster Mix (Applied Biosystems). Las eficiencias de PCR se calcularon usando diluciones estándar y el software LinReg (Ruijteret al.,2009) y tres genes de mantenimiento (GUSB, RPL38 y TBP) para normalizar las señales de PCR.
Captura de conformación cromosómica
El protocolo de captura de conformación de cromatina (3C) se adaptó de Courtet al.,2011. En resumen, las células se reticularon durante 5 minutos con formaldehído al 2 %, se bloquearon durante 5 minutos con glicina 125 mM y se lisaron usando una disolución tampón hipotónica (sacarosa 0,25 M, KCl 25 mM, MgCl2 5 mM, TrisHCl 20 mM, pH 7,5). Los núcleos se resuspendieron en tampón CutSmart (New England Biolabs) y se permeabilizaron con Triton X100 al 0,2 %. La cromatina se digirió durante la noche con HindIII (New England Biolabs) y se ligó durante la noche en condiciones diluidas con ADN ligasa T4 (New England Biolabs). Luego se revirtieron las reticulaciones durante la noche a 65 °C con NaCl 200 mM y se trató con proteína K. El ADN se purificó con fenol-cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en TE. Se usó BAC RRP11-219P13 (CHORI) para analizar todos los posibles productos de 3C y las eficiencias de la PCR de cebador, y la eficiencia del ligamiento de proximidad y la concentración de ADN para normalizar las señales de 3C.
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina.
Los experimentos de ChIP se adaptaron de Graffet al.,2012. Brevemente, las células se reticularon durante 10 minutos con formaldehído al 1 %, se bloquearon durante 5 minutos con glicina 125 mM y se lisó el citoplasma usando tampón de lisis celular (HEPES 5 mM, KCl 85 mM, NP40 al 0,5 %, pH 8). Los núcleos se lisaron con tampón de lisis nuclear (TrisHCl 50 mM, EDTA 10 mM, SDS al 1%, pH 8) y se sonicaron hasta un tamaño promedio de -300 pb con EpiSonic Multi Functional Bioprocessor 1100 (EpiGentek). Se inmunoprecipitó un total de 5-20 |ig por muestra y reacción de ChIP durante la noche a 4 °C con anticuerpos frente a H3K9ac (abcam), H3K14ac (abcam), H3K27ac (abcam), H4K12ac (abcam), CTCF (Millipore), MeCP2 (Sigma) y polimerasa II (abcam) en estado diluido. Luego se aisló la cromatina inmunoprecipitada utilizando Dynabeads de IgG (Life Sciences) y se lavó dos veces con tampón de bajo contenido en sal (NaCl 150 mM, SDS al 0,1 %, NP40 al 1 %, EDTA 1 mM, DeoNa al 0,5 %, TrisHCl 50 mM, pH 8), tampón de alto contenido en sal (NaCl 500 mM, SDS al 0,1 %, NP40 al 1 %, EDTA 1 mM, DeoNa al 0,5 %, TrisHCl 50 mM, pH 8), tampón de litio (LiCl 2250 mM, SDS al 0,1 %, NP40 al 1 %, EDTA 1 mM, DeoNa al 0,5%, TrisHCl 50 mM, pH 8) y tampón TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 0,25 mM, pH 8). Los complejos de cromatina se eluyeron con una disolución de NaHCO30,1 M y SDS al 1 %, y se desreticularon durante la noche a 65 °C con NaCl 200 mM y proteinasa K. El ADN se extrajo con fenolcloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 50 |il de TE. La PCR se llevó a cabo por triplicado usando SYBR Green PCR MasterMaster Mix (Applied Biosystems). Condiciones de termociclado: 10 min 95 °C; 50 ciclos, 15 s 95 °C; 1 minuto 60 °C. Las señales fluorescentes se adquirieron mediante el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). Los valores se normalizaron con respecto a la entrada total de ADN.
Clonación
Se clonó PM20D1 humano (AK057131.1) a partir de una biblioteca de ADNc de oligodT derivado de células de neuroblastoma SH SY5Y. El potenciador Rs708727 se clonó a partir de ADN de células B inmortalizadas. Para PM20D1, se usaron los cebadores directo 5'---AAAAGAATTCGCCACCATGGCTCAGCGGTGC---3' (SEQ ID No.
