ES2964927T3

ES2964927T3 - Composiciones para el tratamiento de plantas

Info

Publication number: ES2964927T3
Application number: ES20206305T
Authority: ES
Inventors: Rachel Didonato Floro; Justin Lee; Gregg Bogosian; Doug Bryant
Original assignee: NewLeaf Symbiotics Inc
Current assignee: NewLeaf Symbiotics Inc
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2024-04-10
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: US20210186026A1; BR122019022021B1; EP3797595B1; US10945441B2; AU2018250519A1; EP3076792B1; WO2015085063A1; EP3797595A1; CA2932891A1; AU2014360414A1; US20190116803A1; US20160302425A1; EP4289274A3; ES2851384T3; AU2014360414B2; EP4289274A2; UA121377C2; US10212939B2; EP3076792A1; AU2018250519B2

Abstract

La presente invención proporciona tanto composiciones que comprenden Mmethylobacterium como composiciones que comprenden Mmethylobacterium que están empobrecidas en sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla de lechuga. También se proporcionan métodos para mejorar la producción de lechuga, métodos para preparar las composiciones y métodos para tratar una planta o semilla de lechuga con las composiciones que comprenden Mmethylobacterium. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para el tratamiento de plantas

Estado de la técnica

Los compuestos orgánicos de un carbono tales como metano y metanol se encuentran ampliamente en la naturaleza y son utilizados como fuentes de carbono por bacterias clasificadas como metanótrofos y metilótrofos. Las bacterias metanotróficas incluyen especies de los génerosMethylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum,yMethylocella(Lidstrom, 2006). Los metanótrofos poseen la enzima metano monooxigenasa, que incorpora un átomo de oxígeno de O2 en metano, formando metanol. Todos los metanótrofos son usuarios obligados de un carbono que no pueden utilizar compuestos que contengan enlaces carbono-carbono. Por otra parte, los metilótrofos también pueden utilizar compuestos orgánicos más complejos, tales como ácidos orgánicos, alcoholes superiores, azúcares y similares. Por tanto, las bacterias metilotróficas son metilótrofos facultativos. Las bacterias metilotróficas incluyen especies de los génerosMethylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Ancylobacter(también conocida comoMicrocyclus), Thiobacillus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Acetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Arthobacter,yNocardia(Lidstrom, 2006).

La mayoría de las bacterias metilotróficas del géneroMethylobacteriumtienen pigmentación rosa. Se les conoce convencionalmente como bacterias PPFM, ya que son metilótrofos facultativos con pigmentación rosa. Green (2005, 2006) identificó doce especies validadas en el géneroMethylobacterium,específicamente MM. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum,yM. zatmanii.Sin embargo,M. nidulanses una metilobacteria fijadora de nitrógeno que no es una PPFM (Syet al.,2001). Las metilobacterias son de naturaleza ubicua, encontrándose en el suelo, el polvo, el agua potable, sedimentos y superficies foliares, así como entornos industriales y clínicos (Green, 2006).

El documento WO200060052 divulga un método de alteración del metabolismo vegetal tratando las semillas de la planta con una metilobacteria mutante seleccionada por sus capacidades de alteración de la planta.

Abanda-Nkpwattet al.(J. Exper. Botany, 57(15):4025-4032, 2006) describen un aislado deMmethylobacterium extorquensde fresa con efectos promotores del crecimiento en tomate(L. exculentum),fresa(F. vesca),tabaco(N. tabacum) y mostaza (S. alba).

Jeounghyun Ryuet al.informan sobre los efectos del tratamiento de las semillas con CBMB20 y CBMB 110 sobre la longitud de las raíces de tomate y pimiento rojo.

Objeto de la invención

La invención se refiere a la materia objeto de las reivindicaciones.

En el presente documento se divulgan composiciones que comprenden la cepa NLS0017 deMmethylobacterium.En determinados aspectos de la divulgación, la composición se usa para tratar una semilla de lechuga.

En el presente documento se divulgan composiciones que comprenden: (i) una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma o (ii) una emulsión con metilobacteria que ha crecido en la misma, en la que dicha metilobacteria es NLS0017 (NRRL B-50931) y un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma tiene un valor cuantitativo de metilobacteria de al menos aproximadamente 5 x 108 UFC/g a al menos aproximadamente 1 x 1014 UFC/g.

También se divulga una metilobacteria NLS0017 aislada (NRRL B-50931)

También se divulgan composiciones que comprenden: (i) una metilobacteria NLS0017 aislada (NRRL B-50931 y (ii) un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos. También se divulgan plantas, partes de plantas y semillas de plantas que están recubiertas o parcialmente recubiertas con una cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, una planta de lechuga, parte de una planta de lechuga o semilla de una planta de lechuga está recubierta o recubierta parcialmente con las composiciones mencionadas anteriormente.

Descripción detallada de la invención

Como se usan en el presente documento, las frases "adherido a la misma" y "adherente" se refieren a metilobacterias que se asocian con una sustancia sólida por crecer, o haber crecido, sobre una sustancia sólida. Como se usa en el presente documento, la frase "adyuvante agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia que potencia el rendimiento de un agente activo en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de plantas. En determinadas composiciones, un agente activo puede comprender un monocultivo o cocultivo de metilobacterias.

Como se usa en el presente documento, la frase "excipiente agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia esencialmente inerte que puede utilizarse como diluyente y/o vehículo para un agente activo en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de plantas. En determinadas composiciones, un agente activo puede comprender un monocultivo o cocultivo de metilobacterias.

Como se usa en el presente documento, el término "metilobacteria" se refiere a bacterias que son metilótrofos facultativos del géneroMethylobacterium.Por lo tanto, el término metilobacteria, tal como se utiliza en el presente documento, no incluye especies de los génerosMethylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum,yMethylocella,que son metanótrofos obligados. Como se usa en el presente documento, la frase "cocultivo de metilobacterias" se refiere a un cultivo de metilobacterias que comprende al menos dos cepas de metilobacterias o al menos dos especies de metilobacterias. Como se usa en el presente documento, la frase "microorganismo contaminante" se refiere a microorganismos en un cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición que no se identificaron antes de la introducción en el cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición.

Como se usa en el presente documento, la frase "derivados de los mismos", cuando se usa en el contexto de un aislado de metilobacteria, se refiere a cualquier cepa que se obtiene del aislado de metilobacteria. Los derivados de un aislado de metilobacteria incluyen, entre otras, variantes de la cepa obtenidas por selección, variantes de la cepa seleccionadas por mutagénesis y selección, y cepas transformadas genéticamente obtenidas del aislado de metilobacteria.

Como se usa en el presente documento, el término "emulsión" se refiere a una mezcla coloidal de dos líquidos inmiscibles en la que un líquido es la fase continua y el otro líquido es la fase dispersa. En determinados aspectos de la divulgación, la fase continua es un líquido acuoso y la fase dispersa es un líquido que no es miscible, o parcialmente miscible, en el líquido acuoso.

Como se usa en el presente documento, la frase "esencialmente libre de microorganismos contaminantes" se refiere a un cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición donde al menos aproximadamente un 95 % de los microorganismos presentes por cantidad o tipo en el cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición son la metilobacteria deseada u otros microorganismos deseados de identidad predeterminada.

Como se usa en el presente documento, la frase "sustancia sólida inanimada" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas y que no está viva o que no es parte de un organismo todavía vivo del que se obtuvo.

Como se usa en el presente documento, la frase "monocultivo de metilobacteria" se refiere a un cultivo de metilobacteria que consiste en una única cepa de metilobacteria.

Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere a cualquier polipéptido de 50 residuos de aminoácidos o menos.

Como se usa en el presente documento, el término "lechuga" se refiere a plantas deLactuca sp.Las plantas deLactuca sp.incluyen, entre otras, las especiesLactuca biennis, Lactuca canadensis, Lactuca floridana, Lactuca graminifolia, Lactuca hirsuta, Lactuca indica, Lactuca ludoviciana, Lactuca saligna, Lactuca sativa, Lactuca serriola, Lactuca terrae-novae, Lactuca virosa,yLactuca Xmorssii.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína" se refiere a cualquier polipéptido que tenga 51 o más residuos de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, un "plaguicida" se refiere a un agente que es insecticida, fungicida, nematicida, bactericida o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la frase "agente bacteriostático" se refiere a agentes que inhiben el crecimiento de bacterias, pero no las destruyen.

Como se usa en el presente documento, la frase "plaguicida que no inhibe sustancialmente el crecimiento de dicha metilobacteria" se refiere a cualquier plaguicida que cuando se proporciona en una composición que comprende un producto de fermentación que comprende una sustancia sólida en la que un monocultivo o cocultivo de metilobacteria se adhiere a la misma, produce no más de un 50 % de inhibición del crecimiento de metilobacteria cuando la composición se aplica a una planta o parte de una planta en comparación con una composición que carece del plaguicida. En determinados aspectos de la divulgación, el plaguicida produce no más de un 40 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de inhibición del crecimiento de metilobacteria cuando la composición se aplica a una planta o parte de una planta en comparación con una composición que carece del plaguicida.

Como se usa en el presente documento, la expresión "bacterias PPFM" se refiere, entre otras, a especies bacterianas del géneroMmethylobacteriumdistintas deM. nodulans.

Como se usa en el presente documento, la frase "sustancia sólida" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas.

Como se usa en el presente documento, la frase "fase sólida que puede suspenderse en la misma" se refiere a una sustancia sólida que puede distribuirse por todo un líquido mediante agitación.

Como se usa en el presente documento, la expresión "no regenerable" se refiere a una parte de una planta o producto vegetal procesado que no puede regenerarse en una planta completa.

Como se usa en el presente documento, la frase "sustancialmente toda la fase sólida se suspende en la fase líquida" se refiere a un medio en el que al menos un 95 %, 98 % o 99 % de la(s) sustancia(s) sólida(s) que comprende(n) la fase sólida(s) se distribuyen por todo el líquido mediante agitación.

Como se usa en el presente documento, la frase "sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida" se refiere a un medio en el que al menos un 5 %, 2 % o 1 % del sólido está en una forma de partículas que se distribuye por todo el medio mediante agitación.

Como se usa en el presente documento, la frase "microorganismo residente" se refiere a bacterias, hongos o levaduras residentes.

Como se usa en el presente documento, la frase "sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla" se refiere a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas.

