ES2962611T3 - Variantes de virus adeno-asociados y procedimientos de utilización - Google Patents

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Bum-Yeol Hwang
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Abstract

La presente divulgación proporciona variantes de AAV que exhiben una preferencia por el movimiento retrógrado en neuronas y métodos para usar dichas variantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de virus adeno-asociados y procedimientos de utilización
CAMPO TÉCNICO
Esta divulgación se refiere en general a variantes de virus adeno-asociados y procedimientos de fabricación y uso.
ANTECEDENTES
Funciones cerebrales como la percepción, la cognición y el control del movimiento dependen de la acción coordinada de redes neuronales a gran escala, compuestas por módulos de circuitos locales que realizan cálculos específicos y están unidos por conexiones de largo alcance que distribuyen los resultados de estos cálculos. Estas conexiones de largo alcance están formadas por neuronas de proyección especializadas que a menudo incluyen varias clases entremezcladas, cada una de las cuales proyecta a un objetivo descendente diferente dentro de la red. También se ha implicado a las neuronas de proyección en la propagación de varias enfermedades neurodegenerativas a partir de lugares de aparición espacialmente localizados. Por lo tanto, la capacidad de dirigir selectivamente clases específicas de neuronas de proyección para la administración de transgenes (por ejemplo, para la monitorización/manipulación de la actividad o la edición del genoma para la eliminación selectiva de genes o la reparación de mutaciones patológicas) será importante tanto para obtener información sobre cómo las redes a gran escala contribuyen a la función cerebral como, a largo plazo, para la intervención terapéutica en enfermedades neurodegenerativas.
Los vectores virales constituyen una clase importante de herramientas para introducir transgenes en poblaciones neuronales específicas, y son con diferencia la mejor opción para el acceso genético a neuronas de proyección diana a través de la entrada en terminales axonales y el transporte retrógrado de su carga útil a los núcleos celulares. Varios virus neurotrópicos que han evolucionado de forma natural presentan la propagación retrógrada como parte de su ciclo de vida, como la rabia, el poliovirus y el virus del herpes simple (VHS), entre otros. De ellos, el virus de la rabia es particularmente neuroinvasivo y se propaga rápidamente por el sistema nervioso mediante transferencia transcelular. Sin embargo, su potencial tanto para la investigación biológica como para la terapia génica se ve obstaculizado por su excesiva virulencia, aunque se está avanzando en la reducción de su toxicidad. Además de las cepas neurotrópicas naturales, muchos otros virus pueden infectar neuronas cuando se administran directamente al sistema nervioso, siendo la "pseudorabia" (SuHV1, en realidad un herpesvirus), los adenovirus y los lentivirus los más utilizados en la investigación con animales. El adenovirus canino-2 (CAV-2) muestra la mejor infectividad y transporte retrógrado de esta clase de virus y se ha convertido cada vez más en el reactivo de elección para acceder a las neuronas de proyección. Sin embargo, el CAV-2 sólo permite niveles modestos de expresión transgénica, presenta un potencial de toxicidad y, en la actualidad, no es fácilmente compatible con una producción escalable y robusta para la generación de estudios de grado clínico o incluso de grandes animales. Por lo tanto, el desarrollo de un vector viral no tóxico, de fácil fabricación, que permita el empaquetamiento flexible de diferentes transgenes, que sea sólidamente internalizado y transportado retrógradamente por los axones, y que soporte la expresión a largo plazo de cargas útiles de alto nivel, sigue siendo una necesidad apremiante.
Lochrie et al., 2006, Virology, 353:68-82 describe genes de la cápside de virus adeno-asociados aislados de ADN genómico de hígado de rata y ratón definen dos especies deAAV distantemente relacionadas con AAV-5. Bello et al., 2014, Scientific Reports, 4:6644 describe que los virus adenoasociados derivados de tejidos porcinos transducen la mayoría de los órganos principales en ratones. WO 2016/054554 A1 describe virus adeno-asociados recombinantes con distintas capacidades de orientación tisular. WO 2006/119150 A2 describe proteínas de la cápside vírica con una mayor orientación a las neuronas y un mayor transporte retrógrado. WO 2015/121501 A1 describe un vector AAV recombinante. Salegio et al., 2013, Gene Therapy, 20:348-352 describe que el transporte axonal de vectores virales adenoasociados depende del serotipo. Aschauer et al., 2013, Plos One, 8:e76310 describe el análisis de la eficacia de la transducción, el tropismo y el transporte axonal de los serotipos 1, 2, 5, 6, 8 y 9 deAAV en el cerebro de ratón. WO 2015/038958 A1 describe procedimientos de cribado selectivo, diversas proteínas y secuencias diana, así como procedimientos para su uso.
SUMARIO
El acceso retrógrado eficiente a las neuronas de proyección para la entrega de sensores y efectores constituye una capacidad importante y habilitadora para la disección de circuitos. Este enfoque también sería útil para la terapia génica, incluido el tratamiento de trastornos neurodegenerativos caracterizados por la propagación patológica a través de redes funcionalmente conectadas y altamente distribuidas. Los vectores virales, en particular, son potentes vehículos de administración de genes para el sistema nervioso, pero todas las herramientas disponibles adolecen de un transporte retrógrado ineficaz o de un potencial clínico limitado. Para responder a esta necesidad, se aplicó la evolución dirigidainvivo a la ingeniería de una potente funcionalidad retrógrada en la cápside del virus adenoasociado (AAV), un vector prometedor para la investigación neurocientífica y la clínica. La variante aquí descrita, denominada rAAV2-retro, permite un acceso retrógrado robusto a las neuronas de proyección con una eficacia comparable a la de los reactivos sintéticos clásicos de etiquetado retrógrado, y permite un alto nivel de expresión que es suficiente para la interrogación de circuitos funcionales y la edición del genomain vivoutilizando CRISPR/Cas9 en poblaciones neuronales diana.
La invención se describe en las reivindicaciones. Las proteínas de la cápside viral descritas en los párrafos siguientes, en la medida en que no entren en el ámbito de las reivindicaciones, no forman parte de la invención.
En un aspecto, se proporciona una proteína de cápside viral que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en xxDxTKx (SEQ ID NO:1) y xDxTKxx (SEQ ID NO:2), donde la proteína de cápside viral tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78. La proteína de la cápside viral puede tener al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. La proteína de la cápside viral puede tener la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. La proteína de la cápside viral puede estar codificada por un ácido nucleico que tenga al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77. La proteína de la cápside viral puede estar codificada por un ácido nucleico que tenga la secuencia mostrada en SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77.
En otro aspecto, se proporciona una partícula de virus que incluye una proteína de cápside viral como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la partícula de virus muestra preferencia por el movimiento retrógrado. En algunas realizaciones, la partícula de virus posee capacidad de transporte retrógrado.
En algunas realizaciones, una partícula de virus tal como se describe en el presente documento incluye además un ácido nucleico que codifica una carga útil. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una carga útil incluye una secuencia promotora unida operablemente a una secuencia codificante que codifica la carga útil. Las secuencias promotoras representativas incluyen, sin limitación, sinapsina-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, TRE y mDlx. En algunas realizaciones, la secuencia codificante que codifica la carga útil se selecciona del grupo que consiste en un gen codificante de proteínas y un ácido nucleico ARN inhibidor. En algunas realizaciones, el ácido nucleico ARN inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARNsi o un ARNi.
En algunas realizaciones, la carga útil es una proteína efectora. Las proteínas efectoras representativas incluyen, sin limitación, una recombinasa (por ejemplo, Cre o Flp), un sistema de edición de genes (por ejemplo, CRISPR/Cas9, TALEN, nucleasa de dedos de zinc), reactivos optogenéticos (activadores (por ejemplo, canalrodopsina o variantes de la misma) o inhibidores (por ejemplo, halorodopsina o Arco)), reactivos quimiogenéticos (por ejemplo, versiones activadoras/inhibidoras de los sistemas DREADD o PSAM/PSEM), activadores y/o inhibidores de vías del sistema celular, y enzimas para el control de la epigenética.
En algunas realizaciones, la carga útil es un constructo informador óptico. Los constructos informadores ópticos representativos incluyen, sin limitación, GCaMP6 (s, m, o f), un fluoróforo (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), GFP mejorada (EGFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), tdTomato), un constructo de cambio de color (por ejemplo, una carga útil que expresa un informador en una población celular y un informador diferente en otra población), sensores de glucosa, jRCaMP, jRGECO y CaMPARI, indicadores de voltaje, mensajeros secundarios, señalizadores de receptores, informadores de transcripción, informadores epigenéticos y informadores neuromoduladores.
En algunas realizaciones, la carga útil es una proteína viral. Una proteína viral representativa es la proteína G de la rabia. En algunas realizaciones, la proteína viral es una proteína que complementa la función de un virus distinto del AAV o una proteína relacionada con el transporte celular y transcelular.
En algunas realizaciones, la secuencia codificante que codifica la carga útil es un gen terapéutico. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es el HSP104 para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades con agregados proteicos tóxicos. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es la frataxina para el tratamiento de la ataxia de Friedreich. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es glucocerebrosidasa lisosomal (GBA) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es la proteína de unión a poliQ para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. En algunas realizaciones, el gen terapéutico es la neurona motora de supervivencia 1 para el tratamiento de la atrofia muscular espinal, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), el autismo, la demencia, la neuropatía periférica, la esquizofrenia o la degeneración retiniana.
En algunas realizaciones, la carga útil es una fracción terapéutica. Una fracción terapéutica representativa es un anticuerpo o un fragmento del mismo. Una fracción terapéutica representativa es una proteína inmunomoduladora. Una fracción terapéutica representativa es una molécula de ARN de interferencia.
En algunas realizaciones, las partículas de virus aquí descritas presentan un acceso retrógrado a las neuronas de proyección córtico-pontinas hasta dos órdenes de magnitud mayor que el adenovirus-2 canino (CAV-2). En algunas realizaciones, el acceso retrógrado a las neuronas de proyección cortico-pontinas o aferentes al estriado dorsomedial (DMS) es comparable al del trazador sintético, perlas fluorescentes Fluoro-Gold.
También se describe un procedimiento para administrar una carga útil a una o más neuronas. Dicho procedimiento suele incluir el contacto de una o más neuronas con una variante de virus adeno-asociado (AAV) que incluye una carga útil empaquetada en el mismo, en el que la variante AAV incluye una proteína de cápside que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) y xDxTKxx (SEQ ID NO:2). En algunas realizaciones, la variante AAV exhibe movimiento retrógrado en las neuronas.
Otro aspecto es una variante de virus adeno-asociado (AAV) que comprende una carga útil empaquetada en el mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, el procedimiento que comprende el contacto de una o más neuronas con dicha variante de AAV, en el que dicha variante de AAV comprende una proteína de cápside que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en xxDxTKx (SEQ ID NO: 1) y xDxTKxx (s Eq ID NO:2), donde la variante AAV tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.