1) e inverso 5'-CAAGGGATCCAGATGTCGGGAGGAAGGG---3' (SEQ ID No. 2), que contenían sitios de digestión con EcoRI y NotI respectivamente. Para el potenciador rs708727, se utilizaron los cebadores directo 5'-AGTAGGTACCCTTAGCTTAGCCATGTCATAGCCTTC---3' (SEQ ID No. 3) e inverso 5'-CGACGCGTCGATATTGGTTTACTCTCGTATCCTTAAAAAG---3' (SEQ ID No. 4), que contenían sitios de digestión con KpnI y MluI, respectivamente. Los transgenes se amplificaron con ADN polimerasa Prime STAR Max de alta fidelidad (Takara) según las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se clonaron en pGEMT easy (Promega) para amplificar el rendimiento. Los insertos se liberaron mediante digestiones con EcoRI y NotI, y KpnI y MluI (New England Biolabs) y se ligaron en el vector pLVX-IRES ZsGreen1 (Promega) y en el vector indicador de luciferasa pGL3-promoter (Promega), respectivamente. Todos los plásmidos clonados se verificaron mediante secuenciación de Sanger.
Ensayos de luciferasa
Se transfectaron células HEK293T con el vector indicador de luciferasa pGL3-promoter (Promega) que contenía potenciador simulado o rs708727 usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Después de dos días, las células se lisaron y se midió la actividad del potenciador usando el sistema de ensayo Luciferase (Promega E1500) según las instrucciones del fabricante.
Producción lentiviral
Se produjeron vectores lentivirales en células HEK293T utilizando un sistema de empaquetado de tercera generación mediante transfección con fosfato cálcico con los siguientes plásmidos: pMD2.G (2,5 |ig), psPAX2 (7,5 'g) y vector pLVX-IRES ZsGreen1 que contenía PM20D1/secuencia simulada (10 |ig). Después de cuatro días, se recogió el medio y se centrifugó en un rotor de ultracentrífuga SW32Ti a 19.000 rpm durante 90 minutos a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 120 |il de tampón que contenía PBS 1X, pH 7,4 y BSA al 0,5% para una disolución madre de virus concentrada 50X. El título viral se determinó usando el kit de ELISA del antígeno p24 de VIH-1 (Zeptometrix Corp).

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Método para el diagnóstico o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende las etapas de colocar una muestra aislada de una persona que se sospecha que tiene enfermedad de Alzheimer sobre un sustrato que marca la muestra para identificar al menos un marcador epigenético y/o variación genética y determinar un estado de la enfermedad de Alzheimer, en donde uno de dichos marcadores epigenéticos es un aumento o una disminución de la metilación del ADN del promotor PM20D1 y/o una de dicha variación genética está en al menos uno de los SNP asociados a mQTL de PM20D1, que es un SNP en rs708727 y/o rs947211 y/o rs708730 y/o rs708724 y/o rs823130.
2. Método según la reivindicación 1, en donde dicha al menos una variación genética es un alelo AA en rs708727 y/o un alelo GG en rs947211 y/o un alelo AA en rs708730 y/o un alelo CC en rs708724 y/o un alelo TT en rs823130.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha al menos una variación genética es un SNP en rs708727.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra se selecciona de uno de líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, esputo, saliva, raspado de mucosas, biopsia de tejido, secreción lagrimal, semen o sudor.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la presencia de una o más variaciones genéticas se lleva a cabo mediante un proceso seleccionado del grupo que consiste en secuenciación directa, hibridación de sondas específicas de alelo, extensión de cebadores específicos de alelo, amplificación específica de alelo, incorporación de nucleótidos específicos de alelo, digestión con nucleasa 5', ensayo de balizas moleculares, ensayo de ligamiento de oligonucleótidos, análisis de tamaño, polimorfismo de conformación monocatenario, electroforesis, cromatografía, espectroscopia de masas, digestión proteolítica, secuenciación de proteínas, ensayo de inmunoafinidad, o una combinación de los mismos.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además someter al sujeto a una o más pruebas de diagnóstico adicionales para la enfermedad de Alzheimer seleccionadas del grupo que consiste en examinar uno o más marcadores genéticos/epigenéticos adicionales, administrar un examen del estado mental o someter al sujeto a procedimientos de obtención de imágenes.
7. Vector viral que codifica PM20D1, y/o proteína PM20D1 recombinante, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
8. Vector viral y/o proteína PM20D1 recombinante para su uso según la reivindicación 7, en donde dicho tratamiento se administra a un subfenotipo de la enfermedad de Alzheimer, en donde dicho subfenotipo de la enfermedad de Alzheimer son sujetos portadores de G en rs708727.
9. Uso de un kit para diagnosticar o pronosticar enfermedad de Alzheimer según el método de la reivindicación 1, comprendiendo el kit al menos una sonda capaz de detectar directa o indirectamente al menos una variación genética seleccionada del grupo que comprende: un SNP en rs708727 y/o en rs947211 y/o en rs708730 y/o en rs708724 y/o rs823130.
10. Uso según la reivindicación 9, comprendiendo el kit además una o más sondas capaces de detectar directa o indirectamente una metilación del ADN en el promotor PM20D1.
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