Composiciones que contienen metilobacterias reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de uso y métodos de preparación

En el presente documento se describen composiciones quecomprenden metilobacteriasque están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de uso de las composiciones para mejorar la producción de lechuga y métodos de preparación de las composiciones. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la composición comprende una sustancia sólida en la que un monocultivo o cocultivo de metilobacteria se adhiere a la misma. En determinados aspectos de la divulgación donde la metilobacteria se adhiere a una sustancia sólida, la composición comprende un coloide formado por la sustancia sólida en la que un monocultivo o cultivo de metilobacteria se adhiere a la misma y un líquido. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide es un gel. En determinados aspectos de la descripción de determinadas composiciones mencionadas anteriormente, la composición es una emulsión que no contiene una sustancia sólida.

Se divulgan composiciones que comprenden una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, la metilobacteria adherente puede tener un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 5 x 108 UFC/g a al menos aproximadamente 5 x 1013 UFC/g o aproximadamente 1 x 1014 UFC/g y la composición está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla.

En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones que contienen metilobacteria divulgadas o usadas en el presente documento se reducen de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando una o más de esas sustancias están ausentes o están esencialmente ausentes. En determinados aspectos de la divulgación, la composición se reduce de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando esas sustancias están presentes en un porcentaje de no más de aproximadamente un 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 % de la masa total, masa/volumen total o volumen total de la composición. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. Las fuentes de carbono incluyen, entre otras, alcoholes, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, lípidos, ácidos grasos y similares. Los alcoholes que se reducen incluyen, entre otros, metanol, etanol, glicerol y similares. Las fuentes de nitrógeno incluyen, entre otras, amoniaco y diversos compuestos que contienen grupos amino que pueden ser metabolizados por microorganismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que se reduce es una fuente de dos o más de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre y una fuente de magnesio. Por ejemplo, la composición que se reduce de aminoácidos o péptidos y carece de otras fuentes de carbono o nitrógeno está reducida tanto para una fuente de carbono como para una fuente de nitrógeno. En determinados aspectos de la divulgación, la composición comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable.

Los microorganismos residentes en la planta o semilla incluyen, entre otros, bacterias, hongos y levaduras. Las sustancias que promueven el crecimiento de dichos microorganismos pueden identificarse mediante métodos que incluyen, entre otros, el análisis de la superficie de la planta o semilla para determinar la cantidad o el número de microorganismos presentes antes de la exposición de la planta o semilla a la sustancia (o a una composición que contiene la sustancia), la exposición de la planta o semilla analizada a la sustancia o composición en paralelo con una composición de control que carece de la sustancia, y el posterior nuevo análisis de la superficie de la planta o semilla para determinar la cantidad o número de microorganismos presentes después de un intervalo de tiempo adecuado y en condiciones de temperatura adecuadas para permitir el crecimiento de los microorganismos residentes. Los ensayos para determinar el número de microorganismos incluyen, entre otros, determinaciones de unidades formadoras de colonias por una cantidad de planta o semilla expuesta a la sustancia y al control.

Sin pretender limitarse a teoría alguna, se cree que las composiciones que contienen metilobacteria divulgadas o utilizadas en el presente documento que están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes producen resultados superiores en comparación con otras composiciones que contienen dichas sustancias cuando se aplican a plantas, partes de plantas o semillas. Se cree que tales resultados superiores incluyen, entre otros, rendimiento mejorado de las plantas, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, maduración de frutos y similares. Sin pretender limitarse a teoría alguna, se cree que las composiciones que contienen metilobacteria que están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes permiten una colonización más eficaz y/o amplia de una planta, parte de una planta o semilla porque se reduce la competición por uno o más de los espacios o nutrientes por parte de los microorganismos residentes.

También se divulgan en el presente documento métodos para mejorar la producción de lechuga que comprenden aplicar cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o metilobacterias divulgadas en el presente documento a una planta de lechuga, parte de una planta de lechuga o semilla de lechuga y, de manera opcional, hacer crecer la planta y/o recoger las hojas o semillas de la planta o una planta cultivada a partir de la semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la composición recubre o recubre parcialmente la planta de lechuga, parte de la planta o semilla. La planta de lechuga tratada o planta que ha crecido a partir de la semilla muestra una mayor tasa de crecimiento de las raíces, una mayor tasa de crecimiento de las hojas, una mayor producción de semillas, un menor tiempo de ciclo (desde la siembra de las semillas hasta la producción de semillas) y/o una biomasa total aumentada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar, obteniendo así una producción de lechuga mejorada. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona al menos aproximadamente un aumento de un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % en la tasa de crecimiento de las raíces, la tasa de crecimiento de las hojas, la producción de semillas y/o la biomasa total aumentada en la planta de lechuga, parte de la planta de lechuga o una planta de lechuga derivada de la misma en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o una planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona aproximadamente un aumento de un 5 % o un 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, o 70 % en la tasa de crecimiento de las raíces, la tasa de crecimiento de las hojas, la producción de semillas y/o la biomasa total aumentada en la planta, parte de la planta o una planta derivada de la misma en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o una planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona al menos una disminución de aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % en el tiempo de ciclo en la planta de lechuga tratada o una planta de lechuga que ha crecido a partir de una semilla tratada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona una disminución de aproximadamente un 5 % o 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % en el tiempo de ciclo en la planta de lechuga tratada o una planta de lechuga que ha crecido a partir de una semilla tratada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o una planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la parte de la planta de lechuga es una hoja, un tallo, una flor, una raíz, un tubérculo o una semilla. En determinados aspectos de la divulgación, el método comprende, además, las etapas de hacer crecer la planta y/o la etapa de recoger al menos una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste en una hoja, un tallo, una flor, una raíz, un tubérculo, o una semilla de la planta de lechuga o parte de la planta. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, los métodos comprenden además obtener un alimento procesado o una composición de pienso a partir de la planta o parte de la planta. En determinados aspectos de la divulgación, la composición de alimento procesado comprende hojas de lechuga troceadas o cortadas.

También se divulgan métodos de preparación de una composición de tratamiento de planta de lechuga o semilla de la planta que comprende metilobacteria y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dichos métodos comprenden (i) hacer crecer un monocultivo o cocultivo de metilobacteria en medio que comprende una fase acuosa, una fase líquida y una fase sólida, o una emulsión, obteniendo así un medio que contiene metilobacteria; (ii) separar la metilobacteria de al menos otra parte del medio que contiene metilobacteria; y (iii) reconstituir la metilobacteria en una matriz que carece de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la etapa de separación se consigue mediante centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene metilobacteria y eliminación del exceso de líquido o emulsión del mismo. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz es un líquido, una emulsión o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. Aún en determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias se hacen crecer en medio que comprende una fase líquida y una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene metilobacteria, y la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma se reconstituye en la matriz mencionada anteriormente. En determinados aspectos de los métodos, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste enM. aminovorans, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. nodulans, M. phyllosphaerae, M thiocyanatum,yM. oryzae.En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria no esM. radiotoleransoM. oryzae.En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria es adherente a una sustancia sólida. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria se adhiere a la sustancia sólida y se combina con un líquido para formar una composición que es un coloide. En determinados aspectos de los métodos, el coloide es un gel. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria adherida a la sustancia sólida se obtiene cultivando la metilobacteria en presencia de la sustancia sólida. En determinados aspectos de los métodos, la composición comprende una emulsión. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria se obtiene cultivando la metilobacteria en una emulsión.

Se ha descubierto que los métodos en los que se cultivan metilobacterias en medio bifásico que comprende una fase líquida y una sustancia sólida aumentan significativamente el rendimiento resultante de la metilobacteria en relación con los métodos en los que se cultivan metilobacterias solo en medio líquido. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos pueden comprender hacer crecer la metilobacteria en medio líquido con una sustancia sólida en partículas que puede suspenderse en el líquido mediante agitación en condiciones que proporcionen el crecimiento de metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación donde se usan sustancias sólidas en partículas, al menos sustancialmente toda la fase sólida puede suspenderse en la fase líquida tras la agitación. Dichas sustancias sólidas en partículas pueden comprender materiales que tienen aproximadamente 1 milímetro o menos de longitud o diámetro. En determinados aspectos de la divulgación, el grado de agitación es suficiente para proporcionar una distribución uniforme de la sustancia sólida en partículas en la fase líquida y/o niveles óptimos de aireación del cultivo. Sin embargo, en otros aspectos divulgados en el presente documento, al menos sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida, o partes de la fase sólida se suspenden en la fase líquida y partes de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida. Sustancias sólidas no particuladas pueden utilizarse en determinados medios bifásicos donde la fase sólida no se suspende en la fase líquida. Dichas sustancias sólidas no particuladas incluyen, entre otras, materiales que tienen más de aproximadamente 1 milímetro de longitud o diámetro. Dichas sustancias sólidas particuladas y no particuladas también incluyen, entre otras, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar áreas superficiales aumentadas para el crecimiento adherente de la metilobacteria. Los medios bifásicos donde se suspenden partes de la fase sólida en la fase líquida y partes de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida pueden comprender una mezcla de sustancias sólidas particuladas y no particuladas. Dichas sustancias sólidas particuladas y no particuladas utilizadas en cualquiera de los medios bifásicos mencionados anteriormente también incluyen, entre otros, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar áreas superficiales aumentadas para el crecimiento adherente de la metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, el medio comprende un coloide formado por una fase sólida y una líquida. Un coloide que comprende un sólido y un líquido puede formarse previamente y añadirse a medio líquido o puede formarse en medio que contiene un sólido y un líquido. Los coloides que comprenden un sólido y un líquido pueden formarse sometiendo determinadas sustancias sólidas a un cambio químico y/o térmico. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide es un gel. En determinados aspectos de la divulgación, la fase líquida del medio es una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Los líquidos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles, en agua incluyen, entre otros, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua igual o menor que la del pentanol, hexanol o heptanol. a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal o una combinación de los mismos; y/o (5) un aceite vegetal que se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, linaza, coco, palma, colza, semilla de sésamo, cártamo y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender de al menos aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 20 % de la fase líquida por masa. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos pueden comprender obtener un medio de cultivo bifásico que comprende el líquido, el sólido y metilobacteria e incubar el cultivo en condiciones que proporcionen el crecimiento de metilobacteria. Los medios de cultivo bifásicos que comprenden el líquido, el sólido y metilobacteria pueden obtenerse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, cualquiera de: (a) inocular un medio bifásico que comprende el líquido y la sustancia sólida con metilobacteria; (b) inocular la sustancia sólida con metilobacteria y luego introducir la sustancia sólida que comprende metilobacteria en el medio líquido; (c) inocular la sustancia sólida con metilobacteria, incubar la metilobacteria en la sustancia sólida y luego introducir la sustancia sólida que comprende metilobacteria en el medio líquido; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). Los métodos y composiciones para cultivar metilobacteria en medio bifásico que comprenden un líquido y un sólido se divulgan en la solicitud de patente de Estados Unidos del mismo cesionario que la presente, n.° 13/907.161, presentada el 31 de mayo de 20l3 y en la solicitud de patente internacional del mismo cesionario que la presente n.° PCT/US13/43722, presentada 31 de mayo de 2013.