En algunas realizaciones, las neuronas son neuronas de proyección. En algunas realizaciones, las neuronas se encuentran en un sujeto (por ejemplo, en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un no humano (por ejemplo, un primate, un roedor, un reptil o un ave). El paso de contacto puede ser en cultivo celular. En algunas realizaciones, la etapa de contacto esin vivomediante inyección intracraneal, intraespinal o intramuscular.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos normales en la materia a la que pertenecen los procedimientos y composiciones de la materia.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la evolución dirigida del rAAV2-retro. El panel A de la Figura 1 es un esquema del procedimiento de evolución dirigida. Se empaquetaron y se inyectaron en la sustancia negra o en núcleos cerebelosos profundos bibliotecas de plásmidos que contenían variantes de los genes AAV cap generados previamente mediante PCR propensa a errores, inserción de péptidos, aleatorización de las regiones de bucle y redistribución del ADN. 3 semanas después, se extrajo el tejido estriado o del rombencéfalo, respectivamente, se aislaron los genomas virales y se amplificaron y empaquetaron los genes cap seleccionados para la siguiente ronda de selección. El panel B de la Figura 1 muestra las subpoblaciones entremezcladas de neuronas corticales que se proyectan al estriado (CP: caudado-putamen), tálamo y colículo superior (SC) marcadas retrogradualmente mediante la inyección de rAAV2-retro portador de diferentes proteínas fluorescentes en el campo axonal correspondiente.
La Figura 2 muestra los resultados de experimentos para cuantificar la eficiencia del transporte retrógrado. El panel A de la Figura 2 muestra el tracto cortico-pontino marcado mediante la inyección pontina basal de rAAV2-retro [El panel superior del panel A muestra un esquema del experimento; la consistencia de la orientación y la calidad de la inyección se monitorizaron mediante la co-inyección de AAV1-CAG-EGFP El panel inferior del panel A muestra el nivel de expresión 3 semanas después de la inyección. Barra de escala: 1 mm]. El panel B de la Figura 2 muestra el diseño del ensayo de cuantificación [El panel superior del panel B muestra un esquema del experimento; la flecha indica el etiquetado nuclear de GFP esperado en las neuronas corticales del tracto cortico-pontino. El panel central del panel B muestra una imagen representativa de un cerebro inyectado con AAV2. El panel inferior del panel B muestra una imagen representativa del cerebro rAAV2retroinyectado. Barra de escala: 1 mm]. El panel C de la Figura 2 muestra un esquema del procedimiento de cuantificación semiautomatizado. Los núcleos fluorescentes (verde) se detectaron automáticamente y se contaron a lo largo de una línea trazada manualmente que trazaba la longitud de la capa cortical V (negro). El panel D de la Figura 2 muestra la eficiencia del transporte retrógrado para diferentes serotipos de AAV y para el adenovirus canino-2 (CAV-2). Las barras de error representan el SEM. Véase también la figura 8.
La Figura 3 muestra los resultados de experimentos para demostrar la generalidad del transporte retrógrado que ofrece rAAV2-retro. El panel A de la Figura 3 son imágenes representativas que muestran un etiquetado extenso en las principales estructuras de entrada al estriado dorsal, incluyendo la corteza (imagen #1), la amígdala (imagen #3) y el tálamo (imagen #4). El panel B de la Figura 3 muestra un esquema de la cuantificación automatizada del etiquetado retrógrado en todo el cerebro. Se tomaron imágenes de los cerebros de Rosa26-LSL-H2B-GFP inyectados con rAAV2-retro hSyn1-Cre para visualizar los núcleos teñidos con DAPI y la fluorescencia verde de los núcleos que expresan H2B-GFP. El canal verde se utiliza para detectar neuronas marcadas; el canal azul se alinea con las imágenes Nissl del cerebro de ratón estándar del Allen Brain Institute. La alineación permite asignar las neuronas detectadas a distintas regiones utilizando la anotación proporcionada por el atlas cerebral. Barra de escala: 1.25 mm. El panel C de la Figura 3 muestra la cuantificación de todo el cerebro del etiquetado retrógrado fuera de una pequeña región del estriado dorso-medial. Las abreviaturas de las distintas áreas cerebrales se indican de acuerdo con el Atlas Cerebral de Allen. La flecha señala el SNc. Las barras de error representan el SEM.
La Figura 4 muestra datos de experimentos en los que el sistema rAAV2-retro se combinó con líneas de controladores Cre. El panel A de la Figura 4 muestra un esquema del experimento. Se inyectó rAAV2-retro con un informador fluorescente de cambio de color dependiente de Cre en el estriado de una línea Cre específica de la capa V cortical. El panel B de la Figura 4 muestra las dos vías corticoestriatales marcadas diferencialmente mediante una inversión dependiente de Cre del informador en una vía, pero no en la otra.
La Figura 5 muestra datos de experimentos que demuestran que el rAAV2-retro soporta una expresión transgénica suficiente para la interrogación del circuito funcional. El panel A de la Figura 5 es un esquema del experimento. La expresión del indicador de calcio GCaMP6f se restringe a las neuronas cortico-pontinas mediante la inyección localizada de rAAV2-retro en la protuberancia basal. El panel B de la Figura 5 es un corte transversal del cerebro que muestra la expresión de GCaMP6f en todo el tracto córtico-pontino. El panel C de la Figura 5 muestra la proyección máxima de una imagen de calcio de dos fotones que muestra los somas y las dendritas apicales del tracto piramidal de la capa V. El Panel D de la Figura 5 muestra la actividad de 89 ROIs durante una sola repetición de alcance de mano (la línea discontinua denota la señal de tono "adelante"). Los paneles E y F de la Figura 5 son dos ejemplos de neuronas cortico-pontinas individuales durante 40 ensayos consecutivos (el mismo animal que en los paneles B y D de la Figura 5).
La Figura 6 muestra que el sistema rAAV2-retro permite la edición del genomain vivomediante CRISPR/Cas9. El panel A de la Figura 6 es un esquema del experimento [El panel superior del panel A muestra que el sistema rAAV2-retro se utilizó para administrarStaphylococcus aureusCas9 (SaCas9) -combinación deARN guía único diseñado para eliminar la expresión detdTomato. El panel inferior del panel A muestra que el rAAV2-retro portador de la carga útil SaCas9-anti-tdTomato fue inyectado en la protuberancia basal de ratones que expresan tdTomato a partir de un único locus genómico en las neuronas de la capa V]. El panel B de la Figura 6 muestra imágenes representativas de secciones cerebrales de animales que recibieron el sistema CRISPR/Cas9 dirigido contra tdtomato o portadores de una guía no dirigida. SaCas9 se marcó con un epítopo, lo que permitió identificar las neuronas marcadas de forma retrógrada (canal verde). Las flechas hacia arriba muestran el etiquetado esperado tras la ablación exitosa de tdTomato; las flechas hacia abajo muestran el etiquetado esperado si la expresión de tdTomato no se ve afectada. El panel C de la figura 6 muestra la eficacia de la ablación. Las barras de error representan el SEM.
La Figura 7 son datos que muestran que el rAAV2-retro media el acceso eficiente a las neuronas de proyección en la rata (los datos mostrados en la Figura 7 están relacionados con los datos mostrados en la Figura 1). El panel A de la figura 7 es un esquema de la inyección. Se inyectaron lotes separados de rAAV2-retro que expresaban EGFP o tdTomato en el cuerpo estriado o en el colículo superior, respectivamente. Los paneles B-E de la Figura 7 muestran neuronas de proyección en varias regiones cerebrales a las que se accedió mediante estas inyecciones localizadas y de las que se obtuvieron imágenes 3 semanas después de la administración del virus.
La Figura 8 son imágenes representativas de cerebros de animales inyectados con varios serotipos de AAV en la protuberancia basal, que muestran que ningún serotipo de AAV de origen natural iguala el rendimiento de rAAV2-retro en el circuito córtico-pontino (los datos mostrados en la Figura 8 están relacionados con los datos mostrados en la Figura 2).
La Figura 9 son datos que muestran una afinidad reducida de la heparina por el rAAV2-retro en comparación con su serotipo parental AAV2 (los datos mostrados en la Figura 9 están relacionados con los datos mostrados en la Figura 1). El panel A de la Figura 9 es un esquema del ensayo de unión a heparina. El panel B de la Figura 9 muestra una fracción de virus eluida con concentraciones crecientes de NaCl tras la carga en 150 mM de NaCl. La fracción de carga representa el virus recuperado en el flujo de la columna tras la carga de la muestra en NaCl 150 mM. Las barras de error representan la DE.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los virus adeno-asociados recombinantes (rAAVs) han surgido como una plataforma eficaz para la terapia génica in vivo, ya que median la expresión de transgenes de alto nivel, no son tóxicos y evocan respuestas inmunes mínimas. Estas propiedades fueron la base de la decisión de conceder la primera aprobación reglamentaria completa de cualquier tratamiento de terapia génica a la restauración mediada por rAAV de la deficiencia de lipoproteína lipasa (véase, por ejemplo, Gaudet et al., 2010, Atherosclerosis Supplem., 11:55-60). Los rAAV son muy prometedores en los ensayos clínicos para una serie de trastornos neurológicos, y constituyen algunos de los vectores más extendidos en la investigación neurocientífica. Desde el descubrimiento original de que los AAV pueden sufrir transporte retrógrado (Kaspar et al., 2002, Mol. Ther., 5:50-56), los rAAV han permitido cierto grado de acceso retrógrado a las neuronas de proyección en circuitos seleccionados, pero su propensión natural al transporte retrógrado es baja, lo que dificulta los esfuerzos para abordar el papel de las neuronas de proyección en los cálculos del circuito o la progresión de la enfermedad.
La presente divulgación describe una nueva variante del rAAV (rAAV2-retro) que, además de su capacidad habitual para infectar cuerpos celulares neuronales en el lugar de exposición, es internalizada de forma robusta por los axones y media el acceso retrógrado a las neuronas de proyección con una eficacia comparable a la de los reactivos de etiquetado retrógrado clásicos, como los colorantes sintéticos. El sistema de administración de genes rAAV2-retro descrito en el presente documento puede utilizarse solo o junto con líneas controladoras de recombinasa Cre para lograr una expresión transgénica de alto nivel y a largo plazo que sea suficiente para una interrogación funcional eficaz de la función del circuito neuronal, así como para la edición del genoma en poblaciones neuronales seleccionadas.
El transporte retrógrado lanza moléculas y/u orgánulos desde las terminaciones axónicas hacia el cuerpo celular. El transporte axonal retrógrado está mediado por la dineína citoplasmática, y se utiliza, por ejemplo, para enviar mensajes químicos y productos de endocitosis dirigidos a endolisosomas desde el axón de vuelta a la célula. Operandoin vivoa velocidades medias de aproximadamente 2 pm/seg, el transporte retrógrado rápido puede cubrir de 10 a 20 centímetros por día. El transporte retrógrado rápido devuelve al soma las vesículas sinápticas usadas y otros materiales e informa al soma de las condiciones en los terminales del axón. Por lo tanto, tal y como se utiliza aquí, el transporte "retrógrado" se refiere al movimiento en un axón hacia su cuerpo celular.
Secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de virus adenoasociados (AAV)
Como se describe en el presente documento, se identificaron secuencias consenso que, cuando están presentes en una proteína de la cápside del AAV, dan lugar a una profunda mejora de la eficacia del transporte retrógrado. Estas secuencias de consenso son xxDxTKx (SEQ ID NO:1) o xDxTKxx (SEQ ID NO:2). Para demostrar la eficacia de las secuencias consenso descritas en el presente documento para impartir capacidad de transporte retrógrado, se generaron diecisiete secuencias de cápside diferentes, cada una de las cuales contenía una secuencia consenso como la descrita en el presente documento, y se demostró que mostraban preferencia por el movimiento retrógrado en las neuronas. La secuencia de ácido nucleico de esas 40 secuencias de cápside se muestra en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77, y los polipéptidos de cápside codificados, cada uno de los cuales contiene una de las secuencias consenso descritas en el presente documento, se muestran en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, respectivamente.
Además de los polipéptidos de la cápside que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78, se proporcionan polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (p. ej., al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de cápside que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78. Del mismo modo, además de las moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (p. ej., al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia) con las moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77.
Para calcular el porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para obtener un valor porcentual de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño de longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una única secuencia puede alinearse con más de una secuencia y, por lo tanto, puede tener diferentes valores porcentuales de identidad de secuencia en cada región alineada.
La alineación de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse utilizando el algoritmo descrito por Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:33893402) tal y como se incorporan a los programas BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local), disponibles en ncbi.nlm.nih.gov en la World Wide Web. Se pueden realizar búsquedas BLAST para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia (ácido nucleico o aminoácido) y cualquier otra secuencia o parte de la misma alineada mediante el algoritmo de Altschul et al. BLASTN es el programa utilizado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP es el programa utilizado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoácidos. Cuando se utilizan programas BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre una secuencia y otra, generalmente se utilizan los parámetros por defecto de los respectivos programas.
También se proporcionan vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos. Los vectores, incluidos los de expresión, están disponibles en el mercado o pueden producirse mediante tecnología recombinante. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico puede tener uno o más elementos para la expresión enlazados operablemente a dicha molécula de ácido nucleico, y además puede incluir secuencias como las que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos), y/o las que pueden utilizarse en la purificación de un polipéptido (por ejemplo, la etiqueta 6xHis). Los elementos de expresión incluyen secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácidos nucleicos. Un ejemplo de elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir uno o más intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de una molécula de ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, de levadura, de insecto, de mamífero o vírico, y los vectores pueden contener una combinación de elementos de expresión de distintos orígenes. Tal como se utiliza en el presente documento, vinculado operablemente significa que los elementos para la expresión se colocan en un vector en relación con una secuencia codificante de tal manera que dirigen o regulan la expresión de la secuencia codificante.
Una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico en un vector (por ejemplo, un vector de expresión, un vector viral) puede introducirse en una célula huésped. El término "célula huésped" se refiere no sólo a la(s) célula(s) concreta(s) en la(s) que se ha introducido la molécula de ácido nucleico, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Las células huésped pueden ser procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, levaduras, insectos, plantas o mamíferos). Las células huésped representativas pueden incluir, sin limitación, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293, Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y células primarias de fibroblastos, hepatocitos y mioblastos derivadas de mamíferos, incluidos humanos, monos, ratones, ratas, conejos y hámsters. Los procedimientos para introducir moléculas de ácido nucleico en las células huésped son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, la precipitación de fosfato cálcico, la electroporación, el choque térmico, la lipofección, la microinyección y la transferencia de ácido nucleico mediada por virus (por ejemplo, la transducción).
Con respecto a los polipéptidos, "purificado" se refiere a un polipéptido (es decir, un péptido o un polipéptido) que ha sido separado o purificado de los componentes celulares que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido se considera "purificado" cuando está al menos en un 70% (por ejemplo, al menos en un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) en peso seco, libre de los polipéptidos y moléculas naturales con los que está naturalmente asociado. Dado que un polipéptido sintetizado químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de forma natural, un polipéptido sintético se considera "purificado", pero puede separarse aún más de los componentes utilizados para sintetizar el polipéptido (por ejemplo, los residuos de aminoácidos). Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, "aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que suelen estar asociadas a ella en el genoma. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico manipulada, como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.
Los polipéptidos pueden obtenerse (p. ej., purificarse) a partir de fuentes naturales (p. ej., una muestra biológica) mediante procedimientos conocidos como el intercambio iónico DEAE, la filtración en gel y/o la cromatografía de hidroxiapatita. También puede obtenerse un polipéptido purificado, por ejemplo, expresando una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión o mediante síntesis química. El grado de pureza de un polipéptido puede medirse utilizando cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC. Del mismo modo, las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse (por ejemplo, aislarse) utilizando procedimientos rutinarios como, sin limitación, la tecnología de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción y ligación) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Además, las moléculas aisladas de ácido nucleico pueden sintetizarse químicamente.
Procedimientos de fabricación de partículas de virus que muestran preferencia por el movimiento retrógrado en las neuronas
Una vez que se ha producido un polipéptido de cápside, o una vez que se ha generado y expresado una molécula de ácido nucleico para producir un polipéptido de cápside, el polipéptido puede ensamblarse en una partícula de virus utilizando, por ejemplo, una célula huésped de empaquetamiento. Los componentes de una partícula de virus (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap, secuencias de repetición terminal invertida (ITR)) pueden introducirse, de forma transitoria o estable, en una célula huésped de empaquetamiento utilizando uno o más vectores. Mientras que el polipéptido de la cápside de una partícula de virus puede contener una secuencia consenso como se describe en el presente documento, los componentes restantes pueden ser de uno o más serotipos conocidos deAAV (por ejemplo, AAV2, AAV8, etc.).
Dichas partículas de virus pueden purificarse utilizando procedimientos rutinarios. Tal y como se utiliza en el presente documento, las partículas de virus "purificadas" se refieren a partículas de virus a las que se les han eliminado los componentes de la mezcla en la que se crearon, como, por ejemplo, componentes víricos (p. ej., secuencias rep, secuencias cap), células huésped de empaquetamiento y partículas de virus parcial o incompletamente ensambladas.
Una vez ensambladas, las partículas de virus pueden ser examinadas para, por ejemplo, la capacidad de replicación; propiedades de transferencia de genes; capacidad de unión a receptores; y/o seroprevalencia en una población (por ejemplo, una población humana). Determinar si una partícula de virus puede replicarse es rutinario en la técnica y normalmente incluye infectar una célula huésped con una cantidad de partículas de virus y determinar si las partículas de virus aumentan en número con el tiempo. Determinar si una partícula de virus es capaz de realizar una transferencia génica también es rutinario en la técnica y normalmente incluye infectar células huésped con partículas de virus que contienen un transgén (por ejemplo, un transgén detectable como un gen informador). Tras la infección y la eliminación del virus, se puede evaluar la presencia o ausencia del transgén en las células huésped. Determinar si una partícula de virus se une a su receptor es rutinario en la técnica, y tales procedimientos pueden realizarsein vitrooin vivo.
La determinación de la seroprevalencia de una partícula de virus se realiza rutinariamente en la técnica y típicamente incluye el uso de un inmunoensayo para determinar la prevalencia de uno o más anticuerpos en muestras (por ejemplo, muestras de sangre) de una población particular de individuos. La seroprevalencia se entiende en la técnica como la proporción de sujetos de una población que es seropositiva (es decir, que ha estado expuesta a un patógeno o inmunógeno concreto), y se calcula como el número de sujetos de una población que producen un anticuerpo contra un patógeno o inmunógeno concreto dividido por el número total de individuos de la población examinada. Los inmunoensayos son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, un inmunodot, transferencia Western , inmunoensayos enzimáticos (EIA), ensayo inmunoenzimático (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA). Del mismo modo, existen varios procedimientos para determinar el grado de anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. Por ejemplo, un ensayo de anticuerpos neutralizantes mide el título en el que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos que neutraliza la infección en un 50% o más en comparación con una muestra de control sin anticuerpos. Ver también, Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12); y Manning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85).
Procedimientos de utilización de virus que muestran preferencia por el movimiento retrógrado en las neuronas
Un virus o una porción del mismo, tal como se describe en el presente documento, puede utilizarse en diversas aplicaciones de investigación y/o terapéuticas. Por ejemplo, un virus o una porción del mismo según se describe en el presente documento puede utilizarse en medicina humana o animal para terapia génica (por ejemplo, en un vector o sistema de vectores para transferencia génica) o para vacunación (por ejemplo, para presentación de antígenos). Más específicamente, un virus o una porción del mismo como se describe en el presente documento puede utilizarse para la adición de genes, el aumento de genes, la administración genética de un polipéptido terapéutico, la vacunación genética, el silenciamiento de genes, la edición del genoma, la terapia génica, la administración de ARNi, la administración de ADNc, la administración de ARNm, la administración de miARN, el esponjamiento de miARN, la inmunización genética, la terapia génica optogenética, la transgénesis, la vacunación con A d N o la inmunización con ADN.
Una célula huésped puede transducirse o infectarse con un virus o una porción del mismoin vitro(p. ej., creciendo en cultivo) oin vivo(p. ej., en un sujeto, p. ej., humano o no humano). Las células huésped que pueden transducirse o infectarse con un virus o una parte del mismoin vitrose describen en el presente documento; las células huésped que pueden transducirse o infectarse con un virus o una parte del mismoin vivoincluyen, sin limitación, neuronas de proyección (por ejemplo, neuronas de proyección cortico-pontinas, neuronas de proyección simpáticas, neuronas de proyección del sistema nervioso central), aferentes al estriado dorsomedial (d Ms ), neuronas corticales/funiculares espinales, neuronas pre-cerebelosas, entradas a ganglios basales, neuronas pre-talámicas, motoneuronas, neuronas sensoriales, u otras neuronas o células del sistema nervioso central.
Un virus o parte del mismo, tal y como se describe en el presente documento, puede modificarse para incluir una carga útil. Una carga útil incluye típicamente al menos un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia promotora unida operablemente a una secuencia codificadora que codifica la carga útil). En ciertos casos, la carga útil puede ser un ácido nucleico inhibidor. Los ácidos nucleicos inhibidores son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ARN de interferencia corta (siARN) y moléculas de ARN de interferencia (ARNi). En ciertos casos, una carga útil puede ser uno o más genes codificadores de proteínas. Sin limitación, los genes codificadores de proteínas incluyen un constructo informador óptico, un gen terapéutico o una proteína efectora.