También se ha descubierto que los métodos en los que se cultiva metilobacteria en medio que comprende una emulsión aumentan significativamente el rendimiento resultante de metilobacteria en relación con los métodos en los que se cultiva metilobacteria solo en medio líquido. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos para preparar las composiciones divulgadas en el presente documento pueden comprender hacer crecer el agente de metilobacteria en una emulsión en condiciones que proporcionan el crecimiento de metilobacteria. Los medios que comprenden la emulsión y metilobacteria pueden obtenerse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, cualquiera de: (a) inocular un medio que comprende la emulsión con metilobacteria; (b) inocular el líquido acuoso con metilobacteria, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; (c) inocular el líquido acuoso con metilobacteria, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). En determinados aspectos de la divulgación, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Los líquidos no acuosos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles, en agua incluyen, entre otros, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua igual o menor que la del n-pentanol , n-hexanol o n-heptanol a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5, 6 o 7 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal o una combinación de los mismos; y/o (5) un aceite vegetal seleccionado del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, linaza, coco, palma, colza, semilla de sésamo, cártamo y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido no acuoso inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender al menos aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 20 % de la emulsión por masa. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido no acuoso inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender al menos aproximadamente cualquiera de aproximadamente un 0,05 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % a aproximadamente un 3 %, 5 %, 10 % o 20 % de la emulsión por masa. Los métodos y composiciones para hacer crecer metilobacteria en medio que comprende una emulsión se divulgan en la solicitud de patente internacional del mismo cesionario que la presente n.° PCT/US2014/040218, presentada el 30 de mayo de 2014.

En determinados aspectos de la divulgación, el caldo de fermentación, el producto del caldo de fermentación o las composiciones que comprenden una especie de metilobacteria puede comprender, además, uno o más microorganismos introducidos de identidad predeterminada distintos de metilobacteria. Otros microorganismos que pueden añadirse incluyen, entre otros, microorganismos que son bioplaguicidas o proporcionan algún otro beneficio cuando se aplican a una planta o parte de una planta. Por lo tanto, los microorganismos bioplaguicidas o beneficiosos de otro modo incluyen, entre otros, diversosBacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp.,yTrichoderma sp.Los bioplaguicidas microbianos pueden ser una bacteria, un hongo, un virus o un protozoo. Los microorganismos bioplaguicidas particularmente útiles incluyen diversas cepas deBacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens,yStreptomyces lydicus.Otros microorganismos que se añaden pueden ser genéticamente modificados o aislados naturales que están disponibles como cultivos puros. En determinados aspectos de la divulgación, se prevé que el microorganismo bacteriano o fúngico pueda proporcionarse en el caldo de fermentación, el producto del caldo de fermentación o la composición en forma de espora.

En determinados aspectos de la divulgación, el medio de cultivo líquido se prepara a partir de componentes económicos y fácilmente disponibles, que incluyen, entre otros, sales inorgánicas tales como fosfato de potasio, sulfato de magnesio y similares, fuentes de carbono tales como glicerol, metanol, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido succínico y similares, y mezclas de aminoácidos tales como peptona, triptona y similares. Los medios líquidos a modo de ejemplo que pueden utilizarse incluyen, entre otros, medio de sales minerales de amonio (AMS) (Whittenburyet al.,1970), medio de cultivo mínimo Vogel-Bonner (VB) (Vogel y Bonner, 1956) y caldo LB ("Caldo Luria - Bertani").

En general, la sustancia sólida utilizada en los métodos y composiciones que proporcionan el crecimiento eficaz de metilobacteria puede ser cualquier sustancia sólida adecuada que sea insoluble o solo parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas. Tales sustancias sólidas adecuadas también son no bactericidas o no bacteriostáticas con respecto a la metilobacteria cuando las sustancias sólidas se proporcionan en el medio de cultivo líquido. En determinados aspectos de la divulgación, tales sustancias sólidas adecuadas también son sustancias sólidas que se obtienen fácilmente en forma estéril o se vuelven fácilmente estériles. Las sustancias sólidas utilizadas en el presente documento pueden esterilizarse mediante cualquier método que proporcione la eliminación de microorganismos contaminantes y, por tanto, incluyen, entre otros, métodos tales como autoclave, irradiación, tratamiento químico y cualquier combinación de los mismos. Estas sustancias sólidas incluyen sustancias naturales de origen animal, vegetal, microbiano, fúngico o mineral, sustancias artificiales o combinaciones de sustancias naturales y artificiales. En definitiva, las sustancias sólidas son sustancias sólidas inanimadas. Las sustancias sólidas inanimadas de origen animal, vegetal, microbiano o fúngico pueden obtenerse de animales, plantas, microbios u hongos que no son viables (es decir, que ya no están vivos) o que se han vuelto inviables. Por tanto, los caparazones de diatomeas son sustancias sólidas inanimadas cuando se han eliminado las algas diatomeas previamente asociadas o se han vuelto de otro modo inviables. Dado que los caparazones de diatomeas son sustancias sólidas inanimadas, no se consideran organismos fotosintéticos ni microorganismos fotosintéticos. En determinados aspectos de la divulgación, las sustancias sólidas incluyen, entre otras, arena, sedimento, tierra, arcilla, ceniza, carbón vegetal, tierra de diatomeas y otros minerales similares, vidrio molido o microesferas de vidrio, materiales cerámicos molidos, microesferas cerámicas, bentonita, caolín, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser un polímero o microesferas poliméricas. Los polímeros que pueden utilizarse como sustancia sólida incluyen, entre otros, diversos polisacáridos tales como polímeros celulósicos y polímeros quitinosos que son insolubles o solo parcialmente solubles en agua o soluciones acuosas, agar (es decir, galactanos) y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser un cristal salino insoluble o solo parcialmente soluble. Los cristales salinos que pueden utilizarse incluyen, entre otros, carbonatos, cromatos, sulfitos, fosfatos, hidróxidos, óxidos y sulfuros insolubles o solo parcialmente solubles. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, una célula fúngica, una espora microbiana o una espora fúngica. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana o una espora microbiana, en la que la célula microbiana o la espora microbiana no es un microorganismo fotosintético. En determinados aspectos de la divulgación, la célula microbiana o espora microbiana no es un microorganismo fotosintético, donde el microorganismo fotosintético se selecciona del grupo que consiste en algas, cianobacterias, diatomeas,Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum,yUlva.En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica inactivada (es decir, inviable). En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica quiescente (es decir, viable, pero sin división activa). En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser restos celulares de origen microbiano. En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser materia particulada de cualquier parte de una planta. Las partes de plantas que pueden utilizarse para obtener la sustancia sólida incluyen, entre otras, mazorcas, cáscaras, vainas, hojas, raíces, flores, tallos, cortezas, semillas y combinaciones de los mismos. También pueden utilizarse productos obtenidos a partir de partes de plantas procesadas que incluyen, entre otros, bagazo, salvado de trigo, sémola de soja, torta de semillas trituradas, rastrojos y similares. Dichas partes de plantas, plantas procesadas y/o partes de plantas procesadas pueden molerse para obtener el material sólido en forma de partículas que pueda utilizarse. En determinados aspectos de la divulgación, puede utilizarse madera o un producto de madera que incluye, entre otros, pulpa de madera, serrín, virutas y similares. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una materia particulada de uno o más animales, incluyendo, entre otros, harina de hueso, gelatina, caparazones molidos o en polvo, pelo, cuero macerado y similares.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida se proporciona en forma de partículas que proporcionan la distribución de la sustancia sólida en el medio de cultivo. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida está compuesta por partículas de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros de longitud o diámetro promedio. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida está compuesta por partículas de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 1000 micrómetros de longitud o diámetro promedio. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida es una partícula de aproximadamente 1, 2, 4, 10, 20 o 40 micrómetros a cualquiera de aproximadamente 100, 200, 500, 750 o 1000 micrómetros de longitud o diámetro promedio. Las características deseables de las partículas utilizadas en los métodos y composiciones divulgadas en el presente documento incluyen una humectabilidad adecuada de modo que las partículas puedan suspenderse por todo el medio tras agitación.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida se proporciona en el medio como un coloide en el que la fase continua es un líquido y la fase dispersa es el sólido. Los sólidos adecuados que pueden utilizarse para formar coloides en medios líquidos usados para hacer crecer metilobacteria incluyen, entre otros, diversos sólidos que se denominan hidrocoloides. Dichos hidrocoloides utilizados en los medios, métodos y composiciones divulgados en el presente documento pueden ser polímeros hidrófilos, de origen vegetal, animal, microbiano o sintético. Los polímeros hidrocoloides utilizados en los métodos pueden contener muchos grupos hidroxilo y/o pueden ser polielectrolitos. Los polímeros hidrocoloides utilizados en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento incluyen, entre otros, agar, alginato, arabinoxilano, carragenano, carboximetilcelulosa, celulosa, curdlano, gelatina, gellan, p-glucano, goma guar, goma arábiga, goma garrofín, pectina, almidón, goma xantana y mezclas de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide utilizado en los medios, métodos y composiciones divulgados en el presente documento puede comprender un polímero hidrocoloide y una o más proteínas.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una sustancia sólida que proporciona el crecimiento adherente de metilobacterias sobre la sustancia sólida. Las metilobacterias que se adhieren a una sustancia sólida son metilobacterias que no pueden eliminarse sustancialmente lavando simplemente la sustancia sólida con las metilobacterias adherentes con medio de crecimiento, mientras que las metilobacterias no adherentes pueden eliminarse sustancialmente lavando la sustancia sólida con medios de crecimiento líquido. En este contexto, "eliminar sustancialmente" significa que al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de las metilobacterias presentes se eliminan cuando la sustancia sólida se lava con tres volúmenes de medio de crecimiento líquido. Dicho lavado puede efectuarse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, decantación de líquido de una fase sólida lavada o pase de líquido a través de una fase sólida en un filtro que permite el flujo a través de las bacterias en el líquido. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes que se asocian con el sólido pueden incluir metilobacterias que se adhieren directamente al sólido y/o metilobacterias que se adhieren indirectamente a la sustancia sólida. Las metilobacterias que se adhieren indirectamente a la sustancia sólida incluyen, entre otras, metilobacterias que se adhieren a otras metilobacterias o a otro microorganismo que se adhiere a la sustancia sólida, metilobacterias que se adhieren a la sustancia sólida adhiriéndose a otra sustancia que está adherida a la sustancia sólida, y similares. En determinados aspectos de la divulgación, al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de las metilobacterias en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones son metilobacterias que se adhieren a la sustancia sólida. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presente sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados, o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presentes en la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria /micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados, o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados. Los caldos de fermentación bifásicos divulgados en el presente documento pueden comprender una fase líquida que contiene metilobacterias no adherentes. En determinados aspectos de la divulgación, los valores cuantitativos de metilobacterias no adherentes en la fase líquida pueden ser inferiores a aproximadamente 100.000, 10.000 o 1.000 UFC/ml.

Los métodos de cultivo bifásico divulgados pueden producir caldos de fermentación con metilobacterias a un valor cuantitativo de más de aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un valor cuantitativo de más de aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un valor cuantitativo de más de aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en el presente documento pueden comprender metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en el presente documento pueden comprender metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 * 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 1 * 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en el presente documento comprenderán metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en el presente documento comprenderán metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

Pueden obtenerse sustancias sólidas con metilobacterias adherentes como productos de fermentación que pueden utilizarse para preparar diversas composiciones útiles para el tratamiento de plantas o partes de plantas con vistas a mejorar el rendimiento de las plantas, la resistencia a insectos de las plantas, la resistencia a las enfermedades fúngicas de las plantas y/o mejorar la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, la composición comprende metilobacterias y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes. Las composiciones descritas en el presente documento que comprenden metilobacterias, sustancias sólidas con metilobacterias que han crecido en las mismas, o que comprenden emulsiones con metilobacterias que han crecido en las mismas, pueden utilizarse para el tratamiento de plantas o partes de plantas. Por lo tanto, se divulgan plantas, partes de plantas y, en particular, semillas de plantas que han sido al menos parcialmente recubiertas o recubiertas con los productos de caldo de fermentación o composiciones que comprenden metilobacterias. También se divulgan productos vegetales procesados que contienen los productos de caldo de fermentación o composiciones con metilobacterias o metilobacterias adherentes. Las sustancias sólidas con metilobacterias adherentes pueden utilizarse para preparar diversas composiciones que son particularmente útiles para el tratamiento de semillas de plantas. Por tanto, se divulgan semillas que han sido recubiertas al menos parcialmente con los productos de caldo de fermentación o composiciones. También se divulgan productos de semillas procesados, que incluyen, entre otros, harina, pienso y copos que contienen los productos de caldo de fermentación o composiciones divulgados en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, el producto vegetal procesado no será regenerable (es decir, no podrá desarrollarse en una planta). En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida utilizada en el producto de fermentación o composición que recubre al menos parcialmente la planta, parte de la planta o semilla de la planta o que está contenida en la planta, parte de la planta o producto de semilla procesado comprende una sustancia sólida y metilobacterias asociadas o adherentes que puede identificarse fácilmente comparando una planta, parte de una planta, semilla de una planta o producto procesado de las mismas tratado y sin tratar. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de una planta o una semilla incluye, entre otros, recubrimiento de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o aproximadamente el 99,5 % del área superficial de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

También se divulgan en el presente documento métodos para preparar una composición de tratamiento de plantas o semillas de plantas que comprende metilobacterias y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dichos métodos pueden comprender (i) hacer crecer un monocultivo o cocultivo de metilobacteria en medio que comprende: (a) una fase acuosa; (b) una fase líquida y una fase sólida; o (c) una emulsión, obteniendo así un medio que contiene metilobacterias; (ii) separar las metilobacterias de al menos otra parte del medio que contiene metilobacterias; y (iii) reconstituir las metilobacterias en una matriz que carece de sustancias que promuevan el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la etapa de separación se efectúa mediante centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene metilobacteria y eliminación del exceso de líquido o emulsión del mismo. En determinados aspectos de la divulgación donde las metilobacterias se hacen crecer en presencia de una sustancia sólida, la separación proporcionará una fracción que contiene metilobacterias con crecimiento adherente a la sustancia sólida y algunas metilobacterias no adherentes que pueden reconstituirse en la matriz. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz es un líquido, una emulsión o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias se hacen crecer en medio que comprende una fase líquida y una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene metilobacteria, y la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma se reconstituye en la matriz mencionada anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz puede ser un líquido que incluye, entre otros, agua y un tampón acuoso reducido de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, o una solución acuosa reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla.

En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga puede identificarse analizando la especie de metilobacteria candidata recién aislada para determinar la presencia de secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria a modo de ejemplo divulgada en el presente documento que mejora la producción de lechuga y que está ausente de la especie de metilobacteria divulgada en el presente documento que no mejora la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065 y/o NLS0089 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos de semillas, pero están ausentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos de semillas. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0017, NLS0042 y NLS0068 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos foliares, pero están ausentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos foliares. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en dos o más de los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes en dos o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes en todos los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga están presentes en todos los aislados de la especie de metilobacteria a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en el presente documento que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes en todos los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en el presente documento que no mejoran la producción de lechuga. Estos polimorfismos de ácidos nucleicos que se producen en la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga pueden incluir, entre otros, polimorfismos mononucleotídicos, RFLP, AFLP y/u otras variaciones de ADN, tales como secuencias repetitivas, secuencias de inserción, transposones e islas genómicas que se producen como resultado de inserciones, eliminaciones y sustituciones (indeles) en el genoma bacteriano que incluye tanto el ADN cromosómico como cualquier elemento de ácido nucleico extracromosómico que pueda estar presente en la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga. Dichos elementos de ácido nucleico extracromosómicos incluyen, entre otros, plásmidos, ADN o ARN de bacteriófagos y similares. Los métodos utilizados para identificar dichos polimorfismos de nucleótidos incluyen, entre otros, técnicas de prolongación de una sola base (SBE), hibridación específica de alelo (ASH), detección por PCR instantánea (es decir, TaqMan™; patentes de Estados Unidos n.° 5.804.375; n.° 5.538.848; n.° 5.487.972; y n.° 5.210.015), combinaciones de ASH y RT-PCR (sistemas de detección KASP™, LGC Genomics, Middlesex, Reino Unido) y técnicas de secuenciación profunda (solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20120264632).

También se divulgan en el presente documento composiciones, métodos de preparación de las composiciones y métodos de uso de las composiciones para mejorar la producción de lechuga, donde las composiciones o métodos comprenden o usan cualquiera de los siguientes aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la siguiente Tabla 1 o derivados de los aislados. En determinados aspectos de la divulgación, dichos derivados pueden incluir variantes, pero no se limitan a, variantes de los aislados obtenidos mediante selección, variantes de los aislados seleccionados por mutagénesis y selección, y aislados genéticamente transformados obtenidos a partir de los aislados.

Tabla 1. Aislados de la es ecie de metilobacteria

continuación

1Número de depósito de la cepa que se deposita en la AGRICULTURAL RESEARCH SERVICE CULTURE COLLECTION (N<r>RL) del National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, E.E.U.U. según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con fines de procedimiento de patente. Sujeto a 37 CFR §1.808(b), todas las restricciones impuestas por el depositario sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de cualquier patente a partir de esta solicitud de patente.

Solicitudes de patente del mismo cesionario que el presente que divulgan usos específicos adicionales de las cepas de metilobacteria de la Tabla 1 tales como: (1) aumentar el rendimiento del maíz (US 61/911780, presentada el 4/12/2013; y solicitud internacional que reivindica prioridad de la misma presentada el 4/12/2014); (2) aumentar el rendimiento de la soja (US 61/911698, presentada el 4/12/2013; y solicitud internacional que reivindica prioridad de la misma presentada el 4/12/2014); (3) mejorar el crecimiento del tomate (US 61/954390, presentada el 17/03/2014; y solicitud internacional que reivindica prioridad de la misma presentada el 4/12/2014); (4) mejorar la maduración de los frutos (US 61/911577, presentada el 4/12/2013; y solicitud Internacional que reivindica prioridad de la misma presentada el 4/12/2014); (5) proporcionar resistencia a enfermedades fúngicas (US 62/045950, presentada el 4/9/2014; US 62/013.464, presentada el 17/06/2014).

También se divulgan en el presente documento especies de metilobacteria que proporcionan una mejor producción de lechuga donde las especies de metilobacteria tienen cualquiera de: (i) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125; o (ii) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia de la Tabla 7. Una especie de metilobacteria tiene al menos un gen que es ortólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-5125, o a la SEQ ID NO correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 7, cuando un cromosoma y/o cualquier ADN extracromosómico en esa especie de metilobacteria contiene un gen que codifica una proteína que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia por toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-5125. La especie de metilobacteria puede tener también al menos dos, tres, cuatro, seis, ocho, 10, 15 o 20 genes que codifican proteínas que son ortólogas a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o que codifican proteínas que son ortólogas a la correspondiente SEQ ID NO de una proteína de referencia de la Tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de 13, 14, 23, 27, 28, 30, 40, 43, 44, 51, 52, 57, 76, 85, 127, 197, 198, 199, 1094, 1100, 1106, 1114,1116, 1117, 1120, 1180, 2180, 2190, 2463, 2467, 2468, 2471, 2510, 2515, 2676, 2971, 3357, 3370, 3372, 3394, 3427, 3429, 3430, 3950, 3952, 3968, 3987, 3996, 4004, 4006, y/o 4067 de la Tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14, 23, 1094, 1100, 1106, 2467, 2468, 3357, 3370 y/o 3968 de la Tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1100, 1116, 2471, 2971 y/o 3950 de la Tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1094 incluyen, entre otras, las proteínas ortólogas identificadas como reguladores transcripcionales que se divulgan en la Tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 23 incluyen, entre otras, las proteínas ortólogas identificadas como proteínas de la familia XRE de reguladoras transcripcionales que se divulgan en la Tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1100 incluyen, entre otras, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 1110, 2179, 2484 y 3367 que son similares a proteínas identificadas como proteínas del tipo de transportador ABC. Los ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1116 incluyen, entre otras, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 1116, 2182 y 2521 que son similares a proteínas identificadas como transportador de múltiples fármacos MatE. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 2471 incluyen, entre otras, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 2471, 3356 y 3958 que son similares a proteínas identificadas como proteínas ACR de bomba de descarga de arsenito. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 2971 incluyen, entre otras, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 250, 1309, 2263 y 2971 que son similares a proteínas identificadas como miembros de los reguladores transcripcionales de la familia LysR. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria tiene al menos un gen que es ortólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-5125, o a la SEQ ID NO correspondiente de una proteína de referencia de la Tabla 7, con la condición de que el gen no se encuentre enM. extorquensAM1,M. extorquensPA1, oM. extorquensME4. También se divulgan composiciones que comprenden cualquiera de las especies de metilobacteria mencionadas anteriormente y un excipiente agrícolamente aceptable, un adyuvante agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos junto con semillas u hojas de lechuga que están al menos parcialmente recubiertas con tales composiciones y métodos de uso de dichas composiciones como tratamientos foliares o de semillas para mejorar la producción de lechuga.