Se conocen muchos tipos de constructos de informador óptico en la técnica, y la siguiente lista pretende ser representativa y no exhaustiva. Por ejemplo, los constructos de informador óptico incluyen, sin limitación, GCaMP6 (GCaMP6s, GCaMP6m, o GCaMP6f; véase WO 2014/059154), un fluoróforo (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), GFP mejorada (EGFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), tdTomato), un constructo de cambio de color (por ejemplo, una carga útil que expresa un informador en una población celular y un informador diferente en otra población), sensores de glucosa (por ejemplo, US 2015/0111222), iRCaMP (Patente estadounidense n.° 9.644.007), iRGECO (por ejemplo, Patente estadounidense n.° 9.644.007), CaMPARI (por ejemplo, Patente estadounidense n° 9.518.996), indicadores de voltaje, mensajeros secundarios, señalizadores de receptores, informadores de transcripción, informadores epigenéticos y informadores de neuromoduladores.
Los genes terapéuticos también son conocidos en la técnica y dependerán de la enfermedad o trastorno concreto que se esté tratando. Por ejemplo, un gen terapéutico puede ser para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo. Los genes terapéuticos representativos (o el polipéptido codificado) y sus trastornos neurodegenerativos asociados incluyen, sin limitación, HSP104 para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, Ataxis (p. ej., frataxina) para el tratamiento de la ataxia de Friedreich, la glucocerebrosidasa lisosomal (GBA) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la proteína de unión a poliQ para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, la neurona motora de supervivencia 1 para el tratamiento de la atrofia muscular espinal, y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), el autismo, la demencia, la neuropatía periférica, la esquizofrenia y la degeneración retiniana. En algunos casos, la carga útil puede ser una fracción terapéutica (en lugar de un gen). Las fracciones terapéuticas incluyen, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, una proteína inmunomoduladora o una molécula de ARN de interferencia (ARNi).
Tal como se utiliza en el presente documento, una proteína "efectora" se refiere a cualquier tipo de proteína que imparte un efecto sobre una célula o el contenido de la misma (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, orgánulos o procesos que implican cualquiera de los anteriores). Por ejemplo, las proteínas efectoras incluyen, sin limitación, recombinasas (por ejemplo, Cre o Flp), sistemas de edición de genes (por ejemplo, CRISPR/Cas9, TALEN, nucleasas de dedos de zinc), reactivos optogenéticos (activadores (por ejemplo, canalrodopsina o variantes de la misma) o inhibidores (por ejemplo, halorodopsina o Arco)), reactivos quimiogenéticos (por ejemplo, versiones activadoras/inhibidoras de los sistemas DREADD o PSAM/PSEM), activadores y/o inhibidores de vías del sistema celular, y enzimas para el control de la epigenética.
Se apreciaría que podría ser deseable administrar una proteína viral que complemente o inhiba la función de un virus (por ejemplo, un virus distinto del AAV). Por ejemplo, una proteína viral que sea un receptor de entrada (por ejemplo, la proteína G de la rabia, una proteína relacionada con el transporte celular y/o transcelular).
Se puede utilizar cualquier número de promotores para dirigir la secuencia que codifica la carga útil. Los promotores constitutivos son conocidos en la técnica, al igual que los promotores específicos de tejido (por ejemplo, promotores específicos de neurona). Simplemente a modo de ejemplo, el promotor puede ser un promotor de sinapsina-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, mDlx o TRE.
Un virus o una porción del mismo, generalmente suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano o no humano (por ejemplo, un primate, un roedor, un reptil o un ave)). Los portadores adecuados incluyen solución salina, que puede formularse con una variedad de soluciones tamponadoras (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina y agua. El virus o parte del mismo se administra en cantidades suficientes para transducir o infectar las células y proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otras, la inyección intracraneal, intraespinal o intramuscular. Otras vías de administración son, por ejemplo, oral, intranasal, intratraqueal, por inhalación, intravenosa, intraocular, subcutánea, intradérmica, transmucosa o por otras vías de administración. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.
La dosis del virus o porción del mismo administrada a un sujeto dependerá principalmente de factores como la afección a tratar, y la edad, peso y salud del sujeto. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz de un virus o de una porción del mismo que se va a administrar a un sujeto humano suele estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml de una solución que contiene concentraciones de aproximadamente 1 ><101 a 1 *1012 copias genómicas (CG) de virus (por ejemplo, aproximadamente 1 *103 a 1 *109 CG). La transducción y/o expresión de un transgén puede controlarse en varios momentos tras la administración mediante ensayos de ADN, ARN o proteínas. En algunos casos, los niveles de expresión del transgén pueden monitorizarse para determinar la frecuencia y/o cantidad de dosificación.
Significativamente, las partículas AAV-retro aquí descritas exhiben hasta dos órdenes de magnitud de mayor acceso retrógrado a las neuronas de proyección cortico-pontinas que, por ejemplo, el adenovirus canino-2 (CAV-2), y el acceso retrógrado a ciertas neuronas (por ejemplo, neuronas de proyección cortico-pontinas o aferentes al estriado dorsomedial (DMS)) es comparable al observado con un trazador sintético como las perlas fluorescentes Fluoro-Gold®.
De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de la habilidad del arte. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1-Procedimientos experimentales
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Janelia Research Campus y de la Universidad de California Berkeley.
Ejemplo 2: Generación de bibliotecas y producción viral
Al inicio del procedimiento de evolución dirigida se utilizaron cuatro bibliotecas virales generadas previamente: 1) una biblioteca de mutagénesis aleatoria generada sometiendo el gen cap deAAV2 (que codifica las proteínas virales VP1-3 y la proteína activadora del ensamblaje (AAP)) a una PCR propensa a errores (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol, 24:198-204); 2) biblioteca de variantes del gen cap AAV2 que contienen inserciones peptídicas de 7-mer entre N587 y R588 (Müller et al., 2003, Nat. Biotechnol, 21:1040-6); 3) biblioteca de variantes del gen cap AAV2 que contienen regiones de bucle aleatorizadas (Koerber et al., 2009, Mol. Ther, 17:2088-95); y 4) una biblioteca de redistribución de ADN generada a partir de secuencias de genes cap AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8 yAAV9 de tipo salvaje (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9). Cada grupo de ADN mutante se había subclonado originalmente en el plásmido de empaquetamiento AAV de replicación competente para crear una biblioteca de plásmidos virales que, cuando se empaquetan en viriones AAV, pueden seleccionarse para cualquier nueva propiedad o función. El sistema AAV competente para la replicación incorpora el gen cap mutante en la carga viral y, de este modo, el genotipo de cada variante está vinculado a su fenotipo. Las secuencias de la cápside de la propiedad deseada pueden recuperarse entonces mediante el análisis de la secuencia de ADN del genoma delAAV encapsulado.
Las cuatro bibliotecas AAV de replicación competente se empaquetaron mediante transfección transitoria con fosfato de calcio de células HEK293-T, seguida de cosecha viral, centrifugación en gradiente de iodixanol y filtración Amicon (Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol, 24:198-204).
Ejemplo 3 - Invecciones invivo de virus o trazadores
Para la administración viralin vivolocalizada, se anestesió a ratones o ratas con isoflurano (-2% por volumen en O2; SurgiVet, Smiths Medical) y se perforó un pequeño orificio en el cráneo por encima del sitio de inyección requerido (véase Tabla 1). En algunos puntos de inyección se realizaron varias inyecciones a distintas profundidades (véase la Tabla 1). Para las inyecciones virales, se inyectaron lentamente ~ 50-100 nl (ratones) o 250-500 nl (ratas) de solución que contenía virus a cada profundidad en el tejido. Para las inyecciones de trazador, se inyectaron 50 nl de Fluorogold al 5% (Fluorochrome, Denver, CO) en NaCl al 0,9%, o 100 nl de retro-perlas (LumaFluor, Durham, NC) diluidas 1:1 en NaCl al 0,9% en el mismo conjunto de sitios para cada objetivo de inyección. Las inyecciones se realizaron con una pipeta de vidrio estirada (rota y biselada a 25-30 pm (diámetro exterior); Drummond Scientific, Wiretrol II Capillary Microdispenser) rellenada con aceite mineral. Se introdujo un émbolo ajustado en la pipeta y se hizo avanzar para desplazar el contenido utilizando un manipulador hidráulico (Narashige, MO-10).
La retracción del émbolo se utilizó para cargar la pipeta con virus. La pipeta de inyección se colocó con un manipulador Sutter MP-285.
Tabla 1. Coordenadas utilizadas en este estudio
Ejemplo 4: Selección y evolución de bibliotecas
Las cuatro bibliotecas virales mutantes se agruparon y se inyectaron en la SNr o en el cerebelo de ratones adultos (6 8 semanas de edad) de tipo salvaje C57/Bl6J (de ambos sexos; Charles River). Tres semanas después de las inyecciones, se extrajo el tejido estriado o del rombencéfalo, se extrajo el ADN y los viriones que habían alcanzado con éxito el tejido diana retrógrado remoto se amplificaron por PCR y se volvieron a clonar en el plásmido de empaquetamiento rcAAV para crear una nueva biblioteca AAV competente en replicación para la siguiente ronda de selección. Después de tres pasos de selección, los genes cap rescatados se mutaron aleatoriamente mediante PCR propensa a errores utilizando 5'-ACG CGG AAG CTT CGATCAACT ACG CAG-3' (SEQ ID NO:79) y 5'-AGACCAAAG TTC AAC TGAAAC GAATTAAAC GG-3' (SEQ ID NO:80) como cebadores directo e inverso, respectivamente.
A continuación se realizaron dos rondas adicionales de selecciónin vivo. Se secuenciaron aislados individuales tras las rondas 4 y 5 para evaluar el grado de enriquecimiento de la biblioteca (Tabla 2).
Se eligieron diecisiete variantes para el cribado secundario al final de la ronda 5, y las correspondientes secuencias del gen cap se volvieron a clonar en un plásmido ayudante rAAV. A continuación, Vector BioLabs, Inc (Filadelfia, PA) realizó preparaciones individuales de alta titulación del AAV2 parental de tipo salvaje y de cada una de las 17 variantes mutantes elegidas con una carga útil CMV-EGFP El promotor del CMV suele ser débil en las neuronas, por lo que este cribado secundario proporcionó una prueba rigurosa de la eficacia del transporte retrógrado. Las variantes individuales de AAV se inyectaron en el cerebelo o en el globo pálido. Al cabo de 3 semanas, se visualizó fluorescencia EGFP endógena y no amplificada en las regiones que se esperaba marcar si el transporte retrógrado era eficiente. La mutante 5R-Hind6 (SEQ ID NO:43 que codifica SEQ ID NO:44) mostró el mayor transporte retrógrado en ambos circuitos, por lo que fue elegida para análisis posteriores y denominada rAAV2-retro.
Ejemplo 5 - Ensayo de unión a heparina
La afinidad a la heparina del AAV2-retro y del AAV2 de tipo salvaje se analizó como se ha descrito previamente (Jang et al., 2011, Mol. Ther., 19:667-75). En resumen, se cargaron aproximadamente 1011 partículas genómicas purificadas en una columna de heparina HiTrap de 1 mL(GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ) previamente equilibrada con 150 mM NaCl y 50 mM Tris a pH 7,5. A continuación se procedió a la elución aumentando la concentración de NaCl en pasos de 50 mM hasta una concentración final de 950 mM, seguida de un lavado con NaCl 1M. Se utilizó una pequeña fracción de cada elución para infectar células HEK293T y se cuantificó el porcentaje de células GFP positivas 48 horas después de la infección utilizando un citómetro de flujo Guava EasyCyte 6HT (EMD/Millipore).