Puede determinarse que una especie de metilobacteria contiene un gen que codifica una proteína que ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 mediante una variedad de técnicas diferentes. En determinados aspectos de la divulgación, puede determinarse que una especie de metilobacteria contiene un gen que codifica una proteína que ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 ensamblando una secuencia genómica electrónica completa que comprende las secuencias de ADN cromosómicas y extracromosómicas presentes en esa especie de metilobacteria con un ordenador y programa informático asociado, y determinando si alguno de los marcos abiertos de lectura (ORF) presentes en esa secuencia de ADN codifica una proteína que tenga el porcentaje de identidad de secuencia mencionado anteriormente. En dichos aspectos de la divulgación, el ORF puede identificarse realizando una traducción de seis vías de la secuencia ensamblada electrónicamente y consultando la traducida con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o la correspondiente SEQ ID NO: de una proteína de referencia de la Tabla 7. En otros aspectos de la divulgación, la presencia o ausencia de una secuencia dada dentro de una especie de metilobacteria, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o la correspondiente SEQ ID NO: de una proteína de referencia de la Tabla 7 puede determinarse mediante una técnica de análisis de ácidos nucleicos o análisis de proteínas. Ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de SEQ ID NO:1-5125 incluyen, aunque sin limitación, SEQ ID NO: 5126-10250, respectivamente. Dichos análisis de ácido nucleico incluyen, entre otras, técnicas basadas en hibridación de ácidos nucleicos, reacciones en cadena de la polimerasa, espectroscopia de masas, detección basada en nanoporos, combinaciones de las mismas y similares. Las técnicas de análisis de proteínas incluyen, entre otras, inmunodetección, espectroscopia de masas, combinaciones de las mismas y similares.

Las composiciones divulgadas en el presente documento que son útiles para el tratamiento de plantas de lechuga o partes de plantas que comprenden metilobacterias y/o están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, contienen una sustancia sólida con metilobacterias adherentes que han crecido en la misma o que comprenden emulsiones con metilobacterias que han crecido en la misma, también pueden comprender, además, un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable. Un adyuvante o un excipiente agrícolamente aceptable es normalmente un ingrediente que no provoca fitotoxicidad indebida u otros efectos adversos cuando se expone a una planta o parte de una planta. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser en sí misma un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable siempre que no sea bactericida o bacteriostático para la metilobacteria. En otros aspectos de la divulgación, la composición comprende, además, al menos uno de un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable. Cualquiera de las composiciones antes mencionadas también puede comprender, además, un plaguicida. Los plaguicidas usados en la composición incluyen, entre otros, un insecticida, un fungicida, un nematicida y un bactericida. En determinados aspectos de la divulgación, el plaguicida usado en la composición es un plaguicida que no inhibe sustancialmente el crecimiento de la metilobacteria. Como las metilobacterias son bacterias gramnegativas, los bactericidas adecuados usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, bactericidas que presentan actividad contra bacterias grampositivas, pero no contra bacterias gramnegativas. Las composiciones divulgadas en el presente documento también pueden comprender un agente bacteriostático que no inhiba sustancialmente el crecimiento de la metilobacteria. Los agentes bacteriostáticos adecuados para su uso en las composiciones divulgadas en el presente documento incluyen, entre otros, aquellos que muestran actividad contra bacterias grampositivas, pero no contra bacterias gramnegativas. Cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente también puede ser un producto esencialmente seco (es decir, que tiene aproximadamente un 5 % o menos de contenido de agua), una mezcla de la composición con una emulsión o una suspensión. Cualquiera de las composiciones divulgadas en el presente documento puede utilizarse para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de una planta o una semilla incluye, entre otros, recubrimiento de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

Los adyuvantes agrícolamente aceptables usados en las composiciones que comprenden metilobacterias incluyen, entre otros, componentes que mejoran la eficacia del producto y/o productos que mejoran la facilidad de aplicación del producto. Los adyuvantes que mejoran la eficacia del producto pueden incluir diversos humectantes/esparcidores que promueven la adhesión y la propagación de la composición sobre partes de la planta, adhesivos que promueven la adhesión a partes de la planta, penetrantes que pueden promover el contacto del agente activo con los tejidos interiores, expansores que aumentan la semivida del agente activo al inhibir la degradación ambiental, y humectantes que aumentan la densidad o el tiempo de secado de las composiciones pulverizadas. Los humectantes/esparcidores usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos de organosilicato y/o tensioactivos acidificados. Los adhesivos utilizados en las composiciones pueden incluir, entre otras, sustancias a base de látex, terpeno/pinoleno y sustancias a base de pirrolidona. Los penetrantes pueden incluir aceite mineral, aceite vegetal, aceite vegetal esterificado, tensioactivos de organosilicato y tensioactivos acidificados. Los extensores usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, sulfato de amonio o sustancias a base de menteno. Los humectantes usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, glicerol, propilenglicol y dietilglicol. Los adyuvantes que mejoran la facilidad de aplicación del producto incluyen, entre otros, agentes acidificantes/tamponantes, agentes antiespumantes/desespumantes, agentes de compatibilidad, agentes reductores del arrastre, tintes y acondicionadores de agua. Los agentes antiespumantes/desespumantes usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, dimetopolisiloxano. Los agentes de compatibilidad usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, sulfato de amonio. Los agentes reductores del arrastre usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, poliacrilamidas y polisacáridos. Los acondicionadores de agua usados en las composiciones pueden incluir, entre otros, sulfato de amonio.

También se divulgan en el presente documento métodos de tratamiento de plantas y/o partes de plantas con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación y composiciones que comprenden metilobacterias. Las plantas tratadas y partes de plantas tratadas obtenidas a partir de las mismas incluyen, entre otras, una planta de pimiento, tomate, mora o plátano. Las partes de plantas que se tratan incluyen, entre otras, hojas, tallos, flores, raíces, semillas, frutos, tubérculos, coleóptilos y similares. Las semillas u otros propágulos de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente pueden tratarse con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y/o composiciones divulgados en el presente documento.

En determinados aspectos de la divulgación, las plantas y/o partes de plantas se tratan aplicando los caldos de fermentación, los productos de caldo de fermentación, los productos de fermentación y las composiciones que comprenden metilobacterias como una pulverización. Dichas aplicaciones de pulverización incluyen, entre otras, tratamientos de una sola parte de la planta o cualquier combinación de partes de la planta. La pulverización puede conseguirse con cualquier dispositivo que distribuya los caldos de fermentación, los productos de caldo de fermentación, los productos de fermentación y las composiciones a la planta y/o parte(s) de la planta. Los dispositivos de pulverización útiles incluyen un pulverizador de varilla, un pulverizador manual o de mochila, fumigadores de cultivos (es decir, fumigación aérea) y similares. También pueden utilizarse dispositivos y/o métodos de pulverización que proporcionen la aplicación de los caldos de fermentación, productos de caldos de fermentación, productos de fermentación y composiciones a una o ambas de la superficie adaxial y/o la superficie abaxial. También se divulgan en el presente documento plantas y/o partes de plantas que están al menos parcialmente recubiertas con cualquiera de un caldo de fermentación bifásico, un producto de caldo de fermentación, un producto de fermentación o composiciones que comprenden una sustancia sólida con metilobacterias adheridas a la misma. También se divulgan en el presente documento productos vegetales procesados que comprenden una sustancia sólida con metilobacterias adheridas a la misma. Cualquiera de las composiciones divulgadas en el presente documento puede utilizarse para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de la planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de una planta o una semilla incluye, entre otros, recubrimiento de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % de la superficie de la planta, parte de la planta o semilla de la planta.