Ejemplo 6-Cargas útiles utilizadas en el estudio
Para todos los experimentos posteriores, se sustituyó el promotor CMV por un promotor conocido por ser más robusto en neuronas adultas. La recombinasa Cre y el sensor de calcio GCaMP6f fueron dirigidos por el promotor humano Synapsin-1 (hSyn1). Todos los fluoróforos estaban controlados por el promotor CAG, y el constructo de cambio de color estaba controlado por el promotor EF1-alfa.
Ejemplo 7-Producción de virus para la cuantificación de la eficacia retrógrada
La carga útil hSyn-Cre se empaquetó utilizando cápsides AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9, DJ y AAV2-retro en el Janelia Viral Shared Resource. Las siete preparaciones de virus se procesaron en paralelo y se ajustaron los títulos antes de las inyeccionesin vivo. Todos los lotes se diluyeron hasta el título más bajo medido (1,3E12 GC/ml), y cada virus se inyectó en el núcleo pontino derecho de tres ratones adultos Rosa26Lox-STOP-LoxH2B-GFP (He et al., 2012, Neuron, 73:35-48).
Ejemplo 8-Histología
Los animales fueron sacrificados tres semanas después de las inyecciones del virus, momento en el que se cosecharon los cerebros y se seccionó sagitalmente el hemisferio derecho a un grosor de 50 pm. Las secciones se montaron en VECTASHlELD Antifade Mounting Medium que contenía DAPI (Vector Laboratories), y se tomaron imágenes con un escáner de portaobjetos P-E Pannoramic (3D Histech) utilizando un objetivo 20x y filtros FITC y DAPI.
Ejemplo 9-Cuantificación del transporte retrógrado
Las imágenes obtenidas con el escáner de diapositivas Pannoramic se cosieron y luego se analizaron utilizando un software personalizado escrito en Matlab (Mathworks) para detectar los núcleos marcados con GFP a través de la corteza. Se trazó manualmente una región de interés (ROI) alrededor de la corteza para aislar el área en la imagen para el recuento celular automatizado. Para mejorar la detección de núcleos, la imagen se convolucionó con un núcleo de "sombrero mexicano" compuesto por la diferencia de dos gaussianas (varianza de 26,00 pm y varianza de 3,25 pm). El ruido de la imagen se redujo mediante un filtro de mediana y, a continuación, se realizó la detección básica de picos.
Ejemplo 10-Análisis de la generalidad del transporte retrógrado
Los ratones Rosa26-LSL-H2B-GFP fueron inyectados con 25 nl de rAAV2-retro hSyn1-Cre en el estriado dorsal. Tres semanas después de la inyección, se tomaron imágenes de cortes coronales de cerebro utilizando un escáner panorámico para visualizar los núcleos teñidos con DAPI y la fluorescencia verde de los núcleos que expresaban H2B-GFP. El canal verde se convolucionó con una diferencia de dos gaussianos y, a continuación, se detectaron picos como máximos locales en estas imágenes de umbral utilizando funciones personalizadas escritas en Matlab. El canal azul de cada sección se alineó con las imágenes Nissl del atlas estandarizado de cerebro de ratón del Allen Brain Institute utilizando rutinas de análisis personalizadas escritas con la ayuda de la Matlab Image Processing Toolbox. A continuación, se utilizaron las regiones anotadas del atlas del cerebro de ratón del ABI para asignar las neuronas detectadas en las secciones alineadas a regiones cerebrales específicas.
Se observó que la precisión finita del atlas de referencia junto con la variabilidad anatómica de los cerebros individuales limitan la robustez de este proceso semiautomatizado a las entradas aferentes prominentes.
Ejemplo 11-Imagen de la actividad de la población neuronal in vivo tras la administración retrógrada de GCaMP6f
Siete ratones adultos se anestesiaron con isoflurano (2%) y se colocaron en un marco estereotáctico (Kopf Instruments; Tujunga, CA) sobre una almohadilla térmica a 37°C. Se retiraron el cuero cabelludo y el periostio sobre el cráneo, se aplicó una capa de adhesivo OptiBond de curado UV (Kerr; Orange, CA) y se colocó un poste de cabeza hecho a medida (Osborne y Dudman, 2014, PLoS One, 9(2):e89007) con cemento dental. Se inyectó AAV2-retro portador de una carga útil hSynGCaMP6f en el BPN (3,9 mm posterior y 0,4 mm lateral a Bregma, profundidades 5,8, 5,6 y 5,4 mm, 100 nl en cada profundidad) utilizando un inyector Nanoliter 2010 (WPI). Se colocó una ventana craneal (un panel de 170 pm de grosor de vidrio cortado con láser, de 2 mm de diámetro) sobre la corteza motora primaria (centrada en 0,7 mm anterior y 1,6 mm lateral a Bregma).
Tras la cirugía, se administraron por vía subcutánea inyecciones de ketoprofeno (5 mg/kg) y buprenorfina (0,1 mg/kg; Henry Schein Animal Health; Melville, NY). Se dejó que los ratones se recuperaran durante 1 semana tras la cirugía y luego se les tomaron breves imágenes con un microscopio de 2 fotones para evaluar la expresión del virus. Todos los animales habían identificado visualmente células que expresaban GCaMP6f en la capa V de M1 una semana después de la inyección. A continuación, se habituó a los animales a la fijación de la cabeza en un aparato hecho a medida y se les entrenó para recuperar una bolita de comida como se ha descrito previamente (Guo et al., 2014, Nat. Med., 20:130-8).
GCaMP6f fue excitado a 920 nm (típicamente 20-40 mW en la apertura posterior) con un Ti: Láser de zafiro (Chameleon, Coherent) y se obtuvieron imágenes a través de un objetivo Nikon 16x, 0,8-N.A. La luz de emisión pasó a través de un filtro dicroico 565 DCXR (Chroma Technology) y un filtro ET525/70m-2p (Chroma Technology) y fue detectada por un tubo fotomultiplicador GaAsP (10770PB-40, Hamamatsu). Las imágenes (512 x 512 píxeles) se adquirieron a ~30 Hz con escáneres resonantes utilizando el software ScanImage.
Ejemplo 12-Edición del genoma con CRISPRlCas9
El promotor CMV en pAAV-CMV-SaCas9-empty (Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8) se sustituyó por hSyn1 para generar pAAV-hSyn1-SaCas9-empty. Los oligonucleótidos que codifican las secuencias protospacer de ARNsg se ordenaron a medida, se fosforilaron, hibridaron y ligaron en los sitios de restricción Bsal de pAAV-hSyn1-SaCas9-emtpy para generar pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1 a -10. Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas fueron: tdTomato ARNsg 1 Fwd: CAC CGCAAG GGC GAG GAG GTC ATC A(SEQ ID NO:87)
tdTomato ARNsg 1 Rev: AAA CTG ATG ACC TCC TCG CCC TTG C (SEQ ID NO:88)
tdTomato ARNsg 2 Fwd: CAC CGT GGA GGG CTC CAT GAA CGG CC (SEQ ID NO:89)
tdTomato ARNsg 2 Rev: AAA CGG CCG TTCATG GAG CCC TCC AC (SEQ ID NO:90)
tdTomato ARNsg 3 Fwd: CAC CGA GGA CGG CGG CCA CTA CCT GG (SEQ ID NO:91)
tdTomato ARNsg 3 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TC (SEQ ID NO:92)
tdTomato ARNsg 4 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:93)
tdTomato ARNsg 4 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:94)
tdTomato ARNsg 5 Fwd: CAC CGA AGG ACG GCG GCC ACT ACC TGG (SEQ ID NO:95)
tdTomato ARNsg 5 Rev: AAA CCC AGG TAG TGG CCG CCG TCC TTC (SEQ ID NO:96)
tdTomato ARNsg 6 Fwd: CAC CGA CAA CAA CAT GGC CGT CAT CA (SEQ ID NO:97)
tdTomato ARNsg 6 Rev: AAA CTG ATG ACG GCC ATG TTG TTG TC (SEQ ID NO:98)
tdTomato ARNsg 7 Fwd: CAC CGG TCA CCT TCAGCT TGG CGG T (SEQ ID NO:99)
tdTomato ARNsg 7 Rev: AAA CAC CGC CAAGCT GAAGGT GAC C (SEQ ID NO:100)
tdTomato ARNsg 8 Fwd: CAC CGC CGT ACA TGA ACT GGG GGG A (SEQ ID NO:101)
tdTomato ARNsg 8 Rev: AAA CTC CCC CCAGTT CAT GTACGG (SEQ ID NO:102)
tdTomato ARNsg 9 Fwd: CAC CGT CTT GTAATC GGG GAT GTC GG (SEQ ID NO:103)
tdTomato ARNsg 9 Rev: AAA CCC GAC ATC CCC GAT TACAAG AC (SEQ ID NO:104)
tdTomato ARNsg 10 Fwd: CAC CGC CGT CCT GCAGGG AGG AGT C (SEQ ID NO:105)
tdTomato ARNsg 10 Rev: AAA CGA CTC CTC CCTGCAGGACGG C (SEQ ID NO:106)
La capacidad de cada oligo para dirigir la edición del genoma se evaluó primeroin vitro.Las células Neuro2A se transfectaron con 800 ng de pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1 a -10, 100 ng de pAAV-FLEX-CAGtdTomato y 100 ng de pAAV-CAG-EGFP utilizando polietilenimina. A las 72 horas de la transfección, se cosecharon las células y se aislaron ~70.000 células Neuro2A EGFP positivas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un BD Influx Sorter (BD Biosciences). A continuación, se extrajo ADN genómico y se evaluó la frecuencia de modificación del gen tdTomato mediante el ensayo de nucleasas Surveyor (Integrated DNA Technologies), como se describió previamente (Cong et al., 2013, Science, 339:819-23). ARNsg 7 - uno de los dos que parecían dirigir dos eventos de escisión dentro de la secuencia tdTomato - se empaquetó en retro-AAV2 y se utilizó para la edición del genomain vivo.
A continuación, se inyectaron 100 nl (5 x1013 genomas vectoriales (vg)/ml) de AAV2-retro-hSyn1-SaCas9-tdTomato o AAV2retro-hSyn1-SaCas9-empty en el BPN de ratones Rbp4-Cre * tdTomato como se ha descrito anteriormente. Seis semanas después de las inyecciones, se cosecharon los cerebros y se cortaron secciones coronales de 40 pm de grosor y se tiñeron contra el Cas9 marcado con HA (anticuerpo anti-HA C29F4 de Cell Signaling, diluido 1:1600; anticuerpo secundario: anti-ratón de burro Alexa Fluor 488 (1:250; Jackson ImmunoResearch) y contra el marcador neuronal NeuN (anticuerpo anti-NeuN A60 de Millipore, diluido 1:250; anticuerpo secundario: anti-conejo de burro Alexa Fluor 647 (1:500; ThermoFisher, A-31573)). Tras la tinción con anticuerpos, las secciones se montaron en portaobjetos con VECTASHIELD Antifade Mounting Medium que contenía DAPI (Vector Laboratories) y se visualizaron con un microscopio invertido Zeiss Axio Observer A1 (Zeiss). La cuantificación de la inmunotinción se realizó mediante el programa de análisis ImageJ (NIH).
Ejemplo 13-Evolución dirigida de rAAV2-retro
Para diseñar nuevos rAAV con transporte retrógrado mejorado, se diseñó un enfoque de evolución dirigidainvivo que enriqueció las variantes de cápside de rAAV que se transportaban eficientemente a los cuerpos celulares de las neuronas que enviaban proyecciones de largo alcance al sitio de inyección del virus en el cerebro del ratón (Figura 1A). Para maximizar la probabilidad de recuperar una variante con las propiedades deseadas, se utilizó una mezcla diversa de bibliotecas de variantes cap del rAAV previamente descritas (Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9; Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95; Koerber et al., 2006, Nat. Protocols, 1:701-6; Müller et al., 2003, Nat. Biotechnol, 21: 1040-6) como material de partida. Las partículas virales se empaquetaron deforma que cada variante de la cápside quedara vinculada al genoma del AAV que contenía el gen de la cápside correspondiente, y el conjunto final de variantes de la cápside incluía mutantes puntuales, variantes con una inserción aleatoria de un péptido de 7 marcadores en la región que el AAV2 utiliza para unirse a su correceptor, el heparán sulfato, y quimeras aleatorias de secuencias genéticas de la cápside de siete serotipos parentales (Figura 1A). Para identificar variantes con amplio tropismo retrógrado, se seleccionaron dos poblaciones independientes de neuronas de proyección: las neuronas estriatales GABAérgicas que se proyectan a la substantia nigra pars reticulata (SNr) y las neuronas glutamatérgicas del rombencéfalo que se proyectan a la corteza cerebelosa. Tres semanas después de la inyección de todo el conjunto de variantes del rAAV en la SNr o el cerebelo (una inyección por animal), se extrajo el tejido estriado o del rombencéfalo, respectivamente, se recuperaron las secuencias de la cápsula mediante PCR y se volvió a empaquetar el virus (Figura 1B). Después de dos pasos más de selección, se realizó una PCR propensa a errores para diversificar aún más la biblioteca, seguida de dos pasos finales de selecciónin vivo.
Se secuenciaron 30 variantes de la cápside después de la 4a ronda de evolución, y la mayoría procedían de la biblioteca de inserción y contenían péptidos exógenos de 7-mer entre N587 y R588 del gen de la cápside VP1 del AAV2 de tipo salvaje. Curiosamente, todos los insertos recuperados eran de la formaLAxxDxTKxA(SEQ ID NO: 107) oLAxDxTKxxA(s Eq ID NO: 108) (donde los residuos en negrita y cursiva son del inserto); las mutaciones en otras partes de la secuencia también estaban enriquecidas (Tabla 2). Se secuenciaron otros 22 clones después de la 5a ronda de evolución, y con esta ronda adicional de evolución, todas las secuencias eran mutantes AAV2 coninserciones LAxxDxTKxA(SEQ ID NO: 107) /LAxDxTKxxA(SEQ ID NO: 108) (Tabla 2), lo que demuestra un marcado grado de mayor convergencia. Tal convergencia sugería que las inserciones peptídicas específicas en el bucle de unión a la heparina eran en gran medida responsables de la funcionalidad retrógrada, con posibles contribuciones secundarias de los otros sitios.
A continuación se examinó un cribado secundario de diecisiete variantes aisladas que poseían diferentes combinaciones de inserciones peptídicas y mutaciones puntuales en la secuencia de la cápside. Para aplicar un alto nivel de rigor, las variantes elegidas se empaquetaron con el transgén de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) impulsado por el promotor CMV, que suele ser débil en las neuronas. Para cada variante de cápside, se evaluó su capacidad de administrar suficiente carga útil a los cuerpos celulares en regiones aferentes clave para permitir la detección de señal EGFP no amplificada por anticuerpos tres semanas después de la inyección. El clon (inserto LADQDYTKTA (SEQ ID NO:85) V708I N382D) que mostró el transporte retrógrado más intenso en dos circuitos independientes en este cribado secundario (corteza a globo pálido y oliva inferior/núcleo pontino basal a cerebelo) fue elegido para análisis posteriores y denominado rAAV2-retro. Cuando se evaluaron dos promotores adicionales más comúnmente utilizados en estudiosin vivocon roedores (CAG - Figura 1B, o Sinapsina-1 humana, datos no mostrados), se observó una notable eficacia de etiquetado retrógrado con esta variante rAAV en una serie de circuitos diferentes en ratones y ratas (Figura 1B y Figura 7). El cambio de la inserción de 7-mer a una de las otras secuencias recuperadas, o la adición de mutaciones puntuales adicionales identificadas en el cribado, no condujeron a nuevos aumentos en el transporte retrógrado.
Ejemplo 14: Acceso retrógrado eficaz a las neuronas de proyección
Dentro de las vías motoras descendentes, el tracto córtico-pontino es notablemente convergente, y se sabe que contribuye con más del 95% de las aferentes a los núcleos pontinos basales (BPN). Así pues, esta vía representa un sistema especialmente ventajoso para cuantificar la eficacia de la captación viral y el transporte retrógrado por los terminales axonales de las neuronas de proyección. De hecho, la inyección de rAAV2-retro en la BPN produjo un marcado denso de las neuronas de la capa V (Figura 2A), en consonancia con estudios de trazado anteriores (Legg et al., 1989, J. Comp. Neurol, 286(4):427-41).
A continuación, se comparó la eficacia del transporte retrógrado en el circuito córtico-pontino del rAAV2-retro frente a varios serotipos de AAV comúnmente utilizados, en condiciones idénticas de infección y procesamiento (Figura 2B-D). Para garantizar la precisión de la cuantificación y eliminar la posible confusión de la variabilidad de célula a célula en el nivel de expresión del transgén, se utilizó el<a>A<v>para liberar la recombinasa Cre en ratones transgénicos Rosa26-Lox-STOP-Lox-H2B-GFP (He et al., 2012, Neuron, 73:35-48). Se ha demostrado que incluso una baja concentración de la enzima Cre es suficiente para activar la expresión de dicho casete dependiente de Cre, y la estricta localización nuclear del informador fusionado con histonas permite la identificación inequívoca de las células infectadas, sin confundir la señal de la neuropila.
Se utilizó un procedimiento de análisis semiautomatizado para calcular la densidad lineal de neuronas de proyección corticales infectadas en secciones sagitales de imágenes de cerebros de ratón cosechadas tres semanas después de la inyección local del virus en el BPN (Figura 2C). En los animales infectados con rAAV2, se observó una mínima expresión cortical de GFP (densidad lineal 0,98 ± 0,20 neuronas/mm, media ± sem, n=5; Figuras 2B, panel central). Por el contrario, y de acuerdo con la observación anterior (Figura 2A), se pudo observar una densa capa de neuronas de proyección de la capa V positivas para GFP a lo largo del eje rostro-caudal de la corteza en los animales rAAV2-retroinyectados (densidad lineal 130,11±11,08 neuronas/mm, n=4; Figura 2B, panel inferior). Ninguno de los otros serotipos de AAV comúnmente utilizados, ni el adenovirus canino-2, igualaron la eficacia retrógrada de la variante rAAV2-retro diseñada (AAV1 de densidad lineal: 0.05 ± 0,04, AAV2: 0.98 ± 0,2, AAV5: 2.38 ± 1,24, AAV8: 1.43 ± 1,43, AAV9: 1.98 ± 0,86, DJ: 24.82 ± 14,32, CAV-2: 5.56 ± 4,13, n=3 a 5 cada uno; Figura 2D, Figura 8). Además, la densidad de neuronas de proyección corticales marcadas con rAAV2-retro era comparable a la conseguida con Fluoro-Gold (Schmued y Fallon, 1986, Brain Res., 377:147-54), un trazador retrógrado sintético robusto (densidad lineal 81,03 ± 11,08 neuronas/mm, n= 3). Así, el rAAV2-retro muestra una mejora de hasta dos órdenes de magnitud sobre los serotipos existentes en el acceso retrógrado a las neuronas de proyección cortico-pontinas, y rivaliza con la eficacia de los trazadores retrógrados sintéticos.
Ejemplo 15 - Funcionalidad retrógrada
A continuación se examinó si la funcionalidad retrógrada del rAAV2-retro se extendía a otros circuitos, específicamente caracterizando el grado en que marcaba varias aferencias al estriado dorsomedial (DMS) - una parte de los ganglios basales que recibe entradas de largo alcance de una variedad de áreas corticales y subcorticales. Se observó que la eficacia del acceso retrógrado mediado por rAAV2-retro a las entradas aferentes más fuertes en DMS - corteza, tálamo y amígdala - era comparable a la de las perlas fluorescentes utilizadas clásicamente para el rastreo retrógrado (Figura 3A). Para proporcionar una estimación no sesgada del número de neuronas marcadas retrógradamente en todas las áreas cerebrales que se sabe que proporcionan una entrada significativa de largo alcance al DMS, se desarrolló un algoritmo que asignaba cualquier etiqueta fluorescente detectada en una sección de imagen del cerebro de ratón a áreas cerebrales específicas alineando la sección con el Atlas cerebral Allen anotado (Figura 3B-C). El análisis cuantitativo (Figura 3C) reveló la existencia de un marcado retrógrado intenso en la inmensa mayoría de las regiones que, según se ha informado anteriormente, envían proyecciones prominentes al cuerpo estriado (Pan et al., 2010, Front Neuroanat., 4: 147). En una notable excepción, sólo se observó un modesto etiquetado en la sustancia negra pars compacta, a pesar de ser la fuente de una fuerte entrada dopaminérgica al DMS (Figura 3C, flecha en el recuento de células para SNc). Un pequeño subgrupo de clases de neuronas de proyección resultó ser similarmente refractario al acceso retrógrado por rAAV2-retro en algunos de los otros circuitos probados (Tabla 3; nótese que todos los demás serotipos de AAV probados tampoco etiquetaron estas proyecciones). A pesar de estas excepciones, el rAAV2-retro es ampliamente aplicable en el sistema nervioso central.