En determinados aspectos de la divulgación, las semillas de lechuga se tratan exponiendo las semillas a los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones que comprenden metilobacterias. Las semillas pueden tratarse con los caldos de fermentación, los productos de caldo de fermentación y las composiciones divulgadas en el presente documento mediante métodos que incluyen, entre otros, imbibición, recubrimiento, pulverización y similares. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas esterilizadas superficialmente se tratan con una composición que comprende metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas no esterilizadas (es decir, semillas que no han sido sometidas a esterilización superficial) se tratan con una composición que comprende metilobacterias que se ha reducido de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en la semilla. Los tratamientos de semillas pueden efectuarse con tratadores de semillas tanto continuos como discontinuos. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas recubiertas pueden prepararse suspendiendo las semillas con una composición de recubrimiento que contiene un caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones que comprenden la sustancia sólida con metilobacterias y secando al aire el producto resultante. El secado al aire puede conseguirse a cualquier temperatura que no sea perjudicial para la semilla o las metilobacterias, pero normalmente no será superior a 30 °C. La proporción de recubrimiento que comprende una sustancia sólida y metilobacterias incluye, sin limitación, un intervalo de un 0,1 a un 25 % en peso de la semilla, de un 0,5 a un 5 % en peso de la semilla y de un 0,5 a un 2,5 % en peso de la semilla. El recubrimiento parcial de una semilla puede incluir, sin limitación, el recubrimiento de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la semilla. En determinados aspectos de la divulgación, una sustancia sólida usada en el recubrimiento o tratamiento de semillas tendrá metilobacterias adheridas en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una sustancia sólida utilizada en el recubrimiento o tratamiento de semillas se asociará con metilobacterias y será un caldo de fermentación, un producto de caldo de fermentación o una composición obtenida mediante los métodos divulgados en el presente documento. Pueden adaptarse diversas composiciones de tratamiento de semillas y métodos para el tratamiento de semillas divulgados en las patentes de Estados Unidos n.° 5.106.648, n.° 5.512.069 y n.° 8.181.388 para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, los productos de caldo de fermentación o las composiciones divulgadas en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, la composición utilizada para tratar la semilla puede contener excipientes agrícolamente aceptables que incluyen, entre otros, harinas de madera, arcillas, carbón activado, tierra de diatomeas, sólidos inorgánicos de grano fino, carbonato de calcio y similares. Las arcillas y los sólidos inorgánicos que pueden utilizarse con los caldos de fermentación, los productos de caldo de fermentación o las composiciones divulgadas en el presente documento incluyen, entre otras, bentonita cálcica, caolín, porcelana, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorillonita y mezclas de los mismos. Los adyuvantes agrícolamente aceptables que promueven la adherencia a la semilla que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, poli(acetatos de vinilo), copolímeros de poli(acetato de vinilo), poli(acetato de vinilo) hidrolizados, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo, poli(alcoholes vinílicos), copolímeros de poli(alcohol vinílico), éter polivinil metílico, copolímero de éter polivinil metílico-anhídrido maleico, ceras, polímeros de látex, celulosas incluyendo etilcelulosas y metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosas, polivinilpirrolidonas, alginatos, dextrinas, maltodextrinas, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, goma karaya, goma jaguar, goma de tragacanto, gomas de polisacárido, mucílago, goma arábiga, goma laca, polímeros y copolímeros de cloruro vinilideno, polímeros y copolímeros de proteína a base de soja, lignosulfonatos, copolímeros acrílicos, almidones, polivinilacrilatos, ceínas, gelatina, carboximetilcelulosa, quitosano, óxido de polietileno, polímeros y copolímeros de acrilamida, acrilato de polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulosa, policloropreno y jarabes o mezclas de los mismos. Otros adyuvantes agrícolamente aceptables útiles que pueden promover el recubrimiento incluyen, aunque sin limitación, polímeros y copolímeros de acetato de vinilo, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo y ceras solubles en agua. Pueden adaptarse diversos tensioactivos, dispersantes, agentes antiaglomerantes, agentes de control de espuma y tintes divulgados en el presente documento y en la patente de Estados Unidos n.° 8.181.388 para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación o composiciones divulgadas en el presente documento.

En el presente documento se divulgan composiciones que comprenden metilobacterias que proporcionan una producción de lechuga mejorada con respecto a plantas sin tratar que no han sido expuestas a las composiciones. En determinados aspectos de la divulgación, partes de plantas, que incluyen, entre otras, una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo, pueden tratarse con las composiciones divulgadas en el presente documento para mejorar la producción de lechuga. Los tratamientos o aplicaciones pueden incluir, entre otros pulverización, recubrimiento, recubrimiento parcial, inmersión y/o embebido de la planta o partes de la planta con las composiciones divulgadas en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo pueden sumergirse y/o embeberse con un líquido, semilíquido, emulsión o suspensión de una composición divulgada en el presente documento. Dicha inmersión o imbibición de semillas puede ser suficiente para proporcionar una producción de lechuga mejorada en una planta o parte de planta tratada en comparación con una planta o parte de planta sin tratar. La producción mejorada de lechuga incluye, entre otros, un mayor crecimiento de las raíces, un mayor crecimiento de las hojas, una mayor producción de semillas y/o un aumento de la biomasa total con respecto a las plantas sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas de plantas se pueden sumergirse y/o embeberse durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. Dicha inmersión y/o imbibición puede, en determinados aspectos de la divulgación, realizarse a temperaturas que no sean perjudiciales para la semilla de la planta o la metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas pueden tratarse a aproximadamente 15 y hasta aproximadamente 30 °C o entre aproximadamente 20 y hasta aproximadamente 25 °C. En determinados aspectos de la divulgación, la imbibición y/o inmersión de las semillas puede realizarse con agitación suave.

Por lo tanto, se espera que las composiciones divulgadas en el presente documento que comprenden metilobacterias sean útiles para mejorar la producción de lechuga.

En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción de lechuga mejorada puede ser una composición con metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para mejorar la producción de lechuga puede ser una composición con metilobacterias a un valor cuantitativo de aproximadamente al menos 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, a al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 * 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o de una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para mejorar la producción de lechuga puede ser un producto de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de metilobacterias de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para mejorar la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 * 107 unidades formadoras de colonias por gramo, o al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida, en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para mejorar la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 * 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 * 107 unidades formadoras de colonias por ml, o al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de metilobacterias adheridas a una sustancia sólida, en la misma o que han crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para mejorar la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 * 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 * 107 unidades formadoras de colonias por ml, o al menos aproximadamente 5 * 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de metilobacterias en la misma o que han crecido en la misma.

En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga puede ser una composición con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga, puede ser una composición con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga puede ser un producto de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de especie de metilobacteria de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de especie de metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria adherida a una sustancia sólida en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en el presente documento que es suficiente para proporcionar una producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria en la misma o que ha crecido en la misma.

En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan o usan composiciones con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan productos de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de especie de metilobacteria de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de especie de metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria adherida a una sustancia sólida en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste en NL 17 NRRL B- 1 NL 2 NRRL B- NL 21NRRL B- NL 7 NRRL B- 41

- , - , - , - , NLS0069 (NRRL B-50936), NLS0089 (NRRL B-50933), y derivados de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, las composiciones pueden comprender además un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0020 NRRL B-50930 NLS0021 NRRL B-50939 NLS0037NRRL B-50941 NLS0038 NRRL B-50942

- , - , - , - , NLS0089 (NRRL B-50933), derivados de las mismas; y también comprende un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar aspectos preferidos de la divulgación.

Ejemplo 1. Cultivo de cepas de PPFM en un medio de crecimiento líquido suplementado con una sustancia sólida

El medio de crecimiento líquido usado para cultivar los cultivos de PPFM fue un medio de sales basales suplementado con glicerol, peptona y tierra de diatomeas. El medio de sales basales utilizado fue un medio de sales minerales de amonio (AMS). El medio AMS contenía, por litro, 700 miligramos de fosfato de potasio dibásico anhidro, 540 miligramos de fosfato de potasio monobásico anhidro, un gramo de sulfato de magnesio heptahidrato, 500 miligramos de cloruro de amonio anhidro y 200 miligramos de cloruro de calcio dihidrato.

El medio basal AMS se preparó a partir de tres soluciones madre, enumeradas a continuación:

Solución madre 1: para un litro a concentración 50X

fosfato de potasio dibásico anhidro 35 gramos

fosfato de potasio monobásico anhidro 27 gramos

Solución madre II: para un litro a concentración 50X

sulfato de magnesio heptahidrato 50 gramos

cloruro de amonio anhidro 25 gramos

Solución madre III: para un litro a concentración 50X

cloruro de calcio dihidrato 10 gramos

Las soluciones madre I, II y III se sometieron a autoclave por separado.

Para preparar un litro de medio AMS líquido con glicerol, peptona y tierra de diatomeas, se añadió lo siguiente a 920 ml de agua destilada:

20 ml de solución madre I

20 ml de solución madre II

20 ml de solución madre III

20 ml de una solución madre de glicerol al 50 %

10 gramos de peptona

2 gramos de tierra de diatomeas

La solución resultante con tierra de diatomeas suspendida se esterilizó mediante autoclave.

Se colocaron dos litros del medio AMS anterior en un matraz de cuatro litros. Se añadieron dos mililitros de PPFM de cultivo líquido al medio para inocularlo. Luego se colocó el matraz en un agitador incubado ajustado a 240 RPM y 30 °C. Los cultivos se cultivaron durante seis días y luego se almacenaron a 4 °C para uso futuro.

Ejemplo 2. Inoculación de semillas de lechuga "Rex" para identificar PPFM que mejoran el crecimiento de raíces y brotes.

Siembra

Se colocó un Oasis HorticubeXL™ de 104 celdas (fondo surcado, surco único; Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja 1020 sin orificios. Se extrajeron cuatro cubos en el centro de la rejilla para permitir el riego inferior. El Oasis HorticubeXL™ se regó de modo que estuviera completamente saturado, se usó la configuración de lluvia con agua moderada. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 100 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Las cepas de PPFM que se iban a ensayar se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 en un medio líquido suplementado con una sustancia sólida. En la campana biológica, se pipeteó la cantidad deseada de solución PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para centrifugar a 3500 RPM durante 15 minutos a 23 °C. Mientras se hacían girar los tubos, se midió un volumen de agua corriente tibia para llevar el volumen de cada muestra hasta el volumen total.

Se vertió cuidadosamente el líquido de cada tubo, con cuidado de mantener intacto el sedimento. Se añadió el volumen apropiado de agua corriente a cada tubo para igualar su volumen inicial de solución PPFM. Se utilizaron PPFMS resuspendidas en agua lo más rápido posible.

Se pipetearon 100 microlitros de solución (solución de PPFM para grupos tratados y agua corriente para grupos de control) en la parte superior de cada semilla. Después de cada 3 filas, el tubo se tapó y se agitó para resuspender cualquier PPFM que pudiera haber sedimentado en el fondo. Las puntas de pipeta se cambiaron entre cada grupo para evitar contaminación cruzada. Las marcas se etiquetaron y fecharon para cada bandeja y se colocaron cúpulas transparentes de humedad en la parte superior de la bandeja. La bandeja se colocó en una cámara de crecimiento con ajuste de temperatura a 20 ° C y 12 horas al día con iluminación de 200 micromoles.

Crecimiento

Después de cinco a seis días, se retiraron las cúpulas tras la germinación de las semillas. Las bandejas se regaron por el fondo solamente y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego (aproximadamente días alternos).

La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Las bandejas se recolectaron entre dos y tres semanas. Se colocaron cúpulas transparentes de humedad en cada bandeja para evitar la evotranspiración durante el transporte. Las cúpulas se dejaron en su sitio hasta que se procesara la bandeja. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica.

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de brotes de plántulas de lechuga cuando se trataba una semilla en el momento de la siembra. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de la raíz, los grupos tratados mostraron más crecimiento en el momento de la recolección. Debido a la variación natural de los sistemas biológicos, todos los tamaños de muestras fueron de 98 - 100 plantas como mínimo y cualquier diferencia por debajo del 12 % no se consideró significativa.

Conclusión

Es evidente que las cepas NLS0017, NLS0020, NLS0066, NLS0065 y NLS0089 muestran un aumento en el peso húmedo de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. Las cepas NLS0069, NLS0037, NLS0038 y NLS0062 mostraron aumentos insignificantes en el peso húmedo en comparación con los controles. También se aprecia, junto con un aumento en la biomasa de los brotes, un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Tabla 2. Efectos de los tratamientos de semillas sobre el crecimiento de la lechu a

Ejemplo 3. Aplicación foliar de lechuga "Rex" para observar cómo las PPFM afectan el crecimiento de raíces y brotes.

Siembra

Se colocó un Oasis HorticubeXL de 104 celdas (fondo surcado, surco único) en una bandeja 1020 sin orificios. Se extrajeron cuatro cubos en el centro de la rejilla para permitir el riego inferior. El Oasis se regó de modo que estuviera completamente saturado, se usó la configuración de lluvia con agua moderada. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 100 semillas por grupo. Las marcas se etiquetaron y fecharon para cada bandeja y se colocaron cúpulas transparentes de humedad en la parte superior de la bandeja. La bandeja se colocó en una cámara de crecimiento con ajuste de temperatura a 20 °C y 12 horas al día con iluminación de 200 micromoles.Inoculación de plántulas de lechuga

Después de cinco a seis días, se retiraron las cúpulas después de que las semillas habían germinado. Las plantas fueron inoculadas en este momento, cuando sólo habían germinado los cotiledones. Las cepas de PPFM que se iban a ensayar se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 en un medio líquido suplementado con una sustancia sólida. Las cepas de PPFM que se iban a ensayar se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 en un medio líquido suplementado con una sustancia sólida. En la campana biológica, se pipeteó la cantidad deseada de solución PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para centrifugar a 3500 RPM durante 15 minutos a 23 °C. Mientras se hacían girar los tubos, se midió un volumen de agua corriente tibia para llevar el volumen de cada muestra al volumen total.

Se vertió cuidadosamente el líquido de cada tubo, con cuidado de mantener intacto el sedimento. Se añadió el volumen apropiado de agua corriente a cada tubo para igualar su volumen inicial de solución PPFM. Las PPFMS resuspendidas en agua se utilizaron lo más rápido posible.

Se vertieron 100 ml de solución de PPFM (agua corriente para control) en un pulverizador portátil Solo™ de 1 litro (Solo™, Newport News, VA, EE. UU.). La bandeja se retiró del grupo para evitar la contaminación cruzada. Se usó la configuración de bruma más fina y se pulverizó un recubrimiento uniforme de solución sobre la parte superior de las plántulas, garantizando una cobertura uniforme por toda la bandeja completa. Esto se repitió para cada grupo usando el tratamiento apropiado.

Crecimiento

Las bandejas se regaron únicamente por el fondo y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE.UU.) en cada riego (aproximadamente días alternos). La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Las bandejas se recolectaron entre dos y tres semanas. Se colocaron cúpulas de humedad transparentes en cada bandeja para evitar la evapotranspiración durante el transporte. Las cúpulas se dejaron en su sitio hasta que se procesara la bandeja. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica.

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de los brotes de plántulas de lechuga cuando la plántula se trataba en el momento de cotiledón. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de la raíz, de modo que los grupos tratados mostraron más crecimiento en el momento de la recolección. Debido a la variación natural de los sistemas biológicos, todos los tamaños de las muestras fueron de un 98 - 100 plantas como mínimo y cualquier diferencia por debajo del 12 % no se consideró significativa.

Conclusión

Es evidente que las cepas NLS0042, NLS0017, NLS0020 y NLS0068 muestran un aumento en el peso húmedo de las plántulas de lechuga después de la aplicación foliar. Las cepas NLS0069, NLS0037, NLS0038 y NLS0062 mostraron aumentos insignificantes en el peso húmedo en comparación con los controles. También se aprecia, junto con un aumento en la biomasa de los brotes, un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Tabla 3. Efectos de los tratamientos foliares sobre el crecimiento de la lechu a

continuación

Ejemplo 4. identificación de polimorfismos de ácido nucleico presentes en metilobacterias que mejoran la producción de lechuga

Se generan colecciones de secuenciación de todo el genoma para la plataforma de secuenciación de alto rendimiento Illumina™ para aislados de especies de metilobacterias proporcionados en la Tabla 1 usando kits de preparación de muestras de ADN Illumina TRUSEQ™ o NEXTE<r>A™ (descritos en los sitios de Internet res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_dna_sample_prep_kits.pdf y res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_dna_sample_prep.pdf) usando los métodos descritos por el fabricante. Las colecciones resultantes entonces se someten a pirosecuenciación (Siqueira JFet al.J Oral Microbiol. 2012; 4: 10.3402/jom.v4i0.10743). Los datos sin procesar de secuencias genómicas generadas por pirosecuenciación se someten a ajuste basado en adaptador y calidad para el control de calidad. Se consigue en un ensamblaje de secuencia forzoso de todo el genoma (1) ensamblando los datos que han pasado el control de calidad usando el ensambladorde novoVelvet (2). Para el hallazgo y anotación de genes, se aprovecharon los datos de instrucción de referencia de TIGRFAM (9), Pfam, COG (10) y UniRef100 (11). Los ARNr se identifican con RNAmmer (5), los genes que codifican proteínas se identifican con Glimmer (3) o Maker (6), y los ARNt se identifican con tRNAscan-SE (4). Las funciones génicas se asignan con blastx (7), blastp (7), HMMER (8) e InterProScan frente a bases de datos de proteínas exhaustivas descritas anteriormente (datos de referencia).

La detección de polimorfismos (SNP u otras variaciones de ADN que se producen como resultado de inserciones, eliminaciones y sustituciones (indeles)) en los aislados de especies de metilobacteria de la Tabla 1 se realiza con BWA (12) y el paquete Samtools (en Internet en samtools.sourceforge.net/), la variación estructural se define con BreakDancer (en Internet en breakdancer.sourceforge.net/) y CoGE (en Internet en genomevolution.org/CoGe/). Los polimorfismos diagnósticos para metilobacterias que proporcionan una producción de lechuga aumentada se identifican por comparaciones de las secuencias de los aislados de metilobacterias a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 que mejoran la producción de lechuga, pero que están ausentes de uno o más aislados de metilobacterias que no mejoran la producción de lechuga. Los polimorfismos presentes en los aislados de las metilobacterias a modo de ejemplo NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 que mejoran la producción de lechuga, pero que están ausentes en aislados de metilobacterias ejemplares que no mejoran la producción de lechuga, se usan entonces para identificar otros aislados de metilobacterias que mejoran la producción de lechuga.

Referencias para el Ejemplo 4

1. Miller JR, Koren S, Sutton G (2010) Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics 95: 315-327.

2. Zerbino DR, Birney E (2008) Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res 18: 821-829.

3. Delcher AL, Bratke KA, Powers EC, Salzberg SL (2007) Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics 23: 673-679.

4. Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res 25: 955-964.

5. Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T,et al.(2007) RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res 35: 3100-3108.

6. Cantarel B, Korf I, Robb S,et al.(2008) MAKER: An easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes. Genome Research 18: 188-196.

7. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z,et al.(1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402.

8. Eddy SR (2009) A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform 23: 205-211.

9. Haft DH, Selengut JD, White O (2003) The TIGRFAMs database of protein families. Nucleic Acids Res 31: 371 373.

10. Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, et al. (2003) The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4: 41.

11. Suzek BE, Huang H, McGarvey P, Mazumder R, Wu CH (2007) UniRef: comprehensive and non-redundant UniProt reference clusters. Bioinformatics 23: 1282-1288.

12. Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60.

Ejemplo 5. La inoculación de semillas de lechuga "Flandria" con PPFM aumenta la biomasa de brotes y raíces.

Siembra

Se colocó un plancha de 276 celdas de Oasis HORTICUBES® (corte delgado de 2,54 cm (1 pulgada); Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja de malla 1020. La bandeja se dividió a la mitad con un trozo de plástico para permitir dos grupos por bandeja. Los Oasis HORTICUBES® se regaron hasta saturación completa. Se usaron semillas de lechuga Flandria de Rijk Zwaan USA (Salinas, CA, EE. UU.). Se colocó una semilla en cada celda para un total de 132 o 144 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Las cepas de PPFM que se iban a ensayar se hicieron crecer como se describe en el Ejemplo 1 en un medio líquido suplementado con tierra de diatomeas a 2 gramos/litro. En el banco de trabajo, se pipeteó la cantidad deseada de solución PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para sedimentar las células a 7500 RPM durante 5 minutos a 23 °C. Se desechó el sobrenadante y los sedimentos de PPFM se resuspendieron en un volumen igual de agua.

Se pipetearon 100 microlitros de solución (solución de PPFM para grupos tratados y agua corriente para grupos de control) en la parte superior de cada semilla. El tubo se agitó periódicamente para mantener las células PPFM en suspensión. Se colocaron cúpulas transparentes de humedad sobre cada bandeja. Las bandejas se colocaron en un invernadero con ajustes de temperatura de 30 °C durante el día, 28 °C por la noche y con una duración de 16 horas de día obtenida con el uso de luz complementaria si fuera necesario.

Crecimiento

Después de dos a tres días tras la siembra, las semillas habían germinado y se retiraron las cúpulas de humedad. Las bandejas se regaron por la parte superior y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego. La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Las plántulas de lechuga se recolectaron a los 10 días después de la siembra. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica.

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de brotes de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de las raíces, y se apreció que los grupos tratados mostraban más crecimiento en el momento de la recolección. La fila exterior de cada grupo no se recolectó para eliminar cualquier efecto de borde en las bandejas.

Conclusión

Es evidente que las cepas PPFM NLS0017, NLS0020, NLS0066 y NLS0068 mostraban un aumento reproducible y estadísticamente significativo en el peso húmedo de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se apreció, junto con un aumento en la biomasa de los brotes, un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

T l 4. R l r l in l i n mill l h "Fl n ri"

continuación

Referencias

1. Abanda-Nkpwatt, D., M. Musch, J. Tschiersch, M. Boettner, and W. Schwab. 2006. Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: growth promotion, methanol consumption, and localization of the methanol emission site. J. Exp. Bot. 57: 4025-4032.

2. Broekaert WF, Terras FR, Cammue BP, Vanderleyden J (1990) An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiology Letters 69: 55-60.