Tabla 3. Eficacia de rAAV2-retro en varios circuitos. La baja eficiencia, más que la ausencia de transporte retrógrado en las proyecciones cortico-talámicas y cortico-coliculares, es sugerida por el etiquetado eficiente de las neuronas de proyección tras la entrega local de cargas útiles dependientes de Cre a los cuerpos celulares de las neuronas de proyección
Lugar de inyección<Localización de las neuronas de>
proyección dirigudasEficacia del etiquetado transgén cPFm de ratón (IL/PL) MEC fuerte Cre cPFm de ratón (IL/PL) LEC fuerte Cre cPFm de ratón (IL/PL) contra mPFC fuerte Cre cPFm de ratón (IL/PL) tálamo mediodorsal moderado Cre cPFm de ratón (IL/PL) núcleo reuniens del tálamo moderado Cre cPFm de ratón (IL/PL) corteza insular fuerte Cre cPFm de ratón (IL/PL) hipocampo- ventral CA1 fuerte Cre cPFm de ratón (IL/PL) AcG fuerte Cre OFC MEC fuerte Cre OFC LEC Fuerte Cre OFC contra OFC fuerte Cre OFC corteza insular fuerte Cre OFC hipocampo- ventral CA1 moderado Cre cA 1 dorsal MEC fuerte Cre cA2 dorsal LEC fuerte Cre cA3 dorsal CA3 débil Cre cA4 dorsal núcleo reuniens del tálamo débil Cre amígdala mPFC fuerte Cre hipotálamo lateral mPFC fuerte Cre estriado dorsomedial mPFC fuerte Cre estriado ventral (NAcc) mPFC fuerte Cre MEC mPFC moderado FLPo mPFC cA1 ventral moderado FLPo mPFC MEC moderado FLPo subículo núcleo accumbens moderado Cre subículo hipocampo ventral fuerte Cre subículo núcleo inteanterotalámico moderado Cre subículo corteza retrosplenial fuerte Cre subículo corteza etorrinal lateral fuerte Cre subículo corteza entorrinal medial fuerte Cre colículo superior capa 5 de la corteza visual muy débil Gcamp6s colículo superior capa 5 de la corteza visual fuerte Cre dLGN capa 6 de la corteza visual muy débil Gcamp6s dLGN capa 6 de la corteza visual fuerte Cre corteza visual corteza visual contralateral fuerte Cre corteza visual corteza visual contralateral fuerte GFP corteza visual corteza visual contralateral débil Gcamp6s corteza visual corteza visual contralateral fuerte tdtomato corteza visual LGN fuerte tdtomato corteza visual claustro fuerte tdtomato corteza visual cingulado moderado tdtomato corteza visual LM fuerte tdtomato estriado dorso-lateral M1 fuerte tdtomato estriado dorso-lateral M1 moderado GFP estriado dorso-lateral M2 fuerte tdtomato estriado dorso-lateral corteza somatosensorial fuerte tdtomato estriado dorso-lateral amígdala basolateral fuerte tdtomato Lugar de inyección<Localización de las neuronas de>
proyección dirigudasEficacia del etiquetado transgén estriado dorso-lateral corteza insular fuerte tdtomato estriado dorso-lateral corteza entorrinal fuerte tdtomato estriado dorso-lateral Globo pálido moderado tdtomato estriado dorso-lateral tálamo moderado tdtomato estriado dorso-lateral núcleos talámicos intralaminares fuerte GFP estriado dorso-lateral rafe nulceus muy débil tdtomato estriado dorso-lateral VTA débil tdtomato
amígdala basolateral corteza gustativa fuerte<flex->tdtomatocorteza motora del
miembro anteriortálamo motor débil GFP núcleos tractos solitarios amígdala lateral moderado tdtomato
médula espinal corteza fuerte<flex->tdtomatomédula espinal corteza fuerte GFP
médula espinal, lámina IX<médula espinal: neuronas inhibidoras>
presinápticasfuerte flextdtomato músculo motoneuronas espinales moderado Cre músculo neuronas propioceptoras fuerte Cre
Ejemplo 16-Acceso retrógrado a poblaciones neuronales definidas genéticamente
También se determinó si la funcionalidad retrógrada del rAAV2-retro podía combinarse con la especificidad de las líneas transgénicas Cre para permitir la interrogación de clases específicas de neuronas de proyección. En concreto, se realizaron experimentos para determinar si las líneas transgénicas rAAV2-retro y Cre podían combinarse para segregar dos conexiones de largo alcance funcionalmente distintas que discurren en paralelo entre dos áreas cerebrales. Las proyecciones de la corteza cerebral al cuerpo estriado proceden principalmente de las neuronas de la capa V, pero algunas neuronas de las capas II y III también proporcionan entradas estriatales. Se ha sugerido que las entradas al estriado procedentes de diferentes capas corticales constituyen vías separadas, con neuronas de la capa V proyectándose al compartimento del parche del estriado, y las de las capas Ii y III a la matriz. La naturaleza interdigitada de los microcompartimentos del parche y de la matriz dificulta la orientación selectiva de estas vías para su interrogación funcional sólo con el sistema rAAV2-retro. Por lo tanto, se exploró si las dos entradas podían segregarse combinando rAAV2-retro con una línea transgénica que expresa la recombinasa Cre en todas las neuronas de la capa V (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80:1368-83), pero no en las neuronas de las capas II y III (Figura 4A).
Para destacar ambas vías en el mismo experimento, se eligió una carga útil de inversión de color dependiente de Cre, que expresa tdtomato en ausencia de Cre, pero se invierte para impulsar la expresión de EGFP en células Cre positivas (Saunders et al., 2012, Front Neural Circuits, 6:47). Cuando el rAAV2-retro con esta carga útil se inyectó en el estriado dorso-medial de una línea conductora Cre específica de la capa V, Rbp4_KL100 Cre (Gerfen et al., 2013, Neuron, 80: 1368-83), sólo las neuronas de la capa V que se proyectaban al cuerpo estriado expresaban EGFP. Además, la vía corticoestriatal de las capas II y III se distinguía claramente por la expresión de tdTomato (Figura 4B). De acuerdo con la naturaleza topográfica de la proyección córtico-estriatal, las inyecciones altamente localizadas del virus en el estriado dorsomedial condujeron a un etiquetado de secciones correspondientemente pequeñas de la corteza. Sin embargo, las poblaciones corticoestriatales de la capa V y de las capas II y III estaban siempre coetiquetadas (Figura 4B, panel inferior), lo que sugiere que las dos vías procedentes de la misma área cortical atraviesan la matriz vecina y los microcompartimentos de parche dentro del cuerpo estriado.
Aunque este experimento destacó ambas vías, elegir una carga útil "Cre-on" o "Cre-off' permitirá el acceso selectivo a una excluyendo la otra. Este ejemplo, por lo tanto, pone de relieve la especificidad añadida de la interrogación de circuitos que puede lograrse mediante la combinación de un virus retrógrado altamente eficiente con líneas de controladores Cre (o Flp) disponibles.
Ejemplo 17: Uso de rAAV2-retro para la interrogación de circuitos y la manipulación de genes
La utilidad del rAAV2-retro para la interrogación de circuitos dependerá de su capacidad para mediar altos niveles de expresión de indicadores y efectores genéticamente codificados. La capacidad de monitorizar la actividad neuronal en clases definidas de neuronas de proyección se evaluó por primera vez mediante la expresión rAAV2-retro-mediada de GCaMP6f (Chen et al., 2013, Nature, 499:295-300) (Figura 5A-C). Utilizando imágenes de Ca2+ de dos fotonesin vivo, se detectaron transitorios de Ca2+ dendríticos y somáticos en la corteza motora primaria tan pronto como 7 días después de la administración viral a la BPN (Figura 5D). El perfil temporal de las señales de Ca2+ reflejaba la estructura de una tarea de alcance con clave, y la señal en muchas neuronas cortico-pontinas estaba estrechamente vinculada a la clave "adelante" (Figura 5E-F) (Li et al., 2015, Nature, 519:51-6). Las grabaciones repetidas de neuronas identificadas fueron posibles tanto a través de ensayos dentro de una sesión al principio del curso temporal de la expresión (Figura 5E, F), como a través de muchas sesiones conductuales durante más de dos meses después de la infección. Así pues, rAAV2-retro confiere la capacidad de expresar sensores en neuronas de proyección a niveles suficientes para la obtención de imágenes, creando muchas nuevas oportunidades para descifrar las contribuciones de proyecciones específicas a los cálculos del circuito.
Finalmente, se evaluó la utilidad del rAAV2-retro para la administración de efectores, como el sistema de edición génica CRISPR/Cas9, a neuronas de proyección (Figura 6). En concreto, elStaphylococcus aureusCas9 (SaCas9 (Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8)) y un único ARN guía diseñado para anular la expresión de tdtomato se empaquetaron en rAAv2-retro. La administración de rAAV2-retro-SaCas9-antitdTomato al BPN de animales que expresan tdTomato en neuronas excitadoras de la capa V cortical produjo la supresión de la expresión de tdTomato en el 88,6 ± 0,7% de las neuronas de la capa V que expresan SaCas9 (Figura 6B, panel inferior y Figura 6C, n = 3). Por el contrario, la administración de un SaCas9 no dirigido no condujo a ningún cambio perceptible, con sólo el 4,4 ± 3,2% de las células mostrando una reducción potencial en la expresión de tdTomato (Figura 6B, panel superior, y Figura 6C, n = 3). Además, la expresión de tdTomato no se vio afectada en las neuronas de la capa V inaccesibles mediante inyección pontina. De este modo, el sistema rAAV2-retro permite modificar genes de forma eficaz y selectiva en neuronas que se proyectan a zonas específicas de interés.
Colectivamente, estas observaciones establecen al rAAV2-retro como un reactivo efectivo para acceder genéticamente a las neuronas de proyección para la interrogación funcional de circuitos neuronales y, a largo plazo, para posibles terapéuticas.
Ejemplo 18-Discusión
Los virus adeno-asociados recombinantes pueden facilitar enormemente la disección funcional de los circuitos neuronales de mamíferos, y son prometedores para la intervención terapéutica en trastornos del sistema nervioso. La evolución dirigida se ha utilizado para dotar a la cápside del AAV de la capacidad adicional de acceso retrógrado eficiente a las neuronas de proyección en muchos circuitos. El rAAV2-retro de nueva ingeniería ofrece hasta dos órdenes de magnitud de mejora en el transporte retrógrado en comparación con los serotipos de AAV utilizados habitualmente, igualando la eficacia de los trazadores retrógrados sintéticos en muchos circuitos. El nivel de expresión transgénica conseguido con rAAV2-retro mediante acceso retrógrado es amplio para interrogar la función del circuito neuronal, así como para manipulaciones dirigidas del genoma neuronal. Así pues, al permitir la monitorización selectiva y la manipulación de las neuronas de proyección que conectan diferentes áreas cerebrales, las herramientas basadas en rAAV2-retro están preparadas para proporcionar información sobre cómo las redes a gran escala permiten la función cerebral, y son prometedoras para la intervención terapéutica en enfermedades caracterizadas por la disfunción progresiva de las redes a gran escala.
El marcado aumento de la eficacia del acceso retrógrado proporcionado por rAAV2-retro en comparación con su serotipo parental AAV2 puede haber sido posible a través de una interrupción mediada por la inserción del sitio de unión nativo para el heparán sulfato y/o a través de la creación de una nueva superficie de unión que incorpora el péptido insertado. Esta variante tiene una afinidad reducida por la heparina (Figura 9), lo que podría disminuir el secuestro del virus en la matriz extracelular de la hendidura sináptica y mejorar la propagación local del vector, como se ha observado con AAV1 yAAV6. Sin embargo, el aumento resultante en la propagación del vector no puede explicar por sí solo la eficacia del transporte retrógrado, ya que otras secuencias insertadas de 7-mer interrumpen la unión a la heparina de forma similar pero no afectan al transporte retrógrado. Además, los AAV5 y AAV9 no se unen a la heparina, pero su eficacia de transporte retrógrado es similar a la delAAV2. En apoyo de la explicación alternativa, las inserciones peptídicas seleccionadas en la selección original(LAxxDxTKxA(SEQ ID NO: 107)/LAxDxTKxxA(SEQ ID NO: 108)) comparten la misma composición general, diferenciándose simplemente en el registro del motivo conservado. La inserción del péptido manipulado podría favorecer la unión a un cofactor celular existente en la vía del AAV (por ejemplo, el receptor común del AAV recientemente identificado), o podría crear una nueva interacción con la maquinaria celular: un receptor de la superficie celular y/o un componente de la vía de tráfico vesicular o de entrada nuclear.
A pesar de la mejora de múltiples órdenes de magnitud en el transporte retrógrado que el rAAV2-retro ofrece sobre los serotipos existentes, un pequeño conjunto de clases de neuronas de proyección parece refractario a la infección retrógrada eficiente por esta variante rAAV recientemente evolucionada (Tabla 3). Cabe señalar, sin embargo, que otros serotipos de a Av tampoco etiquetan estas proyecciones. Queda por determinar en cada caso si el nivel de expresión del factor celular crítico que interactúa con esta nueva variante de AAV en estas neuronas es simplemente extremadamente bajo - una conclusión apoyada para las proyecciones córtico-talámicas y córtico-coliculares, por ejemplo, por la observación de que el rAAV2-retro todavía podía suministrar suficiente recombinasa Cre a los cuerpos celulares para dirigir un alto nivel de expresión para cargas útiles dependientes de Cre suministradas localmente (Tabla 3, entradas resaltadas) - o si el factor falta por completo. Futuras modificaciones adicionales de la cápside de esta u otras variantes podrían permitir una transducción retrógrada mejorada de estas clases de neuronas.
El sistema de vectores rAAV2-retro proporciona una importante adición al conjunto de herramientas genéticas para diseccionar la función del circuito neural, ya que obtener acceso a clases individuales de neuronas de proyección será un paso crítico para elucidar cómo se coordinan la dinámica del circuito local y la función de la red a gran escala. Cada vez se piensa más que los cálculos de los circuitos locales dependen de la dinámica de toda la población neuronal dentro de un módulo de circuito local concreto. En la mayoría de los circuitos aún no se ha resuelto cómo se asigna esta dinámica a las diferentes clases de neuronas de proyección y, por tanto, qué información se transmite a los diferentes objetivos posteriores. Los vectores basados en rAAV2-retro, solos o en combinación con líneas transgénicas Cre específicas, permiten el acceso genético a poblaciones específicas de neuronas de proyección. A su vez, el rAAV2-retro portador de la glicoproteína G de la rabia puede utilizarse para transcomplementar el vector condicional no tóxico de la rabia recientemente desarrollado para acceder a los microcircuitos presinápticos que inciden en clases particulares de neuronas de proyección. La capacidad resultante para monitorizar y manipular selectivamente la actividad de clases individuales de neuronas de proyección y sus microcircuitos locales debería proporcionar información sobre cómo las neuronas de proyección traducen la dinámica del circuito local para sus respectivas redes a gran escala.
El rAAV2-retro también es prometedor para la intervención terapéutica, con varias aplicaciones posibles. Por ejemplo, en situaciones en las que la patología afecta a grandes volúmenes de tejido neural -como la enfermedad de Alzheimer o las enfermedades de almacenamiento lisosómico-, las inyecciones múltiples suponen un riesgo para la seguridad y pueden ser insuficientes para alcanzar los niveles necesarios de transducción. Sin embargo, un pequeño número de inyecciones en lugares estratégicos puede permitir la dispersión del vector en grandes volúmenes (por ejemplo, el tracto cortico-pontino desde el punto de convergencia en el BPN), o en tejidos de difícil acceso (por ejemplo, las motoneuronas espinales desde el músculo). Además, se ha implicado a las redes funcionales a gran escala en la propagación de muchos trastornos neurodegenerativos desde su aparición espacialmente localizada. Un punto de vista emergente prominente postula que la deposición de conjuntos de proteínas anormales en poblaciones neuronales vulnerables desencadena una cascada patológica de actividad neuronal aberrante dentro de redes funcionales a gran escala, y la desintegración de las mismas, lo que en última instancia conduce al fracaso de las funciones neurológicas. Curiosamente, las redes neuronales afectadas parecen capaces de superar transitoriamente la dinámica aberrante al principio de la enfermedad, ya que los pacientes con muchas enfermedades neurodegenerativas suelen mostrar periodos de mejoría espectacular. Así pues, una intervención temprana dirigida a frenar la propagación de los agregados desde el origen cortical de la patología puede ser suficiente para estabilizar, o incluso restaurar, la función cognitiva. Desde esta perspectiva, las neuronas de proyección subcortical en las regiones mesocorticales donde aparecen por primera vez los agregados patológicos de proteínas, tanto en el Alzheimer como en el Parkinson, constituyen una atractiva diana de intervención. Acceder a esas neuronas de proyección con herramientas basadas en rAAV2retro diseñadas, por ejemplo, para introducir una mutación capaz de detener una mayor agregación en cis o para suministrar chaperonas capaces de disolver los agregados tiene el potencial de ralentizar la progresión de los síntomas cognitivos más debilitantes. La evaluación de la eficacia y la seguridad a largo plazo de los reactivos rAAV2-retro en primates no humanos allanará el camino para su eventual consideración para estos y otros enfoques de terapia génica.
Debe entenderse que, si bien los procedimientos y composiciones de materia se han descrito en el presente documento en relación con una serie de aspectos diferentes, la descripción anterior de los diversos aspectos tiene por objeto ilustrar los procedimientos y composiciones de materia.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de cápside viral que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en xxDxTKx (SEQ ID NO:1) y xDxTKxx (SEQ ID NO:2), en la que la proteína de cápside viral tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.
2. Una partícula de virus que comprende la proteína de la cápside viral de la reivindicación 1.
3. La partícula de virus de la reivindicación 2, que comprende además un ácido nucleico que codifica una carga útil; preferentemente, en la que el ácido nucleico que codifica una carga útil comprende una secuencia promotora unida de forma operable a una secuencia codificante que codifica la carga útil.
4. La partícula de virus de la reivindicación 3, en la que el promotor se selecciona del grupo que consiste en sinapsina-1, CMV, GFAP, CAG, CaMKII, MBP, EF1alfa, TRE y mDlx.
5. La partícula de virus de la reivindicación 4, en la que la secuencia codificadora que codifica la carga útil se selecciona del grupo que consiste en un gen codificador de proteínas y un ácido nucleico ARN inhibidor; preferentemente, en la que el ácido nucleico ARN inhibidor es un oligonucleótido antisentido, un ARNsi o un ARNi.
6. La partícula de virus de la reivindicación 3, en la que la carga útil es:
i) una proteína efectora; preferentemente, la proteína efectora se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa (por ejemplo, Cre o Flp), un sistema de edición de genes (por ejemplo, CRISPR/Cas9, TALEN, nucleasa de dedos de zinc), reactivos optogenéticos (activadores (por ejemplo, canalrodopsina o sus variantes) o inhibidores (por ejemplo, halorodopsina o Arch)), reactivos quimiogenéticos (por ejemplo, versiones activadoras/inhibidoras de los sistemas DREADD o PSAM/PSEM), activadores y/o inhibidores de vías del sistema celular y enzimas para el control de la epigenética;
ii) un constructo informador óptico; preferentemente en el que el constructo informador óptico se selecciona del grupo que consiste en GCaMP6 (s, m, o f), un fluoróforo (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), GFP mejorada (EGFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), tdTomato), un constructo de cambio de color (por ejemplo, una carga útil que expresa un informador en una población celular y un informador diferente en otra población), sensores de glucosa, jRCaMP, jRGECO y CaMPARI, indicadores de voltaje, mensajeros secundarios, señalizadores de receptores, informadores de transcripción, informadores epigenéticos y informadores de neuromoduladores; o
iii) una proteína viral; preferentemente, en la que la proteína viral es la proteína G de la rabia o una proteína que complementa la función de un virus distinto del AAV o una proteína relacionada con el transporte celular y transcelular.
7. La partícula de virus de la reivindicación 3, en la que la secuencia codificante que codifica la carga útil es un gen terapéutico; preferentemente, en la que el gen terapéutico es para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo; por ejemplo, en la que el gen terapéutico es:
i) HSP104 para el tratamiento de la enfermedad deAlzheimeru otras enfermedades con agregados proteicos tóxicos;
ii) frataxina para el tratamiento de la ataxia de Friedreich;
iii) glucocerebrosidasa lisosomal (GBA) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson;
iv) proteína de unión a poliQ para el tratamiento de la enfermedad de Huntington; o
v) neurona motora de supervivencia 1 para el tratamiento de la atrofia muscular espinal, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), el autismo, la demencia, la neuropatía periférica, la esquizofrenia o la degeneración retiniana.
8. La partícula de virus de la reivindicación 3, en la que la carga útil es una fracción terapéutica; preferentemente, en la que la fracción terapéutica es:
i) un anticuerpo o fragmento del mismo;
ii) una proteína inmunomoduladora; o
iii) una molécula de ARN de interferencia.
9. La partícula de virus de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que el acceso retrógrado a las neuronas de proyección cortico-pontinas o aferentes al estriado dorsomedial (DMS) es comparable al trazador sintético, perlas fluorescentes de Fluoro-Gold.
10. Una variante de virus adeno-asociado (AAV) que comprende una carga útil empaquetada en el mismo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, comprendiendo el procedimiento ponerse en contacto con una o más neuronas con dicha variante de AAV, en la que dicha variante de AAV comprende una proteína de cápside que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en xxDxTKx (SEQ ID NO:1) y xDxTKxx (SEQ ID NO:2), en la que la variante de AAV tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 18, 22, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 60, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 y 78.
11. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de la reivindicación 10, en la que las neuronas son neuronas de proyección.
12. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de la reivindicación 10 o de la reivindicación 11, en la que las neuronas se encuentran en un sujeto; preferentemente, en la que las neuronas se encuentran en el sistema nervioso central (SNC) de un sujeto.
13. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el sujeto es un humano.
14. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el sujeto es un no humano; preferentemente, en la que el sujeto no humano se selecciona entre un primate, un roedor, un reptil y un ave.
15. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en la que el paso de contacto esin vivomediante inyección intracraneal, intraespinal o intramuscular.
16. La proteína de la cápside viral de la reivindicación 1, en la que la proteína de la cápside viral tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
17. La variante de virus adeno-asociado (AAV) para uso de la reivindicación 10, en la que la proteína de la cápside viral tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
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