3. Cao, Y-R, Wang, Q., Jin, R-X., Tang, S-K., He, W-X., Lai, H-X, Xu, L-H., and C-L Jiang. 2011. Methylobacterium soli sp. nov. a methanol-utilizing bacterium isolated from the forest soil. Antonie van Leeuwenhoek (2011) 99:629-634.

4. Corpe, W.A., and D.V. Basile. 1982. Methanol-utilizing bacteria associated with green plants. Devel. Industr. Microbiol. 23: 483-493.

5. Corpe, W.A., and S. Rheem. 1989. Ecology of the methylotrophic bacteria on living leaf surfaces. FEMS Microbiol. Ecol. 62: 243-250.

6. Green, P.N. 2005. Methylobacterium. In Brenner, D.J., N.R. Krieg, and J.T. Staley (eds.). "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume two, The Proteobacteria. Part C, The alpha-, beta-, delta-, and epsilonproteobacteria" Segunda edición. Springer, New York. Páginas 567-571.

7. Green, P.N. 2006. Methylobacterium. In Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (eds.). "The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Volume 5. Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses." Tercera edición. Springer, New York. Páginas 257-265.

8. Holland, M.A. 1997. Methylobacterium and plants. Recent. Res. Devel. in Plant Physiol. 1: 207-213.

9. Holland, M.A., and J.C. Polacco. 1994. PPFMs and other covert contaminants: Is there more to plant physiology than just plant? Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45: 197-209.

10. Kutschera, U. 2007. Plant-associated methylobacteria as co-evolved phytosymbionts. A hypothesis. Plant Signal Behav. 2: 74-78.

11. Lidstrom, M.E. 2006. Aerobic methylotrophic prokaryotes. In Dworkin, M., S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, and E. Stackebrandt (eds.). "The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria. Volume 2. Ecophysiology and biochemistry." Tercera edición. Springer, New York. Páginas 618-634.

12. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, H.S. Lee, K. Hari, S.P. Sundaram, and T.M. Sa. 2005. Pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria accelerate germination, growth and yield of sugarcane clone Co86032 (Saccharum officinarum L.) Biol. Fertil. Soils 41: 350-358.

13. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, M. Senthilkumar, S. Seshadri, H. Chung, J. Yang, S. Sundaram, and T. Sa.

2004. Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar C0-47 (Oryza saliva L.) by Methylobacterium spp. Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 315-324.

14. Madhaiyan, M., S. Poonguzhali, and T. Sa. 2007. Influence of plant species and environmental conditions on epiphytic and endophytic pink-pigmented facultative methylotrophic bacterial populations associated with fieldgrown rice cultivars. J Microbiol Biotechnol. Oct. 2007;17(10):1645-54.

15. Stanier, R.Y., N.J. Palleroni, and M. Doudoroff. 1966. The aerobic pseudomonads: A taxonomic study. J. Gen. Microbiol. 43: 159-271.

16. Sy, A., Giraud, E., Jourand, P., Garcia, N., Willems, A., De Lajudie, P., Prin, Y., Neyra, M., Gillis, M., Boivin-Masson,C., and Dreyfus, B. 2001. Methylotrophic Methylobacterium Bacteria Nodulate and Fix Nitrogen in Symbiosis with Legumes. Jour. Bacteriol. 183(1):214-220.

17. Sy, A., A.C.J. Timmers, C. Knief, and J.A. Vorholt. 2005. Methylotrophic metabolism is advantageous for Methylobacterium extorquens during colonization of Medicago truncatula under competitive conditions. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7245-7252.

18. Vogel, H.J., and D.M. Bonner. 1956. Acetylomithinase of Escherichia coli: Partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218: 97-106.

19. Vogel, H. J. 1956. A convenient growth medium for Neurospora (Medium N). Microbial Genet Bull 13: 42-43.

20. Whittenbury, R., S.L. Davies, and J.F. Wilkinson. 1970. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J. Gen. Microbiol. 61: 205-218.

21. Vuilleumier S, Chistoserdova L, Lee MC, Bringel F, Lajus A, Zhou Y, Gourion B, Barbe V, Chang J, Cruveiller S, Dossat C, Gillett W, Gruffaz C, Haugen E, Hourcade E, Levy R, Mangenot S, Muller E, Nadalig T, Pagni M, Penny C, Peyraud R, Robinson DG, Roche D, Rouy Z, Saenampechek C, Salvignol G, Vallenet D, Wu Z, Marx CJ, Vorholt JA, Olson MV, Kaul R, Weissenbach J, Médigue C, Lidstrom ME. Methylobacterium genome sequences: a reference blueprint to investigate microbial metabolism of C1 compounds from natural and industrial sources. PLoS One. 2009;4(5):e5584. doi: 10.1371/journal.pone.0005584. Epub 18 de mayo de 2009. PubMed PMID: 19440302; PubMed Central PMCID: PMC2680597.

22. Marx CJ, Bringel F, Chistoserdova L, Moulin L, Farhan Ul Haque M, Fleischman DE, Gruffaz C, Jourand P, Knief C, Lee MC, Muller EE, Nadalig T, Peyraud R, Roselli S, Russ L, Goodwin LA, Ivanova N, Kyrpides N, Lajus A, Land ML, Médigue C, Mikhailova N, Nolan M, Woyke T, Stolyar S, Vorholt JA, Vuilleumier S. Complete genome sequences of six strains of the genus Methylobacterium. J Bacteriol. 2012 Sep;194(17):4746-8. doi: 10.1128/JB.01009-12. PubMed PMID: 22887658; PubMed Central PMCID: PMC3415506.

23. Knief C, Frances L, Vorholt JA. Competitiveness of diverse Methylobacterium strains in the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and identification of representative models, including M. extorquens PA1. Microb Ecol. 2010 Aug;60(2):440-52. doi: 10.1007/s00248-010-9725-3. Epub 11 de agosto de 2010. PubMed PMID: 20700590.Ejemplo 6. La inoculación de semillas de lechuga "Rex" con PPFM aumenta la biomasa de brotes y raíces.

Siembra

Se colocó una plancha de 276 celdas de Oasis HORTICUBES® (corte delgado de 2,54 cm (1 pulgada); Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja de malla 1020. La bandeja se dividió por la mitad con un trozo de plástico para permitir dos grupos por bandeja. Los Oasis HORTICUBES® se regaron hasta saturación completa. Se utilizó semilla de lechuga Rex. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 132 o 144 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Las cepas de PPFM que se iban a ensayar se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 en un medio líquido suplementado con tierra de diatomeas a 2 gramos/litro. En el banco de trabajo, se pipeteó la cantidad deseada de solución PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para sedimentar las células a 7500 RPM durante 5 minutos a 23 °C. Se desechó el sobrenadante y los sedimentos de PPFM se resuspendieron en un volumen igual de agua.

Se pipetearon 100 microlitros de solución (solución de PPFM para los grupos tratados y agua corriente para los grupos de control) en la parte superior de cada semilla. El tubo se agitó periódicamente para mantener las células PPFM en suspensión. Se colocaron cúpulas de humedad transparentes sobre cada bandeja. Las bandejas se colocaron en un invernadero con ajustes de temperatura a 30 °C durante el día, 28 °C durante la noche y con una duración del día de 16 horas de día obtenida con el uso de luz complementaria si fuera necesario.

Crecimiento

Después de dos o tres días tras la siembra, las semillas habían germinado y se retiraron las cúpulas de humedad. Las bandejas se regaron por la parte superior y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego. Se llevó a cabo una reposición diaria de las bandejas para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de las condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de los brotes de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se realizaron observaciones visuales de la masa y el desarrollo de las raíces, y se observó que los grupos tratados mostraban más crecimiento en el momento de la recolección. La fila exterior de cada grupo no se recolectó para eliminar cualquier efecto de borde en las bandejas. Los resultados son como se muestran en la siguiente Tabla.

Tabla 5

continuación

Conclusión

Resultó evidente que las cepas de PPFM NLS0017, NLS0020, NLS21, NLS0037, NLS0038, NLS42, NLS46, NLS62, NLS64, NLS0065, NLS0066, NLS0068 y NLS0089 mostraron un aumento reproducible y estadísticamente significativo en el peso húmedo de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se observó, junto con un aumento en la biomasa de los brotes, un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Ejemplo 7. Pruebas de semillas de Flandria

Se trataron semillas de lechuga Flandria con los aislados de PPFM indicados esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 para producir los siguientes resultados.

Tabla 6

continuación

Resultó evidente que las cepas PPFM NLS0017, NLS0037, NLS0066, NLS0020, NLS0042, NLS0065, NLS0089, NLS0046, NLS0021. NLS0069, NLS0068, NLS0064, NLS0062 y NLS0038 proporcionaban una mayor biomasa de lechuga con respecto a los tratamientos de control.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una metilobacteria aislada NLS0017 (NRRL B-50931).

2. Una composición que comprende: (i) la metilobacteria aislada de la reivindicación 1; y (ii) un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que la metilobacteria aislada está a un valor cuantitativo de al menos 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

4. Uso de la composición de la reivindicación 2 para el tratamiento de una planta, una parte de una planta o un propágulo de una planta.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la parte de la planta es una hoja, tallo, flor, raíz, semilla, fruto, tubérculo o coleóptilo.

6. Una composición que comprende: (a) (i) una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma; o (ii) una emulsión con metilobacteria que ha crecido en la misma, en la que la metilobacteria es la metilobacteria aislada de la reivindicación 1, y (b) un excipiente agrícolamente aceptable, un adyuvante agrícolamente aceptable o una combinación de los mismos.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma tiene un valor cuantitativo de metilobacteria de al menos 5 x 108 UFC/g a al menos 1 x 1014 UFC/g.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la que la composición está adaptada para su uso en el tratamiento de una planta o semilla.

9. La composición de la reivindicación 2 o 6, en la que la composición es un producto esencialmente seco que tiene un 5 % o menos de contenido de agua.

10. La composición de la reivindicación 2, en la que la composición comprende, además, un plaguicida.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que el plaguicida es un insecticida, un fungicida, un nematicida o un bactericida.

12. La composición de la reivindicación 2, en la que la composición comprende, además, un microorganismo distinto de metilobacteria, en la que dicho microorganismo es bioplaguicida o proporciona algún otro beneficio cuando se aplica a una planta o parte de una planta.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que el microorganismo es Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp. o Trichoderma sp.

14. La composición de la reivindicación 2, en la que el adyuvante agrícolamente aceptable mejora la eficacia del producto o la facilidad de aplicación del producto.

15. Una planta, parte de planta o semilla que está recubierta total o parcialmente con la composición de la reivindicación 2.